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WO2013065574A1 - 標的核酸の検出法 - Google Patents

標的核酸の検出法 Download PDF

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WO2013065574A1
WO2013065574A1 PCT/JP2012/077596 JP2012077596W WO2013065574A1 WO 2013065574 A1 WO2013065574 A1 WO 2013065574A1 JP 2012077596 W JP2012077596 W JP 2012077596W WO 2013065574 A1 WO2013065574 A1 WO 2013065574A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
probe
nucleic acid
labeled
quencher
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/077596
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
憲光 保坂
誠司 東出
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eiken Chemical Co Ltd
Original Assignee
Eiken Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eiken Chemical Co Ltd filed Critical Eiken Chemical Co Ltd
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Priority to CN201280058995.6A priority patent/CN103975061A/zh
Priority to HK14112730.4A priority patent/HK1199287A1/xx
Priority to ES12845733T priority patent/ES2755934T3/es
Priority to JP2013541737A priority patent/JP6085564B2/ja
Priority to AU2012333771A priority patent/AU2012333771B2/en
Priority to CA2857308A priority patent/CA2857308C/en
Priority to US14/354,991 priority patent/US10876160B2/en
Priority to EP12845733.0A priority patent/EP2787077B1/en
Publication of WO2013065574A1 publication Critical patent/WO2013065574A1/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid and a kit used for the detection.
  • the detection method of target nucleic acid using the complementarity of nucleobase sequence has long been started with Southern hybridization, and various improvements have been made. Target nucleic acid can be detected.
  • a detection method using a detection probe containing a nucleic acid complementary to the target nucleic acid and bound to a label such as a radioisotope (RI), a luminescent agent, or a fluorophore has been developed.
  • RI radioisotope
  • a luminescent agent or a fluorophore
  • RI radioisotope
  • fluorophore a label that is associated with a plurality of RIs having different emission energies, or when labeling with a plurality of luminescent agents (or fluorescent agents) having different wavelengths of emitted light.
  • SNP Single Nucleotide Polymorphism
  • Q probe Quantenching Probe
  • the target nucleic acid is labeled with a radioisotope or the like, and annealed with an oligonucleotide probe that is complementary to the target nucleic acid and immobilized on the solid phase surface, thereby simultaneously detecting the amount of the plurality of target nucleic acids.
  • a method for detecting a target nucleic acid utilizing the complementarity of nucleic acid base sequences such as so-called DNA chips and microarrays (Patent Document 2).
  • nucleic acid amplification methods include Polymerase ChainPCRReaction (PCR) (Patent Literature 3 and Patent Literature 4), Strand Displacement Amplification (SDA) (Patent Literature 5), Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) (Patent Literature 6). , Rolling Circle Amplification (RCA) (Non-patent Document 1), and Loop-mediated isothermalificationAmplification (LAMP) (Patent Document 7). These nucleic acid amplification methods also enable detection of the target nucleic acid.
  • PCR Polymerase ChainPCRReaction
  • SDA Strand Displacement Amplification
  • NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplification
  • RCA Rolling Circle Amplification
  • LAMP Loop-mediated isothermalificationAmplification
  • the PCR method is frequently used as a method for amplifying nucleic acids.
  • the PCR method uses a thermostable polymerase and two primers complementary to the target nucleic acid to (1) denature the double-stranded target nucleic acid, (2) anneal the primer to the denatured target nucleic acid, (3) primer
  • This is a method of amplifying a target nucleic acid exponentially by advancing three steps, ie, an extension reaction from, by performing temperature control and repeating these three steps.
  • the presence or absence of the amplified product can be detected by electrophoresis of the amplified product after the reaction and using an intercalator such as ethidium bromide (EtBr) or Cyber Green (SYBR (registered trademark) Green).
  • EtBr ethidium bromide
  • SYBR registered trademark
  • Patent Document 9 an oligonucleotide probe typified by TaqMan (registered trademark) probe to which a fluorescent agent and a quencher are added adjacently is added during the PCR amplification reaction, and the PCR reaction is performed.
  • the probe is also annealed to the target nucleic acid, and with the extension reaction in step (3), the probe is decomposed by the 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity of the polymerase and released from the quencher.
  • the target nucleic acid can be detected.
  • Patent Documents 10 and 11 have a fluorescent agent added to one of the complementary oligonucleotide probes and a quencher added to the other, with the aim of detecting the target nucleic acid during amplification in the PCR annealing step (above (2)). It has been devised.
  • the LAMP method is characterized in that four types of primers (FIP, BIP, F3 and B3) are set for six regions of a target nucleic acid, and amplified at a constant temperature using a strand displacement reaction.
  • LB loop primer B
  • LF loop primer F
  • the target nucleic acid can be amplified 10 9 to 10 10 times in 15 minutes to 1 hour due to its high amplification efficiency, and the presence or absence of the target gene sequence can be determined based on the presence or absence of amplification products due to its extremely high specificity. It is also possible to do.
  • pyrophosphate ions which are by-products of the nucleic acid amplification reaction, are measured as insoluble salts (magnesium salts), the turbidity of the reaction solution is measured, or the pyrophosphate ions are reacted with a calcein-manganese complex, The presence of the amplification product is detected by detecting the fluorescence of the liberated calcein (fluorescent substance) (Patent Document 13). Furthermore, a detection method using a fluorescent probe has been established (Patent Documents 14 and 15).
  • Non-patent Document 2 a method for detecting a target nucleic acid amplified by the LAMP method using a fluorescently labeled primer and a probe labeled with a quencher has been reported (Non-patent Document 2). Specifically, the target nucleic acid was amplified by the LAMP method using a fluorescently labeled primer, and after amplification, a probe labeled with a quencher was added and free fluorescent labeling that did not contribute to the amplification of the target nucleic acid was performed.
  • each of the above nucleic acid detection methods has advantages and disadvantages, and particularly requires expensive precision instruments for reaction and detection, and further includes various steps. Therefore, many of them require skill, and these nucleic acid detection techniques are exclusively used. It was performed in a specific laboratory specializing in nucleic acid amplification. In addition, for example, in the detection method described in Non-Patent Document 2, it is necessary to add a quencher after the amplification reaction. When the lid of the reaction vessel is opened and closed, the contamination of the sample or the experimental environment is caused by scattering of amplification products. May cause a nation.
  • nucleic acid Amplification Test Nucleic acid Amplification Test: NAT
  • nucleic acid Amplification tests are also used in tests performed for the purpose of ensuring the safety of blood products against various viruses in the pharmaceutical field. Because of this popularization and generalization trend, so that nucleic acid amplification tests that have been performed only in specific laboratories dedicated to nucleic acid amplification can be performed in any place or scene such as general laboratories, fieldwork, bedside, etc.
  • a nucleic acid detection technique that can be used conveniently and does not contaminate the test environment, and more preferably a technique that can simultaneously detect multiple items.
  • JP 2001-286300 A Special Table 2001-521622 JP-A-61-274697 JP 62-000281 A Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-192195 JP-A-2-005864 Japanese Patent No. 3313358 JP-A-2-002934 JP-T 6-500021 Japanese Patent Laid-Open No. 10-262700 Special Table 2004-511227 International Publication No. 2002/024902 JP 2004-283161 A JP 2001-272475 A International Publication No. 2009/051214
  • An object of the present invention is to provide a novel method for detecting a target nucleic acid. More specifically, an object of the present invention is to provide a method for detecting a target nucleic acid that is simpler and less expensive than the prior art, a kit used for detection, and the like.
  • the present inventors have newly developed a method capable of easily amplifying and detecting a nucleic acid in a closed system. Specifically, in a method for detecting a target nucleic acid amplified by the LAMP method using a fluorescently labeled primer and a probe labeled with a quencher, it is possible to add a fluorescently labeled primer and a quencher labeled probe before the amplification reaction Therefore, a difference was made in the melting temperature (hereinafter referred to as Tm) of the two, and the fluorescent labeled primer was more easily annealed to the target nucleic acid more selectively in the presence of the quencher labeled probe depending on the reaction temperature condition.
  • Tm melting temperature
  • the present inventors can not only combine the above method with amplification by the LAMP method, but also can combine it with any other nucleic acid amplification method and do not include a target nucleic acid amplification step, ie, fluorescent labeling. It has been found that the present invention can be carried out even if the primer is used as a mere probe and the problems of the present invention can be solved, and the present invention has been completed.
  • a method for detecting one or more types of target nucleic acids present in a sample comprising the following steps: (1) a fluorescently labeled primer or probe, which is an oligonucleotide complementary to the target nucleic acid, labeled on the sample with a fluorescent agent; Adding a quencher-labeled probe that is complementary to the fluorescently labeled primer or probe and labeled with a quencher, and is an oligonucleotide having a lower melting temperature (Tm) than the fluorescently labeled primer or probe; (2) keeping the sample at a temperature not higher than the melting temperature (Tm) of the fluorescently labeled primer or probe and higher than the melting temperature (Tm) of the quencher labeled probe; (3) keeping the sample at a temperature equal to or lower than the melting temperature (Tm) of the quencher-labeled probe; (4) The fluorescence of the fluorescently labeled
  • [2] The detection method according to [1], wherein the target nucleic acid is amplified during the incubation in step (2).
  • [3] The detection method according to [2], wherein the amplification of the target nucleic acid is performed under isothermal conditions.
  • [4] The detection method according to any one of [1] to [3], wherein the oligonucleotide base length of the quencher labeled probe is shorter than the base length of the fluorescently labeled primer or probe oligonucleotide.
  • [5] The detection method according to any one of [1] to [3], wherein the oligonucleotide of the quencher-labeled probe contains a modified base.
  • [6] The detection method according to any one of [1] to [5], wherein the fluorescently labeled primer or probe is used while being immobilized on a solid surface.
  • [7] In order to detect two or more types of target nucleic acids, a combination of two or more types of fluorescently labeled primers or probes having different emission wavelengths and a corresponding quencher labeled probe is used. The method of crab.
  • [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the fluorescence measurement in the step (4) is a visual determination.
  • [9] The method according to any one of [1] to [7], wherein the fluorescence measurement in the step (4) is determination by a fluorescence detection device.
  • Tm melting temperature
  • Non-Patent Document 2 When the method of Non-Patent Document 2 was followed, if a fluorescently labeled primer and a quencher labeled probe were added before the amplification reaction, the amplification reaction did not occur normally and it was difficult to detect the target nucleic acid.
  • the target nucleic acid is preferentially obtained even in the presence of the quencher-labeled probe by shifting the melting temperature (Tm) of the fluorescence-labeled primer or probe (hereinafter, fluorescent-labeled primer / probe) and the quencher-labeled probe. And annealing of fluorescently labeled primers.
  • Such an effect of the present invention is effectively exhibited not only in the method of Non-Patent Document 2 including the amplification step, but also in other modes not including the amplification step.
  • the present invention since it is not necessary to add a quencher-labeled probe after the amplification reaction, there is no concern about contamination between samples or experimental environment due to scattering of amplification products. Compared to conventional hybridization methods, it does not include washing steps, temperature control is relatively simple, and precision is not required. Therefore, it is more convenient, less expensive, and requires no special techniques or equipment. Can be detected.
  • Example 2 The fluorescence detection before and after the addition of CT-LBc-Q1-0 (SEQ ID NO: 8) in Example 2 is shown.
  • the reaction tube at the time of UV irradiation after adding a quencher labeled probe after the amplification reaction in Example 4, heating at 95 ° C. for 5 minutes and then cooling to room temperature is shown.
  • the reaction tube at the time of UV irradiation in Example 5 is shown.
  • the real-time turbidity curve of the target nucleic acid using the fluorescence labeled primer / probe and the quencher labeled probe in Example 6 is shown.
  • the reaction tube at the time of UV irradiation after the amplification reaction in Example 6 is shown.
  • the real-time turbidity curve of the target nucleic acid amplification reaction using the single item Chlamydia trachomatis primer, fluorescently labeled primer / probe and quencher labeled probe in Example 7 is shown.
  • the single item in Example 7 shows a reaction tube at the time of UV irradiation after target nucleic acid amplification reaction using Chlamydia trachomatis primer, fluorescently labeled primer / probe and quencher labeled probe.
  • the single item in Example 7 shows the fluorescence wavelength after target nucleic acid amplification reaction using Chlamydia trachomatis primer, fluorescently labeled primer / probe and quencher labeled probe.
  • the real-time turbidity curve of the target nucleic acid amplification reaction using the primer of single item gonococcus in Example 7, a fluorescent label primer / probe, and a quencher label probe is shown.
  • the reaction tube at the time of UV irradiation after the target nucleic acid amplification reaction using the primer of a single item gonococcus in Example 7, a fluorescence labeled primer / probe, and a quencher labeled probe is shown.
  • the fluorescence wavelength after target nucleic acid amplification reaction using the primer of a single item gonococcus in Example 7, a fluorescence labeled primer / probe, and a quencher labeled probe is shown.
  • the real-time turbidity curve of the target nucleic acid amplification reaction using the single item artificial nucleic acid primer, fluorescently labeled primer / probe and quencher labeled probe in Example 7 is shown.
  • the reaction tube at the time of UV irradiation after the target nucleic acid amplification reaction using the primer of a single item gonococcus in Example 7, a fluorescence labeled primer / probe, and a quencher labeled probe is shown.
  • the fluorescence wavelength after the target nucleic acid amplification reaction using the primer of the single item artificial nucleic acid in Example 7, a fluorescence labeled primer / probe, and a quencher labeled probe is shown.
  • the real-time turbidity curve of the target nucleic acid amplification reaction using the two-item S. Chlamydia trachomatis and Koji mold primer in Example 7, a fluorescent label primer / probe, and a quencher label probe is shown.
  • symbols Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae, a fluorescent label primer / probe, and a quencher label probe in Example 7 is shown.
  • symbols Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Example 7, a fluorescent labeled primer / probe, and a quencher labeled probe is shown.
  • the real-time turbidity curve of the target nucleic acid amplification reaction using the two items Chlamydia trachomatis and artificial nucleic acid primer, fluorescently labeled primer / probe and quencher labeled probe in Example 7 is shown.
  • symbol Chlamydia trachomatis and the artificial nucleic acid in Example 7, the fluorescent label primer / probe, and the quencher label probe is shown.
  • the fluorescence wavelength after the target nucleic acid amplification reaction using the two-item Chlamydia trachomatis and the artificial nucleic acid primer, the fluorescently labeled primer / probe and the quencher labeled probe in Example 7 is shown.
  • the real-time turbidity curve of the target nucleic acid amplification reaction using the two items Aspergillus and artificial nucleic acid primer, fluorescently labeled primer / probe and quencher labeled probe in Example 7 is shown.
  • the reaction tube at the time of UV irradiation after the target nucleic acid amplification reaction using the primer of the two-item gonococcus in Example 7, the primer of an artificial nucleic acid, a fluorescent label primer / probe, and a quencher label probe is shown.
  • molds and the artificial nucleic acid in Example 7, the fluorescent label primer / probe, and the quencher label probe is shown.
  • the real-time turbidity curve of the target nucleic acid amplification reaction using the three items Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae and artificial nucleic acid primer, fluorescently labeled primer / probe and quencher labeled probe in Example 7 is shown.
  • symbol Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, and an artificial nucleic acid in Example 7, a fluorescent labeled primer / probe, and a quencher labeled probe is shown.
  • the fluorescence wavelength of the target nucleic acid amplification reaction using the three items Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae and artificial nucleic acid primer, fluorescently labeled primer / probe and quencher labeled probe in Example 7 is shown.
  • Sample is a mixture that is considered to contain “target nucleic acid” to be detected.
  • Samples include living bodies including humans (for example, blood, saliva, body fluids, body tissues, etc.), environments (for example, soil, seawater, environmental waters (hot spring water, bathtub water, cooling tower water, etc.)), or artificial or natural objects (for example, Processed foods such as bread, fermented foods such as yogurt, cultivated plants such as rice and wheat, microorganisms, and viruses), and those that have been subjected to a nucleic acid extraction operation are usually used. If necessary, a nucleic acid purification operation may be added.
  • “Target nucleic acid” is a nucleic acid molecule to be detected according to the present invention.
  • the type of nucleic acid may be deoxyribonucleotide (DNA), ribonucleotide (RNA) and a mixture or conjugate thereof.
  • the bases are naturally occurring nucleotides such as guanine (G), adenine (A), thymine (T), cytosine (C), uracil (U), but other natural and artificial modified bases are used. May be included.
  • the “modified base” means a base in which the five nucleotides are chemically modified.
  • the target nucleic acid needs to be single-stranded for detection, but even a nucleic acid forming a double-stranded or higher-order structure is single-stranded by heat denaturation, alkali denaturation treatment, or the like. It can be used after being converted to.
  • the target nucleic acid of the present invention includes an embodiment to which such a denaturation treatment has been added.
  • cDNA produced by reverse transcription using RNA as a template is also included in the “target nucleic acid”.
  • “Complementary” means that a polynucleotide or oligonucleotide strand anneals with another strand to form a double-stranded structure, and each nucleotide in each strand is Watson-Crick base paired
  • non-Watson-Crick base pairing such as deoxyinosine (dI) and modified nucleotide pairing with a 2-aminopurine base is also used.
  • a “fluorescent agent” is a molecule that, when irradiated with excitation light of a certain wavelength, absorbs its energy to excite electrons and release excess energy as electromagnetic waves (emitted light) when it returns to the ground state. Or a functional group. Specific examples include fluorescein and its derivatives (such as fluorescein phosphoramidide (FAM) and fluorescein isothiocyanate), rhodamine and its derivatives (such as Texas Red), Cy dyes (such as Cy3 and Cy5) ) And the like, but are not limited thereto.
  • fluorescein and its derivatives such as fluorescein phosphoramidide (FAM) and fluorescein isothiocyanate
  • rhodamine and its derivatives such as Texas Red
  • Cy dyes such as Cy3 and Cy5
  • Quencher means a molecule or functional group having an appropriate energy level capable of absorbing the energy of emitted light emitted from a fluorescent agent.
  • a fluorescent agent may be used as a quencher so that tetramethylrhodamine (TAMRA) can be used as a quencher for fluorescein phosphoramidide (FAM).
  • TAMRA tetramethylrhodamine
  • FAM fluorescein phosphoramidide
  • more suitable as a quencher is a molecule or functional group that absorbs the emitted light of the fluorescent agent and does not emit the emitted light itself even when excited. Examples include, but are not limited to, DABCYL, Black Hole Quencher (BHQ TM (Biosearch Technologies)), Eclipse TM Dark Quencher (Epoch Biosciences).
  • Heat retention means placing a sample under a specific temperature.
  • Examples of the heat transfer means include, but are not limited to, a water bath, an air bath, and a metal bath.
  • the melting temperature (Tm) means a temperature at which half of a DNA molecule dissociates into a single strand when a solution of double-stranded DNA is heated.
  • Tm melting temperature
  • Tm ⁇ (1000 ⁇ H) / ( ⁇ 10.8 + ⁇ S + Rln (Ct / 4)) ⁇ ⁇ 273.15 + 16.6 log [Na + ]
  • ⁇ H is the sum of the nearest enthalpy changes in the hybrid [kcal / mol]
  • ⁇ S is the sum of the nearest entropy changes in the hybrid [cal / mol ⁇ K]
  • R is the gas constant (1.987 cal / deg ⁇ mol)
  • Ct represents the total molar concentration [mol / l] of the oligo
  • Na + represents the molar concentration [mol / l].
  • the melting temperature (Tm) varies depending on the nucleotide sequence of the oligonucleotide and its length. The higher the guanine and cytosine contents, the higher the melting temperature (Tm). Therefore, although the annealing temperature is determined by the base sequence and its length, the melting temperature can be adjusted by adding a melting temperature adjusting agent to the reaction solution.
  • fluorescently labeled primer or probe (hereinafter referred to as fluorescently labeled primer / probe) is an “oligonucleotide” to which a “fluorescent agent” is bound, and has a complementarity with the target nucleic acid.
