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WO2019132640A1 - Méthode pour la détermination du seuil de positivité de la surexpression de la protéine her2 dans le cancer de sein et d'autres cancers. - Google Patents

Méthode pour la détermination du seuil de positivité de la surexpression de la protéine her2 dans le cancer de sein et d'autres cancers. Download PDF

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WO2019132640A1
WO2019132640A1 PCT/MA2018/050021 MA2018050021W WO2019132640A1 WO 2019132640 A1 WO2019132640 A1 WO 2019132640A1 MA 2018050021 W MA2018050021 W MA 2018050021W WO 2019132640 A1 WO2019132640 A1 WO 2019132640A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
threshold
her2
gene
pcr
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/MA2018/050021
Other languages
English (en)
Inventor
Hassan AIT BENHASSOU
Abdeladim MOUMEN
Hicham ELHADI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Moroccan Foundation For Advanced Science Innovation And Research (mascir)
Original Assignee
Moroccan Foundation For Advanced Science Innovation And Research (mascir)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Moroccan Foundation For Advanced Science Innovation And Research (mascir) filed Critical Moroccan Foundation For Advanced Science Innovation And Research (mascir)
Publication of WO2019132640A1 publication Critical patent/WO2019132640A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • a method for determining the positivity threshold of overexpression of HER2 protein in breast cancer and other cancers is a method for determining the positivity threshold of overexpression of HER2 protein in breast cancer and other cancers.
  • the present invention provides an easy and convenient method for determining the threshold of positivity (threshold) for the quantification of overexpressed HER2 gene expression in the case of breast, stomach and other types of cancer. cancers.
  • the specific detection and quantification of HER2 gene transcripts and reference genes are done by the real-time reverse transcription-PCR (RTqPCR) method in multiplexed or simplex format. A sample will be considered positive if its HER2 expression level is higher than the positivity threshold calculated by this method.
  • RTqPCR real-time reverse transcription-PCR
  • the HER2 human epidermal growth factor receptor 2 gene is located on chromosome 17 and encodes the HER2 growth factor receptor, a transmembrane protein with tyrosine kinase activity and being overexpressed in 30% of breast cancers.
  • the overexpression of HER2 induced by gene amplification and its activation induces the proliferation of tumor cells, the stimulation of angiogenesis and metastasis.
  • Herceptin ® is a humanized monoclonal antibody that specifically recognizes the extramembrane domain of the HER2 protein (ECD) and thereby inhibits the tumor activity of HER2.
  • ECD extramembrane domain of the HER2 protein
  • Several randomized clinical trials have demonstrated a benefit in overall survival of Herceptin ® in combination with chemotherapy in patients with HER2-overexpressing breast cancer (Romond EH; N Engl J Med. 2005; 353: 1673- 684. Gianni L; Lancet Oncol; 2011; 12: 236-244]
  • Other clinical trials have shown the same efficacy of Herceptin ® in the case of HER2-overexpressing stomach or esophagus cancer (Bang YJ: Lancet, 2010; 16; 376 (9749): 1302).
  • the current standard method for relatively quantifying HER2 expression of a tumor is immunohistochemistry (IHC).
  • IHC immunohistochemistry
  • the goal of IHC is to demonstrate HER2 protein overexpression, which is characterized by a HER2 (3+) score, which indicates Herceptin ® treatment (Genentech, San Francisco, Calif.).
  • Herceptin is an antibody that detects HER2 protein in the cell membrane.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • qPCR real-time PCR
  • qPCR uses in parallel a control gene 'reference gene' expressed ubiquitously in all the cells of the body and which will allow the exact quantification of the target gene.
  • a control gene whose expression is not stable between the different samples analyzed affects the validity of the results.
  • the quantification of the expression of the HER2 gene by the present kit is done by the relative quantification technique (AACt) which consists in comparing the expression of the target gene with respect to a control gene in the sample to be analyzed. and the normalization of this difference with respect to the expression of the same genes in a calibration sample (which is in our case an RNA resulting from the MCF7 line and whose expression of the HER2 gene is considered as reference).
  • AACt relative quantification technique
  • the present invention consists of a mathematical determination facilitating the calculation of the positivity threshold in each experiment and when changing the batch of MCF7 RNA used as a calibrator for the relative quantification of HER2 gene transcripts in breast cancer and other cancers. by the real-time PCR method.
