WO2013029075A1

WO2013029075A1 - Means and method for alkylation

Info

Publication number: WO2013029075A1
Application number: PCT/AT2012/000228
Authority: WO
Inventors: Mandana GRUBER; Harald STECHER; Martin TENGG; Peter Remler
Original assignee: ACIB GmbH; Technische Universitaet Graz
Current assignee: ACIB GmbH; Technische Universitaet Graz
Priority date: 2011-09-01
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2013-03-07
Anticipated expiration: 2014-03-01
Also published as: AT511856A1

Abstract

The invention relates to a method for transferring an alkyl, alkenyl or alkenyl group to a low-molecular weight compound (small molecule) having a nucleophilic centre, the method comprising the step of contacting the compound with an S-Adenosyl-L-methionine (SAM)-dependent methyltransferase in the presence of an alkylated sulfonium salt of general formula (I) or an alkylated sulfonium salt of general formula (II), wherein X^Θis an organic or inorganic anion and R¹, R² and R³ are respectively and independently of one another a substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl and alkinyl group having 1 to 10 carbon atoms.

Description

Mittel und Verfahren zur Alkylierung Means and process for alkylation

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Mittel und Verfahren zur Alkylierung. The present invention relates to means and processes for alkylation.

Die Bildung von C-0 Bindungen zum Aufbau von Ester und Ether, die Bildung von C-N Bindungen zum Aufbau von sekundären und tertiären Aminen und Amiden, die Bildung von C-S Bindungen zum Aufbau von Thioether und Sulfoniumverbindungen und die Bildung von C-C Bindungen zur Kettenverlängerung von aliphatischen Substanzen und Alkylierung von aromatischen Verbindungen (Friedel-Crafts Reaktion) finden breite Anwendung in der Synthese organischer Verbindungen. Gängige The formation of C-O bonds for the formation of esters and ethers, the formation of CN bonds for the formation of secondary and tertiary amines and amides, the formation of CS bonds for the formation of thioethers and sulfonium compounds and the formation of C-C bonds for the chain extension of aliphatic Substances and alkylation of aromatic compounds (Friedel-Crafts reaction) are widely used in the synthesis of organic compounds. common

Alkylierungsmittel zur Durchführung der oben beschriebenen Umsetzungen sind Alkylhalogenide und - sulfonate, die hoch giftig sind. Sehr oft sind aggressive Bedingungen für die Umsetzung nötig und die Umsetzungen verlaufen unselektiv. Das Ergebnis ist eine Produktmischung, welche die Ausbeute am gewünschten Produkt verringert. Isolierung und Reinigung vom Produkt benötigt teure Alkylating agents for carrying out the above-described reactions are alkyl halides and sulfonates which are highly toxic. Very often, aggressive conditions are required for the implementation and the implementation is unselective. The result is a product mixture which reduces the yield of the desired product. Isolation and cleaning of the product requires expensive

Trennungsschritte und erhöht die anfallende Abfallmenge. Separation steps and increases the amount of waste produced.

Daher sind alternative Methoden zur Alkylierung unter umweltverträglichen Prozessen Therefore, alternative methods of alkylation are environmentally friendly processes

wünschenswert. Enzymatische Methoden erfüllen in der Regel diese Ansprüche. Methyltransferasen sind Enzyme, die Alkylierungsreaktionen durchführen. Diese Enzyme benötigen Cofaktoren. desirable. Enzymatic methods usually meet these requirements. Methyltransferases are enzymes that perform alkylation reactions. These enzymes need cofactors.

S-Adenosyl-L-methionin (SAM) ist einer der meist verwendeten Cofaktoren in der Natur und ist unter den SAM-abhängigen Methyltransferasen hoch konserviert. Mehr als 150 Reaktionen sind bekannt, die von SAM-abhängigen Methyltransferasen katalysiert werden. Die Enzyme werden betreffend ihre Substrate klassifiziert. Diese sind niedermolekulare Verbindungen („kleine Moleküle";„small molecules"), Proteine, Nukleinsäuren und Polysaccharide. Die Zielatome in diesen Molekülen sind Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Halogen. Kürzlich wurde berichtet, dass zwei Enzyme neben SAM auch analoge Verbindungen akzeptieren, in denen die Methylgruppe von SAM durch Alkenyl-, Alkinyl- und Benzylreste ersetzt wurde (Stecher H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. S-adenosyl-L-methionine (SAM) is one of the most commonly used cofactors in nature and highly conserved among SAM-dependent methyltransferases. More than 150 reactions are known to be catalyzed by SAM-dependent methyltransferases. The enzymes are classified according to their substrates. These are low molecular weight compounds ("small molecules"), proteins, nucleic acids and polysaccharides. The target atoms in these molecules are carbon, oxygen, nitrogen, sulfur or halogen. Recently, it has been reported that two enzymes besides SAM also accept analogous compounds in which the methyl group of SAM has been replaced by alkenyl, alkynyl and benzyl residues (Stecher H. et al., Angew Chem. Int. Ed.

48(2009):9546-9548). Nichtsdestotrotz sind sowohl SAM als auch seine analogen Verbindungen sehr teuer. Daher können solche Cofaktoren nicht zur Etablierung von ökonomischen Prozessen, zur Alkylierung von großen Substratmengen verwendet werden. 48 (2009): 9546-9548). Nevertheless, both SAM and its analog connections are very expensive. Therefore, such cofactors can not be used to establish economic processes, to alkylate large amounts of substrate.

Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung Methoden und Mittel zur Alkylierung von niedermolekularen Verbindungen („kleinen Molekülen";„small molecules") bereit zu stellen, die nukleophile Zentren enthalten. Diese Methoden und Mittel sollen die Nachteile der bekannten Methoden ausräumen. Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Transfer einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe auf eine niedermolekulare Verbindung („small molecule") mit einem nukleophilen Zentrum umfassend den Schritt des Kontaktierens der Verbindung mit einer S- Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängigen Methyltransferase in Anwesenheit eines alkylierten It is an object of the present invention to provide methods and means for the alkylation of low molecular weight compounds ("small molecules") containing nucleophilic centers. These methods and means are intended to overcome the disadvantages of the known methods. Therefore, the present invention relates to a process for the transfer of an alkyl, alkenyl or alkynyl group to a small molecule having a nucleophilic center comprising the step of contacting the compound with an S-adenosyl-L-methionine ( SAM) -dependent methyltransferase in the presence of an alkylated

Sulfoniumsalzes mit der allgemeinen Formel (I)

Sulfonium salt of the general formula (I)

oder eines alkylierten Sulfoxoniumsalzes mit der allgemeinen Formel (II) or an alkylated sulfoxonium salt having the general formula (II)

ö 1 2 3

wobei X ein organisches oder anorganisches Anion ist und R , R und R jeweils unabhängig voneinander eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyl- und Alkinyigruppe umfassend 1 bis 10 Kohlenstoffatome ist. wherein X is an organic or inorganic anion and R, R and R are each independently a substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl and alkynyl group containing from 1 to 10 carbon atoms.

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass einfache Alkylsulfonium- und It has surprisingly been found that simple alkylsulfonium and

Alkylsulfoxoiniumsalze, wie oben dargestellt, in der Lage sind, für enzymatische Reaktionen, in denen Methyltransferasen involviert sind, als Cofaktoren zu wirken. Dies erlaubt die Etablierung von enzymatischen Methoden zur Alkylierung, die SAM als Cofaktor nicht benötigen. Alkyl sulfoxonium salts, as indicated above, are capable of acting as cofactors for enzymatic reactions involving methyltransferases. This allows the establishment of enzymatic alkylation methods that do not require SAM as a cofactor.

Die Effizienz von enzymatischen Reaktionen hängt nicht nur von den verwendeten Enzymen, The efficiency of enzymatic reactions depends not only on the enzymes used,

Substraten und Cofaktoren ab, sondern auch von den Reaktionsbedingungen, unter denen die Reaktionen durchgeführt wurden. Daher wird bevorzugt, dass die Methode entsprechend der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur durchgeführt wird, bei der die verwendete Substrates and cofactors, but also on the reaction conditions under which the reactions were carried out. Therefore, it is preferred that the method according to the present invention be carried out at a temperature at which the used

Methyltransferase die höchste Reaktionsgeschwindigkeit zeigt, bevorzugt zwischen 25 und 45°C, mehr bevorzugt zwischen 30 und 35°C. Methyltransferase shows the highest reaction rate, preferably between 25 and 45 ° C, more preferably between 30 and 35 ° C.

Der Begriff„niedermolekulare Verbindung" („kleines Molekül";„small molecule"), der hier verwendet wird, bezieht sich auf eine niedermolekulare organische Verbindung mit einer niedrigen Molekülmasse (Molekülmasse kleiner oder gleich 1 kDa, bevorzugt eine Molekülmasse kleiner oder gleich 0,8 kDa), welche per Definition kein Polymer ist. Der Ausdruck„kleines Molekül" bezieht sich ebenfalls auf ein Molekül, das an einem Biopolymer, wie etwa ein Protein, Nukleinsäure, Polysaccharid oder ein Harz, gebunden ist und zusätzlich die Aktivität oder Funktion des Polymers ändern kann.„Kleine Moleküle" können vielfältige biologische Funktionen haben, wie etwa Signalmoleküle, als Instrumente in der Molekularbiologie, als Arzneimittel, als Pestizide und vieles mehr. Diese Verbindungen können natürlicher (wie z.B. Sekundärmetabolite) oder künstlicher (wie z.B. antivirale Arzneimittel) Herkunft sein. Sie können positive Effekte gegen Krankheiten (z.B. Medikamente) oder schädliche Wirkungen (z.B. Teratogene und Kanzerogene) haben. Die Zielatome im Substrat sind Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Kohlenstoff. Die nukleophilen Zentren im Substrat sind -OH, -NH₂, -NHR, -CONH₂, - CONHR, -SH, -SR und elektronenreiche Kohlenstoffatome, bevorzugt ein sp²-hybridisierter Kohlenstoff als Teil einer aliphatischen oder aromatischen Verbindung. The term "small molecule" as used herein refers to a low molecular weight, low molecular weight organic compound (molecular weight less than or equal to 1 kDa, preferably less than or equal to 0, 8 kDa), which is by definition not a polymer The term "small molecule" also refers to a molecule bound to a biopolymer, such as a protein, nucleic acid, polysaccharide or a resin, and additionally the activity or function of the "Small Molecules" can have a variety of biological functions, such as signaling molecules, as tools in molecular biology, as medicines, as pesticides, and much more. These compounds can be more natural (such as secondary metabolites) or artificial (such as antivirals). They can be positive effects against diseases (eg medicines) or harmful Effects (eg teratogens and carcinogens). The target atoms in the substrate are oxygen, nitrogen, sulfur and carbon. The nucleophilic centers in the substrate are -OH, -NH ₂ , -NHR, -CONH ₂ , -CONHR, -SH, -SR, and electron-rich carbon atoms, preferably an sp ² -hybridized carbon as part of an aliphatic or aromatic compound.