  • the target nucleic acid is not amplified, it is used only as a “probe”, but in an embodiment in which the target nucleic acid is amplified, it can be used as a “primer”.
  • the “fluorescently labeled primer / probe” may be synthesized using (mono) nucleotides to which a fluorescent agent is bound, for example, Alexa Fluor TM nucleotides (Invitrogen), or fluorescent at the 5 ′ end or 3 ′ end of the synthesized oligonucleotide.
  • An agent may be bound.
  • fluorescent-labeled primer / probe that is, when used in the form of “primer”
  • a fluorescent agent should not be bound to the 3 ′ end. More preferred is an “oligonucleotide” having a fluorescent agent bound to the 5 ′ end.
  • the length of the base sequence of the “fluorescently labeled primer / probe” is not particularly limited, but is preferably 15 bases or more, more preferably 20 bases or more, and even more preferably 25 bases or more. Furthermore, the length of the base sequence of the “fluorescently labeled primer / probe” is 30 ° C. in consideration of the annealing with the target nucleic acid and the temperature conditions of the subsequent amplification reaction. Desirably, the temperature is designed to be ⁇ 70 ° C., preferably 50 to 65 ° C.
  • Quencher-labeled probe is an “oligonucleotide” to which a “quenching agent” is bound.
  • the “quencher-labeled probe” may be synthesized using a nucleotide to which a quencher is bound, or a quencher may be bound to the 5 ′ end or 3 ′ end of the synthesized oligonucleotide.
  • the quencher can be bound to a position where the emission light (fluorescence) of the “fluorescence-labeled primer / probe” is effectively extinguished by the quencher. preferable.
  • the 3 ′ end of the “quencher-labeled probe” oligonucleotide is blocked so that no extension reaction occurs. More preferably, when the “fluorescently labeled primer / probe” is an “oligonucleotide” having a fluorescent agent bound to the 5 ′ end, the “quencher” corresponding to the “oligonucleotide” having a quencher bound to the 3 ′ end A “labeled probe” is desirable.
  • the base sequence of the oligonucleotide of the “quencher-labeled probe” is complementary to the base sequence of the “fluorescence-labeled primer / probe” and its length is 2, 3, 4, 5, It is desirable that the sequence is 6, 7, 8, 9, 10 bases or shorter, and the 5 ′ terminal base of the “quencher labeled probe” is the 3 ′ terminal of the “fluorescent labeled primer / probe”. It is more desirable that it is due to the fact that it is less than the base.
  • the “quencher” is substantially more effective than the melting temperature (Tm) of the “fluorescently labeled primer / probe”.
  • the melting temperature (Tm) of the “labeled probe” may be lowered.
  • the nucleotide having a modified base having an effect of lowering the Tm value is, for example, a nucleotide having inosine.
  • the nucleotide sequence of the “quencher-labeled probe” oligonucleotide is designed so that it is at least room temperature (for example, 25 ° C., 26 ° C., 27 ° C., 28 ° C., 29 ° C. or 30 ° C.).
  • the length of the oligonucleotide is preferably 7 bases or more, more preferably 9 bases or more.
  • the melting temperature (Tm) of the fluorescently labeled primer / probe and the quencher labeled probe needs to be different, and the melting temperature (Tm) of the quencher labeled probe is the melting temperature (Tm) of the fluorescently labeled primer / probe.
  • Tm melting temperature
  • the melting temperature (Tm) of the quencher labeled probe is the melting temperature (Tm) of the fluorescently labeled primer / probe.
  • “Adding” to a sample includes an aspect of adding a sample to the reagent in addition to an aspect of adding a reagent such as a fluorescently labeled primer / probe or a quencher labeled probe to the sample.
  • the ratio of use in the addition of “fluorescently labeled primer / probe” and “quencher labeled probe” may be 1: 1, 1: 2, or 1:10 or more, more preferably It should just be 1: 2 or more.
  • “Fixed on solid surface” means uneven distribution of “fluorescently labeled primer / probe” during the reaction. Although not limited to this, specifically, it means immobilizing “fluorescently labeled primer / probe” on the surface of glass, nylon membrane, semiconductor wafer, microbead or the like. As for the immobilization method, the oligonucleotide site of “fluorescently labeled primer / probe” may be directly immobilized on the surface of glass or the like using a known technique, or via a bond such as biotin-avidin, or a linker molecule. You may fix indirectly.
  • “Amplification of target nucleic acid using fluorescently labeled primer / probe” means that the target nucleic acid is amplified by performing an extension reaction with a polymerase using the fluorescently labeled primer / probe as a primer.
  • other reagents necessary for amplification of the target nucleic acid such as primers, polymerase, dNTP, etc.
  • "fluorescently labeled primer / probe” and “quencher labeled probe” are added to the sample.
  • “To perform amplification under isothermal conditions” means to amplify the target nucleic acid while maintaining a constant temperature.
  • the isothermal amplification method includes the following: Isothermalhiand Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids (ICAN) method, SDA method, NASBA method, RCA method, SMart Amplification Process version 2 (SMAP2) method (Nature Methods4: 257-262 (2007) ) And the LAMP method.
  • UV irradiation refers to irradiating an electromagnetic wave having a wavelength of about 10 nm to 400 nm, but the electromagnetic wave may not be strictly controlled and may be excitation light of a fluorescent agent.
  • Visual determination means that the presence or absence of emitted light of the fluorescent agent is visually determined within a short time, for example, within 5 seconds, 15 seconds, 30 seconds, or 1 minute after UV irradiation. You may compare with a color sample depending on the case.
  • excitation by “UV irradiation” is optimal, and simultaneous detection of 3 to 4 items is possible.
  • fluorescence detection device a photodiode array detector, etc. It is possible to detect more items at the same time using.
  • Kit means a reagent used in the detection method according to the present invention.
  • reagents, tools and instruments necessary for detection may be included. Further, an instruction manual or a color sample of the “kit” may be included.
  • a reagent necessary for nucleic acid amplification may further be included.
  • the target nucleic acid and the fluorescently labeled primer / probe are prioritized by incubating at a temperature lower than the melting temperature (Tm) of the fluorescently labeled primer / probe and higher than the melting temperature (Tm) of the quencher labeled probe.
  • the target nucleic acid by annealing at a temperature below the melting temperature (Tm) of the quencher labeled probe to anneal the fluorescent labeled primer / probe and the quencher labeled probe that are not annealed to the target nucleic acid.
  • the fluorescent agent of the fluorescence-labeled primer probe that has not been annealed is adjacent to the quencher of the quencher-labeled probe.
  • Labeled primer probe By measuring the light, to detect the target nucleic acid.
  • the melting temperature (Tm) of the “fluorescence-labeled primer / probe” and the “quencher-labeled probe” is shifted, and the relationship between the melting temperature and the reaction temperature is controlled. It is characterized in that the “target nucleic acid” is detected by preferentially annealing the “fluorescence-labeled primer / probe” and the “target nucleic acid” over the annealing of the “probe” and the “quencher-labeled probe”.
  • the most basic aspect of the present invention is as shown in FIG. If “fluorescence-labeled primer / probe” and “quencher-labeled probe” are first added, it is possible to detect the target nucleic acid in a closed system without adding any reagent thereafter.
  • the Tm value of the fluorescently labeled primer / probe is 65 ° C.
  • the Tm value of the quencher labeled probe is 35 ° C.
  • the reaction temperature is 60 ° C.
  • Step 1 the fluorescently labeled primer / probe binds to the target nucleic acid, but the quencher labeled probe does not bind.
  • Step 2 annealing of the “fluorescence-labeled primer / probe” and the “quencher-labeled probe” not bound to the target nucleic acid occurs.
  • the fluorescent agent of “fluorescence labeled primer / probe” bound to “target nucleic acid” emits emitted light (fluorescence) by UV irradiation, and “fluorescence labeled primer / probe” bound to “quencher labeled probe” Fluorescence from the fluorescent agent cannot be detected. Therefore, the fluorescence intensity of the sample depends on the amount of “target nucleic acid” in the sample.
  • FIG. 2 shows an embodiment including a step of amplifying the target nucleic acid in the present invention.
  • a fluorescently labeled probe is annealed with a target nucleic acid or a quenching labeled probe at the PCR annealing stage.
  • the fluorescence intensity is proportional to the amount of amplified target nucleic acid, it does not indicate the amount of amplified target nucleic acid itself, and the fluorescence-labeled and quench-labeled probes may inhibit the subsequent extension reaction. There is a lack of accuracy.
  • the fluorescently labeled primer / probe is incorporated into the amplified double-stranded product, only the amount of the finally amplified target nucleic acid can be detected more accurately.
  • FIG. 3A is a schematic diagram using a fluorescently labeled primer / probe in a probe mode (a mode that does not include a step of amplifying a target nucleic acid). In this case, it may be fixed at the 3 ′ end of the fluorescently labeled primer / probe oligonucleotide.
  • FIG. 3B An example of the immobilization mode is shown in FIG. 3B. (1) Immobilized at the 3 ′ end of the fluorescently labeled primer / probe oligonucleotide. In this case, it is desirable that a quencher is bound to the 5 ′ end of the corresponding quencher-labeled probe.
  • FIG. 3C is an embodiment including a step of amplifying the target nucleic acid.
  • the 3 ′ region of the oligonucleotide of the fluorescently labeled primer / probe is not fixed.
  • the binding between the target nucleic acid and the fluorescently labeled primer / probe is more stable.
  • the nucleic acid to be bound to the microarray is labeled with a radioisotope, a fluorescent agent, etc., and annealed to an unlabeled immobilized oligonucleotide. Thereafter, unbound labeled nucleic acid is removed by washing, and then the nucleic acid can be detected by detecting the label of the nucleic acid bound to the microarray by annealing.
  • the use of a fluorescently labeled primer / probe bound to the solid phase surface eliminates the need for fluorescent labeling of the entire sample and eliminates the need for a washing step. Thus, it becomes possible to detect the target nucleic acid more easily.
  • the present invention uses a plurality of types of fluorescently labeled primers / probes, that is, a plurality of types of fluorescently labeled primers / probes labeled with fluorescent agents that emit different emission lights, and corresponding quencher-labeled probes. Nucleic acids can be detected simultaneously.
  • the fluorescent agent of the fluorescently labeled primer / probe absorbs energy from the outside to excite electrons, and when it returns to the ground state, it emits excess energy as electromagnetic waves (emitted light).
  • each fluorescent agent Since the difference between the energy levels of the excited state and the ground state is specific to the fluorescent agent, even if different fluorescent agents absorb energy from the outside at the same time, each fluorescent agent emits light with a wavelength specific to the fluorescent agent ( Electromagnetic waves), that is, "lights of different colors". This emitted light is absorbed and quenched only by the quencher of the corresponding quencher labeled probe and is not affected by other quencher labeled probes. Therefore, if attention is paid to the “wavelength” of the emitted light of the fluorescent agent, that is, “color”, it is possible to detect a plurality of types of target nucleic acids at the same time. These emitted lights can be detected by using a spectrophotometer or the like, but can be detected by the naked eye as a mixed color or an intermediate color.
  • the detection method of the present invention can be applied to detection of pathogens such as various bacteria, fungi, and viruses.
  • pathogens such as various bacteria, fungi, and viruses.
  • bacteria include Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp., Salmonella spp., Enterohemorrhagic Escherichia coli, tuberculosis, Campylobacter (Campylobacter jejuni and Campylobacter coli), Bordetella pertussis, and the like.
  • fungi include Candida, Aspergillus, and Cryptococcus.
  • Viruses include influenza A (H1N1) pdm virus, influenza A (H1N1) virus, H5 subtype influenza virus, SARS coronavirus, herpes simplex virus type 1 and 2 (Herpes Simplex Virus type1 / 2; HSV-1 / 2) And Norovirus Genogroup I (GI) and Genogroup II (GII).
  • Other parasitic animals include malaria parasites, cryptosporidium parasites, giardia parasites, and the like.
  • genes involved in pathogenicity such as toxin genes (eg, verotoxin (VT) gene type 1 (VT1) and type 2 (VT2)), drug resistance genes, Alternatively, it is possible to detect genes involved in infection (invasion, colonization, and proliferation) of the host. Furthermore, it can be applied to the detection of single nucleotide polymorphism (SNP) such as Cytochrome gene, or the detection of male-specific gene sequences for the determination of bovine embryo discrimination.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • a fluorescently labeled primer / probe that is an oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid sequence specific to the detection target is first designed, and then a corresponding quencher labeled probe is designed. What is necessary is just to implement the detection method of invention.
  • embodiments of the present invention for detecting a plurality of types of target nucleic acids include human influenza virus (type A (including H1N1, H3N2, H1N2, H2N2, H9N1, H5N1), type B and C) or hepatitis virus (type A). , B type, and C type) are effective for detecting and discriminating adjacent viruses such as those at once.
  • HIV HIV
  • HBV hepatitis B virus
  • HCV hepatitis C virus
  • the kit of the present invention is a kit for detecting a target nucleic acid that is used to detect one or more types of target nucleic acids present in a sample, with or without amplification.
  • a fluorescently labeled primer / probe that is an oligonucleotide complementary to a target nucleic acid labeled with an agent, and a fluorescently labeled primer / probe that is complementary to the fluorescently labeled primer / probe labeled with a quencher A kit for detecting a target nucleic acid comprising a combination of quencher-labeled probes that are oligonucleotides having a lower melting temperature (Tm).
  • the length of the base of the oligonucleotide of the quencher labeled probe is shorter than the length of the base of the oligonucleotide of the fluorescent labeled primer / probe, or the oligonucleotide of the quencher labeled probe contains a modified base. It is done.
  • the fluorescently labeled primer / probe may be immobilized on a solid surface.
  • the kit of the present invention may contain other reagents for amplifying the target nucleic acid, and may optionally contain other reagents used for normal nucleic acid detection, if necessary.
  • Example 1 Confirmation of influence of Tm value (1)
  • CT plasmid a plasmid DNA (hereinafter referred to as CT plasmid) was prepared by subcloning a part of the latent plasmid region of Chlamydia trachomatis (SEQ ID NO: 21).
  • Primer synthesis was requested from Operon Biotechnology, and Japan Bioservice was requested for fluorescently labeled primers / probes and quencher-labeled probes.
  • the Tm value of the quencher-labeled probe indicates the calculated value of the nearest neighbor method.
  • CT-FIP 5′-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTTACTCGTCAC-3 ′
  • CT-BIP 5′-GCGGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTTT-3 ′
  • CT-F3 5′-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3 ′
  • CT-B3 5′-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3 ′
  • CT-LF 5′-AAGATAACCCCGCACGT-3 ′
  • CT-LB 5′-GGAGCGAGTTTACGAAGACA-3 ′
  • SEQ ID NO: 6 ⁇ Chlamydia trachomatis fluorescently labeled primer / probe>
  • FAM-CT-LB 5 ′-(FAM) -GGAGCGGAGTTACGAAGACA-3 ′
  • LAMP reaction reagent composition and concentration The concentration of each reagent in 30 ⁇ L of LAMP final reaction solution was prepared as follows.
  • the quencher-labeled probe was not added as a control, and CT-LBc-Q1-0 (SEQ ID NO: 8), CT-LBc-Q1-3 (SEQ ID NO: 9), CT-LBc-Q1-5 (SEQ ID NO: 10), CT-LBc-Q1-6 (SEQ ID NO: 11), CT-LBc-Q1-7 (SEQ ID NO: 12), CT-LBc-Q1-9 (SEQ ID NO: 13) or CT-LBc-Q1-10 (SEQ ID NO: 14) ) was added.
  • LA-320C Amplification reaction in judgment LA-320C
  • the amplification reaction of nucleic acid is monitored by the change in absorbance due to the production of its by-product magnesium pyrophosphate, that is, the change in turbidity.
  • Tt value Turbidity Confirmation of the time until the calculated value of the measurement data reaches the predetermined judgment value from the start of the reaction, turbidity curve: plot of turbidity real-time measurement data), and irradiate UV to the reaction tube after amplification Those that emit fluorescence (FAM) were positive, and those that did not show fluorescence were negative. When no quencher labeled probe was used, amplification of CT plasmid 10 4 copies was observed at 20.6 minutes.
  • CT-LBc-Q1-0 SEQ ID NO: 8
  • CT-LBc- Q1-3 SEQ ID NO: 9
  • CT-LBc-Q1-5 SEQ ID NO: 10
  • CT-LBc-Q1-9 It was 20.7 minutes (+0.0 minutes) for SEQ ID NO: 13) and 20.6 minutes (-0.1 minutes) for CT-LBc-Q1-10 (SEQ ID NO: 14).
  • green that was fluorescence derived from FAM was confirmed in the tube to which CT plasmid was added, and fluorescence could not
  • Tt (DW) indicates the Dt addition
  • Tt (CT) indicates the Tt value when the CT plasmid 10 4 copies is added to one reaction.
  • CT-LBc-Q1 indicates the Tt value when the CT plasmid 10 4 copies is added to one reaction.
  • CT-LBc-Q1 was not added, fluorescence was confirmed even when DW was added because the fluorescent label was not Quenched.
  • CT-LBc-Q1 was added (Q1-0)
  • all were quenched by addition of DW and in the case where CT plasmid was added, it was affected by the Tm value of CT-LBc-Q1. Fluorescence was confirmed without any problems.
  • the larger the Tm value of the quencher-labeled probe the longer the amplification time is delayed. Therefore, it was suggested that Tm of the quencher labeled probe is desirably 32.6 ° C. or less.
  • Example 2 When a quencher-labeled probe is added after amplification by the LAMP method (1)
  • a plasmid DNA (hereinafter referred to as CT plasmid) obtained by subcloning a part of the latent plasmid region of Chlamydia trachomatis (SEQ ID NO: 21) is used. Produced.
  • CT-FIP 5′-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTTACTCGTCAC-3 ′
  • CT-BIP 5′-GCGGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTTT-3 ′
  • CT-F3 5′-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3 ′
  • CT-B3 5′-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3 ′
  • CT-LF 5′-AAGATAACCCCGCACGT-3 ′
  • CT-LB 5′-GGAGCGAGTTTACGAAGACA-3 ′
  • Example 1 Determination As in Example 1, the amplification reaction was confirmed with LA-320C (Table 2, FIG. 4). In the reaction tube to which DW was added, no Tt value was detected and no increase in turbidity was observed. On the other hand, in the reaction tube to which the CT plasmid was added, the Tt value was 18.7 minutes and an increase in turbidity was confirmed. From these facts, it was confirmed that the amplification reaction occurred only in the CT plasmid, that is, the reaction tube containing the target nucleic acid.
  • Example 3 Method for simultaneous amplification detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae using the LAMP method
  • Plasmid DNA obtained by subcloning a part of the latent plasmid region of Chlamydia trachomatis (SEQ ID NO: 21) as a template for internal template for measurement template , CT plasmid).
  • plasmid DNA (hereinafter referred to as NG plasmid) in which a part of the Neisseria gonorrhoeae mtrA region (SEQ ID NO: 32) was subcloned was prepared as a target nucleic acid template.
  • CT-FIP 5′-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTTACTCGTCAC-3 ′
  • CT-BIP 5′-GCGGGGCGATTTGCCTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTTT-3 ′
  • CT-F3 5′-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3 ′
  • CT-B3 5′-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3 ′
  • CT-LB 5′-GGAGCGAGTTTACGAAGACA-3 ′
  • TAM-CT-LF 5 ′-(TAMRA) -AAGATAACCCCGCACGT-3 ′
  • SEQ ID NO: 15 ⁇ Chlamydia trachomatis BHQ2 labeled Quenching
  • Neisseria gonorrhoeae primer FAM-labeled loop primer (fluorescently-labeled primer / probe) and BHQ1-labeled Quenching probe (quencher-labeled probe) Targeting the mtrA region of Neisseria gonorrhoeae, designing a primer that has no cross-reactivity with related bacteria did. Primer synthesis was commissioned to Operon Biotechnology. In addition, synthesis of FAM-labeled loop primer and BHQ1-labeled Quenching probe was requested to J-Bios.