  • the present invention relates to a method for the determination of the threshold of positivity (threshold) for the quantification of HER2 gene expression overexpressed in the case of breast cancer, stomach cancer as well as in other types of cancers.
  • the specific detection and quantification of HER2 gene transcripts and reference genes is done through the real-time reverse transcription-PCR (RTqPCR) method in multiplex or simplex format. A sample will be considered positive if its HER2 expression level is higher than the positivity threshold calculated by this method.
  • RTqPCR real-time reverse transcription-PCR
  • the method of determining the positivity threshold consists of a mathematical equation allowing to establish a new threshold for each experiment and for each batch of calibration RNA, based on the result of the quantification of the HER2 gene and the reference genes. in the calibration sample (mRNA extracted from MCF7 cells).
  • the present invention improves on the other previous methods mentioned above and allows a) High accuracy of results by using a positivity threshold adapted to each experiment.
  • the determination of the threshold of positivity (threshold) for the quantification of the expression of the HER2 gene is done in different stages
  • the word 'HER2' described in the present invention corresponds to the HER2 gene
  • the word 'gene' refers to a nucleic acid sequence in the DNA molecule that occupies a specific region in a chromosome and permits the encoding of instructions for RNA synthesis.
  • the word gene amplification as used in this invention refers to one or more methods capable of copying a nucleic acid thereby allowing an increase in the number of copies of a target nucleic acid sequence.
  • the amplified sequence can be a deoxyribonucleic acid (DNA) or a ribonucleic acid (RNA).
  • the term 'reverse transcription' as used in this invention refers to a method for the synthesis of complementary DNA (cDNA) from an RNA molecule.
  • the cDNA can be used in the PCR method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a sample of DNA or cDNA is added in a solution in the presence of 2 oligonucleotide primers (forward and reverse); unattached nucleotides (eg dNTPs); and the DNA polymerase enzyme (preferably heat-resistant Taq polymerase) which catalyzes the formation of DNA from the 2 primers and dNTPs.
  • the solution is heated to 94-96 ° C to denature the DNA molecule and form 2 single strands of DNA.
  • the primers will then bind specifically to the single-stranded DNA thereby allowing the DNA polymerase to catalyze the attachment of the dNTPs to the primers.
  • 'RT-PCR' reverse transcriptase-PCR
  • the word 'RT-PCR' (reverse transcriptase-PCR) of the present invention represents a PCR method whose starting material is not directly DNA but an RNA translated into cDNA after reverse transcription.
  • qPCR quantitative PCR or real time RT-PCR
  • the term "qPCR” refers to a PCR method allowing the study of the PCR reaction products during the first DNA amplification steps.
  • the PCR products are detected by means of probes labeled at their 5 'ends by a transmitting fluorochrome (reporter), and at their 3' ends by a fluorescent or non-fluorescent quencher, which inhibits the emission of the reporter. when they are nearby.
  • the signal intensity of the fluorescence measured during the amplification reaction is proportional to the number of newly formed products (amplicons).
  • the measurement in DNA or cDNA is in logarithm.
  • qPCR is carried out using TaqMan probes with an amplification analyzer such as ABI PRISM 7500HT 'sequence detection system' which is a screening system that can detect and quantify nucleic acids.
  • the amount of HER2 and reference gene selected from the genes cited above is calculated by the software integrated in the ABI PRISM 7500HT system using the AACT method or standard curve.
  • the reporter of the probe can be FAM, JOE, YAKYE YELLOW (YY) and the quencher BBQ, BHQ1, MGB1 or TAMRA.
  • control gene or "reference gene” represents a gene generally similarly expressed by all cells of an organism.
  • control genes are RPL30, RPL37A and MRPL19.
  • simplex word of the present invention refers to a test that does not run concurrently with other tests.
  • simplex qPCR reflects the detection and quantitation of a single gene in a reaction tube.
  • the multiplex word of the present invention refers to a test that runs concurrently with at least one other test.
  • the multiplexed qPCR reflects the detection and quantification of at least 2 genes in the same reaction tube.
  • the 2 HER2 genes and reference gene selected from the genes cited above are simultaneously detected by qPCR.
