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WO2012026566A1 - 新規人工翻訳合成系 - Google Patents

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Publication number
WO2012026566A1
WO2012026566A1 PCT/JP2011/069251 JP2011069251W WO2012026566A1 WO 2012026566 A1 WO2012026566 A1 WO 2012026566A1 JP 2011069251 W JP2011069251 W JP 2011069251W WO 2012026566 A1 WO2012026566 A1 WO 2012026566A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
trna
amino acid
codon
amino acids
artificial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2011/069251
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
裕明 菅
村上　裕
佑樹 後藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to CN201180052318.9A priority Critical patent/CN103189522B/zh
Priority to EP11820026.0A priority patent/EP2610348A4/en
Priority to US13/816,911 priority patent/US9701993B2/en
Publication of WO2012026566A1 publication Critical patent/WO2012026566A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a novel artificial translation synthesis system using a double genetic code table and artificial codon box division.
  • the inventors named this method “Flexible In-vitro Translation (FIT) system.
  • the translation is a protein synthesis system that is universally performed in vivo, and the ribosome is composed of 20 kinds of proteinous amino acids in turn, using mRNA coding genetic information as a blueprint. Proteins are synthesized accurately by connecting them together. There is no other system that can polymerize various building blocks with precise sequence control, and translation is the best compound precision synthesis system we can use.
  • translation synthesis has many advantages over conventional chemical synthesis methods when a peptide library is constructed and used for the purpose of isolating a functional peptide from the library.
  • a random peptide library can be constructed at once by performing a translation reaction from mRNA having random sequence (or corresponding DNA).
  • mRNA can be amplified and sequenced by molecular biology techniques, allowing library compounds to be re-synthesized and deconvolved (in this technology, the active peptide group enriched from a random peptide library is divided. It also means that it is easy to determine individual sequences).
  • individual peptides as translation products can be directly tagged with mRNAm as a template.
  • an amplifiable / readable tag is added to each peptide molecule in the library.
  • the advantages of constructing a peptide library in a translation system are as follows: 1) high diversity can be obtained easily (up to 10 13 or more), 2) deconvolution is easy, and 3) library amplification is possible. 4) The selection method using in vitro display technology can be performed.
  • the ribosome translation system makes it possible to construct a highly efficient peptide library as described above.
  • the ribosome translation system is a mechanism specialized for producing natural proteins and peptides. It has a fatal defect that only polypeptides consisting of sex amino acids can be synthesized. In other words, peptides containing “special amino acids” with more structural and functional group variations cannot basically be translationally synthesized.
  • the “special amino acid” refers to all amino acids having a structure different from that of proteinaceous amino acids found in proteins.
  • a method called extension of the genetic code uses stop codons and artificial four-base codons that are not used to specify amino acids in natural translation systems, and assigns the 21st amino acid other than protein amino acids to these codons. This made it possible to synthesize proteins and peptides containing amino acids other than protein.
  • a reprogramming method of the genetic code (rewriting by initialization) that assigns non-protein amino acids to empty codons created by removing proteinaceous amino acids from the system was developed.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 The use of proteinaceous amino acids has become possible (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • the reprogramming method of the genetic code also has the disadvantage that it is necessary to remove some proteinaceous amino acids, so that the types of available proteinous amino acids are sacrificed and all 20 proteinaceous amino acids cannot be used.
  • the conventional methods for modifying the genetic code have limited the number of non-protein amino acids or protein amino acids that can be used, and cannot be said to be a synthetic system that can freely use a desired amino acid.
  • special amino acids whose structure is far from the natural L- ⁇ -amino acid (for example, D-form amino acid and N-methyl amino acid) are not allowed as a substrate in the translation system even if they are assigned to empty codons by the method described above. In general, it was not incorporated into peptide synthesis. In other words, special amino acids are amino acids that are generally not or very difficult to be incorporated into peptide chains by ordinary translation systems or conventional modified translation systems.
  • the present inventors have proposed and established two new concepts in the modification of the genetic code, and in principle completed a new artificial translation synthesis system (FIT system) that can simultaneously use more than 40 amino acids.
  • FIT system new artificial translation synthesis system
  • Double genetic code In the natural universal genetic code table, one codon defines only one type of amino acid. However, in prokaryotic translation, the AUG codon specifies fMet (formylmethionine) in the initiation reaction and Met (methionine) in the subsequent extension reaction. Strictly speaking, structurally different amino acids fMet and Met are defined by initiation and elongation, respectively. Here, the present inventors thought that other codons can be used for both initiation and extension as well, and that they can correspond to different amino acids. In other words, a new artificial codon table dedicated to the start reaction is prepared separately from the one for extension, and a new concept “double genetic code” in which two functions simultaneously.
  • a novel artificial translation synthesis system that combines double genetic code table and artificial codon box partitioning Creates a translation system that greatly increases the types of amino acids that can be used simultaneously by combining double genetic code table and artificial codon box partitioning I can do it. That is, a plurality of Dual sense codons used in the double genetic code table are placed in an artificially divided codon box. That is, four different amino acid residues are assigned within one codon box. In addition, special amino acids can be assigned to stop codons. This makes it possible to use 20 types of total protein amino acids + 11 or more artificial starting residues + up to 12 special amino acids simultaneously in one translation system. Furthermore, since it is possible to place Dual sense codons in places other than the artificially divided codon boxes, a translation system that can use 40 or more amino acids at the same time can be used.
  • FIG. 2a shows a conventional rewriting method of the initiation reaction
  • b shows the FIT system of the present invention.
  • the Fit system can cyclize with various structures to obtain a library of peptides containing multiple special amino acids.
  • the gist of the present invention is as follows. (1) A method of synthesizing a peptide into which a special amino acid has been introduced by adding a tRNA combined with a special amino acid to a cell-free translation system and performing peptide synthesis, In the translation initiation reaction on the ribosome, a special amino acid bound to the initiation tRNA having an anticodon complementary to the codon at the translation start site of mRNA is introduced into the peptide N-terminal by functioning as the initiation amino acid, In a peptide chain elongation reaction, a special amino acid was linked according to a modified genetic code table characterized in that a part of a plurality of codons specifying one protein amino acid in the universal genetic code table is assigned to a special amino acid.
  • the method wherein a special amino acid is introduced at a position designated by the anticodon of the extension tRNA.
  • the method as described above, wherein the tRNA bound with the special amino acid is prepared by aminoacylating in vitro a tRNA transcriptionally synthesized in vitro.
  • the modified genetic code table for the extension reaction is a universal genetic code table where some of the codons specifying Leu, Val, Ser, Pro, Thr, Ala, Arg, and Gly are special amino acids. Said method, wherein the method is a genetic code table.
  • the cell-free translation system uses tRNA synthesized for in vitro as a set of tRNA and ARS (aminoacyl tRNA synthetase) for proteinous amino acids, and protein amino acids specific to this in place of natural tRNA.
  • said method comprises a set of ARS that can be ligated to the target and does not comprise natural tRNA.
  • the codon at the translation initiation site is an artificial initiation codon consisting of AUG or any triplet sequence other than AUG.
  • the artificial initiation codon is AUG, UGG, AUC, ACC, UCG, AAC, GCC, GGC, CCG, CGG, GGG, or AUA.
  • codons of the same sequence can be assigned to different special amino acids in the translation initiation reaction and extension reaction by binding different special amino acids to the start tRNA having the same sequence anticodon and the extension tRNA.
  • codons having the same sequence assigned to different special amino acids in the translation initiation reaction and the extension reaction are AUG, UGG, AUC, ACC, UCG, or AAC.
  • nucleic acid library consisting of template nucleic acids having various different sequences, initiation tRNA having various anticodon sequences bound to any special amino acid, and extension having various anticodon sequences bound to any special amino acid
  • tRNA is added to a cell-free translation system to synthesize a peptide library comprising special peptides having various sequences.
  • the special peptide is synthesized in a state of being bound to a template nucleic acid encoding the special peptide.
  • a kit for translating and synthesizing a special peptide (i) mRNA, wherein the region encoding the peptide comprises (a) an artificial initiation codon that designates an artificial initiation residue, and (b) an extension codon that designates a special amino acid; (ii) an aminoacyl-tRNA for an artificial initiation residue and a special amino acid, wherein (c) an initiation tRNA having an artificial initiation residue bound to the artificial initiation codon of (a) and having an anticodon complementary thereto, and (d ) An extended tRNA having an anticodon complementary to the extended codon of (b) and bound with a special amino acid; (iii) a set of tRNA and ARS for proteinaceous amino acids, comprising a proteinous amino acid, an artificial tRNA not containing a modified base, and an ARS capable of binding a proteinaceous amino acid; and (iv) The kit comprising at least an isolated ribosome.
  • the present invention has made it possible to dramatically improve the diversity of special peptides synthesized by a cell-free translation system. Furthermore, peptide synthesis is possible with a small number of factors that are easy to control, compared to conventionally known translation systems, and can be easily produced.
  • the peptide library constructed using the translation system (FIT system) of the present invention can cover a wider sequence space than before, and can be expected to have great advantages in searching for bioactive peptides.
  • Protein amino acids or natural amino acids are ⁇ -aminocarboxylic acids (or substituted ⁇ -aminocarboxylic acids) used in normal translation, such as alanine (Ala), valine (Val), leucine (Leu), and isoleucine.
  • FIG. 1 is an example of an artificial genetic code proposed in the present invention.
  • Two codon tables can be used, dedicated to the start reaction (left) and dedicated to the extension reaction (right).
  • Xi and Xa mean an artificial starting residue and a special amino acid for elongation, respectively.
  • the codon table for extension reaction is characterized in that the codon box can be divided and additional special amino acids can be defined. There are 11 split codon boxes that are not essential for the designation of the 20 proteinaceous amino acids. Therefore, up to 11 unnatural amino acids can be designated in these split codon boxes while maintaining 20 natural amino acids. For example, in the universal genetic code table, two of the four or six codons that specify Leu, Val, Ser, Pro, Thr, Ala, Arg, and Gly, respectively, remain assigned to the original proteinaceous amino acid. Nevertheless, the remainder of these codons (2 or 4) can be assigned to any special amino acid.
  • amino acids refer to both proteinaceous amino acids and special amino acids.
  • the “special amino acid” refers to all amino acids having a structure different from that of the 20 protein amino acids used in natural translation. In other words, non-protein amino acids, artificial amino acids, D-form amino acids, N-methyl amino acids, N-acyl amino acids, ⁇ -amino acids, and amino acid skeletons in which part of the side chain structure of proteinaceous amino acids is chemically altered or modified And all derivatives having a structure in which the amino group or carboxyl group is substituted.
  • a special amino acid that is incorporated into the N-terminus of a peptide in an initiation reaction is particularly referred to as an “artificial initiation residue”, whereas a special amino acid that is incorporated into a peptide chain in an extension reaction is referred to as a “special amino acid” in a narrow sense.
  • an artificial initiation residue a special amino acid that is incorporated into a peptide chain in an extension reaction.
  • special amino acid in a narrow sense.
  • “Peptides into which special amino acids have been introduced” or “special peptides” include polymers having these various special amino acids as constituent elements.
  • a special peptide can have some or all of its constituent elements special amino acids. Therefore, a special peptide can also have a structure different from a normal amide bond as a main chain skeleton.
  • depsipeptides composed of amino acids and hydroxy acids, polyesters in which hydroxy acids are continuously condensed, N-methyl peptides, peptides having various acyl groups at the N-terminus (acetyl groups, pyroglutamic acids, fatty acids, etc.) Included in special peptides.
  • the special peptide also includes a cyclic peptide.
  • TRNA is an RNA molecule having a sequence capable of forming a secondary structure similar to a clover leaf structure, and further takes an L-shaped compact tertiary structure, and has a 3 ′ end corresponding to one end of the L-shaped structure. An amino acid is bound to (acylation) and the codon on mRNA is recognized by an anticodon located at the other end.