  • NG-FIP 5′-CGTGGCTCAACACATGACCCAAGCGTCCGGTCGGCA-3 ′
  • NG-BIP 5′-ACGGAGAAAGTTTACAACCGGGACACAAAACAGGCCTCATATCCAGC-3 ′
  • NG-F3 5′-GCGGTTATCTCTCTGCCATCG-3 ′
  • NG-B3 5′-GGTGTCTGTAGCGGAAAC-3 ′
  • NG-LF 5′-CGGGAAAAATACAATCGCCC-3 ′
  • LAMP reaction reagent composition and concentration The concentration of each reagent in 30 ⁇ L of LAMP final reaction solution was prepared as follows. ⁇ 30 mM Tris-HCl (pH 8.8) ⁇ 15 mM KCl 15 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ⁇ 12 mM MgSO 4 ⁇ 0.15% Tween20 ⁇ 2.1 mM ATP ⁇ 2.1 mM CTP ⁇ 2.1 mM GTP ⁇ 2.1 mM TTP 38.4U Bst DNA polymerase (New England Biolab) Chlamydia trachomatis primer, TAMRA labeled loop primer and BHQ2 labeled Quenching probe 0.8 ⁇ M CT-FIP (SEQ ID NO: 1) and CT-BIP (SEQ ID NO: 2) 0.1 ⁇ M CT-F3 (SEQ ID NO: 3) and CT-B3 (SEQ ID NO: 4) 0.4 ⁇ M CT-LB (SEQ ID NO: 6) and TAM-CT-
  • Example 4 Multi-item simultaneous amplification and detection of Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae and artificial nucleic acid (1) Measurement As a template for template measurement, a plasmid DNA (hereinafter referred to as CT plasmid) obtained by subcloning a part of the latent plasmid region of Chlamydia trachomatis (SEQ ID NO: 21) ), Plasmid DNA (hereinafter referred to as NG plasmid) obtained by subcloning a part of the mtrA region of Bacillus (SEQ ID NO: 32), and plasmid DNA (hereinafter referred to as ARITA2 plasmid) obtained by subcloning the artificial nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 33).
  • CT plasmid plasmid DNA obtained by subcloning a part of the latent plasmid region of Chlamydia trachomatis (SEQ ID NO
  • the 5 ′ end of Chlamydia trachomatis LF is labeled with TAMRA
  • the 5 ′ end of Neisseria gonorrhoeae LB is labeled with FAM
  • the 5 ′ end of artificial nucleic acid sequence LB is labeled with Alexa Fluor TM 350 (hereinafter Alexa 350).
  • the fluorescently labeled primer was used, BHQ2 was labeled at the 3 ′ end of the Chlamydia trachomatis LF complementary strand, BHQ1 was labeled at the 3 ′ end of the Neisseria gonorrhoeae LB complementary strand, and BHQ0 was labeled at the 3 ′ end of the artificial nucleic acid sequence LB complementary strand.
  • the labeled product was used as a quencher labeled probe.
  • Primer synthesis was requested from Operon Biotechnology, and Japan Bioservice was requested for fluorescently labeled primers / probes and quencher-labeled probes.
  • CT-FIP 5′-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTTACTCGTCAC-3 ′
  • CT-BIP 5'-GCGGGGCGATTTGCCTTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTTT-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • CT-F3 5′-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
  • CT-B3 5′-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
  • CT-LB 5′-GGAGCGAGTTTACGAAGACA-3 ′
  • TAM-CT-LF 5 ′-(TAMRA) -AAGATAACCCCGCACGT-3 ′
  • SEQ ID NO: 15 ⁇ Chlamydia trachomatis quencher labeled probe>
  • Example 1 Determination As in Example 1, the amplification reaction was confirmed with LA-320C (Table 3, FIG. 7). In reaction tubes to which DW was added (CT, NG, and ARITA2 plasmids all), no Tt value was detected and no increase in turbidity was observed. On the other hand, Tt values were obtained in reaction tubes to which one, two, or all three types of CT plasmid, NG plasmid, or ARITA2 plasmid were added, and an increase in turbidity was confirmed. From these facts, it was confirmed that the amplification reaction occurred only in the reaction tube containing one kind or plural kinds of CT plasmid, NG plasmid or ARITA2 plasmid.
  • CT-LFc-Q2 (SEQ ID NO: 16), NG-LBc-Q1 (SEQ ID NO: 24), ARITA2-LBc-Q0 (SEQ ID NO: 31) 0.8 ⁇ M was added to the reaction tube after completion of amplification, and 95 ° C. for 5 minutes. After cooling to room temperature after heating, UV was irradiated to observe fluorescence (FIG. 8). Since there was no amplification product in the reaction tube to which DW was added, fluorescence could not be confirmed (Tube No. 1). In the reaction tube containing CT plasmid, red fluorescence was confirmed (Tube No. 2). Similarly, green fluorescence (Tube No.
  • Example 5 FIG. Detection of Target Nucleic Acid (Chlamydia trachomatis) Using Probe (1) Sample Preparation The sample LAMP reaction solution was used as a sample. Regarding the LAMP reaction conditions, the composition of each reagent and the final concentration are as shown below, and CT plasmid is added as a template so that it becomes 10 4 copies per reaction, or DW is added instead of the template, and the final LAMP reaction solution The amplification reaction was carried out at 65 ° C. for 40 minutes using LA-320C as 30 ⁇ L. Further, the obtained reaction solution was heat-treated at 80 ° C.
  • LAMP reaction solution a sample prepared using CT plasmid as a template was a positive sample, and a sample prepared by adding DW was a negative sample.
  • FAM-CT-BL a fluorescently labeled primer / probe
  • Example 5 shows that the most basic aspect of the present invention shown in FIG. 1 can be implemented.
  • Example 6 Amplification detection of Chlamydia trachomatis using SMart Amplification Process version 2 (hereinafter referred to as SMAP2) method (isothermal amplification method other than LAMP method, nucleic acid amplification and detection of amplification product when quencher-labeled probe is added in SMAP2 method)
  • SMAP2 SMart Amplification Process version 2
  • CT plasmid plasmid DNA
  • Primer for SMAP2 reaction (FP, TP, OP1) that targets a part of the latent plasmid region of Chlamydia trachomatis and has no cross-reactivity with related bacteria , OP2 and BP primers in total 5) were designed.
  • the BP primer that anneals to the loop portion generated in the amplification product by the TP primer was fluorescently labeled with Alexa 350 as a fluorescently labeled primer / probe.
  • a quencher-labeled probe was prepared by labeling BHQ0 at the 3 ′ end of the complementary strand of the BP primer.
  • Primer synthesis was requested from Operon Biotechnology, and Japan Bioservice was requested for fluorescently labeled primers / probes and quencher-labeled probes.
  • CT-FP 5′-TTTATATATATAAAAGCGTTTGTACCTCCTCAC-3 ′
  • CT-TP 5'-GCGGGGCGATTTGCCTTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTTT-3 '(SEQ ID NO: 35)
  • CT-OP1 5′-CCTCAGAAGTTTATGCACTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 36)
  • CT-OP2 5′-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3 ′
  • SEQ ID NO: 38 ⁇ Chlamydia trachomatis quencher labeled probe> CT-BPc-Q0: 5′-AACTCGCTCC- (BHQ0) -3 ′
  • LoopampEXIA TM the change in absorbance amplification reaction of nucleic acids by formation of magnesium pyrophosphate which is a by-product, i.e. .Tt value be monitored by changes in turbidity : Time until the calculated value of turbidity measurement data reaches a predetermined judgment value from the start of reaction, turbidity curve: plot of real-time measurement data of turbidity) (Table 4, FIG. 10). In the reaction tube to which DW was added, no Tt value was detected and no increase in turbidity was observed.
  • the Tt value was 23.2 minutes, and an increase in turbidity was confirmed. From these facts, it was confirmed that the amplification reaction occurred only in the CT plasmid, that is, the reaction tube containing the target nucleic acid. As a result of irradiating UV to each reaction tube after the amplification reaction and observing fluorescence (FIG. 11), no fluorescence was observed in the reaction tube (Tube No. 1) to which DW was added, and a reaction tube to which CT plasmid was added. (Tube No. 2) showed fluorescence.
  • Example 6 shows that the present invention can be implemented not only in the LAMP method but also in various isothermal amplification reactions of nucleic acids.
  • Example 7 Fluorescence wavelength detection in single-item amplification, two-item or three-item simultaneous amplification reaction system
  • plasmid DNA obtained by subcloning a part of the latent plasmid region of Chlamydia trachomatis (SEQ ID NO: 21) CT plasmid), plasmid DNA obtained by subcloning part of the mtrA region of gonococci (SEQ ID NO: 32) (hereinafter referred to as NG plasmid), and plasmid DNA obtained by subcloning the artificial nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 33) (hereinafter referred to as ARITA2 plasmid).
  • the fluorescently labeled primer / probe is labeled with BHQ0 at the 3 ′ end of the Chlamydia trachomatis BL complementary strand, BHQ2 at the 3 ′ end of the Neisseria gonorrhoeae BL complementary strand, and BHQ1 at the 3 ′ end of the artificial nucleic acid sequence BL complementary strand.
  • BHQ0 at the 3 ′ end of the Chlamydia trachomatis BL complementary strand
  • BHQ2 at the 3 ′ end of the Neisseria gonorrhoeae BL complementary strand
  • BHQ1 at the 3 ′ end of the artificial nucleic acid sequence BL complementary strand.
  • Primer synthesis was requested from Operon Biotechnology, and Japan Bioservice was requested for fluorescently labeled primers / probes and quencher-labeled probes.
  • CT-FIP 5′-CAAGCAGGACTACAAGCTGCAGCGTTTGTTACTCGTCAC-3 ′
  • CT-BIP 5'-GCGGGGCGATTTGCCTTTAACTCGGTCAACGAAGAGGTTT-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • CT-F3 5′-ATGTCGGAGTCTGAGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
  • CT-B3 5′-CCTCAGAAGTTTATGCACTTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
  • CT-LF 5′-AAGATAACCCCGCACGT-3 ′ (SEQ ID NO: 5)
  • Ale-CT-LB 5 ′-(Alexa350) -GGAGCGAGTTTACGAAGACA-3 ′
  • CT-LF 5′-AAGATAACCCCGCACGT-3 ′
  • Ale-CT-LB 5 ′-(Alexa350) -GGAGCGAGTTTACGAAGACA-3 ′
  • SEQ ID NO: 40 ⁇ Chlamydia trachomati
  • LAMP reaction reagent composition and concentration The concentration of each reagent in 30 ⁇ L of LAMP final reaction solution was prepared as follows. ⁇ 30 mM Tris-HCl (pH 8.8) ⁇ 15 mM KCl 15 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ⁇ 12 mM MgSO 4 ⁇ 0.15% Tween20 ⁇ 2.1 mM ATP ⁇ 2.1 mM CTP ⁇ 2.1 mM GTP ⁇ 2.1 mM TTP 38.4U Bst DNA polymerase (New England Biolab) As for primers, one or more of the following three types of primers, a fluorescently labeled primer / probe, and a quencher labeled probe set were added to one reaction.
  • the combination of primer, fluorescently labeled primer / probe and quencher-labeled probe can be selected from the following three types: Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, and artificial nucleic acid for single item amplification. ⁇ Three types of trachomatis and artificial nucleic acid, Neisseria gonorrhoeae and artificial nucleic acid, and three items of simultaneous amplification are Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae and artificial nucleic acid.
  • the amplification reaction was confirmed by LoopampEXIA TM . After completion of the amplification reaction, the reaction tube was irradiated with UV to observe fluorescence. In addition, a solution obtained by diluting the reaction solution after the amplification reaction 100 times with a diluent is irradiated with excitation light corresponding to each fluorescent label with a spectrofluorophotometer RF-5300PC (manufactured by SHIMADZU) to scan the fluorescence wavelength. went.
  • FIG. 31 Tube No. 2 Blue fluorescence (FIG. 31 Tube No. 2), which seems to be derived from LB (SEQ ID NO: 40), red fluorescence (FIG. 31 Tube No. 3), which is supposed to be derived from TAM-NG-LB (SEQ ID NO: 42), Green fluorescence (Fig. 31 Tube No. 4), which seems to be derived from FAM-ARITA2-LB (SEQ ID NO: 44), purple fluorescence (Fig. 31 Tube, which is supposed to be derived from Ale-CT-LB and TAM-NG-LB) No.
  • nucleic acids when nucleic acids are amplified from a single template in a single-item or multi-item amplification reaction system, fluorescence derived from one type of fluorescent label used for detection for each item, a multi-item amplification reaction system
  • fluorescence derived from one type of fluorescent label used for detection for each item when nucleic acids are amplified from multiple types of templates, fluorescence derived from multiple types of fluorescent labels used for detecting each item is detected.
  • the fluorescent color light is in a range that can be identified by human three-color color vision. For example, as shown in the examples, blue, red, and green fluorescent labels are used as primary colors.
  • the color tones expressed using additive mixing include the seven colors of purple, yellow, light blue, and white, and the case that does not emit fluorescence (colorless or non-fluorescent). A total of eight colors is the upper limit.
  • a fluorescence measuring instrument since it is possible to use a type of fluorescent label that can be identified by the instrument, it is possible to detect more items at the same time, and to quantify by the emission intensity. Is also possible.
  • Example 7 shows that the present invention can measure fluorescence using a fluorescence detection device in order to detect nucleic acid amplification in an isothermal amplification reaction regardless of single item or multiple items.
  • the present invention can provide a method for detecting a target nucleic acid more easily and cheaply than the prior art. Further, by applying the present invention to a microarray, gene expression can be detected without labeling the target nucleic acid. Furthermore, by combining with a conventional nucleic acid amplification technique, it is possible to detect multiple items of target nucleic acid at a time by adding a reagent in one step. In addition, the detection can be performed visually without using special equipment. Therefore, this invention is extremely effective not only in conventional laboratories but also in infectious bacteria and viruses in hospitals, confirmation of drug susceptibility, prediction of therapeutic effects by single nucleotide polymorphism detection, confirmation of safety in food production and sales, etc. It can be a tool.