  • test sample refers to a sample of cells kept in paraffin or other preservation methods, fresh cell, primary cells, cell lines or other tissues and where cells used for quantification of transcripts HER2 gene.
  • the test sample of the present invention may be of human origin or other animal expressing the HER2 gene and reference gene selected from the genes cited above which may be amplified using the primers and probes of the present invention.
  • the efficiency of the qPCR reaction refers to the percentage of DNA molecules that undergo replication at each PCR cycle. An efficiency of 100% reflects a replication of all the target DNA molecules present in the reaction medium after each PCR cycle.
  • the word "threshold” or quantization threshold corresponds to a quantity below which the sample is considered negative and above which the sample is considered positive for the expression of the HER2 gene.
  • Example 1 Correlation of ACT of MCF7 and the threshold of positivity ( Figure 1).
  • the DDOG method is well established in the literature as a method of calculating the amount of expression of a given gene in one sample by providing another considered normalizer or calibration (Litvak).
  • the quantification of HER2 transcripts in a sample is measured by supplying the calibration sample which is here the MCF7 breast cancer line whose HER2 gene expression level is normal. To do this, the CT value of the target gene HER2 and the reference gene PRL 30 is measured in the tested sample and the line MCF7 and the method DDOT is calculated as follows.
  • RNA extraction of cellular RNA is done with RNeasy mini kit from Qiagen according to the supplier's recommendations (Qiagen Inc).
  • the quality of the test is related to the quality of the initial RNA.
  • the degree of purification as well as the quality of the RNA are analyzed either on agarose gel electrophoresis or on Bioanalyzer (Agilant).
  • the cDNA is obtained from total RNA extracted from test sample.
  • the cDNA synthesis is performed using the Thermocycler (Applied Biosystems) using the "RNA to cDNA Reverse Transcription" kit as recommended by the Applied Biosystems supplier. In short, in a test tube and in a final volume of 20mI, mix:
  • RNA 1-2 ⁇ g RNA (maximum 14.2 total mI RNA) 0.8 mI of dNTP Mix (100 mM)
  • RPL30 12.5 mI of the TaqMan ® Universal Fast PCR Master Mix (2x) containing all the elements necessary for carrying out the polymerization reaction, namely the DNA polymerase enzyme, the dNTPs and the reaction buffer with optimal amounts.
  • reaction medium in a 96-well plate placed in the thermal cycler making it possible to carry out the PCR reaction
  • detection of the fluorescence released during the reaction and the quantification of the amplified material (ABI PRISM 7500HT type thermocylator is an example of this. ).
  • the temperature cycles used for the reaction are:
  • reaction medium in a 96-well plate placed in the thermal cycler making it possible to carry out the PCR reaction
  • detection of the fluorescence released during the reaction and the quantification of the amplified material (ABI PRISM 7500HT type thermocylator is an example of this. ).
  • the temperature cycles used for the reaction are: 95 ° C for 20s (1 cycle)
  • the CT values for the HER gene and the RPL30 gene are determined from the amplification curves obtained after the PCR.
  • the ACT ( M CF7) CT H ER2 - CT RPL 3o is calculated.
  • an ACT value ( M CF7) CT H ER2 - CT RPL 3o is calculated.
  • a positivity threshold is calculated using the ROC method for each batch of MCF7.
  • Example 2 Correlation of the positivity threshold calculated experimentally that calculated from the mathematical equation.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode facile et pratique pour la détermination du seuil de positivité (threshold) pour la quantification de l'expression du gène HER2 surexprimé dans le cas du cancer du sein, de l'estomac ainsi que dans d'autres types de cancers. La détection spécifique et la quantification des transcrits du gène HER2 et les gènes de référence se font par la méthode de transcription inverse-PCR en temps réel (RTqPCR) en format multiplexe ou simplexe. Un échantillon sera considéré comme positif si son taux d'expression du gène HER2 est supérieur au seuil de positivité calculé par la présente méthode.

Description

Méthode pour la détermination du seuil de positivité de la surexpression de la protéine HER2 dans le cancer de sein et d'autres cancers.
