WO2013029075A1

WO2013029075A1 - Mittel und verfahren zur alkylierung

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Publication number: WO2013029075A1
Application number: PCT/AT2012/000228
Authority: WO
Inventors: Mandana GRUBER; Harald STECHER; Martin TENGG; Peter Remler
Original assignee: ACIB GmbH; Technische Universitaet Graz
Current assignee: ACIB GmbH; Technische Universitaet Graz
Priority date: 2011-09-01
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2013-03-07
Anticipated expiration: 2014-03-01
Also published as: AT511856A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Transfer einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe auf eine niedermolekulare Verbindung („small molecule") mit einem nukleophilen Zentrum umfassend den Schritt des Kontaktierens der Verbindung mit einer S-Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängigen Methyltransferase in Anwesenheit eines alkylierten Sulfoniumsalzes mit der allgemeinen Formel (I) oder eines alkylierten Sulfoxoniumsalzes mit der allgemeinen Formel (II). Hierbei ist X^Θ ein organisches oder anorganisches Anion und R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppe umfassend 1 bis 10 Kohlenstoffatome.

Description

Mittel und Verfahren zur Alkylierung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Mittel und Verfahren zur Alkylierung.

Die Bildung von C-0 Bindungen zum Aufbau von Ester und Ether, die Bildung von C-N Bindungen zum Aufbau von sekundären und tertiären Aminen und Amiden, die Bildung von C-S Bindungen zum Aufbau von Thioether und Sulfoniumverbindungen und die Bildung von C-C Bindungen zur Kettenverlängerung von aliphatischen Substanzen und Alkylierung von aromatischen Verbindungen (Friedel-Crafts Reaktion) finden breite Anwendung in der Synthese organischer Verbindungen. Gängige

Alkylierungsmittel zur Durchführung der oben beschriebenen Umsetzungen sind Alkylhalogenide und - sulfonate, die hoch giftig sind. Sehr oft sind aggressive Bedingungen für die Umsetzung nötig und die Umsetzungen verlaufen unselektiv. Das Ergebnis ist eine Produktmischung, welche die Ausbeute am gewünschten Produkt verringert. Isolierung und Reinigung vom Produkt benötigt teure

Trennungsschritte und erhöht die anfallende Abfallmenge.

Daher sind alternative Methoden zur Alkylierung unter umweltverträglichen Prozessen

wünschenswert. Enzymatische Methoden erfüllen in der Regel diese Ansprüche. Methyltransferasen sind Enzyme, die Alkylierungsreaktionen durchführen. Diese Enzyme benötigen Cofaktoren.

S-Adenosyl-L-methionin (SAM) ist einer der meist verwendeten Cofaktoren in der Natur und ist unter den SAM-abhängigen Methyltransferasen hoch konserviert. Mehr als 150 Reaktionen sind bekannt, die von SAM-abhängigen Methyltransferasen katalysiert werden. Die Enzyme werden betreffend ihre Substrate klassifiziert. Diese sind niedermolekulare Verbindungen („kleine Moleküle";„small molecules"), Proteine, Nukleinsäuren und Polysaccharide. Die Zielatome in diesen Molekülen sind Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Halogen. Kürzlich wurde berichtet, dass zwei Enzyme neben SAM auch analoge Verbindungen akzeptieren, in denen die Methylgruppe von SAM durch Alkenyl-, Alkinyl- und Benzylreste ersetzt wurde (Stecher H. et al., Angew. Chem. Int. Ed.

48(2009):9546-9548). Nichtsdestotrotz sind sowohl SAM als auch seine analogen Verbindungen sehr teuer. Daher können solche Cofaktoren nicht zur Etablierung von ökonomischen Prozessen, zur Alkylierung von großen Substratmengen verwendet werden.

Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung Methoden und Mittel zur Alkylierung von niedermolekularen Verbindungen („kleinen Molekülen";„small molecules") bereit zu stellen, die nukleophile Zentren enthalten. Diese Methoden und Mittel sollen die Nachteile der bekannten Methoden ausräumen. Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Transfer einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe auf eine niedermolekulare Verbindung („small molecule") mit einem nukleophilen Zentrum umfassend den Schritt des Kontaktierens der Verbindung mit einer S- Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängigen Methyltransferase in Anwesenheit eines alkylierten

Sulfoniumsalzes mit der allgemeinen Formel (I)

oder eines alkylierten Sulfoxoniumsalzes mit der allgemeinen Formel (II)

ö 1 2 3

wobei X ein organisches oder anorganisches Anion ist und R , R und R jeweils unabhängig voneinander eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyl- und Alkinyigruppe umfassend 1 bis 10 Kohlenstoffatome ist.

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass einfache Alkylsulfonium- und

Alkylsulfoxoiniumsalze, wie oben dargestellt, in der Lage sind, für enzymatische Reaktionen, in denen Methyltransferasen involviert sind, als Cofaktoren zu wirken. Dies erlaubt die Etablierung von enzymatischen Methoden zur Alkylierung, die SAM als Cofaktor nicht benötigen.

Die Effizienz von enzymatischen Reaktionen hängt nicht nur von den verwendeten Enzymen,

Substraten und Cofaktoren ab, sondern auch von den Reaktionsbedingungen, unter denen die Reaktionen durchgeführt wurden. Daher wird bevorzugt, dass die Methode entsprechend der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur durchgeführt wird, bei der die verwendete

Methyltransferase die höchste Reaktionsgeschwindigkeit zeigt, bevorzugt zwischen 25 und 45°C, mehr bevorzugt zwischen 30 und 35°C.

Der Begriff„niedermolekulare Verbindung" („kleines Molekül";„small molecule"), der hier verwendet wird, bezieht sich auf eine niedermolekulare organische Verbindung mit einer niedrigen Molekülmasse (Molekülmasse kleiner oder gleich 1 kDa, bevorzugt eine Molekülmasse kleiner oder gleich 0,8 kDa), welche per Definition kein Polymer ist. Der Ausdruck„kleines Molekül" bezieht sich ebenfalls auf ein Molekül, das an einem Biopolymer, wie etwa ein Protein, Nukleinsäure, Polysaccharid oder ein Harz, gebunden ist und zusätzlich die Aktivität oder Funktion des Polymers ändern kann.„Kleine Moleküle" können vielfältige biologische Funktionen haben, wie etwa Signalmoleküle, als Instrumente in der Molekularbiologie, als Arzneimittel, als Pestizide und vieles mehr. Diese Verbindungen können natürlicher (wie z.B. Sekundärmetabolite) oder künstlicher (wie z.B. antivirale Arzneimittel) Herkunft sein. Sie können positive Effekte gegen Krankheiten (z.B. Medikamente) oder schädliche Wirkungen (z.B. Teratogene und Kanzerogene) haben. Die Zielatome im Substrat sind Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Kohlenstoff. Die nukleophilen Zentren im Substrat sind -OH, -NH₂, -NHR, -CONH₂, - CONHR, -SH, -SR und elektronenreiche Kohlenstoffatome, bevorzugt ein sp²-hybridisierter Kohlenstoff als Teil einer aliphatischen oder aromatischen Verbindung.