Bevorzugte Methyltransferasen sind O-Methyltransferasen, N-Methyltransferasen, S- Methyltransferasen und C-Methyltransferasen. O-Methyltransferasen katalysieren die Methylierung einer Hydroxyl (-OH)- oder Carboxyl (-COOH)- funktionalität. N-Methyltransferasen katalysieren die Methylierung von primären und sekundären Aminen (-NH₂, -NHR), Iminen (=NH) und Amiden (-CONH₂, -CONHR). S-Methyltransferasen katalysieren die Methylierung von Thiolen (-SH) und Thioether (-SR). C-Methyltransferasen transferieren die Methylgruppe auf einem elektronenreichen Kohlenstoffatom. Preferred methyltransferases are O-methyltransferases, N-methyltransferases, S-methyltransferases and C-methyltransferases. O-methyltransferases catalyze the methylation of a hydroxyl (-OH) or carboxyl (-COOH) functionality. N-methyltransferases catalyze the methylation of primary and secondary amines (-NH ₂ , -NHR), imines (= NH) and amides (-CONH ₂ , -CONHR). S-methyltransferases catalyze the methylation of thiols (-SH) and thioethers (-SR). C-methyltransferases transfer the methyl group on an electron-rich carbon atom.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppe 1 bis 8 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatome, mehr bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatome, insbesondere 1 Kohlenstoffatom. According to a preferred embodiment of the present invention, the substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl and alkynyl group comprises 1 to 8 carbon atoms, preferably 1 to 7 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, especially 1 carbon atom.

Besonders bevorzugt werden erfindungsgemäß somit substituierte oder nicht substituierte Ci bis Ci₀, vorzugsweise Ci bis C₈, mehr bevorzugt i bis C₇, noch mehr bevorzugt Ci bis C₃, insbesondere Ci, Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppen eingesetzt. Particular preference according to the invention thus substituted or unsubstituted Ci to Ci ₀ , preferably Ci to C ₈ , more preferably i to C ₇ , even more preferably Ci to C ₃ , in particular Ci, alkyl, alkenyl or alkynyl used.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehrere Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen mit mindestens einer Carboxyl-, Carbonyl- und/oder Aminogruppe substituiert sein. Eine Alkylgruppe der erfindungsgemäß eingesetzten Sulfoniumsalze kann keine Adenosylgruppe sein. According to another preferred embodiment of the present invention, one or more alkyl, alkenyl and alkynyl groups may be substituted with at least one carboxyl, carbonyl and / or amino group. An alkyl group of the sulfonium salts used according to the invention can not be an adenosyl group.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine oder mehrere der folgenden Verbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt: According to a particularly preferred embodiment of the present invention, one or more of the following compounds is used in the process according to the invention:

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung von SAM-abhängigen Methyltransferasen. Diese Gruppe von Enzymen umfasst Methyltransferasen, die für ihre The method according to the present invention involves the use of SAM-dependent methyltransferases. This group of enzymes includes methyltransferases that are responsible for their

enzymatische Aktivität SAM als Cosubstrat (Cofaktor) verwenden und/oder benötigen. Die SAM- abhängigen Methyltransferasen der vorliegenden Erfindung akzeptieren Methioninmethylsulfonium als ein Cosubstrat bzw. Cofaktor zu einem deutlich geringeren Ausmaß als SAM oder sind sogar nicht in der Lage die Methylgruppe vom Methioninmethylsulfonium zum Substrat zu transferieren. Demnach zeigen die SAM-abhängigen Methyltransferasen der vorliegenden Erfindung eine verringerte oder keine Affinität zu Methioninmethylsulfonium. Daher ist eine Methyltransferase wie Homocystein-S- methyltransferase EC 2.1.1.10, welche eine höhere Affinität zu anderen Cosubstraten als SAM zeigt, nicht als bevorzugte Methyltransferase in der Methode entsprechend der vorliegenden Erfindung zu verwenden. use enzymatic activity SAM as cosubstrate (cofactor) and / or need. The SAM-dependent methyltransferases of the present invention accept methionine methyl sulfonium as a cosubstrate or cofactor to a significantly lesser extent than SAM, or even are unable to transfer the methyl group from the methionine methyl sulfonium to the substrate. Thus, the SAM-dependent methyltransferases of the present invention show a reduced or no affinity for methionine methylsulfonium. Therefore, a methyltransferase such as homocysteine S-methyltransferase EC 2.1.1.10, which shows a higher affinity to cosubstrates other than SAM, is not to be used as a preferred methyltransferase in the method according to the present invention.

Der Km-Wert von SAM in den SAM-abhängigen Methyltransferasen, die in der Methode entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist bevorzugt kleiner als 10^"3 M, mehr bevorzugt kleiner als 10^"4 M und noch mehr bevorzugt kleiner als 10^"5 M. The Km value of SAM in the SAM-dependent methyltransferases used in the method according to the present invention is preferably less than 10 ^-3 M, more preferably less than 10 ^-4 M and even more preferably less than 10 ^-5 M.

Bevorzugte Methyltransferasen sind: EC 2.1.1.1 Nicotinamid N-Methyltransferase, EC 2.1.1.2 Preferred methyltransferases are: EC 2.1.1.1 nicotinamide N-methyltransferase, EC 2.1.1.2

Guanidinoacetat N-Methyltransferase, EC 2.1.1.4 Acetylserotonin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.6 Catechol O-Methyltransferase, EC 2.1.1.7 Nicotinat N-Methyltransferase, EC 2.1.1.8 Histamin N- Methyltransferase, EC 2.1.1.9 Thiol S-Methyltransferase, EC 2.1.1.12 Methionine S-Methyltransferase, EC 2.1.1.15 Fettsäure („fatty acid") O-Methyltransferase, EC 2.1.1.16 Methylen- Fettsäureacylphospholipid Synthase, EC 2.1.1.17 Phosphatidylethanolamin N-Methyltransferase, EC EC 2.1.1.20 Glycin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.22 Carnosin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.25 Phenol 0- Methyltransferase, EC 2.1.1.26 lodophenol O-Methyltransferase, EC 2.1.1.27 Tyramin N- Methyltransferase, EC 2.1.1.28 Phenylethanolamin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.38 0- Demethylpuromycin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.39 Inositol 3-Methyltransferase, EC 2.1.1.40 Inositol 1-Methyltransferase, EC 2.1.1.41 Sterol 24-C-Methyltransferase, EC 2.1.1.42 Luteolin 0- Methyltransferase, EC 2.1.1.44 Dimethylhistidin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.46 Isoflavon 4'-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.47 Indolepyruvat C-Methyltransferase, EC 2.1.1.49 Amin N- Methyltransferase, EC 2.1.1.50 Loganat O-Methyltransferase, EC 2.1.1.53 Putrescin N- Methyltransferase, EC 2.1.1.59 [Cytochrom cRysin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.64 3- Demethylubiquinon-9 3-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.65 Licodion 2'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.67 Thiopurin S-Methyltransferase, EC 2.1.1.68 Caffeat O-Methyltransferase, EC 2.1.1.69 5- Hydroxyfurancoumarin 5-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.70 8-Hydroxyfurancoumarin 8-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.71 Phosphatidyl-N-Methylethanolamin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.75 Apigenin 4'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.76 Quercetin 3-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.78 Isoorientin 3'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.79 Cyclopropan-Fettsäureacyl-Phospholipid Synthase, EC 2.1.1.82 3- methylquercetin 7-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.83 3,7-Dimethylquercetin 4'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.84 Methylquercetagetin 6-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.87 Pyridin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.88 8-Hydroxyquercetin 8-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.89 Tetrahydrocolumbamin 2-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.91 Isobutyraldoxim O-Methyltransferase, EC 2.1.1.94 Tabersonin 16-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.95 Tocopherol O-Methyltransferase, EC 2.1.1.96 Thioether S- Methyltransferase, EC 2.1.1.97 3-Hydroxyanthranilat 4-C-Methyltransferase, EC 2.1.1.98 Diphthin Synthase, EC 2.1.1.99 3-Hydroxy-16-Methoxy-2,3-Dihydrotabersonin N-Methyltransferase, EC Guanidinoacetate N-methyltransferase, EC 2.1.1.4 acetylserotonin O-methyltransferase, EC 2.1.1.6 catechol O-methyltransferase, EC 2.1.1.7 nicotinate N-methyltransferase, EC 2.1.1.8 histamine N- Methyltransferase, EC 2.1.1.9 thiol S-methyltransferase, EC 2.1.1.12 methionine S-methyltransferase, EC 2.1.1.15 fatty acid O-methyltransferase, EC 2.1.1.16 methylene fatty acid acylphospholipid synthase, EC 2.1.1.17 phosphatidylethanolamine N -Methyltransferase, EC EC 2.1.1.20 glycine N-methyltransferase, EC 2.1.1.22 carnosine N-methyltransferase, EC 2.1.1.25 phenol 0-methyltransferase, EC 2.1.1.26 iodophenol O-methyltransferase, EC 2.1.1.27 tyramine N-methyltransferase, EC 2.1.1.28 phenylethanolamine N-methyltransferase, EC 2.1.1.38 0-demethylpuromycin O-methyltransferase, EC 2.1.1.39 inositol 3-methyltransferase, EC 2.1.1.40 inositol 1-methyltransferase, EC 2.1.1.41 sterol 24-C-methyltransferase, EC 2.1 .1.42 luteolin 0-methyltransferase, EC 2.1.1.44 dimethylhistidine N-methyltransferase, EC 2.1.1.46 isoflavone 4'-0-methyltransferase, EC 2.1.1.47 indolepyruvate C-methyltransferase, EC 2.1.1.49 amine N-methyltransferase, EC 2.1.1.50 Loganate O-methyltransferase, EC 2.1.1.53 Putrescine N-methyltransferase, EC 2.1.1.59 [cytochrome cRysin N-methyltransferase, EC 2.1.1.64 3- demethylubiquinone-9 3-0-methyltransferase, EC 2.1.1.65 licodione 2'-O-methyltransferase, EC 2.1.1.67 thiopurine S- Methyltransferase, EC 2.1.1.68 caffeate O-methyltransferase, EC 2.1.1.69 5-hydroxyfurancoumarin 5-O-methyltransferase, EC 2.1.1.70 8-hydroxyfurancoumarin 8-0-methyltransferase, EC 2.1.1.71 phosphatidyl-N-methylethanolamine N-methyltransferase, EC 2.1.1.75 Apigenin 4'-O-methyltransferase, EC 2.1.1.76 Quercetin 3-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.78 Isoorientin 3'-O-methyltransferase, EC 2.1.1.79 Cyclopropane-fatty acid acyl phospholipid synthase, EC 2.1.1.82 3-methylquercetin 7-O-methyltransferase, EC 2.1.1.83 3,7-dimethylquercetin 4'-O-methyltransferase, EC 2.1.1.84 methylquercetagetine 6-O-methyltransferase, EC 2.1.1.87 pyridine N-methyltransferase, EC 2.1.1.88 8 -Hydroxyquercetin 8-O-methyltransferase, EC 2.1.1.89 tetrahydrocolumbamine 2-0-methyltransferase, EC 2.1.1.91 isobutyraldoxi m O-methyltransferase, EC 2.1.1.94 Tabersonine 16-0- methyltransferase, EC 2.1.1.95 tocopherol O-methyltransferase, EC 2.1.1.96 thioether S-methyltransferase, EC 2.1.1.97 3-hydroxyanthranilate 4-C-methyltransferase, EC 2.1. 1.98 Diphthin synthase, EC 2.1.1.99 3-hydroxy-16-methoxy-2,3-dihydrotabersonine N-methyltransferase, EC

