WO2013064789A1 - Procédé de classification d'échantillons de tissus fixes et inclus en paraffine - Google Patents
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Definitions
- level of expression control is meant a level of expression previously determined or evaluated on a set of good quality control samples, also called reference samples.
- Reference genes means ubiquitous or “housekeeping” genes, the expression of which does not substantially vary, in particular as a function of the age, gender, or condition of the patient , or tissue (healthy or tumoral for example). Tissue samples
- the reference genes may vary depending on the type of tissue to be tested.
- the number of reference genes is greater than or equal to 3, preferably greater than or equal to 4.3, and the said n reference genes comprise at least three genes among the lactin genes, preferably actin genes.
- HPRT gene coding for hypoxanthine phosphoribosyltransferase
- TBP gene encoding the TATA-BOX binding protein
- TFRC gene encoding the transferrin receptor
- the preliminary step is the extraction of the RNA and its purification, by any known method, for example by the method of Chomcynsky and Sacchi, 1987, Anal. Biochem 162: 156-159, or by improved methods (see for example WO01 / 46402). Extraction involves the removal of paraffin, for example using xylenes as solvents or by incubation at 65-75 ° C in lysis buffer. The extraction of the RNA can then be carried out by precipitation or by chromatography for example. Control steps, for example by gel electrophoresis, may be included.
- hydrolysis probes or TaqMan® which utilize the exonuclease activity of Taq polymerase, are used to hydrolyze a fluorescent probe attached to its target. It is also possible to use "molecular beacons" (Stratagene) which are hairpin hybridization probes, the loop of the probe being complementary to the targeted sequence.
- RNA integrity was assessed by Agilent 2100 Bioanalyzer electrophoresis (Agilent Technologies) compared to standard reference RNA as previously described (Cronin et al, supra).
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Abstract
L'invention concerne un procédé de classification d'un échantillon de tissu fixé et inclus en paraffine, dans lequel on détermine si ledit échantillon à tester, désigné échantillon « j », est d'une qualité suffisante pour une étude de l'expression génique par quantification de son ARN, ledit procédé comprenant la comparaison du niveau d'expression de n gènes de référence dans ledit échantillon « j » par rapport au niveau d'expression contrôle desdits n gènes de référence.
Description
Procédé de classification d'échantillons de tissus fixés et inclus en paraffine
L'invention concerne un procédé de classification d'un échantillon de tissu fixé et inclus en paraffine, avant une évaluation transcriptionnelle de biomarqueurs.
Arrière-plan technologique de l'invention :
La détermination des niveaux d'expression des gènes dans des tissus est primordiale pour diagnostiquer de manière exacte et personnalisée les pathologies, et est de plus en plus utilisée pour établir la stratégie de traitement. Des méthodes pharmacogénomiques permettent en outre d'identifier les patients susceptibles de répondre, ou non, à un traitement.
La source de tissu standard pour une évaluation transcriptionnelle de biomarqueurs est traditionnellement du tissu frais congelé. Pourtant, les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (ou tissus FFPE pour « formalin-fixed, paraffin-embedded ») représentent de loin la source la plus abondante de tumeurs, et sont même les seules matières disponibles en ce qui concerne les tumeurs primaires comme les mélanomes (Ravo et al, 2008, Lab Invest, 88 :430-440).
L'utilisation de tissus archivés serait aussi précieuse pour mener des études rétrospectives. Des analyses transcriptionnelles sur ces tissus fixés et inclus en paraffine sont possibles et ont été menées pour valider des signatures de biomarqueurs associés à des caractéristiques cliniques, des taux de survie, ou des réponses thérapeutiques (Coudry et al, 2007, J. Mol. Diag, 9 :70-79 ; Cronin et al, 2004, Am. J. Pathol, 164 :35-42). Malheureusement, ces analyses ne sont pas menées en routine du fait de la détérioration de l'ARN dans ces tissus stockés. En effet, la faible qualité des ARN extraits réduit la fiabilité des quantifications de biomarqueurs (Mittempergher et al, 201 1 , PLoS One 6 :e17163).