Bevorzugte Methyltransferasen sind O-Methyltransferasen, N-Methyltransferasen, S- Methyltransferasen und C-Methyltransferasen. O-Methyltransferasen katalysieren die Methylierung einer Hydroxyl (-OH)- oder Carboxyl (-COOH)- funktionalität. N-Methyltransferasen katalysieren die Methylierung von primären und sekundären Aminen (-NH₂, -NHR), Iminen (=NH) und Amiden (-CONH₂, -CONHR). S-Methyltransferasen katalysieren die Methylierung von Thiolen (-SH) und Thioether (-SR). C-Methyltransferasen transferieren die Methylgruppe auf einem elektronenreichen Kohlenstoffatom.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppe 1 bis 8 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatome, mehr bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatome, insbesondere 1 Kohlenstoffatom.

Besonders bevorzugt werden erfindungsgemäß somit substituierte oder nicht substituierte Ci bis Ci₀, vorzugsweise Ci bis C₈, mehr bevorzugt i bis C₇, noch mehr bevorzugt Ci bis C₃, insbesondere Ci, Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppen eingesetzt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehrere Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen mit mindestens einer Carboxyl-, Carbonyl- und/oder Aminogruppe substituiert sein. Eine Alkylgruppe der erfindungsgemäß eingesetzten Sulfoniumsalze kann keine Adenosylgruppe sein.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine oder mehrere der folgenden Verbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt:

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung von SAM-abhängigen Methyltransferasen. Diese Gruppe von Enzymen umfasst Methyltransferasen, die für ihre

enzymatische Aktivität SAM als Cosubstrat (Cofaktor) verwenden und/oder benötigen. Die SAM- abhängigen Methyltransferasen der vorliegenden Erfindung akzeptieren Methioninmethylsulfonium als ein Cosubstrat bzw. Cofaktor zu einem deutlich geringeren Ausmaß als SAM oder sind sogar nicht in der Lage die Methylgruppe vom Methioninmethylsulfonium zum Substrat zu transferieren. Demnach zeigen die SAM-abhängigen Methyltransferasen der vorliegenden Erfindung eine verringerte oder keine Affinität zu Methioninmethylsulfonium. Daher ist eine Methyltransferase wie Homocystein-S- methyltransferase EC 2.1.1.10, welche eine höhere Affinität zu anderen Cosubstraten als SAM zeigt, nicht als bevorzugte Methyltransferase in der Methode entsprechend der vorliegenden Erfindung zu verwenden.

Der Km-Wert von SAM in den SAM-abhängigen Methyltransferasen, die in der Methode entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist bevorzugt kleiner als 10^"3 M, mehr bevorzugt kleiner als 10^"4 M und noch mehr bevorzugt kleiner als 10^"5 M.

Bevorzugte Methyltransferasen sind: EC 2.1.1.1 Nicotinamid N-Methyltransferase, EC 2.1.1.2

Guanidinoacetat N-Methyltransferase, EC 2.1.1.4 Acetylserotonin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.6 Catechol O-Methyltransferase, EC 2.1.1.7 Nicotinat N-Methyltransferase, EC 2.1.1.8 Histamin N- Methyltransferase, EC 2.1.1.9 Thiol S-Methyltransferase, EC 2.1.1.12 Methionine S-Methyltransferase, EC 2.1.1.15 Fettsäure („fatty acid") O-Methyltransferase, EC 2.1.1.16 Methylen- Fettsäureacylphospholipid Synthase, EC 2.1.1.17 Phosphatidylethanolamin N-Methyltransferase, EC EC 2.1.1.20 Glycin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.22 Carnosin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.25 Phenol 0- Methyltransferase, EC 2.1.1.26 lodophenol O-Methyltransferase, EC 2.1.1.27 Tyramin N- Methyltransferase, EC 2.1.1.28 Phenylethanolamin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.38 0- Demethylpuromycin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.39 Inositol 3-Methyltransferase, EC 2.1.1.40 Inositol 1-Methyltransferase, EC 2.1.1.41 Sterol 24-C-Methyltransferase, EC 2.1.1.42 Luteolin 0- Methyltransferase, EC 2.1.1.44 Dimethylhistidin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.46 Isoflavon 4'-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.47 Indolepyruvat C-Methyltransferase, EC 2.1.1.49 Amin N- Methyltransferase, EC 2.1.1.50 Loganat O-Methyltransferase, EC 2.1.1.53 Putrescin N- Methyltransferase, EC 2.1.1.59 [Cytochrom cRysin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.64 3- Demethylubiquinon-9 3-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.65 Licodion 2'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.67 Thiopurin S-Methyltransferase, EC 2.1.1.68 Caffeat O-Methyltransferase, EC 2.1.1.69 5- Hydroxyfurancoumarin 5-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.70 8-Hydroxyfurancoumarin 8-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.71 Phosphatidyl-N-Methylethanolamin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.75 Apigenin 4'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.76 Quercetin 3-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.78 Isoorientin 3'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.79 Cyclopropan-Fettsäureacyl-Phospholipid Synthase, EC 2.1.1.82 3- methylquercetin 7-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.83 3,7-Dimethylquercetin 4'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.84 Methylquercetagetin 6-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.87 Pyridin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.88 8-Hydroxyquercetin 8-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.89 Tetrahydrocolumbamin 2-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.91 Isobutyraldoxim O-Methyltransferase, EC 2.1.1.94 Tabersonin 16-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.95 Tocopherol O-Methyltransferase, EC 2.1.1.96 Thioether S- Methyltransferase, EC 2.1.1.97 3-Hydroxyanthranilat 4-C-Methyltransferase, EC 2.1.1.98 Diphthin Synthase, EC 2.1.1.99 3-Hydroxy-16-Methoxy-2,3-Dihydrotabersonin N-Methyltransferase, EC