2.1.1.101 Macrocin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.102 Demethylmacrocin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.103 Phosphoethanolamin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.104 Caffeoyl-CoA O-Methyltransferase, EC 2.1.1.105 N-Benzoyl-4-Hydroxyanthranilat 4-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.106 Tryptophan 2-C- Methyltransferase, EC 2.1.1.107 Uroporphyrinogen-Ill C-Methyltransferase, EC 2.1.1.108 6- Hydroxymellein O-Methyltransferase, EC 2.1.1.109 Demethylsterigmatocystin 6-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.110 Sterigmatocystin 8-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.111 Anthranilat N-Methyltransferase, EC 2.1.1.112 Glucuronoxylan 4-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.114 Polyprenyldihydroxybenzoat Methyltransferase, EC 2.1.1.115 (RS)-l-Benzyl-l,2,3,4-Tetrahydroisoquinolin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.116 3'-Hydroxy-N-Methyl-(S)-Coclaurin 4'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.117 (S)-Scoulerin 9-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.118 Columbamin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.119 10- Hydroxydihydrosanguinarin 10-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.120 12-Hydroxydihydrochelirubin 12-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.121 6-O-Methylnorlaudanosolin 5'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.122 (S)- Tetrahydroprotoberberin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.123 [Cytochrom c]-Methionin S- Methyltransferase, EC 2.1.1.124 [Cytochrom c]-Arginin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.128 (RS)- Norcoclaurin 6-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.129 Inositol 4-Methyltransferase, EC 2.1.1.130 Precorrin- 2 C20-Methyltransferase, EC 2.1.1.131 Precorrin-3B C17-Methyltransferase, EC 2.1.1.132 Precorrin-6Y C5,15-Methyltransferase (decarboxylierend), EC 2.1.1.133 Precorrin-4 Cll-Methyltransferase, EC 2.1.1.136 Chlorophenol O-Methyltransferase, EC 2.1.1.137 Arsenit Methyltransferase, EC 2.1.1.139 3'- Demethylstaurosporin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.140 (S)-Coclaurin-N-Methyltransferase, EC 2.1.1.141 Jasmonat O-Methyltransferase, EC 2.1.1.142 Cycloartenol 24-C-Methyltransferase, EC 2.1.1.143 24-Methylenesterol C-Methyltransferase, EC 2.1.1.144 Trans-Aconitat 2-Methyltransferase, EC 2.1.1.145 Trans-Aconitat 3-Methyltransferase, EC 2.1.1.146 (Iso)eugenol O-Methyltransferase, EC 2.1.1.147 Corydalin Synthase, EC 2.1.1.149 Myricetin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.150 Isoflavon 7-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.151 Cobalt-Faktor II C20-Methyltransferase, EC 2.1.1.152 Precorrin-6A Synthase (Deacetylierung), EC 2.1.1.153 Vitexin 2"-0-Rhamnosid 7-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.154 Isoliquiritigenin 2'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.155 Kaempferol 4'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.156 Glycin/Sa rcosin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.157 Sarcosin/Dimethylglycin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.158 7-Methylxanthosin Synthase, EC 2.1.1.159 Theobromin Synthase, EC 2.1.1.160 Koffein Synthase, EC 2.1.1.161 Dimethylglycin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.162 2.1.1.101 Macrocin O-methyltransferase, EC 2.1.1.102 demethylmacrocin O-methyltransferase, EC 2.1.1.103 phosphoethanolamine N-methyltransferase, EC 2.1.1.104 caffeoyl-CoA O-methyltransferase, EC 2.1.1.105 N-benzoyl-4-hydroxyanthranilate 4- O-Methyltransferase, EC 2.1.1.106 Tryptophan 2-C-methyltransferase, EC 2.1.1.107 Uroporphyrinogen-III C-methyltransferase, EC 2.1.1.108 6- Hydroxymellein O-methyltransferase, EC 2.1.1.109 Demethylsterigmatocystin 6-O-methyltransferase, EC 2.1 .1.110 Sterigmatocystin 8-O-methyltransferase, EC 2.1.1.111 anthranilate N-methyltransferase, EC 2.1.1.112 glucuronoxylan 4-O-methyltransferase, EC 2.1.1.114 polyprenyldihydroxybenzoate methyltransferase, EC 2.1.1.115 (RS) -l-benzyl-l, 2,3,4-tetrahydroisoquinoline N-methyltransferase, EC 2.1.1.116 3'-hydroxy-N-methyl- (S) -coclaurine 4'-O-methyltransferase, EC 2.1.1.117 (S) -sculperine 9-0-methyltransferase , EC 2.1.1.118 columbamine O-methyltransferase, EC 2.1.1.119 10- hydroxydihydrosanguinene in 10-O-methyltransferase, EC 2. 1.1.120 12-Hydroxydihydrochelirubin 12-0- methyltransferase, EC 2.1.1.121 6-O-Methylnorlaudanosolin 5'-0-methyltransferase, EC 2.1.1.122 (S) - Tetrahydroprotoberberin N-methyltransferase, EC 2.1.1.123 [cytochrome c] - Methionine S-methyltransferase, EC 2.1.1.124 [cytochrome c] arginine N-methyltransferase, EC 2.1.1.128 (RS) - norcoclaurine 6-O-methyltransferase, EC 2.1.1.129 inositol 4-methyltransferase, EC 2.1.1.130 precorrin-2 C20 methyltransferase, EC 2.1.1.131 precorrin-3B C17 methyltransferase, EC 2.1.1.132 precorrin-6Y C5,15-methyltransferase (decarboxylating), EC 2.1.1.133 precorrin-4 Cll methyltransferase, EC 2.1.1.136 chlorophenol O-methyltransferase , EC 2.1.1.137 arsenite methyltransferase, EC 2.1.1.139 3'- Demethylstaurosporine O-methyltransferase, EC 2.1.1.140 (S) -coclaurine N-methyltransferase, EC 2.1.1.141 jasmonate O-methyltransferase, EC 2.1.1.142 cycloartenol 24-C-methyltransferase, EC 2.1.1.143 24-methylene esterol C-methyltransferase, EC 2.1.1.144 trans-aconitate 2-methyltransferase, EC 2.1.1.145 trans-aconitate 3-methyltransferase, EC 2.1.1.146 (iso) eugenol O-methyltransferase, EC 2.1.1.147 corydaline synthase, EC 2.1.1.149 myricetin O-methyltransferase, EC 2.1.1.150 isoflavone 7-0 methyltransferase, EC 2.1.1.151 cobalt factor II C20 methyltransferase, EC 2.1.1.152 precorrin 6A synthase (deacetylation), EC 2.1.1.153 vitexin 2 "-0-rhamnoside 7-O- Methyltransferase, EC 2.1.1.154 isoliquiritigenin 2'-0-methyltransferase, EC 2.1.1.155 kaempferol 4'-0-methyltransferase, EC 2.1.1.156 glycine / sarcosine N-methyltransferase, EC 2.1.1.157 sarcosine / dimethylglycine N-methyltransferase, EC 2.1.1.158 7-Methylxanthosine Synthase, EC 2.1.1.159 Theobromine Synthase, EC 2.1.1.160 Caffeine Synthase, EC 2.1.1.161 Dimethylglycine N-methyltransferase, EC 2.1.1.162

Glycin/Sarcosin/Dimethylglycin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.163 Demethylmenaquinon Glycine / sarcosine / dimethylglycine N-methyltransferase, EC 2.1.1.163 demethylmenaquinone

Methyltransferase, EC 2.1.1.164 Demethylrebeccamycin-D-Glucose O-Methyltransferase, EC 2.1.1.165 Methyl Halide Transferase, EC 2.1.1.169 Tricetin S'^'^'-O-Trimethyltransferase, EC 2.1.1.175 Tricin Synthase, EC 2.1.1.195 Cobalt-Precorrin-5B (Cl)-Methyltransferase, EC 2.1.1.196 CobaIt-Precorrin-7 (C15)-Methyltransferase, EC 2.1.1.197 Malonyl-CoA O-Methyltransferase, und EC 2.1.1.201 2- Methoxy-6-Polyprenyl-l,4-Benzoquinol Methylase. Methyltransferase, EC 2.1.1.164 Demethylrebeccamycin D-Glucose O-Methyltransferase, EC 2.1.1.165 Methyl Halide Transferase, EC 2.1.1.169 Tricetin S '^' ^ 'O-Trimethyltransferase, EC 2.1.1.175 Tricine Synthase, EC 2.1.1.195 Cobalt Precorrin 5B (Cl) -Methyltransferase, EC 2.1.1.196 Cobalt Precorrin-7 (C15) -Methyltransferase, EC 2.1.1.197 Malonyl CoA O-Methyltransferase, and EC 2.1.1.201 2-Methoxy-6-Polyprenyl- 1,4-benzoquinol methylase.

Die Substrate („kleine Moleküle") und Cosubstrate aller hier erwähnten Methyltransferasen sind bekannt. Jedoch kann die Methode der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um auch andere Substrate (andere„kleine Moleküle") zu alkylieren, alkenylieren und alkinylieren. Methoden zur Identifizierung solcher Substrate sind im Stand der Technik bekannt und umfassen die Untersuchung, ob ein potentieller Substrat entsprechend der vorliegenden Erfindung durch Inkubation von The substrates ("small molecules") and cosubstrates of all of the methyltransferases mentioned herein are known, however, the method of the present invention can be used to alkylate, alkenylate, and alkynylate other substrates (other "small molecules"). Methods for the identification of such substrates are known in the art and include the investigation of whether a potential substrate according to the present invention is obtained by incubation of

Methyltransferase und entsprechendem Cosubstrat modifiziert wurde. Methyltransferase and corresponding Cosubstrat was modified.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das organische oder anorganische Anion aus der Gruppe von Halogeniden und Sulfonaten ausgewählt. According to a preferred embodiment of the present invention, the organic or inorganic anion is selected from the group of halides and sulfonates.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind das alkylierte Sulfoniumsalz mit der allgemeinen Formel (I) und das alkylierte Sulfoxoniumsalz mit der allgemeinen Formel (II) in einem Verhältnis Cosubstrat zu Substrat von 10:1 bis 200:1, bevorzugt von 15:1 bis 150:1, mehr bevorzugt von 20:1 bis 125:1, im Besonderen von 25:1 bis 100:1 der Reaktionsmischung zugesetzt worden. Zum Beispiel, wenn in der Reaktionsmischung das Substrat in einer Konzentration von 0,5 bis 2 mM, vorzugsweise 1 mM, vorliegt, liegt das Cosubstrat gemäß den allgemeinen Formeln (I) und (II) entsprechend der vorliegenden Erfindung in einer Konzentration von 12 bis 200 mM, vorzugsweise 25 bis 100 mM, vor. In a particularly preferred embodiment of the present invention, the alkylated sulfonium salt having the general formula (I) and the alkylated sulfoxonium salt having the general formula (II) in a co-substrate to substrate ratio of 10: 1 to 200: 1, preferably 15: 1 to 150: 1, more preferably from 20: 1 to 125: 1, especially from 25: 1 to 100: 1, has been added to the reaction mixture. For example, in the reaction mixture, when the substrate is in a concentration of 0.5 to 2 mM, preferably 1 mM, the cosubstrate according to the general formulas (I) and (II) according to the present invention is in a concentration of 12 to 200mM, preferably 25 to 100mM.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Methyltransferasen, die in der Methode entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet werden, recombinant hergestellt worden. Außerdem ist es im Besonderen bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren nicht-gereinigte oder im Wesentlichen nicht-gereinigte SAM-abhängige Methyltransferasen zu verwenden. Das bedeutet, dass in der Methode der vorliegenden Erfindung ein Rohlysat eines According to a preferred embodiment of the present invention, the methyltransferases used in the method according to the present invention have been produced recombinantly. In addition, it is particularly preferred to use non-purified or substantially non-purified SAM-dependent methyltransferases in the process according to the invention. That is, in the method of the present invention, a crude lysate of a

Kulturmediums, das Zellen umfasst, die in der Lage sind SAM-abhängige Methyltransferasen zu produzieren, verwendet werden kann. Alternativ dazu ist es auch möglich den Überstand der aufgebrochenen Zellen, welche SAM-abhängige Methyltransferasen produzieren, zu verwenden. Culture medium comprising cells capable of SAM-dependent methyltransferases produce, can be used. Alternatively, it is also possible to use the supernatant of the disrupted cells which produce SAM-dependent methyltransferases.

