[go: up one dir, main page]

WO2012036257A1 - 血小板の機能を維持するための組成物 - Google Patents

血小板の機能を維持するための組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2012036257A1
WO2012036257A1 PCT/JP2011/071190 JP2011071190W WO2012036257A1 WO 2012036257 A1 WO2012036257 A1 WO 2012036257A1 JP 2011071190 W JP2011071190 W JP 2011071190W WO 2012036257 A1 WO2012036257 A1 WO 2012036257A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
platelets
group
hydrogen atom
alkyl group
ethyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2011/071190
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
浩之 江藤
椋子 大西
啓光 中内
隆彦 村田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kaken Pharmaceutical Co Ltd
University of Tokyo NUC
Original Assignee
Kaken Pharmaceutical Co Ltd
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to US13/824,325 priority Critical patent/US9034922B2/en
Priority to KR1020137004224A priority patent/KR101836547B1/ko
Priority to JP2012534058A priority patent/JP5876828B2/ja
Priority to RU2013117422/04A priority patent/RU2578607C2/ru
Priority to EP11825255.0A priority patent/EP2617812B1/en
Priority to CN201180044695.8A priority patent/CN103189501B/zh
Priority to AU2011303013A priority patent/AU2011303013B2/en
Priority to CA2811504A priority patent/CA2811504C/en
Priority to SG2013018999A priority patent/SG188545A1/en
Application filed by Kaken Pharmaceutical Co Ltd, University of Tokyo NUC filed Critical Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Publication of WO2012036257A1 publication Critical patent/WO2012036257A1/ja
Priority to IL225199A priority patent/IL225199A0/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A01N1/126—Physiologically active agents, e.g. antioxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4453—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine only substituted in position 1, e.g. propipocaine, diperodon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/26—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/28—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton with sulfone or sulfoxide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/12—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly or doubly bound nitrogen atoms
    • C07D295/135—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly or doubly bound nitrogen atoms with the ring nitrogen atoms and the substituent nitrogen atoms separated by carbocyclic rings or by carbon chains interrupted by carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)