Il existe donc un besoin en une méthode permettant de sélectionner les échantillons de tissu fixé et inclus en paraffine, qui puissent être utilisés pour des analyses transcriptionnelles. Résumé de l'invention :
L' invention répond à ce besoin en fournissant un procédé de classification d'un échantillon de tissu fixé et inclus en paraffine, dans lequel on détermine si ledit échantillon à tester, désigné échantillon « j », est d'une qualité suffisante pour une étude de l'expression génique par quantification de son ARN, ledit procédé comprenant la comparaison du niveau d'expression de n gènes de référence dans ledit échantillon « j » par rapport au niveau d'expression contrôle desdits n gènes de référence.
La combinaison des gènes de référence et le nombre n entier dépendent du type de tissu à qualifier.
Les échantillons présentant un niveau d'expression des gènes de référence comparable au niveau d'expression contrôle, à savoir au niveau d'expression de ces mêmes gènes dans les échantillons contrôles, sont sélectionnés, et sont notamment utiles pour réaliser des études transcriptionnelles fiables.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé comprend :
la détermination du niveau d'expression desdits n gènes de référence dans l'échantillon « j » à tester, et
la détermination de la déviation
la valeur de la déviation indiquant si l'échantillon « j » est de qualité suffisante pour une étude de l'expression génique ou une analyse transcriptomique.
De préférence l'échantillon de tissu est un échantillon de tissu tumoral, de préférence un mélanome, avec de préférence encore n supérieur ou égal à 4, et lesdits n gènes de référence comprennent au moins les gènes de \'actine β, HPRT, TBP et TRFC. Légende des figures :
La Figure 1 représente un « Boxplot » de niveaux d'ARNm moyens de 19 gènes d'intérêt et 10 gènes de référence ou «de ménage» (« housekeeping ») dans l'ensemble des échantillons congelés et FFPE (fixés au formol et inclus en paraffine) analysés.
La Figure 2A montre une étude de la corrélation entre les échantillons congelés et les échantillons FFPE au niveau de la médiane de chaque gène, évaluée chez tous les patients. Le coefficient de corrélation de Pearson ajusté était de 0,88 (p<0,0001 ).
La Figure 2B montre des exemples de patients avec des corrélations « bonnes », ou « mauvaises » entre les échantillons congelés et les échantillons FFPE.
La Figure 3 montre des corrélations corrigées échantillons FFPE/échantillons congelés pour chaque individu. Le test de corrélation teste l'hypothèse « la corrélation n'est pas valable ». Le seuil représente le seuil de rejet (alpha=5%) selon le test multiple de Bonferroni. Les individus à répartir sont ceux qui se trouvent en dessous du seuil.
Description détaillée de l'invention :
Les inventeurs proposent maintenant une méthode simple et peu coûteuse pour identifier et sélectionner les échantillons fixés inclus en paraffine exploitables ayant une qualité suffisante pour permettre une quantification de biomarqueurs au niveau de leurs ARN.
Définitions
Par « échantillon de tissu fixé et inclus en paraffine », on entend toute biopsie de tissu, de préférence humain ou animal, fixé par toute méthode connue de l'homme du métier, et inclus en paraffine. Une méthode classique de fixation inclut la fixation au formol ou à l'éthanol. Les échantillons comprennent généralement au moins 10, au moins 100, ou au moins 1000, au moins 5000, molécules d'ARN différentes.
Par échantillon de « qualité suffisante », ou de « bonne qualité », on entend que l'ARN de l'échantillon n'est pas substantiellement dégradé ou reste quantifiable, permettant une étude de l'expression génique ou du transcriptome, ou apte à servir dans une réaction d'amplification, notamment par RT-PCR quantitative. A l'inverse, un échantillon de « qualité insuffisante » ou de « mauvaise qualité » est un échantillon dont l'ARN est trop dégradé pour être apte à une étude de l'expression génique ou du transcriptome, ou est inapte à servir dans une réaction d'amplification, notamment par RT-PCR quantitative.