  • tRNA refers to both natural and artificially constructed tRNAs.
  • a typical example of an artificially constructed tRNA is a tRNA synthesized by in vitro transcription.
  • Starting tRNA To start translation of mRNA, a specific tRNA called “starting tRNA” is required. Initiation tRNA bound to the starter amino acid binds to the small subunit of ribosome together with the initiation factor (IF), and the small subunit of ribosome binds to the start codon on the mRNA to start translation.
  • IF initiation factor
  • AUG which is a methionine codon
  • the start tRNA has an anticodon corresponding to methionine, and the start tRNA always contains methionine (formylmethionine in prokaryotes). Carry.
  • the starting amino acid is not limited to methionine by binding an arbitrary starting amino acid to the starting tRNA having an arbitrary anticodon
  • the starting codon is not limited to AUG.
  • an initiation codon other than AUG or AUG that designates an amino acid other than methionine (or formylmethionine) is referred to as an “artificial initiation codon”.
  • a special amino acid designated by an artificial start codon and introduced at the N-terminus of a peptide is referred to as an “artificial start residue”.
  • the first base (first base at the 5 'end) and the 72nd base are mismatched (non-complementary), and this mismatched base pair is recognized by methionylformyltransferase (MTF). It is said that by being formylated, it is incorporated into the initiation reaction and the binding with EF-Tu is suppressed. (Mayer C, Stortchevoi A, Kohrer C, Varshney U, RajBhandary UL. Initiator tRNA and its role in initiation of protein synthesis. Cold Spring Harb Symp Quasnt Biol. 2001; 66: 195-206.
  • the translation initiation reaction requires the formyl group and the formyl donor (10-formyl-5,6,7,8-tetrahydroforlic acid) to modify the amino group of methionine on the starting tRNA with the formyl group.
  • the formyl donor (10-formyl-5,6,7,8-tetrahydroforlic acid) to modify the amino group of methionine on the starting tRNA with the formyl group.
  • tRNA fMetE As an example of the starting tRNA, tRNA fMetE is used in the examples described later.
  • the base sequence of this tRNA is the natural tRNA fMet of E. coli: (5'-CGCGGGG s4 UGGAGCAGCCUGGDAGCUCGUCGGGCmU CAU AACCCGAAGAUCGUCGGT ⁇ CAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3 ').
  • s4 U 4-thiouridine
  • D dihydrouridine
  • Cm 2'-O-methylcytidine
  • T ribothymidine
  • ⁇ pseudouridine
  • SEQ ID NO: 7 The underlined CAU corresponds to the anticodon and AUG starts Corresponds to a codon.
  • the present inventors made in vitro transcription a starting tRNA fMetE in which the modified base was removed and the first C at the 5 ′ end was changed to G for this natural tRNA.
  • the sequence of tRNA fMetE used in Examples of the present application is shown.
  • NNN corresponds to the anticodon and is changed to correspond to the start codon. 5'-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUNNNAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCGCAACCA-3 '([No place of modification, 6 places in total: s4 U8U, D20U, Cm32C, T54U, ⁇ 55U.] [1 place of mutation, 1 place in C]
  • Extension tRNA In the peptide chain elongation reaction, an “extension tRNA” or “extension tRNA” combined with amino acids binds to the elongation factor Tu (called EF-Tu in prokaryotes and eEF-1A in eukaryotes). To the A site of the ribosome. In prokaryotic elongated tRNA, the first base and the 72nd base are base-paired, and the 50th base and the 64th base are base-paired. -It is said that it is necessary for recognition by Tu.
  • tRNA AsnE2 an artificial tRNA derived from tRNA Asn
  • the base sequence of this tRNA is the natural tRNA Asn of Escherichia coli.
  • the present inventors eliminated in vitro modified tRNA Asn-E2 that is not subjected to aminoacylation by 20 aminoacylating enzymes of E. coli by eliminating the modified base and introducing mutations to this natural tRNA. It was produced by. NNN corresponds to the anticodon and is changed to correspond to the extension codon.
  • “Complementary” Nucleic acid base combinations that can form base pairs are said to be “complementary” to each other.
  • DNA adenine (A) and thymine (T), and guanine (G) and cytosine (C)
  • a and uracil (U) in RNA
  • G and C in RNA
  • U uracil
  • G and C in RNA
  • non-Watson-Crick base pairs such as GU
  • GU thermodynamically stable base pairs, so these combinations are also referred to herein as “complementary”.
  • the correspondence between mRNA codons and tRNA anticodons depends on complementary base pairing.
  • non-Watson-Crick base pair pairs are allowed according to the Wobble rule.
  • corresponding to the codon sequence and the anticodon sequence means that the codon sequence and the anticodon sequence form a complementary chain.
  • Peptide translation synthesis method relates to a double genetic code table and novel cell-free by artificial codon box divided (in vitro) artificial translation synthesis system "Flexible In-vitro Translation (FIT) system ".
  • FIT Fluorescence In-vitro Translation
  • a translation system or translation synthesis system is a concept that includes both methods and kits for peptide translation synthesis.
  • the peptide translation synthesis method according to the present invention is a method for synthesizing a special peptide by adding a tRNA combined with a special amino acid to a cell-free translation system and performing peptide synthesis.
  • the cell-free translation system “Flexible In-vitro Translation (FIT) system” in this case is a mixture prepared by arbitrarily mixing proteins, RNA, and small molecules necessary for translation.
  • FIT Fluorous In-vitro Translation
  • the technique described in the following literature which is a system using E. coli ribosome, is known: H. F. Kung, B. Redfield, B. V . Treadwell, B. Eskin, C. Spears and H.
  • FIT system any of its components can be removed freely. As long as it has such characteristics, in the FIT system, components synthesized in vitro can be used in appropriate combination with components isolated from any organism. In the description of the present specification and the examples to be described later, the description is made using a prokaryotic-derived system, but this is for the convenience of explanation only and is not intended to exclude the use of a eukaryotic-derived translation system. Absent.
  • T7 RNA polymerase when transcription is also performed from DNA
  • Escherichia coli initiation factor elongation factor, termination factor, and ribosome recycling as translation factors Factors
  • Escherichia coli initiation factor elongation factor
  • termination factor elongation factor
  • ribosome recycling as translation factors Factors
  • ARS aminoacyl tRNA synthetases
  • MTF methionyl tRNA formyltransferase
  • E. coli 70S ribosome
  • E. coli tRNA isolated from E. coli
  • various amino acids NTP, energy regeneration system and others were included.
  • a translation system is prepared in which no constituent molecules such as amino acids, aminoacyl tRNA synthetase, methionyl tRNA formyltransferase, termination factor, and tRNA are added.
  • Such a system will not function as a normal translation system, but by adding artificially synthesized elements such as those in which an in vitro-transcribed tRNA is charged with an amino acid or other components. Revive the peptide synthesis function. In other words, it is possible to reprogram the desired genetic code by not adding translation system components as necessary.
  • the aminoacyl-tRNA required for the assignment of special amino acids and artificial starting residues is prepared by isolating the tRNA transcribed and synthesized in vitro and aminoacylating in vitro.
  • the aminoacylation of the isolated tRNA in vitro means that the desired amino acid is bound to the 3 'end of the tRNA in the absence of other tRNA or ARS.
  • a method applicable to any amino acid is preferable. Examples of such methods include chemical aminoacylation methods (HecklereckT. G.,. Chang L. H., Zama Y., Naka T., Chorghade M. S.,.
  • the most preferable method for aminoacylating tRNA in vitro is to synthesize it using ARS ribozyme, using in vitro transferred tRNA as a substrate.
  • ARS ribozyme As the aminoacyl-tRNA synthetase used in the present invention, ARS ribozyme (flexizyme), which is an RNA catalyst created by the present inventors by evolution molecular engineering, is suitable. Unlike the natural ARS protein enzyme, ARS ribozyme has no specificity for each amino acid and each tRNA, and can be aminoacylated using any amino acid or hydroxy acid other than the amino acid to be originally charged.
  • Flexizyme is also known by names such as dinitrobenzyl flexizyme (dFx), enhanced flexizyme (eFx), and aminoflexizyme (aFx).
  • dFx dinitrobenzyl flexizyme
  • eFx enhanced flexizyme
  • aFx aminoflexizyme
  • RNA sequences of known ARS ribozymes are shown below.
  • Prototype Flexizyme Fx [GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU-3 ', 45nt] (SEQ ID NO: 3)
  • Dinitrobenzyl flexizyme dFx [5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU-3 ', 46nt]
  • SEQ ID NO: 4 Enhanced Flexizyme eFx [5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU-3 ', 45nt]) (SEQ ID NO: 5)
  • Aminoflexizyme aFx [5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU-3 ', 47nt]) (SEQ ID NO: 6)
  • the aminoacylation reaction with flexizyme can be performed under mild conditions, and can be introduced into a translation system and used by simple post-treatment.
  • the aminoacylation reaction with flexizyme proceeds by simply placing the amino acid substrate and the binding partner tRNA molecule on ice for about 2 hours in the presence of flexizyme.
  • an artificial tRNA having orthogonality with natural ARS is used as an extended tRNA for special amino acids. That is, an artificial tRNA that is not recognized by the natural ARS inherent in the translation system and is not charged by a natural amino acid in the translation system is used. Such artificial tRNA can be synthesized by in vitro transcription.
  • an artificial tRNA derived from E. coli tRNA Asn is used in the following description and examples.
  • the present invention is not limited to this, and any tRNA that has been confirmed to be orthogonal to the endogenous ARS in the translation system to be used and used in the peptide elongation reaction on the ribosome can be used. It can be used.
  • the initiation tRNA has a different sequence than the extension tRNA and is recognized by the initiation factor.
  • an artificial tRNA derived from E. coli tRNA fMet (tRNA fMetE ) synthesized by in vitro transcription is used.
  • the present invention is not limited to this, and any tRNA that has been confirmed to be used in the peptide translation initiation reaction on the ribosome in the translation system to be used can be used.
  • a kit including specific components for translational synthesis of the component special peptide of the Fit system is also an aspect of the present invention.
  • the specific components of the translation system that can be used in the present invention will be described in comparison with a conventionally known system.
  • the translation system is provided with DNA or RNA molecules corresponding to the base sequence that is the template for translation.
  • an appropriate RNA polymerase such as T7 RNA polymerase.
  • T7 RNA polymerase When pre-transcribed mRNA is added to the translation system, it is not necessary to add RNA-polymerase.
  • the nucleic acid sequence may additionally contain a base sequence advantageous for translation in accordance with the translation system to be used, in addition to the region encoding the target amino acid sequence, in the same manner as the protein expression system using living cells. it can.
  • the efficiency of the translation reaction is increased by including a Shine-Dalgarno (SD) sequence or an epsilon sequence upstream of the initiation codon.
  • SD Shine-Dalgarno
  • An artificial start codon that designates a special amino acid serving as an artificial start residue is arranged at the N-terminus of the region encoding the peptide.
  • the special amino acid introduced in the extension reaction is specified by the extension codon.
  • a sequence for linking a nucleic acid molecule and a peptide that is a translation product thereof may be included for in vitro display as in the conventional system.
  • the translation system is provided with tRNA that has been aminoacylated with an artificial start residue or special amino acid in advance for the artificial start residue / special amino acid.
  • tRNA for protein amino acids, a set of protein amino acids, tRNAs and specific ARS protein enzymes is provided.
  • E. coli-derived tRNA is used in a conventionally known system using Escherichia coli ribosomes.
  • an artificial tRNA synthesized by in vitro transcription is used.
  • ARS 20 types of ARS corresponding to all proteinaceous amino acids are used in the conventionally known system.
  • all 20 types are not necessarily used. Does not require ARS.
  • N-formylmethionine is defined in the start codon AUG by the start tRNA, so 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydroforlic acid (Baggott et al., 1995)
  • a special amino acid artificial start residue
  • the formyl donor is optional.
  • methionyl-tRNA-formyltransferase is not essential.