Definitions

  • the present invention relates to a composition for maintaining the function of platelets using an N-hydroxyformamide derivative, a method for preparing platelets, a blood product containing platelets, and a method for maintaining the function of platelets in a blood product. Regarding the method.
  • megakaryocytes are platelet progenitor cells, that is, cells that produce platelets and are known to produce platelets via a propelet structure, and are important in therapeutic applications. . Since platelets are essential for blood coagulation (hemostasis), the demand for leukemia, bone marrow transplantation, anticancer treatment, etc. is extremely high.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2
  • the present inventors add an inhibitor (such as GM6001) that directly inhibits the metalloprotease activity or a p38 MAP kinase inhibitor that indirectly inhibits the activation of the metalloprotease activity such as ADAM17 in a timely manner. It is reported that the function of platelets prepared in vitro can be maintained (Patent Document 3).
  • inhibitors such as GM6001 inhibit not only ADAM17 but also the activities of other metalloproteases (especially MMP9 and MMP14 essential for hematopoietic function), so in the preparation of platelets in vitro using these inhibitors Needed to add these inhibitors at certain times when platelet production was most observed. Since complicated work such as finding the timing in cell culture with poor consistency and reproducibility is required, the method for preparing platelets using these inhibitors is to produce a large amount of functional platelets, especially platelet production. In planting the system, it has not been sufficient yet.
  • Non-selective metalloprotease inhibitors inhibit all metalloprotease activities such as membrane-type and free-type metalloproteases and ADAM, various side effects (for each organ) It is considered that there is a risk that the harmful MMP or ADAM that acts will be adversely affected. In fact, non-selective metalloprotease inhibitors cause serious side effects called musculoskeletal syndrome, and the development of many of these inhibitors has been discontinued (Non-patent Document 3). In addition, it has been suggested that an inhibitor having a hydroxamic acid structure such as GM6001 has mutagenicity (Non-Patent Document 4). Therefore, the platelets obtained by the method using such an inhibitor have not been sufficient in terms of safety.
  • ADAM17 As a method for storing platelets prepared from a living body, there is no effective method other than a method of storing while stirring at 20 ° C. to 24 ° C. Therefore, in order to maintain the function of platelets, ADAM17 It is also considered that it is effective to prepare platelets under such room temperature conditions (20 ° C. to 24 ° C.) even when using the method for suppressing the metalloprotease activity. However, so far, it is possible to differentiate from cord blood or bone marrow cells to megakaryocytes under room temperature conditions, and it is possible to produce platelets from hematopoietic progenitor cells derived from ES cells etc. It has not been verified whether or not.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and its purpose is to specifically inhibit the metalloprotease activity of ADAM17 and maintain the function of platelets by inhibiting GPIb ⁇ shedding. It is to identify the compounds that make it possible. A further object of the present invention is to provide a composition that maintains the function of platelets using the identified compound, to efficiently produce platelets, and to improve the quality maintenance of blood products.
  • the present inventors have found that induction of differentiation from hematopoietic progenitor cells derived from ES cells, iPS cells and the like into megakaryocytes and platelet production from the megakaryocytes are 25 It was found that culture under a room temperature condition of 0 ° C. was not possible and culture conditions around 37 ° C. were preferable. Therefore, the present inventors next searched for a compound capable of specifically suppressing GPIb ⁇ shedding by ADAM17 that occurs in culture at around 37 ° C.
  • an N-hydroxyformamide derivative having a specific structure has a specific inhibitory effect on ADAM17, and when added to a platelet-producing culture system or platelets derived from human peripheral blood, GPIb ⁇ shedding It was found that platelet function was maintained even under temperature conditions around 37 ° C. The present inventors have found that such an action of the identified N-hydroxyformamide derivative is extremely useful for improving the production of platelets efficiently and maintaining the quality of blood products containing platelets. The present invention has been completed.
  • X is a phenylene group
  • Y is a hydrogen atom, or — (CH 2 ) m R 1 ;
  • m is an integer from 0 to 4;
  • R 1 is
  • R 2 is an optionally substituted C1-C6 alkyl group, an optionally substituted aryl group, or a C1-C6 alkoxy group
  • R 3 and R 4 may be each independently a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or R 3 and R 4 together with an adjacent nitrogen atom to form a nitrogen-containing heterocycle
  • R 5 represents a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or a C1-C6 alkylsulfonyl group
  • Z represents a hydrogen atom or a C1-C6 alkyl group.
  • the compound represented by the general formula (I) is N- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (4-diethylaminomethylphenyl) ethyl] -N-hydroxyformamide, or N- ⁇ 4- [2- (4-but- 2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (formylhydroxyamino) ethyl] benzyl ⁇ methanesulfonamide,
  • the composition according to (1) wherein (3)
  • a culture system for inducing differentiation from a cell capable of differentiating into a megakaryocyte into a megakaryocyte and producing platelets from the megakaryocyte is represented by the following general formula (I):
  • X is a phenylene group
  • Y is a hydrogen atom, or — (CH 2 ) m R 1 ;
  • m is an integer from 0 to 4;
  • R 1 is
  • R 2 is an optionally substituted C1-C6 alkyl group, an optionally substituted aryl group, or a C1-C6 alkoxy group
  • R 3 and R 4 may be each independently a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or R 3 and R 4 together with an adjacent nitrogen atom to form a nitrogen-containing heterocycle
  • R 5 represents a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or a C1-C6 alkylsulfonyl group
  • Z represents a hydrogen atom or a C1-C6 alkyl group.
  • the compound represented by the general formula (I) is N- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (4-diethylaminomethylphenyl) ethyl] -N-hydroxyformamide, or N- ⁇ 4- [2- (4-but- 2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (formylhydroxyamino) ethyl] benzyl ⁇ methanesulfonamide,
  • the method according to (4) or (5), wherein the culture temperature in the culture system is 35 to 38 ° C.
  • a culture system that induces differentiation from a cell capable of differentiating into a megakaryocyte into a megakaryocyte and produces platelets from the megakaryocyte is represented by the following general formula (I):
  • X is a phenylene group
  • Y is a hydrogen atom, or — (CH 2 ) m R 1 ;
  • m is an integer from 0 to 4;
  • R 1 is
  • R 2 is an optionally substituted C1-C6 alkyl group, an optionally substituted aryl group, or a C1-C6 alkoxy group
  • R 3 and R 4 may be each independently a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or R 3 and R 4 together with an adjacent nitrogen atom to form a nitrogen-containing heterocycle
  • R 5 represents a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or a C1-C6 alkylsulfonyl group
  • Z represents a hydrogen atom or a C1-C6 alkyl group.
  • a salt thereof, or a culture to which a solvate thereof is added.
  • the compound represented by the general formula (I) is: N- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (4-diethylaminomethylphenyl) ethyl] -N-hydroxyformamide, or N- ⁇ 4- [2- (4-but- 2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (formylhydroxyamino) ethyl] benzyl ⁇ methanesulfonamide,
  • the culture according to (7), wherein (9) The following general formula (I):
  • X is a phenylene group
  • Y is a hydrogen atom, or — (CH 2 ) m R 1 ;
  • m is an integer from 0 to 4;
  • R 1 is
  • R 2 is an optionally substituted C1-C6 alkyl group, an optionally substituted aryl group, or a C1-C6 alkoxy group
  • R 3 and R 4 may be each independently a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or R 3 and R 4 together with an adjacent nitrogen atom to form a nitrogen-containing heterocycle
  • R 5 represents a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or a C1-C6 alkylsulfonyl group
  • Z represents a hydrogen atom or a C1-C6 alkyl group.
  • the compound represented by the general formula (I) is: N- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (4-diethylaminomethylphenyl) ethyl] -N-hydroxyformamide, or N- ⁇ 4- [2- (4-but- 2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (formylhydroxyamino) ethyl] benzyl ⁇ methanesulfonamide,
  • (11) The following general formula (I):
  • X is a phenylene group
  • Y is a hydrogen atom, or — (CH 2 ) m R 1 ;
  • m is an integer from 0 to 4;
  • R 1 is
  • R 2 is an optionally substituted C1-C6 alkyl group, an optionally substituted aryl group, or a C1-C6 alkoxy group
  • R 3 and R 4 may be each independently a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or R 3 and R 4 together with an adjacent nitrogen atom to form a nitrogen-containing heterocycle
  • R 5 represents a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or a C1-C6 alkylsulfonyl group
  • Z represents a hydrogen atom or a C1-C6 alkyl group.
  • a salt thereof, or a solvate thereof is added to a blood product containing platelets, to maintain the function of platelets in the blood product.
  • the compound represented by the general formula (I) is: N- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (4-diethylaminomethylphenyl) ethyl] -N-hydroxyformamide, or N- ⁇ 4- [2- (4-but- 2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (formylhydroxyamino) ethyl] benzyl ⁇ methanesulfonamide, The method according to (11), wherein
  • the function of platelets is maintained even at a temperature of around 37 ° C. by specifically inhibiting the metalloprotease activity of ADAM17 and inhibiting shedding of GPIb ⁇ . Can be maintained. Therefore, according to the derivative, a large amount of functionally stable platelets can be produced in vitro, and the quality of blood products containing platelets can be stabilized.
  • ⁇ Protocol 2> shows that washed platelets were prepared from human peripheral blood, and a compound (S-45282 or S-45457) according to the present invention was added. It is a graph which shows the result of having verified about the function maintenance effect with respect to the ES cell origin platelet of each compound when GM6001 or S-45282 is added to a culture system for 2 days (2days). The vertical axis represents the ratio (%) of CD42b (GPIb ⁇ ) (+) and CD42b (GPIb ⁇ ) ( ⁇ ) when the total platelet count (CD41 (+)) is 100.
  • FIG. 6 is a graph showing the total number of ES cell-derived platelets obtained when GM6001 or S-45282 was added to the culture system for 2 days (2 days).
  • the unit of the vertical axis is the number of cells / well. It is a graph which shows the result of having verified about the function maintenance effect with respect to the ES cell origin platelet of each compound when GM6001 or S-45282 is added to a culture system for 8 days (8days).
  • the vertical axis represents the ratio (%) of CD42b (GPIb ⁇ ) (+) and CD42b (GPIb ⁇ ) ( ⁇ ) when the total platelet count (CD41 (+)) is 100.
  • FIG. 5 is a graph showing the total number of ES cell-derived platelets obtained when GM6001 or S-45282 was added to the culture system for 8 days (8 days).
  • the unit of the vertical axis is the number of cells / well.
  • the number of ES cell-derived platelets (number of CD41 (+) CD42b (+) and CD41 (+) CD42b (-)) obtained when GM6001, S-45282, or S-45457 was added to the culture system for 8 days. It is a graph to show.
  • the unit of the vertical axis is the number of cells / well. It is a graph which shows the result of having verified about the function maintenance effect with respect to the ES cell origin platelet of each compound at the time of adding GM6001, S-45282, or S-45457 to a culture system for 8 days.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of CD42b (GPIb ⁇ ) (+) when the total platelet count (CD41 (+)) is 100.
  • the vertical axis represents the ratio (ratio) of CD41 (+) CD42b (GPIb ⁇ ) (+) when the total number of platelets is 1.0.
  • FIG. 6 is a graph showing the total number of ES cell-derived platelets obtained when GM6001, S-45457, or p38 inhibitor was added to the culture system for 8 days.
  • the unit of the vertical axis is the number of cells / well. It is a graph which shows the result of having verified about the function maintenance effect with respect to the ES cell origin platelet of each compound when GM6001, S-45457, or a p38 inhibitor is added to a culture system for 8 days.
  • the vertical axis represents the percentage (%) of CD42b (GPIb ⁇ ) (+) when the total number of platelets is 100. It is a graph which shows the result of having verified about the function maintenance effect with respect to the peripheral blood origin platelets of GM6001, S-45457, or S-45282. The vertical axis represents the percentage (%) of CD42b (GPIb ⁇ ) (+) when the total number of platelets is 100. It is a graph which shows the result of having verified about the function maintenance effect with respect to peripheral blood origin PRP of GM6001, S-45457, S-45282, or a p38 inhibitor.
  • FIG. 5 is a dot plot diagram showing the function maintenance effect of GM6001, S-45457, S-45282, or p38 inhibitor on platelets derived from peripheral blood.
  • FIG. 4 is a dot plot showing the function maintaining effect on peripheral blood-derived platelets depending on the concentration of S-45457.
  • 3 is a graph showing the results of evaluating the adhesive ability of platelets prepared by adding S-45457 over time. It is a graph which shows the result of having evaluated the adhesiveness of the platelet prepared by adding S-45457.
  • composition of the present invention comprises: The following general formula (I):
  • X is a phenylene group
  • Y is a hydrogen atom, or — (CH 2 ) m R 1 ;
  • m is an integer from 0 to 4;
  • R 1 is
  • R 2 is an optionally substituted C1-C6 alkyl group, an optionally substituted aryl group, or a C1-C6 alkoxy group
  • R 3 and R 4 may be each independently a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or R 3 and R 4 together with an adjacent nitrogen atom to form a nitrogen-containing heterocycle
  • R 5 represents a hydrogen atom, a C1-C6 alkyl group, or a C1-C6 alkylsulfonyl group
  • Z represents a hydrogen atom or a C1-C6 alkyl group.
  • a salt thereof, or a solvate thereof as an active ingredient is a composition for maintaining the function of platelets.
  • C1 to C6 and “C6 to C14” mean that the carbon number is in the range of 1 to 6 and 6 to 14, respectively.
  • the “C1-C6 alkyl group” of the “optionally substituted C1-C6 alkyl group” in R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and Z is a linear or branched C1-C6 alkyl group.
  • specific examples include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, sec-butyl group, n-pentyl group, tert-amyl group, Examples include 3-methylbutyl group, neopentyl group, n-hexyl group and the like.
  • substituent in the “optionally substituted C1-C6 alkyl group” examples include a hydroxyl group, a halogen atom, a cyano group, a nitro group, a C1-C6 alkoxy group, a carboxyl group, a C1-C6 alkoxycarbonyl group, and the like. It is done. These can be substituted one or more at all possible positions. When a plurality of substituents are substituted, these substituents may be the same or different, may be substituted with the same carbon atom, or may be substituted with different carbon atoms.
  • Halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • C1-C6 alkoxy group means an alkoxy group in which the alkyl moiety is the same as the above-mentioned “C1-C6 alkyl group”.
  • the “C1-C6 alkoxycarbonyl group” means that the alkyl part excluding the oxycarbonyl part is a linear or branched C1-C6 alkyl group, for example, a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, an n— Propoxycarbonyl group, isopropoxycarbonyl group, n-butoxycarbonyl group, isobutoxycarbonyl group, tert-butoxycarbonyl group, sec-butoxycarbonyl group, n-pentyloxycarbonyl group, tert-amyloxycarbonyl group, 3-methylbutoxy Examples thereof include a carbonyl group, a neopentyloxycarbonyl group, and an n-hexyloxycarbonyl group.
  • the “nitrogen-containing heterocycle” formed by R 3 and R 4 together with the adjacent nitrogen atom includes, for example, at least one nitrogen atom in addition to a carbon atom as a ring-constituting atom, and an oxygen atom, sulfur Examples thereof include a 5- to 7-membered nitrogen-containing heterocycle which may contain 1 or 2 heteroatoms selected from an atom and a nitrogen atom.
  • the nitrogen-containing heterocycle include a piperidine ring, piperazine ring, morpholine ring, thiomorpholine ring, pyrrolidine ring, imidazolidine ring and the like.
  • the “aryl group” of the “optionally substituted aryl group” in R 2 represents an aromatic carbocyclic ring, preferably a C6-C14 aromatic carbocyclic ring, and examples thereof include a phenyl group and a naphthyl group. .
  • the substituent on the aromatic ring in the “optionally substituted aryl group” includes a hydroxyl group, a halogen atom, a cyano group, a nitro group, a trifluoromethyl group, an optionally substituted C1-C6 alkyl group, Examples thereof include a C1-C6 alkoxy group, a carboxyl group, a C1-C6 alkoxycarbonyl group, and the like. These can be substituted one or more at all possible positions. When a plurality of substituents are substituted, these substituents may be the same or different, may be substituted with the same carbon atom, or may be substituted with different carbon atoms.
  • halogen atom “optionally substituted C1-C6 alkyl group”, “C1-C6 alkoxy group” and “C1-C6 alkoxycarbonyl group” have the same meaning as described above.
  • C1-C6 alkylsulfonyl group in R 5 means an alkylsulfonyl group in which the alkyl moiety has the same meaning as the above-mentioned “C1-C6 alkyl group”, and examples thereof include a methanesulfonyl group and an ethanesulfonyl group. .
  • the salt of the compound represented by the general formula (I) is not particularly limited as long as it is a pharmacologically acceptable salt.
  • a salt with an inorganic base a salt with an organic base, or a salt with an organic acid And salts with inorganic acids and salts with amino acids.
  • the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as lithium salts, sodium salts, potassium salts, calcium salts, and magnesium salts, and alkaline earth metal salts.
  • Examples of the salt with an organic base include triethylamine salt, pyridine salt, ethanolamine salt, cyclohexylamine salt, dicyclohexylamine salt, dibenzylethanolamine salt and the like.
  • salts with organic acids include formate, acetate, tartrate, maleate, succinate, lactate, malate, ascorbate, oxalate, glycolate, phenylacetate, Examples include methanesulfonate.
  • salts with inorganic acids include hydrochloride, hydrobromide, phosphate, sulfamate, nitrate and the like.
  • salts with amino acids include glycine salt, alanine salt, arginine salt, glutamate, aspartate and the like.
  • the compound represented by the general formula (I) can take the form of a prodrug.
  • prodrugs include methyl ester, ethyl ester, aminoalkyl ester derivatives of compounds of general formula (I), acetate, formate and benzoate derivatives of hydroxyl and amine functional groups of compounds of general formula (I) However, it is not limited to these.
  • the compound represented by the general formula (I) can be produced by various methods, but can be efficiently produced by the production method shown below.
  • Specific examples of the “protecting group” used in the following production method include tert-butyl group, benzyl group, o-methylbenzyl group, p-nitrobenzyl group, p-methoxybenzyl group, o-chlorobenzyl.
  • the compound represented by the general formula (I) can be produced, for example, by the reaction in the following step 1 to step 2.
  • step 1 hydroxylamine or a salt thereof is added to compound (II) to produce a compound represented by general formula (III).
  • This addition reaction is carried out in the presence of an inorganic base such as potassium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide or lithium hydroxide when hydroxylamine is a salt (hydrochloride, acetate, etc.). It is.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as it does not significantly inhibit the reaction, but water, tetrahydrofuran, cyclopentyl methyl ether, acetonitrile, 1,4-dioxane, diethyl ether, or a mixed solvent thereof is preferable.
  • the reaction temperature is not particularly limited, and it is usually performed at 0 to 100 ° C., and the reaction time is preferably 2 hours to 1 week.
  • step 2 compound (III) obtained in step 1 is condensed with an intermediate represented by general formula (IV) to produce a compound represented by general formula (I).
  • Intermediate (IV) is an active intermediate obtained from a mixed acid anhydride of formic acid (such as a mixed acid anhydride of formic acid and acetic acid), pentafluorophenyl formate or formic acid and carbodiimide (dicyclohexylcarbodiimide, diisopropylcarbodiimide or water-soluble carbodiimide). It is.
  • an organic base such as triethylamine, diisopropylethylamine, pyridine, lutidine, collidine, dimethylaminopyridine may coexist.
  • the reaction is accelerated by adding 1-hydroxybenzotriazole and / or 4-dimethylaminopyridine.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as it does not significantly inhibit the reaction, but chloroform, methylene chloride, tetrahydrofuran, acetonitrile, cyclopentyl methyl ether, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, pyridine and the like are preferable.
  • the reaction temperature is not critical and the reaction is usually carried out at 0 to 100 ° C.
  • the reaction time is preferably 1 to 24 hours.
  • a CHO group may be added to the hydroxyl group of the hydroxylamino group. This can be achieved by treating with a lower alcohol under acidic, basic or neutral conditions. It can be converted into the target compound (I).
  • a lower alcohol methanol, ethanol, propanol and the like are preferable.
  • An auxiliary solvent may be used, and the auxiliary solvent to be used is not particularly limited.
  • the compound (II) can be produced by steps 3 to 5 as shown below.
  • E is a leaving functional group such as C1-C6 alkoxy group, halogen atom, N, O-dimethylhydroxyamino group
  • M 1 is Li, CeCl
  • 2 NaBH 3 , LiBH 3 , LiBEt 3 , KBEt 3 , LiB [CH (CH 3 ) C 2 H 5 ] 3 , KB [CH (CH 3 ) C 2 H 5 ] 3 , Al [CH (CH 3 ) C 2 H 5 ] 2, etc.
  • Et represents an ethyl group.
  • step 3 the compound represented by general formula (V) is converted to an anion with a base, and then reacted with the compound represented by general formula (VI) to produce compound (VII).
  • the base used include lithium diisopropylamide, lithium (bistrimethylsilyl) amide, lithium tetramethylpiperazide, sodium (bistrimethylsilyl) amide, potassium (bistrimethylsilyl) amide, n-butyllithium, sec-butyllithium, tert- Examples include butyl lithium. These bases are used alone or in combination of two or more in some cases.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as it does not significantly inhibit the reaction. Tetrahydrofuran, cyclopentyl methyl ether, tetrahydropyran, diethyl ether, tert-butyl methyl ether, or a mixed solvent thereof is preferable.
  • the reaction temperature is usually ⁇ 100 to 40 ° C., and the reaction time is preferably 1 to 12 hours.
  • the compound (II) may be obtained depending on the chemical properties of the compound (VI), but there is no problem if this production purpose is taken into consideration.
  • step 4 compound (VII) obtained in step 3 is reacted with a compound represented by general formula (VIII) to produce a compound represented by general formula (IX).
  • reaction solvent when compound (VIII) is sodium borohydride or lithium borohydride, methanol, ethanol, isopropanol, tetrahydrofuran, cyclopentyl methyl ether, dichloromethane, chloroform, or a mixed solvent thereof is preferable.
  • VIII is other than the above two, tetrahydrofuran, cyclopentyl methyl ether, tetrahydropyran, diethyl ether, tert-butyl methyl ether or a mixed solvent thereof is preferable.
  • the reaction temperature is usually ⁇ 100 to 30 ° C., and the reaction time is preferably 1 to 12 hours.
  • step 5 can be performed without separating them, and in all cases, step 5 can be omitted.
  • step 5 compound (II) is produced by subjecting compound (IX) obtained in step 4 to a dehydration reaction.
  • the dehydration reaction is carried out by a combination of a hydroxyl group-activating reagent and an organic base.
  • the hydroxyl group-activating reagent include methanesulfonyl chloride, p-toluenesulfonyl chloride, benzenesulfonyl chloride, methanesulfonyl chloride, thionyl chloride, chloride And sulfuryl and phosphorus pentachloride.
  • organic base examples include triethylamine, diisopropylethylamine, diazabicycloundecene, diazabicyclononene, pyridine, dimethylaminopyridine, lutidine, collidine and the like.
  • a preferred combination is methanesulfonyl chloride and triethylamine.
  • Other dehydrating reagents include triphenylphosphine-diethylazodicarboxylate, triphenylphosphine-diisopropylazocarboxylate, tri-n-butylphosphine-diethylazodicarboxylate, tri-n-butylphosphine-diisopropylazocarboxylate, etc.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as it does not significantly inhibit the reaction, but chloroform, methylene chloride, tetrahydrofuran, cyclopentyl methyl ether, acetonitrile, 1,4-dioxane, dimethylformamide and the like are preferable.
  • the reaction temperature is not critical and the reaction is usually carried out at 0 to 100 ° C.
  • the reaction time is preferably 1 to 24 hours.
  • the compound (V) can be produced by step 6 as shown below.
  • J 1 represents a halogen atom, a methanesulfonyloxy group, p- toluenesulfonyloxy group, benzenesulfonyloxy group, trifluoromethanesulfonyloxy group or a hydroxyl group.
  • step 6 the compound represented by general formula (X) or a salt thereof and the compound represented by general formula (XI) are condensed in the presence of an inorganic base to produce compound (V).
  • Suitable inorganic bases include sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate, calcium hydroxide and the like.
  • J 1 is a hydroxyl group
  • the compound represented by the general formula (X) or a salt thereof is activated with a reagent
  • the compound represented by the general formula (XI) is condensed, and the compound (V) is To manufacture.
  • Suitable reagents for activating the hydroxyl group include diethyl azodicarboxylate (DEAD) -triphenylphosphine, diisopropyl azodicarboxylate-triphenylphosphine, cyanomethylenetributylphosphorane, cyanomethylenetributylphosphorane, butyllithium-chlorodiphenylphosphine. Etc. When activated with butyllithium-chlorodiphenylphosphine, quinones such as 2,6-dimethyl-1,4-benzoquinone and tetrafluoro-1,4-benzoquinone are added.
  • DEAD diethyl azodicarboxylate
  • diisopropyl azodicarboxylate-triphenylphosphine diisopropyl azodicarboxylate-triphenylphosphine
  • cyanomethylenetributylphosphorane cyanomethylenetribu
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as it does not significantly inhibit the reaction, but water, methanol, ethanol, tert-butanol, tetrahydrofuran, cyclopentyl methyl ether, acetonitrile, diethyl ether, dimethyl ether, dichloromethane, 1,4-dioxane, 2-methoxyethanol, N, N-dimethylformamide or a mixed solvent thereof is preferred.
  • the reaction temperature is not critical and the reaction is usually carried out at ⁇ 80 to 120 ° C., and the reaction time is preferably 1 to 24 hours.
  • the compound (II) can also be produced by steps 7 to 11 as shown below.
  • Step 7 in the same manner as in Step 3, the compound represented by General Formula (XII) is converted into an anion with a base and then reacted with Compound (VI) to produce Compound (XIII).
  • step 8 in the same manner as in step 4, the compound represented by general formula (XIII) is reacted with the compound represented by general formula (VIII) to produce compound (XIV).
  • step 9 compound (XV) is produced in the same manner as in step 5 by subjecting compound (XIV) to a dehydration reaction.
  • step 9 the protecting group P 1 may be spontaneously eliminated, and part or all of it may become the compound (XVI).
  • step 10 can be performed without separating them, and in all cases, step 10 can be omitted.
  • step 10 in accordance with the kind of protecting group P 1 used in the compound represented by the general formula (XV), deprotection is carried out by a known method, and the compound represented by the general formula (XVI) Manufacturing.
  • step 11 compound (II) is produced by condensing compound (XVI) and the compound represented by formula (X) or a salt thereof in the same manner as in step 6.
  • the N-hydroxyformamide derivative of the present invention produced by the above-described method is isolated and purified as a free compound, a salt thereof, a solvate such as a hydrate or ethanol solvate thereof, or a polymorphic substance.
  • the pharmacologically acceptable salt of the compound of the general formula (I) can be produced by a conventional salt formation reaction. Isolation and purification are performed by applying chemical operations such as extraction fractionation, crystallization, and various types of fractional chromatography.
  • the optical isomer can be obtained as a stereochemically pure isomer by selecting an appropriate raw material compound or by optical resolution of a racemate.
  • the composition of the present invention maintains the function of platelets containing the compound, a salt thereof, or a solvate thereof (hereinafter also referred to as “the compound represented by the general formula (I)”) as an active ingredient. It is a composition for doing.
  • “maintaining the function of platelets” mainly means maintaining functions related to blood coagulation such as hemostasis of platelets and thrombus formation. The function can be achieved by suppressing GPIb ⁇ shedding by the ADAM17.
  • “Maintaining platelet function” includes, for example, a method for evaluating the adhesion ability of platelets to VWF using a flow chamber system, as described in International Publication No. 2009/119105 and Test Example 15 described later.
  • a method for evaluating the in vivo life of platelets using a mouse, a method for observing the shape of platelets on a fibrinogen-coated cover glass in the presence of thrombin, or laser irradiation and hematoporphyrin as described in Test Example 16 described later A thrombus formation model animal can be prepared using and a platelet molecular dynamics in this model animal can be evaluated using a biomolecular imaging technique or the like.
  • ADAM17 (a disintegrin and metallopeptidase domain 17) is a protein that has a disintegrin domain in structure and has metalloprotease activity.
  • membrane-bound TNF- ⁇ Tumor necrosis factor-alpha, tumor necrosis factor- ⁇
  • TACE TNF-alpha converting enzyme, TNF
  • ACCESSION No. Examples include proteins (genes) specified by NP_003174.3 (No. NM_003183.4).
  • GPIb ⁇ (glycoprotein Ib alpha, glycoprotein Ib ⁇ ) is a membrane protein of platelets and functions as a receptor for von Willebrand factor (VWF). Further, GPIb ⁇ is expressed only in platelets in the human body, so it is also called CD42b antigen and is used as a surface marker for platelets. Typically, as human-derived GPIb ⁇ , ACCESSION No. And a protein (gene) specified by NP_000164.5 (No. NM_000173.5).
  • ADAM17 and GPIb ⁇ each Reference Sequence registered in GenBank is exemplified, but the amino acid sequence of the protein can be mutated in nature (that is, non-artificially). Therefore, it should be understood that ADAM17 and GPIb ⁇ involved in the mechanism of action of the composition of the present invention include such natural variants.
  • “suppression of GPIb ⁇ shedding by ADAM17” includes both complete suppression (inhibition) and partial suppression of shedding by ADAM17. Further, as shown in the examples described later, the ratio of the number of CD42b (GPIb ⁇ ) (+) platelets to the total number of platelets in the presence of the composition of the present invention was calculated, and the ratio in the absence of the composition of the present invention. When the value is larger than that, it can be evaluated that the composition of the present invention suppresses GPIb ⁇ shedding by ADAM17.
  • the degree of inhibition of GPIb ⁇ shedding by the composition of the present invention is preferably such that the ratio of the number of CD42b (+) platelets in the presence of the composition of the present invention is 80% or more, and it is more preferable as it is larger ( For example, 85% or more, 90% or more, 95% or more).
  • IC 50 50% inhibition concentration
  • Examples of the compound represented by the general formula (I) as an active ingredient of the composition of the present invention include N- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (4-diethylaminomethyl). Phenyl) ethyl] -N-hydroxyformamide, N- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (4-dimethylaminomethylphenyl) ethyl] -N-hydroxyformamide, N- ⁇ 4- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (formylhydroxyamino) ethyl] benzyl ⁇ -2-methoxyacetamide, N- ⁇ 4- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (formylhydroxyamino) ethyl] benzyl ⁇ methanesulfonamide
  • N- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (4-diethylaminomethylphenyl] has a high specificity for ADAM17.
  • Ethyl] -N-hydroxyformamide or N- ⁇ 4- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (formylhydroxyamino) ethyl] benzyl ⁇ methanesulfonamide is preferred.
  • N- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (4-diethylaminomethylphenyl) ethyl] -N-hydroxyformamide is “I-1” in the examples described later or N- ⁇ 4- [2- (4-but-2-ynyloxybenzenesulfonyl) -1- (formylhydroxyamino) ethyl] benzyl ⁇ methanesulfonamide, which is “S-45282”, is described in the Examples below. “I-4” or “S-45457” in FIG.
  • composition of the present invention examples include reagents and pharmaceutical additives used for research and development purposes (for example, in vitro and in vivo research and development).
  • composition of the present invention has an action of maintaining the function of platelets by inhibiting GPIb ⁇ shedding by ADAM17
  • a reagent for maintaining the function of platelets for example, from cells capable of differentiating into megakaryocytes to megakaryocytes
  • blood products containing platelets for blood donation etc.
  • a pharmaceutical additive for example, a stabilizer, a solvent, or the like may be contained. .
  • the product of the composition of the present invention may have a label indicating that it is used for maintaining the function of platelets.
  • label indicating that it is used for maintaining the function of platelets means that the product body, container, packaging, etc. are marked, or instructions, package inserts, promotional materials, or other printed materials that disclose product information. It means that the display is attached to.
  • the compound represented by the general formula (I) which is an active ingredient of the composition of the present invention, exhibits the effect of maintaining the function of platelets.
  • Information about the mechanisms up to can be included. As the mechanism, for example, information on maintaining the function of platelets by suppressing GPIb ⁇ shedding by ADAM17 can be mentioned.
  • the display indicating that it is used for maintaining the function of platelets can include information regarding the use of platelets for manufacturing or storage.