Par « niveau d'expression contrôle », on entend un niveau d'expression déterminé au préalable ou évaluée sur un jeu d'échantillons contrôles de bonne qualité, appelés également échantillons de référence.
Par « jeu d'échantillons contrôles de bonne qualité », on entend des échantillons de tissu congelés ou fixés inclus en paraffine présentant des niveaux d'expression des ARNs des gènes de référence corrélés avec les niveaux d'expression des ARNs extraits des tissus congelés. Les échantillons contrôles sont du même type que les échantillons à tester (c'est- à-dire qu'ils proviennent par exemple du même type d'organe, présentant une même pathologie).
Par « gènes de références », on entend des gènes ubiquitaires ou « de ménage » (« housekeeping »), dont l'expression ne varie substantiellement pas, notamment en fonction de l'âge, du sexe, ou de l'état du patient, ou du tissu (sain ou tumoral par exemple).
Echantillons de tissu
L'échantillon de tissu à tester peut être n'importe quel échantillon de tissu dont on souhaite déterminer le niveau d'expression génique ou réaliser une analyse transcriptomique.
Il peut s'agir d'un tissu sain, ou d'un tissu d'un patient atteint d'une pathologie particulière, ou dans un état particulier. Dans un mode de réalisation préféré, il s'agit d'un échantillon de tissu tumoral.
En particulier, il peut s'agir d'un échantillon de mélanome.
Il peut également s'agir d'un échantillon d'un tissu tumoral de sein, de poumon ou de rein, par exemple, ou encore un échantillon de tissu tumoral de cancer du colon, de la prostate, gastrique, du pancréas, de col de l'utérus, des ovaires, du foie, de la vessie, de la thyroïde, du cerveau, ou une hémopathie maligne (l'échantillon de tissu étant alors une biopsie de moelle).
Les gènes de référence :
Les gènes de référence peuvent varier en fonction du type de tissu à tester.
Le nombre de gènes de références est d'au moins 2, de préférence au moins 3, de préférence encore au moins 4.
Dans un mode de réalisation particulier, le nombre de gènes de références est supérieur ou égal à 3, de préférence supérieur ou égal à 4, 3, et lesdits n gènes de référence comprennent au moins trois gènes parmi les gènes de lactine, de préférence actine β, HPRT (gène codant pour l'hypoxanthine phosphoribosyltransférase), TBP (gène codant pour la protéine de liaison à la TATA-BOX) et TFRC (gène codant pour le récepteur à la transferrine). Ceci est particulièrement adapté dans le cas où l'échantillon de tissu est un échantillon de mélanome. Il peut s'agir d'un mélanome primaire, ou avec métastases cutanées, ou encore avec des métastases au niveau des ganglions lymphatiques. De préférence, le procédé est mis en œuvre en déterminant les niveaux d'expression de ces 4 gènes seulement.
Quantification des transcrits des gènes de référence, et classification de l'échantillon :
Le procédé de l'invention vise à classifier un échantillon de tissu sans même avoir à analyser l'expression d'autres gènes que les seuls gènes de référence. Au terme du procédé, l'échantillon est classé comme de « bonne qualité » ou de « mauvaise qualité ». Si l'échantillon est classé comme de « bonne qualité », alors il peut servir à une analyse de l'expression de tout autre gène d'intérêt, ou à une analyse du transcriptome.
Le procédé de l'invention comprend la détermination du niveau d'expression génique, à savoir la quantification des ARNm, des gènes de référence.
Les fragments d'ARNm amplifiés n'ont pas besoin d'être de pleine longueur : des amplicons d'une taille comprise entre environ 70 et environ 100 paires de bases suffisent.
Cette quantification peut être menée par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier par RT-PCR quantitative (qRT-PCR).
