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WO2012093234A2 - Arabinogalactanes sulfates, apiogalacturonanes et heteroglycanes sulfates pour le traitement des maladies causees par les virus influenza - Google Patents

Arabinogalactanes sulfates, apiogalacturonanes et heteroglycanes sulfates pour le traitement des maladies causees par les virus influenza Download PDF

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WO2012093234A2
WO2012093234A2 PCT/FR2012/050017 FR2012050017W WO2012093234A2 WO 2012093234 A2 WO2012093234 A2 WO 2012093234A2 FR 2012050017 W FR2012050017 W FR 2012050017W WO 2012093234 A2 WO2012093234 A2 WO 2012093234A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sulphated
extract
arabinogalactans
polysaccharides
apiogalacturonans
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2012/050017
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English (en)
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WO2012093234A3 (fr
Inventor
Bruno Lina
Olivier Ferraris
Ho Hong Hai VO
François-Loïc Cosset
Judit SZECSI
Alain Heyraud
Hugues Lortat-Jacob
Julia BARTOLI
Rabia Sadir
Thierry Livache
Benoît DARBLADE
Stéphane HAVET
Silvère BONNET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Elicityl
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Elicityl
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Elicityl, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Priority to US13/977,780 priority patent/US9011939B2/en
Priority to BR112013017178A priority patent/BR112013017178A2/pt
Priority to CN201280011695.2A priority patent/CN103476418B/zh
Publication of WO2012093234A2 publication Critical patent/WO2012093234A2/fr
Publication of WO2012093234A3 publication Critical patent/WO2012093234A3/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of influenza viruses. More specifically, the invention relates to the use of certain polysaccharides as a medicament for the treatment, preventive or curative, of an influenza virus.
  • Influenza is a respiratory infection caused by influenza viruses. It is observed all over the world and reappears each year in winter epidemic waves. Today, it is the second leading cause of infectious mortality after pneumonia.
  • the influenza viruses responsible for human pathologies are influenza A and B viruses. While influenza B viruses circulate as lineages, influenza A viruses are classified into viral subtypes according to their properties. antigens of the two major surface glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA).
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • the circulating viruses in humans and responsible for seasonal epidemics are A (H1N1) and A (H3N2) viruses.
  • Vaccination is, for now, the only effective way to protect populations from influenza viruses. Nevertheless, alternative solutions, in the form of anti-viral drugs are the subject of many investigations.
  • WO 2009/027057 describes the use of carrageenans in a pharmaceutical composition for the prophylaxis and treatment of respiratory viral diseases caused by orthomyxoviruses, and in particular by influenza A and B viruses.
  • heparin Polymer formed by the chain of disaccharide units composed of a sulphated iduronic acid and a sulphated galactosamine pentosane polysulfate: Polymer of sulphated D-xylan
  • mannan sulfate sulphated mannan polymer.
  • US patent application 2010/0015248 proposes a composition for the treatment of colds and influenza, which comprises a mixture of acetaminophen, diphenylhydramine, dextromethorphan, arabinogalactan, vitamin C, zinc, extract of olive oil, resveratrol and elderberry extract. It is stated in this document that arabinogalactan, vitamin C and zinc are present to stimulate the immune system. Olive oil extract, resveratrol and elderberry extract are used as anti-viral agents. Acetaminophen, diphenylhydramine and dextromethorphan are used to relieve influenza symptoms.
  • the document WO 98/11778 describes drug compositions for the treatment of various viral diseases comprising an inhibitor of the microbial infection at the origin of the disease to be treated, in the form of an isolate of different plants.
  • the influenza virus is cited among a list of different viral infections, but the invention is rather directed to the treatment of the herpes virus to which all the examples and results relate.
  • the present invention is based on the discovery by the inventors, and those totally unexpectedly, that certain particular polysaccharides exhibited anti-viral activity against influenza viruses.
  • the subject of the invention is thus polysaccharides chosen from sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans and heteroglycan sulphates for their use as medicaments in the preventive or curative treatment of a disease caused by an influenza virus.
  • “Treatment” means any prophylactic or suppressive therapeutic measure of a disease caused by an influenza virus leading to a desirable clinical effect or any beneficial effect, including in particular the suppression or reduction of one or more symptoms, regression, slowing or stopping the progression of the disease associated with it.
  • Diseases caused by an influenza virus are usually called flu.
  • the invention relates to polysaccharides chosen from sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans and sulphated heteroglycans for their use as an antiviral agent against the influenza virus in a medicament intended for the treatment or prevention of a virus. influenza.
  • the present invention relates to the use of a polysaccharide chosen from sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans and heteroglycan sulphates, for the preparation of a medicament intended for the treatment, preventive or curative, of an influenza virus. .
  • the polysaccharide selected from sulfated arabinogalactans, apiogalacturonans and heteroglycan sulfates acts as an active ingredient, i.e., it is used for its anti-viral activity against influenza viruses.
  • the anti-viral activity against the influenza viruses is ensured by at least 70%, preferably at least 90%, and preferably at least 95% by the sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans or heteroglycan sulphates present.
  • said drug or pharmaceutical composition containing at least one polysaccharide chosen from sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans and heteroglycan sulphates contains no other compound, than sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans and heteroglycans sulphates. , exhibiting significant anti-viral activity.
  • a combination of polysaccharides chosen from sulfated arabinogalactans, apiogalacturonans and heteroglycans sulfates By compound exhibiting a significant anti-viral activity is meant a compound which causes a significant inhibition of the replication of the target virus.
  • an inhibition of at least 25%, preferably at least 50%, and preferably at least 80% at a concentration of 250 g / ml, in a test for inhibiting the replication of the influenza virus target such as those described in paragraph 1 of the examples below.
  • the inventors have demonstrated that polysaccharides belonging to the family of sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans or heteroglycans sulphates had an influence on the replication cycle of the influenza viruses and made it possible to inhibit the infection. of cells susceptible to infection. These sugars have also been shown to inhibit the entry of influenza viruses into viral pseudoparticles (VLPs).
  • VLPs viral pseudoparticles
  • Sulphated arabinogalactans are water-soluble sulphated polysaccharides composed of Galactose units linked together by glycoside bonds Beta 1-3. This main chain may have branches of Arabinose or Galactose units via Alpha 1-6 glycosidic linkages. These units may have several Arabinose and / or Galactose units linked together by glycoside bonds 1-3 or 1-6. Arabinoses or Galactoses can show sulfations on secondary alcohol groups.
  • the arabinose / galactose ratio preferably belongs to the range from 3/7 to 2/1, and corresponds, for example, to 1/1, 1/2 or 2/1.
  • sulfated arabinogalactans having a size belonging to the range of 1 000 to 2 ⁇ 10 6 g / mol, preferably in the range of 3000 to 1.1 ⁇ 10 6 g / mol and / or a corresponding average charge of 2 to 50%, preferably 5 to 40% of the sulfate groups.
  • Apiogalacturonans are polysaccharides which can be sulfated, soluble in water formed by a linear chain of Galacturonic Acid units linked together by alpha 1-4 glycosidic linkages. This main chain may have Apiose motifs linked by Beta 1-2 glycoside linkages. These motifs may have several Apiose motifs linked together by glycoside bonds Beta 1-5.
  • apiogalacturonans having a size in the range of 10 000 to 10 6 g / mol, preferably in the range of 50 000 to 700 000 g / mol and / or a corresponding average charge of 2 to 20%, preferably 4 to 12% of the sulfate groups.