In dem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel sind gefrorene und aufgetaute oder In the particularly preferred embodiment are frozen and thawed or

aufgebrochene rekombinante Zellen, die SAM-abhängige Methyltransferasen überexperimieren, für Methylierung von Substraten verwendet worden. disrupted recombinant cells overexperimating SAM-dependent methyltransferases have been used for methylation of substrates.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Kit zum Transfer einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe auf ein Substrat umfassend eine S-Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängige Methyltransferase und ein alkyliertes Sulfoniumsalz mit der allgemeinen Formel (I) Another aspect of the present invention relates to a kit for transferring an alkyl, alkenyl or alkynyl group to a substrate comprising an S-adenosyl-L-methionine (SAM) -dependent methyltransferase and an alkylated sulfonium salt having the general formula (I)

Θ Θ

i i

0 0

R^{3 ' S ^}R² x (i) oder Sulfoxomiumsalz mit der allgemeinen Formel (II) R ^{3 'S ^} R ² x (i) or sulfoxomium salt having the general formula (II)

© ©

R¹ R ¹

i i

R²-S=0 R ² -S = 0

i 0 i 0

x OD wobei R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppe umfassend 1 bis 10 Kohlenstoffatome ist. Die vorliegende Erfindung ist weiterhin mit folgenden Figuren und Beispielen illustriert, jedoch ohne auf diese eingeschränkt zu sein. x OD wherein R ¹ , R ² and R ^{3 are} each independently a substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl and alkynyl group comprising 1 to 10 carbon atoms. The present invention is further illustrated with the following figures and examples, but without being limited thereto.

Figur 1 zeigt S-Adenosyl-L-methionin (SAM), S-Adenosyl-L-homocystein (SAH) und SAM-Analogen. Es ist gezeigt worden, dass DNA-Methyltransferasen auch nicht natürliche Cofaktoren (SAM-Analogen) akzeptieren und sequenzspezifische DNA-Alkylierung wurde bei Verwendung von S-Adenosyl-L- homocystein-Derivaten beobachtet. In allen bekannten und publizierten Ergebnissen bleibt der Adenosylteil des Cofaktors unangetastet und kann mit dem Enzym in Wechselwirkung treten. Figure 1 shows S-adenosyl-L-methionine (SAM), S-adenosyl-L-homocysteine (SAH) and SAM analogues. It has also been shown that DNA methyltransferases also accept non-natural cofactors (SAM analogs) and sequence-specific DNA alkylation was observed using S-adenosyl-L-homocysteine derivatives. In all known and published results, the adenosyl part of the cofactor remains untouched and can interact with the enzyme.

Figur 2 zeigt schwefelhaltige Salze, die als mögliche Methyldonoren für CouO und NovO getestet wurden. Trimethylsulfonium 1 und Trimethylsulfoxonium 2 wurden als lodide eingesetzt, Figure 2 shows sulfur containing salts tested as possible methyl donors for CouO and NovO. Trimethylsulfonium 1 and trimethylsulfoxonium 2 were used as iodides,

Methioninmethylsulfonium 3 als Chlorid. Methionine methyl sulfonium 3 as chloride.

Figur 3 zeigt die Synthese der Substrate für CouO und NovO: a) Ac₂0 (Essigsäureanhydrid), Pyridin, DMAP (4-Dimethylaminopyridin), Raumtemperatur (rt), 24h, 93%. b) SOCI₂, CH₂CI₂, Rückfluss, 5h. c) KOH, MeOH, rt, 3h, 73%. d) Et₃N, MgCI₂, THF, 2h bei 0°C, 16h bei rt, 73%. e) wässr. NaOH, MeOH, rt, 16h, 92%. f) IN HCl, MeOH, rt, 24h, 67%. g) Pyrrol-2-carbonsäure, PyBOP ((Benzotriazol-1- yloxy)tripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate), NMM (N-Methylmorpholin), DMF, rt, Ar- Atmosphäre, 48h, 78%. h) PhCOCI, Pyridin, DMF, rt, 24h. i) 3N NaOH/MeOH 1:1, rt, 72h. (h+i > 99%). Figure 3 shows the synthesis of the substrates for CouO and NovO: a) Ac ₂ O (acetic anhydride), pyridine, DMAP (4-dimethylaminopyridine), room temperature (rt), 24h, 93%. b) SOCl _2, CH ₂ Cl _2, reflux, 5h. c) KOH, MeOH, rt, 3h, 73%. d) Et ₃ N, MgCl ₂ , THF, 2h at 0 ° C, 16h at rt, 73%. e) aq. NaOH, MeOH, rt, 16h, 92%. f) IN HCl, MeOH, rt, 24h, 67%. g) Pyrrole-2-carboxylic acid, PyBOP ((benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate), NMM (N-methylmorpholine), DMF, rt, Ar atmosphere, 48h, 78%. h) PhCOCl, pyridine, DMF, rt, 24h. i) 3N NaOH / MeOH 1: 1, rt, 72h. (h + i> 99%).

Figur 4 zeigt die Methylierung von Coumarinbenzamid 4a katalysiert durch CouO bei unterschiedlichen Konzentrationen der Sulfonium- und Sulfoxoniumsalze. Me₃S Trimethylsulfoniumiodid; Me₃S=0 Trimethylsulfoxoniumiodid; MeMet DL-Methioninmethylsulfoniumchlorid Figur 5 zeigt die Methylierung von Coumarinbenzamid 4a katalysiert durch NovO bei unterschiedlichen Konzentrationen der Sulfonium- und Sulfoxoniumsalze. Me₃S Trimethylsulfoniumiodid; Me₃S=0 Trimethylsulfoxoniumiodid; MeMet DL-Methioninmethylsulfoniumchlorid Figure 4 shows the methylation of coumarin benzamide 4a catalyzed by CouO at different concentrations of the sulfonium and sulfoxonium salts. Me ₃ S trimethylsulfonium iodide; Me ₃ S = 0 trimethylsulfoxonium iodide; MeMet DL-methionine methylsulfonium chloride Figure 5 shows the methylation of coumarin benzamide 4a catalyzed by NovO at different concentrations of the sulfonium and sulfoxonium salts. Me ₃ S trimethylsulfonium iodide; Me ₃ S = 0 trimethylsulfoxonium iodide; MeMet DL-methionine methylsulfonium chloride

Figur 6 zeigt den Einfluss des Zusatzes von SAH zu den Reaktionsmischungen. Konzentrationen an Me₃S⁺r und Me₃SO⁺l^" sind jeweils 25 mM, Konzentration an Methioninmethylsulfoniumchlorid ist 100 mM. Me₃S Trimethylsulfoniumiodid; Me₃S=0 Trimethylsulfoxoniumiodid; MeMet DL- Methioninmethylsulfoniumchlorid Figure 6 shows the influence of the addition of SAH to the reaction mixtures. Concentrations of Me ₃ S ⁺ r and Me ₃ SO ⁺ l ^" are each 25 mM, concentration of methionine methyl sulfonium chloride is 100 mM, Me ₃ S trimethylsulfonium iodide, Me ₃ S = 0 trimethylsulfoxonium iodide, MeMet DL-methionine methylsulfonium chloride

Beispiele Examples

Zwei S-Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängige C-Methyltransferasen aus Streptomyces rishiriensis (CouO) und Streptomyces spheroides (NovO) wurden geklont und in E. coli überexprimiert. Die Methyltransferasen CouO und NovO sind an der Biosynthese der Aminocoumarinantibiotika Two S-adenosyl-L-methionine (SAM) -dependent C-methyltransferases from Streptomyces rishiriensis (CouO) and Streptomyces spheroides (NovO) were cloned and overexpressed in E. coli. The methyltransferases CouO and NovO are involved in the biosynthesis of aminocoumarin antibiotics

Coumermycin AI in Streptomyces rishiriensis und Novobiocin in Streptomyces spheroides, beteiligt. Coumermycin AI in Streptomyces rishiriensis and novobiocin in Streptomyces spheroides.

Aminocoumarine bilden einen Teil der Antibiotikamoleküle, die in den bereits vorhin erwähnten Stämmen produziert werden. Der Aminocoumarinteil ist das Substrat für den Methyltransfer vom natürlichen Cofaktor SAM. Aminocoumarins form part of the antibiotic molecules that are produced in the previously mentioned strains. The aminocoumarin part is the substrate for methyl transfer from the natural cofactor SAM.

