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ES2923224T3 - Oligonucleótidos y métodos para el control interno de las reacciones de amplificación de ADN eucariota - Google Patents

Oligonucleótidos y métodos para el control interno de las reacciones de amplificación de ADN eucariota Download PDF

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ES2923224T3
ES2923224T3 ES19714324T ES19714324T ES2923224T3 ES 2923224 T3 ES2923224 T3 ES 2923224T3 ES 19714324 T ES19714324 T ES 19714324T ES 19714324 T ES19714324 T ES 19714324T ES 2923224 T3 ES2923224 T3 ES 2923224T3
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Vicky Oberkofler
Katrin Janik
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Centro Di Sperimentazione Laimburg
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Abstract

La presente invención se refiere a oligonucleótidos que son cebadores y sondas universales ya métodos que utilizan estos oligonucleótidos para detectar o detectar y cuantificar un ácido nucleico que actúa como control interno universal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos y métodos para el control interno de las reacciones de amplificación de ADN eucariota
La presente invención se refiere en general al campo de la amplificación de ácidos nucleicos y más particularmente a métodos que implican la amplificación y la detección/cuantificación de una secuencia de nucleótidos de control universal, y a cebadores, sondas y kits útiles en tales métodos.
La detección fiable de ácidos nucleicos desempeña un papel importante en diferentes aplicaciones en muchos campos de investigación, especialmente en diagnóstico molecular. Los controles internos para evaluar la integridad de los ácidos nucleicos y la ausencia de inhibidores de la PCR en las reacciones de amplificación son herramientas indispensables para la detección de patógenos moleculares y los estudios de expresión génica. Estos estudios se basan habitualmente en la detección de un ácido nucleico diana específico (por ejemplo, un gen o fragmento de ADN procedente de un patógeno o un gen expresado) y la detección paralela (es decir, en diferentes recipientes de reacción) o múltiple (es decir, en el mismo recipiente de reacción) de un control interno (un gen, o fragmento de ARN o ADN procedente del huésped) que demuestra la presencia e integridad globales de los ácidos nucleicos y la ausencia de inhibidores de la PCR en la muestra respectiva.
Los ensayos de detección de patógenos moleculares se utilizan asimismo para la detección de fitoplasmas. Los fitoplasmas son patógenos de plantas responsables de trastornos graves tanto en plantas ornamentales como en cultivos frutales. En particular, Candidatus Phytoplasma mali es el agente causal de la enfermedad de proliferación del manzano, un trastorno grave que afecta a los manzanos y produce pérdidas económicas significativas a los productores de manzanas.
El ciclo de infección de la enfermedad provocada por Candidatus Phytoplasma mali implica interacciones multitróficas entre el patógeno y diferentes huéspedes, es decir, insectos y plantas. De hecho, los fitoplasmas son patógenos bacterianos que requieren una planta huésped como reservorio de la enfermedad y un insecto huésped que contribuya a propagar el patógeno de una planta infectada a una sana.
Los principales vectores insectos responsables de propagar la enfermedad provocada por Candidatus Phytoplasma mali son dos psílidos, Cacopsylla picta y Cacopsylla melanoneura. La enfermedad asimismo puede transmitirse por medio de las técnicas convencionales de multiplicación de plantas, tales como el injerto, cuando se utiliza material de propagación infectado y, en menor medida, mediante la formación de anastomosis radiculares entre plantas enfermas y plantas sanas adyacentes. Por lo tanto, el estudio y la monitorización de la enfermedad provocada por Candidatus Phytoplasma mali requiere la capacidad para detectar de manera fiable el patógeno en diferentes especies de insectos y plantas.
Se han publicado las secuencias de cebadores y sondas para la detección de Candidatus Phytoplasma mali (Ref.
1). Sin embargo, en la bibliografía no existen informes de cebadores universales adecuados para un control interno que sea útil para la detección fiable del ADN del patógeno en muestras obtenidas a partir de una variedad de organismos eucariotas.
La mayoría de los controles internos publicados para PCR cuantitativa son específicos de especie o son muy limitados en cuanto a la detección en diferentes especies. Esto provoca limitaciones para el sistema de detección, ya que la especificidad del control interno determina en qué organismos puede detectarse de manera fiable el ácido nucleico diana. Varias publicaciones abordan el diseño de cebadores universales para diferentes fines, pero principalmente para amplificar tramos largos de ADN para análisis filogenéticos (Refs. 3-8) y no como control interno universal para análisis de PCR cuantitativa. En particular, la PCR cuantitativa en tiempo real (Ref. 11) requiere cebadores que generen productos de amplificación relativamente cortos, preferentemente no mayores de aproximadamente 100 pb.