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Abstract

　本発明は、標的核酸の新たな検出方法及びそれに用いるキットを提供することを課題とする。　本発明の検出方法は、相補性を有する、蛍光標識されたプライマー／プローブと消光剤（クエンチャー）標識されたプローブの融解温度（Ｔｍ）をずらして設計し、蛍光標識プライマーが標的核酸に優先的にアニールするようにした。標的核酸に結合しなかった蛍光標識プライマー／プローブは消光プローブと結合して蛍光を発しないようにした検出方法であり、より簡便安価で特別な技能、機器を必要とせずに標的核酸を検出することが可能である。

Description

標的核酸の検出法
　本発明は標的核酸の検出方法、およびその検出に用いるキットに関する。
　核酸塩基配列の相補性を用いた標的核酸の検出方法は古くはサザンハイブリダイゼーションから始まり、様々な改良工夫が行われ、現在に至っており、特にin vitroでの核酸増幅法の確立と共に、より微量な標的核酸の検出が可能になっている。
　標的核酸の検出方法としてはラジオアイソトープ（RI）、発光剤(luminescent agent)、蛍光剤（fluorophore）等の標識と結合した、標的核酸と相補性を有する核酸を含む検出プローブを用いた検出方法が開発されている。放出エネルギーが異なる複数のRIで標識した場合や、放出光の波長が異なる複数の発光剤（あるいは蛍光剤）で標識した場合には、多項目検出が可能である。さらにＱプローブ（Quenching Probe）法としてSingle Nucleotide Polymorphism (SNP)を判定する方法も確立されている（特許文献１）。
　またその逆に標的核酸をラジオアイソトープ等で標識化し、標的核酸と相補性を有する、固相面に固定されたオリゴヌクレオチドプローブとアニーリングさせることにより、複数の標的核酸の量を同時に検出することを可能にした、所謂ＤＮＡチップ、マイクロアレイ等の核酸塩基配列の相補性を利用した標的核酸の検出方法もある（特許文献２）。
　一方、核酸増幅法としては、Polymerase Chain Reaction（ＰＣＲ）（特許文献３および特許文献４）、Strand Displacement Amplification（ＳＤＡ）（特許文献５）、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification（ＮＡＳＢＡ）(特許文献６）、Rolling Circle Amplification (ＲＣＡ)（非特許文献１）、および Loop-mediated isothermal Amplification（ＬＡＭＰ）（特許文献７）等が挙げられる。これらの核酸増幅法も標的核酸の検出を可能にしている。
　さらに、Ligase Chain Reaction (ＬＣＲ)（特許文献８）のようなリガーゼを用いた核酸増幅法も存在している。
　現在、核酸の増幅方法として多用されているのはＰＣＲ法である。ＰＣＲ法は耐熱性ポリメラーゼと、標的核酸と相補性を有する２つのプライマーを用いて、（１）２本鎖標的核酸の変性、（２）変性した標的核酸へのプライマーのアニーリング、（３）プライマーからの伸長反応という３つのステップを、温度制御を行うことにより進め、これら３ステップを繰り返すことにより、指数関数的に標的核酸を増幅する方法である。反応後の増幅産物を電気泳動し、エチジウムブロマイド（EtBr）、サイバーグリーン（SYBR（登録商標）Green）などのインターカレーターを用いることにより、増幅産物の有無を検出することが可能となる。また、上記伸長反応の際に、蛍光剤を付加した核酸塩基を用いることにより増幅産物を検出する方法もある。
　さらに、蛍光剤と消光剤（quencher）を用いることにより、標的核酸の増幅を定量的に検出する方法も確立されている（特許文献９）。具体的にはTaqMan（登録商標）probeに代表される、蛍光剤と消光剤が隣接付加されたオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ増幅反応の際に加え、ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲの上記ステップ（２）において該プローブも標的核酸にアニーリングされ、ステップ（３）の伸長反応に伴い、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により該プローブが分解され、消光剤から遊離した蛍光剤の放出光を検出することにより、標的核酸の検出を可能にしている。
　このような蛍光剤と消光剤の組み合わせを用いた核酸検出方法はＰＣＲによる増幅を前提として様々に考案されている（特許文献１０および特許文献１１）。両者は相補性を有するオリゴヌクレオチドプローブの一方に蛍光剤を、もう一方に消光剤を付加し、ＰＣＲのアニーリングのステップ（上記（２））において、増幅中の標的核酸を検出することを目的に考案されている。
　ＬＡＭＰ法は標的核酸の６つの領域に対して４種類のプライマー（ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３およびＢ３）を設定し、鎖置換反応を利用して一定温度で増幅させることを特徴とする。標的核酸を含む試料、プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を混合し、一定温度（６５℃付近）で保温することによって反応が進み、検出までの工程を１ステップで行うことができる方法である。さらにループプライマーＢ（ＬＢ）および／またはループプライマーＦ（ＬＦ）を追加して用いることにより、増幅に要する時間を１／２から１／３に短縮することが可能となる（特許文献１２）。増幅効率が高いことから標的核酸を１５分～１時間で１０９～１０１０倍に増幅することが出来、また、極めて高い特異性から増幅産物の有無で目的とする標的遺伝子配列の有無を判定することも可能である。かかる方法の１つとして、核酸増幅反応の副産物であるピロリン酸イオンを不溶性の塩（マグネシウム塩）として、反応液の濁度を測定するか、該ピロリン酸イオンをカルセイン－マンガン錯体と反応させ、遊離したカルセイン（蛍光物質）の蛍光を検出することにより、増幅産物の存在を検出する(特許文献１３)。さらに、蛍光プローブを用いた検出方法も確立されている（特許文献１４および特許文献１５）。
　また、蛍光標識されたプライマーと消光剤で標識したプローブを用いてＬＡＭＰ法により増幅された標的核酸を検出する方法も報告されている（非特許文献２）。具体的には蛍光標識されたプライマーを用いてＬＡＭＰ法により標的核酸を増幅し、増幅後、消光剤で標識されたプローブを添加し、標的核酸の増幅に寄与しなかったフリーの蛍光標識されたプライマーと消光剤で標識されたプローブをアニーリングさせることにより、標的核酸の増幅に寄与した、すなわち増幅産物の一部となった蛍光標識されたプライマーの蛍光剤からの放出光のみを検出する方法である。
　上記いずれの核酸検出方法も一長一短があり、特に反応や検出に高価な精密機器を必要とし、さらに様々な工程を含むため、その実施には熟練を要するものが多く、これらの核酸検出技術は専ら核酸増幅を専門とする特定の研究室内で行われるものであった。また、例えば、上記非特許文献２に記載の検出方法においては、消光剤を増幅反応後に添加する必要があり、反応容器の蓋を開閉する際に増幅産物の飛散により試料間あるいは実験環境のコンタミネーションを起こすおそれがある。
　近年、産業、医療、研究等の様々な分野において核酸増幅試験（Nucleic acid Amplification Test：ＮＡＴ）の要求が高まると共に、試験項目の種類も充実してきたこともあり、今までにも増して核酸増幅試験は広く普及しつつある。例えば、医薬品分野における血液製剤の種々のウイルスに対する安全性確保の目的で実施する試験にも核酸増幅試験が利用されている。こうした普及・一般化の流れから、今まで核酸増幅専用の特定の研究室内でしか行われていなかった核酸増幅試験が一般実験室やフィールドワーク、ベッドサイド等のあらゆる場所や場面でも行えるように、簡便に使用することができ、かつ試験環境を汚染することのない核酸検出技術、さらに好ましくは多項目を同時に検出することが可能な技術が求められるようになった。
特開2001-286300号公報 特表2001-521622号公報 特開昭61-274697号公報 特開昭62-000281号公報 特開平5-192195号公報 特開平2-005864号公報 特許第3313358号公報 特開平2-002934公報 特表平6-500021公報 特開平10-262700号公報 特表2004-511227号公報 国際公開第2002/024902号 特開2004-283161号公報 特開2001-272475号公報 国際公開第2009/051214号
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92:4641-4645(1995) Journal of Medical Virology 81:966-972(2009)
　本発明の課題は、新規な標的核酸の検出方法を提供することにある。より具体的には、従来技術より簡便安価に標的核酸を検出する方法、および検出に用いるキット等を提供することにある。
　本発明者らは上記課題を解決するために、密閉系で簡易に核酸の増幅および検出が可能な方法を新たに開発した。具体的には蛍光標識されたプライマーと消光剤で標識したプローブを用いてＬＡＭＰ法により増幅された標的核酸を検出する方法において、蛍光標識プライマーとクエンチャー標識プローブを増幅反応前の添加を可能にするため、両者の融解温度（melting temperature：以下Ｔｍ）に差をつけ、反応温度条件により、クエンチャー標識プローブ存在下においても、より選択的に蛍光標識プライマーが標的核酸にアニーリングしやすくした。その後、温度を下げることにより、標的核酸に結合出来なかった蛍光標識プライマーとクエンチャー標識プローブがアニーリング出来るようになり、その結果クエンチングにより、蛍光標識は消光され、標的核酸に結合出来た蛍光標識プライマーの蛍光標識のみが検出できることを見出した。
　本発明者らは、さらに上記方法がＬＡＭＰ法による増幅と組み合わせることができるだけでなく、他のいかなる核酸増幅方法とも組み合わせることが可能であり、また標的核酸の増幅工程を含まなくとも、すなわち蛍光標識プライマーを単なるプローブとして利用しても、実施可能であり、本発明の課題を解決出来ることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明の構成は以下の［１］から［１３］の通りである。
［１］試料中に存在する１種類以上の標的核酸を検出する方法であって、以下のステップを含む核酸を検出する方法：
　　　（１）試料に
　　　　　　蛍光剤で標識された、標的核酸と相補性を有するオリゴヌクレオチドである蛍光標識プライマーまたはプローブと、
　　　　　　消光剤で標識された、該蛍光標識プライマーまたはプローブと相補性を有し、該蛍光標識プライマーまたはプローブより融解温度（Ｔｍ）の低いオリゴヌクレオチドであるクエンチャー標識プローブ
　　　　　　を添加し；
　　　（２）該試料を該蛍光標識プライマーまたはプローブの融解温度（Ｔｍ）以下で、かつ該クエンチャー標識プローブの融解温度（Ｔｍ）より高い温度で保温し；
　　　（３）該試料を該クエンチャー標識プローブの融解温度（Ｔｍ）以下の温度で保温し；
　　　（４）標的核酸に結合した蛍光標識プライマーまたはプローブの蛍光を計測する。
［２］前記ステップ（２）の保温の間に標的核酸を増幅する、[１]に記載の検出方法。
［３］前記標的核酸の増幅を等温条件で行う［２］に記載の検出方法。
［４］前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さが前記蛍光標識プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さより短い、［１］－［３］のいずれかに記載の検出方法。
［５］前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドが修飾塩基を含んでいる、［１］－［３］のいずれかに記載の検出方法。
［６］前記蛍光標識プライマーまたはプローブを固相面に固定させて使用する、［１］－［５］のいずれかに記載の検出方法。
［７］２種類以上の標的核酸を検出するために、発光波長が異なる２種類以上の蛍光標識プライマーまたはプローブとそれぞれに対応するクエンチャー標識プローブの組み合わせを用いる［１］－［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記ステップ（４）における蛍光の計測が目視による判定である［１］－［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記ステップ（４）における蛍光の計測が蛍光検出機器による判定である［１］－［７］のいずれかに記載の方法。
［１０］［１］－［９］のいずれかに記載の検出方法に用いるためのキットであって、１種類または複数種類の
　　蛍光剤で標識された、標的核酸と相補性を有するオリゴヌクレオチドである蛍光標識プライマーまたはプローブと；
　　それぞれの蛍光剤に対応する消光剤で標識された、該蛍光標識プライマーまたはプローブと相補性を有し、該蛍光標識プライマーまたはプローブより融解温度（Ｔｍ）の低いオリゴヌクレオチドであるクエンチャー標識プローブ
　　の組み合わせを；
　含む標的核酸検出用キット。
［１１］前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さが前記蛍光標識プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さより短い、［１０］に記載の標的核酸検出用キット。
［１２］前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドが修飾塩基を含んでいる、［１０］に記載の標的核酸検出用キット。
［１３］さらに核酸増幅用試薬を含む［１０］－［１２］に記載のキット。
［１４］前記蛍光標識プライマーまたはプローブが固相面に固定されている［１０］－［１３］のいずれかに記載の標的核酸検出用キット。
　非特許文献２の方法を踏襲した場合、蛍光標識プライマーとクエンチャー標識プローブを増幅反応前に添加すると、増幅反応が正常に起こらず、標的核酸の検出が難しかった。しかしながら、本発明においては蛍光標識プライマーまたはプローブ（以下、蛍光標識プライマー／プローブ）とクエンチャー標識プローブの融解温度（Ｔｍ）をずらすことにより、クエンチャー標識プローブ存在下においても、優先的に標的核酸と蛍光標識プライマーのアニーリングをさせることが可能となった。
　かかる本発明の効果は増幅工程を含む非特許文献２の方法に対してだけでなく、増幅工程を含まない他の態様においても、有効に発揮される。
　本発明は増幅反応後にクエンチャー標識プローブを添加する必要がないので、増幅産物の飛散による試料間あるいは実験環境の汚染の心配がない。また、従来のハイブリダイゼーション法に較べ、洗浄ステップなどを含まず、温度管理も比較的簡便でかつ、精密さを要求されないため、より簡便安価で、特別の手技、機器を必要とせずに標的核酸を検出することが可能である。
本発明の基本的な態様の模式図である。 標的核酸を増幅する工程を加えた本発明の模式図である。 本発明をマイクロアレイに応用した場合の模式図（標的核酸の増幅をしない態様）である。 本発明をマイクロアレイに応用した場合の蛍光標識プライマー／プローブの固定化の例を示す模式図である。 本発明をマイクロアレイに応用した場合の模式図（標的核酸の増幅工程を含む態様）である。 実施例２における蛍光標識プライマー／プローブを用いた標的核酸のリアルタイム濁度曲線を示す。 実施例２におけるＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－０（配列番号８）添加前後の蛍光検出を示す。 実施例３における標準反応、クラミジア・トラコマティス、淋菌の判別結果を示す。 実施例４における各標的核酸を添加した場合のリアルタイム濁度曲線を示す。 実施例４における増幅反応後にクエンチャー標識プローブを添加し、９５℃５分加熱後室温まで冷却した後のＵＶ照射時反応チューブを示す。 実施例５におけるＵＶ照射時反応チューブを示す。 実施例６における蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸のリアルタイム濁度曲線を示す。 実施例６における増幅反応後のＵＶ照射時反応チューブを示す。 実施例７における単項目　クラミジア・トラコマティスのプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応のリアルタイム濁度曲線を示す。 実施例７における単項目　クラミジア・トラコマティスのプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後のＵＶ照射時反応チューブを示す。 実施例７における単項目　クラミジア・トラコマティスのプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後の蛍光波長を示す。 実施例７における単項目 淋菌のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応のリアルタイム濁度曲線を示す。 実施例７における単項目 淋菌のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後のＵＶ照射時反応チューブを示す。 実施例７における単項目 淋菌のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後の蛍光波長を示す。 実施例７における単項目 人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応のリアルタイム濁度曲線を示す。 実施例７における単項目 淋菌のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後のＵＶ照射時反応チューブを示す。 実施例７における単項目 人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後の蛍光波長を示す。 実施例７における二項目 クラミジア・トラコマティスと淋菌のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応のリアルタイム濁度曲線を示す。 実施例７における二項目 クラミジア・トラコマティスと淋菌のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後のＵＶ照射時反応チューブを示す。 実施例７における二項目 クラミジア・トラコマティスと淋菌のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後の蛍光波長を示す。 実施例７における二項目 クラミジア・トラコマティスと人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応のリアルタイム濁度曲線を示す。 実施例７における二項目 クラミジア・トラコマティスと人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後のＵＶ照射時反応チューブを示す。 実施例７における二項目 クラミジア・トラコマティスと人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後の蛍光波長を示す。 実施例７における二項目 淋菌と人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応のリアルタイム濁度曲線を示す。 実施例７における二項目 淋菌と人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応後のＵＶ照射時反応チューブを示す。 実施例７における二項目 淋菌と人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応の増幅反応後の蛍光波長を示す。 実施例７における三項目 クラミジア・トラコマティスと淋菌および人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応のリアルタイム濁度曲線を示す。 実施例７における三項目 クラミジア・トラコマティスと淋菌および人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応のＵＶ照射時反応チューブを示す。 実施例７における三項目 クラミジア・トラコマティスと淋菌および人工核酸のプライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブを用いた標的核酸増幅反応の蛍光波長を示す。
　以下に本発明について詳細に説明する。
　「試料」とは検出対象となる「標的核酸」を含むと考えられる混合物である。試料はヒトを含む生体（例えば血液、唾液、体液、体組織等）、環境（例えば、土壌、海水、環境水（温泉水、浴槽水、冷却塔水等））、あるいは人工物または自然物（例えば、パンなどの加工食品、ヨーグルトなどの発酵食品、あるいは米や小麦などの栽培植物、微生物、ウイルス）に由来するものであり、通常は核酸抽出操作を経たものを使用する。必要に応じて核酸精製操作を追加してもよい。
　「標的核酸」とは本発明により検出すべき核酸分子である。核酸の種類としてはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびこれらの混合物または結合物であってもよい。またその構成塩基は天然に存在するヌクレオチド、例えばグアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）であるが、それ以外の天然および人工の修飾塩基を含んでいてもよい。ここで「修飾塩基」とは、上記５つのヌクレオチドが化学的修飾を受けた塩基を意味する。これに限定されないが、メチルシチジン、シュードウリジン、4-チオウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、ヒポキサンチン（イノシン（Ｉ））等がこれにあたる。本発明において標的核酸は、検出する際には１本鎖である必要があるが、２本鎖や高次構造を形成している核酸であっても熱変性、アルカリ変性処理などにより１本鎖に変換してから用いることが可能である。本発明の標的核酸にはかかる変性処理を加えた態様も含まれる。あるいはＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により作製されるｃＤＮＡも「標的核酸」に含まれる。
　「オリゴヌクレオチド」とはアデノシン、チミジン、シチジン、グアノシン、ウリジンなどのヌクレオシドあるいは修飾塩基を持つヌクレオシドがホスホジエステル結合により連結してなる直鎖状オリゴマーを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの結合物を示す。場合によってはペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。　
　「相補性」とはポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド鎖が他の鎖とアニーリングして２本鎖構造を形成して、各鎖の各ヌクレオチドがワトソン－クリック型の塩基対合をしていることを意味するだけでなく、デオキシイノシン（ｄＩ）、2-アミノプリン塩基を持つ修飾ヌクレオチドの対合などの非ワトソン－クリック型の塩基対合をしていることも意味する。
　「蛍光剤」とは一定波長の励起光を照射されると、そのエネルギーを吸収することで電子が励起し、それが基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波（放出光）として放出する分子、あるいは官能基を意味する。具体的な例としてはフルオレセイン（fluorescein）、およびその誘導体（フルオレセインホスホアミダイド（ＦＡＭ）、フルオレセインイソチオシアネートなど）、ローダミン（rhodamine）、およびその誘導体（テキサスレッドなど）、Cy色素（Cy3、Cy5など）等が挙げられるがこれらに限定されない。
　「消光剤」とは蛍光剤から放出される放出光のエネルギーを吸収できるような適切なエネルギー準位をもつ分子あるいは官能基を意味する。フルオレセインホスホアミダイド（ＦＡＭ）の消光剤としてテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）が使えるように、蛍光剤を消光剤として使ってもよい。しかしながら消光剤としてより適しているのは蛍光剤の放出光を吸収し、励起しても、自らは放出光を発しない分子あるいは官能基である。例えば、DABCYL、Black Hole Quencher(ＢＨＱＴＭ（バイオサーチテクノロジーズ社）)、EclipseＴＭ Dark Quencher（エポック・バイオサイエンシーズ社）などが挙げられるがこれらに限定されない。
　「保温」とはある特定の温度下に試料をおくことを意味する。熱伝達の手段は水浴、空気浴、金属浴などが挙げられるがこれらに限定しない。
　融解温度（Ｔｍ）とは二本鎖ＤＮＡの溶液を加熱していったとき、ＤＮＡ分子の１／２が解離して一本鎖になるときの温度を意味する。本発明においては５０ｍＭ　Ｎａ＋濃度（Ｎａ＋＝５０×１０－３）と０．５ｍＭオリゴヌクレオチド濃度（Ｃｔ＝０．５×１０－６）の値で、最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)の以下の計算式により算出される（Nucl.Acids Res.(1990) 18(21)：6409-6412）。
　Ｔｍ＝｛（１０００ΔＨ）／（－１０．８＋ΔＳ＋Ｒｌｎ（Ｃｔ／４））｝－２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］
　ここで、ΔＨはハイブリッドにおける最近接エンタルピー変化の合計[kcal/mol] 、ΔＳはハイブリッドにおける最近接エントロピー変化の合計[cal/mol・K]、Ｒは気体定数（1.987cal/deg・mol）、Ｃｔはオリゴのtotalモル濃度[mol/l]、およびＮａ＋はモル濃度[mol/l]を示す。