Die SAM-abhängige Methyltransferase, die an der Biosynthese des Antibiotikums Novobiocin beteiligt ist, wurde 1960 entdeckt. Der gesamte Gen-Cluster zur Biosynthese von Coumermycin AI in SAM-dependent methyltransferase, involved in the biosynthesis of the antibiotic novobiocin, was discovered in 1960. The entire gene cluster for the biosynthesis of coumermycin AI in

Streptomyces rishiriensis und das Gen CouO, das für die Methyltransferase kodiert, sind bereits intensiv untersucht worden, ebenfalls der Gen-Cluster der Novobiocinsynthese in Streptomyces spheroides. Diese Methyltransferasen katalysieren den Transfer des Methylrestes vom SAM selektiv auf die Position 8 des Coumarinringes. Hier wurden zum ersten Mal Methylsulfonium- und Streptomyces rishiriensis and the gene CouO coding for methyltransferase have been extensively studied, as has the gene cluster of novobiocin synthesis in Streptomyces spheroides. These methyltransferases catalyze the transfer of the methyl residue from SAM selectively to position 8 of the coumarin ring. This was the first time methylsulfonium and

Methylsulfoxoniumsalze (Figur 2) gezeigt, die sich in einer von SAM-abhängigen Methyltransferase katalysierten Methylierung als vorteilhaft erwiesen. Experimenteller Teil Methylsulfoxonium salts (Figure 2), which proved to be advantageous in a SAM-dependent methyltransferase catalyzed methylation. Experimental part

1.1. Materialien 1.1. materials

1.1.1. Klonierung und Expression 1.1.1. Cloning and expression

Für die Klonierung und der heterologen Expression der Methyltransferasen-kodierenden Gene NovO und CouO wurde das genomische DNA der Stämme Streptomyces spheroides (DSMZ 40292) und Streptomyces rishiriensis (DSMZ 40489) entsprechend des Protokolls von Kieser et al. (Practical Streptomyces Genetics (Eds.: T. Kieser, et al.), The John Innes Foundation, Norwich, 2000) isoliert. Die Gene wurden nach Standard PCR-Konditionen amplifiziert, wobei der Vorwärtsprimer 5'- AATCTG CATATG AAG ATTG AACCG ATTAC-3' und der Rückwärtsprimer 5'- TAGGTAAAGCTTTCAGGCAGCGGCCCGACGGG-3' verwendet wurden. Diese Primer führten jeweils die Restriktionsstellen Ndel und Hindill (siehe unterstrichenen Teil des Primers) für die anschließende Klonierung in den Expressionsvektor pET26b(+) ein. Die PCR-Produkte wurden am Gel gereinigt, mit Ndel und Hindlll verdaut und in den linearisierten pET26b(+)-Vektor ligiert. Die Verwendung dieser Primer für beide Gene hatte zwei Aminosäureaustausche im Falle von ovO (A5P und S223C) zur Folge. For the cloning and the heterologous expression of the methyltransferase-encoding genes NovO and CouO, the genomic DNA of the strains Streptomyces spheroides (DSMZ 40292) and Streptomyces rishiriensis (DSMZ 40489) was used according to the protocol of Kieser et al. (Practical Streptomyces Genetics (Eds .: T. Kieser, et al.), The John Innes Foundation, Norwich, 2000). Genes were amplified according to standard PCR conditions using the forward primer 5'-AATCTG CATATG AAG ATTG AACCG ATTAC-3 'and the reverse primer 5'- TAGGTAAAGCTTTCAGGCAGCGGCCCGACGGG-3 'were used. These primers each introduced the restriction sites Ndel and Hindill (see underlined part of the primer) for subsequent cloning into the expression vector pET26b (+). The PCR products were gel purified, digested with Ndel and HindIII, and ligated into the linearized pET26b (+) vector. The use of these primers for both genes resulted in two amino acid changes in the case of ovO (A5P and S223C).

Die Expressionskonstrukte pET26b(+)-CouO und pET26b(+)-NovO wurden jeweils in elektrokompetente E. coli BL21Gold(DE3)-Zellen zwecks Proteinexpression transformiert. Transformanten mit den gewünschten Konstrukten wurden bei 30°C in LB Medium, das mit 40 g/ml Kanamycin ergänzt wurde, zu einer OD₆oo von 0,8 kultiviert. Anschließend wurde die Temperatur auf 25°C herabgesetzt und mit 100 mM Endkonzentration an Isopropyl-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Das Wachstum wurde für 16h bei 25°C fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (10 Minuten bei 4000 xg) geerntet, in Puffer A (50 mM Na-phosphatpuffer pH 7 (6,5 für NovO) resuspendiert und durch The expression constructs pET26b (+) - CouO and pET26b (+) - NovO were each transformed into electrocompetent E. coli BL21Gold (DE3) cells for protein expression. Transformants with the desired constructs were cultured at 30 ° C in LB medium supplemented with 40 g / ml kanamycin to an OD ₆ oo of 0.8. Subsequently, the temperature was lowered to 25 ° C and induced with 100 mM final concentration of isopropyl D-thiogalactopyranoside (IPTG). Growth continued for 16h at 25 ° C. The cells were harvested by centrifugation (10 minutes at 4000 xg), resuspended in Buffer A (50 mM Na phosphate buffer pH 7 (6.5 for NovO), and passed through

Ultraschall für 6 Minuten aufgeschlossen. Die unlöslichen Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugieren (60 Minuten bei 50000 xg) abgetrennt und entfernt. Der Überstand wurde über SDS-PAGE analysiert und für enzymatische Umsetzungen bei 4°C gelagert. Der unlösliche Zellkuchen wurde in Puffer A resuspendiert und ebenfalls am SDS-PAGE analysiert. Ultrasound unlocked for 6 minutes. The insoluble cell debris was separated by centrifugation (50,000 xg for 60 minutes) and removed. The supernatant was analyzed by SDS-PAGE and stored for enzymatic reactions at 4 ° C. The insoluble cell cake was resuspended in buffer A and also analyzed on SDS-PAGE.

1.1.2. Synthese von Aminocoumarin-Modellsubstraten 1.1.2. Synthesis of Aminocoumarin Model Substrates

2,4-Diacetoxybenzoesäure 2,4-diacetoxybenzoic

Unter Rühren und lichtgeschützt wurde zu einer Lösung von 5,0 g 2,4-Dihydroxybenzoesäure (32,4 mmol, 1 Eq.) in 30 mL Pyridin, 15,3 mL Essigsäureanhydrid (16,6 g, 162 mmol, 5 Eq.) und 0,40 g DMAP (3,24 mmol, 0,1 Eq.) zugesetzt. Nach 24h wurde Eis zur Reaktionslösung zugesetzt. Mit wässrigem 3N HCl wurde die Lösung angesäuert. Die resultierende Suspension wurde 3x mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und anschließend mit wasserfreiem Na₂S0₄ getrocknet. Die Lösung wurde auf ca. 15 mL While stirring and protected from light, to a solution of 5.0 g of 2,4-dihydroxybenzoic acid (32.4 mmol, 1 eq.) In 30 mL of pyridine, 15.3 mL of acetic anhydride (16.6 g, 162 mmol, 5 eq. ) and 0.40 g of DMAP (3.24 mmol, 0.1 eq.). After 24 hours, ice was added to the reaction solution. The solution was acidified with aqueous 3N HCl. The resulting suspension was extracted 3x with ethyl acetate. The combined organic phases were washed once with saturated NaCl solution and then dried with anhydrous Na ₂ S0 ₄ . The solution was adjusted to ca. 15 mL

aufkonzentriert und durch Stehenlassen kristallisierte das Produkt aus. Das abfiltrierte Produkt wurde über CaCI₂ getrocknet. Eine zweite Produktcharge fiel aus der Mutterlauge aus. Insgesamt wurden 7,2 g (93%) creme-weiße Kristalle gesammelt. *H NMR (300MHz, DMSO-d6) δ ppm: 13,12 (br, 1H, -COOH), 7,98 (d, J = 8,6Hz, 1H, -CHar-), 7,18 (dd, Jl = 8,6, J2 = 2,3Hz, 1H, - CHar-), 7,09 (d, J = 2,2Hz, 1H, -CHar-), 2,29 (s, 3H, -CH3), 2,25 (s, 3H, -CH3). ¹³C (75MHz) 6 ppm: 169,0, 168,6, 165,0, 154,0, 151,1, 132,5, 121,6, 119,7, 117,6, 20,8, 20,8. concentrated and left to stand to crystallize the product. The filtered product was dried over CaCl ₂ . A second batch of product precipitated from the mother liquor. In total, 7.2 g (93%) of cream-white crystals were collected. * H NMR (300MHz, DMSO-d6) δ ppm: 13.12 (br, 1H, -COOH), 7.98 (d, J = 8.6Hz, 1H, -CHar-), 7.18 (dd, Jl = 8.6, J2 = 2.3Hz, 1H, - CHar-), 7.09 (d, J = 2.2Hz, 1H, -CHar-), 2.29 (s, 3H, -CH3), 2.25 (s, 3H, -CH3). ¹³ C (75 MHz) 6 ppm: 169.0, 168.6, 165.0, 154.0, 151.1, 132.5, 121.6, 119.7, 117.6, 20.8, 20, 8th.

2, 4-Diacetoxybenzoylchlorid 2,4-diacetoxybenzoyl chloride

2,0 g 2,4-Diacetoxybenzoesäure (8,4 mmol, 1 Eq.) wurde in 20 mL CH₂CI₂ gelöst. 12 mL SOCI₂ (20 g, 165 mmol, 20 Eq.) wurde der gerührten Lösung zugesetzt. Die Mischung wurde für 5h auf Rückfluss erhitzt, danach wurden CH₂CI₂ und SOCI₂ abdestilliert. Der resultierende braune Feststoff wurde für die nächste Stufe ohne weitere Charakterisierung eingesetzt. 2.0 g of 2,4-diacetoxybenzoic acid (8.4 mmol, 1 eq.) Was dissolved in 20 mL of CH ₂ Cl ₂ . 12 mL of SOCl ₂ (20 g, 165 mmol, 20 eq.) Was added to the stirred solution. The mixture was heated for 5h to reflux, then CH ₂ CI ₂ and SOCl ₂ was distilled off. The resulting brown solid was used for the next step without further characterization.

2-(Tert-butoxycarbonylamino)-3-ethoxy-3-oxopropansäure Zu einer Suspension von 4,49 g KOH (80 mmol, 1 Eq.) in 100 mL EtOH wurde 20,4 mL Diethyl 2-(Tert- butyloxycarbonylamino)propandisäureester (22,0 g, 80 mmol, 1 Eq.) zugesetzt. Die Mischung wurde für 3h gerührt und anschließend ca. 90% des Lösungsmittels entfernt. 150 mL einer IM wässrigen NaHC0₃-Lösung wurde zugesetzt und 2x mit Ethylacetat gewaschen, um das nicht-reagierte Edukt zu entfernen. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt, mit KHS0₄ angesäuert und 3x mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über Na₂S0₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck (Badtemperatur 20°C) abgezogen. Das verbleibende Öl wurde unter Vakuum getrocknet. Das Produkt ist ein weißes Pulver und betrug 14,45 g (73%). ^XH NMR (500MHz, CDCI₃) δ ppm: 7,73 (d, J = 4,4Hz, 0,6H, -NH-), 5,65 (d, J = 6,8Hz, 0,4H, -NH-), 4,98 (d, J = 7,3Hz, 0,4H, -CH-), 4,77 (d, J = 4,9Hz, 0,6H, -CH-), 4,23-4,31 (m, 2H, -CH2- ), 1,42 (s, 9H, 3 -CH3), 1,31 (t, J = 7,3Hz, 3H, -CH3). ¹³C (125MHz) 6 ppm: 168,5, 166,9, 156,4, 83,0, 63,0, 58,9, 28,3, 14,3. 2- (tert-butoxycarbonylamino) -3-ethoxy-3-oxopropanoic acid To a suspension of 4.49 g KOH (80 mmol, 1 eq.) In 100 mL EtOH was added 20.4 mL diethyl 2- (tert-butyloxycarbonylamino) propanedioic acid ester (22.0 g, 80 mmol, 1 eq.). The mixture was stirred for 3 h and then removed about 90% of the solvent. 150 mL of an aqueous NaHCO ₃ solution was added and washed 2x with ethyl acetate to remove the unreacted starting material. The solution was cooled to 0 ° C, acidified with KHSO ₄ and extracted 3x with ethyl acetate. The combined organic phases were washed once with saturated NaCl solution and dried over Na ₂ S0 ₄ . The solvent was removed under reduced pressure (bath temperature 20 ° C). The remaining oil was dried under vacuum. The product is a white powder and was 14.45 g (73%). ^X H NMR (500MHz, CDCl ₃ ) δ ppm: 7.73 (d, J = 4.4Hz, 0.6H, -NH-), 5.65 (d, J = 6.8Hz, 0.4H, - NH-), 4.98 (d, J = 7.3Hz, 0.4H, -CH-), 4.77 (d, J = 4.9Hz, 0.6H, -CH-), 4.23- 4.31 (m, 2H, -CH 2 -), 1.42 (s, 9H, 3 -CH 3), 1.31 (t, J = 7.3Hz, 3H, -CH 3). ¹³ C (125MHz) 6 ppm: 168.5, 166.9, 156.4, 83.0, 63.0, 58.9, 28.3, 14.3.