2.1.1.101 Macrocin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.102 Demethylmacrocin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.103 Phosphoethanolamin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.104 Caffeoyl-CoA O-Methyltransferase, EC 2.1.1.105 N-Benzoyl-4-Hydroxyanthranilat 4-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.106 Tryptophan 2-C- Methyltransferase, EC 2.1.1.107 Uroporphyrinogen-Ill C-Methyltransferase, EC 2.1.1.108 6- Hydroxymellein O-Methyltransferase, EC 2.1.1.109 Demethylsterigmatocystin 6-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.110 Sterigmatocystin 8-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.111 Anthranilat N-Methyltransferase, EC 2.1.1.112 Glucuronoxylan 4-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.114 Polyprenyldihydroxybenzoat Methyltransferase, EC 2.1.1.115 (RS)-l-Benzyl-l,2,3,4-Tetrahydroisoquinolin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.116 3'-Hydroxy-N-Methyl-(S)-Coclaurin 4'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.117 (S)-Scoulerin 9-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.118 Columbamin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.119 10- Hydroxydihydrosanguinarin 10-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.120 12-Hydroxydihydrochelirubin 12-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.121 6-O-Methylnorlaudanosolin 5'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.122 (S)- Tetrahydroprotoberberin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.123 [Cytochrom c]-Methionin S- Methyltransferase, EC 2.1.1.124 [Cytochrom c]-Arginin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.128 (RS)- Norcoclaurin 6-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.129 Inositol 4-Methyltransferase, EC 2.1.1.130 Precorrin- 2 C20-Methyltransferase, EC 2.1.1.131 Precorrin-3B C17-Methyltransferase, EC 2.1.1.132 Precorrin-6Y C5,15-Methyltransferase (decarboxylierend), EC 2.1.1.133 Precorrin-4 Cll-Methyltransferase, EC 2.1.1.136 Chlorophenol O-Methyltransferase, EC 2.1.1.137 Arsenit Methyltransferase, EC 2.1.1.139 3'- Demethylstaurosporin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.140 (S)-Coclaurin-N-Methyltransferase, EC 2.1.1.141 Jasmonat O-Methyltransferase, EC 2.1.1.142 Cycloartenol 24-C-Methyltransferase, EC 2.1.1.143 24-Methylenesterol C-Methyltransferase, EC 2.1.1.144 Trans-Aconitat 2-Methyltransferase, EC 2.1.1.145 Trans-Aconitat 3-Methyltransferase, EC 2.1.1.146 (Iso)eugenol O-Methyltransferase, EC 2.1.1.147 Corydalin Synthase, EC 2.1.1.149 Myricetin O-Methyltransferase, EC 2.1.1.150 Isoflavon 7-0- Methyltransferase, EC 2.1.1.151 Cobalt-Faktor II C20-Methyltransferase, EC 2.1.1.152 Precorrin-6A Synthase (Deacetylierung), EC 2.1.1.153 Vitexin 2"-0-Rhamnosid 7-O-Methyltransferase, EC 2.1.1.154 Isoliquiritigenin 2'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.155 Kaempferol 4'-0-Methyltransferase, EC 2.1.1.156 Glycin/Sa rcosin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.157 Sarcosin/Dimethylglycin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.158 7-Methylxanthosin Synthase, EC 2.1.1.159 Theobromin Synthase, EC 2.1.1.160 Koffein Synthase, EC 2.1.1.161 Dimethylglycin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.162

Glycin/Sarcosin/Dimethylglycin N-Methyltransferase, EC 2.1.1.163 Demethylmenaquinon

Methyltransferase, EC 2.1.1.164 Demethylrebeccamycin-D-Glucose O-Methyltransferase, EC 2.1.1.165 Methyl Halide Transferase, EC 2.1.1.169 Tricetin S'^'^'-O-Trimethyltransferase, EC 2.1.1.175 Tricin Synthase, EC 2.1.1.195 Cobalt-Precorrin-5B (Cl)-Methyltransferase, EC 2.1.1.196 CobaIt-Precorrin-7 (C15)-Methyltransferase, EC 2.1.1.197 Malonyl-CoA O-Methyltransferase, und EC 2.1.1.201 2- Methoxy-6-Polyprenyl-l,4-Benzoquinol Methylase.

Die Substrate („kleine Moleküle") und Cosubstrate aller hier erwähnten Methyltransferasen sind bekannt. Jedoch kann die Methode der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um auch andere Substrate (andere„kleine Moleküle") zu alkylieren, alkenylieren und alkinylieren. Methoden zur Identifizierung solcher Substrate sind im Stand der Technik bekannt und umfassen die Untersuchung, ob ein potentieller Substrat entsprechend der vorliegenden Erfindung durch Inkubation von

Methyltransferase und entsprechendem Cosubstrat modifiziert wurde.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das organische oder anorganische Anion aus der Gruppe von Halogeniden und Sulfonaten ausgewählt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind das alkylierte Sulfoniumsalz mit der allgemeinen Formel (I) und das alkylierte Sulfoxoniumsalz mit der allgemeinen Formel (II) in einem Verhältnis Cosubstrat zu Substrat von 10:1 bis 200:1, bevorzugt von 15:1 bis 150:1, mehr bevorzugt von 20:1 bis 125:1, im Besonderen von 25:1 bis 100:1 der Reaktionsmischung zugesetzt worden. Zum Beispiel, wenn in der Reaktionsmischung das Substrat in einer Konzentration von 0,5 bis 2 mM, vorzugsweise 1 mM, vorliegt, liegt das Cosubstrat gemäß den allgemeinen Formeln (I) und (II) entsprechend der vorliegenden Erfindung in einer Konzentration von 12 bis 200 mM, vorzugsweise 25 bis 100 mM, vor.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Methyltransferasen, die in der Methode entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet werden, recombinant hergestellt worden. Außerdem ist es im Besonderen bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren nicht-gereinigte oder im Wesentlichen nicht-gereinigte SAM-abhängige Methyltransferasen zu verwenden. Das bedeutet, dass in der Methode der vorliegenden Erfindung ein Rohlysat eines

Kulturmediums, das Zellen umfasst, die in der Lage sind SAM-abhängige Methyltransferasen zu produzieren, verwendet werden kann. Alternativ dazu ist es auch möglich den Überstand der aufgebrochenen Zellen, welche SAM-abhängige Methyltransferasen produzieren, zu verwenden.