　融解温度（Ｔｍ）は、オリゴヌクレオチドの塩基配列およびその長さによって変化し、グアニンおよびシトシンの含有量が多いほど、その長さが長いほど融解温度（Ｔｍ）が高くなる。したがって、塩基配列およびその長さによりアニーリング温度が決定されるが、反応溶液に融解温度調整剤を含有させることにより、融解温度を調整することもできる。
　核酸増幅法に用いる融解温度調整剤の例として、ホルムアミド、ベタイン（N,N,N,－トリメチルグリシン）、プロリン、ジメチルスルホキシド、トリメチルアミンN－オキシド、およびテトラアルキルアンモニウム塩等が挙げられる。
　「蛍光標識プライマーまたはプローブ（以下、蛍光標識プライマー／プローブ）」とは「蛍光剤」が結合した「オリゴヌクレオチド」であり、標的核酸と相補性を有するものである。標的核酸を増幅しない態様においては「プローブ」としてのみ用いられるが、標的核酸を増幅する態様においては「プライマー」として用いることが出来る。「蛍光標識プライマー／プローブ」は蛍光剤が結合した（モノ）ヌクレオチド、例えばAlexa FluorＴＭ ヌクレオチド（インビトロジェン）を用いて合成してもよいし、合成したオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に蛍光剤を結合させてもよい。但し、「蛍光標識プライマー／プローブ」を用いて標的核酸の増幅を行う場合、すなわち、「プライマー」としての態様で用いる場合には、３’末端に蛍光剤を結合させるべきではない。より好ましいのは５’末端に蛍光剤を結合させた「オリゴヌクレオチド」である。「蛍光標識プライマー／プローブ」の塩基配列の長さは特に限定しないが、１５base以上、より好ましくは２０base以上、さらに好ましくは２５base以上が好ましい。さらに「蛍光標識プライマー／プローブ」の塩基配列の長さは標的核酸とのアニーリング、およびその後の増幅反応の温度条件を考慮して、「蛍光標識プライマー／プローブ」の融解温度（Ｔｍ）は、３０～７０℃、好ましくは５０～６５℃になるように設計されるのが望ましい。
　「クエンチャー標識プローブ」とは「消光剤」が結合した「オリゴヌクレオチド」である。「クエンチャー標識プローブ」は消光剤が結合したヌクレオチドを用いて合成してもよいし、合成したオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に消光剤を結合させてもよいが、「クエンチャー標識プローブ」と「蛍光標識プライマー／プローブ」がアニーリングした際に、「蛍光標識プライマー／プローブ」の蛍光剤の放出光（蛍光）が消光剤により効果的に消される位置に消光剤を結合させることが好ましい。標的核酸の増幅反応を伴う態様において「クエンチャー標識プローブ」のオリゴヌクレオチドの３’末端は伸長反応が起こらないようブロックさせていることが好ましい。さらに好ましくは、「蛍光標識プライマー／プローブ」が５’末端に蛍光剤を結合させた「オリゴヌクレオチド」である場合、３’末端に消光剤を結合させた「オリゴヌクレオチド」に対応する「クエンチャー標識プローブ」とすることが望ましい。
　「クエンチャー標識プローブ」のオリゴヌクレオチドの塩基配列は「蛍光標識プライマー／プローブ」の塩基配列と相補性を有し、かつその長さが蛍光標識プライマー／プローブよりも２、３、４、５、６、７、８、９、１０塩基またはそれ以上短い配列であることが望ましく、その短さが「クエンチャー標識プローブ」の５’末端の塩基が「蛍光標識プライマー／プローブ」の３’端の塩基に較べ、少ないことに起因していることがさらに望ましい。あるいは塩基配列の長さが同じであっても、Ｔｍ値を下げる効果を持つ修飾塩基を持つヌクレオチドを用いることにより、実質的に「蛍光標識プライマー／プローブ」の融解温度（Ｔｍ）より「クエンチャー標識プローブ」の融解温度（Ｔｍ）が低くなるようにしてもよい。Ｔｍ値を下げる効果を持つ修飾塩基を持つヌクレオチドとは、例えばイノシンを持つヌクレオチドである。より好ましくは室温（例えば２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃あるいは３０℃）以上となるように「クエンチャー標識プローブ」のオリゴヌクレオチドの塩基配列を設計することが望ましい。かかる条件を満たすためにはオリゴヌクレオチドの長さが７塩基以上であることが好ましく、より好ましくは９塩基以上である。
　本発明では、蛍光標識プライマー／プローブとクエンチャー標識プローブの融解温度（Ｔｍ）は相違することが必要であり、クエンチャー標識プローブの融解温度（Ｔｍ）は蛍光標識プライマー／プローブの融解温度（Ｔｍ）より低いものである。より具体的には、５℃低いことが好ましく、１０℃低いことがさらに好ましく、１５℃低いことがさらに好ましく、２０℃低いことがさらに好ましく、３０℃低いことがさらに好ましく、３５℃低いことがさらに好ましく、４０℃あるいは４５℃以上低いことがより好ましい。
　試料に「添加」するとは、試料に蛍光標識プライマー／プローブ、クエンチャー標識プローブ等の試薬を加える態様以外に、該試薬に試料を加える態様も含まれる。
　「蛍光標識プライマー／プローブ」と「クエンチャー標識プローブ」の添加の際の使用比率はモル分子数の比にして、１：１、１：２あるいは１：１０以上であればよく、より好ましくは１：２以上であればよい。
　「固相面に固定」とは反応中、「蛍光標識プライマー／プローブ」を偏在させることを指す。これに限定されないが、具体的にはガラス、ナイロンメンブレン、半導体ウェハー、マイクロビーズなどの表面に「蛍光標識プライマー／プローブ」を固定することを意味する。固定の方法は公知の技術を用いて、直接「蛍光標識プライマー／プローブ」のオリゴヌクレオチド部位をガラス等の表面に固定してもよいし、ビオチン－アビジンなどの結合を介して、あるいはリンカー分子を介して間接的に固定させてもよい。
　「蛍光標識プライマー／プローブを用いて標的核酸を増幅」とは、蛍光標識プライマー／プローブをプライマーとして用いてポリメラーゼにより伸長反応を行い、標的核酸を増幅することを意味する。なお、当業者には自明のことであるが、本発明の標的核酸を増幅する工程を含む態様においては、当然にそれ以外の標的核酸の増幅に必要な試薬、例えばプライマーやポリメラーゼ、ｄＮＴＰなどを、実施する増幅方法に応じて「蛍光標識プライマー／プローブ」および「クエンチャー標識プローブ」と試料に加えるものとする。
　「増幅を等温条件で行う」とは一定温度に保った状態で標的核酸を増幅することをいう。等温増幅法としては、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids（ＩＣＡＮ）法、ＳＤＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法、SMart Amplification Process version 2（ＳＭＡＰ２）法（Nature Methods 4: 257-262(2007)）およびＬＡＭＰ法が挙げられる。
　「ＵＶ照射」とは波長が１０ｎｍ－４００ｎｍ程度の電磁波を照射することをいうが、該電磁波は厳密な波長の制御はされていなくてもよく、蛍光剤の励起光となればよい。
　「目視による判定」とは短時間、例えばＵＶ照射より５秒、１５秒、３０秒、または１分以内に肉眼的にその蛍光剤の放出光の有無の判定を行うことである。場合によっては色見本と比較してもよい。
　「目視による判定」の場合、「ＵＶ照射」による励起が最適で、３から４項目程度までの同時多項目検出が可能であり、「蛍光検出機器」による測定の場合、フォトダイオードアレイ検出器などを用いて、より多項目の同時検出も可能である。
　「キット」とは本発明に係る検出方法に用いる試薬を意味する。「蛍光標識プライマー／プローブ」や「クエンチャー標識プローブ」以外に、検出に必要な試薬、道具および器具などを含んでよい。さらに該「キット」の取扱説明書や色見本を含んでいてもよい。また、核酸増幅を伴う態様においては核酸増幅に必要な試薬をさらに含んでいてもよい。
　本発明の検出方法では、蛍光標識プライマー／プローブの融解温度（Ｔｍ）以下で、かつクエンチャー標識プローブの融解温度（Ｔｍ）より高い温度でインキュベーションして、標的核酸と蛍光標識プライマー／プローブを優先的にアニーリングさせ、次いでクエンチャー標識プローブの融解温度（Ｔｍ）以下の温度でインキュベーションして、標的核酸とアニーリングしていない蛍光標識プライマー／プローブとクエンチャー標識プローブをアニーリングさせることにより、標的核酸とアニーリングしていない蛍光標識プライマープローブの蛍光剤とクエンチャー標識プローブの消光剤を隣接させ、次いでクエンチャー標識プローブの融解温度（Ｔｍ）以下の温度に試料を保ったまま、標的核酸に結合した蛍光標識プライマープローブの蛍光を計測することにより、標的核酸を検出する。
　本発明の検出方法は、「蛍光標識プライマー／プローブ」と「クエンチャー標識プローブ」の融解温度（Ｔｍ）をずらし、これらの融解温度と反応温度との関係を制御して、「蛍光標識プライマー／プローブ」と「クエンチャー標識プローブ」のアニーリングよりも「蛍光標識プライマー／プローブ」と「標的核酸」を優先的にアニーリングさせることにより、「標的核酸」を検出することに特徴がある。さらに検出に必要な蛍光標識プライマー／プローブとクエンチャー標識プローブを増幅反応後に添加する必要がないため、操作が従来の技術に較べ、簡単であり、増幅産物の拡散によるコンタミネーションを防ぐこともできる。
　以下に本発明の各態様の詳細を開示するが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
　本発明の最も基本的な態様は図１に示す通りである。最初に「蛍光標識プライマー／プローブ」および「クエンチャー標識プローブ」を添加すれば、以後いかなる試薬を追加することなく、閉鎖系で標的核酸の検出が可能である。仮に蛍光標識プライマー／プローブのＴｍ値を６５℃、クエンチャー標識プローブのＴｍ値を３５℃とする。反応温度を６０℃（Ｓｔｅｐ１）とすると、蛍光標識プライマー／プローブは標的核酸に結合するが、クエンチャー標識プローブは結合しない。その後、クエンチャー標識プローブのＴｍ値以下（３０℃）にすると（Ｓｔｅｐ２）、標的核酸に結合していない「蛍光標識プライマー／プローブ」と「クエンチャー標識プローブ」のアニーリングが起こる。ＵＶ照射により、放出光（蛍光）を発するのは「標的核酸」に結合した「蛍光標識プライマー／プローブ」の蛍光剤のみであり、「クエンチャー標識プローブ」に結合した「蛍光標識プライマー／プローブ」の蛍光剤からの蛍光は検出できない。従って、試料の蛍光強度は試料中の「標的核酸」の量に依存することになる。
　本発明において標的核酸を増幅する工程を含む態様を図２に示す。従来技術である特許３０１６７５９号公報や特許３９９９６５３号公報に記載されているような核酸増幅検出法は、ＰＣＲのアニーリングの段階では蛍光標識プローブが標的核酸あるいは消光標識プローブとアニーリングしたものが混在するため、蛍光強度は増幅された標的核酸の量に比例するものの増幅された標的核酸の量そのものを示すものではないこと、また、蛍光標識プローブと消光標識プローブは後に続く伸長反応を阻害する可能性もあることから、精確性に乏しい。一方、図２の本態様の場合、増幅された２本鎖産物に蛍光標識プライマー／プローブが取り込まれるため、最終的に増幅された標的核酸の量のみをより精確に検出できる。
　本発明を所謂ＤＮＡチップあるいはマイクロアレイに適用した態様を図３に示す。
　図３Ａは蛍光標識プライマー／プローブをプローブの態様（標的核酸の増幅する工程を含まない態様）で用いた模式図である。此の場合は、蛍光標識プライマー／プローブのオリゴヌクレオチドの３’末端で固定されていてもかまわない。
　固定化の態様の例を図３Ｂに示す。
（１）蛍光標識プライマー／プローブのオリゴヌクレオチドの３’末端で固定化されている。この場合は対応するクエンチャー標識プローブは５’末端に消光剤が結合していることが望ましい。
（２）蛍光標識プライマー／プローブのオリゴヌクレオチドの３’末端に結合した蛍光剤を介して固定化されている。この場合は対応するクエンチャー標識プローブは５’末端に消光剤が結合していることが望ましい。
（３）蛍光標識プライマー／プローブのオリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光剤が結合し、３’ 末端で固定化されている。この場合は対応するクエンチャー標識プローブは３’ 末端に消光剤が結合していることが望ましい。
　図３Ｃは標的核酸の増幅する工程を含む態様である。この場合は、蛍光標識プライマー／プローブのオリゴヌクレオチドの３’領域で固定されていないことが好ましい。核酸増幅の工程を含む態様の場合、標的核酸と蛍光標識プライマー／プローブの結合がより安定する。
　マイクロアレイに結合させる核酸はラジオアイソトープ、蛍光剤などで標識され、標識されていない固定化したオリゴヌクレオチドなどにアニーリングさせる。その後、結合していない、標識された核酸を洗浄により除去後、アニーリングによりマイクロアレイに結合した核酸の標識を検出することにより、核酸の検出が可能となる。しかしながら、図３の態様を見ればわかるように、固相面に結合した蛍光標識プライマー／プローブを用いることにより、試料全体の蛍光ラベル化を行う必要がなくなり、また洗浄の工程を必要としないため、より簡便に標的核酸を検出することが可能になる。
　本発明は、複数種類の蛍光標識プライマー／プローブ、すなわち各々異なる放出光を発する蛍光剤で標識された複数種類の蛍光標識プライマー／プローブと対応するクエンチャー標識プローブを用いることにより、複数種類の標的核酸を同時に検出することが出来る。蛍光標識プライマー／プローブの蛍光剤は外部からエネルギーを吸収することで電子が励起し、それが基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波（放出光）として放出する。励起状態と基底状態のエネルギー準位の差はその蛍光剤特異的であるため、異なる蛍光剤が外部から同時にエネルギーを吸収しても、各々の蛍光剤は蛍光剤特異的な波長の放出光（電磁波）、すなわち「違う色の光」を発する。この放出光は対応するクエンチャー標識プローブの消光剤によってのみ吸収消光され、他のクエンチャー標識プローブの影響は受けない。従って、蛍光剤の放出光の「波長」、すなわち「色」に着目すれば、同時に複数種類の標的核酸を検出することが可能である。これらの放出光は分光光度計等を用いれば、各々検出することが可能であるが、肉眼においても、混合色あるいは中間色として検出することが可能である。
　本発明の検出方法は、各種細菌、真菌、ウイルス等の病原体の検出に適用できる。細菌としてはMycoplasma pneumoniae、レジオネラ属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌、結核菌、カンピロバクター（Campylobacter jejuniおよびCampylobacter coli）、百日咳菌(Bordetella pertussis)等があげられる。真菌としてはCandida属菌、Aspergillus属菌、Cryptococcus属菌等があげられる。ウイルスとしてはインフルエンザA（H1N1）pdmウイルス、インフルエンザA（H1N1）ウイルス、H5亜型インフルエンザウイルス、SARSコロナウイルス、単純ヘルペスウイルス 1型および2型 (Herpes Simplex Virus type1/2　;ＨＳＶ－１／２)、並びにノロウイルスGenogroup I（GI）およびGenogroup II（GII）等があげられる。その他、寄生動物としては、マラリア原虫、クリプトスポリジウム原虫、ジアルジア原虫等があげられる。また、病原体そのものを検出するだけではなく、病原性に関与する遺伝子、例えば、毒素遺伝子（例えばベロ毒素（verotoxin；以下VT）遺伝子１型（VT1）および２型（VT2））や薬剤耐性遺伝子、あるいは宿主への感染（侵入・定着・増殖）に関わる遺伝子等を検出することも可能である。さらにCytochrome遺伝子等の一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism; SNP）の検出、あるいは牛胚性判別の判定のための雄特異的遺伝子配列の検出などに応用できる。これらを検出するためには、検出対象に特異的な核酸配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド配列である蛍光標識プライマー／プローブを先ず設計して、次いで対応するクエンチャー標識プローブを設計して、本発明の検出方法を実施すればよい。
　特に本発明の複数種類の標的核酸を検出する態様は、ヒトのインフルエンザウイルス（Ａ型（H1N1、H3N2、H1N2、H2N2、H9N1、H5N1を含む）、Ｂ型およびＣ型）あるいは肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型およびＣ型）などの近接種ウイルスを１度に検出識別するのに有効である。また、性感染症の原因となる、淋菌、梅毒トレポネーマ菌、クラミジア・トラコマティスなどの有無を１度に検出識別するのにも有効である。さらに感染性胃腸炎の原因となる、ノロウイルスやロタウイルスなどの有無を１度に検出識別するのにも有効である。あるいは輸血用血液のスクリーニング検査としてエイズウイルス(ＨＩＶ)、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)の有無を１度に検出識別するのにも有効である。
　本発明のキットは、試料中に存在する１種類以上の標的核酸を、増幅させて、あるいは増幅させることなく検出するために用いる標的核酸検出用キットであって、１種類または複数種類の、蛍光剤で標識された、標的核酸と相補性を有するオリゴヌクレオチドである蛍光標識プライマー／プローブと、消光剤で標識された、該蛍光標識プライマー／プローブと相補性を有し、該蛍光標識プライマー／プローブより、融解温度（Ｔｍ）の低いオリゴヌクレオチドであるクエンチャー標識プローブの組み合わせを含む標的核酸検出用キットである。
　前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さは前記蛍光標識プライマー／プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さより短いか、あるいは前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドが修飾塩基を含んでいるものが挙げられる。
　前記蛍光標識プライマー／プローブが固相面に固定されていてもよい。また、本発明のキットは標的核酸を増幅させるための他の試薬を含んでよく、通常の核酸検出用に用いる他の試薬を必要に応じて、任意に含んでよい。
　以下に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．Ｔｍ値の影響確認
（１）測定鋳型
　測定用鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部（配列番号２１）をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下ＣＴプラスミド）を作製した。
（２）プライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブの合成
　クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないＬＡＭＰ反応用のプライマーを設計した。設計したプライマーのうち、ＬＢの５’末端をＦＡＭにて蛍光標識したものを蛍光標識プライマー／プローブとし、相補鎖の３’末端にＢＨＱ１を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。また、クエンチャー標識プローブについては、５’末端側を３～１０塩基削除し、Ｔｍ値を下げたクエンチャー標識プローブも設計した。プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。クエンチャー標識プローブのＴｍ値は最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)の計算値を示している。
＜クラミジア・トラコマティス　プライマー＞
　ＣＴ－ＦＩＰ：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＣ－３’（配列番号１）
　ＣＴ－ＢＩＰ：５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴ－３’（配列番号２）
　ＣＴ－Ｆ３：５’－ＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号３）
　ＣＴ－Ｂ３：５’－ＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＴＴＣ－３’（配列番号４）
　ＣＴ－ＬＦ：５’－ＡＡＧＡＴＡＡＣＣＣＣＧＣＡＣＧＴ－３’（配列番号５）
　ＣＴ－ＬＢ：５’－ＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ－３’（配列番号６）
＜クラミジア・トラコマティス蛍光標識プライマー／プローブ＞
　ＦＡＭ－ＣＴ－ＬＢ：５’－（ＦＡＭ）－ＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ－３’（配列番号７）
＜クラミジア・トラコマティス　クエンチャー標識プローブ＞
　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－０：５’－ＴＧＴＣＴＴＣＧＴＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号８）Ｔｍ＝６０．６℃
　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－３：５’－ＣＴＴＣＧＴＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号９）Ｔｍ＝５３．９℃
　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－５：５’－ＴＣＧＴＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号１０）Ｔｍ＝４９．７℃
　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－６：５’－ＣＧＴＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号１１）Ｔｍ＝４６．５℃
　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－７：５’－ＧＴＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号１２）Ｔｍ＝３７．５℃
　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－９：５’－ＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号１３）Ｔｍ＝３２．６℃
　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－１０：５’－ＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号１４）Ｔｍ＝２６．７℃
（３）ＬＡＭＰ反応試薬組成および濃度
　ＬＡＭＰ最終反応溶液３０μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。クエンチャー標識プローブは未添加を対照とし、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－０（配列番号８）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－３（配列番号９）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－５（配列番号１０）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－６（配列番号１１）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－７（配列番号１２）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－９（配列番号１３）もしくはＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－１０（配列番号１４）の何れかを添加した。
・３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
・１５ｍＭ　ＫＣｌ
・１５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４
・１２ｍＭ　ＭｇＳＯ４
・０．１５％　Ｔｗｅｅｎ２０
・２．１ｍＭ　ｄＡＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＣＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＧＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＴＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・３８．４Ｕ　Ｂｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社）
・プライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブ
　　０．８μＭ　ＣＴ－ＦＩＰ（配列番号１）
　　０．８μＭ　ＣＴ－ＢＩＰ（配列番号２）
　　０．１μＭ　ＣＴ－Ｆ３（配列番号３）
　　０．１μＭ　ＣＴ－Ｂ３（配列番号４）
　　０．４μＭ　ＣＴ－ＬＦ（配列番号５）
　　０．４μＭ　ＦＡＭ－ＣＴ－ＬＢ（配列番号７）