  • the sulphated heteroglycans used in the context of the invention are water-soluble polysaccharides formed by a linear chain of alpha-1-3 and terminal-linked Galactose units, 1-4-linked xylose units and units. arabinose related in 1-4.
  • the Galactose units may have C 6 sulphates and the arabinose units C 3 sulphates.
  • sulfated heteroglycans having a size in the range of 500,000 to 5 ⁇ 10 6 g / mol and, for example, approximately 10 6 g / mol and / or a charge, will preferably be used. corresponding average of 5 to 30%, preferably 13 to 22% of the sulfate groups.
  • sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans and sulphated heteroglycans used in the context of the invention may be prepared by chemical synthesis or will preferably be extracted from a natural source such as algae or plants. In particular, they can correspond to:
  • any extraction method well known to those skilled in the art may be used.
  • the methods for extracting complex sugars by aqueous or organic solvents, followed or not by purification by selective precipitation, ionic interactions, filtration, etc. can be implemented.
  • an extraction comprising a step of extraction with water and a precipitation step with an alcohol such as ethanol.
  • influenza virus is meant all influenza viruses, including influenza viruses human, avian, equine, porcine and feline.
  • influenza viruses can be selected from types A, B and C.
  • influenza virus can be of type A and in particular correspond to the subtype strains H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H5IM2, H7N1. , H7N7 and H9N2.
  • influenza virus is selected from type B viruses, A-H5N1, A-H7N1 and A-H3N2.
  • the present invention also relates to the pharmaceutical compositions can be administered to animals, particularly humans, comprising, in combination with at least one pharmaceutically acceptable excipient according to the European Pharmacopoeia in particular 7 th edition:
  • excipients present in the medicaments and pharmaceutical compositions according to the invention are chosen according to the pharmaceutical form and the desired mode of administration.
  • the polysaccharides may be administered in unit dosage forms. administration, in admixture with conventional pharmaceutical carriers, to animals and humans for the prophylaxis or treatment of the above diseases.
  • Suitable unit dosage forms include oral forms, such as tablets, capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual, oral, intratracheal, intranasal, subcutaneous, intramuscular, intracartilage or intravenous administration and forms of rectal administration.
  • oral forms such as tablets, capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual, oral, intratracheal, intranasal, subcutaneous, intramuscular, intracartilage or intravenous administration and forms of rectal administration.
  • the compounds according to the invention can be used in creams, ointments or lotions.
  • the drug or composition generally contains a therapeutically effective amount of polysaccharides selected from sulfated arabinogalactans, apiogalacturonans and heteroglycan sulfates.
  • therapeutically effective amount is meant any amount of a composition that improves one or more of the parameters characteristics of the condition being treated.
  • the dose of polysaccharide varies, for example, between 0.001 and 100 mg per kg of body weight per day. Nevertheless, in the context of the invention, the pharmaceutical compositions also include homeopathic compositions.
  • the main active ingredient is mixed with a pharmaceutical carrier, such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic or the like.
  • a pharmaceutical carrier such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic or the like.
  • the tablets can be coated with sucrose, a cellulose derivative, or other suitable materials or they can be treated in such a way that they have prolonged or delayed activity and continuously release a quantity predetermined active ingredient.
  • a preparation in capsules is obtained by mixing the active ingredient with a diluent and pouring the resulting mixture into soft or hard gelatin capsules.
  • compositions containing a polysaccharide according to the invention may also be in liquid form, for example, solutions, emulsions, suspensions or syrups, and in particular in a form suitable for oral or intranasal administration, for example.
  • suitable liquid carriers may be, for example, water, organic solvents such as glycerol or glycols, as well as their mixtures, in varying proportions, in water.
  • a preparation in the form of a syrup or elixir or for administration in the form of drops may contain the active ingredient together with a sweetener, preferably acaloric, methylparaben and propylparaben as antiseptic, as well as a flavoring agent. and a suitable dye.
  • a sweetener preferably acaloric, methylparaben and propylparaben as antiseptic, as well as a flavoring agent. and a suitable dye.
  • Water-dispersible powders or granules may contain the active ingredient in admixture with dispersants or wetting agents, or suspending agents, such as polyvinylpyrrolidone, as well as with sweeteners or scavengers disgust.
  • the drugs or compositions comprising at least one polysaccharide chosen from sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans and heteroglycan sulphates are for human or veterinary use.
  • the polysaccharide may be in a food additive.
  • the antiviral drugs and antiviral compositions against the influenza virus according to the invention do not contain olive oil, resveratrol or elderberry extract, in particular when or they contain an arabinogalatane as previously defined.
  • the present invention also relates to a method for treating humans or animals, and in particular chickens, comprising administering the use of a polysaccharide chosen from sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans and sulfated heteroglycans to fight, as a preventive or curative, a disease caused by an influenza virus.
  • a polysaccharide chosen from sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans and sulfated heteroglycans
  • the present invention also relates to the use of a polysaccharide chosen from sulphated arabinogalactans, apiogalacturonans and heteroglycan sulphates in a food composition in which said polysaccharide is used for preventive or curative control, against a disease caused by an influenza virus.
  • the food composition comprises:
  • the food composition does not contain olive oil, resveratrol or elderberry extract.
  • Obtaining the Codium Fragile extracts presented in the invention consists, in a first step, in the depigmentation of the crushed algae by an organic solvent, in particular ethanol.
  • the depigmented residue is then extracted, at ambient temperature, in an aqueous medium for a few hours at 24 hours.
  • the extract thus obtained can be improved by using polysaccharide purification methods, such as selective precipitation with organic solvents such as ethanol and / or ionic interaction, and / or ultrafiltration dialysis.
  • the extract thus obtained mainly presents the described structure of sulphated arabinogalactan (Marina Ciancia et al., 2007 - International Journal of Macromolecules 41 (2007) 641-649), namely a linear chain of galactoses linked together by glycosidic bonds Beta 1-3.
  • This main chain can present branchings of Arabinose or Galactose units by glycoside bonds Alpha 1-6. These units may have several Arabinose and / or galactoses linked together by glycoside bonds 1-3 or 1-6.
  • Arabinoses or Galactoses can show sulfations on secondary alcohol groups.
  • the monosaccharide composition of the extracts obtained in the context of this invention is confirmed by assays of monosaccharides by the HPAEC PAD chromatography technique following total acid hydrolysis.
  • the extracts show Arabinose and Galactose (3/7 to 1/1).
  • the characteristic signals of the glycosidic bonds of arabinogalactan are evidenced by Nuclear Magnetic Resonance of Proton.
  • Assays of sulphate groups by the method of Barium Chloride make it possible to assess the rate of sulphation of the extracts between 18 and 30% by weight.
  • Size Exclusion Chromatography (SEC) of the polymers makes it possible to estimate the average molecular weight of sulfated arabinogalactan polysaccharides present in the extracts. This, depending on the samples, is in the range of from about 3,000 to about 1.103 ⁇ 4 / mol.
  • the seaweed can be depigmented.
  • 50 g of Codium Fragile in Powder can be depigmented by 4 successive washes with an organic solvent such as ethanol. Each wash consists of suspending the 50 g of algae powder in one liter of pure ethanol and shaking for 2 hours at 400 rpm with a temperature of 20 ° C. After each wash, the extraction residue is isolated by filtration on Whatman paper. This operation is renewed three times. Following these depigmentation steps, the extraction residue is dried overnight in an oven at 40 ° C.