4-(2-(Tert-butoxycarbonylamino)-3-ethoxy-3-oxopropanoyl)-l,3-phenylendiacetat 4- (2- (tert-butoxycarbonylamino) -3-ethoxy-3-oxopropanoyl) -l, 3-phenylendiacetat

Zu einer eisgekühlten Lösung von 2-(Tert-butyloxycarbonylamino)-3-ethoxy-3-oxopropansäure (2,91 g, 11,8 mmol, 1,4 Eq.) in trockenem THF (30 mL) wurden 7,4 mL Triethylamin (5,36 g, 52,8 mmol, 6,3 Eq.) und 2,69 g MgCI₂ (28,3 mmol, 3,4 Eq.) zugesetzt und die resultierende Suspension für 2h stark gerührt. Die Rohsubstanz 2,4-Diacetoxybenzoylchlorid (theoretische Menge 8,4 mmol, 1 Eq.) in 50 mL trockenem THF wurde der Lösung zugesetzt und die resultierende Suspension über Nacht bei To an ice-cooled solution of 2- (tert-butyloxycarbonylamino) -3-ethoxy-3-oxo-propanoic acid (2.91 g, 11.8 mmol, 1.4 eq.) In dry THF (30 mL) was added 7.4 mL of triethylamine (5.36 g, 52.8 mmol, 6.3 eq.) And 2.69 g MgCl ₂ (28.3 mmol, 3.4 eq.) Were added and the resulting suspension stirred vigorously for ₂ h. The crude 2,4-diacetoxybenzoyl chloride (theoretical amount 8.4 mmol, 1 eq.) In 50 mL dry THF was added to the solution and the resulting suspension was added overnight

Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter wässriger NH₄CI-Lösung gequencht, bis sich eine klare Lösung bildete. Die Lösung wurde 3x mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na₂S0₄ getrocknet. Nach Abziehen des Lösungsmittels blieb 4,31 g (121%) eines dunkelbraunen Öls, welches ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe eingesetzt wurde. Room temperature stirred. The reaction was quenched with saturated aqueous NH ₄ Cl solution until a clear solution formed. The solution was extracted 3x with ethyl acetate. The combined organic phases were dried over Na ₂ S0 ₄ . After removal of the solvent remained 4.31 g (121%) of a dark brown oil, which was used without further purification for the next stage.

Tert-butyl 4,7-dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-ylcarbamat 4 Tert-butyl 4,7-dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-ylcarbamate 4

Die Rohsubstanz 4-(2-(Tert-butyloxycarbonylamino)-3-ethoxy-3-oxopropanoyl)-l,3-phenylendiacetat (4,31 g) wurde in 24 mL MeOH gelöst und 30 mL 1,5 N NaOH zugesetzt. Die Lösung wurde für 3h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Lösung mit 1 N HCl auf pH 3 angesäuert und 3x mit Essigsäureethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCI- Lösung gewaschen, über Na₂S0₄ getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum abgezogen. The crude substance 4- (2- (tert-butyloxycarbonylamino) -3-ethoxy-3-oxopropanoyl) -1,3-phenylene diacetate (4.31 g) was dissolved in 24 mL MeOH and 30 mL 1.5 N NaOH added. The solution was stirred for 3 h at room temperature. The solution was then acidified to pH 3 with 1 N HCl and extracted 3x with ethyl acetate. The combined organic phases were washed with saturated NaCl solution, dried over Na ₂ S0 ₄ and the solvent removed under vacuum.

Das Rohprodukt wurde mittels Chromatographie gereinigt. Die Ausbeute betrug 1,24 g (50% über drei Stufen) eines orangen Feststoffes. H NMR (500MHz, DMSO-d6) 5 ppm: 7,78 (s, 1H, -NH-), 7,64 (d, J = 8,8Hz, 1H, -CHar-), 6,77 (dd, Jl = 8,8, J2 = 2,0Hz, 1H, -CHar-), 6,66 (d, J = 2Hz, 1H, -CHar-), 1,40 (s, 9H, - CH3). ¹³C NMR (125MHz) δ ppm: 166,4, 161,9, 161,6, 155,4, 154,1, 125,7, 113,5, 108,.7, 102,5, 100,8, 79,3, 28,9. The crude product was purified by chromatography. The yield was 1.24 g (50% over three steps) of an orange solid. H NMR (500MHz, DMSO-d6) 5ppm: 7.78 (s, 1H, -NH-), 7.64 (d, J = 8.8Hz, 1H, -CHar-), 6.77 (dd, Jl = 8.8, J2 = 2.0Hz, 1H, -CHar-), 6.66 (d, J = 2Hz, 1H, -CHar-), 1.40 (s, 9H, -CH3). ¹³ C NMR (125 MHz) δ ppm: 166.4, 161.9, 161.6, 155.4, 154.1, 125.7, 113.5, 108, .7, 102.5, 100.8, 79.3, 28.9.

3-Amino-4, 7-dihydroxy-2H-chromen-2-on hydrochlorid 3-Amino-4,7-dihydroxy-2H-chromen-2-one hydrochloride

Zu einer gekühlten Lösung von 25 mL Et₂0 und 5 mL MeOH wurde vorsichtig 4,3 mL Acetylchlorid zugesetzt. Die saure Lösung wurde zu einer gekühlten und gerührten Lösung von 1,24 g tert-butyl 4,7- dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-ylcarbamat in 25 mL Et₂0 und 5 mL MeOH (IN HCl in der Reaktionslösung) gegossen. Die Lösung wurde für weitere 24h bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet. Die Ausbeute betrug 0,52 g (53%) eines leicht braunen Feststoffes. ^XH NMR (500MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,96 (d, J = 8,8Hz, 1H, -CHar-), 6,84 (dd, Jl = 8,8Hz, J2 = 2,0Hz, 1H, -CHar-), 6,75 (d, J = 2,0Hz, 1H, -CHar-). ¹³C NMR (125MHz) δ ppm: 162,7, 161,5, 160,4, 154,2, 126,4, 113,9, 108,7, 103,0, 95,5. To a cooled solution of 25 mL Et ₂ O and 5 mL MeOH was carefully added 4.3 mL acetyl chloride. The acidic solution was added to a cooled and stirred solution of 1.24 g of tert-butyl 4,7-dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-ylcarbamate in 25 mL Et ₂ O and 5 mL MeOH (IN HCl in the Reaction solution). The solution was stirred for a further 24 h at room temperature. The precipitate was collected and dried. The yield was 0.52 g (53%) of a light brown solid. ^X H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7.96 (d, J = 8.8Hz, 1H, -CHar-), 6.84 (dd, Jl = 8.8Hz, J2 = 2.0Hz, 1H, -CHar-), 6.75 (d, J = 2.0Hz, 1H, -CHar-). ¹³ C NMR (125MHz) δ ppm: 162.7, 161.5, 160.4, 154.2, 126.4, 113.9, 108.7, 103.0, 95.5.

N-(4, 7-Dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl)benzamid 4a N- (4,7-Dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl) benzamide 4a

Zu einer gerührten Lösung von 200 mg 3-Amino-4,7-ihydroxy-2H-chromen-2-on hydrochlorid (0,87 mmol, 1 Eq.) in 10 mL Ethylacetat wurden 0,51 mL Benzoylchlorid (0,61 g, 4,4 mmol, 5 Eq.) und 1,22 mL Triethylamin (0,88 g, 8,7 mmol, 10 Eq.) zugesetzt. Die Suspension wurde über Nacht bei To a stirred solution of 200 mg of 3-amino-4,7-ihydroxy-2H-chromen-2-one hydrochloride (0.87 mmol, 1 eq.) In 10 mL of ethyl acetate was added 0.51 mL of benzoyl chloride (0.61 g , 4.4 mmol, 5 eq.) And 1.22 mL triethylamine (0.88 g, 8.7 mmol, 10 eq.). The suspension was added overnight

Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Niederschlag wurde abfiltriert und das Lösungsmittel einrotiert. Der verbliebene Feststoff wurde in 10 mL MeOH gelöst und 10 mL IN NaOH zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde für 24h gerührt, anschließend mit IN HCL auf pH 3 angesäuert und 3x mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen, über Na₂S0₄ getrocknet, Celite zugesetzt und das Lösungsmittel unter Vakuum abgezogen. Das feine braune Pulver wurde durch Chromatographie gereinigt. Die Ausbeute betrug 243 mg (94%) eines orangen Feststoffes. H NMR (500MHz, DSMO-d6) 5 ppm: 11,82 (s, 1H, -OH), 10,56 (s, 1H, -OH), 9,42 (s, 1H, -NH-), 8,00 (d, J = 7,3Hz, 2H, -CHar-), 7,72 (d, J = 8,8Hz, 1H, -CHar-), 7,58 (t, J = 7,3 Hz, 1H, - CHar-), 7,51 (t, J = 7,6Hz, 2H, -CHar-), 6,83 (dd, Jl = 8,8Hz, J2 = 2,0Hz, 1H, -CHar-), 6,74 (d, J = 2,4Hz, 1H, -CHar-). ¹³C (125MHz) δ ppm: 166,6, 161,4, 160,8, 160,3, 153,5, 133,9, 131,6, 128,2, 128,0, 125,0, 113,0, 107,9, 101,9, 100,1. Room temperature stirred. The precipitate was filtered off and the solvent evaporated. The remaining solid was dissolved in 10 mL MeOH and 10 mL IN NaOH added. The reaction solution was stirred for 24 h, then acidified to pH 3 with IN HCl and extracted 3x with ethyl acetate. The combined organic phases were washed with saturated NaCl solution, dried over Na ₂ S0 ₄ , added celite and the solvent removed under vacuum. The fine brown powder was purified by chromatography. The yield was 243 mg (94%) of an orange solid. H NMR (500MHz, DSMO-d6) 5ppm: 11.82 (s, 1H, -OH), 10.56 (s, 1H, -OH), 9.42 (s, 1H, -NH-), 8 , 00 (d, J = 7.3Hz, 2H, -CHar-), 7.72 (d, J = 8.8Hz, 1H, -CHar-), 7.58 (t, J = 7.3Hz, 1H, - CHar-), 7.51 (t, J = 7.6Hz, 2H, -CHar-), 6.83 (dd, Jl = 8.8Hz, J2 = 2.0Hz, 1H, -CHar-) , 6.74 (d, J = 2.4Hz, 1H, -CHar-). ¹³ C (125MHz) δ ppm: 166.6, 161.4, 160.8, 160.3, 153.5, 133.9, 131.6, 128.2, 128.0, 125.0, 113, 0, 107.9, 101.9, 100.1.