Domaine technique :
La présente invention concerne une méthode facile et pratique pour la détermination du seuil de positivité (threshold) pour la quantification de l'expression du gène HER2 surexprimé dans le cas du cancer du sein, de l'estomac ainsi que dans d'autres types de cancers. La détection spécifique et la quantification des transcrits du gène HER2 et les gènes de référence se font par la méthode de transcription inverse-PCR en temps réel (RTqPCR) en format multiplexe ou simplexe. Un échantillon sera considéré comme positif si son taux d'expression du gène HER2 est supérieur au seuil de positivité calculé par la présente méthode.
Description de l'art antécédent Le cancer du sein représente la première cause de mortalité par cancer chez la femme. Il est aussi le cancer le plus répandu des cancers de la femme. Au Maroc, le cancer du sein frappe plus de 15 000 femmes chaque année (registre des cancers Région Casablanca, 2004, édition 2007).
Le gène HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) est localisé sur le chromosome 17 et code pour le récepteur de facteur de croissance HER2, une protéine transmembranaire ayant une activité tyrosine kinase et étant surexprimée dans 30% des cancers de sein. La surexpression de HER2 induit par une amplification génique_et son activation induit la prolifération des cellules tumorales, la stimulation de l'angiogénèse et la métastase.
L'Herceptin® est un anticorps monoclonal humanisé qui reconnaît spécifiquement le domaine extra-membranaire de la protéine HER2 (ECD) et inhibe ainsi l'activité tumorale de cette dernière. Plusieurs essaies cliniques randomisés ont démontré un bénéfice en survie globale de l'Herceptin® en combinaison avec la chimiothérapie chez les patientes atteints par un du cancer de sein surexprimant HER2 (Romond EH ; N Engl J Med. 2005; 353:1673- 684. Gianni L ; Lancet Oncol ; 2011;12:236-244] D'autre essaies cliniques ont montré la même efficacité de l'Herceptin® dans le cas du cancer de l'estomac ou de l'œsophage surexprimant HER2 (Bang YJ : Lancet. 2010; 16;376(9749):1302).
La méthode standard actuelle permettant de quantifier relativement l'expression de HER2 d'une tumeur est l'immunohistochimie (IHC). Le but de l'IHC est de mettre en évidence une surexpression de la protéine HER2, qui se caractérise par un score HER2 (3+), lequel indique un traitement par l'Herceptin® (Genentech, San Francisco, Calif.). L'Herceptin est un anticorps qui détecte la protéine HER2 au niveau de la membrane cellulaire. La technique de FISH (fluorescence in situ hybridization) est utilisée dans les situations de scores intermédiaires (Her2 (2+)). La FISH permet de visualiser directement l'amplification du gène HER2 en utilisant des sondes ADN fluorescentes. Cependant, l'IHC et la FISH manquent surtout d'essais quantitatifs et qualitatifs, elles sont moins spécifiques, utilisent des anticorps ou des hybridations complexes, prennent énormément de temps (plusieurs jours), le score final nécessite plusieurs examinateurs, en plus la méthode FISH est très coûteuse.
C'est pour les raisons citées ci-dessus qu'il est préférable d'identifier des méthodes de quantification de HER2 avec plus de sensibilité et de fiabilité, de meilleures reproductibilités quantitatives et qualitatives et avec un coût plus bas.
Actuellement, la PCR en temps réel (qPCR) qui consiste en une amplification du gène cible a été appliquée avec succès en diagnostics cliniques (Hughes TP ; N Engl J Med. 2003;349:1423-1432) en raison de sa haute spécificité, de sa rapidité, de sa fiabilité et de son faible coût.
Pour la quantification d'un gène cible, la qPCR utilise en parallèle un gène contrôle 'reference gene'' exprimé de manière ubiquitaire dans toutes les cellules du corps et qui permettra la quantification exacte du gène cible. Cependant, l'utilisation d'un gène contrôle dont l'expression n'est pas stable entre les différents échantillons analysés affecte la validité des résultats.
La quantification de l'expression du gène HER2 par le présent kit se fait par la technique de la quantification relative (AACt) qui consiste en la comparaison de l'expression du gène cible par rapport à un gène control dans l'échantillon à analyser, et la normalisation de cette différence par rapport a l'expression des mêmes gènes dans un échantillon de calibration (qui est dans notre cas un ARN issu de la lignée MCF7 et dont l'expression du gène HER2 est considérée comme reference) .