  • the depigmentation residue can be extracted in an aqueous medium.
  • the residue corresponding to 50 g of depigmented Codium Fragile is resuspended in DI of deionized water, stirred for 16 h at 600 rpm and at room temperature. After 16h, the soluble extract is isolated by centrifugation (7000 rpm 4 ° C 40 minutes). This aqueous extract is called A aqueous extract.
  • the sample extract No. 98 is obtained by desalting the aqueous extract A by tangential ultrafiltration on a membrane of 10 kDa. Desalting is obtained after diafiltration with the passage of 6 volumes of deionized water, ie 6L. The ultrafiltration retentate corresponds to sample No. 98.
  • the extracted sample No. 79 is obtained by a new refining step of the sample No. 98 by tangential ultrafiltration membrane 0.2 ⁇ . This ultrafiltration is carried out at a concentration of 10 g / L with a diafiltration in deionized water of 10 volumes. The fraction retained corresponds to the extracted sample No. 79.
  • the aqueous extract A can also be treated by tangential ultrafiltration on a membrane of 0.2 ⁇ . This ultrafiltration is carried out at a concentration of 10 g / L with a diafiltration in deionized water of 10 volumes. The fraction retained corresponds to the sample extracted No. 141.
  • the algae can be directly extracted with an aqueous solvent.
  • 50 g of Codium Fragile in Powder are dissolved in 1 L of deionized water with stirring of 400 rpm, at room temperature overnight.
  • the soluble extract is isolated by centrifugation (8000 rpm, 4 ° C, 60 minutes). This aqueous extract is called aqueous extract B.
  • Extracted samples Nos. 109 and 238 are obtained by precipitation with an organic solvent, such as ethanol.
  • an organic solvent such as ethanol.
  • the aqueous extract B is precipitated with 50% v / v of pure ethanol.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (5000 rpm, 4 ° C, 10 minutes).
  • the sample extract No. 294 is obtained by a new refining step of the sample No. 109 or 238 by ionic interactions.
  • This step purification by ionic interactions is carried out on an anion exchange support, in particular polysaccharide microbumbles formed of crosslinked chitosan.
  • the sample No. 109 or 238 is dissolved in a solution of pH 4-5 by acidification, in particular with hydrochloric acid.
  • the sample is then brought into contact with the ion exchange support, then rinsed with deionized water, preferably acidified, in particular with hydrochloric acid to reach a pH of 4-5.
  • the sugar of interest is released from the support with a basic buffer, in particular a bicarbonate / carbonate buffer, preferably adjusted to a pH of about 10.
  • a basic buffer in particular a bicarbonate / carbonate buffer, preferably adjusted to a pH of about 10.
  • the soluble fraction is isolated, preferentially by filtration.
  • This fraction is then desalted, in particular by precipitation with an organic solvent, such as ethanol.
  • the fraction is concentrated, preferably to a concentration of 1 to 10 g / l polysaccharides, then precipitated with 50% v / v of pure ethanol.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (5000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) and then oven-dried.
  • the fraction thus obtained is sample No. 294.
  • Extracted sample No. 242 is obtained by a new step of refining sample No. 109 or 238 by tangential ultrafiltration on a 0.2 ⁇ m membrane. This ultrafiltration is carried out at a concentration of 10 g / l with a diafiltration in deionized water of 10 volumes. The fraction retained corresponds to the extracted sample No. 242.
  • the sample extracts No. 152 is obtained by acid hydrolysis, in particular with hydrochloric acid, of the extracted samples No. 109 or 238 followed by a selection of the molecular mass on two ultrafiltration membranes 3 and 10 kDa.
  • the mass selection is carried out by a first tangential ultrafiltration on a 10 kDa membrane made at 10 g / L with a diafiltration of 10 volumes with deionized water.
  • the permeate is then passed through tangential ultrafiltration on a 3 kDa membrane, with a first concentration phase of a factor of 10, then a diafiltration of 10 volumes with deionized water.
  • the retentate of this second tangential ultrafiltration on a membrane of 3 kDa constitutes the sample extracted No. 152.
  • Extracted samples Nos. 237 and 239 are obtained by treating the aqueous extract B with bentonite followed by ethanol precipitation.
  • the aqueous extract B obtained from the extraction of 50 g of Codium Fragile in 1 L of water is treated by the addition of 10 g of bentonite previously resuspended in 100 ml of deionized water. The solution is stirred and then left to stand for about 1 hour at room temperature.
  • the soluble phase is isolated by centrifugation (8000 rpm 4 ° C 15 minutes).
  • the isolated soluble phase is precipitated with an organic solvent, in particular with final 50% v / v ethanol.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (5000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) and constitutes the extracted samples No. 237 and 239.
  • the extracted sample No. 240 is obtained by a new step of refining sample No. 237 or 239 by tangential ultrafiltration on a 0.2 ⁇ m membrane. This ultrafiltration is carried out at a concentration of 10 g / L with a diafiltration in deionized water of 10 volumes. The fraction retained corresponds to the extracted sample No. 240.
  • the extracts obtained present, for the most part, the described structure of sulphated arabinogalactan (Marina Ciancia et al., 2007 - International Journal of Biological Macromolecules 41 (2007) 641-649), namely a linear chain of galactoses linked together by glycosidic bonds Beta 1-3.
  • This main chain may have branches of Arabinose or Galactose units via Alpha 1-6 glycosidic linkages. These units may have several Arabinose and / or Galactose units linked together by glycoside bonds 1-3 or 1-6.
  • Arabinoses or Galactoses can show sulfations on secondary alcohol groups.
  • Obtaining the Zostera marina extracts presented in the invention consists in a first step in the depigmentation of the plant with an organic solvent, in particular ethanol.
  • the depigmented residue is then extracted under heat in an aqueous medium for a few hours at 24 hours.
  • the extraction residue undergoes a second extraction in an acidic medium, in particular in TFA medium.
  • the extraction polysaccharide is obtained by precipitation according to the pH of the filtrate obtained previously. This polysaccharide can be improved using polysaccharide purification methods such as selective precipitation with organic solvents such as ethanol, and / or ultrafiltration dialysis.
  • the extract thus obtained mainly presents the described structure of apiogalacturonan (Véronique BRUDIEUX- 2007 PhD thesis - University of Limoges - Extraction, enzymatic modification and chemical characterization of new pectic structures Application of the structure / activity relationship to dermocosmetics. ), namely a linear chain of Galacturonic Acids linked together by alpha 1-4 glycosidic bonds. This main chain may have branched Apiose motifs linked by Beta 1-2 glycoside bonds. These motifs may have several Apioses linked together by glycoside bonds Beta 1-5.
  • the monosaccharide composition of the extracts obtained in the context of this invention is confirmed by assays of monosaccharides by the HPAEC PAD chromatography technique following total acid hydrolysis and by gas chromatography technique after derivatization of the monosaccharides by acetylation.
  • the extracts present Galacturonic Acid and Apiose.
  • the characteristic signals of the glycosidic linkages of apiogalacturonan are evidenced by Nuclear Magnetic Resonance of Proton, in particular the chain of Galacturonic Acid in alpha 1-4 after partial acid hydrolysis of Apioses.
  • Assays of sulfate groups by Barium Chloride method make it possible to evaluate the sulfation rate of the extracts between 4 and 12% by weight.
  • the SEC of polymers makes it possible to estimate the average molecular mass of sulfated arabinogalactan polysaccharides present in the extracts, which varies from 50,000 to 700,000 g / mol.