N-(4, 7-Dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl)-l H-pyrrol-2-carboxamid 4b N- (4,7-Dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl) -1H-pyrrole-2-carboxamide 4b

Eine Mischung aus 200 mg 3-Amino-4,7-dihydroxy-2H-chromen-2-on hydrochlorid (0,87 mmol, 1 Eq.), 97 mg lW-pyrrole-2-carboxysäure (0,87 mmol, 1 Eq.), 454 mg (Benzotriazol-l-yloxy) A mixture of 200 mg of 3-amino-4,7-dihydroxy-2H-chromen-2-one hydrochloride (0.87 mmol, 1 eq.), 97 mg lW-pyrrole-2-carboxy acid (0.87 mmol, 1 Eq.), 454 mg (benzotriazol-1-yloxy)

Tripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphat (PyBOP) (0,87 mg, 1 Eq.) und 770 μί N- Methylmorpholin (707 mg, 7,0 mol, 8 Eq.) in 12 mL DMF wurde für 27h bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre gerührt. Weitere 227 mg PyBOP (0,44 mmol, 0,5 Eq.) wurden der Lösung zugesetzt und weitere 66h gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit IN HCI-Lösung angesäuert und 3x mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter NaCI- Lösung gewaschen und über Na₂S0₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das resultierende braune Öl wurde in Ethylacetat aufgenommen. Es bildete sich eine Suspension. Der abfiltrierte Feststoff bildete das gewünschte Produkt. Aus der Mutterlauge wurde weiters einProdukt gewonnen und in Cyclohexan umkristallisiert. Das getrocknete Produkt ergab eine Ausbeute von 180 mg (72%) eines braunen Pulvers. ^XH NMR (500MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,01 (br, 1H, -OH), 11,65 (s, 1H, -NH-) 10,57 (br, 1H, -OH), 9,30 (s, 1H, -NH-), 7,69 (d, J = 8,3Hz, 1H, -CHar-) 7,01 (s, 1H, -CHpyrr-), 6,94 (s, 1H, -CHpyrr-), 6,81 (dd, Jl = 8,8, J2 = 2,0Hz, 1H, -CHar-), 6,71 (d, J = 2Hz, 1H, -CHar-), 6,15 (s, 1H, - CHpyrr-). ¹³C NMR (125Hz) δ ppm: 162,0, 161,6, 161,5, 160,3, 154,0, 126,2, 125,7, 123,1, 113,7, 112,9, 109,7, 108,8, 102,6, 100,9. Tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) (0.87 mg, 1 eq.) And 770 μM N-methylmorpholine (707 mg, 7.0 mol, 8 eq.) In 12 mL DMF was stirred for 27 h at room temperature under an argon atmosphere. An additional 227 mg of PyBOP (0.44 mmol, 0.5 eq.) Was added to the solution and stirred for a further 66 h. The reaction solution was acidified with IN HCl solution and extracted 3x with ethyl acetate. The combined organic phases were washed once with saturated NaCl solution and dried over Na ₂ S0 ₄ . The solvent was removed in vacuo. The resulting brown oil was taken up in ethyl acetate. It formed a suspension. The filtered solid formed the desired product. From the mother liquor, a product was further recovered and recrystallized in cyclohexane. The dried product gave a yield of 180 mg (72%) of a brown powder. ^X H NMR (500MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12.01 (br, 1H, -OH), 11.65 (s, 1H, -NH-) 10.57 (br, 1H, -OH), 9 , 30 (s, 1H, -NH-), 7.69 (d, J = 8.3Hz, 1H, -CHar-) 7.01 (s, 1H, -CHpyrr-), 6.94 (s, 1H , -CHpyrr-), 6.81 (dd, Jl = 8.8, J2 = 2.0Hz, 1H, -CHar-), 6.71 (d, J = 2Hz, 1H, -CHar-), 6, 15 (s, 1H, - CHpyrr-). ¹³ C NMR (125Hz) δ ppm: 162.0, 161.6, 161.5, 160.3, 154.0, 126.2, 125.7, 123.1, 113.7, 112.9, 109 , 7, 108, 8, 102, 6, 100, 9.

1.1.3. Aktivitätsassay der Methyltransferase Die enzymatische Umsetzung wurde entsprechend dem dargestellten Schema (Enzymatische Synthese von Alkylcoumarinderivaten) durchgeführt: 1.1.3. Activity assay of methyltransferase The enzymatic conversion was carried out according to the scheme shown (enzymatic synthesis of alkyl coumarin derivatives):

Methyldonormethyl donor

Für die Aktivitätsuntersuchung wurden Modelsubstrate mit hoher Ähnlichkeit zu den natürlichen Substraten dieser Enzyme ausgewählt und synthetisiert (Figur 3). Die möglichen Methylquellen (Figur 2) wurden bezüglich ihrer Aktivität mit beiden Enzymen CouO und NovO getestet. Zu Beginn der Untersuchungen betreffend alternativer Cofaktoren wurden Konzentrationen an Sulfoniumsalzen von 1 M gewählt, damit in einem ähnlichen Konzentrationsbereich gearbeitet wurde, der von der For the activity study, model substrates with high similarity to the natural substrates of these enzymes were selected and synthesized (FIG. 3). The possible methyl sources (Figure 2) were tested for activity with both CouO and NovO enzymes. At the beginning of the studies on alternative cofactors, concentrations of sulfonium salts of 1 M were chosen to operate in a similar concentration range as that used by the

Arbeitsgruppe Klimasauskas berichtet worden war (siehe S. Klimasauskas et al., Nat. Chem. Biol. 5, 2009, 400-402). Diese Arbeitsgruppe konnte eine Hydroxyalkylierung zeigen, die durch DNA- Methyltransferase katalysiert wurde, dabei wurden Formaldehyd und Acetaldehyd als SAM- Substituenten mit einer 0,8 M Konzentration verwendet. Für die enzymatische Umsetzung wurden geerntete Zellen der rekombinanten E.coli verwendet, die lx im flüssigen Stickstoff gefroren und anschließend aufgetaut wurden. 0,1 g aufgebrochene Zellen per mL Puffer (100 mM Phosphatpuffer pH 6,5 für NovO und pH 7,0 für CouO) wurden für die Untersuchungen verwendet. Verschiedene Negativkontrollen wurden durchgeführt, um die chemische Produktbildung ausschließen zu können. Es wurde keine Produktbildung detektiert, wenn kein Enzym zugesetzt wurde oder vor dem Zusatz das Enzym thermisch inaktiviert wurde (Inaktivierung vor dem Gebrauch für 30 Minuten bei 85°C). Bei einer Konzentration von 1 M ist Trimethylsulfoxoniumiodid nicht löslich, während Klimasauskas working group (see S. Klimasauskas et al., Nat. Chem. Biol. 5, 2009, 400-402). This group was able to demonstrate hydroxyalkylation catalyzed by DNA methyltransferase using formaldehyde and acetaldehyde as SAM substituents with a concentration of 0.8 M. For the enzymatic conversion harvested cells of the recombinant E. coli were used, which were frozen in liquid nitrogen lx and then thawed. 0.1 g of disrupted cells per mL buffer (100 mM phosphate buffer pH 6.5 for NovO and pH 7.0 for CouO) were used for the investigations. Various negative controls were performed to exclude chemical product formation. No product formation was detected when no enzyme was added or prior to addition the enzyme was thermally inactivated (inactivation before use for 30 minutes at 85 ° C). At a concentration of 1 M trimethylsulfoxonium iodide is not soluble while

Trimethylsulfoniumiodid und Methioninmethylsulfoniumchlorid bei dieser Konzentration vollständig gelöst sind. Der Umsatz betrug 5-20% (höchster Umsatz mit Verbindung 2). Der Einfluss der Trimethylsulfoniumiodid and Methioninmethylsulfoniumchlorid are completely dissolved at this concentration. The conversion was 5-20% (highest conversion with compound 2). The influence of

Konzentration der alternativen Cofaktoren auf den Umsatz wurde in weiteren Versuchen untersucht. Der Konzentrationsbereich wurde in zwei unabhängigen Versuchen von 2 mM bis 1 M untersucht. Die Ergebnisse sind in den Figuren 4 und 5 zusammengefasst. Concentration of the alternative cofactors on the turnover was investigated in further experiments. The concentration range was examined in two independent experiments from 2 mM to 1 M. The results are summarized in FIGS. 4 and 5.

Die Reaktionen wurden in 0,2 mL Maßstab in einem Thermomixer bei 30°C und 1000 UpM für 24h durchgeführt. Die Lösungen enthielten 1 mM (mmolar) Substrat aus einer 10 mM Stocklösung in DMSO (Dimethylsulfoxid), 2 mM SAM (A7007 von Sigma) aus einer Stocklösung in 50 mM The reactions were performed in 0.2 mL scale in a thermomixer at 30 ° C and 1000 rpm for 24 h. The solutions contained 1 mM (mmolar) substrate of a 10 mM stock solution in DMSO (dimethylsulfoxide), 2 mM SAM (A7007 from Sigma) from a stock solution in 50 mM

Phosphatpuffer (Positivkontrolle) oder die Sulfoniumsalze in unterschiedlichen Konzentrationen, 1 mg/mL BSA (Rinderserumalbumin A3294 von Sigma) und aufgebrochene Zellen, die die rekombinanten Proteine CouO bzw. NovO enthielten. Die Reaktion wurde durch Aufheizen der Reaktionsgefäße auf 85°C für 15 Minuten abgestoppt. Anschließend wurden die Reaktionsgefäße für 15 Minuten in den Kühlschrank gestellt. Danach wurden die Mischungen bei 14000 UpM für 15 Minuten zentrifugiert. 3 μί der wässrigen Lösung wurden ohne weitere Verdünnung in die HPLC eingespritzt. Diese Screening wurde 3x wiederholt. Die Analyse erfolgte auf einem 1200 Agilent HPLC-System ausgerüstet mit Autosampier, Multiwave-UV- und SingleQuad MS-Detektor. Die MS-Signale wurden im Scan und SIM ESI-positiv Modus gesammelt. Eine 100 x 2 mm Chromolith^® Performance RP-18e Säule der Firma Merck wurde verwendet. Das Eluent bestand aus 10 mM Ammoniumacetat-Puffer pH 5,5 und Acetonitril 95:5 bzw. 96:4. Der Fluss betrug 0,7 mL/min bei 40°C Säulentemperatur. R_rWerte sind: Phosphate buffer (positive control) or the sulfonium salts in different concentrations, 1 mg / mL BSA (bovine serum albumin A3294 from Sigma) and disrupted cells containing the recombinant proteins CouO or NovO. The reaction was stopped by heating the reaction vessels to 85 ° C for 15 minutes. Subsequently, the reaction vessels were placed in the refrigerator for 15 minutes. Thereafter, the mixtures were centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes. 3 μί of the aqueous solution were injected into the HPLC without further dilution. This screening was repeated 3 times. The analysis was performed on a 1200 Agilent HPLC system equipped with autosampler, Multiwave UV and SingleQuad MS detector. The MS signals were collected in scan and SIM ESI positive mode. A 100 x 2 mm Chromolith ^® Performance RP-18e column from Merck was used. The eluent consisted of 10 mM ammonium acetate buffer pH 5.5 and acetonitrile 95: 5 and 96: 4, respectively. The flow was 0.7 mL / min at 40 ° C column temperature. R _r values are:

4a: 2,3 Minuten; 8-Methyl-4a: 4,9 Minuten 4a: 2.3 minutes; 8-methyl-4a: 4.9 minutes

Um zu untersuchen, ob die Methyldonoren über die Methylierung von SAH, SAM rezyklieren, wurden Experimente mit zwei unterschiedlichen SAH-Konzentrationen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 6 dargestellt. To investigate whether the methyl donors recycle via the methylation of SAH, SAM, experiments with two different SAH concentrations were performed. The results are shown in FIG.