Un conjunto de cebador/sonda disponible comercialmente, basado en el gen de ARNr 18S eucariota, para su utilización como control interno universal se comercializa por Applied Biosystems™ y consiste en una mezcla de cebador/sonda lista para utilizar para amplificar un tramo en el gen de ARNr 18S (Ref. 2). Sin embargo, las secuencias de este conjunto de cebador/sonda no están disponibles y su utilización está siempre asociada a la compra del conjunto de cebador/sonda del fabricante al precio indicado.
El gen de p-actina se consideró un posible control universal en la detección de ADN y ARN (Ref. 9), pero un análisis in silico reveló que la secuencia de p-actina de varias especies de insectos no está suficientemente conservada para ser un control universal adecuado en ensayos en los que la muestra se obtiene a partir de esas especies de insecto. Subbotin Sergei A. et al 2001 (“A rapid method for the identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines using duplex PCR”, NEMATO, BRILL, LEIDEN, NL, vol. 3, n.° 4, 1 de enero de 2001) describe un par de cebadores universales, que amplifican la región de expansión D3 del gen ribosómico de subunidad grande (gen de ADNr 28S).
Que se sepa, ninguna otra publicación proporciona información de secuencia para un conjunto de cebador/sonda universal aplicable como control interno fiable para la detección por PCR cuantitativa de un ácido nucleico diana en un amplio conjunto de organismos eucariotas, que van desde células de levadura hasta humanas.
A partir de lo anterior, la finalidad de la presente invención es proporcionar un control universal para reacciones de amplificación que se amplifique de manera fiable en un amplio conjunto de organismos eucariotas. La invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un control universal que sea rentable y permita verificar la integridad de la muestra y la ausencia de inhibidores de PCR, en particular, para validar resultados de diagnóstico negativos.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un control que pueda utilizarse para verificar la integridad de la muestra y la ausencia de inhibidores de PCR en ensayos moleculares tanto cualitativos como cuantitativos dirigidos a ADN o ARN.
Otro objetivo de la invención es proporcionar unos medios para verificar la integridad de la muestra y la ausencia de inhibidores de PCR en ensayos de detección individuales o múltiples y en ensayos en los que se detectan y/o cuantifican múltiples dianas en paralelo.
La finalidad, así como estos y otros objetivos que resultarán más evidentes a continuación en la presente memoria, se logran mediante un par de cebadores que consiste en un primer cebador que comprende SEC ID N°: 1 y un segundo cebador que comprende SEC ID N°: 2.
La finalidad y los objetivos de la presente invención asimismo se logran mediante una sonda que consiste en SEC ID N°: 3 o un complemento de la misma.
Además, la finalidad y los objetivos de la invención se logran mediante una composición que comprende el par de cebadores y opcionalmente la sonda descrita anteriormente.
La finalidad y el objetivo de la invención asimismo se logran mediante un kit que comprende:
(a) el par de cebadores de la invención; y
(b) opcionalmente la sonda de la invención.
La finalidad y el objetivo de la invención asimismo se logran mediante un método controlado internamente de amplificación de ácidos nucleicos en una muestra de prueba, en el que la muestra de prueba comprende una secuencia de control que comprende SEC ID N°: 5 y el método comprende:
(a) formar una mezcla poniendo en contacto la muestra de prueba con el par de cebadores de la invención; (b) someter la mezcla formada en (a) a una amplificación de ácido nucleico en condiciones para generar un producto de amplificación de la secuencia de control; y
(c) detectar la presencia y/o cuantificar la cantidad de la secuencia de control.
Finalmente, la finalidad y el objetivo de la invención asimismo se logran mediante un método controlado internamente de amplificación de ácidos nucleicos en una muestra de prueba, en el que la muestra de prueba comprende una secuencia de control que comprende SEC ID N°: 5 y comprende potencialmente una o más secuencias diana y el método comprende:
(a) formar una mezcla poniendo en contacto la muestra con el par de cebadores de la invención;
(c) formar una o más mezclas poniendo en contacto la muestra de prueba con por lo menos un par de cebadores específicos para la una o más secuencias diana;
(d) someter la una o más mezclas formadas en (a) y (b) a una amplificación de ácido nucleico en condiciones para generar productos de amplificación de la secuencia de control y de la una o más secuencias diana; y (e) detectar la presencia y/o cuantificar la cantidad de la secuencia de control.
Las características y ventajas adicionales de la invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones se aplicarán las siguientes definiciones.
Los términos “secuencia diana”, “ácido nucleico diana” y “secuencia de ácido nucleico diana” son sinónimos y se utilizan en la presente memoria para indicar un ácido nucleico en una muestra de prueba que debe analizarse, es decir, debe determinarse la presencia, ausencia y/o cantidad del mismo en una muestra.