  • ribosomes as protein synthesizers are essential.
  • a ribosome is an RNA-protein complex in which more than 50 ribosomal proteins and several RNA molecules (rRNA) are assembled. It reads the genetic information of mRNA and catalyzes the polymerization of amino acids.
  • Ribosomes isolated from E. coli are preferably used, but those derived from other organisms can also be used.
  • proteins include translation initiation factors (eg, IF1, IF2, IF3), translation elongation factors (eg, EF-Tu, EF-Ts, EF-G), translation termination factors (eg, RF1, RF2, RF3, RRF). ), Enzymes for regeneration of energy sources (for example, creatine kinase, myokinase, pyrophosphatase, nucleotide-diphosphatase kinase) are used. Among these, addition of an enzyme for regeneration of a translation termination factor / energy source is optional.
  • the artificial starting residue is referred to as Xi
  • the special amino acid used for the extension reaction is referred to as Xa.
  • Double genetic code In order to use multiple codons as artificial start codons, multiple aminoacyl start tRNAs with various anticodon sequences are added to the translation system. If each of them is charged with a separate artificial start residue, each artificial start residue can be assigned to a codon corresponding to the anticodon sequence (artificial start codon). If a sequence of artificial start codons is present at the start codon position on the translated mRNA, the corresponding aminoacyl start tRNA (eg, aminoacyl tRNA fMetE with the corresponding anticodon sequence) reads them and the desired artificial start A peptide with a residue at the N-terminus is synthesized.
  • the corresponding aminoacyl start tRNA eg, aminoacyl tRNA fMetE with the corresponding anticodon sequence
  • the translation system has a plurality of aminoacyl extension tRNAs having various anticodon sequences (for example, aminoacyl tRNA AsnE2 having corresponding anticodon sequences).
  • the starting tRNA and the extended tRNA have different sequences, they do not function wrongly (for example, the extended tRNA is not used in the starting reaction, and vice versa). This makes it possible to assign different amino acids to one codon sequence in the initiation reaction and the extension reaction.
  • Codon box artificial division Since natural tRNA is modified in its nucleotide sequence, even less than 3 tRNAs can read all four codon sequences in one codon box. For example, Val tRNA in which U in the anticodon sequence UAC is modified to cmo5U reads all four codons in GU (U / C / A / G). This is why the GUN codon box is occupied by Val.
  • tRNA Those synthesized in vitro by an appropriate RNA polymerase are preferred. Since intvitro synthesized tRNAs do not have modified bases, they do not read 4 types of codons as described above.
  • Val codon box for example, for example, in vitro synthesized tRNA Val CAC with CAC anticodon and tRNA AsnE2 (Xa-tRNA AsnE2 GAC ) with GAC anticodon acylated with the desired special amino acid.
  • tRNA Val CAC is converted to Val-tRNA Val CAC by Val ARS in the system and Val is assigned by reading the GUG codon, and Xa-tRNA AsnE2 GAC is independently GU (U / C) codon. Read and assign Xa.
  • the codon box that is normally used for only one amino acid can be artificially divided, and the desired special amino acid can be added to the genetic code while retaining the original protein amino acid.
  • the translation reaction can be started at least UGG, AUC, ACC, UCG, AAC, GCC, GGC, CCG, CGG, AUA in addition to the natural start codon AUG, and a wide range of codons can be used as artificial start codons Was confirmed.
  • tRNA Ac Phe-tRNA fMetE xxx , xxx means each anticodon
  • N-acetylphenylalanine Ac Phe
  • tRNA fMetE having anticodon sequence corresponding to each Dual sense codon codon sequence preparing and the tRNA AsnE2 having an anticodon sequence N- acetyllysine (Aly) were allowed to charge tRNA (Aly-tRNA AsnE2 xxx) .
  • mRNA was translated in the presence of two types of aminoacyl-tRNAs, starting and extending, and it was confirmed whether or not the desired peptide containing Ac Phe at the N-terminus and Aly in the peptide chain could be obtained as a translation product.
  • the artificial start codons of AUG, UCG, AAC and UGG are N-acetylphenylalanine ( Ac Phe), N-pentenoylphenylalanine ( Pe Phe) and N-aminomethylbenzoylphenylalanine ( BA Phe, respectively). ), N-methylhexanoylphenylalanine ( Mh Phe), and N-acetyllysine (Aly), iodophenylalanine (Iph), and hydroxyproline as the extension codons for AUG, UCG, AAC, and UGG, respectively.
  • Codon box artificial partitioning experiment ( Figure 7-10) Here we describe an experiment in which the codon boxes of valine, serine, arginine, and glycine were artificially divided.
  • Fig. 7 is an image of a codon box splitting experiment.
  • a translation system that does not contain any natural tRNA (translationRNAsystem without natural tRNAs) is used.
  • the codon box is artificially divided by adding a synthesis technology), and the original proteinaceous amino acid and the special amino acid coexist in each of the divided boxes.
  • the desired peptide that is, a peptide containing both natural and non-natural amino acids present in a divided codon box
  • the concept of artificial division of codon boxes was experimentally verified, and a translational synthesis system that can simultaneously use natural 20 amino acids + 4 special amino acids was established.
  • the GUN codon box was divided, and the protein amino acid Val was assigned to the GUG codon and the special amino acid Me Tyr was assigned to the GUC codon.
  • P-1 and P-2 The sequence of mRNA used and the amino acid sequence encoded by it (P-1 and P-2). [Lower, left] Tricine-SDS PAGE of translation products. Lane 1: Synthesizes P-1 by translating mRNA using a normal translation system that contains all natural tRNA. Lane 2: Synthesizes P-1 by translating mRNA in a translation system that does not contain all natural tRNA and adds necessary in vitro transcribed tRNA.
  • Lane 3 Synthesizes P-2 by translating mRNA in a translation system that does not contain all natural tRNAs and adds necessary in vitro transcribed tRNAs and non-natural aminoacyl tRNAs.
  • MALTI-TOF MS analysis Mass analysis results (MALTI-TOF MS analysis) of peptides synthesized by translation under conditions of Lane 2 and 3 of Tricine-SDS PAGE. As specified, synthesis of peptides with sequences P-1 and P-2 was confirmed.
  • FIG. 10 shows an experiment in which two codon boxes are divided at a time.
  • the codon boxes of (1) CGN, GUN, (2) UCN, GUN, (3) CGN, GGN were divided, respectively.
  • the results of actual translation synthesis and mass analysis of translation products are shown on the right.
  • the split genetic code the synthesis of peptides containing both natural and non-natural amino acids in multiple split codon boxes was confirmed.
  • FIG. 11 is an image diagram of a new artificial translation system using a combination of a double genetic code and a split codon box.
  • This translation system uses a translation system that does not contain any natural tRNA. This includes tRNAs (synthesized by in vitro transcription) required to specify 20 proteinaceous amino acids, and aminoacyl tRNAs (in vitro transcription, and the necessary special amino acids and artificial start residues). Synthesis) using an acylation technique such as flexizyme.
  • the codon box of serine, arginine, and glycine was artificially divided, and a certain codon present therein was also used as an artificial start codon, which was also made to function as a dual-sense codon.
  • tRNA fMetE artificial start residues Ac Tyr-tRNA fMetE CCG, Pen Tyr-tRNA fMetE CGA, Mh Phe-tRNA fMetE CCC
  • tRNA with the special amino acid AsnE2 Me Ser -tRNA AsnE2 GCG , Aly-tRNA AsnE2 GGA , Iph-tRNA AsnE2 GCC
  • tRNA Arg CCG Arg CCG
  • tRNA Ser CGA tRNA Gly
  • CCC proteinaceous amino acids
  • FIG. 12 shows the results of the above peptide synthesis example.
  • (1) CGG ⁇ (2) UCG ⁇ (3) GGG is used as an artificial start codon
  • the codon box of (1) CGN ⁇ (2) UCN ⁇ (3) GGN is divided and special Amino acids were assigned.
  • Special peptides are generic names for peptides containing structures such as N-terminal acyl groups, N-methylamino acids, D-amino acids, and macrocyclic skeletons. Because of these special skeletons, they have medicinal properties such as membrane permeability, specificity, and biological stability. In addition, it has the characteristics necessary for drug development and can be expected as a motif for drug development. Since the translation system is an excellent synthesis method for constructing a peptide library, a technique capable of synthesizing a special peptide using the translation system has become a very powerful tool for searching for new drug candidates.
  • This technology can increase the number of special amino acids that can be used in one translation system (usually 20 proteinaceous amino acids, adding more than 20 special amino acids to a total of 40 or more). Thereby, the sequence space in the special peptide library constructed by the translation system can be greatly expanded. This means that the obtained peptide library shows not only high sequence diversity but also high structural diversity, and it can be said that it is possible to construct a library of better quality.