Malgré la grande stabilité de l'expression du gène cible (HER2) et des gènes de références dans l'ARN calibration issu des lignées MCF7, une fluctuation entre différents expériences n'est pas toujours évitable, impliquant une nouvelle détermination du seuil de positivité (threshold ) dont la valeur est liée à la différence entre l'expression du gène cible et les gènes de références dans l'échantillon de calibration. La présente invention consiste en une détermination mathématique facilitant le calcule du seuil de positivité dans chaque expérience et lors du changement du lot d'ARN MCF7 utilisé comme calibrant pour la quantification relative des transcrits du gène HER2 dans le cancer de sein et d'autres cancers par la méthode de PCR en temps réel.
Expose de l'invention.
La présente invention concerne une méthode pour la détermination du seuil de positivité (threshold) pour la quantification de l'expression du gène HER2 surexprimé dans le cas du cancer du sein, de l'estomac ainsi que dans d'autres types de cancers. La détection spécifique et la quantification des transcrits du gène HER2 et les gènes de référence se fait par l'intermédiaire de la méthode de transcription inverse-PCR en temps réel (RTqPCR) en format multiplexe ou simplexe. Un échantillon sera considéré comme positif si son taux d'expression du gène HER2 est supérieur au seuil de positivité calculé par la présente méthode.
La méthode de détermination du seuil de positivité consiste en une équation mathématique permettant d'établir un nouveau seuil pour chaque expérience et pour chaque lot d'ARN de calibration, en se basant sur le résultat de la quantification du gène HER2 et des gènes de référence dans l'échantillon de calibration (ARNm extrait des cellules MCF7).
En effet les méthodes antérieurs se basaient sur la courbe ROC pour la détermination de seuil de positivé, ce qui implique un nouveau calcul a chaque fois ou il ya une variation dans l'expression du gène HER2 et des gènes de référence dans l'échantillon de calibration. Ce calcul ne pouvant être effectué au niveau de l'utilisateur final du test de quantification des transcrits d'HER2 et nécessite à chaque fois l'implication du fabriquant afin d'intégrer cette modification dans cette procédure de calcul du seuil par la méthode du ROC
La présente invention améliore les autres méthodes antérieures citées ci-dessus et permet a) Une grande précision des résultats grâce à l'utilisation d'un seuil de positivité adapté a chaque expérience b) Un calcul facile du seuil de positivité qui peut être réalisé directement par l'utilisateur final du test de quantification des transcrits d'HER2 et ne nécessitant pas l'intervention du fabriquant c) Un calcul rapide du seuil de positivité par une équation mathématique au lieu de méthode ROC
Selon la présente invention, la détermination du seuil de positivité (threshold) pour la quantification de l'expression du gène HER2 se fait en différentes étapes
a) extraction des ARNs totaux des échantillons paraffinés ou frais et production de cDNA par transcription inverse b) quantification des transcrits par qPCR c) calcul du seuil de positivité par l'équation mathématique à partir des résultats de la ACT de l'échantillon de calibration (MCF7) d) quantification des transcrits du gène HER2 dans un échantillon donné par rapport à l'échantillon de calibration par la méthode de AACT e) comparaison de la quantité déterminée au seuil de positivité prédéterminé et identification de patients candidats pour un traitement à l'Herceptin®.
Le mot 'HER2' décrit dans la présente invention correspond au gène HER2
Le mot 'gène' réfère à une séquence d'acide nucléique dans la molécule d'ADN qui occupe une région précise dans un chromosome et permet de coder les instructions pour la synthèse de l'ARN.
Le mot amplification de gène comme utilisé dans cette invention réfère à une ou plusieurs méthodes capables de copier un acide nucléique permettant ainsi une augmentation du nombre de copie d'une séquence d'acide nucléique cible. La séquence amplifiée peut être un acide désoxyribonucléique (ADN) ou un acide ribonucléique (ARN). Le mot 'transcription inverse' comme utilisé dans cette invention réfère à une méthode permettant la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc) à partir de molécule d'ARN. L'ADNc peut être utilisée dans la méthode PCR.