Los términos “secuencia de control” o “control de ácido nucleico” tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a un ácido nucleico basado en el gen de ARNr 28S eucariota que comprende, o que consiste esencialmente en, o que consiste en una secuencia de SEC ID N°: 5 y que sirve como control interno universal, es decir, cuya amplificación y/o cantidad se determinan para evaluar la integridad de los ácidos nucleicos y la ausencia de inhibidores de amplificación en la muestra de prueba.
Los términos “muestra de prueba” o “muestra” se refieren a un material obtenido a partir de un organismo eucariota, tal como células de levadura, hongos, plantas, artrópodos incluyendo insectos y arácnidos, peces, o mamíferos incluyendo seres humanos, que se sospecha que contiene o contiene potencialmente por lo menos un ácido nucleico diana de interés y contiene la secuencia de control. La muestra de prueba puede tratarse previamente antes de su utilización en los métodos de la presente invención, por ejemplo, preparando plasma o suero a partir de sangre, rompiendo células, preparando líquidos a partir de materiales sólidos, diluyendo fluidos viscosos, filtrando líquidos, destilando líquidos, concentrando líquidos, inactivando componentes que interfieren, añadiendo reactivos, purificando ácidos nucleicos, y similares.
El término “recipiente de reacción” comprende, pero sin limitarse a, tubos o los pocillos de placas tales como micropocillos, pocillos profundos u otros tipos de placas de múltiples pocillos, en los que tiene lugar la reacción de amplificación para el análisis de la muestra de prueba. Tales recipientes están fabricados con materiales químicamente inertes, de manera que no interfieran con la reacción analítica que tiene lugar en su interior.
Una “reacción de amplificación” se refiere a cualquier reacción química, incluyendo enzimática, que da como resultado un aumento de copias de una secuencia de ácido nucleico. Un método de amplificación de ácido nucleico es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que conocen bien los expertos, y que se da a conocer, por ejemplo, en la patente US n° 4.683.202. Otras reacciones de amplificación comprenden, entre otras, la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la reacción en cadena de la polimerasa-ligasa (PLCR), Gap-LCR, reacción de cadena de reparación, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), amplificación por círculo rodante (RCA) y amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP).
El término “activos de amplificación” se refiere a componentes químicos o bioquímicos que permiten la amplificación de ácidos nucleicos. Tales reactivos comprenden, pero no se limitan a, un agente para polimerización (tal como una enzima ADN polimerasa o transcriptasa inversa), tampones, mononucleótidos tales como nucleósidos trifosfato, oligonucleótidos, por ejemplo, cebadores, sales y sus disoluciones respectivas, sondas de detección, colorantes fluorescentes, y más. La composición de los reactivos de amplificación puede determinarse de manera apropiada por expertos en la materia dependiendo de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos utilizada.
Los términos “ácido nucleico” o “secuencia de ácido nucleico” o “secuencia de nucleótidos” se refieren a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido (respectivamente, ADN o ARN) en forma o bien monocatenaria o bien bicatenaria, incluyendo asimismo ADNc. A menos que se limite de otro modo, los ácidos nucleicos pueden englobar análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de manera idéntica a o de manera similar a los nucleótidos que se producen de manera natural.
Los términos “análogo de nucleótido correspondiente” y “nucleótido correspondiente” pretenden indicar que la nucleobase en el análogo de nucleótido y la del nucleótido son idénticas. Por ejemplo, cuando un nucleótido contiene adenina como su nucleobase, entonces el análogo de nucleótido correspondiente asimismo contiene adenina.
Una secuencia que es “complemento” de o es “complementaria” a una secuencia de nucleótidos específica significa una secuencia que puede realizar emparejamiento de bases con la secuencia de nucleótidos específica según las reglas de complementariedad convencionales de Watson-Crick. Específicamente, las bases de purina realizarán emparejamiento de bases con bases de pirimidina para formar una combinación de guanina emparejada con citosina (G:C) y adenina emparejada con timina (A:T) en el caso del ADN o adenina emparejada con uracilo (A:U) en el caso del ARN.
El término “oligonucleótido” se refiere a una molécula compuesta por dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, tales como cebadores, sondas, fragmentos de ácido nucleico que van a detectarse, y controles de ácido nucleico. Los oligonucleótidos pueden prepararse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo por ejemplo, clonación y restricción de secuencias adecuadas y síntesis química directa, tal como la química de fosforamidita convencional y bien conocida. En el contexto de la presente invención, los oligonucleótidos pueden modificarse químicamente, es decir, el cebador y/o la sonda pueden comprender uno o más compuestos nucleotídicos o no nucleotídicos modificados.