2. Ergebnisse und Schlussfolgerungen 2. Results and conclusions

Zwei SAM-abhängige Methyltransferasen CouO und NovO sind entdeckt worden, die Two SAM-dependent methyltransferases CouO and NovO have been discovered that

überraschenderweise alternative Alkyldonoren als Cofaktoren für Methylierungen akzeptieren. Ein einziges Produkt wurde gebildet, obwohl eine sehr große Menge des Methylierungsreagenzes verwendet wurde, welche billig, kommerziell erhältlich und ungiftig ist. Bei den alternativen Surprisingly, accept alternative alkyl donors as cofactors for methylations. A single product was formed, although a very large amount of the methylating reagent was used, which is cheap, commercially available and non-toxic. In the alternative

Cofaktoren handelt es sich um Trimethylsulfoniumhalogenid, Trimethylsulfoxoniumhalogenid und DL- Methioninmethylsulfoniumhalogenid. Cofactors are trimethylsulfonium halide, trimethylsulfoxonium halide and DL-methionine methylsulfonium halide.

Dem Verlauf des Umsatzes zufolge liefert DL-Methioninmethylsulfoniumhalogenid ein anderes Verhalten als die zwei anderen alternativen Cofaktoren. Verbindung 3 hat ein Konzentrationsoptimum von ca. 100 mM für beide Enzyme und ist höher als die beiden anderen Verbindungen (Figur 4 und 5). Ebenso zeigt Verbindung 3 den höchsten Umsatz mit beiden Enzymen im Vergleich zu den anderen zwei Verbindungen. Für die Salze 1 und 2 zeigt eine Konzentration von 25 mM die besten Ergebnisse. Sehr hohe Konzentrationen an Sulfonium- bzw. Sulfoxoniumsalzen scheinen die Enzyme zu inhibieren. In terms of turnover, DL-methionine-methylsulfonium halide behaves differently than the other two alternative cofactors. Compound 3 has a concentration optimum of about 100 mM for both enzymes and is higher than the other two compounds (Figures 4 and 5). Similarly, compound 3 shows the highest conversion of both enzymes compared to the other two compounds. For salts 1 and 2, a concentration of 25 mM shows the best results. Very high concentrations of sulfonium or sulfoxonium salts seem to inhibit the enzymes.

Eine starke Hintergrundreaktion wurde gefunden. Bei der Verwendung von aufgebrochenen Zellen konnte auch ohne Methyldonorzusatz Produktbildung festgestellt werden. Dennoch, der Zusatz von einer der drei Methyldonoren erhöht den Umsatz im Vergleich zu den Versuchen ohne Zusatz von alternativen Methyldonoren. Im Moment ist der Reaktionsmechanismus dieser„alternativen A strong background reaction was found. When broken cells were used, product formation could be detected even without added methyl donor. Nevertheless, the addition of one of the three methyl donors increases the conversion compared to the experiments without the addition of alternative methyl donors. At the moment, the reaction mechanism of this "alternative

Cofaktoren" nicht geklärt. Ob die Methylgruppe direkt vom alternativen Cofaktor zum Substrat transportiert wird oder ob eine Transmethylierung vor der Substratmethylierung stattfindet, ist Gegenstand weiterer Untersuchungen. Cofactors "has not been clarified Whether the methyl group is transported directly from the alternative cofactor to the substrate or whether transmethylation takes place before substrate methylation is the subject of further investigations.

Die Alkyltransferaseaktivität von CouO und NovO zeigt den ersten Fall einer enzymkatalysierten Friedel-Crafts-Reaktion. Diese S-Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängigen Methyltransferasen sind in der Lage,„nicht-natürliche" Cofaktoren (alkylierte SAH-Derivate) zu akzeptieren und den Alkylrest regioselektiv und mit hoher Ausbeute auf das aromatische System zu übertragen. Die Substratbreite dieser Enzyme ist breiter als zunächst erwartet wurde. Die Umsetzung von komplett unterschiedlichen Substraten als die natürlichen Substrate machen diese Enzyme zu attraktiven Katalysatoren für die organische Synthese. Für SAM, die natürliche Verbindung, wurden bereits Ansätze zur Steigerung der Produktion gemacht, worin die Stoffwechselwege verändert wurden. Pichla pastoris und The alkyltransferase activity of CouO and NovO shows the first case of an enzyme-catalyzed Friedel-Crafts reaction. These S-adenosyl-L-methionine (SAM) -dependent methyltransferases are capable of accepting "non-natural" cofactors (alkylated SAH derivatives) and transferring the alkyl moiety regioselectively and in high yield to the aromatic system These enzymes are broader than expected, and the use of substrates that are completely different than natural substrates make these enzymes attractive catalysts for organic synthesis. "SAM, the natural compound, has already begun to increase production by altering its metabolic pathways Pichla pastoris and

Saccharomyces cerevisiae Mutanten sind generiert worden, die große SAM-Mengen bis zu 13,5 g/L produzieren. Trotzdem haben Methyltransferasen als Enzyme zur C-C-Bindungsbildung den Zugang zur industriellen Biotechnologie noch nicht gefunden. Der Hauptgrund dafür ist der hohe Preis. Die Verwendung von billigen und kommerziell erhältlichen Alkyldonoren könnte den Weg für die Verwendung von SAM-abhängigen Methyltransferasen zur selektiven Alkylierung ebnen. Um diese „Hochenergie"-Verbindung zu ersetzen, wurden einfache Alkylsulfoniumsalze in dieser Studie zum ersten Mal erfolgreich eingesetzt. Die spezifische Aktivität von diesen Methyltransferasen für nichtnatürliche Cofaktoren ist nicht so hoch wie für der natürliche Cofaktor SAM. Gleichzeitig steigert der Ersatz von SAM durch einfache Methyldonoren die Atomökonomie drastisch. Die Selektivität der Enzyme führt zur Vermeidung von Nebenprodukten. Die Verwendung von Enzymen als Katalysatoren bringt alle allgemeinen Vorteile von enzymatischen Umsetzungen, wie milde Reaktionsbedingungen und Abfallreduktion, mit sich. Die Alkylsulfoniumsalze sind billige, kommerziell-erhältliche und ungiftige Alkylierungsreagenzien. Saccharomyces cerevisiae mutants have been generated that produce large quantities of SAM up to 13.5 g / L. Nevertheless, methyltransferases, as enzymes for C-C bond formation, have not yet found access to industrial biotechnology. The main reason for this is the high price. The use of inexpensive and commercially available alkyl donors could pave the way for the use of SAM-dependent methyltransferases for selective alkylation. To replace this "high-energy" compound, simple alkylsulfonium salts were successfully used in this study for the first time, and the specific activity of these methyltransferases for unnatural cofactors is not as high as for the natural cofactor SAM The use of enzymes as catalysts brings with it all the general advantages of enzymatic reactions, such as mild reaction conditions and waste reduction The alkylsulfonium salts are cheap, commercially available and non-toxic alkylating reagents.

Jede S-Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängige Homocystein-S-Methyltransferase, die eine Any S-adenosyl-L-methionine (SAM) -dependent homocysteine S-methyltransferase that has a

Methylgruppe von SAM auf Homocystein transferieren kann, kann verwendet werden, wie z.B. L- Homocystein-S-Methyltransferase, die von Shapiro und Stanley (Methods Enzymol. 17 Pt.B, Sulfur Amino acids, pp. 400-405 (1971)) und Shapiro (Biochim. Biophys. Acta. 29:405-9 (1958)) beschrieben wurde und noch mehr bevorzugt sind die SAM-abhängige Homocystein-S-Methyltransferasen aus E.coli (Thanbichler et al., J. Bacteriol., 181(2):662-5 (1999)) oder aus Saccharomyces cerevisiae (Shapiro et al., J. Biol. Chem., 239(5):1551-6 (1964) und Thomas et al., JBiol. Chem., 275(52):40718-24 (2000)). Can transfer methyl group from SAM to homocysteine can be used, e.g. L-homocysteine S-methyltransferase described by Shapiro and Stanley (Methods Enzymol 17 Pt.B, Sulfur Amino acids, pp. 400-405 (1971)) and Shapiro (Biochim Biophys Acta 29: 405-9 ( 1958)) and even more preferred are the SAM-dependent homocysteine S-methyltransferases from E. coli (Thanbichler et al., J. Bacteriol., 181 (2): 662-5 (1999)) or from Saccharomyces cerevisiae Chem., 239 (5): 1551-6 (1964) and Thomas et al., J. Biol. Chem., 275 (52): 40718-24 (2000)).

Claims

New claims: 1. Process for the transfer of an alkyl, alkenyl or alkynyl group to a low molecular weight

A small molecule having a nucleophilic center comprising the step of

Contacting the compound with an S-adenosyl-L-methionine (SAM) -dependent methyltransferase in the presence of an alkylated sulfonium salt having the general formula (I)

an alkylated sulfoxonium salt having the general formula (II)

Θ

R ² -S = 0

Θ

R ³ x (ii) θ 1 2 3

wherein is an organic or inorganic anion and R, R and R are each independently a substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl and alkynyl group comprising 1 to 10 carbon atoms and the alkyl group does not comprise an adenosyl group.

2. The method according to claim 1, characterized in that the substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl and alkynyl group 1 to 8 carbon atoms, preferably 1 to 7 carbon atoms, more preferably 1 to 3 carbon atoms, in particular 1 carbon atom.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the alkyl, alkenyl and

Alkinyl group is substituted with at least one carboxyl, carbonyl and / or amino group.

4. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the alkyl group is selected from the group consisting of methyl and 2-aminobutyryl.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the low molecular weight compound is an aliphatic or aromatic substrate having a molecular weight less than 1 kDa (1000 g / mol).

6. The method according to claim 5, characterized in that the aromatic compound comprises at least one homocyclic or heterocyclic aromatic ring.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the SAM-dependent methyltransferase is a methyltransferase which methylates low molecular weight compounds.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the organic or inorganic anion is selected from the group of halides or sulfonates.

A kit for transferring an alkyl, alkenyl or alkyne group to a substrate comprising an S-adenosyl-L-methionine (SAM) -dependent methyltransferase and an alkylated sulfonium salt having the general formula (I)

or sulfoxomium salt having the general formula (II)

characterized in that R ¹ , R ² and R ^{3 are} each independently a substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl and alkynyl group containing 1 to 10 carbon atoms and the alkyl group does not comprise an adenosyl group.