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Abstract

特殊アミノ酸を結合したtRNAを無細胞翻訳系に添加し、二重遺伝暗号表と人工コドンボックス分割に従って特殊アミノ酸が導入されたペプチドを合成する新規な人工翻訳合成系。

Description

新規人工翻訳合成系
　本発明は、二重遺伝暗号表と人工コドンボックス分割による新規な人工翻訳合成系に関する。本発明者らは、この方法を「Flexible In-vitro Translation (FIT) system」と名付けた。
　１．翻訳合成系のメリット、及びその技術的制限
　翻訳とは生体内で普遍的に行われているタンパク質合成系であり、遺伝情報をコードしたmRNAを設計図としてリボソームが２０種類の蛋白質性アミノ酸を順に繋ぎ合わせていくことでタンパク質が正確に合成されている。この様に多種のビルディングブロックを正確な配列制御を伴って重合できる系は他に例が無く、翻訳は我々が利用できる最高の化合物精密合成システムと言える。特に、ペプチドライブラリーを構築し、その中から機能性ペプチドを単離する用途に用いる場合、翻訳合成は従来の化学合成法と比べて多くの長所を持つ。
　翻訳反応はmRNA の配列に依存した鋳型合成であるので、ランダム配列を持つmRNA（もしくは対応するDNA）から翻訳反応を行うとランダムペプチドライブラリーを一気に構築することが出来る。その上、mRNA は分子生物学的手法により増幅、配列の読み取りが可能であるため、ライブラリー化合物の再合成やデコンボリューション（本技術においては、ランダムペプチドライブラリーから濃縮された活性ペプチド群を分割し、個々の配列を決定することを意味する）も容易であるという長所も併せ持つ。さらには、mRNA ディスプレイ法に代表されるin vitroディスプレイ技術と組み合わせる事で、翻訳産物である個々のペプチドをその鋳型であるmRNA で直接タグ付けすることができる。すなわち、ライブラリー中のそれぞれのペプチド分子に増幅・読み取り可能なタグが付加される事になる。このライブラリーの中から標的タンパク質に結合する活性種のみを選択し、RT-PCR で対応するmRNA を増幅、再び翻訳するという作業を繰り返すことで、通常の化学合成ライブラリーでは実施不可能である進化分子工学的な活性ペプチドの選択・単離を行うことができる。
　まとめると、翻訳系においてペプチドライブラリー構築を行うメリットしては
１）容易に高多様性を得られる(～1013あるいはそれ以上)、２）デコンボリューションが容易、３）ライブラリーの増幅が可能である、４）in vitro ディスプレイ技術によるセレクション法が行える、などが挙げられる。
　リボソーム翻訳系は、上述の様に効率的に高機能化されたペプチドライブラリーの構築を可能にするが、一方で天然のタンパク質・ペプチドを作ることに特化した機構なので一般には20種類の蛋白質性アミノ酸からなるポリペプチドしか合成できないという致命的な欠点を持つ。つまり、より構造的・官能基的にバリエーションを持つ「特殊アミノ酸」を含んだペプチドは、基本的に翻訳合成することが出来ない。本明細書において、「特殊アミノ酸」とは、蛋白質で見られる蛋白質性アミノ酸とは構造の異なるアミノ酸全般を指す。つまり、蛋白質性アミノ酸の側鎖構造の一部が化学的に変更・修飾された非蛋白質性アミノ酸や人工アミノ酸、D体アミノ酸、N-メチルアミノ酸、N-アシルアミノ酸、β-アミノ酸等が全て含まれる。
　２．従来までに報告されている遺伝暗号の改変法
　２０種類の蛋白質性アミノ酸からなるペプチドしか合成できないという、リボソーム翻訳系の致命的な欠点を緩和するため、これまでにいくつかの遺伝暗号の改変法が報告されている。翻訳におけるコドン-アミノ酸の対応関係は遺伝暗号として知られ、20 種類のアミノ酸の利用が厳密に規定されている。この対応関係を人工的に改変することで20 種類以外のアミノ酸を利用しようとする概念である。
　遺伝暗号の拡張と呼ばれる手法では、天然の翻訳系でアミノ酸の指定に使われていない停止コドンや人工４塩基コドンを利用し、それらのコドンに蛋白質性アミノ酸以外の「21番目のアミノ酸」を割り当てることで、蛋白質性以外のアミノ酸を含むタンパク質・ペプチドの合成を可能にした。しかし、停止コドンや利用可能な４塩基コドンの数に限りがあるため、同時に利用可能な非蛋白質性アミノ酸の数に上限があった(これまでに報告された例としては、最高３種類、通常は２種類あるいは１種類)。一方で2000 年代に入り、蛋白質性アミノ酸を系から除去することで作成した空コドンに非蛋白質性アミノ酸を割り当てる、遺伝暗号のリプログラミング法（初期化による書き換え）が開発され、4 種類以上の非蛋白質性アミノ酸の利用が可能になった（非特許文献１～３）。しかしながら遺伝暗号のリプログラミング法も、いくつかの蛋白質性アミノ酸を除去する必要があるため利用可能な蛋白質性アミノ酸の種類が犠牲になり、20 種類全ての蛋白質性アミノ酸を利用できないという欠点を持つ。つまり、従来の遺伝暗号の改変法では、利用可能な非蛋白質性アミノ酸もしくは蛋白質性アミノ酸の数に制限があり、自由自在に望みのアミノ酸を利用できる合成系とは言えなかった。
　また、天然のL-α-アミノ酸から構造がかけ離れた特殊アミノ酸（例えばD体アミノ酸やN-メチルアミノ酸）は、たとえ上述した手法により空きコドンに割り当てたとしても、翻訳系に基質として許容されず、ペプチド合成に取り込まれないことが一般的であった。つまり特殊アミノ酸は、通常の翻訳系もしくは従来の改変翻訳系では、一般にペプチド鎖に取り込まれない、あるいは極めて取り込まれ難いアミノ酸であった。
Forester, A. C. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.100, p.6353-6357 (2003) Josephson, K., Hartman, M. C., Szostak, J. W.: J. Am. Chem. Soc., Vol. 127, p. 11727-11735 (2005) Murakami, H. et al.: Nat. Mathods, Vol.3, p.357-359 (2006)
　従来の遺伝暗号のリプログラミングでは、蛋白質性アミノ酸を一部取り除くことで、空コドンをつくり特殊アミノ酸をアサインしていたため、取り除いた蛋白質性アミノ酸を使うことができなくなった。
　全ての蛋白質性アミノ酸に加えて、多数の特殊アミノ酸を同時に利用可能な翻訳合成系を提供することが、本発明の課題である。
　本発明者らは遺伝暗号の改変において新たに二つの新規概念を提唱・確立することにより、原理的に40 種類以上ものアミノ酸を同時利用可能な新規人工翻訳合成システム（FIT system）を完成した。以下、（１）二重遺伝暗号と、（２）コドンボックスの人工分割の概念を順に説明する。
　１．二重遺伝暗号
　天然の普遍遺伝暗号表では、一つのコドンは１種類のアミノ酸のみを定義している。しかし例外的に、原核生物の翻訳では、AUG コドンは開始反応ではfMet（ホルミルメチオニン）を、その後の伸長反応においてはMet（メチオニン）を指定する。つまり厳密にはfMet とMet という構造的に異なるアミノ酸を開始と伸長でそれぞれ定義している。ここで本発明者らは、他のコドンでも同様に開始・伸長の両方で利用でき、かつ異なるアミノ酸に対応させることが可能ではないかと考えた。つまり、伸長用とは別に開始反応専用の人工コドン表を新たに用意し、その二つが同時に機能する新概念「二重遺伝暗号」である。
　天然の翻訳系ではAUG のみが開始コドンとして機能するのに対し、二重遺伝暗号ではAUG 以外の複数のコドンが開始反応に参加する。さらにこれらの人工開始コドンは、開始と伸長反応で別々の二つのアミノ酸を指示する、つまり“Dual sense codon”といえる。二重遺伝暗号を用いた翻訳系では複数の人工開始残基が同時に機能するため、様々なN 末端構造を持ったペプチドライブラリーを一挙に合成可能である。これは一つの翻訳系で機能する開始残基が一つに限られる従来の翻訳系と比べて、大きなメリットであると言える。
　２．コドンボックスの人工分割
　二重遺伝暗号では開始残基のバラエティーが大幅に増大しているが、伸長反応で特殊アミノ酸を利用する場合に、依然いくつかの蛋白質性アミノ酸の利用を諦めなければならない。この問題を解決したのがコドンボックスを人工的に分割した遺伝暗号のリプログラミングである。
　普遍遺伝暗号表では複数のコドンが同じアミノ酸を定義するケースがある。例えば、GUN のコドンボックスはまるまるVal で占められている。コドンボックスの人工分割の概念では、こういったコドンボックスを二つに分割し、一方に元々の蛋白質性アミノ酸を指定し、他方には別の特殊アミノ酸を定義する［図1右の伸長専用遺伝暗号；例えば、GUN のボックスのうち、GU(A/G)にはVal をGU(U/C)には望みの特殊アミノ酸（Xa3）を割り当てる］。 原理上、この翻訳システムでは、天然の20 種類のアミノ酸に加えて、11 種類までの特殊アミノ酸を伸長反応で同時に利用可能である。
　３．二重遺伝暗号表と人工コドンボックス分割を組み合わせた新規人工翻訳合成システム
　二重遺伝暗号表と人工コドンボックス分割を組み合わせることで、同時利用可能なアミノ酸の種類を大幅に増やした翻訳系を創ることが出来る。つまり、二重遺伝暗号表で利用されている複数のDual sense codon を人工的に分割したコドンボックスに配置する。つまり、1 つのコドンボックス内に4 つの異なるアミノ酸残基を割り当てる。さらに、停止コドンにも特殊アミノ酸を割り当てることが可能である。これにより20 種類の全蛋白質性アミノ酸+11種類以上の人工開始残基+最大12種類までの特殊アミノ酸を同時に一つの翻訳系で利用可能になる。さらに人工分割されたコドンボックス以外の場所にもDual sense codon を配置可能なため、全てあわせるとゆうに40種類以上のアミノ酸を同時利用可能な翻訳系となる。
　このFIT systemを従来の開始反応の書き換えによる環状ペプチドライブラリー合成（Goto et al., ACS Chem. Biol., 2008, 3, 120-129；WO2008/117833「環状ペプチド化合物の合成方法」）と比較したものが図2 である。図２ａが従来の開始反応の書き換え法、ｂが本発明のFIT systemを示す。以前の手法（図２a）では、一つの翻訳系における開始残基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 は一種類に限定され、またMet は同時利用が出来なかった。これに対し、Fit systemでは多様な構造で環化し、複数の特殊アミノ酸を含むペプチドからなるライブラリーを得ることができる。
　さらに、伸長反応で特殊アミノ酸を利用する場合はその分蛋白質性アミノ酸の利用が制限された。しかし、FIT systemではfMet に加えて複数種類の改変開始残基を同時利用可能であり、さらに複数の特殊アミノ酸及び全ての蛋白質性アミノ酸も伸長反応で導入することが可能である。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）特殊アミノ酸を結合したtRNAを無細胞翻訳系に添加してペプチド合成を行うことにより、特殊アミノ酸が導入されたペプチドを合成する方法であって、
　リボソーム上の翻訳開始反応において、mRNAの翻訳開始部位のコドンに相補的なアンチコドンを持つ開始tRNAに結合した特殊アミノ酸が開始アミノ酸として機能することでペプチドN末端に導入され、
　ペプチド鎖伸長反応において、普遍遺伝暗号表で１種の蛋白質性アミノ酸を指定する複数のコドンの一部が特殊アミノ酸に割り当てられることを特徴とする改変された遺伝暗号表に従って、特殊アミノ酸を結合した伸長用tRNAのアンチコドンで指定される位置に特殊アミノ酸が導入される、前記方法。
（２）特殊アミノ酸を結合したtRNAが、in vitroで転写合成されたtRNAを、in vitroでアミノアシル化することにより調製されたものである、前記方法。
（３）伸長反応用の改変された遺伝暗号表が、普遍遺伝暗号表でLeu、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Arg、及びGlyをそれぞれ指定する複数のコドンの一部が特殊アミノ酸に割り当てられることを特徴とする遺伝暗号表である、前記方法。
（４）伸長反応用の改変された遺伝暗号表において、普遍遺伝暗号表でLeu、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Arg、Glyをそれぞれ指定する４個または６個のコドンのうち２個のコドンが元の蛋白質性アミノ酸に割り当てられたままでありながら、これらコドンの残りは任意の特殊アミノ酸に割り当てられる、（３）の方法。
（５）伸長反応用の改変された遺伝暗号表において、さらに停止コドンの一部が特殊アミノ酸に割り当てられる、（３）の方法。
（６）無細胞翻訳系が、蛋白質性アミノ酸用のtRNA及びARS（アミノアシルtRNA合成酵素）のセットとして、天然のtRNAに代えてin vitroで転写合成されたtRNA、及びこれに蛋白質性アミノ酸を特異的に結合させ得るARSのセットを含み、天然のtRNAを含まない、前記方法。