In dem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel sind gefrorene und aufgetaute oder

aufgebrochene rekombinante Zellen, die SAM-abhängige Methyltransferasen überexperimieren, für Methylierung von Substraten verwendet worden.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Kit zum Transfer einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe auf ein Substrat umfassend eine S-Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängige Methyltransferase und ein alkyliertes Sulfoniumsalz mit der allgemeinen Formel (I)

Θ

i

0

R^{3 ' S ^}R² x (i) oder Sulfoxomiumsalz mit der allgemeinen Formel (II)

©

R¹

i

R²-S=0

i 0

x OD wobei R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppe umfassend 1 bis 10 Kohlenstoffatome ist. Die vorliegende Erfindung ist weiterhin mit folgenden Figuren und Beispielen illustriert, jedoch ohne auf diese eingeschränkt zu sein.

Figur 1 zeigt S-Adenosyl-L-methionin (SAM), S-Adenosyl-L-homocystein (SAH) und SAM-Analogen. Es ist gezeigt worden, dass DNA-Methyltransferasen auch nicht natürliche Cofaktoren (SAM-Analogen) akzeptieren und sequenzspezifische DNA-Alkylierung wurde bei Verwendung von S-Adenosyl-L- homocystein-Derivaten beobachtet. In allen bekannten und publizierten Ergebnissen bleibt der Adenosylteil des Cofaktors unangetastet und kann mit dem Enzym in Wechselwirkung treten.

Figur 2 zeigt schwefelhaltige Salze, die als mögliche Methyldonoren für CouO und NovO getestet wurden. Trimethylsulfonium 1 und Trimethylsulfoxonium 2 wurden als lodide eingesetzt,

Methioninmethylsulfonium 3 als Chlorid.

Figur 3 zeigt die Synthese der Substrate für CouO und NovO: a) Ac₂0 (Essigsäureanhydrid), Pyridin, DMAP (4-Dimethylaminopyridin), Raumtemperatur (rt), 24h, 93%. b) SOCI₂, CH₂CI₂, Rückfluss, 5h. c) KOH, MeOH, rt, 3h, 73%. d) Et₃N, MgCI₂, THF, 2h bei 0°C, 16h bei rt, 73%. e) wässr. NaOH, MeOH, rt, 16h, 92%. f) IN HCl, MeOH, rt, 24h, 67%. g) Pyrrol-2-carbonsäure, PyBOP ((Benzotriazol-1- yloxy)tripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate), NMM (N-Methylmorpholin), DMF, rt, Ar- Atmosphäre, 48h, 78%. h) PhCOCI, Pyridin, DMF, rt, 24h. i) 3N NaOH/MeOH 1:1, rt, 72h. (h+i > 99%).

Figur 4 zeigt die Methylierung von Coumarinbenzamid 4a katalysiert durch CouO bei unterschiedlichen Konzentrationen der Sulfonium- und Sulfoxoniumsalze. Me₃S Trimethylsulfoniumiodid; Me₃S=0 Trimethylsulfoxoniumiodid; MeMet DL-Methioninmethylsulfoniumchlorid Figur 5 zeigt die Methylierung von Coumarinbenzamid 4a katalysiert durch NovO bei unterschiedlichen Konzentrationen der Sulfonium- und Sulfoxoniumsalze. Me₃S Trimethylsulfoniumiodid; Me₃S=0 Trimethylsulfoxoniumiodid; MeMet DL-Methioninmethylsulfoniumchlorid

Figur 6 zeigt den Einfluss des Zusatzes von SAH zu den Reaktionsmischungen. Konzentrationen an Me₃S⁺r und Me₃SO⁺l^" sind jeweils 25 mM, Konzentration an Methioninmethylsulfoniumchlorid ist 100 mM. Me₃S Trimethylsulfoniumiodid; Me₃S=0 Trimethylsulfoxoniumiodid; MeMet DL- Methioninmethylsulfoniumchlorid

Beispiele

Zwei S-Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängige C-Methyltransferasen aus Streptomyces rishiriensis (CouO) und Streptomyces spheroides (NovO) wurden geklont und in E. coli überexprimiert. Die Methyltransferasen CouO und NovO sind an der Biosynthese der Aminocoumarinantibiotika

Coumermycin AI in Streptomyces rishiriensis und Novobiocin in Streptomyces spheroides, beteiligt.

Aminocoumarine bilden einen Teil der Antibiotikamoleküle, die in den bereits vorhin erwähnten Stämmen produziert werden. Der Aminocoumarinteil ist das Substrat für den Methyltransfer vom natürlichen Cofaktor SAM.

Die SAM-abhängige Methyltransferase, die an der Biosynthese des Antibiotikums Novobiocin beteiligt ist, wurde 1960 entdeckt. Der gesamte Gen-Cluster zur Biosynthese von Coumermycin AI in

Streptomyces rishiriensis und das Gen CouO, das für die Methyltransferase kodiert, sind bereits intensiv untersucht worden, ebenfalls der Gen-Cluster der Novobiocinsynthese in Streptomyces spheroides. Diese Methyltransferasen katalysieren den Transfer des Methylrestes vom SAM selektiv auf die Position 8 des Coumarinringes. Hier wurden zum ersten Mal Methylsulfonium- und

Methylsulfoxoniumsalze (Figur 2) gezeigt, die sich in einer von SAM-abhängigen Methyltransferase katalysierten Methylierung als vorteilhaft erwiesen. Experimenteller Teil

1.1. Materialien

1.1.1. Klonierung und Expression

Für die Klonierung und der heterologen Expression der Methyltransferasen-kodierenden Gene NovO und CouO wurde das genomische DNA der Stämme Streptomyces spheroides (DSMZ 40292) und Streptomyces rishiriensis (DSMZ 40489) entsprechend des Protokolls von Kieser et al. (Practical Streptomyces Genetics (Eds.: T. Kieser, et al.), The John Innes Foundation, Norwich, 2000) isoliert. Die Gene wurden nach Standard PCR-Konditionen amplifiziert, wobei der Vorwärtsprimer 5'- AATCTG CATATG AAG ATTG AACCG ATTAC-3' und der Rückwärtsprimer 5'- TAGGTAAAGCTTTCAGGCAGCGGCCCGACGGG-3' verwendet wurden. Diese Primer führten jeweils die Restriktionsstellen Ndel und Hindill (siehe unterstrichenen Teil des Primers) für die anschließende Klonierung in den Expressionsvektor pET26b(+) ein. Die PCR-Produkte wurden am Gel gereinigt, mit Ndel und Hindlll verdaut und in den linearisierten pET26b(+)-Vektor ligiert. Die Verwendung dieser Primer für beide Gene hatte zwei Aminosäureaustausche im Falle von ovO (A5P und S223C) zur Folge.