  • the compound represented by the general formula (I) is an active ingredient for producing the composition of the present invention. Accordingly, the present invention is characterized by using the compound represented by the general formula (I) and the compound represented by the general formula (I), which are used for producing the composition of the present invention. The present invention also provides a method for producing the composition of the present invention.
  • the present invention also provides a culture obtained by adding a compound represented by the general formula (I) to a culture system that induces differentiation from cells capable of differentiating into megakaryocytes into megakaryocytes and produces platelets from the megakaryocytes. It is to provide. Furthermore, the present invention is characterized in that the compound represented by the general formula (I) is added to a culture system that induces differentiation from cells capable of differentiating into megakaryocytes to megakaryocytes and produces platelets from the megakaryocytes. A method for preparing platelets is provided.
  • the “megakaryocyte” in the present invention is also called a platelet precursor cell or megakaryocyte, and is a cell that produces platelets by separating the cytoplasm.
  • “cells capable of differentiating into megakaryocytes” are not particularly limited as long as they are cells that can be induced to differentiate into megakaryocytes.
  • fertilized eggs embryonic stem cells (ES cells), Universal stem cells such as potent stem cells (iPS cells) and embryonic germ cells (EG cells), hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells, megakaryoblasts, and adipocytes.
  • ES cells embryonic stem cells
  • Universal stem cells such as potent stem cells (iPS cells) and embryonic germ cells (EG cells)
  • hematopoietic stem cells hematopoietic progenitor cells
  • megakaryoblasts megakaryoblasts
  • adipocytes hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells may be collected from bone marrow or umbilical cord blood.
  • iPS cells are preferred.
  • the iPS cell-derived megakaryocytes can continue to increase from 25 to 35 days after the start of iPS cell culture, and the number of platelets produced from such megakaryocytes is also determined by three factors (Oct3 / 4). From the viewpoint of 2 to 10 times the iPS cells established using Sox2, Klf4), iPS cells established using 4 factors (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc) More preferred. It has been confirmed by the present inventors that the increase in the number of megakaryocytes and platelets is caused by reactivation of the c-Myc gene.
  • animal species from which the cells used in the method of the present invention are derived is not particularly limited, and examples thereof include humans, mice, rats, dogs, cats, cows, horses, sheep, etc., preferably mice, Rats and humans are preferred, mice and humans are more preferred, and humans are particularly preferred.
  • a culture system that induces differentiation from a cell capable of differentiating into a megakaryocyte into a megakaryocyte and produces platelets from the megakaryocyte is, for example, an embryoid body (a medium that has undergone differentiation induction during the stage leading to platelets).
  • a culture system (cell population including undifferentiated germ layer cells) (Eto et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • hematopoietic progenitor cells are concentrated in the net-like structure, and can be efficiently produced in vitro, such as megakaryocytes and platelets. A system is preferred.
  • the culture condition of the culture system according to the present invention is not particularly limited as long as it is a condition suitable for megakaryocyte culture and platelet production, but the culture temperature is preferably 35 to 38 ° C, more preferably. Is 37 ° C. If the culture temperature is less than the lower limit, the number of megakaryocytes and platelets tends to be reduced, and if the upper limit is exceeded, cell culture and maintenance tends to be difficult.
  • feeder cells when culturing “cells capable of differentiating into megakaryocytes” according to the present invention (particularly in the process of inducing differentiation of megakaryocytes), it is preferable to co-culture with feeder cells.
  • the “feeder cell” used here is not particularly limited as long as it contributes to the differentiation induction of “cells capable of differentiating into megakaryocytes”.
  • mouse embryo fibroblast preferably 10T1 / 2 Cell lines, OP9 cells and the like can be used.
  • cells other than the immortalized cell line include human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (cells prepared and cultured directly from human bone marrow), and the mesenchymal stem cells can be used as feeder cells.
  • the addition amount (concentration) of the compound represented by the general formula (I) to the culture system is preferably 0.01 to 100 ⁇ M.
  • concentration concentration of the compound represented by the general formula (I) to the culture system.
  • the time when the compound represented by the general formula (I) is added to the culture system is to ensure homogeneity in the culture process in spite of the non-uniformity of blood cell differentiation, From the viewpoint of securing, it is preferably the entire period from hematopoietic progenitor cells to the production of platelets, and is greatly different from GM6001 in that it is not limited to the period from megakaryocytes to the production of platelets.
  • the method for preparing platelets of the present invention will be described more specifically by taking as an example a method for forming a net-like structure suitably used in the culture system of the present invention.
  • a method for forming a net-like structure will be described.
  • the culture conditions suitable for preparing the net-like structure vary depending on the ES cells or iPS cells to be used.
  • Iscov modified Dulbecco medium IMDM
  • IMDM Iscov modified Dulbecco medium
  • FBS FBS
  • those appropriately added with growth factors and supplements can be used.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the culture environment varies depending on the type of ES cells or iPS cells used, but is preferably 5% CO 2 , 35 to 38 ° C., more preferably 37 ° C.
  • the culture period until the net-like structure is formed varies depending on the type of ES cell or iPS cell, but its existence should be confirmed about 15 days (after 14 to 16 days) after seeding on the feeder cell. Can do.
  • the formed net-like structure has a follicular structure, and hematopoietic progenitor cells, particularly CD34 positive cells, are present in a concentrated state. Hematopoietic progenitor cells present inside the net-like structure can be separated by passing through physical means such as a sterilized sieving instrument (eg, a cell strainer).
  • a sterilized sieving instrument eg, a cell strainer
  • Hematopoietic progenitor cells obtained by the separation are seeded on feeder cells, and cultured under conditions suitable for producing megakaryocytes and platelets.
  • condition suitable for producing megakaryocytes and platelets are, for example, in the presence of thrombopoietin (TPO, 10 to 200 ng / mL, preferably about 100 ng / mL), or stem cell factor (SCF 10-200 ng / mL, preferably about 50 ng / mL), heparin (Heparin, 10-100 U / mL, preferably about 25 U / ml) and TPO (10-200 ng / mL, preferably about 100 ng / mL)
  • TPO thrombopoietin
  • the culture is performed for about 7 to 15 days.
  • the culture environment is preferably 5% CO 2 , 35 to 38 ° C., more preferably 37 ° C.
  • the compound represented by the general formula (I) it is preferable to add the compound represented by the general formula (I) to the culture system when the hematopoietic progenitor cells are seeded on feeder cells. More preferably, the compound represented by the general formula (I) is added around the 22nd day (from the 20th day to the 23rd day, from the 6th day to the 10th day after re-rolling the net-like structure).
  • a fraction of a culture solution rich in platelets released from megakaryocytes (for example, in the method of forming a net-like structure, after culturing human iPS cells or ES cells 22 ⁇ 28th day fraction) is collected, and components other than platelets (megakaryocytes, other blood cells) are removed using a leukocyte removal filter (available from Terumo, Asahi Kasei Medical, etc.)
  • a leukocyte removal filter available from Terumo, Asahi Kasei Medical, etc.
  • the present invention adds a blood product containing platelets to which the compound represented by the general formula (I) is added, and a compound represented by the general formula (I) to a blood product containing platelets.
  • the present invention also provides a method for maintaining the function of platelets in blood products.
  • the compound represented by the general formula (I) is an active ingredient for producing a blood product containing platelets. Therefore, the present invention also provides a compound represented by the above general formula (I) as a pharmaceutical additive used for producing the blood product of the present invention.
  • the platelets contained in the blood product of the present invention are not particularly limited, and may be platelets obtained by the above-described method for preparing platelets of the present invention, or peripheral blood obtained by blood collection. It may be platelets derived from the like. In preparing a blood product, other components that contribute to the stabilization of platelets may be included in consideration of the unstableness of platelets with respect to storage.
  • the conditions for stabilizing platelets can be selected from methods well known to those skilled in the art. For example, in a solution necessary for maintaining the function of platelets (for example, ACD-A solution (a solution prepared from sodium citrate / citric acid / glucose), etc., in some cases, fresh frozen plasma or the like is appropriately added.
  • concentration for example, about 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 platelets / mL, preferably about 1 ⁇ 10 9 platelets / mL.
  • concentration for example, about 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 platelets / mL, preferably about 1 ⁇ 10 9 platelets / mL.
  • concentration is preferably 0.01 to 100 ⁇ mol / L. If the added amount is less than the lower limit, platelets tend not to have an adhesive function. If the added amount exceeds the upper limit, the maximum effect is obtained.
  • ES cells human ES cells
  • KhES cell line KhES-3 established by the Research Institute for Medical Science of Kyoto University and provided by the laboratory was used.
  • hiPS cells are 0.1 mM non-iPS cell lines (TkDA3-4) established by introducing Oct4, Klf4, Sox2, and c-Myc into human-derived skin cells at the University of Tokyo. Essential amino acids (Invitrogen) were used. Then, TkDA3-4 cells were treated with 2 mM L-glutamine (manufactured by Invitrogen), 20% knockout serum replacement additive (KSR, manufactured by Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, and 5 ng / ml basic fibroblasts.
  • KSR knockout serum replacement additive
  • mouse fetal fibroblast C3H10T1 / 2 cell line (hereinafter also referred to as “10T1 / 2 cell”) purchased from RIKEN BioResource Center was added with 10% fetal bovine serum (FBS) and 2 mM L-glutamine. The cells were cultured in a basal medium (BME, manufactured by Invitrogen). Then, 10T1 / 2 cells adjusted to 8 ⁇ 10 6 cells / 10 cm dish were irradiated with 50 Gy as feeder cells.
  • FBS fetal bovine serum
  • BME basal medium
  • this culturing was performed using a CO 2 incubator (product name: HERA CELL 150i, manufactured by Thermo SCIENTIFIC) at 37 ° C., 5% CO 2 , 21% O 2 (atmospheric oxygen). Then, the medium was changed every 3 days, and the cells were cultured under such conditions until the 15th day when many sac structures (net-like structures) containing hematopoietic progenitor cells were confirmed.
  • a CO 2 incubator product name: HERA CELL 150i, manufactured by Thermo SCIENTIFIC
  • the sac structure was peeled off from the dish and crushed, suspended in a phosphate buffer solution (PBS) containing 3% FBS, and then passed through a 40 ⁇ m cell strainer (manufactured by BD). The passed solution was centrifuged at 440 ⁇ g for 10 minutes to recover hematopoietic progenitor cells, and the number of cells was counted.
  • PBS phosphate buffer solution
  • hematopoietic progenitor cells at 2 to 3 ⁇ 10 4 cells / well were prepared on 10T1 / 2 cells (6 ⁇ 10 5 cells / one 6-well plate) that had been irradiated with 50 Gy prepared in 6-well plates.
  • FBS product name: CELLect (TM) GOLD, manufactured by ICN Biomedicals
  • 2 mM L-glutamine manufactured by Invitrogen
  • ITS supplement (10 ⁇ g / ml insulin, 5.5 mg / ml transferrin, 5 ng / ml) Sodium selenate) (manufactured by Sigma), 50 ⁇ g / ml ascorbic acid (manufactured by Sigma), 0.45 mM MTG (manufactured by Sigma), 100 ng / ml human thrombopoietin (human TPO, manufactured by Peprotec), 50 ng / ml Human stem cell factor (SCF, Peprot c Inc.) and 25 U / ml IMDM supplemented with heparin (Invitrogen / GIBCO Co.) and further cultured for 8 days in, to induce megakaryocyte / platelet.
  • FBS product name: CELLect (TM) G
  • the induced megakaryocytes / platelets were collected with an anticoagulant solution (Acid Citrate Dextrose, ACD), and then centrifuged at 900 rpm for 10 minutes without a brake. The supernatant obtained by centrifugation was further centrifuged without a brake at 1500 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was removed. The number of megakaryocytes and platelets in the precipitate thus obtained was stained with an antibody and analyzed by flow cytometry.
  • an anticoagulant solution Acid Citrate Dextrose, ACD
  • Flow cytometry uses FACS Aria manufactured by Becton Dickinson, and as antibodies used for staining megakaryocytes and platelets, phycoerythrin (PE) -modified anti-human CD42a (GPIX) antibody, PE-modified anti-human CD42b (GPIb ⁇ ) )
  • PE phycoerythrin
  • GPIX PE-modified anti-human CD42a
  • GPIb ⁇ PE-modified anti-human CD42b
  • An antibody, an allophycocyanin (APC) -labeled anti-CD41a (integrin ⁇ IIbbeta3 complex, HIP8 clone) antibody was used.
  • the cells were stained with these antibodies and analyzed by flow cytometry using TruCount beads (BD Bioscience).
  • CD45 low CD34 + cells were selected and isolated from cord blood (CB) using a bead column. 4 ⁇ 10 4 umbilical cord blood-derived CD34 (+) cells obtained were seeded on the feeder cells, medium A (15% FBS (product name: CELLect (TM) GOLD, manufactured by ICN Biomedicals), 2 mM L ⁇ ) Glutamine (manufactured by Invitrogen), ITS supplement (10 ⁇ g / ml insulin, 5.5 mg / ml transferrin, 5 ng / ml sodium selenite) (manufactured by Sigma), 50 ⁇ g / ml ascorbic acid (manufactured by Sigma), 0.45 mM IMDM (Invitrogen / GIBCO) supplemented with MTG (Sigma) and cytokine cocktail (2 ng / ml TPO (Peprotec), 7.5 ng / ml SCF (Peprotec), 11 ng /
  • medium B On day 4 of culture, the same amount of medium B as medium A was added to cord blood-derived CD34 (+) cells. Unlike medium A, medium B is supplemented with 30 ng / ml TPO, 1 ng / ml SCF, 7.5 ng / ml IL-6 and 13.5 ng / ml IL-9 as cytokine cocktails. Further, medium A and medium B have the same composition except for the added cytokine cocktail.
  • umbilical cord blood-derived CD34 (+) cells cultured in this way were adjusted to 4 ⁇ 10 5 cells / mL with medium B, and further cultured at 37 ° C. for 7 days (control) or The cells were further cultured for 7 days at 24 to 25 ° C. (room temperature culture), and the numbers of megakaryocytes and platelets were measured by flow cytometry on the 14th day of the culture. The obtained results are shown in FIGS.
  • JEOL JMS-HX-110A type is used for low-resolution mass spectrum (Fast Atom Bombardment: FAB-MS) measurement, and Thermo Fisher Scientific (ESI-MS) is used for mass spectrum (electrospray ionization: ESI-MS) measurement. Exactive from the company) was used.
  • Test Example 3 ADAM17 Inhibition Experiment The presence or absence of an inhibitory effect on ADAM17 of the N-hydroxyformamide derivatives obtained in Examples 1 to 7 was examined.
  • ADAM17 has been reported by Moss et al. (See Moss et al., Nature, 1997, 385, pp. 733-736). Thus, ADAM-17 cDNA was obtained and incorporated into an expression vector. This vector was then transformed into mammalian cells or insect cells to express ADAM17.
  • ADAM17 was used as an enzyme, and as a substrate, a fluorescent synthetic substrate containing the ADAM17 cleavage sequence of membrane-bound TNF Nma (N-methylanthranilic acid) -Leu-Ala-Gln-Ala-Val- with Arg-Ser-Ser-Lys- Dnp ( dinitrophenyl) -D-Arg-NH 2, was measured as follows activity of ADAM17 under test substance the presence or absence.
  • TNF Nma N-methylanthranilic acid
  • assay buffer A 50 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 200 mmol / L sodium chloride, 5 mmol / L calcium chloride, 10 ⁇ mol / L zinc sulfate, 2 mg / mL bovine serum albumin
  • 14 unit enzyme solution the amount of enzyme that decomposes 1 pmol of the substrate in 1 minute under the condition of 25 ° C.
  • assay buffer B 200 mmol / L sodium chloride, 5 mmol / L calcium chloride, 10 ⁇ mol / 90 ⁇ L of a fluorescent synthetic substrate prepared to a concentration of 20 ⁇ mol / L with 50 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing L zinc sulfate and 0.05% PLURONIC F-68 was mixed, and 1. The reaction was allowed for 5 hours. Thereafter, the enzyme activity was determined by measuring with a fluorescence intensity meter (Fluoroskan Ascent) under conditions of an excitation wavelength of 355 nm and a measurement wavelength of 460 nm. Then, the inhibition rate was determined from the enzyme activity in the presence and absence of the test compound, and the 50% inhibition concentration (IC 50 ) was calculated. The obtained results are shown in Table 1.
  • Test Example 4 Various Evaluation Tests Among the N-hydroxyformamide derivatives obtained in Examples 1 to 7, Compound I-1 (hereinafter also referred to as “S-45282”) having a high inhibitory effect on ADAM17 And I-4 (hereinafter also referred to as “S-45457”) were examined for their specificity as inhibitors and TACE inhibitory activity in cells by the following methods. For comparison, the non-selective metalloprotease inhibitor GM6001 (EMD / Calbiochem, product number 364205) was also evaluated.
  • EMD / Calbiochem product number 364205
  • the substrates used in this test are as follows: 444221 substrate (DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-Lys (Nma) -NH 2 , custom synthesis): excitation wavelength 355 nm, 460 nm fluorescence wavelength TACE substrate (same as used in Test Example 3): excitation wavelength 355 nm, fluorescence wavelength 460 nm 3168 substrate (MOCAc-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys (Dnp) -NH 2 , manufactured by Peptide Institute, Inc.): excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 405 nm 3163 substrate (MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A 2 pr (Dnp) -Ala-Arg-NH 2 , manufactured by Peptide Laboratories): excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 405 nm.
  • an enzyme reaction was performed using the enzyme and the substrate. That is, depending on the manufacturer's information, depending on the enzyme, it was previously activated with APMA (final concentration 1 mmol / L, p-aminophenylmeric acetate, Sigma-Aldrich, A9563), and then assay buffer A (200 mmol / L on a 96-well plate dedicated for fluorescence). Assay buffer B was added to 90 ⁇ L of an enzyme solution prepared with 50 mmol / L Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing sodium chloride, 5 mmol / L calcium chloride, 10 ⁇ mol / L zinc sulfate, 2 mg / mL bovine serum albumin.
  • THP-1 cells human acute monocytic leukemia-derived cells, ATCC catalog number: TIB202
  • RPMI1640 containing 10 v / v% FBS
  • 96-well culture plate 200 ⁇ L / well (1 ⁇ 10 5 cells.
  • PMA final concentration 50 nmol / L
  • culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 40 to 48 hours to differentiate THP-1 cells into macrophage-like cells. After differentiation, the medium was discarded and the cells were washed with THP-1 wash buffer (RPMI1640, 20 mM HEPES-NaOH (pH 7.4)).
  • THP-1 assay buffer (RPMI1640, 20 mmol / L HEPES-NaOH (pH 7.4), 0.01 w / v% PF-68, 10 v / v% FBS) was added in an amount of 100 ⁇ L / well. Then, add 50 ⁇ L / well of THP-1 assay buffer containing the test substance (I-1 or I-4), mix by tapping, preincubate for 30 to 45 minutes in a CO 2 incubator, and then enter LPS THP-11 assay buffer was added at 50 ⁇ L / well (the final concentration of LPS is 1 ⁇ g / mL). Furthermore, the plate was mixed by tapping and incubated in a CO 2 incubator for 6 hours.
  • the human TNF- ⁇ concentration in the culture supernatant was measured with a commercially available kit (Human TNF- ⁇ CytoSet (manufactured by BIOSOURCE) or Human TNF- ⁇ Ready-Set-Go! (Manufactured by eBioscience)). .
  • Table 3 shows the results obtained by these test methods.
  • both the compounds I-1 and I-4 according to the present invention have high specificity for ADAM17 as compared to metalloproteases other than ADAM17. It was confirmed. Inhibitory activity against TACE expressed in macrophage-like cells was also confirmed. Moreover, both compounds suppressed ADAM10 although it was a little weak compared with ADAM17.
  • ADAM10 is an enzyme that also cleaves the same substrate as ADAM17 (see Caescu et al., Biochemical J., 2009, 424, 79-88), suggesting that its inhibition is useful for preserving platelet function.
  • the compounds I-1 and I-4 according to the present invention are ADAM17-specific inhibitors, and other compounds according to the present invention having the same basic skeleton (for example, I-2, I-3, I -5, I-6) was also suggested to be an ADAM17 specific inhibitor.
  • GM6001 having a hydroxamic acid structure strongly inhibited metalloprotease non-specifically as known in the art, but its inhibitory activity against ADAM17 was weak.
  • GM6001, S-45282, or DMSO is added and cultured, or 8 days: 8 days after reseeding hematopoietic progenitor cells derived from ES cells Each day (after “d15” shown in FIG. 6), GM6001 (50 ⁇ M), S-45282 (5 ⁇ M or 50 ⁇ M), or DMSO is added and cultured under the conditions of culture.
  • the number of CD41 (+) CD42b (+), the number of CD41 (+) CD42b ( ⁇ ), and the total number of platelets were measured by cytometry. The obtained results are shown in FIGS. Since CD41 (integrin ⁇ IIb) is a surface marker for platelets, CD41 (+) indicates platelets.
  • CD42b (GPIb ⁇ ) (+) indicates that GPIb ⁇ is a platelet present on the surface
  • CD42b (GPIb ⁇ ) ( ⁇ ) indicates that GPIb ⁇ has been shed by ADAM17.
  • GM indicates the result of adding 50 ⁇ M GM6001 (solvent: DMSO)
  • ⁇ indicates that GPIb ⁇ has been shed by ADAM17.
  • GM indicates the result of adding 50 ⁇ M GM6001 (solvent: DMSO)
  • “45282” indicates the result of adding each concentration of S-45282 (solvent: DMSO).
  • Test Example 6 Verification of the effect of maintaining the function of S-45457 and S-45282 on ES cell-derived platelets
  • the ES cell-derived hematopoietic progenitor cells obtained as described above were prepared under the conditions (protocol shown in FIG. In 1), platelets were induced. That is, 8 days after re-seeding hematopoietic progenitor cells derived from ES cells (from “d15” shown in FIG.
  • Test Example 7 Verification of concentration dependency of S-45457 on function maintenance effect on platelets ES cells or iPS cell-derived hematopoietic progenitor cells obtained as described above were obtained under the conditions shown in FIG. The guidance was performed. That is, 8 days after seeding hematopoietic progenitor cells derived from ES cells or iPS cells (after “d15” shown in FIG. 6), GM6001 (50 ⁇ M), S-45457 (1.5 to 50 ⁇ M), or DMSO is added. The cells were cultured and collected as described above, and the number of CD41 (+) CD42b (+), the number of CD41 (+) CD42b ( ⁇ ), and the total number of platelets were measured by flow cytometry.
  • S is a compound according to the present invention in the culture system using ES cells (FIG. 14) as well as the culture system using iPS cells (FIG. 16). It was confirmed that by adding -45457, the shedding of GPIb ⁇ by ADAM17 was inhibited depending on the added concentration. Furthermore, as is clear from the results shown in FIGS. 13 and 15, it was also confirmed that S-45457, which is a compound according to the present invention, has low toxicity to ES cells and iPS cells, and cells induced to differentiate therefrom. .
  • Test Example 8 Verification of concentration dependency of S-45457 on function maintaining effect on platelets derived from human peripheral blood Not only platelets obtained using the culture system as described above but also peripheral blood obtained by blood collection It was verified whether the compound according to the present invention exerts a function maintaining effect even in the derived platelets. That is, as shown in ⁇ Protocol 2> shown in FIG. 6, first, 1/10 amount of ACD was added to human peripheral blood obtained by blood collection, and centrifuged at 900 rpm for 10 minutes without a brake. The supernatant obtained by centrifugation was further centrifuged without a brake at 1500 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was removed.
  • the obtained precipitate was suspended in Tyrode-HEPES buffer (without calcium), the number of platelets in the suspension was counted, and 5 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 cells / Tyrode-HEPES buffer (without calcium) 200 ⁇ L.
  • a suspension containing platelets (washed platelets, Washed Platelet) was prepared.
  • 50 ⁇ M GM6001, 1.5-50 ⁇ M S-45457, or DMSO is added to the washed platelets obtained in this way together with 100 ⁇ M CCCP (Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrone), and the mixture is added at 37 ° C. for 24 hours.
  • CCCP Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrone
  • the compound according to the present invention has a function maintaining effect on human peripheral blood-derived platelets, particularly a function maintaining effect at 37 ° C., like GM6001. It was done.
  • washed platelets prepared in the same manner as in Test Example 8 were mixed with 100 ⁇ M CCCP, 40 ⁇ M p38 inhibitors (p38 MAP kinase inhibitor, manufactured by Calbiochem, product numbers SB202190 and SB203580), 50 ⁇ M S-45457, Alternatively, DMSO was added, incubated at 37 ° C. for 24 hours, and dot plot analysis of CD41 (+) and CD42b (+) was performed by flow cytometry. The obtained result is shown in FIG. Note that. In FIG. 18, the X axis represents CD41, and the Y axis represents CD42b. In the figure, “202190” and “203580” indicate the results of adding 40 ⁇ M of each p38 inhibitor (solvent: DMSO).
  • washed platelets prepared in the same manner as in Test Example 8 were added with 40 ⁇ M p38 inhibitor, 50 ⁇ M GM6001, 0.5-50 ⁇ M S-45457, or DMSO together with 100 ⁇ M CCCP at 37 ° C. And analyzed by flow cytometry, and the ratio of CD41 (+) CD42b (+) in platelets was calculated. The obtained result is shown in FIG.
  • Test Example 11 Verification of the function maintenance effect of S-45457 and S-45282 on platelets derived from human peripheral blood Test example to examine the function maintenance effect of S-45457 and S-45282 on platelets derived from human peripheral blood
  • 50 ⁇ M GM6001, 5 ⁇ M, or 50 ⁇ M S-45457, 50 ⁇ M S-45282, or DMSO was added to washed platelets together with 100 ⁇ M CCCP, and incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • the total number and the number of CD42b (+) were measured, and the ratio of CD42b (+) in platelets was calculated. The obtained result is shown in FIG.
  • the compound according to the present invention has a function maintaining effect on human peripheral blood-derived platelets, particularly a function maintaining effect at 37 ° C., like GM6001. It was done.
  • Test Example 13 Verification of function maintenance effect on platelets derived from human peripheral blood Washed platelets obtained in the same manner as in Test Example 8 were mixed with 100 ⁇ M CCCP, 50 ⁇ M GM6001, 50 ⁇ M S-45457, 5 ⁇ M S-45282, 40 ⁇ M p38 inhibition Two kinds of agents or DMSO were added, incubated at 37 ° C. for 24 hours, and dot plot analysis of CD41 (+) and CD42b (+) was performed by flow cytometry. The obtained results are shown in FIG. In FIG. 24, the X axis indicates CD41, and the Y axis indicates CD42b. In FIG. 24, “fresh” indicates the result of analysis by flow cytometry without incubation of washed platelets.
  • S-45457 which is a compound according to the present invention, suppressed GPIb ⁇ (CD42b) shedding by ADAM17. Further, although it was inferior to S-45457, it was confirmed that S-45282, which is a compound according to the present invention, also has a high function-maintaining effect on human peripheral blood-derived platelets. Furthermore, it was confirmed that the effect of the p38 inhibitor was weak.
  • Test Example 14 Verification of concentration dependency of S-45457 in function maintenance effect on platelets derived from human peripheral blood
  • washed platelets were mixed with 100 ⁇ M CCCP, 50 ⁇ M GM6001, 0.5 to 50 ⁇ M S -45457 or DMSO was added, incubated at 37 ° C. for 24 hours, and dot plot analysis of CD41 (+) and CD42b (+) was performed by flow cytometry.
  • the function maintenance effect was investigated. The obtained results are shown in FIG. In FIG. 25, the X axis represents CD41, and the Y axis represents CD42b.
  • ACD was added to human peripheral blood obtained by blood collection, and the supernatant was collected by centrifugation at 900 rpm for 10 minutes without a brake.
  • 1 ⁇ M prostaglandin E1 (PGE1) was added to the obtained supernatant, and after centrifugation for 10 minutes at 1500 rpm without brake, the supernatant was removed.
  • the obtained precipitate was suspended in Tyrode HEPES Ca ( ⁇ ) buffer, 100 ⁇ M CCCP was added, and DMSO or 15 ⁇ M S-45457 was added at the same time, followed by incubation at 37 ° C. for 24 hours.
  • a mixture obtained by adding CCCP and DMSO and incubating was prepared as a negative control, and a sample prepared without adding anything and not subjected to incubation treatment was prepared as a positive control.
  • TMRE tetramethylrhodamine ethyl ester, perchloric acid
  • each platelet sample labeled with fluorescence is added to a whole blood sample of human peripheral blood collected by anticoagulation treatment with argatroban (antithrombin drug) so that the number is 10% of the whole blood platelets.
  • the blood sample prepared in this manner is injected at a constant wall shear rate (1500 S ⁇ 1 ) by a syringe pump (manufactured by Harvard Apparatus) into a chamber whose surface is coated with VWF.
  • Fluorescently-labeled platelets that adhere via VWF and form thrombus are visualized using an inverted stage epifluorescence video microscope system (DM IRB, manufactured by Leica), and the microscopic image is expressed by a photosensitive color CCD camera (L-600).
  • DM IRB inverted stage epifluorescence video microscope system
  • FIGS. 26 and 27 the vertical axis represents the average value
  • S-45457 represents the result in platelets prepared by adding 15 ⁇ M S-45457
  • DMSO represents the result in the negative control
  • Fresh indicates the result in a positive control (fresh platelets).
  • the horizontal axis in FIG. 26 indicates the measurement time (unit: minutes) after injection into the chamber.
  • the compound according to the present invention (S-45457) has a surface area coverage by platelets compared with the result of incubation with CCCP by adding DMSO as a negative control. The rate was large. However, it has been clarified that the compound according to the present invention suppresses GPIb ⁇ shedding by ADAM17, thereby allowing association of GPIb ⁇ and VWF and maintaining the adhesion ability of platelets.
  • the thrombus formation model used in this test example uses platelets such as laser irradiation and hematoporphyrin to generate reactive oxygen (ROS) locally in the blood vessel, thereby causing damage to the vascular endothelial cells. Adheres to blood vessels and induces thrombus formation.
  • the biomolecule imaging method used in this test example uses a high-speed laser confocal microscope and a multi-beam confocal unit to focus on a very narrow section parallel to the direction of blood flow and acquire high-speed images.
  • platelets to be injected into a thrombus formation model mouse were prepared. That is, ACD was added to human peripheral blood obtained by blood sampling to 10 v / v%, and the supernatant was collected by centrifugation at 900 rpm for 10 minutes without a brake. 1 ⁇ M PGE1 was added to the obtained supernatant, and after centrifugation at 1500 rpm for 10 minutes without brake, the supernatant was removed. The obtained precipitate was suspended in Tyrode HEPES Ca ( ⁇ ) buffer, 100 ⁇ M CCCP and DMSO or 15 ⁇ M S-45457 were added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • a sample obtained by adding CCCP and DMSO and incubating was prepared as a negative control, and a sample obtained by adding nothing and not performing the incubation treatment was prepared as a positive control.
  • the number of platelets in the precipitate was counted and suspended in 2 ml Tyrode HEPES Ca ( ⁇ ) buffer (containing 1 ⁇ M PGE1). Then, 5 ⁇ M TMRE was added to the suspension and incubated at room temperature for 15 minutes to fluorescently label platelets. Thereafter, Tyrode HEPES Ca (-) buffer solution was added, and the product was centrifuged for 8 minutes at 1500 rpm, without a brake, and washed.
  • NOG mice severe combined immunodeficiency mice
  • 2 Gy radiation treatment were anesthetized and a small incision was made in the abdominal wall to visually analyze microcirculation and thrombus formation in the mesentery I was able to do it.
  • FITC-dextran (20 mg / kg body weight) was injected into the tail vein of the NOG mice.
  • fluorescently labeled platelets as described above were injected into this NOG mouse so that the number of circulating platelets was 15% of this mouse.
  • hematoporphyrin (1.8 mg / kg body weight) was administered to the NOG mice to induce thrombus formation. It should be noted that by treating the mouse in this way, blood cell dynamics and thrombus formation will be visualized during laser irradiation and ROS production.
  • Such visualized images (sequential images) upon laser irradiation include a rotating disk confocal microscope (CSU-X1 manufactured by Yokogawa Electric Corporation) and an EM (Electron Multiplexing) -CCD camera (manufactured by iXon, Andor).
  • CSU-X1 rotating disk confocal microscope
  • EM Electro Multiplexing
  • CSU-X1 rotating disk confocal microscope
  • EM Electromography
  • S-45457 indicates thrombus formation in mice injected with platelets prepared by adding 15 ⁇ M S-45457
  • DMSO indicates the result of thrombus formation in the negative control
  • Fresh indicates the result of thrombus formation in the positive control.
  • a white arrow in FIG. 28, which is a representative example, indicates the direction of blood flow
  • a part indicated by a white triangle indicates a part where human-derived platelets adhere to a blood vessel
  • a scale bar indicates 10 ⁇ m.
  • the vertical axis in FIG. 29 is the ratio (%) of the number of human platelets to the total number of platelets involved in thrombus formation, and the value is the average of 20 + standard error.
  • the present invention it is possible to maintain the platelet function by specifically suppressing the metalloprotease activity of ADAM17 and suppressing the shedding of GPIb ⁇ . Therefore, the present invention maintains the function of platelets in reagents and blood products for efficient and large-scale production of functionally stable and highly safe platelets without the need for complicated operations, and its quality. It is useful as a pharmaceutical additive for stabilizing the drug.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　下記一般式（Ｉ）：［式中、Ｘは、フェニレン基； Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１； ｍは０～４のいずれかの整数； Ｒ１は、－ＮＲ５ＣＯＲ２、－ＮＲ５ＳＯ２Ｒ２、または－ＮＲ３Ｒ４； Ｒ２は、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、アリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基等； Ｒ３およびＲ４は、Ｃ１～Ｃ６アルキル基等； Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基等； Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］ で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。