  • the first method makes it possible to obtain the extracted sample No. 138.
  • the marine plant, Zostera marina powder is washed with water. 40 g of Zostera marina powder are dissolved in 1 L of deionized water, about 5 hours at 95 ° C with stirring of 500 rpm. The wash residue is isolated by centrifugation (8000 rpm, 4 ° C, 20 minutes).
  • the resulting pellet is then extracted in an acid medium, for example with TFA.
  • the wash residue is redissolved in 0.5 N TFA, stirred at 500 rpm for about 2 hours at 25 ° C.
  • the soluble fraction is isolated by centrifugation (8000 rpm, 4 ° C, 30 minutes).
  • the soluble fraction thus isolated is neutralized to pH 7.5, a precipitate appears.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (8000 rpm, 4 ° C., 30 minutes).
  • This precipitate is returned to solution with IL of deionized water.
  • This solution is then precipitated with ethanol previously placed at -20 ° C., up to 60% final v / v.
  • the precipitate formed is isolated by centrifugation (7000 rpm, 4 ° C., 10 minutes).
  • the precipitate is dissolved again at a rate of 10 g / L to be desalted by tangential ultrafiltration on a 650 Da membrane. A diafiltration of 10 volumes is carried out with deionized water. The retentate obtained is lyophilized to give the extracted sample No. 138.
  • the pellet obtained during the first extraction with hot water can also be extracted in acidic medium with hydrochloric acid.
  • the washing residue is redissolved in IL of 0.5N HCl, stirred at 500 rpm. for about 2 hours at 25 ° C.
  • the soluble fraction is isolated by centrifugation (8000 rpm, 4 ° C, 30 minutes).
  • the soluble fraction thus isolated is neutralized to pH 7.5, a precipitate appears.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (8000 rpm, 4 ° C., 30 minutes).
  • This precipitate is returned to solution with IL of deionized water.
  • This solution is then precipitated with ethanol previously placed at -20 ° C., up to 60% final v / v.
  • the precipitate formed is isolated by centrifugation (7000 rpm, 4 ° C., 10 minutes).
  • the oven-dried precipitate gives the extracted sample No. 296.
  • the second method is an extraction of Zostera marina with oxalate after depigmentation with an organic solvent such as ethanol.
  • 50 g of Zostera marina powder are suspended in IL pure ethanol. The mixture is brought to 78 ° C. with stirring at 500 rpm for approximately 5 hours.
  • the depigmenting residue is isolated by filtration on a Buchner filter of 20-25 ⁇ m and dried in an oven at 40 ° C. overnight.
  • the depigmented marine plant is then dissolved in 1% ammonium oxalate solution with stirring at 750 rpm at 70 ° C. for approximately 2 hours.
  • the soluble extract is isolated by centrifugation (8000 rpm, 4 ° C, 30 minutes).
  • the extracted fraction can be desalted by tangential ultrafiltration on 10 kDa membranes. Diafiltration of about 10 volumes is carried out with deionized water.
  • the retentate is lyophilized to give the extracted sample No. 158.
  • the third method is an extraction of Zostera marina with 3% sodium carbonate after depigmentation with an organic solvent such as ethanol.
  • 50 g of Zostera marina powder are suspended in IL pure ethanol. The mixture is brought to 78 ° C. with stirring at 500 rpm for approximately 5 hours.
  • the depigmenting residue is isolated by filtration on 20-25 ⁇ m Buchner filter and dried in an oven at 40 ° C overnight.
  • the depigmented marine plant is then redissolved in IL 3% sodium carbonate with stirring of 500 rpm at 70 ° C for about 2 hours.
  • the soluble extract is isolated by centrifugation (8000 rpm, 4 ° C, 30 minutes) and then neutralized with hydrochloric acid.
  • the product thus isolated is precipitated with ethanol previously placed in 20 ° C, up to 50% v / v final.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (6000 rpm, 4 ° C, 5 minutes).
  • the precipitate can be washed several times, three times for example, with pure ethanol. It is then dried in an oven at 40 ° C overnight.
  • the dried precipitate can then be desalted by tangential ultrafiltration on 10 kDa membranes. Diafiltration of about 10 volumes is carried out with deionized water.
  • the retentate is lyophilized to give the extracted sample No. 160.
  • the retentate may also be precipitated by an organic solvent such as ethanol previously placed at -20 ° C, up to 50% v / v final.
  • the precipitate is isolated by centrifugation at 6000 rpm 4 ° C. for approximately 5 minutes.
  • the precipitate can be washed several times, three times for example, with pure ethanol. It is then dried in an oven at 40 ° C overnight.
  • the dried precipitate constitutes the extracted sample No. 161. Characterization of Zostera marina extracts:
  • the extracts thus obtained mainly present the described structure of apiogalacturonan (Véronique BRUDIEUX - 2007 PhD thesis - University of Limoges - Extraction, enzymatic modification and chemical characterization of new pectic structures Application of the structure / activity relationship to dermocosmetics), namely a linear chain of galacturonic acids linked together by alpha 1-4 glycosidic linkages.
  • This main chain may have apiose motifs linked by Beta 1-2 glycoside bonds. These motifs may have several Apioses linked together by glycoside bonds Beta 1-5.
  • Obtaining the Caulerpa racemosa extracts presented in the invention consists in a first step in the depigmentation of the crushed algae by an organic solvent, in particular ethanol.
  • the depigmented residue is then extracted under heat in an aqueous medium for a few hours at 24 hours.
  • the resulting extract can be improved using polysaccharide purification methods such as selective precipitation with organic solvents such as ethanol and / or ionic interaction, and / or ultrafiltration dialysis.
  • the extract thus obtained predominantly exhibits the described structure of the sulphated heteroglycan (CHATTOPADHYAY Kausik et al., 2006 - Carbohydrate polymers 2007, vol.68, no.3, pp. 407-415), namely galactoses linked in alpha 1-3 and terminal, 1-4-linked xyloses and 1-4 arabinoses.
  • Galactoses can have C 6 sulphates and C3 sulphate arabinoses.
  • the monosaccharide composition of the extracts obtained in the context of this invention is confirmed by assays of monosaccharides by the HPAEC PAD chromatography technique following total acid hydrolysis.
  • the extracts show Arabinose, Galactose and Xylose (10/10 / 0.5 to 13/13/1).
  • the characteristic signals of the xyloarabinogalactan glycoside bonds are evidenced by Proton Nuclear Magnetic Resonance.
  • Assays of sulphate groups by the method of Barium Chloride make it possible to evaluate the rate of sulphation of the extracts between 22 and 13% by mass.
  • the SEC of the polymers makes it possible to estimate the average molecular weight of sulphated arabinogalactan polysaccharides present in the extracts at approximately 10 6 g / mol.
  • Extracted samples 162 and 234 are obtained by cold precipitation of the aqueous extract with an organic solvent, such as ethanol.
  • an organic solvent such as ethanol.
  • the aqueous extract is precipitated with 50% v / v of pure ethanol previously put at -20 ° C.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (4000 rpm, 4 ° C, 10 minutes).
  • the precipitate can be washed several times, three times for example, with pure ethanol. It is then dried in an oven at 40 ° C overnight.
  • Extracted sample No. 295 is obtained by a new refining step of sample No. 162 or 234 by ionic interactions.
  • This step purification by ionic interactions is carried out on an anion exchange support, especially polysaccharide microbeads formed of crosslinked chitosan.
  • the sample No. 162 or 234 is dissolved in a pH of 4-5 by acidification, in particular with hydrochloric acid.