L'étape préalable est l'extraction de l'ARN et sa purification, par toute méthode connue, par exemple par la méthode de Chomcynsky et Sacchi, 1987, Anal. Biochem 162 :156-159, ou par des méthodes améliorées (cf par exemple WO01/46402). L'extraction implique l'élimination de la paraffine, par exemple en utilisant des xylènes comme solvants ou par incubation à 65-75°C dans un tampon de lyse. L'extraction de l'ARN peut être ensuite réalisée par précipitation ou par chromatographie par exemple. Des étapes de contrôles, par exemple par électrophorèse sur gel, peuvent être incluses.
La RT-PCR quantitative peut utiliser différentes techniques d'agents intercalants ou sondes fluorescentes. Une technique usuelle met en œuvre un fluorophore spécifique de l'ADN, du type SyBr Green, et on mesure alors l'augmentation de fluorescence à la fin de chaque étape d'élongation. Selon une autre technique usuelle, on peut aussi utiliser une sonde interne fluorescente spécifique du produit amplifié. Plusieurs types de formats de sondes sont disponibles. Par exemple, on peut utiliser Le Light Cycler de Roche, avec deux sondes d'hybridation, qui hybrident « tête-bêche » sur leur séquence cible, l'une des deux sondes portant à son extrémité une fluorescéine. Dans un mode de réalisation préférée, on utilise des sondes d'hydrolyse ou TaqMan®, qui utilisent l'activté 5'exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser une sonde fluorescente fixée sur sa cible. On peut par ailleurs utiliser des « molecular beacons » (Stratagene) qui sont des sondes d'hybridation en épingle à cheveux, la boucle de la sonde étant complémentaire de la séquence ciblée.
Le procédé de l'invention permet de sélectionner les échantillons dans lesquels l'intégrité des ARN permet une analyse transcriptionnelle. Les échantillons sont sélectionnés pour exprimer des gènes de référence à un niveau comparable comparable au niveau d'expression de ces mêmes gènes dans les échantillons contrôles.
Les inventeurs ont ainsi mis au point une méthode statistique capable d'identifier les échantillons dont les niveaux d'expression sont corrélés avec ceux d'échantillons congelés, en quantifiant les transcrits de seulement quelques gènes de référence.
Cette approche s'est basée sur le postulat que le niveau d'expression de ces gènes de référence devrait être globalement stable entre les échantillons de bonne qualité.
Une déviation de l'expression par rapport aux échantillons contrôles de bonne qualité peut être calculée comme suit :
où n est le nombre de gènes de références, μί et σί sont respectivement la moyenne et la déviation standard pour l'expression d'un gène « i » de référence établies au préalable ou évaluées sur ledit jeu d'échantillons contrôles de bonne qualité ; xij est le niveau d'expression dudit gène i évaluée dans l'échantillon « j »,
la valeur de la déviation indiquant si l'échantillon « j » est de qualité suffisante pour une étude de l'expression génique.
Plus précisément, la significativité de la déviation peut être testée par un test classique de Chi au carré, avec n degrés de liberté :
Si la valeur p est non-significative, on conclut qu'il n'y a pas de déviation, et l'échantillon est classé comme « de bonne qualité ».
Si la valeur p est significative, on conclut qu'il y a une déviation substantielle, et l'échantillon est classé comme « de mauvaise qualité ».
Dans un mode de réalisation particulier, le test peut être réalisé sans faire appel à de nouveaux échantillons contrôles de bonne qualité, les valeurs mu et sigma de référence ayant été au préalable établies. Ainsi, les valeurs μ et σ de référence, représentant les moyennes/écarts-types de chaque gène de référence sont
μ = 8.15 et σ = 1 .86 pour le gène de l'actine β ;
μ = -15.06 et σ= 2.03 pour le gène de HPRT ;
μ = -2.55 et σ= 1 .41 pour le gène TBP
μ = -14.34 et σ = 1 .91 pour le gène TRFC.