Le mot 'PCR' (polymerase chain reaction) de la présente invention réfère à une méthode dont un échantillon d'ADN ou ADNc est ajouté dans une solution en présence de 2 oligonucleotides amorces (forward et reverse) ; de nucléotides non attachés (exemple les dNTPs) ; et de l'enzyme ADN polymérase (préférablement la Taq polymérase qui résiste à la chaleur) qui catalyse la formation d'ADN à partir des 2 amorces et dNTPs. La solution est chauffée à 94-96 C° pour dénaturer la molécule d'ADN et former 2 simples brins d'ADN. Les amorces vont ensuite se fixer spécifiquement sur l'ADN simple brin permettant ainsi à l'ADN polymérase de catalyser l'attachement des dNTPs aux amorces.
Le mot 'RT-PCR' (reverse transcriptase-PCR) de la présente invention représente une méthode de PCR dont le produit de départ n'est pas directement un ADN mais un ARN traduit en ADNc après transcription inverse.
Le mot 'qPCR' (quantitative PCR ou real time RT-PCR) cité dans la présente invention réfère à une méthode de PCR permettant l'étude des produits de la réaction PCR durant les premières étapes d'amplification de l'ADN. La détection des produits de PCR se fait grâce à des sondes marquées à leurs extrémités 5' par un fluorochrome émetteur (reporter), et à leurs extrémités 3' par un fluorochrome suppresseur (quencher) fluorescent ou non, qui inhibe l'émission du reporter lorsqu'ils sont à proximité. De ce fait, l'intensité du signal de la fluorescence mesurée au cours de la réaction d'amplification est proportionnelle au nombre de produits nouvellement formés (amplicons). La mesure en ADN ou ADNc se fait en logarithme. Pour déterminer la positivité d'une PCR et/ou quantifier un échantillon par qPCR, on détermine le nombre de cycles à partir duquel le produit PCR est détectable. Le moment d'apparition de ce signal seuil dénommé cycle seuil ou Ct (Cycle Threshold) est dépendant de la quantité de matrice initialement présente dans l'échantillon amplifié. Le Ct calculé est inversement proportionnel au logarithme décimal du nombre de copies initiales. Préférentiellement, dans la présente invention, la qPCR est réalisée en utilisant les sondes TaqMan avec un analyseur d'amplification comme ABI PRISM 7500HT 'sequence détection System' qui est un système de screening qui peut détecter et quantifier des acides nucléiques. La quantité de HER2 et gène de référence choisi parmi les gènes cite ci-dessus est calculée par le logiciel intégré dans le système ABI PRISM 7500HT en utilisant la méthode AACT ou de la courbe standard. Selon une autre caractéristique de la présente invention, le reporteur de la sonde peut être FAM, JOE, YAKYE YELLOW (YY) et le quencher BBQ, BHQ1, MGB1 ou TAMRA.
Le mot 'gène contrôle' ou 'gène de référence' représente un gène exprimé en général da façon similaire par toutes les cellules d'un organisme. Parmi les gènes contrôle, on trouve le RPL30, RPL37A et MRPL19.
Le mot simplexe de la présente invention réfère à un essai qui ne se déroule pas simultanément avec d'autres essais. Dans notre invention, la qPCR en simplex reflète la détection et la quantification d'un seul gène dans un tube de réaction.
Le mot multiplexe de la présente invention réfère à un essai qui se déroule simultanément avec au moins un autre essai. La qPCR en multiplexe reflète la détection et la quantification d'au moins 2 gènes dans un même tube de réaction. Par exemple, dans la présente invention, les 2 gènes HER2 et gène de référence choisi parmi les gènes cite ci-dessus sont détectés simultanément par qPCR.
Le mot 'échantillon test' comme utilisé dans la présente invention réfère à un échantillon de cellules gardé dans le paraffine ou autre méthodes de conservation, cellule fraîche, de cellules primaires, lignées cellulaires ou autre tissus et où des cellules utilisées pour une quantification des transcrits du gène HER2. L'échantillon test de la présente invention peut être d'origine humaine ou autre animal exprimant le gène HER2 et gène de référence choisi parmi les gènes cite ci-dessus qui peuvent être amplifié en utilisant les amorces et sondes de la présente invention.