　　０．８μＭ　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－０（配列番号８）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－３（配列番号９）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－５（配列番号１０）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－６（配列番号１１）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－７（配列番号１２）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－９（配列番号１３）もしくはＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－１０（配列番号１４）
（４）増幅
　蒸留水（ＤＷ）またはＣＴプラスミド１０４ｃｏｐｉｅｓを１反応に添加し、リアルタイム濁度測定装置ＬＡ－３２０Ｃ（テラメックス社）を用い、６５℃１２０分間増幅反応を行った。
（５）判定
　ＬＡ－３２０Ｃにて増幅反応（ＬＡ－３２０Ｃでは、核酸の増幅反応をその副産物であるピロリン酸マグネシウムの生成による吸光度の変化、すなわち濁度の変化によりモニタリングする。Ｔｔ値：濁度測定データの演算値が反応開始から所定の判定値に到達するまでの時間、濁度曲線：濁度のリアルタイム測定データのプロット)の確認を行うとともに、増幅後反応チューブにＵＶを照射し、緑色の蛍光（ＦＡＭ）を発しているものを陽性、蛍光が認められないものを陰性とした。
　クエンチャー標識プローブを使用していない場合は、ＣＴプラスミド１０４ｃｏｐｉｅｓの増幅は２０．６分で認められた。それに対し、クエンチャー標識プローブを添加したものではクエンチャー標識プローブによって増幅時間が異なり、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－０（配列番号８）では９２．４分（＋７１．７分）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－３（配列番号９）では４１．５分（＋２０．８分）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－５（配列番号１０）では２７．８分（＋７．１分）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－６（配列番号１１）では２５．５分（＋４．８分）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－７（配列番号１２）では２２．８分（＋２．１分）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－９（配列番号１３）では２０．７分（＋０．０分）、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－１０（配列番号１４）では２０．６分（－０．１分）であった。また、何れのクエンチャー標識プローブを用いた場合でも、ＣＴプラスミドを添加したチューブではＦＡＭ由来の蛍光である緑が確認され、ＤＷを添加したチューブでは蛍光が確認できなかった(表１)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　「Ｔｔ（ＤＷ）」はＤＷ添加、「Ｔｔ（ＣＴ）」はＣＴプラスミド１０４ｃｏｐｉｅｓを１反応に添加して反応させた時のＴｔ値を示す。
　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１を添加していない場合は、ＤＷ添加においても蛍光標識がＱｕｅｎｃｈｉｎｇされていないため蛍光が確認できた。ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１を添加しているもの（Ｑ１－０）では、何れもＤＷ添加では消光しており、またＣＴプラスミドを添加しているものでは、ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１のＴｍ値に影響されることなく蛍光が確認できた。
　［表１］が示すように、クエンチャー標識プローブのＴｍ値が大きいほど増幅時間が遅延しているが、Ｔｍ値が３２．６℃以下ではその影響がなくなっている。従ってクエンチャー標識プローブのＴｍは３２．６℃以下が望ましいということが示唆された。
実施例２．ＬＡＭＰ法による増幅後にクエンチャー標識プローブを添加した場合
（１）測定鋳型
　測定用鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部（配列番号２１）をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下ＣＴプラスミド）を作製した。
（２）プライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブの合成
　クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないプライマーを設計した。設計したプライマーのうち、ＬＢの５’末端をＦＡＭにて蛍光標識したものを蛍光標識プライマー／プローブとし、相補鎖の３’末端にＢＨＱ１を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、蛍光標識プライマーおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。
＜クラミジア・トラコマティス　プライマー＞
　ＣＴ－ＦＩＰ：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＣ－３’（配列番号１）
　ＣＴ－ＢＩＰ：５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴ－３’（配列番号２）
　ＣＴ－Ｆ３：５’－ＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号３）
　ＣＴ－Ｂ３：５’－ＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＴＴＣ－３’（配列番号４）
　ＣＴ－ＬＦ：５’－ＡＡＧＡＴＡＡＣＣＣＣＧＣＡＣＧＴ－３’（配列番号５）
　ＣＴ－ＬＢ：５’－ＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ－３’（配列番号６）
＜クラミジア・トラコマティス　蛍光標識プライマー＞
　ＦＡＭ－ＣＴ－ＬＢ：５’－（ＦＡＭ）－ＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ－３’（配列番号７）
＜クラミジア・トラコマティス　Ｑｕｅｎｃｈｅｒ標識プローブ＞
　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－０：５’－ＴＧＴＣＴＴＣＧＴＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号８）
（３）ＬＡＭＰ反応試薬組成および濃度
　ＬＡＭＰ最終反応溶液３０μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
・１５ｍＭ　ＫＣｌ
・１５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４
・１２ｍＭ　ＭｇＳＯ４
・０．１５％　Ｔｗｅｅｎ２０
・２．１ｍＭ　ｄＡＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＣＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＧＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＴＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・３８．４Ｕ　Ｂｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社）
・プライマーおよび蛍光標識プライマー／プローブ
　　０．８μＭ　ＣＴ－ＦＩＰ（配列番号１）
　　０．８μＭ　ＣＴ－ＢＩＰ（配列番号２）
　　０．１μＭ　ＣＴ－Ｆ３（配列番号３）
　　０．１μＭ　ＣＴ－Ｂ３（配列番号４）
　　０．４μＭ　ＣＴ－ＬＦ（配列番号５）
　　０．４μＭ　ＦＡＭ－ＣＴ－ＬＢ（配列番号７）
また、増幅反応後以下の試薬を添加した。
・クエンチャー標識プローブ
　　０．８μＭ　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－０（配列番号８）
（４）増幅
　ＤＷまたはＣＴプラスミド１０４ｃｏｐｉｅｓを１反応に添加し、ＬＡ－３２０Ｃを用い、６５℃１２０分間増幅反応を行った。
（５）判定
　実施例１と同様に、ＬＡ－３２０Ｃにて増幅反応の確認を行った（表２、図４）。
　ＤＷを添加した反応チューブでは、Ｔｔ値は検出されず、濁度の上昇は見られなかった。一方、ＣＴプラスミドを添加した反応チューブでは、Ｔｔ値が１８．７分、および濁度の上昇が確認された。これらのことからＣＴプラスミド、すなわち標的核酸が含まれる反応チューブでのみ増幅反応が起こったことが確認された。
　各反応チューブの蛍光については、ＤＷを添加した反応チューブ(Tube No. 1)およびＣＴプラスミドを添加した反応チューブ(Tube No. 2)共に蛍光が検出された（図５）。次に、各反応チューブにＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ１－０（配列番号８）を室温で添加すると、ＤＷを添加した反応チューブ(Tube No. 3)は消光された。これに対し、ＣＴプラスミドを添加した反応チューブ(Tube No. 4)では蛍光が保持された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３．ＬＡＭＰ法を用いたクラミジア・トラコマティスと淋菌の同時増幅検出方法
（１）測定鋳型
　内部標準物質鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部(配列番号２１)をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下、ＣＴプラスミドという。）を作製した。また、標的核酸鋳型として、淋菌ｍｔｒＡ領域の一部（配列番号３２）をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下、ＮＧプラスミドという。）を作製した。
（２）クラミジア・トラコマティス　プライマー、ＴＡＭＲＡ標識ループルライマー（蛍光標識プライマー／プローブ）およびＢＨＱ２標識Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブ（クエンチャー標識プローブ）の合成
　クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、ＴＡＭＲＡ標識ループプライマーおよびＢＨＱ２標識Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブの合成は、Ｊ－Ｂｉｏｓ社に依頼した。
＜クラミジア・トラコマティス　プライマー＞
　ＣＴ－ＦＩＰ：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＣ－３’（配列番号１）
　ＣＴ－ＢＩＰ：５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴ－３’（配列番号２）
　ＣＴ－Ｆ３：５’－ＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号３）
　ＣＴ－Ｂ３：５’－ＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＴＴＣ－３’（配列番号４）
　ＣＴ－ＬＢ：５’－ＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ－３’（配列番号６）
＜クラミジア・トラコマティス　ＴＡＭＲＡ標識ループプライマー＞
　ＴＡＭ－ＣＴ－ＬＦ：５’－（ＴＡＭＲＡ）－ＡＡＧＡＴＡＡＣＣＣＣＧＣＡＣＧＴ－３’（配列番号１５）
＜クラミジア・トラコマティス　ＢＨＱ２標識Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブ＞
　ＣＴ－ＬＦｃ－Ｑ２：５’－ＧＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴ－（ＢＨＱ２）－３’（配列番号１６）
（３）淋菌　プライマー、ＦＡＭ標識ループプライマー（蛍光標識プライマー／プローブ）およびＢＨＱ１標識Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブ（クエンチャー標識プローブ）の合成
　淋菌のｍｔｒＡ領域をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないプライマーを設計した。プライマーの合成は、オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。また、ＦＡＭ標識ループプライマーおよびＢＨＱ１標識Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブの合成は、Ｊ－Ｂｉｏｓ社に依頼した。
＜淋菌　プライマー＞
　ＮＧ－ＦＩＰ：５’－ＣＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡ－３’（配列番号１７）
　ＮＧ－ＢＩＰ：５’－ＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＡＣＡＡＣＣＧＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＴＡＴＣＣＡＧＣ－３’（配列番号１８）
　ＮＧ－Ｆ３：５’－ＧＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＧ－３’（配列番号１９）
　ＮＧ－Ｂ３：５’－ＧＧＴＧＴＣＧＴＡＧＣＧＧＡＡＡＣ－３’（配列番号２０）
　ＮＧ－ＬＦ：５’－ＣＧＧＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＣ－３’（配列番号２２）
＜淋菌　ＦＡＭ標識ループプライマー＞
　ＦＡＭ－ＮＧ－ＬＢ：５’－（ＦＡＭ）－ＣＧＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＡＣＡＴＴＴＡＴＧＧ－３’（配列番号２３）
＜淋菌　ＢＨＱ１標識Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブ＞
　ＮＧ－ＬＢｃ－Ｑ１：５’－ＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号２４）
（４）ＬＡＭＰ反応試薬組成および濃度
　ＬＡＭＰ最終反応溶液３０μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
　・３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
　・１５ｍＭ　ＫＣｌ
　・１５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４
　・１２ｍＭ　ＭｇＳＯ４
　・０．１５％　Ｔｗｅｅｎ２０
　・２．１ｍＭ　ＡＴＰ
　・２．１ｍＭ　ＣＴＰ
　・２．１ｍＭ　ＧＴＰ
　・２．１ｍＭ　ＴＴＰ
　・３８．４Ｕ　Ｂｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社）
　・クラミジア・トラコマティスプライマー、ＴＡＭＲＡ標識ループプライマーおよびＢＨＱ２標識Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブ
　　０．８μＭ　ＣＴ－ＦＩＰ（配列番号１）およびＣＴ－ＢＩＰ（配列番号２）
　　０．１μＭ　ＣＴ－Ｆ３（配列番号３）およびＣＴ－Ｂ３（配列番号４）
　　０．４μＭ　ＣＴ－ＬＢ（配列番号６）およびＴＡＭ－ＣＴ－ＬＦ（配列番号１５）
　　０．８μＭ　ＣＴ－ＬＦｃ－Ｑ２（配列番号１６）
　・淋菌　プライマー、ＦＡＭ標識ループプライマーおよびＢＨＱ１標識Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇプローブ
　　０．８μＭ　ＮＧ－ＦＩＰ（配列番号１７）およびＮＧ－ＢＩＰ（配列番号１８）
　　０．１μＭ　ＮＧ－Ｆ３（配列番号１９）およびＮＧ－Ｂ３（配列番号２０）
　　０．４μＭ　ＮＧ－ＬＦ（配列番号２２）およびＦＡＭ－ＮＧ－ＬＢ（配列番号２３）
　　０．８μＭ　ＮＧ－ＬＢｃ－Ｑ１（配列番号２４）
（５）増幅
　ＤＷ、またはＣＴプラスミド１０４コピー、またはＮＧプラスミド１０４コピー、またはＣＴプラスミド１０４コピーおよびＮＧプラスミド１０４コピーを添加し、ＬＡ－３２０Ｃを用いて、６５℃６０分間増幅反応を行った。
（６）判定
　クラミジア・トラコマティス由来の核酸（ＣＴ）が増幅されるとＵＶ照射下において赤色（ＴＡＭＲＡ）が目視でき、淋菌由来の核酸（ＮＧ）が増幅されると緑色（ＦＡＭ）が目視できる。上記増幅反応後、ＵＶを照射して蛍光を確認した結果（図６）、ＤＷ（陰性検体）では無色(Tube No. 1 - 4)；淋菌陽性検体では緑色(Tube No. 5 - 8)；クラミジア・トラコマティス陽性検体では赤色(Tube No. 9 - 12)；両陽性検体では黄色（赤色＋緑色）が目視できた(Tube No. 13 - 16)。
実施例４．クラミジア・トラコマティス、淋菌および人工核酸の多項目同時増幅検出
（１）測定鋳型
　測定用鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部（配列番号２１）をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下ＣＴプラスミド）、淋菌のｍｔｒＡ領域の一部（配列番号３２）をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下ＮＧプラスミド）、人工核酸配列（配列番号３３）をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下ＡＲＩＴＡ２プラスミド）を作製した。
（２）プライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブの合成
　クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域、淋菌のｍｔｒＡ領域および人工核酸配列をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないＬＡＭＰ反応用のプライマーを設計した。設計したプライマーのうち、クラミジア・トラコマティス　ＬＦの５’末端をＴＡＭＲＡに、淋菌ＬＢの５’末端をＦＡＭに、人工核酸配列ＬＢの５’末端をＡｌｅｘａ　ＦｌｕｏｒＴＭ　３５０（以下Ａｌｅｘａ３５０）にて蛍光標識したものを蛍光標識プライマーとし、クラミジア・トラコマティス　ＬＦ相補鎖の３’末端にＢＨＱ２を標識、淋菌ＬＢ相補鎖の３’末端にＢＨＱ１を標識、人工核酸配列ＬＢ相補鎖の３’末端にＢＨＱ０を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。
＜クラミジア・トラコマティス　プライマー＞
　ＣＴ－ＦＩＰ：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＣ－３’（配列番号１）
　ＣＴ－ＢＩＰ：５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴ－３’（配列番号２）
　ＣＴ－Ｆ３：５’－ＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号３）
　ＣＴ－Ｂ３：５’－ＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＴＴＣ－３’（配列番号４）
　ＣＴ－ＬＢ：５’－ＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ－３’（配列番号６）
＜クラミジア・トラコマティス　蛍光標識プライマー／プローブ＞
　ＴＡＭ－ＣＴ－ＬＦ：５’－（ＴＡＭＲＡ）－ＡＡＧＡＴＡＡＣＣＣＣＧＣＡＣＧＴ－３’（配列番号１５）
＜クラミジア・トラコマティス　クエンチャー標識プローブ＞
　ＣＴ－ＬＦｃ－Ｑ２：５’－ＡＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴ－（ＢＨＱ２）－３’（配列番号１６）
＜淋菌　プライマー＞
　ＮＧ－ＦＩＰ：５’－ＣＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡ－３’（配列番号１７）
　ＮＧ－ＢＩＰ：５’－ＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＡＣＡＡＣＣＧＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＴＡＴＣＣＡＧＣ－３’（配列番号１８）
　ＮＧ－Ｆ３：５’－ＧＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＧ－３’（配列番号１９）
　ＮＧ－Ｂ３：５’－ＧＧＴＧＴＣＧＴＡＧＣＧＧＡＡＡＣ－３’（配列番号２０）
　ＮＧ－ＬＦ：５’－ＣＧＧＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＣ－３’（配列番号２２）
＜淋菌　蛍光標識プライマー／プローブ＞
　ＦＡＭ－ＮＧ－ＬＢ：５’－（ＦＡＭ）－ＣＧＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＡＣＡＴＴＴＡＴＧＧ－３’（配列番号２３）
＜淋菌　クエンチャー標識プローブ＞
　ＮＧ－ＬＢｃ－Ｑ１：５’－ＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号２４）
＜人工核酸　プライマー＞
　ＡＲＩＴＡ２－ＦＩＰ：５’－ＣＧＣＴＴＧＧＡＴＡＧＴＣＧＧＡＴＧＣＡＡＧＧＧＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣ－３’（配列番号２５）
　ＡＲＩＴＡ２－ＢＩＰ：５’－ＡＣＧＧＴＧＴＡＴＧＣＴＴＣＧＧＴＧＴＧＣＧＡＡＣＣＴＡＴＣＡＧＣ－３’（配列番号２６）
　ＡＲＩＴＡ２－Ｆ３：５’－ＧＧＡＣＡＡＴＣＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡ－３’（配列番号２７）
　ＡＲＩＴＡ２－Ｂ３：５’－ＡＴＣＡＣＧＧＡＴＣＧＴＡＴＧＴＧＧ－３’（配列番号２８）
　ＡＲＩＴＡ２－ＬＦ：５’－ＧＣＴＡＧＣＴＡＡＧＴＧＣＣＡＴＣＣ－３’（配列番号２９）
＜人工核酸　蛍光標識プライマー／プローブ＞
　Ａｌｅ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢ：５’－（Ａｌｅｘａ３５０）－ＡＡＣＧＡＴＣＧＣＡＣＴＡＡＧＣＡＴ－３’（配列番号３０）
＜人工核酸　クエンチャー標識プローブ＞
　ＡＲＩＴＡ２－ＬＢｃ－Ｑ０：５’－ＡＴＧＣＴＴＡＧＴＧＣＧＡＴＣＧＴＴ－（ＢＨＱ０）－３’（配列番号３１）
（３）ＬＡＭＰ反応試薬組成および濃度
　ＬＡＭＰ最終反応溶液３０μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
　・３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
　・１５ｍＭ　ＫＣｌ
　・１５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４
　・１２ｍＭ　ＭｇＳＯ４
　・０．１５％　Ｔｗｅｅｎ２０
　・２．１ｍＭ　ｄＡＴＰ　（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
　・２．１ｍＭ　ｄＣＴＰ　（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
　・２．１ｍＭ　ｄＧＴＰ　（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
　・２．１ｍＭ　ｄＴＴＰ　（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
　・３８．４Ｕ　Ｂｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社）
　・プライマーおよび蛍光標識プライマー／プローブ
　　０．６μＭ　ＣＴ－ＦＩＰ（配列番号１）、ＮＧ－ＦＩＰ（配列番号１７）
　　０．６μＭ　ＣＴ－ＢＩＰ（配列番号２）、ＮＧ－ＢＩＰ（配列番号１８）
　　０．１μＭ　ＣＴ－Ｆ３（配列番号３）、ＮＧ－Ｆ３（配列番号１９）
　　０．１μＭ　ＣＴ－Ｂ３（配列番号４）、ＮＧ－Ｂ３（配列番号２０）
　　０．３μＭ　ＣＴ－ＬＢ（配列番号６）、ＮＧ－ＬＦ（配列番号２２）
　　０．１μＭ　ＡＲＩＴＡ２－ＦＩＰ（配列番号２５）、ＡＲＩＴＡ２－ＢＩＰ（配列番号２６）
　　０．０２μＭ　ＡＲＩＴＡ２－Ｆ３（配列番号２７）、ＡＲＩＴＡ２－Ｂ３（配列番号２８）
　　０．１μＭ　ＡＲＩＴＡ２－ＬＦ（配列番号２９）
　　０．４μＭ　ＴＡＭ－ＣＴ－ＬＦ（配列番号１５）、ＦＡＭ－ＮＧ－ＬＢ（配列番号２３）、Ａｌｅ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢ（配列番号３０）
また、増幅反応後以下の試薬を添加した。
・クエンチャー標識プローブ
　０．８μＭ　ＣＴ－ＬＦｃ－Ｑ２（配列番号１６）、ＮＧ－ＬＢｃ－Ｑ１（配列番号２４）、ＡＲＩＴＡ２－ＬＢｃ－Ｑ０（配列番号３１）
（４）増幅