Les échantillons classés comme « de bonne qualité » peuvent servir à une analyse de l'expression de tout autre gène d'intérêt, ou à une analyse du transcriptome. Lors de ces analyses subséquentes, de préférence par RT-PCR, un contrôle interne peut être encore souhaitable, mais une normalisation avec d'autres gènes de référence n'est plus nécessaire.
Les figures et exemples illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemples
Exemple 1 : Sélection de tissues FFPE de mélanome pour une analyse transcriptionnelle
MATERIELS ET METHODES
Patients
Les inventeurs ont étudié des échantillons de tissus recueillis de 2000 à 2005, congelés ou fixés par le formol et inclus dans la paraffine (FFPE), pour les mêmes sections de tumeur, issues de 25 patients avec des mélanomes primaires (7 patients), des mélanomes avec métastases cutanées (4 patients), et des mélanomes avec des métastases au niveau des noyaux lymphatiques (14 patients).
Echantillon, extraction de l'ARN, et transcription inverse
Tous les tissus de mélanomes frais congelés ont été divisés, la moitié est maintenue sous forme congelés, et l'autre sous forme fixés dans le formol et inclus en paraffine. Plus de 90% du tissu est composé de cellules tumorales. Cinq sections de 10μηι d'échantillons congelés et dix sections de 10μηι de blocs FFPE ont subi une extraction d'ARN.
L'ARN total des 25 paires de blocs FFPE archivés et des tumeurs congelées apparentées a été extrait avec la méthode de Chomcynsky et Sacchi et al, supra, pour les échantillons congelés et en utilisant le kit d'extraction d'ARN FFPE de Qiagen, après le traitement au xylène pour les échantillons FFPE, selon le protocole du fabricant. Chaque échantillon a été traité avec de la DNase I, pour éliminer toute trace d'ADN génomique. La transcription inverse a été menée avec un Super-Script II (Invitrogen).
Le rendement total en ARN a été déterminé en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop
ND-1000 (NanoDrop Tech, Wilmington, DE). L'intégrité de l'ARN a été évaluée par électrophorèse Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies) comparée à l'ARN de référence standard comme décrit précédemment (Cronin et al, supra).
Les sondes et amorces pour RT-PCR ont été conçues, testées, et validées. Les sondes fluorogéniques ont été doublement marquées, avec 5-FAM comme rapporteur, et TAMRA comme quencheur.
Les séquences des amorces utilisées sont indiquées ci-après :
Pour le gène de l'actine β :
Amorce sens CTGGCACCCAGCACAATG (SEQ ID NO :1 )
Amorce anti-sens GCCGATCCACACGGAGTACT (SEQ ID NO :2)
Pour le gène de HPRT1 :
Amorce sens TTATGGACAGGACTGAACGTCTTG (SEQ ID NO :3)
Amorce anti-sens G CACACAGAGG G CTACAATGTG (SEQ ID NO :4)
Pour le gène de TBP:
Amorce sens CACgAACCACggCACTgATT (SEQ ID NO :5)
Amorce anti-sens TTTTCTTgCTgCCAgTCTggAC (SEQ ID NO :6)
Pour le gène de TFRC:
Amorce sens CTTTGCCAGTTGGAGTGCTG (SEQ ID NO :7)
Amorce anti-sens ACGAAAGGTATCCCTCTAGCCAT (SEQ ID NO :8)
Quantification muliparamétrique des transcrits
Biomarqueurs d'invasion et d'angiogénèse/lymphangiogénèse : VEGF (formes solubles VEGF121 et VEGF165), VEGF récepteurs (VEGFR1 et VEGFR2à, PDGF-A, PDGF-B, récepteurs PDGF (PDGFR-alpha et beta), les serine protéases (uPA PAI-1 ) et métalloprotéinase de matrice (MMP1 , 2, 9, et 14), inhibiteurs MMP (TIMP1 , 2), inducteur de protéase EMMPRIN, facteurs de transcription régulateurs de l'angiogénèse/lymphangiogénèse HIF1 a, PROX-1.