Description

血小板の機能を維持するための組成物
　本発明は、Ｎ－ヒドロキシホルムアミド誘導体を利用した、血小板の機能を維持するための組成物、血小板を調製するための方法、血小板を含む血液製剤、並びに血液製剤における血小板の機能を維持するための方法に関する。
　白血病に代表される血液関連疾患の治療に対し、治療に必要な量の血球細胞を安定に増殖させて供給することは極めて重要なことであるため、これまでに多くの研究者によって、造血幹細胞又は造血前駆細胞を効率的に増殖させようとする試みがなされてきた。
　血球細胞の中で巨核球は、血小板前駆細胞、すなわち血小板を産生せしめる細胞でありｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ（胞体突起）構造を経て血小板を産生することが知られており、治療的な応用において重要な位置づけにある。血小板は血液凝固（止血）において必須であるため、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおける需要が極めて高い。
　血小板の生産においては、これまでドナーからの献血により採取する方法の他、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）を投与する方法の利用や、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球を分化させる方法の利用などが試みられてきた。最近では、造血前駆細胞を生体外において増殖させ、これらの前駆細胞から血小板を調製する方法なども試みられるようになった。例えば、本発明者らは、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から造血前駆細胞を内包するネット様構造物を調製し、このネット様構造物から比較的大量かつ効率的に血小板の産生を行う方法（特許文献１）や、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からインビトロの培養系により、成熟巨核細胞および血小板を効率的に調製する方法（特許文献２）等を報告している。
　このように、血小板自体を細胞外において調製する方法の研究は進展しているものの、調製された血小板の機能は安定性に乏しいことから、長期保存に耐えうる機能的血小板を大量に調製しうる方法の開発が必要とされている。
　血小板と細胞外マトリックスとの結合は、血液凝固（止血、血栓形成など）が誘導される上で重要な過程である。この過程は、血小板受容体ＧＰＩｂが、αサブユニット（ＧＰＩｂα）を介してフォン・ウィルブランド因子（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ：ＶＷＦ）と結合することよって、開始されると考えられている。しかしながら、３７℃付近の条件下においては、メタロプロテアーゼのＡＤＡＭ１７（ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ｄｏｍａｉｎ　１７）がＧＰＩｂαの細胞外領域をシェディング（Ｓｈｅｄｄｉｎｇ、切断して除去）してしまうことにより、ＧＰＩｂαとＶＷＦとの会合が阻害され、血小板の血液凝固機能が失われてしまうことが報告されている（非特許文献１及び非特許文献２）。
　このためインビトロにおいて調製した血小板の機能を保持するためには、少なくともＡＤＡＭ１７の活性を抑制する必要があることが予想される。実際、本発明者らによって、メタロプロテアーゼ活性を直接阻害する阻害剤（ＧＭ６００１等）、あるいは、ＡＤＡＭ１７等のメタロプロテアーゼ活性の活性化を間接的に阻害するｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を、タイミング良く添加することにより、インビトロにおいて調製した血小板の機能を保持することができることが報告されている（特許文献３）。
　しかしながら、ＧＭ６００１等の阻害剤はＡＤＡＭ１７のみならず、他のメタロプロテアーゼ（特に造血機能に必須なＭＭＰ９やＭＭＰ１４）の活性も阻害してしまうため、これら阻害剤を利用したインビトロでの血小板の調製においては、これら阻害剤を血小板産生が最も観察される一定時期に添加することが必要であった。一貫性及び再現性が乏しい細胞培養においてそのタイミングを見計らうといった煩雑な作業を要するため、これら阻害剤を利用した血小板の調製方法は、機能的血小板を大量に調製するという点、特に血小板産生系のプラント化においては、未だ十分なものではなかった。
　さらに、非選択的なメタロプロテアーゼ阻害剤は，膜型及び遊離型メタロプロテアーゼやＡＤＡＭ等、すべてのメタロプロテアーゼ活性を阻害してしまう為に、生体内部での使用によって、各種の副作用（臓器毎に作用する必須ＭＭＰあるいはＡＤＡＭを阻害する事による弊害）が発揮される危険性が生じると考えられている。実際に、非選択的なメタロプロテアーゼ阻害剤は、筋骨格シンドロームと呼ばれる重篤な副作用を引き起こすため、これら多くの阻害剤の開発は中止に至っている（非特許文献３）。また、ＧＭ６００１のようなヒドロキサム酸構造を有する阻害剤は、変異原性を有することが示唆されている（非特許文献４）。従って、かかる阻害剤を用いた方法によって得られた血小板は、安全性という点においても、未だ十分なものではなかった。
　一方、現在のところ、生体から調製した血小板を保存する方法としては、２０℃から２４℃において攪拌しながら保存する方法以外に有効な方法が存在しないことから、血小板の機能を保持するためにＡＤＡＭ１７のメタロプロテアーゼ活性を抑制する方法を利用する場合も、かかる室温（２０℃から２４℃）条件下において血小板の調製を行うことが有効であるとも考えられる。しかしながら、これまでのところ、室温条件下において、臍帯血又は骨髄細胞から巨核球に分化させることが可能であるかどうか、また、ＥＳ細胞等に由来する造血前駆細胞から血小板を産生させることが可能であるかどうかについては何ら検証がなされていない。
　以上のように、血小板の機能を維持するための組成物の有効成分として実用化可能な化合物は未だ見出されておらず、このため、機能的に安定した血小板をインビトロにおいて取得するための方法、特に安全性の高い血小板の大量生産に適した方法が確立されていないのが現状である。
国際公開２００８／０４１３７０号 国際公開２００９／１２２７４７号 国際公開２００９／１１９１０５号
Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、９５巻、６６０～６７０ページ Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、１０２巻、４２２９～４２３５ページ Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、２００６年、６９巻、６７７～６８７ページ Ｓｋｉｐｐｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、１９８０年、４０巻、４７０４～４７０８ページ
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＡＤＡＭ１７のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、ＧＰＩｂαのシェディングを抑制することによって、血小板の機能を維持することを可能とする化合物を同定することにある。さらなる本発明の目的は、同定した化合物を利用して血小板の機能を維持する組成物を提供すること、効率的に血小板を産生すること、および血液製剤の品質維持の向上を図ることにある。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等に由来する造血前駆細胞から巨核球への分化誘導や、該巨核球からの血小板産生は、２５℃の室温条件での培養では行うことができず、３７℃付近の培養条件が好ましいことを見出した。そこで、本発明者らは、次に、３７℃付近の培養において生じるＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを特異的に抑制しうる化合物の探索を行った。その結果、特定の構造を有するＮ－ヒドロキシホルムアミド誘導体が、ＡＤＡＭ１７に対して特異的な阻害作用を有し、血小板を産生させる培養系やヒト末梢血由来の血小板に添加した場合、ＧＰＩｂαのシェディングが抑制され、３７℃付近の温度条件下においても血小板の機能が維持されることを見出した。本発明者らは、同定したＮ－ヒドロキシホルムアミド誘導体のこのような作用から、当該誘導体が効率的な血小板の産生や血小板を含む血液製剤の品質維持の向上などにおいて極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）下記一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０～４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。
（２）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、または
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、（１）に記載の組成物。
（３）血小板の機能を維持するための試薬または血小板を含む血液製剤への添加剤である、（１）または（２）に記載の組成物。
（４）巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０～４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法。
（５）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、または
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、（４）に記載の方法。
（６）前記培養系における培養温度が３５～３８℃であることを特徴とする、（４）または（５）に記載の方法。
（７）巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０～４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加した培養物。
（８）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、または
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、（７）に記載の培養物。
（９）下記一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０～４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物が添加された、血小板を含む血液製剤。
（１０）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、または
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、（９）に記載の血液製剤。
（１１）下記一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０～４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法。
（１２）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、または
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
である、（１１）に記載の方法。
　本発明において見出されたＮ－ヒドロキシホルムアミド誘導体によれば、ＡＤＡＭ１７のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、ＧＰＩｂαのシェディングを抑制することによって、３７℃付近の温度条件下においても血小板の機能を維持することが可能である。従って、当該誘導体によれば、インビトロにおいて、機能的に安定した血小板を大量に生産することが可能であり、また、血小板を含む血液製剤の品質の安定化を図ることができる。
室温条件下における、ＥＳ細胞等由来の造血前駆細胞から巨核球／血小板への誘導方法を示す概略図である。 室温条件下での培養において、ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞から産生された巨核球数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。 室温条件下での培養において、ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞から産生された血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。 室温条件下での培養において、臍帯血由来のＣＤ３４(＋）細胞から産生された巨核球数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。 室温条件下での培養において、臍帯血由来のＣＤ３４(＋）細胞から産生された血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。 ＜プロトコール１＞は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の造血前駆細胞から巨核球／血小板への誘導する過程において、本発明にかかる化合物（Ｓ－４５２８２又はＳ－４５４５７）等を添加した時期を示す。＜プロトコール２＞は、ヒトの末梢血から洗浄血小板を調製し、本発明にかかる化合物（Ｓ－４５２８２又はＳ－４５４５７）等を添加したことを示す。 ＧＭ６００１又はＳ－４５２８２を２日間培養系に添加した際（２ｄａｙｓ）の、各化合物のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数（ＣＤ４１（＋））を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）およびＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（－）の割合（％）を表す。 ＧＭ６００１又はＳ－４５２８２を２日間培養系に添加した際（２ｄａｙｓ）に得られたＥＳ細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。 ＧＭ６００１又はＳ－４５２８２を８日間培養系に添加した際（８ｄａｙｓ）の、各化合物のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数（ＣＤ４１（＋））を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）およびＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（－）の割合（％）を表す。 ＧＭ６００１又はＳ－４５２８２を８日間培養系に添加した際（８ｄａｙｓ）に得られたＥＳ細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。 ＧＭ６００１、Ｓ－４５２８２、又はＳ－４５４５７を８日間培養系に添加した際に得られたＥＳ細胞由来血小板数（ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（＋）及びＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（－）の数）を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。 ＧＭ６００１、Ｓ－４５２８２、又はＳ－４５４５７を８日間培養系に添加した際の、各化合物のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数（ＣＤ４１（＋））を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（％）を表す。 ＧＭ６００１、又はＳ－４５４５７を８日間培養系に添加した際に得られたＥＳ細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。値は、平均値＋標準誤差（ｎ＝４）である。 Ｓ－４５４５７の濃度依存的なＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（％）を表す。値は、平均値＋標準誤差（ｎ＝４）である。＃（シャープ）は、ｐ＜０．１を示す。 ＧＭ６００１、又はＳ－４５４５７を８日間培養系に添加した際に得られたｉＰＳ細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。値は、平均値＋標準誤差（ｎ＝４）である。 Ｓ－４５４５７の濃度依存的なｉＰＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（％）を表す。＊（アスタリスク）、＊＊（アスタリスク２つ）は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１を示す。 Ｓ－４５４５７の濃度依存的な末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１．００とした時の、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（比率）を表す。値は、平均値＋標準誤差（ｎ＝４）である。＊＊（アスタリスク２つ）は、ｐ＜０．０１を示す。 Ｓ－４５４５７又はｐ３８阻害剤の末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すドットプロット図である。 ＧＭ６００１、Ｓ－４５４５７、又はｐ３８阻害剤の末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１．０とした時の、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（比率）を表す。値は、平均値＋標準誤差（ｎ＝４）である。 ＧＭ６００１、Ｓ－４５４５７、又はｐ３８阻害剤を８日間培養系に添加した際に得られたＥＳ細胞由来血小板の総数を示すグラフである。縦軸の単位は、細胞数／ｗｅｌｌである。 ＧＭ６００１、Ｓ－４５４５７、又はｐ３８阻害剤を８日間培養系に添加した際の、各化合物のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（％）を表す。 ＧＭ６００１、Ｓ－４５４５７、又はＳ－４５２８２の末梢血由来血小板に対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数を１００とした時の、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）の割合（％）を表す。 ＧＭ６００１、Ｓ－４５４５７、Ｓ－４５２８２、又はｐ３８阻害剤の末梢血由来ＰＲＰに対する機能維持効果について検証した結果を示すグラフである。縦軸は血小板総数（ＣＤ４１（＋））を１００とした時の、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（＋）及びＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ（－）の割合（％）を表す。 ＧＭ６００１、Ｓ－４５４５７、Ｓ－４５２８２、又はｐ３８阻害剤の末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すドットプロット図である。 Ｓ－４５４５７の濃度依存的な末梢血由来血小板に対する機能維持効果を示すドットプロット図である。 Ｓ－４５４５７を添加し調製した血小板の接着能を経時的に評価した結果を示すグラフである。 Ｓ－４５４５７を添加し調製した血小板の接着能を評価した結果を示すグラフである。 レーザー照射時（０秒）及びその２０秒後の、Ｓ－４５４５７を添加し調製した血小板を注入したマウスにおける血栓形成を示す顕微鏡写真である。 Ｓ－４５４５７を添加し調製した血小板の血栓形成への寄与を表すグラフである。縦軸は、各サンプルを輸血したマウスの腸間膜毛細血管に誘発した閉塞性血栓を観察し、血栓形成に関与した血小板の総数（マウス＋ヒト）に占めるヒト血小板の数の割合（％）である。値は２０血管の観察で得られた割合の平均値＋標準誤差である。
　本発明の組成物は、
下記一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
［式中、Ｘは、フェニレン基；
Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
ｍは０～４のいずれかの整数；
Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物である。
　前記一般式（Ｉ）で表される化合物における「Ｃ１～Ｃ６」、「Ｃ６～Ｃ１４」は、それぞれ、炭素数が１～６、６～１４の範囲内にあることを意味する。
　Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５およびＺにおける「置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基」の「Ｃ１～Ｃ６アルキル基」とは、直鎖または分岐状のＣ１～Ｃ６アルキル基を意味し、具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－アミル基、３－メチルブチル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基等が挙げられる。
　前記、「置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基」における置換基とは、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、カルボキシル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシカルボニル基等が挙げられる。これらは、全ての可能な位置で一個以上置換しうる。複数個置換する場合は、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよいし、同一の炭素原子に置換していてもよいし異なる炭素原子に置換していてもよい。
　「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を意味する。
　「Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基」とは、アルキル部分が、前記「Ｃ１～Ｃ６アルキル基」と同義であるアルコキシ基を意味し、たとえば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ－アミルオキシ基、３－メチルブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基などの直鎖または分岐状のアルコキシ基が挙げられる。
　「Ｃ１～Ｃ６アルコキシカルボニル基」とは、オキシカルボニル部分を除いたアルキル部分が直鎖または分岐状のＣ１～Ｃ６アルキル基であるものを意味し、たとえば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ－プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ－ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ｓｅｃ－ブトキシカルボニル基、ｎ－ペンチルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－アミルオキシカルボニル基、３－メチルブトキシカルボニル基、ネオペンチルオキシカルボニル基、ｎ－ヘキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
　Ｒ３およびＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって形成する「含窒素複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に少なくとも１個の窒素原子を含み、さらに酸素原子、硫黄原子および窒素原子から選ばれるヘテロ原子を１または２個含んでいてもよい５～７員の含窒素複素環が挙げられる。該含窒素複素環の好適な例としては、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環、ピロリジン環、イミダゾリジン環等が挙げられる。
　Ｒ２における「置換されていてもよいアリール基」の「アリール基」とは、芳香族炭素環を表わし、Ｃ６～Ｃ１４の芳香族炭素環が好ましく、たとえば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
　前記、「置換されていてもよいアリール基」における芳香環上の置換基とは、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル基、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、カルボキシル基、Ｃ１～Ｃ６アルコキシカルボニル基等が挙げられる。これらは、全ての可能な位置で一個以上置換しうる。複数個置換する場合は、それらの置換基は同一であっても異なっていてもよいし、同一の炭素原子に置換していてもよいし異なる炭素原子に置換していてもよい。ここで、「ハロゲン原子」、「置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基」、「Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基」および「Ｃ１～Ｃ６アルコキシカルボニル基」は前記と同じ意味を示す。
　Ｒ５における「Ｃ１～Ｃ６アルキルスルホニル基」とは、アルキル部分が、前記「Ｃ１～Ｃ６アルキル基」と同義であるアルキルスルホニル基を意味し、たとえば、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基などがあげられる。
　一般式（Ｉ）で表される化合物において、不斉炭素が存在する場合には、そのラセミ体、ジアステレオ異性体および個々の光学活性体のいずれも本発明に包含されるものであり、また幾何異性体が存在する場合には（Ｅ）体、（Ｚ）体およびその混合物のいずれも本発明に包含されるものである。
　一般式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、薬理学的に許容される塩であればとくに制限されず、たとえば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、有機酸との塩、無機酸との塩およびアミノ酸との塩等が挙げられる。無機塩基との塩の例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩等が挙げられる。有機塩基との塩の例としては、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、エタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジベンジルエタノールアミン塩等が挙げられる。有機酸との塩の例としては、ギ酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩、グリコール酸塩、フェニル酢酸塩、メタンスルホン酸塩等が挙げられる。無機酸との塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、硝酸塩等が挙げられる。また、アミノ酸との塩の例としては、グリシン塩、アラニン塩、アルギニン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等が挙げられる。
　一般式（Ｉ）で表される化合物はプロドラッグの形態をとり得る。プロドラッグの例としては、一般式（Ｉ）の化合物のカルボキシル基のメチルエステル、エチルエステル、アミノアルキルエステル誘導体、一般式（Ｉ）の化合物の水酸基およびアミン官能基のアセテート、ホルメート、およびベンゾエート誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、種々の方法で製造できるが、以下に示す製造方法により、効率よく製造することができる。なお、以下の製造方法において使用される「保護基」の具体例としては、ｔｅｒｔ－ブチル基、ベンジル基、ｏ－メチルベンジル基、ｐ－ニトロベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基、ｏ－クロロベンジル基、２，４－ジクロロベンジル基、ｐ－ブロモベンジル基、アリル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｏ－メチルベンジルオキシカルボニル基、ｐ－ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｏ－クロロベンジルオキシカルボニル基、２，４－ジクロロベンジルオキシカルボニル基、ｐ－ブロモベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基、トリエチルシリル基、トリメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、カルボニルの保護基（たとえば、エタンジオール、プロパンジオール、メルカプトエタノール、メルカプトプロパノール、エタンジチオール、プロパンジチオールなどによる保護基）等が挙げられる。
　前記一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば下記の工程１～工程２における反応により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（式中、Ｘ、ＹおよびＺは前記と同じ意味を示す。）。
　＜工程１＞
　工程１においては、ヒドロキシルアミンまたはその塩を化合物（II）に付加し、一般式（III）で表される化合物を製造する。この付加反応では、ヒドロキシルアミンが塩（塩酸塩や酢酸塩など）の場合、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどの無機塩基の存在下に行なわれる。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、水、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、１，４－ジオキサン、ジエチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。
　反応温度はとくに限定されず、通常、０～１００℃で行なわれ、反応時間は、２時間から１週間が好ましい。
　＜工程２＞
　工程２においては、工程１で得られた化合物（III）を、一般式（IV）で表される中間体と縮合し、一般式（Ｉ）で表される化合物を製造する。中間体（IV）は、ギ酸の混合酸無水物（ギ酸と酢酸の混合酸無水物など）、ギ酸ペンタフルオロフェニルまたはギ酸とカルボジイミド（ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドまたは水溶性カルボジイミド）から得られる活性中間体である。反応を円滑に行なうためにトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、ルチジン、コリジン、ジメチルアミノピリジンなどの有機塩基を共存させてもよい。これらの場合の幾つか（とくにカルボジイミドから活性中間体を得る場合）は１－ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび／または４－ジメチルアミノピリジンを加えることにより反応が促進される。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、シクロペンチルメチルエーテル、１，４－ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジンなどが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、０～１００℃で行なわれ、反応時間は、１～２４時間が好ましい。なお、本工程において、原料の化学的性質により、ヒドロキシルアミノ基の水酸基にもＣＨＯ基が付加する場合があるが、これは、酸性、塩基性または中性条件下において低級アルコールで処理することにより目的物である化合物（Ｉ）に変換できる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノールなどが好ましい。補助溶媒を使用してもよく、その場合使用する補助溶媒はとくに限定されない。
　Ｘ、Ｙ、およびＺの性質によっては、前記工程１～工程２の反応において事前に保護基を使用することおよび事後に保護基の除去を行なうことが必要であることは言うまでもない。保護されていない場合、次工程あるいは次次工程の収率が低下したり、中間体の取り扱いが困難な場合がある。
　前記化合物（II）は、以下に示すように、工程３～工程５により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは前記と同じ；Ｅは、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、ハロゲン原子、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシアミノ基などの脱離性官能基；Ｍ１は、Ｌｉ、ＣｅＣｌ２、ＮａＢＨ３、ＬｉＢＨ３、ＬｉＢＥｔ３、ＫＢＥｔ３、ＬｉＢ［ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５]３、ＫＢ[ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５]３、Ａｌ [ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５]２などを表す。Ｅｔはエチル基を表す。）。
　＜工程３＞
　工程３においては、一般式（Ｖ）で表される化合物を塩基によりアニオンにしたのち、一般式（VI）で表される化合物と反応させて化合物（VII）を製造する。使用する塩基としては、リチウムジイソプロピルアミド、リチウム（ビストリメチルシリル）アミド、リチウムテトラメチルピペラジド、ナトリウム（ビストリメチルシリル）アミド、カリウム（ビストリメチルシリル）アミド、ｎ－ブチルリチウム、ｓｅｃ－ブチルリチウム、ｔｅｒｔ－ブチルリチウム等が挙げられる。これらの塩基は、単独で用いるか、または場合によって２つ以上を組み合わせて使用する。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロピラン、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。
　反応温度は、通常－１００～４０℃で行なわれ、反応時間は、１～１２時間が好ましい。なお、この工程においては、化合物（VI）の化学的性質により化合物（II）が得られる場合があるが、本製造目的を斟酌すると問題にならない。
　＜工程４＞
　工程４においては、工程３で得られた化合物（VII）を一般式（VIII）で表される化合物と反応させ、一般式（IX）で表される化合物を製造する。反応溶媒としては、化合物（VIII）が水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素リチウムの場合には、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはそれらの混合溶媒などが好ましく、化合物（VIII）が前記２種以外の場合は、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロピラン、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。反応温度は、通常－１００～３０℃で行なわれ、反応時間は、１～１２時間が好ましい。
　なお、工程４の反応中あるいは反応後に、生成した化合物（IX）の水酸基が自然脱離し、一部あるいは全部が化合物（II）になる場合がある。一部の場合、それらを分離することなく工程５を行なうことができ、全部の場合、工程５を省略することができる。
　＜工程５＞
　工程５においては、工程４で得られた化合物（IX）を脱水反応により化合物（II）を製造する。脱水反応は、水酸基を活性化する試薬と有機塩基の組み合わせにより行なわれ、水酸基を活性化する試薬としては、塩化メタンスルホニル、塩化ｐ－トルエンスルホニル、塩化ベンゼンスルホニル、塩化メタンスルホニル、塩化チオニル、塩化スルフリル、五塩化リン等が挙げられる。有機塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン、ジアザビシクロノネン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、ルチジン、コリジン等が挙げられる。好適な組み合わせとして、塩化メタンスルホニルとトリエチルアミンがあげられる。また、別の脱水試薬として、トリフェニルホスフィン－ジエチルアゾジカルボキシラート、トリフェニルホスフィン－ジイソプロピルアゾカルボキシラート、トリｎ－ブチルホスフィン－ジエチルアゾジカルボキシラート、トリｎ－ブチルホスフィン－ジイソプロピルアゾカルボキシラート等が挙げられる。反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、クロロホルム、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、１，４－ジオキサン、ジメチルホルムアミドなどが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、０～１００℃で行なわれ、反応時間は、１～２４時間が好ましい。
　Ｘ，Ｙ、およびＺの性質によっては、前記工程３～工程５の反応において事前に保護基などを使用することおよび事後に保護基などの除去を行なうことが必要であることは言うまでもない。
　前記化合物（Ｖ）は、以下に示すように、工程６により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（式中、Ｚは前記と同じ；Ｊ１はハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基、ｐ－トルエンスルホニルオキシ基、ベンゼンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基または水酸基を表す。）。
　＜工程６＞
　工程６においては、一般式（Ｘ）で表される化合物またはその塩と一般式（XI）で表される化合物を無機塩基の存在下縮合させ、化合物（Ｖ）を製造する。好適な無機塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。ただし、Ｊ１が水酸基の場合は、一般式（Ｘ）で表される化合物またはその塩の水酸基を試薬により活性化し、一般式（XI）で表される化合物を縮合させ、化合物（Ｖ）を製造する。水酸基の活性化に適した試薬としては、アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）－トリフェニルホスフィン、アゾジカルボン酸ジイソプロピル－トリフェニルホスフィン、シアノメチレントリブチルホスホラン、シアノメチレントリメチルホスホラン、ブチルリチウム－クロロジフェニルホスフィン等が挙げられる。また、ブチルリチウム－クロロジフェニルホスフィンで活性化する場合は、２，６－ジメチル－１，４－ベンゾキノン、テトラフルオロ－１，４－ベンゾキノンなどのキノン類を添加する。
　反応溶媒としては、反応を著しく阻害しない溶媒であればとくに限定されないが、水、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、ジクロロメタン、１，４－ジオキサン、２－メトキシエタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドまたはそれらの混合溶媒などが好ましい。反応温度はとくに限定されず、通常、－８０～１２０℃で行なわれ、反応時間は、１～２４時間が好ましい。
　また、前記化合物（II）は、以下に示すように、工程７～工程１１によっても製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｅ、Ｍ1およびＪ1は前記と同じ、Ｐ１は水酸基の保護基を表す。）。
　＜工程７＞
　工程７においては、工程３と同様にして、一般式（XII）で表される化合物を塩基によりアニオンとした後、化合物（VI）と反応させて化合物（XIII）を製造する。
　＜工程８＞
　工程８においては、工程４と同様にして、一般式（XIII）で表される化合物を一般式（VIII）で表される化合物と反応させ、化合物（XIV）を製造する。
　ＸおよびＹの性質によっては、前記工程７～工程８の反応において事前に保護基などを使用することおよび事後に保護基などの除去を行うことが必要であることは言うまでもない。
　＜工程９＞
　工程９においては、工程５と同様にして、化合物（XIV）を脱水反応により化合物（XV）を製造する。
　なお、工程９において保護基Ｐ１が自然脱離し、一部あるいは全部が化合物（XVI）になる場合がある。一部の場合、それらを分離することなく工程１０を行なうことができ、全部の場合、工程１０を省略する事ができる。
　＜工程１０＞
　工程１０においては、一般式（XV）で表される化合物に使用されている保護基Ｐ１の種類にあわせて、公知の方法によりその脱保護を行い、一般式（XVI）で表される化合物を製造する。
　＜工程１１＞
　工程１１においては、工程６と同様にして、化合物（XVI）と一般式（X）で表される化合物またはその塩を縮合させ、化合物（II）を製造する。
　前述した方法で製造される本発明のＮ－ヒドロキシホルムアミド誘導体は遊離化合物、その塩、その水和物もしくはエタノール和物などの各種溶媒和物または結晶多形の物質として単離精製される。一般式（Ｉ）の化合物の薬理学的に許容される塩は常法の造塩反応により製造することができる。単離精製は抽出分別、結晶化、各種分画クロマトグラフィーなどの化学操作を適用して行なわれる。また、光学異性体は適当な原料化合物を選択することにより、またはラセミ化合物の光学分割により立体化学的に純粋な異性体として得ることができる。
　本発明の組成物は、前記化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物(以下、「前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等」とも称する）を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物である。本発明において「血小板の機能を維持する」とは、主として、血小板の止血や血栓形成といった血液凝固に関する機能を維持することを意味する。当該機能は、本発明の組成物により、ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディング（Ｓｈｅｄｄｉｎｇ、切断して除去）を抑制することによって達成することができる。
　「血小板の機能の維持」は、例えば、国際公開２００９／１１９１０５号や後述の試験例１５に記載されているような、フローチャンバーシステムを用いて血小板のＶＷＦに対する接着能を評価する方法、血小板減少マウスを用いて血小板の生体内寿命を評価する方法、トロンビン存在下フィブリノーゲンコートカバーグラス上の血小板の形状を観察する方法、あるいは、後述の試験例１６に記載したような、レーザー照射とヘマトポルフィリン等とを用いて血栓形成モデル動物を作製し、このモデル動物内における血小板の動態を単一レベルで観察する生体分子イメージング手法等を用いて、評価することができる。
　ＡＤＡＭ１７（ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ｄｏｍａｉｎ　１７）は、構造上ディスインテグリンドメインを有し、メタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質である。ＧＰＩｂα以外にも膜結合型のＴＮＦ－α（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ、腫瘍壊死因子－α）をシェディングし、遊離型のＴＮＦ－αを産生することから、ＴＡＣＥ（ＴＮＦ－ａｌｐｈａ　ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ、ＴＮＦ－α変換酵素）とも称されるタンパク質である。典型的には、ヒト由来のＡＤＡＭ１７として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿００３１７４．３（Ｎｏ．ＮＭ＿００３１８３．４）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　また、ＧＰＩｂα（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｂ　ａｌｐｈａ、糖タンパク質Ｉｂα）は、血小板の膜タンパク質であり、フォン・ウィルブランド因子（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ、ＶＷＦ）の受容体として機能している。また、ＧＰＩｂαはヒト体内において血小板のみに発現しているため、ＣＤ４２ｂ抗原とも称され、血小板の表面マーカーとしても用いられている。典型的には、ヒト由来のＧＰＩｂαとして、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＮＰ＿０００１６４．５（Ｎｏ．ＮＭ＿０００１７３．５）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。