（７）翻訳開始部位のコドンがAUGまたはAUG以外の任意のトリプレット配列からなる人工開始コドンである、前記方法。
（８）人工開始コドンが、AUG, UGG, AUC, ACC, UCG, AAC, GCC, GGC, CCG, CGG, GGG,又はAUA である、（７）の方法。
（９）同一配列のアンチコドンを持つ開始tRNAと伸長tRNAに異なる特殊アミノ酸を結合することにより、翻訳開始反応と伸長反応で同一配列のコドンを異なる特殊アミノ酸に割り当てることができる、前記方法。
（１０）翻訳開始反応と伸長反応で異なる特殊アミノ酸に割り当てられる同一配列のコドンが、AUG, UGG, AUC, ACC, UCG, 又はAACである、（８）の方法。
（１１）互いに異なる配列の人工開始コドンを持つ複数のmRNAを鋳型として利用し、それぞれの人工開始コドンに相補的なアンチコドンを持つ開始tRNAに異なる人工開始残基が結合したアミノアシル開始tRNAを無細胞翻訳系に添加してペプチド合成を行うことにより、互いに異なるN末端アミノ酸を持つ複数のペプチドが一つの翻訳系中で合成される、前記方法。
（１２）互いに異なる様々な配列を持つ鋳型核酸からなる核酸ライブラリー、任意の特殊アミノ酸を結合した様々なアンチコドン配列を持つ開始tRNA、及び任意の特殊アミノ酸を結合した様々なアンチコドン配列を持つ伸長用tRNAを無細胞翻訳系に添加して、様々な配列を持つ特殊ペプチドからなるペプチドライブラリーを合成する、（１）の方法。
（１３）特殊ペプチドが、これをコードする鋳型核酸と結合した状態で合成される、（１２）の方法。
（１４）特殊ペプチドを翻訳合成するためのキットであって、
(i)mRNAであって、ペプチドをコードする領域が、（ａ）人工開始残基を指定する人工開始コドン、及び（ｂ）特殊アミノ酸を指定する伸長コドン、を含むmRNA；
(ii)人工開始残基及び特殊アミノ酸用のアミノアシルtRNAであって、（ｃ）前記(a)の人工開始コドンと相補的なアンチコドンを有する、人工開始残基を結合した開始tRNA、及び（ｄ）前記（ｂ）の伸長コドンと相補的なアンチコドンを有する、特殊アミノ酸を結合した伸長tRNA；
(iii)蛋白質性アミノ酸用のtRNA及びARSのセットであって、蛋白質性アミノ酸、修飾塩基を含まない人工tRNA、及びこれに蛋白質性アミノ酸を結合させ得るARSを含むセット；及び
(iv）単離されたリボソーム
を少なくとも含む、前記キット。
　本発明により、無細胞翻訳系により合成する特殊ペプチドの多様性を飛躍的に向上させることが可能となった。さらに、従来公知の翻訳系よりも、少数のコントロールしやすい因子群でペプチド合成を可能にし、かつ簡単に製造できる。
　本発明の翻訳系（FIT system）を用いて構築されるペプチドライブラリーは従来よりも幅広いシークエンススペースをカバーでき、生理活性ペプチドを探索する上で大きなメリットが期待できる。
本発明者らが提案する人工遺伝暗号の例を示す。開始反応専用（左）と伸長反応専用（右）の二つのコドン表を用いる。 翻訳合成による環状ペプチドライブラリー合成のイメージ図である。（ａ）従来の開始反応の書き換え法と（ｂ）本発明のFIT systemを比較した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 はそれぞれ人工開始残基・特殊アミノ酸・蛋白質性アミノ酸を示す。
AUG 以外の複数のコドンが人工開始コドンとして機能することの確認実験の結果である。 同一のコドンが開始・伸長の両方で機能し、別々のアミノ酸をコードすることの確認実験の結果である。 二重遺伝暗号を利用し合計8 種類の特殊アミノ酸・人工開始残基を同時利用した実験の結果である。 T7 RNA ポリメラーゼでin vitro 転写合成したtRNA が翻訳反応で機能することの確認実験の結果である。 コドンボックス分割実験のイメージ図である。 コドンボックス（Valコドンボックス）の人工分割実験の結果である。 コドンボックス（Valコドンボックス以外のコドンボックス）の人工分割実験の結果である。 コドンボックスの人工分割実験（一度に二つのコドンボックスを分割）の結果である。 二重遺伝暗号と分割コドンボックスの組み合わせによるFIT systemのイメージ図である。 二重遺伝暗号表と分割コドンボックスを組み合わせたペプチド合成の例を示す。
　まず、本願で使用される重要な用語と技術の説明をする。
　「遺伝暗号（コドン）」　天然の翻訳では、以下に示す普遍遺伝暗号表に従って、６４種類のコドンそれぞれに、２０種類の蛋白質性アミノ酸及び翻訳の終止が割り当てられている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　蛋白質性アミノ酸または天然アミノ酸とは、通常の翻訳で使用されるα-アミノカルボン酸（または置換型α-アミノカルボン酸）である、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン（Ｍet）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、チロシン（Tyr）、システイン（Ｃys）、グルタミン（Gln）、アスパラギン（Asn）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、アスパラギン酸（Asp）、及びグルタミン酸（Glu）の２０種類のアミノ酸を指す。
　これに対し、本発明では、人工遺伝暗号により、各コドンに特殊アミノ酸が割り当てられている。図１は、本発明で提案する人工遺伝暗号の例である。開始反応専用（左）と伸長反応専用（右）の二つのコドン表を用いることができる。XiとXaはそれぞれ人工開始残基と伸長用特殊アミノ酸を意味する。
　開始反応用のコドン表では、AUG以外に複数の「人工開始コドン」が機能することが特徴である。
　伸長反応用のコドン表では、コドンボックスを分割し特殊アミノ酸を追加で定義できることが特徴である。２０種類の蛋白質性アミノ酸の指定に必須ではない分割コドンボックスが１１個ある。そのため、20種類の天然アミノ酸を維持したまま、これらの分割コドンボックスに最大11種類まで非天然アミノ酸を指定できる。例えば、普遍遺伝暗号表でLeu、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Arg、Glyをそれぞれ指定する４個または６個のコドンのうち２個のコドンが元の蛋白質性アミノ酸に割り当てられたままでありながら、これらコドンの残り（２個または４個）を任意の特殊アミノ酸に割り当てることができる。
　開始用と伸長用の二種類のコドン表を組み合わせることにより、一種類のトリプレット配列からなるコドンが開始反応と伸長反応でそれぞれ異なる二つのアミノ酸を定義する（Dual sense codon）。
　「特殊アミノ酸」及び「特殊ペプチド」　本願においてアミノ酸とは、蛋白質性アミノ酸と特殊アミノ酸の両方を指す。「特殊アミノ酸」とは、天然の翻訳で使用される２０種類の蛋白質性アミノ酸とは構造の異なるアミノ酸全般を指す。つまり、蛋白質性アミノ酸の側鎖構造の一部が化学的に変更・修飾された非蛋白質性アミノ酸や人工アミノ酸、D体アミノ酸、N-メチルアミノ酸、N-アシルアミノ酸、β-アミノ酸、アミノ酸骨格上のアミノ基やカルボキシル基が置換された構造を有する誘導体等が全て含まれる。本願では便宜上、開始反応においてペプチドのN末端に取り込まれる特殊アミノ酸を特に「人工開始残基」と呼び、それに対し伸長反応においてペプチド鎖中に取り込まれる特殊アミノ酸を狭い意味での「特殊アミノ酸」と呼称することもある。
　「特殊アミノ酸が導入されたペプチド」あるいは「特殊ペプチド」には、これらの様々な特殊アミノ酸を構成要素とする重合体が含まれる。特殊ペプチドは、その構成要素の一部または全部が特殊アミノ酸であることができる。したがって、特殊ペプチドは、主鎖骨格として通常のアミド結合とは異なる構造も有し得るものである。例えば、アミノ酸とヒドロキシ酸から構成されるデプシペプチド、ヒドロキシ酸が連続して縮合したポリエステル、N-メチルペプチド、N-末端に様々なアシル基（アセチル基、ピログルタミン酸、脂肪酸など）を有するペプチドも、特殊ペプチドに含まれる。また、特殊ペプチドには環状ペプチドも含まれる。上述したように、本発明者らは以前に、翻訳合成された直鎖状のペプチドを分子内反応によって環状化させる手法を開発し、報告した（Goto et al., ACS Chem. Biol., 2008, 3, 120-129、WO2008/117833「環状ペプチド化合物の合成方法」）。同様の方法を本願でも利用可能である。N末にクロロアセチル基を有する特殊アミノ酸を配置し、ペプチド鎖中又はC末にシステインを配置したペプチド配列を翻訳合成して得られる、チオエーテル結合で環化した環状ペプチドはその一例である。これ以外にも、結合形成が可能な官能基の様々な組み合わせに応じて、多様な構造で環化することができる。
　「ｔＲＮＡ」は、クローバー葉構造に類似する２次構造の形成が可能な配列を有するＲＮＡ分子であって、さらにＬ字形のコンパクトな三次構造をとり、Ｌ字形構造の一方の端にあたる３’末端にアミノ酸を結合し（アシル化）、もう一方の端に位置するアンチコドンによってｍＲＮＡ上のコドンを認識するという機能をもつ。本明細書において、ｔＲＮＡは天然のｔＲＮＡと人工的に構築したｔＲＮＡの両方を指す。人工的に構築したｔＲＮＡの典型的な例は、in vitro転写により合成されたｔRNAである。
　「開始ｔＲＮＡ」　mRNAの翻訳の開始には、「開始tRNA」と呼ばれる特定のtRNAが必要である。開始アミノ酸を結合した開始tRNAが、開始因子(IF)とともにリボソームの小サブユニットに結合し、リボソームの小サブユニットがmRNA上の開始コドンに結合することで、翻訳が始まる。普遍暗号表においては、開始コドンとしては一般的にはメチオニンのコドンであるAUGが用いられるため、開始tRNAはメチオニンに対応するアンチコドンを有し、開始tRNAは必ずメチオニン（原核細胞ではホルミルメチオニン）を運ぶ。しかしながら、本発明においては、任意のアンチコドンを持つ開始tRNAに任意の開始アミノ酸を結合することにより、開始アミノ酸がメチオニンに限定されず、開始コドンもAUGに限定されない。本願では、メチオニン（又はホルミルメチオニン）以外のアミノ酸を指定するAUG又はAUG以外の開始コドンを「人工開始コドン」と呼ぶ。また、人工開始コドンにより指定され、ペプチドN末端に導入される特殊アミノ酸を「人工開始残基」と呼ぶ。
　原核生物の開始tRNAでは、1番目の塩基（5’末端の最初の塩基）と72番目の塩基がミスマッチ（非相補的）であり、このミスマッチ塩基対がメチオニルホルミルトランスフェラーゼ（MTF）により認識されてホルミル化されることにより開始反応へと取り込まれ、またEF-Tuとの結合が抑制されるといわれている。（Mayer C, Stortchevoi A, Kohrer C, Varshney U, RajBhandary UL. Initiator tRNA and its role in initiation of protein synthesis. Cold Spring Harb Symp Quasnt Biol. 2001;66:195-206.）一般的に、原核生物由来の翻訳開始反応では、ホルミル基転移酵素及びホルミルドナー（10-formyl-5,6,7,8-tetrahydroforlic acid）によって、開始tRNA上のメチオニンのアミノ基がホルミル基で修飾されることが必要と考えられていたが、本発明者らの別の研究により、その制限がないことが明らかとなっている。例えば、アシル基のないアミノ酸でも翻訳を開始できるばかりか、アミノ基に導入するアシル基には任意のＲを付けることができる（R-CO-aa-）。したがって、FIT systemにおいてはホルミルドナー及びMTFは必ずしも必須でない。
　開始ｔRNAの例として、後述の実施例ではtRNAfMetEを用いている。このtRNAの塩基配列は、大腸菌の天然tRNAfMet:
(5’-CGCGGGGs4UGGAGCAGCCUGGDAGCUCGUCGGGCmUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGTΨCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3’)がベースになっている。(s4U:4-チオウリジン、D:ジヒドロウリジン、Cm:2’-O-メチルシチジン、T:リボチミジン、Ψ:シュードウリジン)（配列番号７）下線部CAUの箇所がアンチコドンに相当し、AUG開始コドンに対応する。
　本発明者らは、この天然tRNAに対して、修飾塩基を無くし、5’末端最初のCをGに変化させた開始用tRNAfMetEをin vitro転写によって作製した。本願実施例で使用したtRNAfMetEの配列を示す。NNNの箇所がアンチコドンに相当し、開始コドンに対応するように変化させる。
5’-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUNNNAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3’ （配列番号１）（[修飾を無くした箇所、合計6カ所：s4U8U、D20U、Cm32C、T54U、Ψ55U。][変異の箇所 、合計1カ所：C1G]) 