Die Expressionskonstrukte pET26b(+)-CouO und pET26b(+)-NovO wurden jeweils in elektrokompetente E. coli BL21Gold(DE3)-Zellen zwecks Proteinexpression transformiert. Transformanten mit den gewünschten Konstrukten wurden bei 30°C in LB Medium, das mit 40 g/ml Kanamycin ergänzt wurde, zu einer OD₆oo von 0,8 kultiviert. Anschließend wurde die Temperatur auf 25°C herabgesetzt und mit 100 mM Endkonzentration an Isopropyl-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Das Wachstum wurde für 16h bei 25°C fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (10 Minuten bei 4000 xg) geerntet, in Puffer A (50 mM Na-phosphatpuffer pH 7 (6,5 für NovO) resuspendiert und durch

Ultraschall für 6 Minuten aufgeschlossen. Die unlöslichen Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugieren (60 Minuten bei 50000 xg) abgetrennt und entfernt. Der Überstand wurde über SDS-PAGE analysiert und für enzymatische Umsetzungen bei 4°C gelagert. Der unlösliche Zellkuchen wurde in Puffer A resuspendiert und ebenfalls am SDS-PAGE analysiert.

1.1.2. Synthese von Aminocoumarin-Modellsubstraten

2,4-Diacetoxybenzoesäure

Unter Rühren und lichtgeschützt wurde zu einer Lösung von 5,0 g 2,4-Dihydroxybenzoesäure (32,4 mmol, 1 Eq.) in 30 mL Pyridin, 15,3 mL Essigsäureanhydrid (16,6 g, 162 mmol, 5 Eq.) und 0,40 g DMAP (3,24 mmol, 0,1 Eq.) zugesetzt. Nach 24h wurde Eis zur Reaktionslösung zugesetzt. Mit wässrigem 3N HCl wurde die Lösung angesäuert. Die resultierende Suspension wurde 3x mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und anschließend mit wasserfreiem Na₂S0₄ getrocknet. Die Lösung wurde auf ca. 15 mL

aufkonzentriert und durch Stehenlassen kristallisierte das Produkt aus. Das abfiltrierte Produkt wurde über CaCI₂ getrocknet. Eine zweite Produktcharge fiel aus der Mutterlauge aus. Insgesamt wurden 7,2 g (93%) creme-weiße Kristalle gesammelt. *H NMR (300MHz, DMSO-d6) δ ppm: 13,12 (br, 1H, -COOH), 7,98 (d, J = 8,6Hz, 1H, -CHar-), 7,18 (dd, Jl = 8,6, J2 = 2,3Hz, 1H, - CHar-), 7,09 (d, J = 2,2Hz, 1H, -CHar-), 2,29 (s, 3H, -CH3), 2,25 (s, 3H, -CH3). ¹³C (75MHz) 6 ppm: 169,0, 168,6, 165,0, 154,0, 151,1, 132,5, 121,6, 119,7, 117,6, 20,8, 20,8.

2, 4-Diacetoxybenzoylchlorid

2,0 g 2,4-Diacetoxybenzoesäure (8,4 mmol, 1 Eq.) wurde in 20 mL CH₂CI₂ gelöst. 12 mL SOCI₂ (20 g, 165 mmol, 20 Eq.) wurde der gerührten Lösung zugesetzt. Die Mischung wurde für 5h auf Rückfluss erhitzt, danach wurden CH₂CI₂ und SOCI₂ abdestilliert. Der resultierende braune Feststoff wurde für die nächste Stufe ohne weitere Charakterisierung eingesetzt.

2-(Tert-butoxycarbonylamino)-3-ethoxy-3-oxopropansäure Zu einer Suspension von 4,49 g KOH (80 mmol, 1 Eq.) in 100 mL EtOH wurde 20,4 mL Diethyl 2-(Tert- butyloxycarbonylamino)propandisäureester (22,0 g, 80 mmol, 1 Eq.) zugesetzt. Die Mischung wurde für 3h gerührt und anschließend ca. 90% des Lösungsmittels entfernt. 150 mL einer IM wässrigen NaHC0₃-Lösung wurde zugesetzt und 2x mit Ethylacetat gewaschen, um das nicht-reagierte Edukt zu entfernen. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt, mit KHS0₄ angesäuert und 3x mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und über Na₂S0₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck (Badtemperatur 20°C) abgezogen. Das verbleibende Öl wurde unter Vakuum getrocknet. Das Produkt ist ein weißes Pulver und betrug 14,45 g (73%). ^XH NMR (500MHz, CDCI₃) δ ppm: 7,73 (d, J = 4,4Hz, 0,6H, -NH-), 5,65 (d, J = 6,8Hz, 0,4H, -NH-), 4,98 (d, J = 7,3Hz, 0,4H, -CH-), 4,77 (d, J = 4,9Hz, 0,6H, -CH-), 4,23-4,31 (m, 2H, -CH2- ), 1,42 (s, 9H, 3 -CH3), 1,31 (t, J = 7,3Hz, 3H, -CH3). ¹³C (125MHz) 6 ppm: 168,5, 166,9, 156,4, 83,0, 63,0, 58,9, 28,3, 14,3.

4-(2-(Tert-butoxycarbonylamino)-3-ethoxy-3-oxopropanoyl)-l,3-phenylendiacetat

Zu einer eisgekühlten Lösung von 2-(Tert-butyloxycarbonylamino)-3-ethoxy-3-oxopropansäure (2,91 g, 11,8 mmol, 1,4 Eq.) in trockenem THF (30 mL) wurden 7,4 mL Triethylamin (5,36 g, 52,8 mmol, 6,3 Eq.) und 2,69 g MgCI₂ (28,3 mmol, 3,4 Eq.) zugesetzt und die resultierende Suspension für 2h stark gerührt. Die Rohsubstanz 2,4-Diacetoxybenzoylchlorid (theoretische Menge 8,4 mmol, 1 Eq.) in 50 mL trockenem THF wurde der Lösung zugesetzt und die resultierende Suspension über Nacht bei

Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter wässriger NH₄CI-Lösung gequencht, bis sich eine klare Lösung bildete. Die Lösung wurde 3x mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na₂S0₄ getrocknet. Nach Abziehen des Lösungsmittels blieb 4,31 g (121%) eines dunkelbraunen Öls, welches ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe eingesetzt wurde.