　ＡＤＡＭ１７及びＧＰＩｂαの典型例としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている各々のＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅを例示したが、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明の組成物の作用機序に関わる、ＡＤＡＭ１７及びＧＰＩｂαには、このような天然の変異体も含まれることを理解されたい。
　本発明における「ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングの抑制」には、ＡＤＡＭ１７によるシェディングの完全な抑制（阻害）および部分的な抑制の双方が含まれる。また、後述の実施例において示すように、本発明の組成物の存在下における血小板総数に対するＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（＋）血小板数の割合を算出し、本発明の組成物の非存在下におけるその割合と比較して、大きい値である場合には、本発明の組成物がＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制すると評価することができる。本発明の組成物によるＧＰＩｂαのシェディングの抑制の程度としては、本発明の組成物の存在下におけるＣＤ４２ｂ（＋）血小板数の割合が８０％以上であることが好ましく、より大きいほどより好ましい（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上）。
　なお、本発明の組成物によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制する能力を、後述の試験例３において示す方法を用いて評価した場合には、５０％抑制濃度（ＩＣ50）が０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ～１００ｎｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
　本発明の組成物の有効成分たる前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物としては、例えば、Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジメチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－２－メトキシアセトアミド、
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシ－アミノ）エチル］ベンジル｝ベンズアミド、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－ヒドロキシ－Ｎ－［１－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）－２－（４－ペント－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ホルムアミド、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジメチルアミノフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（３－ジメチルアミノフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（２－ジメチルアミノフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ピペリジン－１－イルメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（３－ピペリジン－１－イルメチルフェニル）エチル］ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（３－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－｛４－［（エチルメチルアミノ）メチル］フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－（２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－｛３－［（エチルメチルアミノ）メチル］フェニル｝エチル）－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－Ｎ－メチルメタンスルホンアミド、
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－４－メチルベンゼンスルホンアミド、
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－４、Ｎ－ジメチルベンゼンスルホンアミド、
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－Ｎ－メチルスルホニルメタンスルホンアミド、
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－［４－（２－ジメチルアミノエチル）フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－［４－（２－モルホリン－４－イルエチル）フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－（２－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］フェニル｝エチル）メタンスルホンアミド、
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－［４－（３－ジメチルアミノプロピル）フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－［４－（３－ジエチルアミノプロピル）フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシ－ベンゼンスルホニル）－１－［４－（３－モルホリン－４－イルプロピル）フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－［４－（４－モルホリン－４－イルブチル）－フェニル］－エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、
　Ｎ－｛４－［１－（ホルミルヒドロキシアミノ）－２－（４－ペント－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、または、
　Ｎ－｛４－［１－（ホルミルヒドロキシアミノ）－２－（４－オクト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミドが挙げられる。後述の試験例４に示すように、ＡＤＡＭ１７に対して高い特異性を有するという観点から、Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、またはＮ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミドが好ましい。
　なお、Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミドは、後述の実施例における「Ｉ－１」又は「Ｓ－４５２８２」であり、Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミドは、後述の実施例における「Ｉ－４」又は「Ｓ－４５４５７」である。
　本発明の組成物の形態としては、例えば、研究開発目的（例えば、インビトロやインビボの研究開発）に用いられる試薬や医薬品添加剤が挙げられる。
　本発明の組成物は、ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制することにより血小板の機能を維持する作用を有するため、血小板の機能を維持するための試薬（例えば、巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に使用する試薬や生産した血小板に添加してその機能を維持するための試薬）や献血等用の血小板を含む血液製剤に添加される医薬品添加物として好適に用いることができる。本発明における組成物を上記添加物や試薬として用いる場合には、有効成分たる前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等の他に、例えば、安定化剤や溶剤等が含有されていてもよい。
　本発明の組成物の製品（例えば、試薬や医薬品添加物）またはその説明書は、血小板の機能を維持するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。血小板の機能を維持するために用いられる旨の表示においては、本発明の組成物の有効成分である前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等が血小板の機能を維持する効果を発揮するに至るまでの機序についての情報を含むことができる。機序としては、例えば、ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制することにより、血小板の機能を維持することに関する情報が挙げられる。また、血小板の機能を維持するために用いられる旨の表示においては、血小板の製造又は保存のため等に用いられること、に関する情報を含むことができる。
　前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等は、上記本発明の組成物を製造するための有効成分となる。従って、本発明は、上記本発明の組成物を製造するために用いられる、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等、および前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を用いることを特徴とする、上記本発明の組成物の製造方法をも提供するものである。
　また、本発明は、巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を添加した培養物を提供するものである。さらに、本発明は、巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法を提供するものである。
　本発明における「巨核球」は、血小板前駆細胞、巨核細胞とも称され、その細胞質を分離することにより、血小板を産生する細胞である。
　本発明において「巨核球に分化し得る細胞」は、巨核球に分化誘導することができる細胞であれば特に制限されることはなく、例えば、受精卵、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）といった万能幹細胞、造血幹細胞、造血前駆細胞、巨核芽球、脂肪細胞が挙げられる。造血幹細胞や造血前駆細胞は、骨髄や臍帯血等から採取されるものであってもよい。さらに、これらの中では、胚を壊すことがないため倫理的な問題がなく、本発明によって調製された血小板を輸血する患者とヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）の型を適合させ易いという観点から、ｉＰＳ細胞が好ましい。また、ｉＰＳ細胞の培養を開始してから２５～３５日まで、ｉＰＳ細胞由来の巨核球は増加し続けることが可能であり、かかる巨核球から産生される血小板数も、３因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）を用いて樹立したｉＰＳ細胞と比較して、２～１０倍になるという観点から、４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ）を用いて樹立したｉＰＳ細胞がより好ましい。なお、かかる巨核球及び血小板産生数の増加は、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子の再活性化によって引き起こされるということは本発明者等によって確認されている。
　さらに、本発明の方法に用いる上記細胞が由来する動物種としては特に制限はなく、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジなどが挙げられるが、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはマウス又はヒトであり、特に好ましくは、ヒトである。
　本発明において「巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系」としては、例えば、血小板に至る途中の段階で胚様体（分化誘導した中胚葉系未分化細胞を含む細胞集団）を形成させる培養系（Ｅｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００２年、９９巻、１２８１９－１２８２４ページ等）、造血前駆細胞を内包するネット様構造物（ｓａｃ構造体）を形成させる培養系（特許文献１～３等参照）、臍帯血由来の造血前駆細胞から血小板を産生させる培養系（Ｒｏｂｅｒｔら、「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｂａｌｐｈａ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｌａｔｅｌｅｔｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ．」、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０１０年５月２６日オンライン版等参照）等を挙げることができる（その他、Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、１０２巻、４０４４－４０５１ページ：Ｈｉｒｏｙａｍａら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２００６年、３４巻、７６０－７６９ページ：Ｇａｕｒら、Ｊ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔ．、２００５年、４巻、４３６－４４２ページ等参照）。これらの中では、ネット様構造物内に造血前駆細胞が濃縮されて存在しており、生体外において効率的に巨核球や血小板等を産生させることができるため、ネット様構造物を形成させる培養系が好ましい。
　本発明にかかる培養系の培養条件としては、巨核球の培養および血小板の産生に適した条件であれば特に制限はないが、培養温度としては、３５～３８℃であることが好ましく、より好ましくは３７℃である。前記培養温度が前記下限未満であると、巨核球や血小板の産生数が少なくなる傾向にあり、前記上限を超えると細胞の培養や維持が困難となる傾向にある。
　さらに、本発明にかかる「巨核球に分化し得る細胞」を培養する際（特に、巨核球を分化誘導する過程において）、フィーダー細胞と共培養することが好ましい。ここで使用する「フィーダー細胞」としては、「巨核球に分化し得る細胞」の分化誘導に寄与するものであれば特に制限はないが、例えば、マウス胚線維芽細胞、好ましくは、１０Ｔ１／２細胞株、ＯＰ９細胞などを用いることができる。不死化した株化細胞以外の細胞としては、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ヒト骨髄から直接調製し培養して得た細胞）を挙げることができ、当該間葉系幹細胞をフィーダー細胞として用いた場合でも、ヒトＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からの巨核球成熟および血小板産生が可能である。マトリゲルなどの細胞外基質上で培養した場合でも、効率は下がるが、血小板を誘導することが可能である。「フィーダー細胞」を用いる際には、放射線を照射するなどして、細胞の増殖を抑止することが好ましい。
　前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等の前記培養系への添加量（濃度）は、０．０１～１００μＭであることが好ましい。前記添加量が前記下限未満であると血小板におけるＧＰＩｂαの切断の抑制が困難になる傾向にあり、前記上限を超えると細胞の増殖を抑制する傾向にある。また、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を前記培養系に添加する時期としては、血液細胞分化の不均一性の状況下にも関わらず培養過程における均一性の確保、均質な製品の確保を行う観点から、造血前駆細胞から血小板の産生に至る全期間であることが好ましく、巨核球から血小板の産生に至る期間に限定されないという点で、ＧＭ６００１とは大きく異なる。
　以下に、本発明の培養系に好適に用いられるネット様構造物を形成させる方法を一例として、本発明の血小板を調製するための方法をより具体的に説明する。
　先ず、ネット様構造物（ｓａｃ構造体）を形成させる方法について説明する。ネット様構造物を調製するために適した培養条件は、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。さらに、ネット様構造物を効率的に形成させるために、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を０～１００ｎｇ／ｍｌ、０～３００ｎｇ／ｍｌ程度、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ程度加えるのがよい。培養の環境としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、好ましくは、５％ＣＯ２、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、フィーダー細胞上に播いてから、１５日目（１４～１６日後）くらいにその存在を確認することができる。
　形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、内部には、造血前駆細胞、特にＣＤ３４陽性の細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する造血前駆細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。
　次に、ネット様構造物から分離した造血前駆細胞から血小板を調製する方法について説明する。分離して得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、巨核球及び血小板を産生させるのに適した条件で培養を行う。ここで「巨核球及び血小板を産生させるのに適した条件」とは、例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ程度）の存在下で、又は幹細胞因子（ＳＣＦ、１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ程度）、ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ、１０～１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは２５Ｕ／ｍｌ程度）及びＴＰＯ（１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ程度）の存在下で、７～１５日間程度培養することが挙げられる。培養環境としては、好ましくは、５％ＣＯ２、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
　また、かかる培養系において、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等をこの培養系に添加する時期としては、造血前駆細胞をフィーダー細胞上にまき直す際に添加することが好ましく、培養開始後２２日目（２０日～２３日目、ネット様構造物のまき直しから６日～１０目目）頃に前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を添加することがより好ましい。
　さらに、本発明の方法においては、巨核球から放出された血小板が豊富に存在する培養液の画分（例えば、ネット様構造物を形成させる方法においては、ヒトｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞の培養後２２～２８日目程度の画分）を回収し、白血球除去フィルター（例えば、テルモ社、旭化成メディカル社などから購入可能）などを使用して血小板以外の成分（巨核球、その他の血液細胞）の除去を行うことにより、血小板を調製することができる。
　前述の通り、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等は、ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制し、血小板の機能を維持する作用を有する。従って、本発明は、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等が添加された血小板を含む血液製剤、並びに、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法をも提供するものである。
　また、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等は、血小板を含む血液製剤を製造するための有効成分となる。従って、本発明は、上記本発明の血液製剤を製造するために用いられる医薬品添加物として、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等をも提供するものである。
　本発明における血液製剤に含まれる血小板としては特に制限されることはなく、前述の本発明の血小板を調製するための方法によって得られた血小板であってもよく、また採血によって得られた末梢血等由来の血小板であってもよい。血液製剤を調製するにあたっては、血小板が保存に対して不安定であることなどを考慮して、血小板の安定化に資する他の成分を含有せしめることもできる。血小板を安定化させる条件は、当該技術分野の専門家において周知の方法を選択することが可能である。例えば、血小板の機能を保持するために必要な溶液中（例えば、ＡＣＤ－Ａ液（クエン酸ナトリウム／クエン酸／ブドウ糖から調製される液）など、場合によっては、新鮮凍結血漿などを適宜添加する）に、適当な濃度（例えば、１×１０８～１×１０１０血小板／ｍＬ程度、好ましくは、１×１０９血小板／ｍＬ程度）で懸濁し製剤化することができる。なお、血小板を含む製剤を収納する容器は、ガラスのように血小板を活性化する材質のものを避けることが好ましい。前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物等の添加量（濃度）は、０.０１～１００μｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。前記添加量が前記下限未満であると血小板は接着機能を保持できないとする傾向にあり、前記上限を超えると最大効果となる。
　以下、実施例及び試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、後述する試験例において用いた巨核球や血小板の産生、並びにこれらの解析は下記に示す方法を用いて行った。
　＜ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、及びフィーダー細胞の調製＞
　ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳ　ｃｅｌｌｓ）は、京都大学再医科学研究所が樹立し、同研究所から供与されたＫｈＥＳ細胞株（ＫｈＥＳ－３）を用いた。
　また、ヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳ　ｃｅｌｌｓ）は、東京大学でヒト由来の皮膚細胞にＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃを導入して樹立したｉＰＳ細胞株（ＴｋＤＡ３－４）を、０．１ｍＭ　非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。そして、ＴｋＤＡ３－４細胞を、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、２０％　ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、及び５ｎｇ／ｍｌ　塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を添加したダルベッコ変法イーグル培地とハムＦ－１２培地(ＳＩＧＭＡ社製）との混合培地（混合比率１：１）中、放射線照射したマウス線維芽細胞上で培養し、３日毎に継代して、未分化状態を維持したものを使用した。
　さらに、理研バイオリソースセンターから購入したマウス胎児由来の線維芽細胞　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株（以下、「１０Ｔ１／２細胞」とも称する）を１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミンを添加したイーグル基礎培地（ＢＭＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養した。そして、細胞数８×１０６個／１０ｃｍディッシュになるように調整した１０Ｔ１／２細胞に５０Ｇｙの放射線照射を行ったものをフィーダー細胞として用いた。
　＜巨核球及び血小板の産生、並びにこれらの解析＞
　前記フィーダー細胞上に、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞を細胞数５×１０４～１×１０５個／１０ｃｍディッシュになるように播き、１５％　ＦＢＳ（製品名：ＣＥＬＬｅｃｔ（ＴＭ）　ＧＯＬＤ、ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ　インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ　ヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ　亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．４５ｍＭ　α－モノチオグリセロール（ＭＴＧ、Ｓｉｇｍａ社製）、２０ｎｇ／ｍｌ　血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社製）中で培養した。また、この培養はＣＯ２インキュベーター（製品名：ＨＥＲＡ　ＣＥＬＬ　１５０ｉ、Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２（大気酸素）下で実施した。そして、３日毎に培地交換を行い、内部に造血前駆細胞を含んだｓａｃ構造体（ネット様構造物）が多数確認される１５日目まで、かかる条件で培養した。
　次に、ｓａｃ構造体をディッシュから剥がして破砕し、３％　ＦＢＳを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した後、４０μｍセルストレイナー（ＢＤ社製）を通過させた。通過した溶液を４４０×ｇ、１０分間遠心分離して造血前駆細胞を回収し、細胞数をカウントした。新たに、６ウェル（ｗｅｌｌ）プレートに用意した５０Ｇｙ放射線照射済みの１０Ｔ１／２細胞（６×１０５個／６ウェルプレート１枚）上に造血前駆細胞を２～３×１０４個／ウェルで播き、１５％　ＦＢＳ（製品名：ＣＥＬＬｅｃｔ（ＴＭ）　ＧＯＬＤ、ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ　インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ　トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ　亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、０．４５ｍＭ　ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、１００ｎｇ／ｍｌ　ヒトトロンボポイエチン（ヒトＴＰＯ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）、５０ｎｇ／ｍｌ　ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）及び２５Ｕ／ｍｌ　ヘパリンを添加したＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社製）中でさらに８日間培養し、巨核球／血小板を誘導した。
　そして、誘導した巨核球／血小板を抗凝固剤液（Ａｃｉｄ　Ｃｉｔｒａｔｅ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ、ＡＣＤ）にて回収した後、ブレーキ無し、９００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心して得られた上清を更にブレーキ無し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除去した。そして、このようにして得られた沈殿物における巨核球や血小板の数は、抗体で染色し、フローサイトメトリーにて解析した。
　なお、フローサイトメトリーはＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のＦＡＣＳ　Ａｒｉａを用い、巨核球や血小板を染色するために用いた抗体として、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）修飾抗ヒトＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ）抗体、ＰＥ修飾抗ヒトＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）抗体、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ４１ａ（インテグリンαＩＩｂｂｅｔａ３複合体、ＨＩＰ８　ｃｌｏｎｅ）抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。また、巨核球や血小板の絶対数を正確に測定するために、細胞をこれらの抗体によって染色し、ＴｒｕＣｏｕｎｔビーズ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）も用いて、フローサイトメトリーにて解析を行った。
　（試験例１）　室温条件下におけるＥＳ細胞由来の造血前駆細胞から巨核球／血小板への誘導
　室温条件下での培養（２５℃での培養）によって、巨核球／血小板の誘導が可能であるかどうかを調べるため、前述の通りにして得られたＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を、図１に示した条件にて巨核球／血小板の誘導を試みた。すなわち、造血前駆細胞を巨核球／血小板に誘導する前述の８日間の培養過程において、
コントロール：３７℃で８日間培養
２日間の室温培養：３７℃で６日間培養した後、２５℃で２日間培養、
室温培養：２５℃で８日間培養、
という条件下で各々培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて巨核球及び血小板の数を測定した。得られた結果は図２及び図３に示す。
　図２及び図３に示した結果から明らかなように、２５℃で８日間培養したものに関しては、殆ど巨核球も血小板も得ることはできなかった。また、フローサイトメトリー解析の２日前から２５℃において培養したものは、巨核球及び血小板を得ることはできたものの、コントロールの半分程度の量しかなかった。
　（試験例２）　室温条件下における臍帯血由来ＣＤ３４(＋）細胞から巨核球／血小板への誘導
　室温条件下での培養（２４～２５℃での培養）で、臍帯血由来ＣＤ３４(＋）細胞から血小板の誘導が可能であるかどうかを調べた。
　先ず、臍帯血（ＣＢ）からビーズカラムを用いて１０６個のＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３４＋細胞の選別及び単離を行った。得られた臍帯血由来ＣＤ３４（＋）細胞４×１０４個を、前記フィーダー細胞上に播き、ｍｅｄｉｕｍ　Ａ（１５％　ＦＢＳ（製品名：ＣＥＬＬｅｃｔ（ＴＭ）　ＧＯＬＤ、ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩＴＳサプリメント（１０μｇ／ｍｌ　インスリン、５．５ｍｇ／ｍｌ　トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ　亜セレン酸ナトリウム）（Ｓｉｇｍａ社製）、５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、０．４５ｍＭ　ＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、及びサイトカインカクテル（２ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）、７．５ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ社製）、１１ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ－３）を添加したＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社製））中で４日間培養した。培養４日目にｍｅｄｉｕｍ　Ａと同じ量のｍｅｄｉｕｍ　Ｂを臍帯血由来ＣＤ３４（＋）細胞に追加した。なお、ｍｅｄｉｕｍ　Ｂはｍｅｄｉｕｍ　Ａと異なり、サイトカインカクテルとして、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ、１ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、７．５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－６及び１３．５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－９が添加されている。また、ｍｅｄｉｕｍ　Ａとｍｅｄｉｕｍ　Ｂとは添加しているサイトカインカクテルが異なる以外は同じ組成である。
　そして、このようにして培養した７日目の臍帯血由来ＣＤ３４（＋）細胞をｍｅｄｉｕｍ　Ｂで４×１０５個／ｍＬになるように調整して、更に７日間３７℃で培養（コントロール）又は更に７日間２４～２５℃で培養（室温培養）し、培養１４日目にフローサイトメトリーにて巨核球及び血小板の数を測定した。得られた結果を図４及び図５に示す。
　図４及び図５に示した結果から明らかなように、約２５℃で７日間培養したものに関しては、先に示したＥＳ細胞由来の造血前駆細胞と同じく、殆ど巨核球も血小板も得ることはできなかった。従って、試験例１及び試験例２において示した結果から、ＥＳ細胞や臍帯血由来ＣＤ３４（＋）細胞等の巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系において、培養温度が３７℃付近であることが好ましく、２５℃付近の室温条件下の培養では巨核球及び血小板を産生させることができないことが明らかになった。
　しかしながら、かかる血小板を産生させる培養系において培養温度を３７℃付近にしてしまうと、血小板表面上にあり、血液凝固において重要な因子であるＧＰＩｂαがＡＤＡＭ１７によりシェディングされてしまうため、止血機能を発揮しない血小板が得られにくいという問題がある。また、ＡＤＡＭ１７を含むメタロプロテアーゼを対象とした阻害剤（例えば、ＧＭ６００１）を培養系に添加してＧＰＩｂαのシェディングを抑制することもできるが、かかる場合においては造血機能に必須であるＡＤＡＭ１７以外のメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１４）をも阻害してしまうため、血小板産生が最も観察される一定時期のみに添加する必要性があり、血小板を産生させる培養系のプラント化等を実施する際には好ましくない。さらに、ＧＭ６００１のような非特異的メタロプロテアーゼ阻害剤は、生体に投与すると安全性の面で懸念があるために、かかる阻害剤が混入している血小板を血液製剤として用いることも好ましくない。
　そこで、下記実施例において示す、ＡＤＡＭ１７を特異的に阻害する化合物を設計、合成した。なお、以下に示す１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、重クロロホルム（ＣＤＣｌ３）または重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）を溶媒とし、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として、ＥＣＡ４００型スペクトルメーター（４００ＭＨｚ、日本電子株式会社製）で測定したものである。化学シフトの測定結果は、δ値をｐｐｍで示し、結合定数のＪ値をＨｚで示した。略号のｓはｓｉｎｇｌｅｔ、ｄはｄｏｕｂｌｅｔ、ｔはｔｒｉｐｌｅｔ、ｑはｑｕａｒｔｅｔ、ｄｄはｄｏｕｂｌｅｔ　ｄｏｕｂｌｅｔ、ｍはｍｕｌｔｉｐｌｅｔ、ｂｒはｂｒｏａｄを意味する。低分解能質量スペクトル（高速原子衝撃法：ＦＡＢ－ＭＳ）測定には、日本電子ＪＭＳ－ＨＸ－１１０Ａ型を、質量スペクトル（エレクトロスプレーイオン化法：ＥＳＩ-ＭＳ）測定には、サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）のＥｘａｃｔｉｖｅをそれぞれ使用した。
　（実施例１）
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（I－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　（１－１）：１－ブト－２－イニルオキシ－４－メタンスルホニルベンゼン（Ｖ－１）
　１－ブロモ－２－ブチン２．１２ｇ（１５．９ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド溶液（３０ｍＬ）に４－メチルスルホニルフェノール２．８８ｇ（１５．９ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた後、炭酸カリウム２．６４ｇ（１９．１ｍｍｏｌ）を加えた。６時間撹拌した後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。１－ブト－２－イニルオキシ－４－メタンスルホニルベンゼン（Ｖ－１）３．３９ｇ（１５．１１ｍｍｏｌ）を粗精製物として得た（収率９５％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 225 (M+H)+.
1H-NMR(CDCl3):δ 7.88(2H, m), 7.10(2H, m),
4.73(2H, m), 3.04(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（１－２）：｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）アセチル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステル（VII－１）
　前記（１－１）で得た化合物（Ｖ－１）１．３６ｇ（６．０８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（７０ｍＬ）溶液に、アルゴン雰囲気下－７８℃でリチウムジイソプロピルアミドの２．０Ｍヘキサン－ヘプタン－エチルベンゼン溶液３．６５ｍＬ（７．２９ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した後、リチウムヘキサメチルジシラジドの１．０Ｍ－テトラヒドロフラン溶液１２．１６ｍＬ（１２．１６ｍｍｏｌ）と、４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノメチル）安息香酸メチル（VI－１）１．６１ｇ（６．０８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液５ｍＬを加えた。－７８℃にて５分間撹拌した後、徐々に室温まで昇温し、１時間撹拌した。飽和食塩水を加えた後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１）にて精製し、｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）アセチル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステル（VII－１）２．０２ｇ（４．４１ｍｍｏｌ）を無色飴状物質として得た（収率７２％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 480 (M+Na)+.
1H-NMR (CDCl3)
: δ 7.93(2H, br d, J
= 8.2 Hz), 7.81(2H, m), 7.40(2H, br d, J = 8.2 Hz), 7.07 (2H, m), 4.72(2H, m),
4.70(2H, s), 4.39(2H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.57(9H, s).。
　（１－３）：｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－ヒドロキシエチル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステル（IX－１）
　前記（１－２）で得た化合物（VII－１）２．０２ｇ（４．４１ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）溶液に、０℃で水素化ホウ素ナトリウム１６７ｍｇ（４．４１ｍｍｏｌ）を加えた。２時間３０分間撹拌した後、飽和食塩水と飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた。メタノールを減圧下留去した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－ヒドロキシエチル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステル（IX－１）２．０４ｇ（４．４１ｍｍｏｌ）を無定形状固体の粗精製物として得た（収率９９％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 482 (M+Na)+.。
　（１－４）：｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステル（II－１ａ）
　前記（１－３）で得た化合物（IX－１）２．０４ｇ（４．４１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン３．１ｍＬ（２２．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４５ｍＬ）溶液に０℃で塩化メタンスルホニル０．７ｍＬ（８．８ｍｍｏｌ）を加えた。３時間３０分間撹拌した後、飽和食塩水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：酢酸エチル＝３：１）で精製し、｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル｝カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステル（II－１ａ）１．７７ｇ（４．００ｍｍｏｌ）を無色無定形状固体として得た（収率９１％）。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.87(2H, d, J