  • the sample is then brought into contact with the ion exchange support, then rinsed with deionized water, preferably acidified, in particular with hydrochloric acid to reach a pH of 4-5.
  • the sugar of interest is released from the support with a basic buffer, in particular a bicarbonate / carbonate buffer, preferably adjusted to a pH of about 10.
  • a basic buffer in particular a bicarbonate / carbonate buffer, preferably adjusted to a pH of about 10.
  • the soluble fraction is isolated, preferentially by filtration.
  • This fraction is then desalted, in particular by precipitation with an organic solvent, such as ethanol.
  • the fraction is concentrated, preferably to a concentration of 1 to 10 g / l polysaccharides, then precipitated with 50% v / v of pure ethanol.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (5000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) and then oven-dried.
  • the fraction thus obtained is sample No. 295.
  • the aqueous extract may also be treated with bentonite to improve its purification and then precipitated with an organic solvent, especially ethanol.
  • the aqueous extract from the extraction of 70 g of Caulerpa racemosa in 1 L of water is treated by the addition of 6.5 g of bentonite previously resuspended in 65 ml of deionized water. The solution is stirred and then left to stand for about 1 hour at room temperature.
  • the soluble phase is isolated by centrifugation (8000 rpm, 4 ° C, 15 minutes).
  • the product thus isolated is precipitated with ethanol previously placed at -20 ° C., up to 50% final v / v.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (5000 rpm, 4 ° C, 10 minutes).
  • the precipitate can be washed several times, three times for example, with pure ethanol. It is then dried in an oven at 40 ° C overnight.
  • the precipitation residue constitutes the extracted sample No. 233. Characterization
  • the extracts thus obtained predominantly have the described structure of the sulphated heteroglycan (CHATTOPADHYAY Kausik et al. Carbohydrate polymers 2007, vol. 68, no. 3, pp. 407-415), namely alpha and terminal linked galactoses, 1-4-linked xyloses and 1-4 arabinoses.
  • Galactoses can have C 6 sulphates and C3 sulphate arabinoses.
  • the signals observed correspond to the characteristic signals of the described structures of sulfated Heteroglycans.
  • the milled Ulva armoricana seaweed is treated by extraction in aqueous phase.
  • 70 g of Ulva armoricana are suspended in one liter of deionized water at 95 ° C. for approximately 12 hours with stirring of 850 rpm.
  • the soluble extract is isolated by centrifugation (8000 rpm, 4 ° C, 45 minutes).
  • the product thus isolated is precipitated with ethanol previously placed at -20 ° C., up to 60% final v / v.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (4000 rpm, 4 ° C, 5 minutes).
  • the precipitate can be washed several times, three for example, with pure ethanol. It is then dried in an oven at 40 ° C overnight.
  • the precipitated extract is then purified on tangential ultrafiltration membranes. First, the precipitated extract is dissolved in 5 g / l and diafiltered with 10 volumes of deionized water on a 300 kDa membrane.
  • the permeate of this ultrafiltration is concentrated by 10 on a second tangential ultrafiltration membrane of 100 kDa, then diafiltered by 10 volumes of deionized water.
  • the retentate of this second ultrafiltration is lyophilized to give the extracted sample # 244.
  • the permeat is lyophilized after concentration to give the sample No. 245 sample.
  • the extract thus obtained has predominantly the described structure of ulvane (Marc Lahaye, Carbohydrate Research 1998), namely a chain formed of patterns among the following four reasons:
  • the crushed Agardhiella tenera seaweed is treated by extraction in aqueous phase after depigmentation with an organic solvent such as ethanol.
  • 200 g of powdered Agardhiella tenera are suspended in IL of pure ethanol.
  • the mixture is brought to 78 ° C. with stirring at 500 rpm for approximately 3 hours.
  • the depigmenting residue is isolated by filtration on a 20-25 ⁇ m Buchner filter and dried in an oven at 40 ° C. overnight.
  • the alga thus depigmented is then redissolved in 10 liters of deionized water at 37 ° C. for approximately 6 hours with stirring of 850 rpm.
  • the soluble extract is isolated by centrifugation (8000 rpm, 30 ° C, 30 minutes).
  • the product thus isolated is precipitated with ethanol previously placed at -20 ° C., up to 67% v / v final.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (4000 rpm, 4 ° C, 5 minutes).
  • the precipitate can be washed several times, three times for example, with pure ethanol. It is then left to dry in an oven at 40 ° C., forming the extracted sample No. 164.
  • the soluble portion resulting from the first precipitation step is taken up with ethanol addition at -20 ° C. to 83% final v / v of ethanol.
  • the precipitate is isolated by centrifugation (4000 rpm, 4 ° C.).
  • the precipitate can be washed several times, for example, three times with pure ethanol, and is then dried in an oven at 40 ° C., forming the extracted sample No. 165.
  • ethanol is added at -20 ° C. to obtain 92% final v / v of ethanol.
  • the precipitate can be washed several times, for example three times, with pure ethanol. It is then dried in an oven at 40 ° C forming the sample extracted No. 166.
  • the identification of active samples relies on the evaluation of the ability of molecules to block the viral replication of the influenza virus on a cell system that is permissive to the latter.
  • the evaluation was conducted against influenza viruses type A and B, which can induce epidemics in the human population. i).
  • viruses A / Brisbane / 10/2007 H3N2, and B / Florida / 4/06 were used in the neutralization tests. These represent antigenically the circulating strains of the winter seasons 2008-2009 for the southern and northern hemisphere. They were selected to enter the vaccine composition of the corresponding winters.
  • concentrations of samples are made in the middle of infection (250 ⁇ g / ml; ; 2.5mg / ml). Each concentration is contacted with an equal volume of a standardized amount of virus. This mixture is deposited at the rate of 4 cups per concentration, in 96 well plates coated with MDCK cells. Negative controls are performed to verify the absence of cytopathic effect of uninfected MDCK cells. A control of the amount of virus used in the test is also deposited. After 48 hours of incubation, the% neutralization is determined by the detection of the virus in the culture supernatant by an enzymatic test.
  • the polysaccharides 79, 98, 109, 141, 237, 239, 240, and 242 belong to the family of sulfated arabinogalactans.
  • the polysaccharide 138 belongs to the family of apiogalacturonans.
  • Polysaccharides 233 and 234 belong to the family of sulfated heteroglycans.
  • Polysaccharides 164 to 166 belong to the family of carrageenans, and finally ulvans are represented by polysaccharides 244 and 245.
  • Polysaccharides with the exception of ulvans, have demonstrated a high biological activity with respect to type B viruses. All the molecules inhibit more than 70% of the replication at a concentration of 250 mg / ml. The concentration which makes it possible to inhibit 50% of viral replication is between 25 and 250 mg / ml for apiogalacturonan 138 and is less than 2.5 g / ml for all sulphated arabinogalactans and sulphated heteroglycans.
  • sulfated arabinogalactan polysaccharides and heteroglycan sulphates which exhibit such activity are more effective than control carrageenans.
  • the sulfated arabinogalactans 79, 98, 109, 141 inhibit between 25 and 75% of the viral replication when they are used at 250 ⁇ 9 / ⁇ .