Le mot efficacité de la réaction de la qPCR réfère au pourcentage des molécules d'ADN subissant une réplication à chaque cycle de PCR. Une efficacité de 100% reflète une réplication de toutes les molécules d'ADN cibles présent dans le milieu réactionnel après chaque cycle de PCR. Le mot «threshold» ou seuil de quantification correspond à une quantité en dessous duquel l'échantillon est considéré négatif et au dessus duquel l'échantillon est considéré positif pour l'expression du gène HER2.
EXPERIENCES
Exemple 1. : Corrélation de la ACT du clibrateur MCF7 et le seuil de positivité (Figure 1).
La méthode DDOG est bien établie dans la littérature comme une méthode de calcule de la quantité de l'expression d'un gène donné dans un échantillon par apport un autre considéré comme normalisateur ou de calibration (Litvak). La quantification des transcrits HER2 dans un échantillon est mesurée par apport à l'échantillon au de calibration qui est ici la lignée du cancer de sein MCF7 dont le taux d'expression du gène HER2 est normal. Pour se faire, la valeur CT du gène cible HER2et du gène de référence PRL 30 est mesurée dans l'échantillon teste et le lignée MCF7 et la méthode DDOT est calculée comme suivant
ACT(échantillon) = CTHER2 — DTRPL30
ACT(MCF7) = CTHER2 - CTRPL30
DD0T— A
Quantité
Figure imgf000008_0001
Pour chaque lot des lignée de cellule de MCF7 utilisée comme moyen de calibration le ACT(MCF7) = CTHER2 - CTRpL3o est calculé comme suivant
1-Extraction de l'ARNm totale cellulaire
L'extraction de l'ARN cellulaire se fait avec RNeasy mini kit de Qiagen suivant les recommandations du fournisseur (Qiagen Inc). La qualité du test est liée à la qualité de l'ARN initiale. De ce fait, le degré de la purification ainsi que la qualité de l'ARN sont analysés soit sur électrophorèse en gel d'agarose ou sur Bioanalyzer (Agilant).
2-Synthèse de l'ADNc par transcription inverse. L'ADNc est obtenue à partir d'ARN total extrait d'échantillon test. La synthèse d'ADNc est réalisée à l'aide du Thermocycleur (Applied Biosystems) en utilisant le kit «RNA to cDNA Reverse Transcription» suivant les recommandations du fournisseur Applied Biosystems. En bref, dans un tube à essai et dans un volume final de 20mI, mélanger :
1-2 pg de l'ARN (maximum 14.2 mI total de l'ARN) 0.8 mI de dNTP Mix (lOOmM)
2mI de 10X RT random primers 2mI de 10X RT Buffer ImI de MultiScribe reverse transcriptase Qsp Nuclease free H20 20mI
Mettre le milieu réactionnel dans un thermocycleur en utilisant les températures suivantes 25°C pour 10min
37°C pour 60 min
37°C pour 60 min 84°C pour 5s
4°C jusqu'à utilisation
3- La réaction de qPCR.
3a. Format simplex.
Il est réalisé dans un volume final de 25mI en mélangeant: 50 à 200ng de l'ADNc issu de la transcription inverse.
300 nM (2,5 mI d'une solution mère de 3mM) de l'amorce « Forward » pour la détection des transcrits du gène HER2 et un autre pour la détection des transcrits du gène RPL30.
300 nM (2,5 mI d'une solution mère de 3mM) de l'amorce « Reverse » pour la détection des transcrits du gène HER2 et un autre pour la détection des transcrits du gène RPL30. 200nM (2,5 mI d'une solution mère de 2mM) de la Sonde TaqMan fluorescente pour la détection des transcrits du gène HER2 et une autre pour la détection des transcrits du gène
RPL30. 12,5 mI du TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2x) contenant tous les éléments nécessaires pour la réalisation de la réaction de polymérisation à savoir l'enzyme ADN polymérase, les dNTPs et le tampon de la réaction avec des quantités optimales.
Mettre le milieu réactionnel dans une plaque 96 puits placée dans le thermocycleur permettant la réalisation de la réaction de PCR, la détection de la fluorescence libérée au cours de la réaction et la quantification du matériel amplifié (thermocyleur de type ABI PRISM 7500HT en est un exemple). Les cycles de température utilisés pour la réaction sont :
95°C pour 20s (1 cycle)
95°C pour ls et 60°C pour 30s (50 cycles) 3b. Format multiplex (duplex).