Tert-butyl 4,7-dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-ylcarbamat 4

Die Rohsubstanz 4-(2-(Tert-butyloxycarbonylamino)-3-ethoxy-3-oxopropanoyl)-l,3-phenylendiacetat (4,31 g) wurde in 24 mL MeOH gelöst und 30 mL 1,5 N NaOH zugesetzt. Die Lösung wurde für 3h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Lösung mit 1 N HCl auf pH 3 angesäuert und 3x mit Essigsäureethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCI- Lösung gewaschen, über Na₂S0₄ getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum abgezogen.

Das Rohprodukt wurde mittels Chromatographie gereinigt. Die Ausbeute betrug 1,24 g (50% über drei Stufen) eines orangen Feststoffes. H NMR (500MHz, DMSO-d6) 5 ppm: 7,78 (s, 1H, -NH-), 7,64 (d, J = 8,8Hz, 1H, -CHar-), 6,77 (dd, Jl = 8,8, J2 = 2,0Hz, 1H, -CHar-), 6,66 (d, J = 2Hz, 1H, -CHar-), 1,40 (s, 9H, - CH3). ¹³C NMR (125MHz) δ ppm: 166,4, 161,9, 161,6, 155,4, 154,1, 125,7, 113,5, 108,.7, 102,5, 100,8, 79,3, 28,9.

3-Amino-4, 7-dihydroxy-2H-chromen-2-on hydrochlorid

Zu einer gekühlten Lösung von 25 mL Et₂0 und 5 mL MeOH wurde vorsichtig 4,3 mL Acetylchlorid zugesetzt. Die saure Lösung wurde zu einer gekühlten und gerührten Lösung von 1,24 g tert-butyl 4,7- dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-ylcarbamat in 25 mL Et₂0 und 5 mL MeOH (IN HCl in der Reaktionslösung) gegossen. Die Lösung wurde für weitere 24h bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet. Die Ausbeute betrug 0,52 g (53%) eines leicht braunen Feststoffes. ^XH NMR (500MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,96 (d, J = 8,8Hz, 1H, -CHar-), 6,84 (dd, Jl = 8,8Hz, J2 = 2,0Hz, 1H, -CHar-), 6,75 (d, J = 2,0Hz, 1H, -CHar-). ¹³C NMR (125MHz) δ ppm: 162,7, 161,5, 160,4, 154,2, 126,4, 113,9, 108,7, 103,0, 95,5.

N-(4, 7-Dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl)benzamid 4a

Zu einer gerührten Lösung von 200 mg 3-Amino-4,7-ihydroxy-2H-chromen-2-on hydrochlorid (0,87 mmol, 1 Eq.) in 10 mL Ethylacetat wurden 0,51 mL Benzoylchlorid (0,61 g, 4,4 mmol, 5 Eq.) und 1,22 mL Triethylamin (0,88 g, 8,7 mmol, 10 Eq.) zugesetzt. Die Suspension wurde über Nacht bei

Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Niederschlag wurde abfiltriert und das Lösungsmittel einrotiert. Der verbliebene Feststoff wurde in 10 mL MeOH gelöst und 10 mL IN NaOH zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde für 24h gerührt, anschließend mit IN HCL auf pH 3 angesäuert und 3x mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter NaCI-Lösung gewaschen, über Na₂S0₄ getrocknet, Celite zugesetzt und das Lösungsmittel unter Vakuum abgezogen. Das feine braune Pulver wurde durch Chromatographie gereinigt. Die Ausbeute betrug 243 mg (94%) eines orangen Feststoffes. H NMR (500MHz, DSMO-d6) 5 ppm: 11,82 (s, 1H, -OH), 10,56 (s, 1H, -OH), 9,42 (s, 1H, -NH-), 8,00 (d, J = 7,3Hz, 2H, -CHar-), 7,72 (d, J = 8,8Hz, 1H, -CHar-), 7,58 (t, J = 7,3 Hz, 1H, - CHar-), 7,51 (t, J = 7,6Hz, 2H, -CHar-), 6,83 (dd, Jl = 8,8Hz, J2 = 2,0Hz, 1H, -CHar-), 6,74 (d, J = 2,4Hz, 1H, -CHar-). ¹³C (125MHz) δ ppm: 166,6, 161,4, 160,8, 160,3, 153,5, 133,9, 131,6, 128,2, 128,0, 125,0, 113,0, 107,9, 101,9, 100,1.

N-(4, 7-Dihydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-yl)-l H-pyrrol-2-carboxamid 4b

Eine Mischung aus 200 mg 3-Amino-4,7-dihydroxy-2H-chromen-2-on hydrochlorid (0,87 mmol, 1 Eq.), 97 mg lW-pyrrole-2-carboxysäure (0,87 mmol, 1 Eq.), 454 mg (Benzotriazol-l-yloxy)

Tripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphat (PyBOP) (0,87 mg, 1 Eq.) und 770 μί N- Methylmorpholin (707 mg, 7,0 mol, 8 Eq.) in 12 mL DMF wurde für 27h bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre gerührt. Weitere 227 mg PyBOP (0,44 mmol, 0,5 Eq.) wurden der Lösung zugesetzt und weitere 66h gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit IN HCI-Lösung angesäuert und 3x mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit gesättigter NaCI- Lösung gewaschen und über Na₂S0₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das resultierende braune Öl wurde in Ethylacetat aufgenommen. Es bildete sich eine Suspension. Der abfiltrierte Feststoff bildete das gewünschte Produkt. Aus der Mutterlauge wurde weiters einProdukt gewonnen und in Cyclohexan umkristallisiert. Das getrocknete Produkt ergab eine Ausbeute von 180 mg (72%) eines braunen Pulvers. ^XH NMR (500MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,01 (br, 1H, -OH), 11,65 (s, 1H, -NH-) 10,57 (br, 1H, -OH), 9,30 (s, 1H, -NH-), 7,69 (d, J = 8,3Hz, 1H, -CHar-) 7,01 (s, 1H, -CHpyrr-), 6,94 (s, 1H, -CHpyrr-), 6,81 (dd, Jl = 8,8, J2 = 2,0Hz, 1H, -CHar-), 6,71 (d, J = 2Hz, 1H, -CHar-), 6,15 (s, 1H, - CHpyrr-). ¹³C NMR (125Hz) δ ppm: 162,0, 161,6, 161,5, 160,3, 154,0, 126,2, 125,7, 123,1, 113,7, 112,9, 109,7, 108,8, 102,6, 100,9.