  • Polysaccharide 152 belongs to the family of sulfated arabinogalactans, polysaccharides 158, 160 and 161 to the family of apiogalacturonans, and polysaccharide 162 to the family of sulfated heteroglycans. All of these polysaccharides exhibit a high activity with respect to the type A virus, since for a concentration of 250 g / ml, the percentage inhibition is between 75 and 100%. The concentration to inhibit 50% of viral replication is between 2.5 and 25 mg / ml. Polysaccharides 152 and 162 are also characterized by high activity against type B virus, with a concentration to inhibit 50% of viral replication less than 2.5 ⁇ g / ml.
  • glycoproteins capable of embedding on the surface of retroviral particles and forming functional VLPs are impressive (Sandrin V, et al., (2003) Targeting retroviral and lentiviral vectors. Curr Top Microbiol Immunol 281: 137-78) and includes many viruses from very distant families.
  • the concept of pseudotyping has led to several applications in the different sectors of biotherapeutic research, and more particularly, in the search for antivirals. Indeed, by mimicking the cellular input properties of parental viruses whose glycoproteins originate, PPVs allow numerous fundamental studies in low confinement conditions (L2 or even L1) even for class 4 viruses, due to fact that such hybrids are defective for replication.
  • PPV infection is limited to the single step of cell entry and integration of the recombinant genome, and induces the insertion of the genetic marker by virtue of the properties of the retroviral particle used (Negro D, et al (2000) Characterization of novel safe lentiviral vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) that efficiently transduce mature human dendritic cells, Gene Ther., 7: 1613-23.).
  • SIVmac251 novel safe lentiviral vectors derived from simian immunodeficiency virus
  • the quantitative measurement of the consecutive expression of the GFP marker gene by means of cytofluorimetry technique makes it possible to very precisely determine the infectious capacity of the PPVs.
  • VLPs are therefore particularly suitable for identifying compounds that have an antiviral effect due to interference with the functions of surface glycoproteins, such as, for example, cell entry inhibitors.
  • influenza A H3N2 PPVs that incorporate on their surface glycoproteins from two human influenza virus strains that regularly circulate in the population have been developed: influenza A H3N2 and influenza B. This has allowed the identification of compounds that, in the future, can protect the human population in the event of an epidemic caused by these viruses. iii) Production of retroviral particles pseudotyped with influenza virus glycoproteins.
  • influenza virus glycoproteins are incorporated on the surface of replication-deficient retroviruses and are native to murine leukemia virus (MLV).
  • Flu-PPVs consist of MLV GagPol proteins and a defective genome with the GFP marker gene (Hatziiannou et al., 1998, Szécsi et al., 2006). Expression of GFP in cells infected with these PPVs accurately reflects the infectious capacity of glycoproteins on the surface of PPVs. This system is therefore a very suitable tool for studying cell entry and inhibition of influenza virus entry. On the surface of PPV haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) of the various influenza viruses mentioned above have been incorporated. Flu-PPVs were produced by transient expression in producer cells, internal viral (GagPol, GFP) and surface (HA, NA) components. Flu-PPVs were harvested from the supernatant of the producer cells 48 h after transfection.
  • HA haemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • the level of target cell infectivity by FACS was measured by taking advantage of GFP expression in infected cells (Bartosch B, et al., (2003) In vitro assay for neutralizing antibody to hepatitis C virus: evidence for broadly conserved neutralization epitopes, Proc Natl Acad Sci USA 100: 14199-204).
  • The% inhibition that reflects the inhibition of virus entry was determined as the decrease in infectious titer in the presence of sugar compared to the titre determined without sugar.
  • This inhibition test is particularly sensitive and robust, and the results are reproducible. This test can be easily adapted to the 96-well plate format that can be easily analyzed with our cytometer (HTS / CantoII, Becton-Dickinson), which has an adapter to pass high-throughput samples.
  • This inhibition test was miniaturized to increase the screening capacity: the inhibition test was performed in 96-well plates that allowed us to test 96 different samples at a time.
  • Figure 16 shows the inhibitory activity of sulfated arabinogalactans tested on the entry of PPV influenza A H3N2.
  • Figure 17 shows the inhibitory activity of sulfated arabinogalactans tested on the entry of PPV influenza B.
  • Figure 18 shows the inhibitory activity of sulfated arabinogalactans tested at the entry of influenza A H5N1 PPVs.
  • Figure 19 shows the inhibitory activity of sulfated arabinogalactans tested on the entry of PPV influenza A H7N1.
  • Sulfated arabinogalactans have been very effective in preventing viral entry, even at a low concentration (ie, 10 ⁇ g / ml).
  • the inhibition obtained with these sulphated arabinogalactan compounds was more effective than the inhibition by the control sugars, the carrageenans.
  • the sulphating of the arabinogalactans was necessary to obtain the anti-inflammatory activity. -grippale.
  • Figure 20 shows the% inhibition of entry of influenza A H5N1 PPV obtained with sulfated arabinogalactans extracted from Codium brittle (79, 98, 109, 141, 152, 237, 238, 239, 240, 242) in comparison with those obtained in the case of two arabinogalactans extracted from fragile Codium, but which have been desulfated (278, 279) and from an unsulfated arabinogalactan extracted from larch (206). It is clear that, in the absence of sulfation, no activity is observed.
  • Figure 21 shows the inhibitory activity of the apiogalacturonans tested on the entry of PPV influenza A H3N2. Both samples of apiogalacturonan 160 and 161 inhibited the entry of influenza A H3N2 PPV at concentrations of 500 and 100pg / ml. The effectiveness of the inhibition obtained with these sugars was between 50 and 60%.
  • Figure 22 shows the inhibitory activity of apiogalacturonans tested at the entry of influenza B PPV. All apiogalacturonan samples tested inhibited the entry of influenza B PPV at concentrations of 500 and 100 g / ml. The effectiveness of the inhibition obtained with these sugar compounds was between 40 and 65%.
  • Figure 23 shows the inhibitory activity of the apiogalacturonans tested on the entry of PPV influenza A H5N1. All apiogalacturonan samples tested inhibited entry of influenza A H5N1 PPVs to concentrations of 500 and 100 ⁇ g / ml. The effectiveness of the inhibition obtained with these sugar compounds was between 40 and 55%.
  • Figure 24 shows the inhibitory activity of sulfated heteroglycans tested on the entry of influenza A H3N2 PPV. All sulfated heteroglycans tested inhibited the entry of influenza A H3N2 PPV at concentrations of 500 and 100 ⁇ g / ml. The effectiveness of the inhibition obtained with these sugar compounds was between 50 and 80%. The inhibition obtained with these sulfated heteroglycan compounds was similar to that obtained with the control sugars, carrageenans.
  • Figure 25 shows the inhibitory activity of sulfated heteroglycans tested on the entry of influenza B PPV. All sulfated heteroglycans tested inhibited the entry of influenza B PPV at concentrations of 500 and 100 ⁇ g / ml. The effectiveness of the inhibition obtained with these sugar compounds was between 90 and 65%. The inhibition obtained with these sulfated heteroglycan compounds was similar to that obtained with the control sugars, the carrageenans.
  • Figure 26 shows the inhibitory activity of sulfated heteroglycans tested on the entry of influenza A H5N1 PPVs. All sulfated heteroglycans tested inhibited the entry of influenza A H5N1 PPV at concentrations of 500 and 100 ⁇ g / ml. The effectiveness of the inhibition obtained with these sugar compounds was between 55 and 80%. The inhibition obtained with these sulfated heteroglycan compounds was similar to that obtained with the control sugars, carrageenans.