El término “cebador” se utiliza en la presente memoria tal como conoce el experto y se refiere a oligonucleótidos naturales o sintéticos que pueden actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador complementario a una cadena de ácido nucleico, es decir en presencia de cuatro nucleósidos trifosfato diferentes y un agente para la polimerización (tal como una enzima ADN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada.
El término “sonda” se refiere a un oligonucleótido natural o sintético que puede hibridarse en condiciones adecuadas con un producto de amplificación de un ácido nucleico con el fin de detectar ese producto de amplificación. Para este fin, las sondas normalmente portan marcadores (por ejemplo, un fluoróforo y/o un extintor (“quencher”) de fluorescencia). Las sondas marcadas incluyen, entre otros, sonda de baliza molecular, sondas TaqMan®, sondas Scorpion, sondas MGB TaqMan® y otras conocidas por los expertos. Se entiende bien que el término sonda engloba asimismo oligonucleótidos no marcados utilizados, por ejemplo, en asociación con agentes de intercalación en sistemas de detección basados en análisis de fusión, tales como fusión de alta resolución (HRM).
El término “marcador” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere en general a un resto molecular que hace que un ácido nucleico sea distinguible. Por ejemplo, los marcadores incluyen fluoróforos y extintores.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “fluoróforo” se refiere en general a un resto molecular que emite luz cuando se excita mediante luz de otra longitud de onda. Los fluoróforos ejemplificativos incluyen, pero no se limitan a colorantes de fluoresceína tales como 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 6-carboxifluoresceína (6-FAM), hexaclorofluoresceína (HEX), tetraclorofluoresceína (TET™) y 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (JOE); colorantes de rodamina tales como rodamina, rodamina B, rodamina 6G, tetrametilrodamina (TAMRA™) e isotiocianato de rodamina; colorantes de cianina tales como Cy3™, Cy3.5™, Cy5™, Cy5.5™ y Cy7™; colorantes LightCycler® (LC) tales como LC-amarillo 555, LC-rojo 610, LC-rojo 640, LC-rojo 670 y LC-rojo 705; y colorantes Alexa Fluor® tales como Alexa 488, Alexa 546 y Alexa 647.
El término “extintor” se refiere en general a un resto molecular que puede disminuir eficazmente la intensidad de la fluorescencia emitida por un fluoróforo. Un extintor puede ser un fluoróforo o una estructura molecular que no emite luz visible, tal como Dabcyl (ácido N-[4-(4-dimetilamino)fenilazo]benzoico), un Black Hole Quencher® que extingue en todo el espectro visible, un extintor IRDye® QC-1, un extintor QXL®, un extintor Iowa black® FQ que extingue en la parte verde-amarilla del espectro, o un extintor Iowa black® RQ que extingue en la parte naranjaroja del espectro.
La presente invención proporciona oligonucleótidos, kits y métodos nuevos que proporcionan un sistema de control interno universal para evaluar la integridad de la muestra y la ausencia de inhibidores que podría afectar potencialmente a la detección y cuantificación de dianas en ensayos moleculares en muestras obtenidas a partir de una amplia variedad de organismos eucariotas, incluyendo hongos, plantas, artrópodos, peces y mamíferos.
Se llevó a cabo el diseño de un par de cebadores universales y una sonda debido a la necesidad de un control interno universal que permita la detección del patógeno de plantas Candidatus Phytoplasma mali en diferentes organismos huésped. Basándose en el análisis in silico, los presentes inventores han identificado una secuencia (SEC ID N°: 5) del gen de ARNr 28S que está altamente conservada en diferentes especies de insectos, así como en otros organismos eucariotas.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un par de cebadores que consiste en un primer cebador que comprende, preferentemente que consiste esencialmente en, más preferentemente que consiste en SEC ID N°: 1 y un segundo cebador que comprende, preferentemente que consiste esencialmente en, más preferentemente que consiste en SEC ID N°: 2.
Lo más preferentemente, los dos cebadores comprenden, o consisten esencialmente en, o consisten en las secuencias de nucleótidos de SEC ID N°: 1 y SEC ID N°:2 respectivamente.
El producto de amplificación generado por cebadores que comprenden, preferentemente que consisten esencialmente en, más preferentemente que consisten en SEC ID N°: 1 y 2 respectivamente, está altamente conservado en muchos organismos eucariotas, tales como hongos, plantas, artrópodos, peces y mamíferos. Este es un requisito esencial para un diseño de sonda eficaz.
La presente invención asimismo se refiere a una sonda que consiste en SEC ID N°: 3 o un complemento de la misma.