1.1.3. Aktivitätsassay der Methyltransferase Die enzymatische Umsetzung wurde entsprechend dem dargestellten Schema (Enzymatische Synthese von Alkylcoumarinderivaten) durchgeführt:

Methyldonor

Für die Aktivitätsuntersuchung wurden Modelsubstrate mit hoher Ähnlichkeit zu den natürlichen Substraten dieser Enzyme ausgewählt und synthetisiert (Figur 3). Die möglichen Methylquellen (Figur 2) wurden bezüglich ihrer Aktivität mit beiden Enzymen CouO und NovO getestet. Zu Beginn der Untersuchungen betreffend alternativer Cofaktoren wurden Konzentrationen an Sulfoniumsalzen von 1 M gewählt, damit in einem ähnlichen Konzentrationsbereich gearbeitet wurde, der von der

Arbeitsgruppe Klimasauskas berichtet worden war (siehe S. Klimasauskas et al., Nat. Chem. Biol. 5, 2009, 400-402). Diese Arbeitsgruppe konnte eine Hydroxyalkylierung zeigen, die durch DNA- Methyltransferase katalysiert wurde, dabei wurden Formaldehyd und Acetaldehyd als SAM- Substituenten mit einer 0,8 M Konzentration verwendet. Für die enzymatische Umsetzung wurden geerntete Zellen der rekombinanten E.coli verwendet, die lx im flüssigen Stickstoff gefroren und anschließend aufgetaut wurden. 0,1 g aufgebrochene Zellen per mL Puffer (100 mM Phosphatpuffer pH 6,5 für NovO und pH 7,0 für CouO) wurden für die Untersuchungen verwendet. Verschiedene Negativkontrollen wurden durchgeführt, um die chemische Produktbildung ausschließen zu können. Es wurde keine Produktbildung detektiert, wenn kein Enzym zugesetzt wurde oder vor dem Zusatz das Enzym thermisch inaktiviert wurde (Inaktivierung vor dem Gebrauch für 30 Minuten bei 85°C). Bei einer Konzentration von 1 M ist Trimethylsulfoxoniumiodid nicht löslich, während

Trimethylsulfoniumiodid und Methioninmethylsulfoniumchlorid bei dieser Konzentration vollständig gelöst sind. Der Umsatz betrug 5-20% (höchster Umsatz mit Verbindung 2). Der Einfluss der

Konzentration der alternativen Cofaktoren auf den Umsatz wurde in weiteren Versuchen untersucht. Der Konzentrationsbereich wurde in zwei unabhängigen Versuchen von 2 mM bis 1 M untersucht. Die Ergebnisse sind in den Figuren 4 und 5 zusammengefasst.

Die Reaktionen wurden in 0,2 mL Maßstab in einem Thermomixer bei 30°C und 1000 UpM für 24h durchgeführt. Die Lösungen enthielten 1 mM (mmolar) Substrat aus einer 10 mM Stocklösung in DMSO (Dimethylsulfoxid), 2 mM SAM (A7007 von Sigma) aus einer Stocklösung in 50 mM

Phosphatpuffer (Positivkontrolle) oder die Sulfoniumsalze in unterschiedlichen Konzentrationen, 1 mg/mL BSA (Rinderserumalbumin A3294 von Sigma) und aufgebrochene Zellen, die die rekombinanten Proteine CouO bzw. NovO enthielten. Die Reaktion wurde durch Aufheizen der Reaktionsgefäße auf 85°C für 15 Minuten abgestoppt. Anschließend wurden die Reaktionsgefäße für 15 Minuten in den Kühlschrank gestellt. Danach wurden die Mischungen bei 14000 UpM für 15 Minuten zentrifugiert. 3 μί der wässrigen Lösung wurden ohne weitere Verdünnung in die HPLC eingespritzt. Diese Screening wurde 3x wiederholt. Die Analyse erfolgte auf einem 1200 Agilent HPLC-System ausgerüstet mit Autosampier, Multiwave-UV- und SingleQuad MS-Detektor. Die MS-Signale wurden im Scan und SIM ESI-positiv Modus gesammelt. Eine 100 x 2 mm Chromolith^® Performance RP-18e Säule der Firma Merck wurde verwendet. Das Eluent bestand aus 10 mM Ammoniumacetat-Puffer pH 5,5 und Acetonitril 95:5 bzw. 96:4. Der Fluss betrug 0,7 mL/min bei 40°C Säulentemperatur. R_rWerte sind:

4a: 2,3 Minuten; 8-Methyl-4a: 4,9 Minuten

Um zu untersuchen, ob die Methyldonoren über die Methylierung von SAH, SAM rezyklieren, wurden Experimente mit zwei unterschiedlichen SAH-Konzentrationen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 6 dargestellt.

2. Ergebnisse und Schlussfolgerungen

Zwei SAM-abhängige Methyltransferasen CouO und NovO sind entdeckt worden, die

überraschenderweise alternative Alkyldonoren als Cofaktoren für Methylierungen akzeptieren. Ein einziges Produkt wurde gebildet, obwohl eine sehr große Menge des Methylierungsreagenzes verwendet wurde, welche billig, kommerziell erhältlich und ungiftig ist. Bei den alternativen

Cofaktoren handelt es sich um Trimethylsulfoniumhalogenid, Trimethylsulfoxoniumhalogenid und DL- Methioninmethylsulfoniumhalogenid.

Dem Verlauf des Umsatzes zufolge liefert DL-Methioninmethylsulfoniumhalogenid ein anderes Verhalten als die zwei anderen alternativen Cofaktoren. Verbindung 3 hat ein Konzentrationsoptimum von ca. 100 mM für beide Enzyme und ist höher als die beiden anderen Verbindungen (Figur 4 und 5). Ebenso zeigt Verbindung 3 den höchsten Umsatz mit beiden Enzymen im Vergleich zu den anderen zwei Verbindungen. Für die Salze 1 und 2 zeigt eine Konzentration von 25 mM die besten Ergebnisse. Sehr hohe Konzentrationen an Sulfonium- bzw. Sulfoxoniumsalzen scheinen die Enzyme zu inhibieren.