Transcrits de référence étudiés : HPRT, TBP, microglobine B2, GAPDH, ACTBP, GUS, PPIA, TFRC, 18S, 5S, RPLP1 , RPLPO, RPL5, RPL19, actine-alpha, et actine-beta. Normalisation
Pour comparer les profils d'expression entre les échantillons, une normalisation basée sur les 15 gènes de référence a été menée pour corriger les différences venant de la variabilité de la qualité de l'ARN et de la quantité totale d'ARN dans chaque essai. La quantification relative de chaque transcrit s'est inspirée des travaux de Cronin et al, supra.
Analyse Statistique
Les analyses statistiques ont été menées avec le logiciel R1 (version 2.13.1 ). Les valeurs p sont considérées significatives sous la barre des 5% après ajustement de Bonferroni pour des tests multiples. RESULTATS
Comparaison des profils d'expression des ARN de tissus de mélanomes FFPE et à l'état congelé :
L'expression de 25 gènes impliqués dans l'angiogénèse, la lymphangiogénèse et l'invasion tumorale a été analysée dans des mélanomes malins. Pour cela, l'ARN total a été préparé pour 25 paires apparentées d'échantillons congelés et FFPE. Une inspection de l'ARN par électrophorèse par le Bioanalyzer d'Agilent a montré un profil d'ARN non dégradé typique dans les échantillons congelés, tandis que les extraits de FFPE présentaient un ARN dégradé d'environ 150 et 50 pb, selon les échantillons.
L'hétérogénéité dans la qualité et la quantité d'ARN extrait est connue pour être principalement causée par les variations dans la quantité de tissu, le type de fixation et le retard de la fixation après l'intervention chirurgicale. En outre, l'efficacité de la transcription inverse et de la PCR elle-même peut représenter un paramètre de variabilité supplémentaire. Aussi, les mesures de qRT-PCR des gènes d'intérêt ont été normalisées vis-à-vis d'un jeu validé de gènes «de ménage» (housekeeping). Ce jeu validé a été déterminé en comparant 15 gènes «de ménage» (housekeeping) différents entre tissus
congelés et tissus FFPE, 10 gènes ayant été retenus comme gènes de référence, pour leur expression stable (moyennes proches entre échantillons congelés et FFPE).
La Figure 1 représente un « Boxplot » de niveaux d'ARNm moyens de 19 gènes d'intérêt et 10 gènes «de ménage» (« housekeeping ») dans tous les échantillons congelés et FFPE, montrant des moyennes comparables pour la plupart des gènes, mais pas tous. Ainsi par exemple, VEGFR-2 et PDGFR-beta montrent des moyennes étroitement apparentées, alors que MMP1 et PDGFR-alpha étaient non-apparentés.
La Figure 2A montre une étude de la corrélation entre les échantillons congelés et les échantillons FFPE au niveau de la médiane de chaque gène, évaluée chez tous les patients, atteignant un coefficient de corrélation de Pearson « très bon », de 0,88 (p<0,0001 ).
La Figure 2B montre des exemples de patients avec des corrélations « bonnes », ou « mauvaises » entre les échantillons congelés et les échantillons FFPE (coefficients de corrélation de Pearson de 0,87 et 0,48 avec p<0,0001 et p=0,007 respectivement).
Sur les 25 échantillons analysés, 21 ont été classés « bons », 1 « moyen », et 3 « mauvais » (cf Figure 3).
Identification des échantillons avec une bonne corrélation de l'expression génique entre état congelé et FFPE :
Les inventeurs ont ensuite mis au point une méthode statistique capable d'identifier les échantillons de mélanome avec une bonne corrélation congelé/FFPE, afin d'écarter les échantillons dont les niveaux d'expression ne sont pas corrélés, sur la base des données de paraffine pour des gènes de référence seulement.