= 8.7 Hz), 7.61(1H, d, J = 15 Hz), 7.43(2H, J = 8.2 Hz), 7.30(2H, d, J = 8.2
Hz), 7.10(2H, d, J = 8.7 Hz), 6.82 (1H, d, J = 15 Hz), 4.88(1H, m), 4.71(2H,
m), 4.33(2H, m), 1.86(3H, m), 1.45(9H, s).。
　（１－５）：４－［（Ｅ）－２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジルアミン塩酸塩（II－１ｂ）
　前記（１－４）で得た化合物（II－１ａ）２９５ｍｇ（０．６７ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液に、０℃で４Ｍ－塩酸／ジオキサン２ｍＬを加えて１０分間撹拌した後、室温まで昇温し、２時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、メタノール２０ｍＬを加えて再び、溶媒を減圧下留去し、４－［（Ｅ）－２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジルアミン塩酸塩（II－１ｂ）を無色固体として得た。物性値を以下に示す。
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 7.85(2H, d, J
= 8.7 Hz), 7.78(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.52(2H,d, J = 8.2 Hz), 7.20(2H, d, J = 8.7
Hz), 4.87(2H, m), 4.05(2H, m), 1.83(3H, m).。
　（１－６）：｛４－［（Ｅ）－２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル｝ジエチルアミン（II－１ｃ）
　前記（１－５）で得た化合物（II－１ｂ）のメタノール（６ｍＬ）溶液に、０℃でアセトアルデヒド１ｍＬ、トリアセトキシヒドロほう酸ナトリウム２１２ｍｇ（１．００ｍｍｏｌ）および酢酸３滴をそれぞれ加えた後、室温にて１時間３０分間撹拌した。飽和食塩水と飽和重曹水を加えた後、溶媒を減圧下留去した。クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１→１０：１）にて精製し、｛４－［（Ｅ）－２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル｝ジエチルアミン（II－１ｃ）１１１．７ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）を淡黄色無定形状固体として得た（２段階収率４２％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 398 (M+H)+.。
　（１－７）：Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］ヒドロキシルアミン（III－１）
　前記（１－６）で得た化合物（II－１ｃ）１０８ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（８ｍＬ）溶液に、５０％ヒドロキシルアミン溶液（３ｍＬ）を加え、室温にて２５時間攪拌した。反応溶液を減圧下留去した後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシ－ベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］ヒドロキシルアミン（III－１）９２．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）を淡黄色無定形状固体として得た（収率８１％）。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.84(2H, m),
7.27(2H, m), 7.20(2H, m), 7.07(2H, m), 4.72(2H, m), 3.75(1H, m), 3.51(2H, s),
3.33(1H, m), 2.49(4H, m), 1.87(3H, s), 1.03(6H, m).。
　（１－８）：Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－１）
　ギ酸１ｍＬを０℃に冷却し、無水酢酸０．３ｍＬを滴下した後、３０分間撹拌することでギ酸―酢酸の混合酸無水物溶液を調製した。前記（１－７）で得た化合物（III－１）９２ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（３ｍＬ）溶液に、０℃で、先に調製したギ酸―酢酸の混合酸無水物溶液０．６ｍＬを加え、室温で４時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮した後、トルエンで共沸した。得られた油状物をクロロホルム２ｍＬおよびメタノール１０ｍＬに溶解し、１２時間撹拌した。この溶液を減圧濃縮し、得られた油状物をクロロホルムに溶解し、飽和重曹水を加えて中和した。クロロホルムで抽出した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９５：５→７５：２５）により精製し、Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－１）５３．９ｍｇ（０．１１ｍｍｏｌ）を淡黄色無定形状固体として得た（収率５２％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 459(M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.32(0.6H, s),
8.10(0.4H, s), 7.80-7.86(2H, m), 7.21-7.30(4H, m), 7.06-7.14(2H, m), 5.65(0.6H,
m), 5.36(0.4H, m), 4.74(2H, br s), 4.20(0.4H, m), 4.05(0.6H, br t, J = 13 Hz),
3.48-3.57(3H, m), 2.46(4H, m), 1.87(3H, br s), 0.99(6H, m).。
　（実施例２）
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジメチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　実施例１と同様の操作により、上記の化合物（Ｉ－２）を得た。
MS
(FAB) m/z : 431 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.28(0.6H, s),
8.14(0.4H, s), 7.79-7.91(2H, m), 7.04-7.32(6H, m), 5.69(0.6H, m), 5.35(0.4H,
m), 4.74(2H, br s), 4.18(0.4H, m), 4.07(0.6H, m), 3.47(1H, m), 3.33(2H, m),
2.11(6H, s), 1.87(3H, s).。
　（実施例３）
Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－２－メトキシアセトアミド（Ｉ－３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　（３－１）：Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル｝－２－メトキシアセトアミド（II－３）
　前記実施例１（１－５）で得た化合物（II－１ｂ）２８３ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（５ｍＬ）に、室温でメトキシアセチルクロリド０．２ｍＬ（１．８５ｍｍｏｌ）を滴下した。２日後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１→１０：１）にて精製し、化合物（II－３）２９６ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ）を淡黄色固体として得た（収率９４％）。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 414 (M+H)+.。
　（３－２）：Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－２－メトキシ－アセトアミド（Ｉ－３）
　前記（３－１）で得た化合物（II－３）を用い、前記実施例１と同様な方法（１－７および１－８）により、Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－２－メトキシアセトアミド（Ｉ－３）を得た。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.32(0.6H, s),
8.09(0.4H, s), 7.77-7.88(2H, m), 7.20-7.31(4H, m), 7.06-7.16(2H, m), 5.65(0.6H,
m), 5.37(0.4H, m), 4.75(2H, br s), 4.39-4.47(2H, m), 4.16(0.4H, m), 4.03(0.6H,
br t), 3.93(0.8H, br s), 3.90(1.2H, br s), 3.46(1H, m), 3.40(3H, br s),
1.87(3H, br s).。
　（実施例４）
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド（Ｉ－４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　実施例３と同様の操作により、上記の化合物（Ｉ－４）を得た。
MS
(FAB) m/z : 481 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.42(0.6H, s),
7.87(0.4H, s), 7.78-7.88(2H, m), 7.30-7.35(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.65(0.6H,
m), 5.39(0.4H, m), 4.75(2H, m), 4.28(2H, m), 4.15(0.4H, m), 4.00(0.6H, br t, J
= 12 Hz), 3.45(1H, m), 2.91(1.2H, s), 2.89(1.8H, s), 1.87(3H, m).。
　（実施例５）
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝ベンズアミド（Ｉ－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　実施例３と同様の操作により、上記の化合物（Ｉ－５）を得た。
MS
(FAB) m/z : 507 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.31(0.6H, s),
8.08(0.4H, s), 7.73-7.87(4H, m), 7.51(1H, m), 7.42(2H m), 7.27-7.33(3H, m),
7.07-7.14(2H, m), 5.65(0.6H, m), 5.37(0.4H, m), 4.73(2H, m), 4.54-4.62(2H, m),
4.15(0.4H, m), 4.00(0.6H, m), 3.45(1H, m), 1.86(3H, br s).。
　（実施例６）
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　（６－１）：ｔｅｒｔ－ブチル－（４－メタンスルホニルフェノキシ）ジメチルシラン（XII－６）
　４－メチルスルホニルフェノール１０ｇ（５８．０７ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１５０ｍＬ）にイミダゾール９．９ｇ（１４５．１８ｍｍｏｌ）を加えて溶解させた後、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルクロロシラン１０．５ｇ（６９．７ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。反応終了後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で３回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１→３：１）にて精製し、ｔｅｒｔ－ブチル－（４－メタンスルホニルフェノキシ）ジメチルシラン（XII－６）１５．９７ｇ（５５．７５ｍｍｏｌ）を得た（収率９６％）。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.83(1H, m),
7.81(1H, m), 6.97(1H, m), 6.95(1H, m), 3.04(1H, s), 1.56(9H, s), 0.25(6H, s).。
　（６－２）：　２－［４－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシラニロキシ）ベンゼンスルホニル］－１－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エタノン（XIII－６）
　前記（６－１）で得たｔｅｒｔ－ブチル－（４－メタンスルホニルフェノキシ）ジメチルシラン（XII－６）２．０ｇ（６．９８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液に、アルゴン雰囲気下－７８℃でリチウムジイソプロピルアミドの２．０Ｍヘキサン－ヘプタン－エチルベンゼン溶液４．１９ｍＬ（８．３７ｍｍｏｌ）を加え、リチウムヘキサメチルジシラジドの１．０Ｍ－テトラヒドロフラン溶液６．９８ｍＬ（６．９８ｍｍｏｌ）と、４－モルホリン－４－イルメチル安息香酸メチル（IX－６）１．６ｇ（６．９８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液５ｍＬを加えた。その後、撹拌しながら徐々に室温まで昇温した。反応終了後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧下留去した。２－［４－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシラニロキシ）ベンゼンスルホニル］－１－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エタノン（XIII－６）３．７４ｇを粗精製物として得た。
　（６－３）：２－［４－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシラニロキシ）ベンゼンスルホニル］－１－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エタノール（XIV－６）
　前記（６－２）で得た化合物（XIII－６）３．７４ｇ（６．９８ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍＬ）溶液に、０℃で水素化ホウ素ナトリウム　２６４ｍｇ（６．９８ｍｍｏｌ）を加えた。１時間撹拌した後、飽和食塩水を加えた。メタノールを減圧下留去した後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル→酢酸エチル：メタノール＝１０：１）で精製し、２－［４－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシラニロキシ）ベンゼンスルホニル］－１－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エタノール（XIV－６）を２．１９ｇ（４．４８ｍｍｏｌ）得た。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.83(2H, m),
7.25-7.30(4H, m), 6.98(2H, m), 5.22(1H, d, J = 7.7 Hz), 3.68(4H, m), 3.46(3H,
m), 3.30(1H, dd, J= 1.5, 14 Hz), 2.40(4H, m), 0.99(9H, s), 0.25(6H, s)．。
　（６－４）：　４－［（Ｅ）－２－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エテンスルホニル］フェノール（XVI－６）
　前記（６－３）で得た２－［４－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシラニロキシ）ベンゼンスルホニル］－１－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エタノール（XIV－６）２．１９ｇ（４．４８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４５ｍＬ）にトリエチルアミン３．１０ｍＬを加え、０℃にて撹拌した。塩化メタンスルホニル０．６１ｍＬ（８．９１ｍｍｏｌ）を加えた後、室温にて８時間撹拌した。さらにトリエチルアミン３．１０ｍＬ、塩化メタンスルホニル０．６１ｍＬをそれぞれ加え、４時間撹拌した。飽和食塩水を加えてクロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２→酢酸エチル→酢酸エチル：メタノール＝１０：１）で精製し、４－［（Ｅ）－２－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エテンスルホニル］フェノール（XVI－６）を０．７５７ｇ（２．１１ｍｍｏｌ）得た（収率４７％）。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.01(1H, d, J
= 8.7 Hz), 7.81(1H, d, J = 8.7 Hz), 7.61(1H, d, J = 15 Hz), 7.35-7.47(5H, m),
6.92(1H, d, J = 6.9 Hz), 6.81(1H, d, J = 15 Hz), 3.71(4H, m), 3.51(2H, m),
2.44(4H, m).。
　（６－５）：　４－｛４－［（Ｅ）－２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル］モルホリン（II－６）
　前記（６－４）で得た４－［（Ｅ）－２－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エテンスルホニル］フェノール（XVI－６）１８７ｍｇ（０．５２０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液に炭酸カリウム１０８ｍｇ（０．７８０ｍｍｏｌ）および１－ブロモ－２－ブチン０．０９４ｍＬ（１．０４ｍｍｏｌ）を加え、４時間撹拌した。飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：クロロホルム＝１：１→１：２→酢酸エチル）で精製し、４－｛４－［（Ｅ）－２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）ビニル］ベンジル］モルホリン（II－６）を０．０２３８ｇ（０．０５７８ｍｍｏｌ）得た（収率１１％）。物性値を以下に示す。
1H-NMR (CDCl3) : δ 7.87(2H, d, J
= 8.7 Hz), 7.63(1H, d, J = 15.5 Hz), 7.35-7.44(4H, m), 7.07(2H, d, J = 8.7 Hz),
6.83(1H, d, J = 15.5 Hz), 4.71(2H, m), 3.69(4H, m), 3.50(2H, s), 2.43(4H, m),
1.86(3H, s).。
　（６－６）：　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－６）
　前記（６－５）で得た化合物（II－６）を用い、前記と同様な方法（１－７および１－８）により、Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－モルホリン－４－イルメチル－フェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－６）を得た。物性値を以下に示す。
MS
(FAB) m/z : 473 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.45(0.6H, s),
8.11(0.4H, s), 7.80-7.88(2H, m), 7.23-7.32(4H, m), 7.07-7.16(2H, m), 5.63(0.6H,
m), 5.38(0.4H, m), 4.75(2H, m), 4.19(0.4H, m), 4.03(0.6H, m), 3.64-3.71(4H, m),
3.40-3.51(2H, m), 2.39(4H, m), 1.87(3H, m).。
　（実施例７）
　Ｎ－ヒドロキシ－Ｎ－［１－（４－モルホリン－４－イルメチルフェニル）－２－（４－ペント－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ホルムアミド（Ｉ－７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　実施例６と同様の操作により、上記の化合物（Ｉ－７）を得た。
MS
(FAB) m/z : 487 (M+H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.44(0.6H, s),
8.11(0.4H, s), 7.78-7.88(2H, m), 7.26-7.32(4H, m), 7.06-7.16(2H, m), 5.63(0.6H,
dd, J = 3.6, 12.3 Hz), 5.38(0.4H, dd, J = 3.0, 10.1 Hz), 4.75(2H, m),
4.18(0.4H, dd, J = 10.1, 15.7 Hz), 4.03(0.6H, dd, J = 12.3, 14.6 Hz), 3.72(2H,
q, J = 6.9 Hz), 3.64-3.70(4H, m), 3.41-3.48(3H, m), 2.36-2.43(4H, m), 1.24(3H,
t, J = 6.9 Hz).。
　スキーム１～４に従い、実施例１～７と同様の方法にて、以下の化合物（Ｉ－８～Ｉ－２８）を得た。
　（実施例８）
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジメチルアミノフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
MS
(ESI) m/z : 417(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.40(0.5H, s),
8.04(0.5H, s), 7.73-7.89(2H, m), 7.02-7.22(4H, m), 6.62(2H, d, J = 8.7 Hz),
5.49-5.58(0.5H, m), 5.22-5.31(0.5H, m), 4.73(2H, d, J = 9.2 Hz), 3.98-4.23(1H,
m), 3.37-3.55(1H, m), 2.93(3H, s), 2.91(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（実施例９）
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（３－ジメチルアミノフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
MS
(ESI) m/z : 417(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.45(0.5H, s),
8.07(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.21(4H, m), 6.57-6.68(2H, m),
5.54-5.62(0.5H, m), 5.27-5.34(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.00-4.25(1H, m),
3.41-3.54(1H, m), 2.90-2.95(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（実施例１０）
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（２－ジメチルアミノフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－１０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
MS
(ESI) m/z : 417(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.31(0.6H, s),
8.08(0.4H, s), 7.88(0.6H, d, J = 9.2 Hz), 7.83(0.4H, d, J = 8.7 Hz), 7.07-7.42(6H,
m), 6.57-6.68(2H, m), 6.04(0.4H, dd, J = 2.7, 10 Hz), 5.88(0.6H, dd, J = 2.7,
11 Hz), 4.71-4.78(2H, m), 3.99-4.08(1H, m), 3.39-3.51(1H, m), 2.61(2.4H, s),
2.54(3.6H, s), 1.86(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（実施例１１）
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ピペリジン－１－イルメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－１１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
MS
(ESI) m/z : 471(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.28(0.6H, s),
8.10(0.4H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.30(6H, m), 5.61-5.69(0.6H, m),
5.31-5.39(0.4H, m), 4.69-4.78(2H, m), 3.99-4.26(1H, m), 3.35-3.53(3H, m),
2.37(4H, br s), 1.87(3H, br s), 1.35-1.59(6H, m).。
　（実施例１２）
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（３－ピペリジン－１－イルメチルフェニル）エチル］ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－１２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
MS
(ESI) m/z : 471(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.38(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.04-7.30(6H, m), 5.70(0.5H, dd, J = 3.7, 11
Hz), 5.30-5.38(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.01-4.27(1H, m), 3.23-3.60(3H, m),
2.30(4H, br s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.31-1.55(6H, m).。
　（実施例１３）
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（３－モルホリン－４－イルメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－１３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
MS
(ESI) m/z : 473(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.46(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.78-7.90(2H, m), 7.06-7.31(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.35-5.42(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 3.98-4.26(1H, m), 3.68(4H, dd, J =
4.6, 4.6 Hz), 3.39-3.54(3H, m), 2.36-2.44(4H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（実施例１４）
　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－｛４－［（エチルメチルアミノ）メチル］フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－１４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
MS
(ESI) m/z : 445(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.35(0.5H, s),
8.11(0.5H, s), 7.78-7.89(2H, m), 7.06-7.28(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.32-5.40(0.5H, m), 4.71-4.77(2H, m), 3.99-4.24(1H, m), 3.38-3.53(3H, m),
2.38(3H, q, J = 7.3 Hz), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.05(3H, t, J = 7.3 Hz).。
　（実施例１５）
　Ｎ－（２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－｛３－［（エチルメチルアミノ）メチル］フェニル｝エチル）－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－１５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
MS
(ESI) m/z : 445(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.5H, s),
8.11(0.5H, s), 7.78-7.90(2H, m), 7.06-7.34(6H, m), 5.70(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.32-5.40(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 4.00-4.22(1H, m), 3.29-3.59(3H, m),
2.38(3H, q, J = 6.9 Hz), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.03(3H, t, J = 6.9 Hz).。
　（実施例１６）
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－Ｎ－メチルメタンスルホンアミド（Ｉ－１６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
MS
(ESI) m/z : 495(M＋H)+.
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 8.22(0.5H, br
s), 8.11(0.5H, br s), 7.75-7.86(2H, m), 7.09-7.42(4H, m), 7.13(2H, d, J = 9.2
Hz), 5.70(0.5H, br s), 5.40(0.5H, br s), 4.83-4.89(2H, m), 4.18(2H, s),
3.86-4.16(2H, m), 2.94(3H, s), 2.63(3H, s), 1.84(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（実施例１７）
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－４－メチルベンゼンスルホンアミド（Ｉ－１７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
MS
(ESI) m/z : 557(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.6H, br
s), 8.03(0.4H, br s), 7.69-7.88(4H, m), 7.04-7.33(8H, m), 5.61(0.6H, dd, J =
3.6, 12 Hz), 5.31-5.39(0.4H, m), 4.70-4.83(2H, m), 3.92-4.17(3H, m),
3.36-3.51(1H, m), 2.43(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（実施例１８）
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－４、Ｎ－ジメチルベンゼンスルホンアミド（Ｉ－１８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
MS
(ESI) m/z : 571(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.47(0.6H, br
s), 8.11(0.4H, br s), 7.78-7.89(2H, m), 7.70(2H, d, J = 8.2 Hz), 7.35(2H, d, J
= 8.2 Hz), 7.23-7.32(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.64(0.6H, dd, J = 3.6, 12 Hz),
5.36-5.43(0.4H, m), 4.71-4.78(2H, m), 3.96-4.22(3H, m), 3.38-3.52(1H, m),
2.58(1.2H, s), 2.54(1.8H, s), 2.45(3H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（実施例１９）
　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝－Ｎ－メチルスルホニルメタンスルホンアミド（Ｉ－１９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
MS
(ESI) m/z : 559(M＋H)+.
1H-NMR (DMSO-d6) : δ 8.12(0.5H, br
s), 8.21(0.5H, br s), 7.80(2H, br s), 7.35-7.44(1H, m), 7.32(2H, d, J = 9.2
Hz), 7.31(1H, s), 7.14(2H, d, J = 9.2 Hz), 5.41(0.5H, br s), 5.71(0.5H, br s),
4.87(2H, q, J = 2.3 Hz), 4.83(2H, s), 4.00-4.16(1H, m), 3.84-3.98(1H, m),
3.25(6H, s), 1.84(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（実施例２０）
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－［４－（２－ジメチルアミノエチル）フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－２０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
MS
(ESI) m/z : 445(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.30(0.5H, s),
8.14(0.5H, s), 7.76-7.89(2H, m), 7.00-7.24(6H, m), 5.71(0.5H, dd, J = 3.7, 11
Hz), 5.29-5.36(0.5H, m), 4.69-4.76(2H, m), 4.02-4.21(1H, m), 3.42-3.59(1H, m),
2.43-2.54(2H, m), 2.10-2.28(2H, m), 2.19(6H, s), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（実施例２１）
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－［４－（２－モルホリン－４－イルエチル）フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－２１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
MS
(ESI) m/z : 487(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.44(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.05-7.27(6H, m), 5.62(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.32-5.39(0.5H, m), 4.69-4.78(2H, m), 3.96-4.23(1H, m), 3.71(4H, dd, J =
4.1, 4.6 Hz), 3.39-3.53(1H, m), 2.69-2.77(2H, m), 2.43-2.56(6H, m), 1.87(3H, t,
J = 2.3 Hz).。
　（実施例２２）
　Ｎ－（２－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］フェニル｝エチル）メタンスルホンアミド（Ｉ－２２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
MS
(ESI) m/z : 495(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.39(0.5H, s),
8.07(0.5H, s), 7.78-7.89(2H, m), 7.05-7.30(6H, m), 5.65(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.33-5.41(0.5H, m), 4.70-4.78(2H, m), 3.95-4.21(1H, m), 3.31-3.52(3H, m),
2.80-2.91(5H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz).。
　（実施例２３）
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－［４－（３－ジメチルアミノプロピル）フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－２３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
MS
(ESI) m/z : 459(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.06-8.13(1H,
m), 7.74-7.88(2H, m), 7.02-7.24(6H, m), 5.64-5.75(0.5H, m), 5.22-5.32(0.5H, m),
4.68-4.76(2H, m), 4.02-4.22(1H, m), 3.40-3.58(1H, m), 2.51(2H, dd, J = 7.3, 7.8
Hz), 2.17(2H, dd, J = 7.3, 7.8 Hz), 2.08(3H, s), 2.06(3H, s), 1.87(3H, t, J =
2.3 Hz), 1.52-1.66 (2H, m).。
　（実施例２４）
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－［４－（３－ジエチルアミノプロピル）フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－２４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
MS
(ESI) m/z : 487(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.29(0.5H, s),
8.07(0.5H, m), 7.75-7.89(2H, m), 7.04-7.24(6H, m), 5.64(0.5H, dd, J = 3.7, 11
Hz), 5.28-5.37(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 4.00-4.23(1H, m), 3.41-3.55(1H, m),
2.33-2.60(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz), 1.61-1.72(2H, m), 0.91-1.01(6H, m).。
　（実施例２５）
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシ－ベンゼンスルホニル）－１－［４－（３－モルホリン－４－イルプロピル）フェニル］エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－２５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
MS
(ESI) m/z : 501(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.37(0.5H, s),
8.08(0.5H, s), 7.76-7.89(2H, m), 7.04-7.24(6H, m), 5.64(0.5H, dd, J = 3.7, 12
Hz), 5.29-5.38(0.5H, m), 4.68-4.77(2H, m), 3.98-4.23(1H, m), 3.67(4H, br s),
3.40-3.53(1H, m), 2.52-2.63(2H, m), 2.24-2.46(6H, m), 1.87(3H, t, J = 2.3 Hz),
1.65-1.76(2H, m).。
　（実施例２６）
　Ｎ－｛２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－［４－（４－モルホリン－４－イルブチル）－フェニル］－エチル｝－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド（Ｉ－２６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
MS
(ESI) m/z : 515(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.41(0.5H, s),