　「伸長ｔＲＮＡ」　ペプチド鎖伸長反応では、アミノ酸を結合した「伸長ｔＲＮＡ」あるいは「伸長用tRNA」が、伸長因子Ｔｕ（原核生物ではEF-Tu、真核生物ではeEF-1Aと呼ばれる）と結合し、リボソームのＡ部位へ運ばれる。原核生物の伸長tRNAでは、1番目の塩基と72番目の塩基とが塩基対形成し、かつ、50番目の塩基と64番目の塩基とが塩基対形成しており、これらの塩基対形成はEF-Tuによる認識に必要であるといわれている。
　特殊アミノ酸用の伸長用ｔRNAの例として、後述の実施例では、tRNAAsn由来の人工tRNA（tRNAAsnE2）を用いている。このtRNAの塩基配列は、大腸菌の天然tRNAAsn
(5’-UCCUCUGs4UAGUUCAGDCGGDAGAACGGCGGACUQUUt6AAΨCCGUAUm7GUCACUGGTΨCGAGUCCAGUCAGAGGAGCCA-3’) がベースになっている(s4U:4-チオウリジン、D:ジヒドロウリジン、Q:キューオシン、t6A:6-スレオニルカルバモイルアデニン、Ψ:シュードウリジン、m7G:7-メチルグアノシン、T:リボチミジン)（配列番号８）
　本発明者らは、この天然tRNAに対して、修飾塩基を無くし、かつ変異を導入することで、大腸菌の20種類のアミノアシル化酵素によってアミノアシル化を受けない伸長用tRNAAsn-E2をin vitro転写によって作製した。NNNの箇所がアンチコドンに相当し、伸長コドンに対応するように変化させる。
(tRNAAsn-E2:5’-GGCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGCGGACUNNNAAUCCGUAUGUCACUGGUUCGAGUCCAGUCAGAGCCGCCA-3’ （配列番号２）[修飾を無くした箇所、合計8カ所：s4U8U、D16U、D20U、t6A37A、Ψ39U、m7G46G、T54U、Ψ55U。34番目のQに関しては、アンチコドンなので、伸長コドンに対応して変化させる。][変異の箇所 、合計4カ所：U1G、C2G、G71C、A72C]) 
　「相補的」　塩基対を形成し得るような核酸の塩基の組合わせを、互いに「相補的」であるという。ＤＮＡではアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、及び、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）、ＲＮＡではＡとウラシル（Ｕ）、及び、ＧとＣが対合する。さらに、ＲＮＡではＧ－Ｕなどのいわゆる非ワトソン－クリック塩基対も熱力学的に安定な塩基対として存在するので、本明細書においてはこれらの組合せも「相補的」であるという。ｍRNAのコドンとｔRNAのアンチコドンの対応は、相補的な塩基の対合に依存する。特に、コドンの3’側第三塩基とアンチコドンの5’側第一塩基の相補鎖形成は、Wobble則により、非ワトソン－クリック塩基対のペアが許容される。コドン配列とアンチコドン配列が「対応する」とは、コドンとアンチコドンの配列が相補鎖を組むことを意味する。
　上述の他、本発明の実施のための材料及び方法は、化学及び分子生物学の技術分野で慣用される技術に従って、様々な一般的な教科書や専門的な参考文献に記載されている方法を用いる。専門的な参考文献には、本発明者らのグループによりこれまで公表された多数の論文や特許文献が含まれる。
　ペプチド翻訳合成方法
　本発明は、二重遺伝暗号表と人工コドンボックス分割による新規な無細胞（in vitro）人工翻訳合成系「Flexible In-vitro Translation (FIT) system」に関する。一般的に、翻訳系あるいは翻訳合成系とは、ペプチド翻訳合成のための方法及びキットの両方を含む概念である。
　本発明によるペプチド翻訳合成方法は、特殊アミノ酸を結合したtRNAを無細胞翻訳系に添加してペプチド合成を行うことにより、特殊ペプチドを合成する方法である。この場合の無細胞翻訳系である「Flexible In-vitro Translation (FIT) system」は、翻訳に必要な蛋白質・RNA・小分子を任意に混合して調製された混合物である。これに類似した再構成型の翻訳系の例としては、大腸菌のリボソームを用いる系である、次の文献に記載された技術が公知である：H. F. Kung, B. Redfield, B. V. Treadwell, B. Eskin, C. Spears and H. Weissbach (1977) “DNA-directed in vitrosynthesis of beta-galactosidase. Studies with purified factors” The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894 ;M. C. Gonza, C. Cunningham and R. M. Green (1985) “Isolation and point of action of a factor from Escherichia coli required to reconstruct translation” Proceeding of National Academy of Sciences of the United States of America Vol. 82, 1648-1652 ; M. Y. Pavlov and M. Ehrenberg (1996) “Rate of translation of natural mRNAs in an optimized in Vitro system” Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16 ; Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa and T. Ueda (2001) “Cell-free translation reconstituted with purified components” Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755；H. Ohashi, Y. Shimizu, B. W. Ying, and T. Ueda (2007) “Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components” Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276。
　FIT systemの特徴として、その構成成分のうち任意のものを自由に取り除くことができる点が重要である。かかる特徴を有する限りにおいて、FIT systemでは、任意の生物から単離された成分に、in vitro合成された成分を適宜組み合わせて用いることができる。本明細書の説明及び後述の実施例においては、原核生物由来の系を用いて説明しているが、あくまで説明の便宜のためであり、真核生物由来の翻訳系の使用を排除する意図ではない。
　以下、大腸菌由来のリボソームを用いた実施例に沿って、本発明を説明する。
　翻訳系の典型的な構成として、従来は、（i）T7 RNAポリメレース（DNAからの転写も行う場合）、（ii）翻訳因子としての、大腸菌の開始因子・伸長因子・終結因子・リボソームリサイクリング因子、（iii）20種類のアミノアシルｔRNA合成酵素（ARS）、メチオニルｔRNAホルミル転移酵素（MTF)、（iv）大腸菌７０Sリボソーム、（v）大腸菌tRNA（大腸菌から単離）、（vi）各種アミノ酸、NTP、エネルギー再生系、その他が含まれていた。
　本発明で使用されるFIT systemにおいては、上記の（ii）及び（iii）及び（v）の材料を全部、あるいは一部加えていない。例えば、アミノ酸、アミノアシルｔRNA合成酵素、メチオニルｔRNAホルミル転移酵素、終結因子、tRNA等の構成分子を加えていない翻訳系を調製する。そのような系は、通常の翻訳系としては機能しなくなるが、そこへ、in vitro 転写合成したtRNAにアミノ酸をチャージしたもの等の人工的に合成した要素や、その他の成分を添加することで、ペプチド合成機能を復活させる。言い換えると、翻訳系の構成要素を必要に応じて加えないことにより望みの遺伝暗号のリプログラミングが可能になる。
　特殊アミノ酸や人工開始残基の割り当てに必要な、アミノアシルtRNA は、in vitroで転写合成されたtRNAを単離し、in vitroでアミノアシル化することにより調製される。単離されたtRNAをin vitroでアミノアシル化するとは、他のtRNAやARSが存在しない条件で、所望のアミノ酸をtRNAの3’末端に結合させることを意味する。このようなアミノアシル化の方法として、本発明ではペプチドに導入される特殊アミノ酸や人工開始残基に制限がないことから、どのようなアミノ酸にも適用できる方法が好ましい。このような方法として、例えば、化学的アミノアシル化法（Heckler T. G., Chang L. H., Zama Y., Naka T., Chorghade M. S., Hecht S. M.: T4 RNA ligase mediated preparation of novel “chemically misacylated” tRNAPheS. Biochemistry 1984, 23:1468-1473.）、または本発明者らが開発したアミノアシルtRNA 合成リボザイム(ARSリボザイム)を用いる方法が公知である。あるいは、適用できるアミノ酸の種類が限られるが、天然のARSを人工的に改変した酵素を用いる方法も利用可能である。
　本発明において、tRNAをin vitroでアミノアシル化する方法として、最も好ましいものは、in vitro 転写合成したtRNA を基質として、ARSリボザイムを利用して合成する方法である。
　本発明で使用されるアミノアシルtRNA合成酵素としては、本発明者らが進化分子工学により創製したRNA触媒であるARSリボザイム（フレキシザイム）が好適である。ARSリボザイムは、天然のARSタンパク質酵素とは異なり、各アミノ酸及び各tRNAに対して特異性を持たず、本来チャージすべきアミノ酸以外の任意のアミノ酸またはヒドロキシ酸を用いたアミノアシル化が可能である。
　フレキシザイムは、ジニトロベンジルフレキシザイム（dFx）、エンハンスドフレキシザイム（eFx）、アミノフレキシザイム（aFx）等の呼称でも知られる。これらのARSリボザイムを利用することにより、任意のtRNA に望みの人工開始残基もしくは特殊アミノ酸を結合させることができる。
　公知のARSリボザイムの例（RNA配列）を以下に示す。
原型のフレキシザイム Fx
[GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU-3’, 45nt] （配列番号３）
ジニトロベンジルフレキシザイム dFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU-3’,46nt] （配列番号４）
エンハンスドフレキシザイム eFx
[5'-GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU-3’,45nt]) （配列番号５）
アミノフレキシザイム aFx
[5'- GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU-3’,47nt]) （配列番号６）
　フレキシザイムによるアミノアシル化反応は穏和な条件で行うことができ、容易な後処理を行うだけで翻訳系に導入して用いることができる。フレキシザイムは、弱く活性化されたアミノ酸を基質として、アミノ酸の反応点であるカルボニル基、及びアミノ酸側鎖あるいは脱離基である芳香環、並びにtRNAの３’末端に存在する5'-RCC-3'配列部分（R = A or G）を認識して、３’末端のアデノシンにアミノアシル化する触媒能を有する。フレキシザイムによるアミノアシル化反応は、アミノ酸基質と、結合相手であるtRNA分子を、フレキシザイム存在下、２時間程度氷上に置くだけで進行する。詳細は以下の文献を参照されたい。
H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662； H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084； H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359 "A highly flexible tRNA acylation method for non-natural polypeptide synthesis"； N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894 "A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water-friendly leaving group"; 及びWO2007/066627。