　ＤＷ、ＣＴプラスミド１０４ｃｏｐｉｅｓ、ＮＧプラスミド１０４ｃｏｐｉｅｓまたはＡＲＩＴＡ２プラスミド１０２ｃｏｐｉｅｓのうち１種類もしくは複数種類を１反応に添加し、ＬＡ－３２０Ｃを用い、６５℃１２０分間増幅反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（５）判定
　実施例１と同様に、ＬＡ－３２０Ｃにて増幅反応の確認を行った（表３、図７）。　
　ＤＷを添加した（ＣＴ、ＮＧおよびＡＲＩＴＡ２プラスミドすべて－）反応チューブでは、Ｔｔ値は検出されず、濁度の上昇は見られなかった。一方、ＣＴプラスミド、ＮＧプラスミドあるいはＡＲＩＴＡ２プラスミドを１種類、２種類組合せて、あるいは３種類すべてを添加した反応チューブでは、それぞれＴｔ値が得られ、また、濁度の上昇が確認された。これらのことからＣＴプラスミド、ＮＧプラスミドあるいはＡＲＩＴＡ２プラスミドを１種類あるいは複数種類含む反応チューブでのみ増幅反応が起こったことが確認された。増幅終了後の反応チューブに、ＣＴ－ＬＦｃ－Ｑ２（配列番号１６）、ＮＧ－ＬＢｃ－Ｑ１（配列番号２４）、ＡＲＩＴＡ２－ＬＢｃ－Ｑ０（配列番号３１）０．８μＭ添加し、９５℃５分加熱後に室温まで冷却した後、ＵＶを照射して蛍光を観察した（図８）。
　ＤＷを添加した反応チューブでは増幅産物がないため、蛍光が確認できなかった（Tube No. 1）。ＣＴプラスミド添加反応チューブでは、赤の蛍光が確認できた(Tube No. 2)。同様に、ＮＧプラスミド添加反応チューブでは緑の蛍光(Tube No. 3)、ＡＲＩＴＡ２プラスミド添加反応チューブでは青の蛍光が確認できた(Tube No. 4)。二種のプラスミドを添加した反応チューブではそれぞれの蛍光色の中間色を示し、ＣＴプラスミドとＮＧプラスミド添加反応チューブでは黄の蛍光(Tube No. 5)、ＣＴプラスミドとＡＲＩＴＡ２プラスミド添加反応チューブでは紫の蛍光(Tube No. 6)、ＮＧプラスミドとＡＲＩＴＡ２プラスミド添加反応チューブでは水色の蛍光が確認できた(Tube No. 7)。また、三種のプラスミドを添加した反応チューブでは白色の蛍光が確認できた(Tube No. 8)。
実施例５．プローブを用いた標的核酸（クラミジア・トラコマティス）の検出
（１）試料の調製
　試料には、反応後のＬＡＭＰ反応液を用いた。ＬＡＭＰ反応条件については、各試薬組成と終濃度は以下に示すとおりとし、鋳型としてＣＴプラスミドを１反応あたり１０４ｃｏｐｉｅｓとなるように添加、あるいは鋳型の代わりにＤＷを添加し、ＬＡＭＰ最終反応溶液３０μＬとして、ＬＡ－３２０Ｃを用いて、６５℃４０分間増幅反応を行った。また、得られた反応液は８０℃５分間加熱処理をすることでＢｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの失活処理を行ない、後に行なう蛍光標識プライマー／プローブによる検出時に増幅反応が起こらないようにした。このようにして得られたＬＡＭＰ反応液すなわち試料のうち、ＣＴプラスミドを鋳型にして調製したものは陽性検体、ＤＷを添加して調製したものは陰性検体とした。
＜ＬＡＭＰ反応試薬組成および終濃度＞
　ＬＡＭＰ最終反応溶液３０μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
・１５ｍＭ　ＫＣｌ
・１５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４
・１２ｍＭ　ＭｇＳＯ４
・０．１５％　Ｔｗｅｅｎ２０
・２．１ｍＭ　ｄＡＴＰ　（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＣＴＰ　（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＧＴＰ　（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＴＴＰ　（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・３８．４Ｕ　Ｂｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社）
＜クラミジア・トラコマティス　プライマー＞
・　０．８μＭ　ＣＴ－ＦＩＰ：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＣ－３’ （配列番号１）
・　０．８μＭ　ＣＴ－ＢＩＰ：５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴ－３’ （配列番号２）
・　０．１μＭ　ＣＴ－Ｆ３：５’－ＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号３）
・　０．１μＭ　ＣＴ－Ｂ３:５’－ＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＴＴＣ－３’ （配列番号４）
・　０．４μＭ　ＣＴ－ＦＬ：５’－ＡＡＧＡＴＡＡＣＣＣＣＧＣＡＣＧＴ－３’ （配列番号５）
・　０．４μＭ　ＣＴ－ＢＬ：５’－ＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ－３’ （配列番号６）
（２）蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブの合成
　設計したプライマーのうち、ＢＬの５’末端をＦＡＭにて蛍光標識したものを蛍光標識プライマー／プローブとし、相補鎖の３’末端にＢＨＱ１を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。なお、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。
＜クラミジア・トラコマティス　蛍光標識プライマー／プローブ＞
ＦＡＭ－ＣＴ－ＢＬ：５’－（ＦＡＭ）－ＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ－３’（配列番号７）
＜クラミジア・トラコマティス　クエンチャー標識プローブ＞
ＣＴ－ＢＬｃ－Ｑ１－０：５’－ＴＧＴＣＴＴＣＧＴＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号８）
（３）試料への蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブの添加
　（１）で調製した陽性検体と陰性検体それぞれに対して、０．４μＭ蛍光標識プライマー／プローブ（配列番号７）を添加し、９５℃５分間加熱処理を行ない、鋳型の変性を行なった。続いて室温まで冷却し鋳型と蛍光標識プライマーをアニーリングさせた。
　室温まで冷却した後、０．８μＭ　クエンチャー標識プローブ（配列番号８）を添加し攪拌後、ＵＶ下その蛍光を確認した(図９)。
（４）判定
　陽性検体、陰性検体のいずれも、蛍光標識プライマー／プローブの添加前では、蛍光は検出できず（Tube No. 1, 2）、蛍光標識プライマー／プローブであるＦＡＭ－ＣＴ－ＢＬ（配列番号７）の添加後は、蛍光が検出できた（Tube No. 3, 4）。これらを９５℃５分加熱後、室温まで冷却し、クエンチャー標識プローブであるＣＴ－ＢＬｃ－Ｑ１－０（配列番号８）を添加したところ、陰性検体では、ＬＡＭＰ産物は存在しないため、ＦＡＭ－ＣＴ－ＢＬ（配列番号７）はＣＴ－ＢＬｃ－Ｑ１－０（配列番号８）と結合するために、蛍光は消光（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）された（Tube No. 5）。これに対し、陽性検体では、ＣＴプラスミドを鋳型として増幅されたＬＡＭＰ産物にＦＡＭ－ＣＴ－ＢＬ（配列番号７）が結合しており、ＣＴ－ＢＬｃ－Ｑ１－０（配列番号８）とは結合しないため、蛍光が保持されていた（Tube No. 6）。
　従って実施例５は、図１に示す本願発明の最も基本的な態様は実施可能であることを示している。
実施例６．SMart Amplification Process version 2（以下、ＳＭＡＰ２）法を用いたクラミジア・トラコマティスの増幅検出（ＬＡＭＰ法以外の等温増幅法 ＳＭＡＰ２法におけるクエンチャー標識プローブを添加した場合の核酸増幅と増幅産物の検出）
（１）測定鋳型
　測定用鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部（配列番号２１）をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ（以下ＣＴプラスミド）を作製した。
（２）プライマー、蛍光標識プライマーおよびクエンチャー標識プローブの合成
　クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないＳＭＡＰ２反応用のプライマー（ＦＰ、ＴＰ、ＯＰ１、ＯＰ２およびＢＰプライマーの計５本）を設計した。設計したプライマーのうち、ＴＰプライマーによって増幅産物に生じるループ部分にアニールするＢＰプライマーの５’末端をＡｌｅｘａ３５０にて蛍光標識したものを蛍光標識プライマー／プローブとした。さらにＢＰプライマーの相補鎖の３’末端にＢＨＱ０を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。
＜クラミジア・トラコマティス　ＳＭＡＰ２プライマー＞
　ＣＴ－ＦＰ：５’－ＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＧＣＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＣ－３’（配列番号３４）
　ＣＴ－ＴＰ：５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴ－３’（配列番号３５）
　ＣＴ－ＯＰ１：５’－ＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＴＴＣ－３’（配列番号３６）
　ＣＴ－ＯＰ２：５’－ＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号３７）
＜クラミジア・トラコマティス　蛍光標識プライマー／プローブ＞
　Ａｌｅ－ＣＴ－ＢＰ：５’－（Ａｌｅｘａ３５０）－ＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ－３’（配列番号３８）
＜クラミジア・トラコマティス　クエンチャー標識プローブ＞
　ＣＴ－ＢＰｃ－Ｑ０：５’－ＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ０）－３’（配列番号３９）
（３）ＳＭＡＰ２反応試薬組成および濃度
　　ＳＭＡＰ２最終反応溶液３０μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
・３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
・１５ｍＭ　ＫＣｌ
・１５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４
・１２ｍＭ　ＭｇＳＯ４
・０．１５％　Ｔｗｅｅｎ２０
・２．１ｍＭ　ｄＡＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＣＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＧＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・２．１ｍＭ　ｄＴＴＰ（ＧｅｎｅＡＣＴ社）
・３８．４Ｕ　Ｂｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社）
・プライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブ
　　１．３３μＭ　ＣＴ－ＦＰ（配列番号３４）
　　１．３３μＭ　ＣＴ－ＴＰ（配列番号３５）
　　０．１７μＭ　ＣＴ－ＯＰ１（配列番号３６）
　　０．１７μＭ　ＣＴ－ＯＰ２（配列番号３７）
　　０．６７μＭ　Ａｌｅ－ＣＴ－ＢＰ（配列番号３８）
　　１．３３μＭ　ＣＴ－ＢＰｃ－Ｑ０（配列番号３９）
（４）増幅
　ＤＷまたはＣＴプラスミド１０6ｃｏｐｉｅｓを１反応に添加し、リアルタイム濁度測定装置 ＬｏｏｐａｍｐＥＸＩＡＴＭ（テラメックス社）を用い、６５℃４５分間増幅反応を行った。
（５）判定
　ＬｏｏｐａｍｐＥＸＩＡＴＭにて増幅反応の確認を行った（ＬｏｏｐａｍｐＥＸＩＡＴＭでは、核酸の増幅反応をその副産物であるピロリン酸マグネシウムの生成による吸光度の変化、すなわち濁度の変化によりモニタリングする。Ｔｔ値：濁度測定データの演算値が反応開始から所定の判定値に到達するまでの時間、濁度曲線：濁度のリアルタイム測定データのプロット)（表４、図１０）。
　ＤＷを添加した反応チューブでは、Ｔｔ値は検出されず、濁度の上昇はみられなかった。一方、ＣＴプラスミドを添加した反応チューブでは、Ｔｔ値が２３．２分、および濁度の上昇が確認された。これらのことから、ＣＴプラスミド、すなわち標的核酸が含まれる反応チューブでのみ増幅反応が起こったことが確認された。
　増幅反応終了後の各反応チューブにＵＶを照射して蛍光を観察した結果（図１１）、ＤＷを添加した反応チューブ(Tube No. 1)では蛍光は観察されず、ＣＴプラスミドを添加した反応チューブ(Tube No. 2)では蛍光を認めた。
　実施例６は、本願発明が、ＬＡＭＰ法のみならず、様々ある核酸の等温増幅反応においても実施可能であることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例７．単項目増幅、二項目あるいは三項目同時増幅反応系における蛍光波長検出
（１）測定鋳型
　測定用鋳型として、クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域の一部(配列番号２１)をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ(以下ＣＴプラスミド) 、淋菌のｍｔｒＡ領域の一部（配列番号３２）をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ(以下ＮＧプラスミド)、人工核酸配列（配列番号３３）をサブクローニングしたプラスミドＤＮＡ (以下ＡＲＩＴＡ２プラスミド)を作製した。
（２）プライマー、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブの合成
　クラミジア・トラコマティスの潜在プラスミド領域、淋菌のｍｔｒＡ領域および人工核酸配列をターゲットとし、類縁菌との交差性を持たないＬＡＭＰ反応用のプライマーを設計した。設計したプライマーのうち、クラミジア・トラコマティスＢＬの５’末端をＡｌｅｘａ３５０にて蛍光標識、淋菌ＢＬの５’末端をＴＡＭＲＡにて蛍光標識、人工核酸配列ＢＬの５’末端をＦＡＭにて蛍光標識したものを蛍光標識プライマー／プローブとし、クラミジア・トラコマティスＢＬ相補鎖の３’末端にＢＨＱ０を標識、淋菌ＢＬ相補鎖の３’末端にＢＨＱ２を標識、人工核酸配列ＢＬ相補鎖の３’末端にＢＨＱ１を標識したものをクエンチャー標識プローブとした。プライマーの合成はオペロンバイオテクノロジー社に依頼し、蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブについては日本バイオサービス社に依頼した。
＜クラミジア・トラコマティス プライマー＞
　ＣＴ－ＦＩＰ：５’－ＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＣ－３’（配列番号１）
　ＣＴ－ＢＩＰ：５’－ＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＡＣＴＣＧＧＴＣＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＴ－３’（配列番号２）
　ＣＴ－Ｆ３：５’－ＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣ－３’（配列番号３）
　ＣＴ－Ｂ３：５’－ＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＴＴＣ－３’（配列番号４）
　ＣＴ－ＬＦ：５’－ＡＡＧＡＴＡＡＣＣＣＣＧＣＡＣＧＴ－３’（配列番号５）
＜クラミジア・トラコマティス 蛍光標識プライマー／プローブ＞
Ａｌｅ－ＣＴ－ＬＢ：５’－（Ａｌｅｘａ３５０）－ＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＣＧＡＡＧＡＣＡ－３’（配列番号４０）
＜クラミジア・トラコマティス クエンチャー標識プローブ＞
　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ０：５’－ＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ－（ＢＨＱ０）－３’（配列番号４１）
＜淋菌 プライマー＞
　ＮＧ－ＦＩＰ：５’－ＣＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧＣＧＴＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡ－３’（配列番号１７）
　ＮＧ－ＢＩＰ：５’－ＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＡＣＡＡＣＣＧＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＴＡＴＣＣＡＧＣ－３’（配列番号１８）
　ＮＧ－Ｆ３：５’－ＧＣＧＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＣＡＴＣＧ－３’（配列番号１９）
　ＮＧ－Ｂ３：５’－ＧＧＴＧＴＣＧＴＡＧＣＧＧＡＡＡＣ－３’（配列番号２０）
　ＮＧ－ＬＦ：５’－ＣＧＧＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＣ－３’（配列番号２２）
＜淋菌 蛍光標識プライマー／プローブ＞
　ＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢ：５’－（ＴＡＭＲＡ）－ＣＧＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＡＣＡＴＴＴＡＴＧＧ－３’（配列番号４２）
＜淋菌 クエンチャー標識プローブ＞
　ＮＧ－ＬＢｃ－Ｑ２：５’－ＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧ－（ＢＨＱ２）－３’（配列番号４３）
＜人工核酸 プライマー＞
　ＡＲＩＴＡ２－ＦＩＰ：５’－ＣＧＣＴＴＧＧＡＴＡＧＴＣＧＧＡＴＧＣＡＡＧＧＧＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣ－３’（配列番号２５）
　ＡＲＩＴＡ２－ＢＩＰ：５’－ＡＣＧＧＴＧＴＡＴＧＣＴＴＣＧＧＴＧＴＧＣＧＡＡＣＣＴＡＴＣＡＧＣ－３’（配列番号２６）
　ＡＲＩＴＡ２－Ｆ３：５’－ＧＧＡＣＡＡＴＣＧＡＡＧＣＣＡＧＡＡ－３’（配列番号２７）
　ＡＲＩＴＡ２－Ｂ３：５’－ＡＴＣＡＣＧＧＡＴＣＧＴＡＴＧＴＧＧ－３’（配列番号２８）
　ＡＲＩＴＡ２－ＬＦ：５’－ＧＣＴＡＧＣＴＡＡＧＴＧＣＣＡＴＣＣ－３’（配列番号２９）
＜人工核酸 蛍光標識プライマー／プローブ＞
　ＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢ：５’－（ＦＡＭ）－ＡＡＣＧＡＴＣＧＣＡＣＴＡＡＧＣＡＴ－３’（配列番号４４）
＜人工核酸 クエンチャー標識プローブ＞
　ＡＲＩＴＡ２－ＬＢｃ－Ｑ１：５’－ＡＴＧＣＴＴＡＧＴＧＣＧＡＴＣＧＴＴ－（ＢＨＱ１）－３’（配列番号４５）
（３）ＬＡＭＰ反応試薬組成および濃度
　ＬＡＭＰ最終反応溶液３０μＬ中の各試薬濃度が以下になるよう調製した。
　・３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
　・１５ｍＭ　ＫＣｌ
　・１５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４
　・１２ｍＭ　ＭｇＳＯ４
　・０．１５％　Ｔｗｅｅｎ２０
　・２．１ｍＭ　ＡＴＰ
　・２．１ｍＭ　ＣＴＰ
　・２．１ｍＭ　ＧＴＰ
　・２．１ｍＭ　ＴＴＰ
　・３８．４Ｕ　Ｂｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社）
　プライマーについては、以下３種類のプライマーと蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブのセットを1種類もしくは複数種類を1反応に添加した。
　プライマーと蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブのセットの組合せは、単項目増幅では、クラミジア・トラコマティス、淋菌、人工核酸の３通り、２項目同時増幅では、クラミジア・トラコマティスと淋菌、クラミジア・トラコマティスと人工核酸、淋菌と人工核酸の３通り、３項目同時増幅では、クラミジア・トラコマティスと淋菌と人工核酸の1通りである。
＜クラミジア・トラコマティス プライマーと蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブ＞
　０．６７μＭ　ＣＴ－ＦＩＰ（配列番号１）
　０．６７μＭ　ＣＴ－ＢＩＰ（配列番号２）
　０．１７μＭ　ＣＴ－Ｆ３（配列番号３）
　０．１７μＭ　ＣＴ－Ｂ３（配列番号４）
　０．３３μＭ　ＣＴ－ＬＦ（配列番号５）
　０．６７μＭ　Ａｌｅ－ＣＴ－ＬＢ（配列番号４０）
　１．３３μＭ　ＣＴ－ＬＢｃ－Ｑ０（配列番号４１）
＜淋菌 プライマーと蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブ＞
　１．２０μＭ　ＮＧ－ＦＩＰ（配列番号１７）
　１．２０μＭ　ＮＧ－ＢＩＰ（配列番号１８）
　０．１７μＭ　ＮＧ－Ｆ３（配列番号１９）
　０．１７μＭ　ＮＧ－Ｂ３（配列番号２０）
　０．６７μＭ　ＮＧ－ＬＦ（配列番号２２）
　０．６７μＭ　ＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢ（配列番号４２）
　１．３３μＭ　ＮＧ－ＬＢｃ－Ｑ２（配列番号４３）
＜人工核酸 プライマーと蛍光標識プライマー／プローブおよびクエンチャー標識プローブ＞
　０．２０μＭ　ＡＲＩＴＡ２－ＦＩＰ（配列番号２５）
　０．２０μＭ　ＡＲＩＴＡ２－ＢＩＰ（配列番号２６）
　０．０３μＭ　ＡＲＩＴＡ２－Ｆ３（配列番号２７）
　０．０３μＭ　ＡＲＩＴＡ２－Ｂ３（配列番号２８）
　０．１３μＭ　ＡＲＩＴＡ２－ＬＦ（配列番号２９）
　０．６７μＭ　ＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢ（配列番号４４）
　１．３３μＭ　ＡＲＩＴＡ２－ＬＢｃ－Ｑ１（配列番号４５）
（４）増幅
　ＤＷ、ＣＴプラスミド１０３ｃｏｐｉｅｓ、ＮＧプラスミド１０３ｃｏｐｉｅｓまたはＡＲＩＴＡ２プラスミド１０３ｃｏｐｉｅｓのうち1種類もしくは複数種類を1反応に添加し、ＬｏｏｐａｍｐＥＸＩＡＴＭを用い、６５℃４５分間増幅反応を行った。
（５）判定
　ＬｏｏｐａｍｐＥＸＩＡＴＭにて増幅反応の確認を行った。
　増幅反応終了後、反応チューブにＵＶを照射し、蛍光の観察を行った。
　また、増幅反応後の反応液を希釈液にて１００倍に希釈したものを分光蛍光光度計 ＲＦ－５３００ＰＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製)にて各蛍光標識に対応した励起光を照射し蛍光波長のスキャンを行った。
　＜希釈液の組成＞
　・３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．８
　・１５ｍＭ　ＫＣｌ
　・１５ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４
　・１２ｍＭ　ＭｇＳＯ４
　各蛍光標識に対応する励起光として以下の波長を用いた。
　・Ａｌｅｘａ３５０　　　　３５０ｎｍ
　・ＴＡＭＲＡ　　　　　　　５５５ｎｍ
　・ＦＡＭ　　　　　　　　　４９５ｎｍ
１）単項目　クラミジア・トラコマティスの増幅反応系の増幅反応後の蛍光波長測定結果
　ＤＷを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず（表５ 鋳型ＣＴ“－”より、Ｔｔ値は検出されず；図１２のＤＷの増幅曲線より、濁度の上昇なし）、ＵＶ照射下で蛍光が確認できない（図１３ Tube No.1）が、ＣＴプラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ（表５ 鋳型ＣＴ“＋”のＴｔ値 １３．３分；図１２のＣＴの増幅曲線より濁度の上昇あり）、ＵＶ照射下ではＡｌｅ－ＣＴ－ＬＢ（配列番号４０）に由来すると思われる青の蛍光が確認できた（図１３ Tube No.2）。蛍光波長においても同様に、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、鋳型（－）(ＤＷを添加した)の反応液では(図１４ Ａ)、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークのみを確認した。一方、鋳型（＋）（ＣＴプラスミドを添加した）の反応液では(図１４ Ｂ)、３５０ｎｍ付近に励起光と、３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークに加え４４３ｎｍ付近にＡｌｅ－ＣＴ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
２）単項目　淋菌の増幅反応系の増幅反応後の蛍光波長測定結果