Cette approche s'est basée sur le postulat que le niveau d'expression de ces gènes de référence devrait être globalement stable entre les échantillons bons. Les inventeurs ont alors défini un profil moyen d'expression dit « Mean-Good-Expression-Profile » MGEP) comme la moyenne des profils d'expression des échantillons « bons » et les échantillons déviant significativement du MGEP comme des profils mauvais.
La déviation par rapport au MGEP a été calculée comme suit :
La déviation a été mesurée et testée par un test classique de Chi au carré, avec n degrés de liberté :
Si la valeur p est non-significative, on conclut qu'il n'y a pas de déviation par rapport au MGEP, et l'échantillon est classé « bon ».
Si la valeur p est significative, on conclut qu'il y a une déviation substantielle par rapport au MGEP, et l'échantillon est classé « mauvais».
Parmi les 21 bons échantillons identifiés, 14 ont été utilisés comme échantillons « contrôles de bonne qualité », pour construire le MGEP (la sélection étant basée sur une valeur p de corrélation inférieure à 10"3). Les 7 bons échantillons restant et les 3 mauvais échantillons ont été utilisés pour validation.
Le jeu de gènes de référence avec le coefficient moyen minimum de variation sur les échantillons contrôles de qualité a été choisi : il incluait les 4 gènes actine, HPRT, TBP, TRFC. Avec ce jeu de gènes de référence, l'approche basée sur le profil MGEP a parfaitement discriminé les 21 échantillons des 3 mauvais (100% de prédiction).
Claims
1 . Procédé de classification d'un échantillon de tissu fixé et inclus en paraffine, dans lequel on détermine si ledit échantillon à tester, désigné échantillon « j », est d'une qualité suffisante pour une étude de l'expression génique par quantification de son ARN, ledit procédé comprenant la comparaison du niveau d'expression de n gènes de référence dans ledit échantillon « j » par rapport au niveau d'expression contrôle desdits n gènes de référence.
Procédé selon la revendication 1 , dans lequel n est supérieur ou égal à
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel n est supérieur ou égal à
4.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, ledit procédé comprenant :
la détermination du niveau d'expression desdits n gènes de référence dans l'échantillon « j » à tester, et
la détermination de la déviation
où n est le nombre de gènes de références, μ, et σ, sont respectivement la moyenne et la déviation standard pour l'expression d'un gène « i » de référence établies au préalable ou évaluées sur un jeu d'échantillons contrôles de bonne qualité ; x,j est le niveau d'expression dudit gène i évaluée dans l'échantillon « j »,
la valeur de la déviation indiquant si l'échantillon « j » est de qualité suffisante pour une étude de l'expression génique ou une analyse transcriptomique.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel l'échantillon de tissu est un échantillon de tissu tumoral.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'échantillon de tissu est un échantillon de mélanome.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel n est supérieur ou égal à 4, et lesdits n gènes de référence comprennent au moins les gènes de Yactine, HPRT, TBP et TRFC.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel n=4 et lesdits gènes de références sont les gènes de Yactine β, HPRT, TBP et TRFC.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel les valeurs μ et σ pour chacun desdits gènes de référence sont
μ = 8.15 et σ = 1 .86 pour le gène de l'actine β ;
μ = -15.06 et σ= 2.03 pour le gène de HPRT ;
μ = -2.55 et σ= 1 .41 pour le gène TBP
μ = -14.34 et σ = 1 .91 pour le gène TRFC.
10. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'échantillon de tissu est un échantillon de tissu tumoral de sein, de rein ou de poumon, ou de cancer du colon, de la prostate, gastrique, du pancréas, de col de l'utérus, des ovaires, du foie, de la vessie, de la thyroïde, du cerveau, ou encore une hémopathie maligne.
1 1 . Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel l'expression des gènes de référence est quantifiée par RT-PCR quantitative.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 1 1 , dans lequel l'échantillon de tissu fixé et inclus en paraffine est un échantillon de tissu fixé par du formol.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel l'expression des gènes de référence est quantifiée par amplification de fragments de 70 à 100pb.
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