Para diseñar una sonda con características de PCR ideales, tales como sensibilidad y especificidad, uno o más nucleótidos en la sonda pueden reemplazarse por análogo de nucleótido correspondientes. Pueden utilizarse análogos de nucleótidos diferentes para lograr las propiedades deseadas de emparejamiento de bases. Estos incluyen, entre otros, ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino, ácido nucleico de glicol (GNA), ácido nucleico de treosa (TNA), ácido xenonucleico (XNA) y ácido nucleico bloqueado (LNA). La utilización de unidades de LNA se conoce, por ejemplo, a partir de la Ref. l0.
En una forma de realización preferida, uno o más nucleótidos de SEC ID N°: 3 están reemplazados por análogo de nucleótido correspondientes que son unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA).
En una forma de realización más preferida, cada uno de los nucleótidos en la posición 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y 12 de SEC ID N°: 3 está reemplazado por una unidad de LNA correspondiente (SEC ID N°: 4).
Lo más preferentemente, la sonda comprende, o consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEC ID N°: 3 o SEC ID N°: 4. Sin embargo, se aprecia que los complementos de las sondas mencionadas anteriormente son adecuados de manera similar para su utilización en la presente invención. En otra forma de realización preferida, la sonda está marcada. En particular, la sonda puede marcarse con uno o más marcadores, tales como fluoróforos y/o extintores. En una forma de realización preferida, la sonda está marcada tanto con un fluoróforo como con un extintor.
Los fluoróforos pueden seleccionarse de entre el grupo que consiste en colorantes de fluoresceína, tales como 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 6-carboxifluoresceína (6-FAm ), hexaclorofluoresceína (HEX), tetraclorofluoresceína (TET™) y 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (JOE); colorantes de rodamina tales como rodamina, rodamina B, rodamina 6G, tetrametil-rodamina (TAMRA™) e isotiocinato de rodamina; colorantes de cianina tales como Cy3™, Cy3.5™, Cy5™, Cy5.5™y Cy7™; colorantes LightCycler® (LC) tales como LC-amarillo 555, LC-rojo 610, LC-rojo 640, LC-rojo 670 y LC-rojo 705; y colorantes Alexa Fluor® tales como Alexa 488, Alexa 546 y Alexa 647. Los extintores pueden seleccionarse de entre el grupo que consiste en un fluoróforo y una estructura molecular que no emite luz visible, tal como Dabcyl (ácido N-[4-(4-dimetilamino)fenilazo]benzoico), un extintor Black Hole Quencher®, un extintor IRDye® QC-1, un extintor QXL®, un extintor Iowa black® FQ, y un extintor Iowa black® RQ. En una forma de realización más preferida, la sonda está marcada con un fluoróforo que es 5'-hexaclorofluoresceína (5'-HEX) y un extintor que es 3'-Dabcyl (3'-DAB).
En la forma de realización más preferida, la sonda consiste en SEC ID N°: 4 y está marcada con 5'-HEX y 3'-DAB. Se entenderá que los cebadores que comprenden, o que consisten esencialmente en, o que consisten en cualquiera de las secuencias de SEC ID N°: 1-2, así como las sondas que comprenden, o que consisten esencialmente en, o que consisten en cualquiera de las secuencias de SEC ID N°: 3-4, asimismo engloban oligonucleótidos que comprenden, o que consisten esencialmente en, o que consisten en un homólogo de cualquiera de las SEC ID N°: 1-4. Los homólogos son ácidos nucleicos que presentan por lo menos una alteración en la secuencia que no destruye la capacidad de los cebadores y las sondas para hibridarse con un tramo de la secuencia altamente conservada del gen de ARNr 28S (SEC ID N°: 5). Por lo tanto, la secuencia de cualquiera de SEC ID N°: 1-4 puede alterarse, por ejemplo, mediante la inserción, adición, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos.
Habitualmente, los homólogos tendrán una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de ácido nucleico por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% con una secuencia de ácido nucleico expuesta en cualquiera de SEC ID N°: 1-4. La identidad con respecto a tales secuencias se define en la presente memoria como el porcentaje de nucleótidos en la secuencia candidata que son idénticos con los polinucleótidos conocidos después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje de identidad máximo. No se interpretará que las deleciones, extensiones o inserciones terminales (5' o 3') o internas en la secuencia de nucleótidos afectan a la identidad.
La presente invención asimismo se refiere a un conjunto de cebador/sonda que consiste en el par de cebadores y la sonda según cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente.
La presente invención asimismo se refiere a una composición que comprende el par de cebadores y opcionalmente la sonda según cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente.
Según otro aspecto, la invención asimismo proporciona un kit que comprende:
(a) el par de cebadores según la invención; y
(b) opcionalmente la sonda según cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente.