  • Figure 27 shows the inhibitory activity of sulfated heteroglycans tested on the entry of influenza A H7N1 PPVs. All sulfated heteroglycans tested inhibited the entry of influenza A H7N1 PPVs to concentrations of 500 and 100 g / ml. The effectiveness of the inhibition obtained with these sugar compounds was between 60 and 80%. The inhibition obtained with these sulfated heteroglycan compounds was similar to that obtained by the control sugars, carrageenans.
  • Figure 28 shows the inhibitory activity of carrageenan tested on the entry of PPV influenza A H3N2. All carrageenans tested inhibited the entry of influenza A H3IM2 PPV at concentrations of 500 and 100 g / ml.
  • the effectiveness of the inhibition obtained with these sugar compounds was between 60 and 70%.
  • Figure 29 shows the inhibitory activity of carrageenans tested on the entry of influenza B PPV. All carrageenans tested inhibited the entry of influenza B PPV at concentrations of 500 and 100 ⁇ g / ml.
  • the effectiveness of the inhibition obtained with these sugar compounds was between 90 and 80%.
  • the inhibition obtained with these carrageenans was lower than that obtained with the sulfated arabinogalactans.
  • Figure 30 shows the inhibitory activity of carrageenans tested on the entry of influenza A H5N1 PPVs. All carrageenans tested inhibited the entry of influenza A H5N1 PPV at concentrations of 500 and 100 ⁇ g / ml. The effectiveness of the inhibition obtained with these sugar compounds was between 90 and 80%. The inhibition obtained with these carrageenan compounds was lower than that obtained with the sulphated arabinogalactans.
  • Figure 31 shows the inhibitory activity of carrageenans tested on the entry of PPV influenza A H7N1. All carrageenans tested inhibited the entry of influenza A H7N1 PPV at concentrations of 500 and 100 ⁇ g / ml. The effectiveness of the inhibition achieved with these sugar compounds has been between 60 and 80%. The inhibition obtained with these carrageenan compounds was lower than that obtained with the sulphated arabinogalactans.
  • sulfated heteroglycans (295) and apiogalacturonans (296) are evaluated in a mouse influenza infection model.
  • mice 6-8 weeks old and free of specified pathogens (16-20 g) were provided by Charles Rivers Laboratories (France). The mice had a period of acclimatization and observation of more than 48 h (before virus inoculation) to possibly remove animals with signs of disease and / or physical abnormalities. All animal care and experimental procedures have been approved by the Animal Ethics Committee of the University of Lyon.
  • Figure 32 shows the effect of treatment with polysaccharides of sulphated arabinogalactan 294, sulphated heteroglycan 295 and apiogalacturonan 296 on the survival of H1N1 influenza A / Puerto Rico / 8/34-infected mice (25). MLD50).
  • the polysaccharides were administered orally in a single application of 20 mg / kg 4 hours after inoculation of the virus and then, 24 hours after inoculation, twice daily by application of 10 mg / kg.
  • mice were anesthetized with isoflurane and exposed by intranasal instillation to 20 ⁇ l of different dilutions in phosphate buffered saline (PBS) 1/10 of influenza A (H1N1) A virus / Puerto Rico / 8/1934.
  • PBS phosphate buffered saline
  • influenza A H1N1
  • MLD50 50% lethal dose
  • mice Three groups of 5 mice were formed for the evaluation of the activity of each of the polysaccharides: 1) Uninfected group and treated with the polysaccharide, 2) Group infected and not treated with the polysaccharide, 3) Infected group and treated with the polysaccharide.
  • mice from the infected groups were obtained after nasal administration under isoflurane anesthesia of the corresponding MLD50 viral load.
  • mice of the polysaccharide-treated and infected groups received a single 20 mg / kg nasal or oral (oral) administration and then, 24 hours after infection with the polysaccharide. virus, 10mg / kg twice daily for 3 days.
  • the untreated groups received a corresponding administration of saline (vehicle polysaccharides).
  • influenza infection causes death of animals in a few days preceded by weight loss.
  • the antiviral activity is evaluated over a period of 14 days by measuring the following parameters: weight loss, reduction of mortality and / or an increase in the survival time (mean day to death: MDD).
  • Treatment with polysaccharides of sulfated arabinogalactan 294, sulfated heteroglycan 295 and apiogalacturonan 296 reduces the mortality of animals infected with influenza H1N1 A / Puerto Rico / 8/34. While the survival percentage is 0% in the untreated infected group, the percentage survival in the infected and treated groups by sulphated arabinogalactan, sulphated heteroglycan and apiogalacturonan polysaccharides is 20%. % and 20%, respectively.
  • Treatment with polysaccharides of sulfated arabinogalactan and apiogalacturonan is also effective in preventing weight loss of infected animals and increases the MDD by 1 day.
  • the MDD of the untreated infected group is 6 days whereas MDD groups infected and treated with sulphated arabinogalactan polysaccharides and apiogalacturonan are 7 days, as shown in Figure 32. 3.
  • This technology - requiring a prior chemical functionalization of sugars before their immobilization - coupled with a Surface Plasmon Resonance (SPRi) imaging detection method, is a relevant method for studying biomolecules in real time and without labeling. between the immobilized polysaccharides and proteins in solution.
  • SPRi Surface Plasmon Resonance
  • the chosen ligand is the hemagglutinin HA envelope glycoprotein, more precisely the soluble subunit HA1, necessary for the attachment of the Influenza virus to the host cell.
  • the pyranose form of the sugar at the reducing end is in equilibrium with a minority open tautomeric form, having an aldehyde function. It is this function which reacts initially with the hydrazide of adipate dihydrazide in an acid medium. This step, limited by the ring opening rate of monosaccharides (1% open form), is decisive. During the reaction, an equilibrium towards the cyclic form of the sugar is favored, which makes it possible to recover the native form of the ose.
  • This reaction must take place in a 50% PBS / 50% DMSO v / v buffer, in order to promote the solubility of the Pyrrole-NHS, without precipitating the polysaccharide.
  • the sugars functionalized with adipate dihydrazide are taken up in PBS at 20 mg / ml. 100 ⁇ l of sugar, 60 ⁇ l of DMSO, and 40 ⁇ l of a stock solution of Pyrrole-NHS at 50 mM (in DMSO) are mixed. The reaction is carried out for 2 hours at room temperature.
  • Control conditions, with unmodified sugars are also performed.
  • the reaction volume is supplemented at 500 ⁇ with 50% PBS / 50% DMSO v / v buffer, and a dialysis step against this buffer makes it possible to eliminate the remaining Pyrrole-NHS.
  • the salts are then removed by dialysis against H 2 0.
  • the sugars are finally lyophilized, and weighed precisely. They are taken up to 20 mg / mL in water.
  • a colorimetric assay makes it possible to obtain an estimation of the coupling efficiency of the two reactions, and thus of being able to graft onto the surface the different polysaccharides of interest at the same sugar-pyrrolyl concentration.
  • This method using the TNBSA reagent (P2297-10 mL, Sigma-Aldrich), is based on the detection of primary amines and hydrazines. It allows after the first coupling reaction, to determine the proportion of sugars coupled with adipate dihydrazide, and after the second reaction, to estimate the amount of sugar-pyrrolylated, by measuring a decrease of hydrazines in the solution.
  • the detection is at 450 nm (Victor 1420 Multilabel Counter), and the quantification is estimated by means of a standard range made with different solutions of adipate dihydrazide.
  • 10 pL of sample (sugar modified or not) or reference range are added to 40 of buffer ⁇ _ 0.1M 2 C03 / NaHC0 3 pH 9.6.
  • 10 ⁇ of TNBSA reagent diluted to l / 10th in this buffer are added to each well.