Eine starke Hintergrundreaktion wurde gefunden. Bei der Verwendung von aufgebrochenen Zellen konnte auch ohne Methyldonorzusatz Produktbildung festgestellt werden. Dennoch, der Zusatz von einer der drei Methyldonoren erhöht den Umsatz im Vergleich zu den Versuchen ohne Zusatz von alternativen Methyldonoren. Im Moment ist der Reaktionsmechanismus dieser„alternativen

Cofaktoren" nicht geklärt. Ob die Methylgruppe direkt vom alternativen Cofaktor zum Substrat transportiert wird oder ob eine Transmethylierung vor der Substratmethylierung stattfindet, ist Gegenstand weiterer Untersuchungen.

Die Alkyltransferaseaktivität von CouO und NovO zeigt den ersten Fall einer enzymkatalysierten Friedel-Crafts-Reaktion. Diese S-Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängigen Methyltransferasen sind in der Lage,„nicht-natürliche" Cofaktoren (alkylierte SAH-Derivate) zu akzeptieren und den Alkylrest regioselektiv und mit hoher Ausbeute auf das aromatische System zu übertragen. Die Substratbreite dieser Enzyme ist breiter als zunächst erwartet wurde. Die Umsetzung von komplett unterschiedlichen Substraten als die natürlichen Substrate machen diese Enzyme zu attraktiven Katalysatoren für die organische Synthese. Für SAM, die natürliche Verbindung, wurden bereits Ansätze zur Steigerung der Produktion gemacht, worin die Stoffwechselwege verändert wurden. Pichla pastoris und

Saccharomyces cerevisiae Mutanten sind generiert worden, die große SAM-Mengen bis zu 13,5 g/L produzieren. Trotzdem haben Methyltransferasen als Enzyme zur C-C-Bindungsbildung den Zugang zur industriellen Biotechnologie noch nicht gefunden. Der Hauptgrund dafür ist der hohe Preis. Die Verwendung von billigen und kommerziell erhältlichen Alkyldonoren könnte den Weg für die Verwendung von SAM-abhängigen Methyltransferasen zur selektiven Alkylierung ebnen. Um diese „Hochenergie"-Verbindung zu ersetzen, wurden einfache Alkylsulfoniumsalze in dieser Studie zum ersten Mal erfolgreich eingesetzt. Die spezifische Aktivität von diesen Methyltransferasen für nichtnatürliche Cofaktoren ist nicht so hoch wie für der natürliche Cofaktor SAM. Gleichzeitig steigert der Ersatz von SAM durch einfache Methyldonoren die Atomökonomie drastisch. Die Selektivität der Enzyme führt zur Vermeidung von Nebenprodukten. Die Verwendung von Enzymen als Katalysatoren bringt alle allgemeinen Vorteile von enzymatischen Umsetzungen, wie milde Reaktionsbedingungen und Abfallreduktion, mit sich. Die Alkylsulfoniumsalze sind billige, kommerziell-erhältliche und ungiftige Alkylierungsreagenzien.

Jede S-Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängige Homocystein-S-Methyltransferase, die eine

Methylgruppe von SAM auf Homocystein transferieren kann, kann verwendet werden, wie z.B. L- Homocystein-S-Methyltransferase, die von Shapiro und Stanley (Methods Enzymol. 17 Pt.B, Sulfur Amino acids, pp. 400-405 (1971)) und Shapiro (Biochim. Biophys. Acta. 29:405-9 (1958)) beschrieben wurde und noch mehr bevorzugt sind die SAM-abhängige Homocystein-S-Methyltransferasen aus E.coli (Thanbichler et al., J. Bacteriol., 181(2):662-5 (1999)) oder aus Saccharomyces cerevisiae (Shapiro et al., J. Biol. Chem., 239(5):1551-6 (1964) und Thomas et al., JBiol. Chem., 275(52):40718-24 (2000)).

Claims

Neue Ansprüche: l.Verfahren zum Transfer einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe auf eine niedermolekulare

Verbindung („small molecule") mit einem nukleophilen Zentrum umfassend den Schritt des

Kontaktierens der Verbindung mit einer S-Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängigen Methyltransferase in Anwesenheit eines alkylierten Sulfoniumsalzes mit der allgemeinen Formel (I)

nes alkylierten Sulfoxoniumsalzes mit der allgemeinen Formel (II)

Θ

R²-S=0

Θ

R³ x (ii) θ 1 2 3

wobei ein organisches oder anorganisches Anion ist und R , R und R jeweils unabhängig voneinander eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppe umfassend 1 bis 10 Kohlenstoffatome ist und die Alkylgruppe keine Adenosylgruppe umfasst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppe 1 bis 8 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 7 Kohlenstoffatome, mehr bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatome, insbesondere 1 Kohlenstoffatom, umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkyl-, Alkenyl- und

Alkinylgruppe mit mindestens einer Carboxyl-, Carbonyl- und/oder Aminogruppe substituiert ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkylgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyl und 2-Aminobutyryl.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die niedermolekulare Verbindung ein aliphatisches oder aromatisches Substrat mit einer Molekülmasse kleiner als 1 kDa (1000 g/mol) ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die aromatische Verbindung mindestens einen homozyklischen oder heterozyklischen aromatischen Ring umfasst.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die SAM-abhängige Methyltransferase eine Methyltransferase ist, die niedermolekulare Verbindungen methyliert.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das organische oder anorganische Anion aus der Gruppe der Halogenide oder Sulfonate gewählt ist.

9. Kit zum Transfer einer Alkyl-, Alkenyi- oder Alkinyigruppe auf ein Substrat umfassend eine S- Adenosyl-L-methionin (SAM)-abhängige Methyltransferase und ein alkyliertes Sulfoniumsalz mit der allgemeinen Formel (I)

oder Sulfoxomiumsalz mit der allgemeinen Formel (II)

dadurch gekennzeichnet, dass R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyi- und Alkinyigruppe umfassend 1 bis 10 Kohlenstoffatome ist und die Alkylgruppe keine Adenosylgruppe umfasst.