En una forma de realización preferida, el kit comprende el conjunto de cebador/sonda que consiste en el par de cebadores según la invención y la sonda según cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente. Más preferentemente, el conjunto de cebador/sonda consiste en:
un cebador de SEC ID N°:1;
un cebador de SEC ID N°: 2; y
una sonda de SEC ID N°: 4 marcada con 5'-HEX y 3'-DAB.
Según otro aspecto, la presente invención asimismo se refiere a un método controlado internamente de amplificación de ácidos nucleicos en una muestra de prueba, en el que la muestra de prueba comprende una secuencia de control que comprende SEC ID N°: 5 y el método comprende:
(a) formar una mezcla poniendo en contacto la muestra de prueba con el par de cebadores de la invención;
(b) someter la mezcla formada en (a) a una amplificación de ácido nucleico en condiciones para generar un producto de amplificación de la secuencia de control; y
(c) detectar la presencia y/o cuantificar la cantidad de la secuencia de control.
La presente invención asimismo se refiere a un método controlado internamente de amplificación de ácidos nucleicos en una muestra de prueba, en el que la muestra de prueba comprende una secuencia de control que comprende SEC ID N°: 5 y comprende potencialmente una o más secuencias diana y el método comprende:
(a) formar una mezcla poniendo en contacto la muestra con el par de cebadores según la invención;
(b) formar una o más mezclas poniendo en contacto la muestra de prueba con por lo menos un par de cebadores específicos para la una o más secuencias diana;
(c) someter la una o más mezclas formadas en (a) y (b) a una amplificación de ácido nucleico en condiciones para generar productos de amplificación de la secuencia de control y de la una o más secuencias diana; y
(d) detectar la presencia y/o cuantificar la cantidad de la secuencia de control.
En una forma de realización preferida de los métodos anteriores, la mezcla de la etapa (a) comprende además la sonda según la invención, formando la sonda un híbrido con el producto de amplificación de la secuencia de control; y se detecta el híbrido formado entre la sonda y el producto de amplificación de la secuencia de control, mediante lo cual se detecta la presencia de la secuencia de control y/o se cuantifica la cantidad de la secuencia de control.
En otra forma de realización preferida de los métodos anteriores según la invención, la mezcla de la etapa (a) comprende además un agente de intercalación de ácido nucleico. El agente de intercalación se une al producto de amplificación de la secuencia de control y se detecta el producto de amplificación de la secuencia de control unido al agente de intercalación.
El agente de intercalación de ácido nucleico puede seleccionarse, entre otros, de entre el grupo que consiste en bromuro de etidio, yoduro de propidio, Sybr® Green, PicoGreen®, EvaGreen®, YO-PRO® y Yo Yo ®.
Aún en otra forma de realización de los métodos anteriores según la invención, la mezcla de la etapa (a) comprende además un agente de intercalación de ácido nucleico y una sonda. El agente de intercalación se une al híbrido formado entre la sonda y el producto de amplificación de la secuencia de control, mediante lo cual se detecta la presencia de la secuencia de control mediante el análisis de fusión, particularmente mediante fusión de alta resolución (HRM).
En algunas formas de realización de los métodos que utiliza un agente de intercalación, se detecta la presencia de la secuencia de control. En algunas otras formas de realización, se detecta la secuencia de control y se cuantifica su cantidad.
Los métodos de la invención en los que se logra detección utilizando agentes de intercalación y análisis de fusión permiten una detección rentable de secuencias de dianas múltiples y del control universal en un solo recipiente de reacción (un solo tubo), así como en múltiples recipientes de reacción (en paralelo). El formato de ensayo más adecuado (un solo tubo o múltiples tubos) depende del número y de la naturaleza de las secuencias diana de interés. En todos los formatos de ensayo, el control universal y la una o más secuencias diana se amplifican simultáneamente.
“Simultáneamente”, tal como se utiliza en la presente memoria, significa que dos o más reacciones, tales como la amplificación de un primer y un segundo o más ácidos nucleicos, se realizan al mismo tiempo y en las mismas condiciones físicas.
Por lo tanto, en una forma de realización de los métodos de la presente invención, se realiza la amplificación simultánea de por lo menos los ácidos nucleicos diana primero y segundo en un recipiente. En otra forma de realización del método, se realiza la amplificación simultánea con por lo menos un ácido nucleico en un recipiente y por lo menos un segundo ácido nucleico en un segundo recipiente, al mismo tiempo y en las mismas condiciones físicas, particularmente con respecto a la temperatura y el tiempo de incubación, y en el que el ácido nucleico de control interno mencionado anteriormente está presente en cada uno de dichos recipientes.
Los métodos según la invención asimismo pueden utilizarse para proporcionar un control interno para ensayos de detección indirecta de ARN en los que la secuencia diana es un ARN, utilizando ensayos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos por el experto.