　本発明において、特殊アミノ酸用の伸長tRNAとしては、天然のARSに対して直交性を持つ人工tRNAを利用する。すなわち、翻訳系に内在する天然のARSによって認識されず、翻訳系中で天然のアミノ酸によってチャージされることがないような人工tRNAを利用する。このような人工tRNAは、in vitroの転写により合成することができる。特殊アミノ酸用の伸長用ｔRNAの例として、後述の説明及び実施例では、大腸菌tRNAAsn 由来の人工tRNA（tRNAAsnE2）を用いている。しかしながら、これに限定されるものではなく、使用する翻訳系中において、内在ARSに対して直交性であり、リボソーム上のペプチド伸長反応で利用されることが確認されたtRNAであれば、いずれも使用可能である。
　開始tRNAは伸長tRNAと異なる配列を有し、開始因子によって認識される。後述の実施例では、in vitro転写により合成した、大腸菌tRNAfMet 由来の人工tRNA（tRNAfMetE）を用いている。しかしながら、これに限定されるものではなく、使用する翻訳系中において、リボソーム上のペプチド翻訳開始反応で利用されることが確認されたtRNAであれば、いずれも使用可能である。
　Fit systemの成分
　特殊ペプチドを翻訳合成するための具体的な構成成分を含むキットも、本発明の一態様である。従来公知の系と対比させながら、本発明で利用可能な翻訳系の具体的な構成成分について説明する。
　翻訳系には、翻訳の鋳型となる塩基配列に対応するDNAまたはRNA分子が供される。鋳型DNAからの転写を行うためには、T7 RNA polymeraseのような適当なRNAポリメレースを加える。あらかじめ転写したmRNAを翻訳系に加える場合、RNA polymeraseの添加は不要である。核酸配列には、生細胞を利用したタンパク質発現系と同様に、目的のアミノ酸配列をコードする領域に加えて、使用する翻訳系に合わせて、翻訳に有利な塩基配列を付加的に含むことができる。例えば、大腸菌由来のリボソームを利用する系の場合は、開始コドンの上流にShine-Dalgarno(SD)配列やイプシロン配列などを含むことにより翻訳反応の効率が上昇する。ここまでは従来の無細胞翻訳系と同様である。ペプチドをコードする領域のN末端には、人工開始残基となる特殊アミノ酸を指定する人工開始コドンが配置される。伸長反応で導入される特殊アミノ酸は、伸長コドンにより指定される。C末端側には、従来の系と同様、in vitroディスプレイ用に、核酸分子とその翻訳産物であるペプチドを連結するための配列を含んでいてもよい。
　さらに、翻訳系には、人工開始残基・特殊アミノ酸用に、予め人工開始残基もしくは特殊アミノ酸でアミノアシル化されたtRNAが供される。蛋白質性アミノ酸用には、蛋白質性アミノ酸・tRNA・特異的なARS蛋白質酵素のセットが供される。蛋白質性アミノ酸用のtRNAとして、大腸菌のリボソームを用いた従来公知の系では大腸菌由来のtRNAを用いるが、本願発明においてはin vitro転写により合成した人工tRNAを使用する。ARSについても、従来公知の系では全ての蛋白質性アミノ酸に対応する20種類のARSを用いるが、本願発明においては任意に指定した二重遺伝暗号・分割遺伝暗号を利用するため、必ずしも20種類全てのARSを必要としない。
　通常の翻訳反応では、開始コドンAUGには、開始tRNAにより、N-ホルミルメチオニンが規定されるため、10-formyl-5,6,7,8-tetrahydroforlic acid（Baggott et al., 1995）のようなホルミルドナーが必須であるが、本発明では開始コドンAUG又は人工開始コドンを利用して特殊アミノ酸（人工開始残基）を導入するため、ホルミルドナーは任意である。同様の理由で、methionyl-tRNA formyltransferase（MTF）も必須でない。
　従来の系と同様、タンパク質合成装置としてのリボソームは必須である。リボソームは５０種以上のリボソームタンパク質と数種のRNA分子（rRNA）が集合したRNA-蛋白質複合体であり、mRNAの遺伝情報を読み取り、アミノ酸の重合を触媒する。大腸菌から単離されたリボソームが好適に利用されるが、他の生物由来のものでも利用できる。
　その他、蛋白質類では、翻訳開始因子（例えば、IF1、IF2、IF3）、翻訳伸長因子（例えばEF-Tu、EF-Ts、EF-G）、翻訳終結因子（例えば、RF1、RF2、RF3、RRF）、エネルギーソース再生のための酵素（例えばcreatine kinase, myokinase, pyrophosphatase, nucleotide-diphosphatase kinase）を使用する。この中で、翻訳終結因子・エネルギーソース再生のための酵素の添加は任意である。
　加えて、従来の系と同様、適当な緩衝溶液、翻訳反応のエネルギーソースとしてのNTP類、Creatine phosphate、リボソーム活性化、RNA安定化、蛋白質安定化のために必要な因子等を適宜使用することができる。
　さらに、本発明者らの別の研究で実証された主鎖骨格が環化したペプチドの合成のために（T. Kawakami, A. Ohta, M. Ohuchi, H. Ashigai, H. Murakami, H. Suga, Nat. Chem. Biol., 2009, 5,888-890）、peptide deformylase (PDF)や methionine aminopeptidase (MAP)などの翻訳反応には直接関与しない酵素を追加で適宜加えることも可能である。
　以下、人工開始残基をXi、伸長反応に用いられる特殊アミノ酸をXa と称して説明を行う。
　１．二重遺伝暗号
　複数のコドンを人工開始コドンとして利用するために、翻訳系には様々なアンチコドン配列を持つ複数のアミノアシル開始tRNA を加える。そのそれぞれに別々の人工開始残基をチャージさせておけば、アンチコドン配列に対応するコドン（人工開始コドン）にそれぞれの人工開始残基を割り当てることが出来る。翻訳されるmRNA 上の開始コドンの位置に人工開始コドンの配列が存在する場合には、対応するアミノアシル開始tRNA（例えば、対応するアンチコドン配列を有するアミノアシルtRNAfMetE）がそれらを読み取り、望みの人工開始残基をN 末端に持つペプチドが合成される。
　上述で利用した人工開始コドンの配列をDual sense codon として伸長反応でも利用するために、翻訳系には様々なアンチコドン配列を持つ複数のアミノアシル伸長tRNA（例えば、対応するアンチコドン配列を有するアミノアシルtRNAAsnE2）を加える。
　開始tRNA と伸長tRNA は異なる配列を持つため、お互いが間違って機能することはない（例えば、伸長tRNAは開始反応では利用されない、逆もまた同じ）。これにより、一つのコドン配列に開始反応と伸長反応で別々のアミノ酸を割り当てることが可能になる。
　２．コドンボックスの人工分割
　天然のtRNA はその塩基配列に修飾を受けているため、3 個以下のtRNA でもひとつのコドンボックス中の４つのコドン配列全てを読み取ることが出来る。例えば、アンチコドン配列UAC 中のU がcmo5U へと修飾されているVal のtRNA はGU(U/C/A/G)の4 つ全てのコドンを読み取る。これがGUNコドンボックスがVal で占められている所以である。
　本発明においては、こういったコドン-アンチコドン配列のミスマッチの許容を避けるため、コドンボックスの人工分割を行う場合には天然のtRNA を一切使わず、修飾塩基を含まない、人工的に合成されたtRNAを用いる。適当なRNAポリメレースによりin vitro合成したものが好適である。in vitro 合成されたtRNA は修飾塩基を持たないため、上記の様に4 種類のコドンを読み取ることはない。
　Val のコドンボックスを例にとって説明を続けると、例えば、CAC アンチコドンを持つin vitro 合成されたtRNAVal CAC と望みの特殊アミノ酸でアシル化したGAC アンチコドンを持つtRNAAsnE2（Xa-tRNAAsnE2 GAC）とを加える。そうするとtRNAVal CACは系中でVal のARS によってVal-tRNAVal CAC へと変換されてGUG コドンを読み取ることでVal を割り当て、Xa-tRNAAsnE2 GAC はそれとは独立してGU(U/C)コドンを読み取りXa を割り当てる。これにより、通常は一つのアミノ酸のみに利用されているコドンボックスを人工的に分割し、元々の蛋白質性アミノ酸を保持したまま望みの特殊アミノ酸を遺伝暗号に追加することが出来る。
　以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
　AUG 以外の複数のコドンが人工開始コドンとして機能することの確認実験（図3）
　開始コドン部位に様々なコドンを配置したmRNA（mRNA1XXX，XXX はそれぞれのmRNAに配置された人工開始コドンの配列を意味する）を用意する。
　それぞれの人工開始コドン配列に対応するアンチコドン配列を有するtRNAfMetEにN- アセチルフェニルアラニン（AcPhe）をチャージさせたtRNA（AcPhe-tRNAfMetE xxx, xxx はそれぞれのアンチコドンを意味する）存在下でｍRNA を翻訳し、望みのN 末端にAcPhe を持つペプチドが翻訳産物として得られるかどうかを確認した。
　その結果、天然開始コドンのAUG に加え、少なくともUGG, AUC, ACC, UCG, AAC, GCC, GGC, CCG, CGG, AUA でも翻訳反応を開始できることが示され、幅広いコドンが人工開始コドンとして利用できることが確認された。
　同一のコドンが開始・伸長の両方で機能し、別々のアミノ酸をコードすることの確認実験（図4）
　開始コドン部位と伸長部位の両方に様々なコドンを配置したmRNA（mRNA2XXX, XXX はそれぞれのmRNA に配置された評価対象のDual sense codon の配列を意味する）を用意する。それぞれのDual sense codon コドン配列に対応するアンチコドン配列を有するtRNAfMetE にN-アセチルフェニルアラニン（AcPhe）をチャージさせたtRNA（AcPhe-tRNAfMetE xxx, xxx はそれぞれのアンチコドンを意味する）と、同じアンチコドン配列を有するtRNAAsnE2 にN-アセチルリシン（Aly）をチャージさせたtRNA（Aly-tRNAAsnE2 xxx）とを調製する。そして、ｍRNA を開始・伸長二種類のアミノアシルtRNA 存在下で翻訳し、望みのN 末端にAcPhe を、ペプチド鎖中にAly を含むペプチドが翻訳産物として得られるかどうかを確認した。
　その結果、少なくともAUG, UGG, AUC, ACC,UCG, AAC のコドンがDual sense codon として機能し、開始反応と伸長反応の両方で別々のアミノ酸を指定出来ることが確認された。
　二重遺伝暗号を利用して合計8 種類の特殊アミノ酸・人工開始残基を同時利用した実験（図5）
　この実験で用いる二重遺伝暗号ではAUG, UCG, AAC, UGG の人工開始コドンにそれぞれN-アセチルフェニルアラニン（AcPhe）、N-ペンテノイルフェニルアラニン（PePhe）、N-アミノメチルベンゾイルフェニルアラニン（BAPhe）、N-メチルヘキサノイルフェニルアラニン（MhPhe）の4 種類の人工開始残基を、AUG, UCG, AAC,UGG の伸長コドンにそれぞれN-アセチルリシン（Aly）、ヨードフェニルアラニン（Iph）、ヒドロキシプロリン（Hyp）、シトルリン（Cit）の4 種類の特殊アミノ酸を配置する。そのため、AcPhe-tRNAfMetE CAU, PePhe-tRNAfMetE CGA, BAPhe-tRNAfMetE GUU, MhPhe-tRNAfMetE CCA,Aly-tRNAAsnE2 CAU, Iph-tRNAAsnE2 CGA, Hyp-tRNAAsnE2 GUU, Cit-tRNAAsnE2 CCA の8 種類のアミノアシルtRNA を調製して翻訳系に加える。さらに、ここでは4種類のmRNA（mRNA2AUG, mRNA2UGG, mRNA2AAC, mRNA2UGG）を混合し一つの翻訳系中で共発現させた。
　得られた翻訳産物の混合物には望みの4 種類のペプチドのみが存在した。この結果から、実際に二重遺伝暗号による翻訳系を利用し、異なるN 末端（人工開始残基）及び特殊アミノ酸を持つ複数のペプチドを一反応でミックス合成できることが示された。
　T7 RNA ポリメラーゼでin vitro 転写合成したtRNA が翻訳反応で機能することの確認実験（図6）
　20 種類の蛋白質性アミノ酸それぞれをコードしているコドンを有するmRNA4 XXX（XXX は様々なコドン）を用意し、これらのmRNA をin vitro 転写合成したtRNA のみ存在する翻訳系（translation system without natural tRNAs）で発現した。
　その結果、全ての種類のアミノ酸を含むペプチドが合成され、T7 RNA ポリメラーゼでin vitro 転写合成されたtRNA を用いても通常通り翻訳合成が機能することが確認された。
　コドンボックスの人工分割実験（図7-10）