Il est réalisé dans un volume final de 25mI en mélangeant:
50 à 200ng de l'ADNc issu de la transcription inverse.
300 nM (1,25 mI d'une solution mère de 6mM) de l'amorce « Forward » pour la détection des transcrits du gène HER2 et un autre pour la détection des transcrits du gène RPL30. 300 nM (1,25 mI d'une solution mère de 6mM) de l'amorce « Reverse » pour la détection des transcrits du gène HER2 et un autre pour la détection des transcrits du gène RPL30.
200nM (1,25 mI d'une solution mère de 4mM) de la Sonde TaqMan fluorescente pour la détection des transcrits du gène HER2 et 300nM (1,25 mI d'une solution mère de 6mM) de la Sonde TaqMan fluorescente pour la détection des transcrits du gène RPL30. 12,5 mI du TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2x) contenant tous les éléments nécessaires pour la réalisation de la réaction de polymérisation à savoir l'enzyme ADN polymérase, les dNTPs et le tampon de la réaction avec des quantités optimales.
Mettre le milieu réactionnel dans une plaque 96 puits placée dans le thermocycleur permettant la réalisation de la réaction de PCR, la détection de la fluorescence libérée au cours de la réaction et la quantification du matériel amplifié (thermocyleur de type ABI PRISM 7500HT en est un exemple). Les cycles de température utilisés pour la réaction sont : 95°C pour 20s (1 cycle)
95°C pour ls et 60°C pour BOs (50 cycles)
Les valeurs CT pour le gène HER et le gène RPL30 sont déterminées à partir des courbes d'amplification obtenue après la PCR. Ainsi la ACT(MCF7) = CTHER2 - CTRPL3o est calculé. Pour chaque lot des cellules MCF7 une valeur ACT(MCF7) = CTHER2 - CTRPL3o est calculé. Un seuil de positivité est calculé avec la méthode ROC pour chaque lot de MCF7. Les valeurs ACT(MCF7) = CTHER2 - CT RPL3o sont ensuit représentées en fonction de la valeur du seuil de positivité. Les résultats de représentation sont décrits sur la figure 1.
Exemple 2. : Corrélation du seuil de positivité calculé expérimentalement celle calculé à partir de l'équation mathématique .
Les valeurs seuil de plusieurs lots du de calibration MCF7 ont été mesurées (comme décrit dans l'exemple 1) soit d'une façon expérimental en utilisant la méthode ROC (seuil expérimentale) ou bien en extrapolation a partir de la courbe ACt=F (seuil) décrite en haut (seuil mathématique). Les résultats sont représentés sur le tableau ci-dessous.
Figure imgf000011_0001

Claims

Revendications :
1) Méthode pour la détermination du seuil de la surexpression de la protéine HER2 dans le diagnostic du cancer de sein, de l'estomac et d'autres cancers utilisant la valeur ACT (caiib) de l'échantillon de calibration , la méthode comprend les étapes suivantes : mesure de la valeur ACT(ca|ib) qui correspond à la différence entre la valeur Ct obtenue pour HER2 et celle obtenue pour un gène de référence Ct ACT(MCF7) = CTHER2 - CTGR par la technique PCR.
Représentation linéaire des valeurs ACT(caiib) en fonction du seuil selon la formule : Y = 4.910X - 12.32, ou Y est la valeur de seuil recherchée et X la valeur du ACT(Calib),
la valeur du seuil de la surexpression de la protéine HER2 est déduite de la courbe linéaire.
2) Méthode pour la détermination du seuil de la surexpression de la protéine HER2 selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'échantillon de calibration pourrait être de l'ARN synthétisé in vitro ou bien de l'ARNm extrait d'un échantillon de cellules cancéreuses ou non, exprimant normalement la protéine HER2.
3) Méthode pour la détermination du seuil de la surexpression de la protéine HER2 selon la revendication 1 caractérisée en ce que, les valeurs Ct sont mesurées pour un échantillon d'ARN ou d'ADN donné par la méthode PCR normale ou bien PCR quantitative (qPCR).
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