Los métodos según la invención pueden utilizarse convenientemente para proporcionar un control interno para ensayos para detectar y/o cuantificar por lo menos un ácido nucleico diana en una muestra de prueba obtenida a partir de una amplia variedad de organismos eucariotas diferentes, tales como hongos, plantas, artrópodos (incluyendo insectos y arácnidos), peces y mamíferos (incluyendo seres humanos). Por ejemplo, la muestra de prueba puede obtenerse a partir de cualquiera de las especies en la lista no limitativa de especies sometidas a prueba proporcionadas en la tabla 1 a continuación. En una forma de realización preferida, la muestra de prueba se obtiene a partir de plantas o artrópodos. En otra forma de realización preferida, se sospecha que la muestra de prueba contiene o contiene potencialmente por lo menos una secuencia de ácido nucleico diana que es una secuencia de ácido nucleico del patógeno de plantas Candidatus Phytoplasma mali.
A continuación se describe adicionalmente la invención haciendo referencia al siguiente ejemplo no limitativo.
Ejemplo
Para la detección del fragmento 28S conservado que presenta SEC ID N°: 5, se extrajo ADN de los artrópodos, peces y mamíferos enumerados en la tabla 1 a continuación, de insectos completos o de 100 mg de tejido (peces y mamíferos) utilizando el DNeasy Blood and Tissue Kit. (Qiagen), mientras que el ADN de las plantas y los hongos enumerados en la tabla 1 a continuación se extrajo de 100 mg de tejido de plantas y hongos (hojas, raíces o cuerpos fructíferos) utilizando el DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), según las instrucciones del fabricante.
Se aplicaron las siguientes condiciones de PCR para la amplificación del fragmento 28S que presenta SEC ID N°: 5 en un volumen de reacción total de 10 |iL, utilizando 2 |iL de ADN molde, 5 |iL de 2x iQ™ Multiplex Powermix (Biorad), 400 nM de cada cebador (cebador directo de 28S, 5'-CTACTATCTAGCGAAACC-3', SEC ID N°: 1; cebador inverso de 28S, 5'-AYTAGAGTCAAGCTCAAC-3', SEC ID N°: 2) y 200 nM de la sonda (sonda de 28S, 5'-AAA+G+A+AG+A+C+C+C+T-3' donde “+” indica que la base posterior es un nucleótido bloqueado (LNA), SEC ID N°: 4) marcado con 5'-HEX y 3'-DAB. Los cebadores y la sonda se sintetizaron de manera personalizada utilizando la química de síntesis de oligonucleótidos convencional. Todos los análisis de PCR se realizaron en un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX384 Touch (Biorad) aplicando las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95°C durante 3 minutos, 35 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 1 minuto.
Los resultados del experimento, expresados en lo que se refiere al ciclo de cuantificación (Cq), es decir, el ciclo de umbral (Ct ), los valores para la amplificación de 28S (definida como el número de ciclo en el que la señal fluorescente atraviesa la línea del umbral y puede detectarse), se resumen en la tabla 1 a continuación y muestran que el fragmento 28S que presenta SEC ID N°: 5 se detectó en todas las especies sometidas a prueba.
A la inversa, cuando se utilizó ADN de Escherichia coli en un experimento diseñado de manera similar para someter a prueba la amplificación del fragmento 28S que presenta SEC ID N°: 5 en un organismo procariota modelo, el conjunto de cebador/sonda de la presente invención no permitió la amplificación y detección de un amplicón del molde de ADN de Escherichia coli.
Tabla 1
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En la práctica se ha encontrado que los oligonucleótidos y métodos según la invención logran completamente la finalidad y los objetivos previstos, puesto que proporcionan una solución rentable y fiable para verificar la integridad de la muestra y la ausencia de inhibidores en las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos realizadas en muestras obtenidas de una amplia variedad de organismos eucariotas.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Par de cebadores que consiste en un primer cebador que comprende SEC ID N°: 1 y un segundo cebador que comprende SEC ID N°: 2.
2. Sonda que consiste en SEC ID N°: 3 o complemento de la misma, en la que cada uno de los nucleótidos en la posición 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y 12 de SEC ID N°: 3 está reemplazado por una unidad de ácido nucleico bloqueado (LNA) correspondiente (SEC ID N°: 4).
3. Sonda según la reivindicación 2, en la que la sonda está marcada, preferentemente en la que la sonda está marcada tanto con un fluoróforo como con un extintor, más preferentemente en la que el fluoróforo es 5'-hexaclorofluoresceína (5'-HEX) y el extintor es 3'-Dabcyl (3'-DAB).