　ここでは、バリン・セリン・アルギニン・グリシンのコドンボックスを人工的に分割した実験について述べる。
　図７はコドンボックス分割実験のイメージ図である。コドンボックス分割実験では、天然のtRNAを一切含まない翻訳系（translation system without natural tRNAs）を用いる。これに、20種類の蛋白質性アミノ酸を指定するのに必要なtRNA（in vitro転写で合成）と、望みの特殊アミノ酸を指定するのに必要なアミノアシルtRNA（in vitro転写、及びフレキシザイム等のアシル化技術を利用して合成）を加えることで人工的にコドンボックスを分割し、分割したボックスのそれぞれに元の蛋白質性アミノ酸と特殊アミノ酸とを共存させる。
　分割するコドンに配置されている4種類のアミノ酸をコードするためのin vitro 転写tRNA（tRNAVal CAC, tRNAArg CCG, tRNASer CGA, tRNAGly CCC）、それ以外の16 種類の蛋白質性アミノ酸用のin vitro 転写tRNA、及び四種類の特殊アミノ酸でチャージされたtRNAAsnE2 （ MeTyr-tRNAAsnE2 GAC, MeSer-tRNAAsnE2 GCG, Aly-tRNAAsnE2 GGA, Iph-tRNAAsnE2 GCC）を加えた翻訳系を用意する。この翻訳系で用いられる遺伝暗号は上記４つのコドンボックスが人工的に分割されており、その中に元々の蛋白質性アミノ酸と特殊アミノ酸とが共存している。
　この翻訳系を用いて様々な配列のmRNA を発現した結果、全てのケースで望みのペプチド（つまり分割されたコドンボックス中に存在する天然・非天然両方のアミノ酸を含むペプチド）が得られた。これにより、コドンボックスの人工分割の概念が実験的に実証されたと共に、天然の20 種類のアミノ酸＋4 種類の特殊アミノ酸が同時利用可能な翻訳合成系が確立された。
　図８から図１０は、コドンボックス分割実験結果の例示である。
　図８では、GUNのコドンボックスを分割し、GUGコドンに蛋白質性アミノ酸のValを、GUCコドンに特殊アミノ酸のMeTyrを割り当てた。
〔上段〕用いたmRNAの配列、及びそれにコードされるアミノ酸配列（P-1及びP-2）。
〔下段・左〕翻訳産物のTricine-SDS PAGE。Lane 1：天然のtRNAを全て含む、通常の翻訳系でmRNAを翻訳し、P-1を合成。Lane 2：天然のtRNAを全て含まず、必要なin vitro転写tRNAを加えた翻訳系でmRNAを翻訳し、P-1を合成。Lane 3：天然のtRNAを全て含まず、必要なin vitro転写tRNAと非天然アミノアシルtRNAを加えた翻訳系でmRNAを翻訳し、P-2を合成。
〔下段・右〕Tricine-SDS PAGEのLane2及び3の条件で翻訳合成したペプチドの質量分析結果（MALTI-TOF MS analysis）。
指定した通り、P-1及びP-2の配列を持つペプチドの合成が確認された。
　図９では、(1)CGN・(2)UCN・(3)GGNのコドンボックスを分割し、特殊アミノ酸として、(1)MeSer・(2)Aly・(3)Iphを割り当てた。また、分割遺伝暗号を利用して翻訳合成したペプチドの質量分析結果を右に示した。分割遺伝暗号に指定された通り、分割されたコドンボックス中の天然・非天然両方のアミノ酸を含むペプチドの合成が確認された。
　図１０では、一度に二つのコドンボックスを分割した実験を示す。それぞれ、(1)CGN,GUN・(2)UCN,GUN・(3)CGN,GGNのコドンボックスを分割した。実際に翻訳合成を行い、翻訳産物の質量分析を行った結果を右に示した。分割遺伝暗号に指定された通り、複数の分割コドンボックス中の天然・非天然両方のアミノ酸を含むペプチドの合成が確認された。
　二重遺伝暗号表と人工コドンボックス分割を組み合わせた新規人工翻訳合成システム（図11-12）
　図１１は、二重遺伝暗号と分割コドンボックスの組み合わせによる新規人工翻訳システムのイメージ図である。この翻訳システムでは、天然のtRNAを一切含まない翻訳系を用いる。これに、20種類の蛋白質性アミノ酸を指定するのに必要なtRNA（in vitro転写で合成）と、望みの特殊アミノ酸及び人工開始残基を指定するのに必要なアミノアシルtRNA（in vitro転写、及びフレキシザイム等のアシル化技術を利用して合成）を加える。これにより、利用する開始コドンを増やしてそのそれぞれに人工開始残基を割り当て、また一方で伸長反応では、人工的にコドンボックスを分割し、分割したボックスのそれぞれに元の蛋白質性アミノ酸と特殊アミノ酸とを共存させる。
　本実施例では、セリン・アルギニン・グリシンのコドンボックスを人工的に分割し、かつその中に存在するあるコドンを人工開始コドンとしても利用し、Dual sense codon としても機能させた。
　三種類の人工開始残基でチャージされたtRNAfMetE（AcTyr-tRNAfMetE CCG, PenTyr-tRNAfMetE CGA, MhPhe-tRNAfMetE CCC）・三種類の特殊アミノ酸でチャージされたtRNAAsnE2（MeSer-tRNAAsnE2 GCG, Aly-tRNAAsnE2 GGA, Iph-tRNAAsnE2 GCC）・分割するコドンに配置されている3 種類のアミノ酸をコードするためのin vitro 転写tRNA（tRNAArg CCG, tRNASer CGA, tRNAGly CCC）・それ以外の17 種類の蛋白質性アミノ酸用のin vitro 転写tRNA を加えた翻訳系を用意する。この翻訳系で用いられる遺伝暗号は上記３つのコドンボックスが人工的に分割されており、その中には開始と伸長両方で機能するDual sense codon が配置されているため、元々の蛋白質性アミノ酸・人工開始残基・特殊アミノ酸の３つのアミノ酸が一つのコドンボックス中に共存している。
　図１２は、上述のペプチド合成例の結果を示す。ここでは、(1)CGG・(2)UCG・(3)GGGを人工開始コドンとして利用し、伸長反応では(1)CGN・(2)UCN・(3)GGNのコドンボックスを分割し、特殊アミノ酸を割り当てた。実際に翻訳合成を行い、翻訳産物の質量分析を行った結果、コドン分割を含む二重遺伝暗号に指定された通り、N末端に人工開始残基を持ち、複数の分割コドンボックス中の天然・非天然両方のアミノ酸を含むペプチドの合成が確認された。
　この翻訳系を用いて様々な配列のmRNA を発現した結果、全てのケースで望みのペプチド（つまり分割されたコドンボックス中で指定された人工開始残基、天然・非天然両方のアミノ酸を含むペプチド）が得られた。これにより、二重遺伝暗号とコドンボックスの人工分割の組み合わせが可能であることが実験的に実証されたと共に、天然の20 種類のアミノ酸＋3 種類の人工開始残基＋4 種類の特殊アミノ酸が同時利用可能な翻訳合成系が確立された。
　これまでに本発明者らは、翻訳系において特定の特殊アミノ酸を利用することで様々な特殊な骨格を含むペプチド（特殊ペプチド）の翻訳合成法を複数開発している。特殊ペプチドとはN 末端アシル基・N-メチルアミノ酸・D-アミノ酸・大環状骨格など構造を含むペプチドの総称であり、これら特殊骨格を含むため膜透過性・特異性・生体安定性などの医薬品に必要な特性を併せ持っており、医薬品開発のモチーフとして期待ができる。翻訳系はペプチドライブラリーの構築法として優れた合成手法であるため、翻訳系で特殊ペプチドが合成出来る技術は新たな医薬品候補の探索を行う上で非常に強力なツールとなってきている。
　本技術によって一つの翻訳系で利用可能な特殊アミノ酸の数を増やすことができる（通常は20 種類の蛋白質性アミノ酸のところ、20 種類以上の特殊アミノ酸を追加して合計40 種類以上）。これにより、翻訳系で構築される特殊ペプチドライブラリーにおける配列空間を大幅に拡げることが出来る。これは得られるペプチドライブラリーが高い配列多様性だけでなく、高い構造的多様性も示すことを意味し、より良いクオリティのライブラリー構築が可能になると言える。

　［配列表フリーテキスト］
配列番号１　tRNAfMetE
配列番号２　tRNAAsn-E2
配列番号３　Fx
配列番号４　dFx
配列番号５　eFx
配列番号６　aFx
配列番号７　tRNAfMet
配列番号８　tRNAAsn

Claims (14)

  1. 　特殊アミノ酸を結合したtRNAを無細胞翻訳系に添加してペプチド合成を行うことにより、特殊アミノ酸が導入されたペプチドを合成する方法であって、
    　リボソーム上の翻訳開始反応において、mRNAの翻訳開始部位のコドンに相補的なアンチコドンを持つ開始tRNAに結合した特殊アミノ酸が開始アミノ酸として機能することでペプチドN末端に導入され、
    　ペプチド鎖伸長反応において、普遍遺伝暗号表で１種の蛋白質性アミノ酸を指定する複数のコドンの一部が特殊アミノ酸に割り当てられることを特徴とする改変された遺伝暗号表に従って、特殊アミノ酸を結合した伸長用tRNAのアンチコドンで指定される位置に特殊アミノ酸が導入される、前記方法。
  2. 　特殊アミノ酸を結合したtRNAが、in vitroで転写合成されたtRNAを、in vitroでアミノアシル化することにより調製されたものである、請求項１の方法。
  3. 　伸長反応用の改変された遺伝暗号表が、普遍遺伝暗号表でLeu、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Arg、及びGlyをそれぞれ指定する複数のコドンの一部が特殊アミノ酸に割り当てられることを特徴とする遺伝暗号表である、請求項１または２の方法。
  4. 　伸長反応用の改変された遺伝暗号表において、普遍遺伝暗号表でLeu、Val、Ser、Pro、Thr、Ala、Arg、Glyをそれぞれ指定する４個または６個のコドンのうち２個のコドンが元の蛋白質性アミノ酸に割り当てられたままでありながら、これらコドンの残りは任意の特殊アミノ酸に割り当てられる、請求項３の方法。
  5. 　伸長反応用の改変された遺伝暗号表において、さらに停止コドンの一部が特殊アミノ酸に割り当てられる、請求項３または４の方法。
  6. 　無細胞翻訳系が、蛋白質性アミノ酸用のtRNA及びARSのセットとして、天然のtRNAに代えてin vitroで転写合成されたtRNA、及びこれに蛋白質性アミノ酸を特異的に結合させ得るARSのセットを含み、天然のtRNAを含まない、請求項１または２の方法。
  7. 　翻訳開始部位のコドンがAUGまたはAUG以外の任意のトリプレット配列からなる人工開始コドンである、請求項１または２の方法。
  8. 　人工開始コドンが、AUG, UGG, AUC, ACC, UCG, AAC, GCC, GGC, CCG, CGG, GGG 又はAUA である、請求項７の方法。
  9. 　同一配列のアンチコドンを持つ開始tRNAと伸長tRNAに異なる特殊アミノ酸を結合することにより、翻訳開始反応と伸長反応で同一配列のコドンを異なる特殊アミノ酸に割り当てることができる、請求項１または２の方法。
  10. 　翻訳開始反応と伸長反応で異なる特殊アミノ酸に割り当てられる同一配列のコドンが、AUG, UGG, AUC, ACC, UCG, 又はAACである、請求項９の方法。
  11. 　翻訳開始部位のコドンとして、AUGまたはAUG以外の任意のトリプレット配列から選択される、互いに異なる配列の人工開始コドンを持つ複数のmRNAを鋳型として利用し、それぞれの人工開始コドンに相補的なアンチコドンを持つ開始tRNAに異なる特殊アミノ酸が結合したアミノアシル開始tRNAを無細胞翻訳系に添加してペプチド合成を行うことにより、互いに異なるN末端アミノ酸を持つ複数のペプチドが一つの翻訳系中で合成される、請求項１または２の方法。
  12. 　互いに異なる様々な配列を持つ鋳型核酸からなる核酸ライブラリー、任意の特殊アミノ酸を結合した様々なアンチコドン配列を持つ開始tRNA、及び任意の特殊アミノ酸を結合した様々なアンチコドン配列を持つ伸長用tRNAを無細胞翻訳系に添加して、様々な配列を持つ特殊ペプチドからなるペプチドライブラリーを合成する、請求項１の方法。
  13. 　ペプチドが、これをコードする鋳型核酸と結合した状態で合成される、請求項１２の方法。
  14. 　特殊ペプチドを翻訳合成するためのキットであって、
    (i)mRNAであって、ペプチドをコードする領域が、
    （ａ）人工開始残基を指定する人工開始コドン、及び
    （ｂ）特殊アミノ酸を指定する伸長コドン
    を含むmRNA；
    (ii)人工開始残基及び特殊アミノ酸用のアミノアシルtRNAであって、
    （ｃ）前記(a)の人工開始コドンと相補的なアンチコドンを有する、人工開始残基を結合した開始tRNA、及び
    （ｄ）前記（ｂ）の伸長コドンと相補的なアンチコドンを有する、特殊アミノ酸を結合した伸長tRNA；
    (iii)蛋白質性アミノ酸用のtRNA及びARSのセットであって、蛋白質性アミノ酸、修飾塩基を含まない人工tRNA及びこれに蛋白質性アミノ酸を結合させ得るARSを含むセット；
    及び
    (iv）単離されたリボソーム
    を少なくとも含む、前記キット。
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