8.10(0.5H, s), 7.77-7.89(2H, m), 7.05-7.24(6H, m), 5.57-5.66(0.5H, m),
5.31-5.38(0.5H, m), 4.69-4.77(2H, m), 3.97-4.23(1H, m), 3.67(4H, dd, J = 4.1,
4.6 Hz), 3.40-3.53(1H, m), 2.52-2.63(2H, m), 2.24-2.46(6H, m), 1.87(3H, t, J =
2.3 Hz), 1.39-1.63(4H, m).。
　（実施例２７）
　Ｎ－｛４－［１－（ホルミルヒドロキシアミノ）－２－（４－ペント－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド（Ｉ－２７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
MS
(ESI) m/z : 495(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3) : δ 8.29(0.6H, s),
8.00(0.4H, s), 7.75-7.88(2H, m), 7.23-7.35(4H, m), 7.05-7.16(2H, m), 5.66(0.6H,
dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.31-5.41(0.4H, m), 4.71-4.80(2H, m), 4.26(2H, br s),
3.95-4.18(1H, m), 3.39-3.50(1H, m), 2.89(3H, br s), 2.24(2H, tq, J = 1.8, 7.3
Hz), 1.14(3H, t, J = 7.3 Hz).。
　（実施例２８）
　Ｎ－｛４－［１－（ホルミルヒドロキシアミノ）－２－（４－オクト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド（Ｉ－２８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
MS
(ESI) m/z : 537(M＋H)+.
1H-NMR (CDCl3)
: δ 8.35(0.6H, s),
8.03(0.4H, s), 7.76-7.88(2H, m), 7.27-7.36(4H, m), 7.06-7.17(2H, m), 5.66(0.6H,
dd, J = 3.7, 12 Hz), 5.34-5.42(0.4H, m), 4.72-4.82(2H, m), 4.23-4.33(2H, m),
3.94-4.18(1H, m), 3.38-3.51(1H, m), 2.90(1.2H, s), 2.89(1.8H, s), 2.22(2H, tt,
J = 2.3, 7.3 Hz), 1.45-1.55(2H, m), 1.23-1.38(4H, m), 0.87(3H, t, J = 7.3 Hz).。
　（試験例３）　ＡＤＡＭ１７阻害実験
　実施例１～７において得られたＮ－ヒドロキシホルムアミド誘導体のＡＤＡＭ１７に対する阻害作用の有無を調べた。
　すなわち、先ず、ＡＤＡＭ１７の塩基配列はモス（Ｍｏｓｓ）らにより報告されている（Ｍｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３８５巻、７３３－７３６ページ　参照）ので、ヒト単球細胞株ＴＨＰ－１細胞から定法にしたがってＡＤＡＭ－１７のｃＤＮＡを取得し、これを発現ベクターに組み込み、次いでこのベクターを哺乳動物細胞あるいは昆虫細胞に形質転換し、ＡＤＡＭ１７を発現させ取得した。
　次に、得られたＡＤＡＭ１７を酵素として用い、また基質としては、膜結合型ＴＮＦのＡＤＡＭ１７切断配列を含んだ蛍光合成基質　Ｎｍａ（Ｎ－メチルアントラニル酸）－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｄｎｐ（ジニトロフェニル）－Ｄ－Ａｒｇ－ＮＨ２を用いて、被験物質存在下または非存在下におけるＡＤＡＭ１７の活性を以下のようにして測定した。
　すなわち、アッセイバッファーＡ（２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０μｍｏｌ／Ｌ硫酸亜鉛、２ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミンを含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））にて調製した１４ｕｎｉｔｓの酵素液（２５℃の条件下で１ｐｍｏｌの基質を１分間で分解する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した）９０μＬ、およびアッセイバッファーＢ（２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０μｍｏｌ／Ｌ硫酸亜鉛、０．０５％ＰＬＵＲＯＮＩＣ　Ｆ－６８を含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））にて２０μｍｏｌ／Ｌに調製した蛍光合成基質９０μＬを混合し、３７℃で１．５時間反応させた。この後、蛍光強度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ　Ａｓｃｅｎｔ）にて、励起波長３５５ｎｍ、測定波長４６０ｎｍの条件で測定し、酵素活性を求めた。そして、被験化合物の存在下および非存在下の酵素活性より阻害率を求め、５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を算出した。得られた結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
　表１に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物（Ｎ－ヒドロキシホルムアミド誘導体）であるＩ－１～Ｉ－７はいずれも低濃度にてＡＤＡＭ１７の酵素活性を阻害することが確認された。
　（試験例４）　各種評価試験
　次に実施例１～７において得られたＮ－ヒドロキシホルムアミド誘導体の中から、ＡＤＡＭ１７に対する阻害効果の高かった化合物　Ｉ－１（以下、「Ｓ－４５２８２」とも称する）及びＩ－４（以下、「Ｓ－４５４５７」とも称する）について、下記の方法にて、その阻害剤としての特異性と細胞におけるＴＡＣＥ阻害活性を調べた。比較のために非選択的なメタロプロテアーゼ阻害剤であるＧＭ６００１（ＥＭＤ／Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、製品番号３６４２０５）も評価した。
　＜酵素阻害試験＞
　この試験において用いた酵素は下記の通りである
　Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　１（ＭＭＰ－１）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４４４２０８）
　Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　２（ＭＭＰ－２）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４４４２１３）
　Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　３（ＭＭＰ－３）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４４４２１７）
　Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　８（ＭＭＰ－８）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４４４２２９）
　Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　９（ＭＭＰ－９）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４４４２３１）
　Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　１３（ＭＭＰ－１３）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、製品番号：ＣＣ０６８）
　Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　１４（ＭＭＰ－１４）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４７５９３５）
　Ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　１７（ＭＭＰ－１７）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号：４７５９４０）
　Ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　１０（ＡＤＡＭ１０）（フナコシ社製、商品コード：９３６－ＡＤ－０２０）
　Ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　１７（ＡＤＡＭ１７、ＴＡＣＥ）（試験例３の通り、科研製薬にて遺伝子組み換え法を用いて作製したものを使用した。なお、試験例３の通り、２５℃の条件下で１ｐｍｏｌの基質を１分間で分解する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。）。
　また、この試験で用いた基質は下記の通りである
　４４４２２１基質（ＤＮＰ－Ｐｒｏ－Ｃｈａ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｍｅ）－Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｌｙｓ（Ｎｍａ）－ＮＨ２、カスタム合成）：励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ
　ＴＡＣＥ基質（試験例３で用いたものと同じ）：　励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ
　３１６８基質（ＭＯＣＡｃ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｎｖａ－Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）－ＮＨ２、ペプチド研究所社製）：　励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０５ｎｍ
　３１６３基質（ＭＯＣＡｃ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＮＨ２、ペプチド研究所社製）：　励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０５ｎｍ。
　そして、前記酵素及び基質を用いて酵素反応を行った。すなわち、酵素によっては製造元の情報に従い予めＡＰＭＡ（終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐ－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｍｅｒｃｕｒｉｃ　ａｃｅｔａｔｅ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ａ９５６３）で活性化させた後、蛍光専用９６ｗｅｌｌプレートにアッセイバッファーＡ（２００ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化カルシウム、１０μｍｏｌ／Ｌ　硫酸亜鉛、２ｍｇ／ｍＬ　牛血清アルブミンを含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））にて調製した酵素液９０μＬに、アッセイバッファーＢ（２００ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化カルシウム、１０μｍｏｌ／Ｌ　硫酸亜鉛、０．０５％ＰＬＵＲＯＮＩＣ　Ｆ－６８を含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））にて２０μｍｏｌ／Ｌに調製した基質９０μＬを混合し、２５℃もしくは３７℃で数時間反応させた。そして、反応前後の蛍光強度を蛍光強度計にて測定し、酵素活性を求め、試験物質の存在下および非存在下の酵素活性より阻害率を求め、５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を算出した。各酵素の反応条件は表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
　＜細胞におけるＴＡＣＥ阻害試験＞
　ＴＨＰ－１細胞（ヒト急性単球型白血病由来の細胞、ＡＴＣＣカタログ番号：ＴＩＢ２０２）を１０ｖ／ｖ％　ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、９６ウェル培養プレートに、２００μＬ／ｗｅｌｌ（１×１０５個）ずつ分注し、ＰＭＡ（終濃度５０ｎｍｏｌ／Ｌ）添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて４０～４８時間培養し、ＴＨＰ－１細胞をマクロファージ様細胞へと分化させた。分化後に、培地を捨て、細胞をＴＨＰ－１洗浄バッファー（ＲＰＭＩ１６４０、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４））で洗浄した。細胞の洗浄後、ＴＨＰ－１アッセイバッファー（ＲＰＭＩ１６４０、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、０．０１ｗ／ｖ％　ＰＦ－６８、１０ｖ／ｖ％　ＦＢＳ）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。そして、試験物質（Ｉ－１又はＩ－４）含有ＴＨＰ－１アッセイバッファーをさらに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、タッピングによって混合し、ＣＯ２インキュベーター内にて３０～４５分間プレインキュベートした後、ＬＰＳ入りＴＨＰ－１１アッセイバッファーを５０μＬ／ｗｅｌｌ加えた（ＬＰＳの最終濃度は１μｇ／ｍＬとなる）。更に、プレートをタッピングすることで混合し、ＣＯ２インキュベーター内にて６時間インキュベートした。インキュベート終了後、培養上清中のヒトＴＮＦ－α濃度を市販キット（Ｈｕｍａｎ　ＴＮＦ－α　ＣｙｔｏＳｅｔ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）、または、Ｈｕｍａｎ　ＴＮＦ－α　Ｒｅａｄｙ－Ｓｅｔ－Ｇｏ！（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））で測定した。
　これらの試験方法で得られた結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
　表３に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるＩ－１及びＩ－４は共にＡＤＡＭ１７以外のメタロプロテアーゼと比較して、ＡＤＡＭ１７に対して高い特異性を有していることが確認された。マクロファージ様細胞に発現したＴＡＣＥに対する阻害活性も確認された。また、両化合物は、ＡＤＡＭ１０もＡＤＡＭ１７に比べると若干弱いものの抑制した。ＡＤＡＭ１０は、ＡＤＡＭ１７と同一の基質をも切断する酵素であり（Ｃａｅｓｃｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊ．、２００９年、４２４巻、７９～８８ページ　参照）、その阻害は血小板機能の保存に有用であることが示唆されている（Ｂｅｎｄｅｒら、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ＧＰVI　ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ　ｓｈｅｄｄｉｎｇ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．」、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年７月１９日電子版　参照）。然るに、本発明にかかる化合物であるＩ－１及びＩ－４はＡＤＡＭ１７特異的阻害剤であり、同様の基本骨格を有する他の本発明にかかる化合物（例えば、Ｉ－２、Ｉ－３、Ｉ－５、Ｉ－６）もＡＤＡＭ１７特異的阻害剤であることが示唆された。一方、ヒドロキサム酸構造を有するＧＭ６００１は、従来知られているように非特異的にメタロプロテアーゼを強く阻害したが、ＡＤＡＭ１７に対する阻害活性は弱いものであった。
　（試験例５）　ＧＭ６００１及びＳ－４５２８２のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果についての検証
　前述の通りにして得られたＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を、図６に示した条件下（プロトコール１）で血小板の誘導を行った。すなわち、造血前駆細胞を巨核球／血小板に誘導する前述の８日間の培養過程において、
２ｄａｙｓ：フローサイトメトリー解析にかける２日前（図６において示す「ｄ２２」）にＧＭ６００１、Ｓ－４５２８２、又はＤＭＳＯを添加して培養、又は
８ｄａｙｓ：ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから８日間（図６において示す「ｄ１５」以降）、ＧＭ６００１（５０μＭ）、Ｓ－４５２８２（５μＭ又は５０μＭ）、又はＤＭＳＯを添加して培養
という条件下で各々培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の数、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(－）の数、及び血小板の総数を測定した。得られた結果を図７～図１０に示す。なお、ＣＤ４１（インテグリンαIIｂ）は血小板の表面マーカーであるため、ＣＤ４１（＋）は血小板であることを示している。また、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）(＋）は、ＧＰＩｂαが表面に存在している血小板であることを示し、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）(－）は、ＡＤＡＭ１７によってＧＰＩｂαがシェディングされてしまった血小板であることを示す。また図中「ＧＭ」は５０μＭ　ＧＭ６００１（溶媒：ＤＭＳＯ）を添加した結果を示し、「４５２８２」は各濃度のＳ－４５２８２（溶媒：ＤＭＳＯ）を添加した結果を示す。
　図７及び図９に示した結果から明らかなように、ＧＭ６００１及びＳ－４５２８２は各々ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを阻害していることが確認された。さらに、Ｓ－４５２８２は５μＭでも５０μＭ　ＧＭ６００１に相当する阻害効果を有していることも明らかになった。
　また、図８及び図１０に示した結果から明らかなように、５０μＭのＧＭ６００１と５μＭのＳ－４５２８２の２日間添加では、ほぼ同数の血小板が得られるが、８日間添加した場合においては、ＧＭ６００１は５μＭのＳ－４５２８２と比べて血小板数が少なく、５０μＭのＧＭ６００１は細胞毒性を有していることが明らかになった。
　（試験例６）　Ｓ－４５４５７及びＳ－４５２８２のＥＳ細胞由来血小板に対する機能維持効果についての検証
　前述の通りにして得られたＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を、図６に示した条件下（プロトコール１）で血小板の誘導を行った。すなわち、ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから８日間（図６において示す「ｄ１５」以降）、ＧＭ６００１（５０μＭ）、Ｓ－４５４５７（５μＭ又は５０μＭ）、Ｓ－４５２８２（５μＭ）、又はＤＭＳＯを添加して培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の数、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(－）の数、及び血小板の総数を測定した。得られた結果は図１１及び図１２に示す。なお、図中「４５４５７」は各濃度のＳ－４５４５７（溶媒：ＤＭＳＯ）を添加した結果を示す。
　図１１及び図１２に示した結果から明らかなように、Ｓ－４５４５７も、ＧＭ６００１及びＳ－４５２８２同様にＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを阻害していることが確認された。
　（試験例７）　Ｓ－４５４５７の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証
　前述の通りにして得られたＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の造血前駆細胞を、図６に示した条件下で血小板の誘導を行った。すなわち、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから８日間（図６において示す「ｄ１５」以降）、ＧＭ６００１（５０μＭ）、Ｓ－４５４５７（１．５～５０μＭ）、又はＤＭＳＯを添加して培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の数、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(－）の数、及び血小板の総数を測定した。４回実施して得られた結果を図１３～１６に示す。なお、血小板総数に占めるＣＤ４２ｂ（＋）の比率における統計処理は、角変換した値を分散分析で実施し、Ｄｕｎｎｅｔ法でＤＭＳＯ群と試験物質群の群間差を多重比較した。
　図１４及び１６に示した結果から明らかなように、ＥＳ細胞を用いた培養系（図１４）と同様にｉＰＳ細胞を用いた培養系(図１６)においても、本発明にかかる化合物であるＳ－４５４５７を添加することによって、その添加した濃度依存的にＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを阻害していることが確認された。さらに、図１３及び１５に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるＳ－４５４５７はＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞、並びにこれらから分化誘導される細胞に対する毒性は低いことも確認された。
　（試験例８）　Ｓ－４５４５７のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証
　前述のような培養系を用いて得られた血小板だけでなく、採血によって得られた末梢血由来の血小板においても、本発明にかかる化合物は機能維持効果を発揮するのかを検証した。すなわち、図６に示した＜プロトコール２＞の通り、先ず、採血して得られたヒト末梢血にその１／１０量のＡＣＤを加え、ブレーキ無し、９００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心して得られた上清を更にブレーキ無し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をＴｙｒｏｄｅ－ＨＥＰＥＳバッファー（カルシウム含まず）に懸濁し、懸濁液中の血小板数を数え、５×１０７～１×１０８個/Ｔｙｒｏｄｅ－ＨＥＰＥＳバッファー（カルシウム含まず）２００μＬになるように血小板を含む懸濁液（洗浄血小板、Ｗａｓｈｅｄ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ）を調製した。次に、このように調製して得られた洗浄血小板に１００μＭ　ＣＣＣＰ（Ｃａｒｂｏｎｙｌ　ｃｙａｎｉｄｅ　ｍ－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）と共に、５０μＭ　ＧＭ６００１、１．５～５０μＭ　Ｓ－４５４５７、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の数、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(－）の数を測定した。なお、ＣＣＣＰの添加により、血小板表面上のＧＰＩｂαのシェディングは亢進されることが知られている（Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、１０２巻、４２２９～４２３５ページ　参照）。得られた結果を図１７に示す。統計処理は、試験例７と同様である。
　図１７に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、ＧＭ６００１と同様に、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果、特に３７℃における機能維持効果を有していることが確認された。
　（試験例９）　Ｓ－４５４５７及びｐ３８阻害剤のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果の検証
　ｐ３８を阻害することにより、ＧＰＩｂαのシェディングは阻害されることが知られている（Ｍａｔｔｈｉａｓ　Ｃ．ら、ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ、ＢＬＯＯＤ、２０１０年３月４日、１１５巻、９号、１８３５～１８４２ページ　参照）。そこで、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果において、ｐ３８阻害剤と本発明にかかる化合物とを比較した。すなわち、試験例８と同様にして調製して得られた洗浄血小板に１００μＭ　ＣＣＣＰと共に、４０μＭ　ｐ３８阻害剤２種（ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、製品番号ＳＢ２０２１９０及びＳＢ２０３５８０）、５０μＭ　Ｓ－４５４５７、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）及びＣＤ４２ｂ(＋）のドットプロット解析を行った。得られた結果を図１８に示す。なお。図１８中、Ｘ軸はＣＤ４１を示し、Ｙ軸はＣＤ４２ｂを示す。また、図中「２０２１９０」「２０３５８０」は４０μＭ　各ｐ３８阻害剤（溶媒：ＤＭＳＯ）を添加した結果を示す。
　さらに、試験例８と同様にして調製して得られた洗浄血小板に１００μＭ　ＣＣＣＰと共に、４０μＭ　前記ｐ３８阻害剤２種、５０μＭ　ＧＭ６００１、０．５～５０μＭ　Ｓ－４５４５７、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて解析し、血小板におけるＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の割合を算出した。得られた結果を図１９に示す。
　図１８及び図１９に示した結果から明らかなように、ｐ３８阻害剤の添加におけるＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）（＋）細胞の数は、ＤＭＳＯ添加のそれと比較して多いことから、ｐ３８阻害剤もヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を有していることが確認された。しかしながら、本発明にかかる化合物の添加による効果は、ｐ３８阻害剤の添加による効果よりも優れたものであった。
　（試験例１０）　Ｓ－４５４５７及びｐ３８阻害剤のＥＳ細胞由来の血小板に対する機能維持効果についての検証
　前述の通りにして得られたＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を、図６に示した条件下（プロトコール１）で血小板の誘導を行った。すなわち、ＥＳ細胞由来の造血前駆細胞を播き直してから８日間（図６において示す「ｄ１５」以降）、５０μＭ　ＧＭ６００１、０．１５～５０μＭ　Ｓ－４５４５７、４０μＭ　前記ｐ３８阻害剤２種、５０μＭ　ＧＭ６００１、又はＤＭＳＯを添加して培養を行い、前述の通り回収して、フローサイトメトリーにて、血小板の総数、血小板におけるＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の割合を測定、算出した。得られた結果を図２０及び図２１に示す。
　図２０に示した結果から明らかなように、ｐ３８阻害剤の添加によって得られた血小板の数は著しく少ないものであり、顕著な細胞毒性が確認された。また、図２１に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物の添加によるＥＳ細胞由来の血小板に対する機能維持効果は認められるが、ｐ３８阻害剤の添加による効果は、全く認められなかった。
　（試験例１１）　Ｓ－４５４５７及びＳ－４５２８２のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果についての検証
　Ｓ－４５４５７及びＳ－４５２８２のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を調べるため、試験例８と同様にして、洗浄血小板に１００μＭ　ＣＣＣＰと共に、５０μＭ　ＧＭ６００１、５μＭ若しくは５０μＭ　Ｓ－４５４５７、５０μＭ　Ｓ－４５２８２、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、血小板の総数及びＣＤ４２ｂ(＋）の数を測定し、血小板におけるＣＤ４２ｂ(＋）の割合を算出した。得られた結果を図２２に示す。
　図２２に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、ＧＭ６００１と同様に、ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果、特に３７℃における機能維持効果を有していることが確認された。
　（試験例１２）　ヒト末梢血ＰＲＰに対する機能維持効果についての検証
　ヒト末梢血ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈ　ｐｌａｓｍａ、多血小板血漿）を用いて、各化合物が有する血小板に対する機能維持効果の持続性について調べた。すなわち、先ず、採血して得られたヒト末梢血にその１／１０量のＡＣＤを加え、室温下、ブレーキ無し、９００ｒｐｍで１０分間遠心した。次に、このようにして得られた上清（ＰＲＰ）に、５０μＭ　ＧＭ６００１、５０μＭ　Ｓ－４５４５７、５μＭ　Ｓ－４５２８２、４０μＭ　前記ｐ３８阻害剤２種、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間又は７２時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の数、ＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(－）の数を測定し、血小板におけるＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(－）又はＣＤ４１（＋）ＣＤ４２ｂ(＋）の割合を算出した。得られた結果を図２３に示す。また図２３中、「ｆｒｅｓｈ」はヒト末梢血ＰＲＰをインキュベーションせずにフローサイトメトリーにて解析した結果を示す。
　図２３に示した結果から、本発明にかかる化合物であるＳ－４５４５７は７２時間インキュベーションしてもＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）のシェディングを抑制し続けられることが明らかになった。また、本発明にかかる化合物であるＳ－４５２８２も５μＭという添加濃度を考慮すると高いヒト末梢血ＰＲＰに対する機能維持効果を有していることが明らかになった。一方、p３８阻害剤の効果は弱いか、あるいはほぼ観察できないレベルしか認められなかった。
　（試験例１３）　ヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果の検証
　試験例８と同様にして得た洗浄血小板に１００μＭ　ＣＣＣＰと共に、５０μＭ　ＧＭ６００１、５０μＭ　Ｓ－４５４５７、５μＭ　Ｓ－４５２８２、４０μＭ　前記ｐ３８阻害剤２種、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）及びＣＤ４２ｂ(＋）のドットプロット解析を行った。得られた結果を図２４に示す。なお図２４中、Ｘ軸はＣＤ４１を示し、Ｙ軸はＣＤ４２ｂを示す。また図２４中、「ｆｒｅｓｈ」は洗浄血小板をインキュベーションせずにフローサイトメトリーにて解析した結果を示す。
　図２４に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物であるＳ－４５４５７はＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）のシェディングを抑制していることが確認された。また、Ｓ－４５４５７には劣るものの、本発明にかかる化合物であるＳ－４５２８２も高いヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を有していることが確認された。さらに、ｐ３８阻害剤の効果は弱いことが確認された。
　（試験例１４）　Ｓ－４５４５７のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果における濃度依存性についての検証
　試験例８と同様にして、洗浄血小板に１００μＭ　ＣＣＣＰと共に、５０μＭ　ＧＭ６００１、０．５～５０μＭ　Ｓ－４５４５７、又はＤＭＳＯを添加し、３７℃で２４時間インキュベーションし、フローサイトメトリーにて、ＣＤ４１（＋）及びＣＤ４２ｂ(＋）のドットプロット解析を行い、Ｓ－４５４５７のヒト末梢血由来の血小板に対する機能維持効果を調べた。得られた結果を図２５に示す。なお図２５中、Ｘ軸はＣＤ４１を示し、Ｙ軸はＣＤ４２ｂを示す。
　図２５に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物は、その濃度依存的にＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）のシェディングを抑制していることが確認された。
　（試験例１５）　フローチャンバーを用いた、Ｓ－４５４５７による血小板接着能の維持効果の検証
　通常、血管壁が損傷すると、血管内皮細胞下のコラーゲン組織の露出が生じ、血漿中のフォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）がコラーゲン組織に結合するようになる。そして、ＶＷＦとＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）との相互作用、及び、ＶＷＦとα２ｂβ３インテグリンとの相互作用を介して、血小板は血管に接着するようになると解されている。また、血管に接着した血小板を起点として、ＶＷＦとＧＰＩｂαとの相互作用、並びに、ＶＷＦとα２ｂβ３インテグリンとの相互作用を介して、血小板どうしも接着していき、血栓は発達していくと解されている（Ｒｕｇｇｅｒｉ　ＺＭ．、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００２年１１月、８巻、１１号、１２２７～１２３４ページ　参照）。
　そこで、試験例１～１４において示された、本発明にかかる化合物（Ｓ－４５４５７等）によるＧＰＩｂαシェディングに対する抑制効果は、ＶＷＦとＧＰＩｂα（ＣＤ４２ｂ）との相互作用を維持し、血小板の接着能の維持に寄与しているのかを、血栓形成の経過を定量的に評価することのできるフローチャンバーを用いて、評価した。
　すなわち、先ず、採血して得られたヒト末梢血にＡＣＤを加え、ブレーキ無し、９００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収した。得られた上清に１μＭ　プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）を加え、ブレーキ無し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をＴｙｒｏｄｅ　ＨＥＰＥＳ　Ｃａ（－）緩衝液中に懸濁し、１００μＭ　ＣＣＣＰを添加し、同時にＤＭＳＯ若しくは１５μＭ　Ｓ－４５４５７とを添加した後、３７℃で２４時間インキュベーションした。なお、この際ＣＣＣＰとＤＭＳＯとを添加してインキュベーションしたものを陰性対照として、何も添加せずインキュベーション処理を行わなかったものを陽性対照として用意した。
　そして、インキュベーション後（陽性対照はインキュベーションせずに）、懸濁液に１／２０００に希釈したＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル、過塩素酸）を添加し、室温下で１５分間インキュベートして血小板を蛍光標識した。その後、Ｔｙｒｏｄｅ　ＨＥＰＥＳ　Ｃａ（－）緩衝液を加え、ブレーキ無し、１５００ｒｐｍで８分間遠心し、洗浄を行った。
　次に、蛍光標識した各血小板サンプルを、アルガトロバン（抗トロンビン薬）にて抗凝固処理を行って採取したヒト末梢血の全血サンプルに、全血血小板の１０％の数になるように加え、混合した。そして、このように調製した血液サンプルを一定の壁剪断速度（１５００Ｓ－１）で、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）により、ＶＷＦで表面をコ―ティングしたチャンバー内に注入し、この表面上にＶＷＦを介して接着し、血栓を形成する蛍光標識した血小板を倒立ステージエピ蛍光ビデオ顕微鏡システム（ＤＭ　ＩＲＢ、Ｌｅｉｃａ社製）を用いて可視化し、その顕微鏡像を感光性カラーＣＣＤカメラ（Ｌ－６００、Ｌｅｉｃａ社製）を用いてデジタル化し、更にイメージ－Ｊソフトウェア（ＮＩＨイメージ）を用いて、血小板による表面積カバー率を算出した。なお、かかる試験は２回ずつ行い、陽性対照（ｆｒｅｓｈな血小板）における表面積カバー率の最大値を各々１００％にして、各サンプルの生データを換算して、２回の試験から得られた値の平均値を算出した。得られた結果は図２６及び図２７に示す。なお、図２６及び２７中、縦軸は前記平均値を示し、「Ｓ－４５４５７」は１５μＭ　Ｓ－４５４５７を添加して調製した血小板における結果を示し、「ＤＭＳＯ」は陰性対照における結果を示し、「ｆｒｅｓｈ」は陽性対照（ｆｒｅｓｈな血小板）における結果を示す。また、図２６中の横軸はチャンバー内に注入してからの計測時間（単位：分）を示す。
　図２６及び図２７に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物（Ｓ－４５４５７）は、陰性対照であるＤＭＳＯを添加してＣＣＣＰと共にインキュベーションした結果と比較して、血小板による表面積カバー率は大きいものであった。然るに、本発明にかかる化合物はＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制し、ひいてはＧＰＩｂαとＶＷＦとの会合をも可能とし、血小板の接着能を維持することができることが明らかになった。
　（試験例１６）　生体分子イメージング手法を用いた、Ｓ－４５４５７による血小板接着能の維持効果の検証
　本発明者等によって開発された血栓形成モデル並びに生体分子イメージング手法を用いて、本発明にかかる化合物（Ｓ－４５４５７等）による血小板接着能の維持効果、特に血小板の血管への接着能をインビボにおいて評価した。
　なお、本試験例において用いた血栓形成モデルは、レーザー照射とヘマトポルフィリン等とを用いて、活性酸素（ＲＯＳ）を血管内に局所的に発生させ、血管内皮細胞に障害を引き起こすことにより、血小板を血管に接着させ、血栓形成を誘発させるものである。また、本試験例において用いた生体分子イメージング手法は、高速レーザー共焦点顕微鏡及びマルチビーム式の共焦点ユニットを用いて、血流の方向と平行にごく狭い断面に焦点を合わせて高速画像を取得することが可能であるため、血管内を変形しながら流れる血小板等に各々フォーカスを合わせて観察することにより、単一血小板レベルでの生体イメージングを可能とするものである（Ｔａｋｉｚａｗａら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１０年１月、１２０巻、１号、１７９～１９０ページ　参照）。以下、本試験例で用いた血栓形成モデル並びに生体分子イメージング手法について説明する。
　先ず、血栓形成モデルマウスに注入するための血小板を調製した。すなわち、採血して得られたヒト末梢血に１０ｖ/ｖ％になるようＡＣＤを加え、ブレーキ無し、９００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収した。得られた上清に１μＭ　ＰＧＥ１を加え、ブレーキ無し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除去した。得られた沈殿物をＴｙｒｏｄｅ　ＨＥＰＥＳ　Ｃａ（－）緩衝液に懸濁し、１００μＭ　ＣＣＣＰと、ＤＭＳＯ又は１５μＭ　Ｓ－４５４５７とを添加した後、３７℃で２４時間インキュベーションした。なお、この際ＣＣＣＰとＤＭＳＯを添加してインキュベーションしたものを陰性対照として、何も添加せずインキュベーション処理を行わなかったものを陽性対照として用意した。インキュベーション後（陽性対照はインキュベーションせずに）、かかる沈殿物における血小板の数を計測し、２ｍｌ　Ｔｙｒｏｄｅ　ＨＥＰＥＳ　Ｃａ（－）緩衝液（１μＭ　ＰＧＥ１含有）中に懸濁した。そして、かかる懸濁液に５μＭ　ＴＭＲＥを添加し、室温下で１５分間インキュベートして血小板を蛍光標識した。その後、Ｔｙｒｏｄｅ　ＨＥＰＥＳ　Ｃａ（－）緩衝液を加え、ブレーキ無し、１５００ｒｐｍで８分間遠心し、洗浄を行った。
　次に、血栓形成モデルマウスを調製した。すなわち、予め２Ｇｙの放射線処置によって血小板減少処置を施しておいたＮＯＧマウス（重度複合免疫不全マウス）を麻酔して腹壁に小切開を施し、腸間膜における微小循環及び血栓形成を視覚的に解析できるようにした。さらに、ＮＯＧマウス由来の血球の動態を可視化するために、ＦＩＴＣ－デキストラン（２０ｍｇ／ｋｇ体重）をこのＮＯＧマウスの尾静脈に注入した。そして、前記の通りにして蛍光標識した血小板をこのＮＯＧマウスに、このマウスの循環血小板数の１５％の数になるように注入した。さらに、血栓形成を誘発させるために、ヘマトポルフィリン（１．８ｍｇ／ｋｇ体重）をこのＮＯＧマウスに投与した。なお、このようにマウスを処理することにより、血球動態及び血栓形成は、レーザー照射及びＲＯＳ産生の間可視化されることになる。
　そして、レーザー照射の際のかかる可視化画像（シークエンシャル画像）は、回転ディスク共焦点顕微鏡（横河電機株式会社製、ＣＳＵ－Ｘ１）及びＥＭ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ）－ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ、Ａｎｄｏｒ社製）を用いて、２０秒間、３０フレーム／秒で、先に施した小切開部位（～３ｍｍ）を通して観察及び撮影することにより得た。なお、かかる観察は、Ｓ－４５４５７を添加して調製した血小板を注入したマウス、陰性対照、陽性対照について、閉塞性血栓を形成した２０本の独立した血管を対象として行った。得られた結果は図２８及び図２９に示す。なお、図２８及び図２９中、「Ｓ－４５４５７」は１５μＭ　Ｓ－４５４５７を添加して調製した血小板を注入したマウスにおける血栓形成を示し、「ＤＭＳＯ」は陰性対照における血栓形成の結果を示し、「ｆｒｅｓｈ」は陽性対照における血栓形成の結果を示す。また、代表例である図２８中の白い矢印は血流の方向を示し、白い三角が指している箇所はヒト由来の血小板が血管に付着している箇所を示し、スケールバーは１０μｍを示す。さらに、図２９中の縦軸は、血栓形成に関与した血小板総数に占めるヒト血小板数の割合（％）であり、値は、２０本の平均＋標準誤差である。
　図２８及び図２９に示した結果から明らかなように、本発明にかかる化合物（Ｓ－４５４５７）を添加して調製した血小板を注入したマウスにおいては、陰性対照と比較して、ヒト由来の血小板が血栓形成に寄与する割合が大きかった。然るに、本発明にかかる化合物は、ＡＤＡＭ１７によるＧＰＩｂαのシェディングを抑制することにより、血小板の血管への接着能を維持することができることが明らかになった。
　以上説明したように、本発明によれば、ＡＤＡＭ１７のメタロプロテアーゼ活性を特異的に抑制し、ＧＰＩｂαのシェディングを抑制することによって、血小板の機能を維持することが可能となる。したがって、本発明は、機能的に安定し、安全性の高い血小板を、煩雑な作用を要さず、効率良く大量に生産するための試薬や、血液製剤における血小板の機能を維持し、その品質の安定化を図るための医薬品添加剤などとして有用である。