4. Composición que comprende el par de cebadores según la reivindicación 1 y opcionalmente una sonda que comprende SEC ID N°: 3 o un complemento de la misma.
5. Composición según la reivindicación 4, en la que la sonda presenta uno o más nucleótidos de SEC ID N°: 3 reemplazados por un análogo de nucleótido correspondiente que es una unidad de ácido nucleico bloqueado (LNA), preferentemente en la que cada uno de los nucleótidos en la posición 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y 12 de SEC ID N°: 3 está reemplazado por una unidad de LNA correspondiente (SEC ID N°: 4).
6. Composición según la reivindicación 4 o 5, en la que la sonda está marcada, preferentemente en la que la sonda está marcada tanto con un fluoróforo como con un extintor, más preferentemente en la que el fluoróforo es 5'-hexaclorofluoresceína (5'-HEX) y el extintor es 3'-Dabcyl (3'-DAB).
7. Kit que comprende:
(a) el par de cebadores según la reivindicación 1; y
(b) opcionalmente una sonda que comprende SEC ID N°: 3 o un complemento de la misma.
8. Kit según la reivindicación 7, en el que la sonda presenta uno o más nucleótidos de SEC ID N°: 3 reemplazados por un análogo de nucleótido correspondiente que es una unidad de ácido nucleico bloqueado (LNA), preferentemente en el que cada uno de los nucleótidos en la posición 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y 12 de SEC ID N°: 3 está reemplazado por una unidad de LNA correspondiente (SEC ID N°: 4).
9. Kit según la reivindicación 7 u 8, en el que la sonda está marcada, preferentemente en el que la sonda está marcada tanto con un fluoróforo como con un extintor, más preferentemente en el que el fluoróforo es 5'-hexaclorofluoresceína (5'-HEX) y el extintor es 3'-Dabcyl (3'-DAB).
10. Método controlado internamente de amplificación de ácidos nucleicos en una muestra de prueba, en el que la muestra de prueba comprende una secuencia de control que comprende SEC ID N°: 5 y en el que el método comprende:
(a) formar una mezcla poniendo en contacto la muestra de prueba con el par de cebadores según la reivindicación 1;
(b) someter la mezcla formada en (a) a una amplificación de ácido nucleico bajo unas condiciones para generar un producto de amplificación de la secuencia de control; y
(c) detectar la presencia y/o cuantificar la cantidad de la secuencia de control.
11. Método controlado internamente de amplificación de ácidos nucleicos en una muestra de prueba, en el que la muestra de prueba comprende una secuencia de control que comprende SEC ID N°: 5 y comprende potencialmente una o más secuencias diana y en el que el método comprende:
(a) formar una mezcla poniendo en contacto la muestra con el par de cebadores según la reivindicación 1; (b) formar una o más mezclas poniendo en contacto la muestra de prueba con por lo menos un par de cebadores específico para las una o más secuencias diana;
(c) someter las mezclas formadas en (a) y (b) a una amplificación de ácido nucleico bajo unas condiciones para generar los productos de amplificación de la secuencia de control y de las una o más secuencias diana; y (d) detectar la presencia y/o cuantificar la cantidad de la secuencia de control.
12. Método según la reivindicación 10 u 11 en el que:
la mezcla formada en (a) comprende además una sonda que comprende SEC ID N°: 3 o un complemento de la misma, formando la sonda un híbrido con el producto de amplificación de la secuencia de control; y
se detecta el híbrido formado entre la sonda y el producto de amplificación de la secuencia de control, por lo que se detecta la presencia de la secuencia de control y/o se cuantifica la cantidad de la secuencia de control.
13. Método según la reivindicación 12, en el que la sonda presenta uno o más nucleótidos de SEC ID N°: 3 reemplazados por un análogo de nucleótido correspondiente que es una unidad de ácido nucleico bloqueado (LNA), preferentemente en el que cada uno de los nucleótidos en la posición 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y 12 de SEC ID N°: 3 está reemplazado por una unidad de LNA correspondiente (SEC ID N°: 4).
14. Método según la reivindicación 12 o 13, en el que la sonda está marcada, preferentemente en el que la sonda está marcada tanto con un fluoróforo como con un extintor, más preferentemente en el que el fluoróforo es 5'-hexaclorofluoresceína (5'-HEX) y el extintor es 3'-Dabcyl (3'-DAB).
15. Método según la reivindicación 10 u 11 en el que:
la mezcla formada en (a) comprende además un agente de intercalación de ácido nucleico, uniéndose el agente de intercalación al producto de amplificación de la secuencia de control; y
se detecta el producto de amplificación de la secuencia de control unido al agente de intercalación, por lo que se detecta la presencia de la secuencia de control y/o se cuantifica la cantidad de la secuencia de control.
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