　ＤＷを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず（表６ 鋳型ＮＧ“－”より、Ｔｔ値は検出されず；図１５のＤＷの増幅曲線より、濁度の上昇なし）、ＵＶ照射下で蛍光が確認できない（図１６ Tube No.1）が、ＮＧプラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ（表６ 鋳型ＮＧ“＋”より、Ｔｔ値 １１．６分；図１５のＮＧの増幅曲線より、濁度の上昇あり）、ＵＶ照射下ではＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢ（配列番号４２）に由来すると思われる赤の蛍光が確認できた（図１６ Tube No.2）。蛍光波長においても同様に、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、鋳型（－）(ＤＷを添加した)の反応液では(図１７ Ａ)、５５５ｎｍ付近に励起光のみを確認した。一方、鋳型（＋）（ＮＧプラスミドを添加した）の反応液では(図１７ Ｂ)、５５５ｎｍ付近に励起光と、５８０ｎｍ付近にＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
３）単項目　人工核酸 の増幅反応系の増幅反応後の蛍光波長測定結果
　ＤＷを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず（表７ 鋳型ＡＲＩＴＡ２“－”より、Ｔｔ値は検出されず；図１８のＤＷの増幅曲線より、濁度の上昇なし）、ＵＶ照射下で蛍光が確認できない（図１９ Tube No.1）が、ＡＲＩＴＡ２プラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ（表７ 鋳型ＡＲＩＴＡ２“＋”より、Ｔｔ値は、反応時間内に検出されなかったが、図１８のＡＲＩＴＡ２の増幅曲線より、濁度の上昇を確認したことから、核酸は増幅したと判断した）、ＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢ（配列番号４４）に由来すると思われる緑の蛍光が確認できた（図１９ Tube No.2）。
　蛍光波長においては、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、鋳型（－）(ＤＷを添加した)の反応液（図２０ Ａ）と鋳型（＋）（ＡＲＩＴＡ２プラスミドを添加した）の反応液（図２０ Ｂ）はともに、４９５ｎｍ付近に励起光、５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークがみられたが、鋳型（－）の反応液ではより小さな(蛍光強度２０未満の)ピーク（バックグラウンド）であり、鋳型（＋）の反応液においてより大きな(蛍光強度８０超の)ピークを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
４）二項目　クラミジア・トラコマティスと淋菌の同時増幅反応系の増幅反応後の蛍光波長測定結果
　ＤＷを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず（表８ 鋳型ＣＴ“－”およびＮＧ“－”より、Ｔｔ値は検出されず；図２１のＤＷの増幅曲線より、濁度の上昇はなし）、ＵＶ照射下で蛍光は確認できない（図２２ Tube No.1）が、ＣＴプラスミドのみ添加、ＮＧプラスミドのみ添加あるいはＣＴプラスミドとＮＧプラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ（表８　鋳型ＣＴのみ“＋”、鋳型ＮＧのみ“＋”、鋳型ＣＴ“＋”およびＮＧ“＋”のＴｔ値はそれぞれ１２．８分、１３．６分、１２．２分；図２１のＣＴ、ＮＧ、ＣＴ＋ＮＧの増幅曲線よりいずれも濁度の上昇あり）、ＵＶ照射下ではそれぞれ、Ａｌｅ－ＣＴ－ＬＢ（配列番号４０）に由来すると思われる青の蛍光（図２２ Tube No.2）、ＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢ（配列番号４２）に由来すると思われる赤の蛍光(図２２ Tube No.3)、Ａｌｅ－ＣＴ－ＬＢとＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢに由来すると思われる紫の蛍光(図２２ Tube No.4)が確認できた。
　蛍光波長においては、ＣＴおよびＮＧともに鋳型（－）(ＤＷを添加した)の反応液では（図２３ Ａ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピーク、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光のみを確認した。
　ＣＴのみ鋳型（＋）（ＣＴプラスミドのみ添加した）の反応液では（図２３ Ｂ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークに加え４４３ｎｍ付近にＡｌｅ－ＣＴ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光を確認しただけであった。
　ＮＧのみ鋳型（＋）（ＮＧプラスミドのみ添加した）の反応液では（図２３ Ｃ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光と５８０ｎｍ付近にＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認した。
　ＣＴおよびＮＧともに鋳型（＋）（ＣＴプラスミドとＮＧプラスミドを添加した）の反応液では（図２３ Ｄ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近にＡｌｅｘａ３５０のための励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークに加え４４３ｎｍ付近にＡｌｅ－ＣＴ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光と、５８０ｎｍ付近にＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
５）二項目　クラミジア・トラコマティスと人工核酸の同時増幅反応系の増幅反応後の蛍光波長測定結果
　ＤＷを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず（表９ 鋳型ＣＴ“－”およびＡＲＩＴＡ２“－”より、Ｔｔ値は検出されず；図２４のＤＷの濁度曲線より、濁度の上昇なし）、ＵＶ照射下で蛍光は確認できない（図２５ Tube No.1）が、ＣＴプラスミドのみ添加、ＡＲＩＴＡ２プラスミドのみ添加あるいはＣＴプラスミドとＡＲＩＴＡ２プラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ（表９ 鋳型ＣＴのみ“＋”、鋳型ＡＲＩＴＡ２のみ“＋”、鋳型ＣＴ“＋”およびＡＲＩＴＡ２“＋”のＴｔ値はそれぞれ１２．０分、２８．２分、１３．６分；図２４のＣＴ、ＡＲＩＴＡ２、ＣＴ＋ＡＲＩＴＡ２の濁度曲線より、いずれも濁度の上昇有あり）、ＵＶ照射下ではそれぞれ、Ａｌｅ－ＣＴ－ＬＢ（配列番号４０）に由来すると思われる青の蛍光（図２５ Tube No.2）、ＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢ（配列番号４４）に由来すると思われる緑の蛍光(図２５ Tube No.3)、Ａｌｅ－ＣＴ－ＬＢとＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる水色の蛍光(図２５ Tube No.4)が確認できた。
　蛍光波長においては、ＣＴおよびＡＲＩＴＡ２ともに鋳型（－）(ＤＷを添加した)の反応液では（図２６ Ａ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピーク、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光のみを確認した。
　ＣＴのみ鋳型（＋）（ＣＴプラスミドのみ添加した）の反応液では（図２６ Ｂ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークに加え４４３ｎｍ付近にＡｌｅ－ＣＴ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度２０未満の)ピーク（バックグラウンド）を確認した。
　ＡＲＩＴＡ２のみ鋳型（＋）（ＡＲＩＴＡ２プラスミドのみ添加した）の反応液では（図２６ Ｃ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度８０超の)ピークを確認した。
　ＣＴおよびＡＲＩＴＡ２ともに鋳型（＋）（ＣＴプラスミドとＡＲＩＴＡ２プラスミドを添加した）の反応液では（図２６ Ｄ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークに加え４４３ｎｍ付近にＡｌｅ－ＣＴ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と、５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度８０超の)ピークを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
６）二項目　淋菌と人工核酸の同時増幅反応系の増幅反応後の蛍光波長測定結果
　ＤＷを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず（表１０ 鋳型ＮＧ“－”およびＡＲＩＴＡ２“－”より、Ｔｔ値は検出されず；図２７のＤＷの濁度曲線より、濁度の上昇なし）、ＵＶ照射下で蛍光は確認できない（図２８ Tube No.1）が、ＮＧプラスミドのみ添加、ＡＲＩＴＡ２プラスミドのみ添加あるいはＮＧプラスミドとＡＲＩＴＡ２プラスミドを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ（表１０ 鋳型ＮＧのみ“＋”、鋳型ＡＲＩＴＡ２のみ“＋”、鋳型ＮＧ“＋”およびＡＲＩＴＡ２“＋”のＴｔ値はそれぞれ１２．０分、２９．０分、１１．９分；図２７のＮＧ、ＡＲＩＴＡ２、ＮＧ＋ＡＲＩＴＡ２の濁度曲線より、いずれも濁度の上昇あり）、ＵＶ照射下ではそれぞれ、ＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢ（配列番号４２）に由来すると思われる赤の蛍光（図２８ Tube No.2）、ＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢ（配列番号４４）に由来すると思われる緑の蛍光(図２８ Tube No.3)、ＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢとＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる黄の蛍光(図２８ Tube No.4)が確認できた。
　蛍光波長においては、ＮＧおよびＡＲＩＴＡ２Ｇともに鋳型（－）(ＤＷを添加した)の反応液では（図２９ Ａ）、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度２０未満の)ピーク（バックグラウンド）を確認した。
　ＮＧのみ鋳型（＋）（ＮＧプラスミドのみ添加した）の反応液では（図２９ Ｂ）、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光と５８０ｎｍ付近にＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢ由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度２０未満の)ピーク（バックグラウンド）を確認した。
　ＡＲＩＴＡ２のみ鋳型（＋）（ＡＲＩＴＡ２プラスミドのみ添加した）の反応液では（図２９ Ｃ）、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光のみを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度８０超の)ピークを確認した。
　ＮＧおよびＡＲＩＴＡ２ともに鋳型（＋）（ＮＧプラスミドとＡＲＩＴＡ２プラスミドを添加した）の反応液では（図２９ Ｄ）、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光と５８０ｎｍ付近にＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢ由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度８０超の)ピークを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
７）三項目　クラミジア・トラコマティス、淋菌および人工核酸の増幅反応系の増幅反応後の蛍光波長測定結果
　ＤＷを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられず（表１１ 鋳型ＣＴ“－”、ＮＧ“－”およびＡＲＩＴＡ２“－”より、Ｔｔ値は検出されず；図３０のＤＷの濁度曲線より、濁度の上昇なし）、ＵＶ照射下で蛍光は確認できない（図３１ Tube No.1）が、ＣＴプラスミド、ＮＧプラスミド、ＡＲＩＴＡ２プラスミドを１種類添加、２種類組み合わせて添加、あるいは３種類すべてを添加した反応チューブでは核酸の増幅がみられ（表１１ 鋳型ＣＴのみ“＋”、鋳型ＮＧのみ“＋”、鋳型ＡＲＩＴＡ２のみ“＋”、鋳型ＣＴ“＋”およびＮＧ“＋”、鋳型ＣＴ“＋”およびＡＲＩＴＡ２“＋”、鋳型ＮＧ“＋”およびＡＲＩＴＡ２“＋”、鋳型ＣＴ“＋”とＮＧ“＋”およびＡＲＩＴＡ２“＋”のＴｔ値はそれぞれ１４．３分、１３．５分、３５．６分、１２．３分、１４．２分、１３．５分、１２．４分；図３０のＣＴ、ＮＧ、ＡＲＩＴＡ２、ＣＴ＋ＮＧ、ＣＴ＋ＡＲＩＴＡ２、ＮＧ＋ＡＲＩＴＡ２、ＣＴ＋ＮＧ＋ＡＲＩＴＡ２の濁度曲線より、いずれも濁度の上昇あり）、ＵＶ照射下ではそれぞれ、Ａｌｅ－ＣＴ－ＬＢ（配列番号４０）に由来すると思われる青の蛍光（図３１ Tube No.2）、ＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢ（配列番号４２）に由来すると思われる赤の蛍光（図３１ Tube No.3）、ＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢ（配列番号４４）に由来すると思われる緑の蛍光(図３１ Tube No.4)、Ａｌｅ－ＣＴ－ＬＢとＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢに由来すると思われる紫の蛍光(図３１ Tube No.5)、Ａｌｅ－ＣＴ－ＬＢとＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる水色の蛍光(図３１ Tube No.6)、ＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢとＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる黄の蛍光(図３１ Tube No.7)、Ａｌｅ－ＣＴ－ＬＢとＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢおよびＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる白の蛍光(図３１ Tube No.8)が確認できた。
　蛍光波長においては、ＣＴ、ＮＧおよびＡＲＩＴＡ２すべて鋳型（－）(ＤＷを添加した)の反応液では（図３２ Ａ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と、３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光のみを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度２０未満の)ピーク（バックグラウンド）を確認した。
　ＣＴのみ鋳型（＋）（ＣＴプラスミドを添加した）の反応液では（図３２ Ｂ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークに加え、４４３ｎｍ付近にＡｌｅ－ＣＴ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光のみを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度２０未満の)ピーク（バックグラウンド）を確認した。
　ＮＧのみ鋳型（＋）（ＮＧプラスミドのみ添加した）の反応液では（図３２ Ｃ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光に加え、５８０ｎｍ付近にＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢ由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度２０未満の)ピーク（バックグラウンド）を確認した。
　ＡＲＩＴＡ２のみ鋳型（＋）（ＡＲＩＴＡ２プラスミドのみ添加した）の反応液では（図３２ Ｄ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光のみを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度８０超の)ピークを確認した。
　ＣＴおよびＮＧともに鋳型（＋）（ＣＴプラスミドとＮＧプラスミドを添加した）の反応液（図３２ Ｅ）では、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近にＡｌｅｘａ３５０のための励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークに加え４４３ｎｍ付近にＡｌｅ－ＣＴ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光と、５８０ｎｍ付近にＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認したが、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の小さな(蛍光強度２０未満の)ピーク（バックグラウンド）を確認しただけであった。
　ＣＴおよびＡＲＩＴＡ２ともに鋳型（＋）（ＣＴプラスミドとＡＲＩＴＡ２プラスミドを添加した）の反応液では（図３２ Ｆ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークに加え４４３ｎｍ付近にＡｌｅ－ＣＴ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光のみを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と、５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度８０超の)ピークを確認した。
　ＮＧおよびＡＲＩＴＡ２ともに鋳型（＋）（ＮＧプラスミドとＡＲＩＴＡ２プラスミドを添加した）の反応液では（図３２ Ｇ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近に励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークのみを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光と５８０ｎｍ付近にＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢ由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度８０超の)ピークを確認した。
　ＣＴ、ＮＧおよびＡＲＩＴＡ２すべて鋳型（＋）(ＣＴプラスミドとＮＧプラスミドおよびＡＲＩＴＡ２プラスミドを添加した)の反応液では（図３２ Ｈ）、Ａｌｅｘａ３５０に対応する励起光を照射した場合、３５０ｎｍ付近にＡｌｅｘａ３５０のための励起光と３９８ｎｍ付近に水のラマン分光のピークに加え４４３ｎｍ付近にＡｌｅ－ＣＴ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、ＴＡＭＲＡに対応する励起光を照射した場合、５５５ｎｍ付近に励起光と、５８０ｎｍ付近にＴＡＭ－ＮＧ－ＬＢに由来すると思われる蛍光のピークを確認し、さらに、ＦＡＭに対応する励起光を照射した場合、４９５ｎｍ付近に励起光と、５２２ｎｍ付近にＦＡＭ－ＡＲＩＴＡ２－ＬＢに由来すると思われる蛍光の十分に大きな(蛍光強度８０超の)ピークを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　本願発明は、単項目あるいは多項目の増幅反応系で1種類の鋳型から核酸が増幅される場合は、項目毎の検出に用いる1種類の蛍光標識に由来する蛍光、多項目の増幅反応系で複数種類の鋳型から核酸が増幅される場合は、各項目の検出に用いる複数種類の蛍光標識に由来する蛍光を検出するものである。目視で検出を行う場合は、ヒトの三色型色覚で識別可能な範囲の蛍光色光である必要があり、例えば、実施例で示したように、青、赤、緑の蛍光標識を原色に用いて加法混合を利用して表現される色調は、先の三つの原色に加えて、紫、黄、水色、白色の七つの色、これに蛍光を発しない場合（無色すなわち無蛍光）を含めて全部で８種類の色が上限となる。一方、蛍光測定機器で検出を行う場合は、機器により識別可能な種類の蛍光標識を用いることができるため、さらに多くの項目を同時に検出することが可能であり、また、発光強度により定量することも可能である。
　実施例７は、本願発明が、単項目、多項目によらず等温増幅反応における核酸の増幅を検出するために、蛍光検出機器による蛍光の計測が実施可能であることを示している。
　本発明は、従来技術より簡便安価に標的核酸を検出する方法を提供できる。また、本発明をマイクロアレイに適用することにより、標的核酸を標識することなく、遺伝子発現を検出することが出来る。さらには従来の核酸増幅技術と組み合わせることにより、１ステップの試薬添加で、多項目の標的核酸を一度に検出することも可能である。加えて、その検出を特別な機器を用いることなく、目視で出来ることを可能にする。従ってかかる発明は従来の研究室内だけでなく、病院における感染菌、ウイルスの同定、薬剤感受性の確認、一塩基多型検出による治療効果予測、食品製造販売における安全性の確認などにおいて、極めて有効なツールとなりうる。

Claims (14)

  1. 　試料中に存在する１種類以上の標的核酸を検出する方法であって、以下のステップを含む核酸を検出する方法：
    　　　（１）試料に
    　　　　　　蛍光剤で標識された、標的核酸と相補性を有するオリゴヌクレオチドである蛍光標識プライマーまたはプローブと、
    　　　　　　消光剤で標識された、該蛍光標識プライマーまたはプローブと相補性を有し、該蛍光標識プライマーまたはプローブより融解温度（Ｔｍ）の低いオリゴヌクレオチドであるクエンチャー標識プローブ
    　　　　　　を添加し；
    　　　（２）該試料を該蛍光標識プライマーまたはプローブの融解温度（Ｔｍ）以下で、かつ該クエンチャー標識プローブの融解温度（Ｔｍ）より高い温度で保温し；
    　　　（３）該試料を該クエンチャー標識プローブの融解温度（Ｔｍ）以下の温度で保温し；
    　　　（４）標的核酸に結合した蛍光標識プライマーまたはプローブの蛍光を計測する。
  2. 　前記ステップ（２）の保温の間に標的核酸を増幅する、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記標的核酸の増幅を等温条件で行う請求項２に記載の検出方法。
  4. 　前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さが前記蛍光標識プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さより短い、請求項１－３のいずれかに記載の検出方法。
  5. 　前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドが修飾塩基を含んでいる、請求項１－３のいずれかに記載の検出方法。
  6. 　前記蛍光標識プライマーまたはプローブを固相面に固定させて使用する、請求項１－５のいずれかに記載の検出方法。
  7. 　２種類以上の標的核酸を検出するために、発光波長の異なる２種類以上の蛍光標識プライマーまたはプローブとそれぞれに対するクエンチャー標識プローブの組み合わせを用いる請求項１－６のいずれかに記載の方法。
  8. 　前記ステップ（４）における蛍光の計測が目視による判定である請求項１－７のいずれかに記載の方法。
  9. 　前記ステップ（４）における蛍光の計測が蛍光検出機器による判定である請求項１－７のいずれかに記載の方法。
  10. 　請求項１－９のいずれかに記載の検出方法に用いるためのキットであって、１種類又は複数種類の
    　　蛍光剤で標識された、標的核酸と相補性を有するオリゴヌクレオチドである蛍光標識プライマーまたはプローブと；
    　　それぞれの蛍光剤に対応する消光剤で標識された、該蛍光標識プライマーまたはプローブと相補性を有し、該蛍光標識プライマーまたはプローブより融解温度（Ｔｍ）の低いオリゴヌクレオチドであるクエンチャー標識プローブ
    　　の組み合わせを；
    　含む標的核酸検出用キット。
  11. 　前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さが前記蛍光標識プライマーまたはプローブのオリゴヌクレオチドの塩基の長さより短い、請求項１０に記載の標的核酸検出用キット。
  12. 　前記クエンチャー標識プローブのオリゴヌクレオチドが修飾塩基を含んでいる、請求項１０に記載の標的核酸検出用キット。
  13. 　さらに核酸増幅用試薬を含む請求項１０－１２に記載のキット。
  14. 　前記蛍光標識プライマーまたはプローブが固相面に固定されている請求項１０－１３のいずれかに記載の標的核酸検出用キット。
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