Claims (12)

  1. 　下記一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｘは、フェニレン基；
    Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
    ｍは０～４のいずれかの整数；
    Ｒ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
    Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
    Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
    Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
    で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする、血小板の機能を維持するための組成物。
  2. 　前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
    　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、または
    　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
    である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　血小板の機能を維持するための試薬または血小板を含む血液製剤への添加剤である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 　巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｘは、フェニレン基；
    Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
    ｍは０～４のいずれかの整数；
    Ｒ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
    Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
    Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
    Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
    で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加することを特徴とする、血小板を調製するための方法。
  5. 　前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
    　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、または
    　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
    である、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記培養系における培養温度が３５～３８℃であることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
  7. 　巨核球に分化し得る細胞から巨核球に分化誘導させ、該巨核球から血小板を産生させる培養系に、下記一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、Ｘは、フェニレン基；
    Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
    ｍは０～４のいずれかの整数；
    Ｒ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
    Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
    Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
    Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
    で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を添加した培養物。
  8. 　前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
    　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、または
    　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
    である、請求項７に記載の培養物。
  9. 　下記一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式中、Ｘは、フェニレン基；
    Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
    ｍは０～４のいずれかの整数；
    Ｒ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
    Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
    Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
    Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
    で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物が添加された、血小板を含む血液製剤。
  10. 　前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
    　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、または
    　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
    である、請求項９に記載の血液製剤。
  11. 　下記一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     ［式中、Ｘは、フェニレン基；
    Ｙは、水素原子、または－（ＣＨ２）ｍＲ１；
    ｍは０～４のいずれかの整数；
    Ｒ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     Ｒ２は、置換されていてもよいＣ１～Ｃ６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、またはＣ１～Ｃ６アルコキシ基；
    Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、あるいはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって含窒素複素環を形成していてもよい；
    Ｒ５は、水素原子、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、またはＣ１～Ｃ６アルキルスルホニル基；
    Ｚは、水素原子またはＣ１～Ｃ６アルキル基を示す。］
    で表される化合物、もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物を、血小板を含む血液製剤に添加することを特徴とする、血液製剤における血小板の機能を維持するための方法。
  12. 　前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物が、
    　Ｎ－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（４－ジエチルアミノメチルフェニル）エチル］－Ｎ－ヒドロキシホルムアミド、または
    　Ｎ－｛４－［２－（４－ブト－２－イニルオキシベンゼンスルホニル）－１－（ホルミルヒドロキシアミノ）エチル］ベンジル｝メタンスルホンアミド、
    である、請求項１１に記載の方法。
PCT/JP2011/071190 2010-09-17 2011-09-16 血小板の機能を維持するための組成物 Ceased WO2012036257A1 (ja)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2811504A CA2811504C (en) 2010-09-17 2011-09-16 Composition for maintaining function of platelets
KR1020137004224A KR101836547B1 (ko) 2010-09-17 2011-09-16 혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물
JP2012534058A JP5876828B2 (ja) 2010-09-17 2011-09-16 血小板の機能を維持するための組成物
RU2013117422/04A RU2578607C2 (ru) 2010-09-17 2011-09-16 Композиция для поддержания функции тромбоцитов
EP11825255.0A EP2617812B1 (en) 2010-09-17 2011-09-16 Composition for maintaining platelet function
US13/824,325 US9034922B2 (en) 2010-09-17 2011-09-16 Composition for maintaining function of platelets
AU2011303013A AU2011303013B2 (en) 2010-09-17 2011-09-16 Composition for maintaining platelet function
CN201180044695.8A CN103189501B (zh) 2010-09-17 2011-09-16 用于维持血小板的功能的组合物
SG2013018999A SG188545A1 (en) 2010-09-17 2011-09-16 Composition for maintaining function of platelets
IL225199A IL225199A0 (en) 2010-09-17 2013-03-13 Assembly to preserve the function of blood platelets

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010210146 2010-09-17
JP2010-210146 2010-09-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012036257A1 true WO2012036257A1 (ja) 2012-03-22

Family

ID=45831710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/071190 Ceased WO2012036257A1 (ja) 2010-09-17 2011-09-16 血小板の機能を維持するための組成物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9034922B2 (ja)
EP (1) EP2617812B1 (ja)
JP (1) JP5876828B2 (ja)
KR (1) KR101836547B1 (ja)
CN (1) CN103189501B (ja)
AU (1) AU2011303013B2 (ja)
CA (1) CA2811504C (ja)
IL (1) IL225199A0 (ja)
RU (1) RU2578607C2 (ja)
SG (1) SG188545A1 (ja)
WO (1) WO2012036257A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014196624A1 (ja) 2013-06-07 2014-12-11 科研製薬株式会社 血小板の機能を維持するための組成物
CN114558032A (zh) * 2012-12-21 2022-05-31 安斯泰来再生医药协会 由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002535392A (ja) * 1999-01-27 2002-10-22 アメリカン・サイアナミド・カンパニー マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤としての２，３，４，５−テトラヒドロ−１ｈ−〔１，４〕ベンゾジアゼピン−３−ヒドロキサム酸
JP2005501087A (ja) * 2001-08-09 2005-01-13 アストラゼネカ・アクチエボラーグ アリールピペラジンとアリールピペリジン、およびメタロプロテイナーゼ阻害剤としてのそれらの使用
JP2007161686A (ja) * 2005-12-16 2007-06-28 Hideaki Hara 糖尿病網膜症治療剤及び眼局所投与用製剤
WO2008041370A1 (en) 2006-10-04 2008-04-10 The University Of Tokyo Structure enclosing hematopoietic progenitor cells from es cells and method for preparing blood cells using the same
JP2009513601A (ja) * 2005-10-26 2009-04-02 ラボラトワール セローノ ソシエテ アノニム メタロプロテイナーゼの調節のためのスルホンアミド誘導体とその使用
WO2009119105A1 (ja) 2008-03-28 2009-10-01 国立大学法人東京大学 ＧＰＩｂα＋ＧＰＶ＋ＧＰＶＩ＋血小板のインビトロ調製法
WO2009122747A1 (ja) 2008-04-01 2009-10-08 国立大学法人東京大学 ｉＰＳ細胞からの血小板の調製方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0994104A4 (en) * 1996-06-27 2001-09-12 Ono Pharmaceutical Co ARYL SULFIDE, SULFOXIDE AND SULPHONE DERIVATIVES AND MEDICINAL PRODUCTS CONTAINING THEM AS AN ACTIVE INGREDIENT
KR20000075808A (ko) * 1997-02-27 2000-12-26 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제로서의 ｎ-하이드록시-2-(알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 설파닐, 설피닐 또는 설포닐)-3-치환된 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴아미드
AR035311A1 (es) * 1999-01-27 2004-05-12 Wyeth Corp Derivados de acido hidroxamico que contienen alquinilo, como inhibidores de las metalloproteinasas de matriz y de la tace, composicion farmaceutica y el uso de los mismos para la manufactura de un medicamento
WO2000044712A1 (en) * 1999-01-27 2000-08-03 Abbott Laboratories N-hydroxyformamide derivatives as inhibitors of matrix metalloproteinases
US7511144B2 (en) * 2001-09-07 2009-03-31 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Reverse hydroxamic acid derivatives
GB0216382D0 (en) 2002-07-13 2002-08-21 Astrazeneca Ab Compounds
EP1581488B1 (en) 2002-12-19 2009-09-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of tace
WO2012005229A1 (ja) 2010-07-08 2012-01-12 科研製薬株式会社 Ｎ－ヒドロキシホルムアミド誘導体およびそれを含有する医薬

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002535392A (ja) * 1999-01-27 2002-10-22 アメリカン・サイアナミド・カンパニー マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤としての２，３，４，５−テトラヒドロ−１ｈ−〔１，４〕ベンゾジアゼピン−３−ヒドロキサム酸
JP2005501087A (ja) * 2001-08-09 2005-01-13 アストラゼネカ・アクチエボラーグ アリールピペラジンとアリールピペリジン、およびメタロプロテイナーゼ阻害剤としてのそれらの使用
JP2009513601A (ja) * 2005-10-26 2009-04-02 ラボラトワール セローノ ソシエテ アノニム メタロプロテイナーゼの調節のためのスルホンアミド誘導体とその使用
JP2007161686A (ja) * 2005-12-16 2007-06-28 Hideaki Hara 糖尿病網膜症治療剤及び眼局所投与用製剤
WO2008041370A1 (en) 2006-10-04 2008-04-10 The University Of Tokyo Structure enclosing hematopoietic progenitor cells from es cells and method for preparing blood cells using the same
WO2009119105A1 (ja) 2008-03-28 2009-10-01 国立大学法人東京大学 ＧＰＩｂα＋ＧＰＶ＋ＧＰＶＩ＋血小板のインビトロ調製法
WO2009122747A1 (ja) 2008-04-01 2009-10-08 国立大学法人東京大学 ｉＰＳ細胞からの血小板の調製方法

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENDER ET AL.: "Differentially regulated GPVI ectodomain shedding by multiple platelet-expressed proteinases", BLOOD, 19 July 2010 (2010-07-19)
BERGMEIER ET AL., BLOOD, vol. 102, 2003, pages 4229 - 4235
BERGMEIER ET AL., CIRCULATION RESEARCH, vol. 95, 2004, pages 660 - 670
CAESCU ET AL., BIOCHEMICAL J., vol. 424, 2009, pages 79 - 88
ETO ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, 2002, pages 12819 - 12824
FUJIMOTO ET AL., BLOOD, vol. 102, 2003, pages 4044 - 4051
GAUR ET AL., J THROMB HAEMOST., vol. 4, 2005, pages 436 - 442
HIROYAMA ET AL., EXP. HEMATOL., vol. 34, 2006, pages 760 - 769
HIROYUKI ETO ET AL.: "Saisei Iryo no Saibo Source 3 ES Saibo Yurai Kesshoban", BIOMEDICINE & THERAPEUTICS, vol. 43, no. 6, 2009, pages 21 - 26, XP008168096 *
MATTHIAS C. ET AL.: "TRANSFUSION MEDICINE", BLOOD, vol. 115, no. 9, 4 March 2010 (2010-03-04), pages 1835 - 1842
MOSS ET AL., NATURE, vol. 385, 1997, pages 733 - 736
MUSSO D.L. ET AL.: "N-Hydroxyformamide peptidomimetics as TACE/Matrix metalloprotease inhibitors: oral activity via P1 isobutyl substitution", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 11, 2001, pages 2147 - 2151, XP055082834 *
PETERSON ET AL., CARDIOVASC. RES., vol. 69, 2006, pages 677 - 687
ROBERT ET AL.: "Glycoprotein Ibalpha receptor instability is associated with loss of quality of platelets produced in culture", STEM CELLS AND DEVELOPMENT, 26 May 2010 (2010-05-26)
RUGGERI ZM., NATURE MEDICINE, vol. 8, no. 11, November 2002 (2002-11-01), pages 1227 - 1234
See also references of EP2617812A4
SKIPPER ET AL., CANCER RES., vol. 40, 1980, pages 4704 - 4708
TAKIZAWA ET AL., THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 120, no. 1, January 2010 (2010-01-01), pages 179 - 190

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114558032A (zh) * 2012-12-21 2022-05-31 安斯泰来再生医药协会 由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物
CN114558032B (zh) * 2012-12-21 2025-07-29 安斯泰来再生医药协会 由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物
WO2014196624A1 (ja) 2013-06-07 2014-12-11 科研製薬株式会社 血小板の機能を維持するための組成物
KR20160018517A (ko) 2013-06-07 2016-02-17 가껭세이야꾸가부시기가이샤 혈소판의 기능을 유지하기 위한 조성물
CN105392482A (zh) * 2013-06-07 2016-03-09 科研制药株式会社 用于维持血小板的功能的组合物
EP3006029A4 (en) * 2013-06-07 2017-01-04 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Composition for maintaining platelet function
JPWO2014196624A1 (ja) * 2013-06-07 2017-02-23 科研製薬株式会社 血小板の機能を維持するための組成物
CN105392482B (zh) * 2013-06-07 2017-08-08 科研制药株式会社 用于维持血小板的功能的组合物

Also Published As

Publication number Publication date
RU2578607C2 (ru) 2016-03-27
JPWO2012036257A1 (ja) 2014-02-03
KR101836547B1 (ko) 2018-04-19
EP2617812A1 (en) 2013-07-24
US9034922B2 (en) 2015-05-19
RU2013117422A (ru) 2014-10-27
CA2811504A1 (en) 2012-03-22
IL225199A0 (en) 2013-06-27
CN103189501B (zh) 2015-04-22
AU2011303013B2 (en) 2014-08-21
CN103189501A (zh) 2013-07-03
JP5876828B2 (ja) 2016-03-02
EP2617812B1 (en) 2019-03-20
SG188545A1 (en) 2013-04-30
EP2617812A4 (en) 2014-10-22
AU2011303013A1 (en) 2013-04-11
CA2811504C (en) 2018-06-05
US20130177900A1 (en) 2013-07-11
KR20140007788A (ko) 2014-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104508121B (zh) 体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法
CN110268048B (zh) 从人多能干细胞生成心房心肌细胞和心室心肌细胞谱系
JP5764598B2 (ja) 幹細胞を培養するための方法及びキット
KR20140082673A (ko) 다능성 간세포로부터의 거핵구 및/또는 혈소판의 제조 방법
WO2011043629A2 (ko) 인간 지방 줄기세포의 고활성을 유도하는 방법 및 배지
WO2012096461A2 (ko) 줄기세포의 부유배양용 조성물
US11629132B2 (en) Compounds for inducing proliferation and differentiation of cells, and methods of use thereof
KR102230631B1 (ko) 줄기 세포로부터 동심방결절 세포 (심박조율기 세포) 를 생산하는 방법, 및 생산된 동심방결절 세포의 용도
JP5876828B2 (ja) 血小板の機能を維持するための組成物
CN103396985A (zh) 诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法与应用
WO2012157612A1 (ja) 細胞分化誘導剤および分化誘導方法
KR20220122667A (ko) 조혈 줄기세포의 배양 방법
WO2009119105A1 (ja) ＧＰＩｂα＋ＧＰＶ＋ＧＰＶＩ＋血小板のインビトロ調製法
EP2617415B1 (en) Use of a compound for inducing differentiation of mesenchymal stem cells into cartilage cells
WO2024117199A1 (ja) 組成物、細胞の生産方法、細胞、細胞の培養方法および組成物の生産方法
JPWO2019151097A1 (ja) 心筋細胞の製造方法
Thongsa-Ad et al. Improving hematopoietic differentiation from human induced pluripotent stem cells by the modulation of Hippo signaling with a diarylheptanoid derivative
JP4012399B2 (ja) 再生医療用薬剤の簡便なスクリーニング
EP4372080A1 (en) Pericyte-like cell expressing vascular endothelial growth factor (vegf) at high level
US20240316115A1 (en) Method for producing vascular endothelial growth factor (vegf)- highly expressing pericyte-like cell
WO2025024235A1 (en) A novel method for the automatic generation of cell spheroid with core-shell structure
WO2022210712A1 (ja) 細胞シートの製造方法
WO2025159194A1 (ja) 組成物、培地、細胞集団、細胞の生産方法、及び治療薬
TW202309044A (zh) 氧呯衍生物
IE20120312A1 (en) Growing eukaryotic cells in culture using adult camel blood serum

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11825255

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012534058

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20137004224

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 225199

Country of ref document: IL

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2811504

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13824325

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011825255

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011303013

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20110916

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013117422

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A