  • the covalent immobilization of the "polysaccharide-pyrrole” molecules is carried out by electro-copolymerization with pyrrole monomers. This process, called electrospotting, allows the very rapid grafting of a biomolecule onto a gold surface via a polypyrrole film (Livache T, et al., Synth Met, 2001, 121 (2-3): 1443-1444). .
  • the protocol described by Mercey et al (Methods Mol Biol 2007 385: 159-75), consists in preparing reaction mixtures containing pyrrole at 20 mM and pyrololated sugars at different concentrations (5 and 50 ⁇ l) in buffer electrocopolymerization (50 mM NaH 2 PO 4 , 50 mM IMaCl, 10% (w / v) glycerol pH 6.8).
  • the construction of the chip is then performed using a robot (Genomic solutions) and a U12 acquisition card (LabJack), driven by Labview software.
  • the electrochemical system consists of a ceramic needle (X-Tend Pin, Genoptics) containing a platinum wire of 200 ⁇ , capable of taking the pyrrolylated sugar solutions contained in a 96-well plate and depositing them at a specific location on the prism.
  • a voltage pulse of 2.4 V for 100 ms between the needle (against electrode) and the gold surface (working electrode) causes the synthesis of the polypyrrole film and its deposition on the surface.
  • the prism is rinsed with water, dried and stored at 4 ° C.
  • FIG. 34 An illustration of the diagram of the arrangement of the pads on the golden surface of a prism, is given in Figure 34. To the left of Figure 34 is presented the differential image obtained in SPR, during the injection of HA ⁇ (H1N1) to 600 nM.
  • Family A Apiogalacturonans
  • Family B Sulphated Arabinogalactans
  • Family C Sulphated Heteroglycans
  • Family D Carrageenans
  • Family E Glucomannans
  • Hp 15 kDa heparin
  • PPy polypyrrole.
  • Haemagglutinin HA is a 220 kDa homotrimer, present on the surface of Influenza viruses, and responsible for their attachment to target cells via its binding to sialic acids attached to host glycoproteins and glycolipids (Skehel JJ, Wiley DC. 2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin Annu Rev Biochem 69: 531-69). Each monomer is composed of two subunits, linked together by a disulfide bridge: HA1 and HA2. HA1, which is the soluble part of the protein, contains the receptor binding site. The hemagglutinins included in these studies come from two influenza viruses extremely pathogenic avian: H5N1 and H7N1.
  • haemagglutinin HA1 of the pandemic H1N1 virus strain was included in this study. All haemagglutinins were expressed as soluble proteins merged with a 6xHis tag, allowing their purification. Proteins were produced by transient transfection in these 293T human kidney cells. Soluble proteins were purified from the supernatant of the producer cells 48 hours after transfection. The purification of the different HAI by their 6xHis tag is carried out by means of a Nickel-NTA column (Quiagen), then by a gel filtration column (Superdex 75, GE Healthcare), in order to eliminate any contaminants.
  • the purity of the protein was verified by migration on an SDS PAGE gel followed by staining of the Coomassie blue proteins, as well as by Western Blot, by revelation with an anti-His-Tag monoclonal antibody (Sigma) or an anti-human antibody. - HA ⁇ . Evaluation of the amount of protein collected is carried out using a colorimetric assay (QuantiPro BCA assay kit, Sigma-Aldrich), and the proteins are stored at 4 ° C.
  • the interactions take place within a 7.2 ⁇ L PEEK interaction cell, connected to a syringe pump, in the rinse buffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, pH 7.4) delivered at a flow rate of 70 ⁇ l / min. All the buffers used for these experiments are previously filtered and degassed. Before each interaction study, the prism is saturated with an injection of rinse buffer containing 1% BSA (w / v). After injection of the protein for 7 minutes, the surface is rinsed with rinse buffer to remove unbound molecules, and dissociate the complexes. Regeneration is performed with rinse buffer containing 1M NaCl, or 2M Guanidine-HCl, for 5 minutes.
  • the proteins are injected at increasing concentrations, ranging from 50 nM to 800 nM.
  • the image on the left represents the prism seen in SPR imaging, when injecting the HA1 protein (H1N1) at 600 nM.
  • the values of the percentage of reflectivity of each species - sugar or pyrrole, which is the negative control of our experiments - are recorded at the end of the injection of the protein.
  • results are symbolized in the form of histograms, representing the percentage of reflectivity of the sugar (deposited at 50 ⁇ ) relative to the percentage of reflectivity of the pyrrole (recorded at the end of injection), for the concentration of 800 nM protein.
  • These standardized responses are used to compare the interactions obtained for each of the polysaccharides studied. The higher the value, the greater the observed interaction.
  • Figure 35 shows the interaction curves of sulfated arabinogalactans tested with HA1 protein. All sulfated arabinogalactans tested demonstrated significant interaction with purified haemagglutinins from the three virus strains studied. It can be noted that, when the three proteins could be tested, HA1 (H5N1) is the one with the strongest interaction. The interactions observed are much stronger than those obtained between the HAI proteins and the carrageenans, patented polysaccharides for their antiviral activity.
  • Figure 36 shows the association and dissociation curves between arabinogalactan 79 and ⁇ 1 of the three influenza viruses, at different concentrations
  • Figure 37 shows the association and dissociation curves between pyrrole (negative control) and HAI from three Influenza viruses, at different concentrations.
  • Figure 38 shows the interaction curves of sulfated heteroglycans tested with HA1 protein. Sulphated heteroglycans active in biological tests also interact specifically with the purified HA1 proteins of the three virus strains studied, and these interactions are superior to the carrageenans.
  • Figure 39 shows the association and dissociation curves between sulfated heteroglycan 233 and HA1 of the three Influenza viruses at different concentrations. As illustrated with the 233 polysaccharide, the observed interactions are specific and dependent on the concentration of injected protein (control: pyrrole). iii. Interaction studies with carrageenans
  • Figure 40 shows the interaction curves of the carrageenans tested with HAI protein.
  • Carrageenan polysaccharides already described for their antiviral activity, serve as efficacy controls for the biological tests developed.
  • the polysaccharides 164, 165 and 166 from this family did not interact or very little with the purified haemagglutinins.
  • the interactions obtained are indeed weak, while the antiviral activities are similar to those of other polysaccharides. It can therefore be assumed that the antiviral effect of these polysaccharides is not caused by the binding to the HA glycoprotein of the virus envelope, but manifests itself vis-à-vis another target.
  • Figure 41 shows the association and dissociation curves between carrageenan 164 and ⁇ 1 of the three influenza viruses at different concentrations.
  • b Example of MOA during the viral cycle
  • the modalities 1 to 4 allow to highlight an activity during the early phases of the infection.
  • the modality 5 allows the study of an antiviral activity on the late phase of the infection.
  • Figures 43 and 44 show the results of inhibition of viral replication according to the five modes of infection.
  • the inhibition of replication is mainly observable in modality No. 5, both in the presence of A / Brisbane / 10/07 virus and B / Florida / 04/06 virus, showing that the molecule 152 mainly inhibits the end of the cycle. replicative of the virus.

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Abstract

La présente invention concerne des polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates pour leur utilisation en tant que médicament dans le traitement, préventif ou curatif, d'un virus influenza, ainsi que les compositions pharmaceutiques comprenant, notamment en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable : - soit un extrait de Codium fragile, comprenant des arabinogalactanes sulfatés, - soit un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes, - soit un extrait de Caulerpa raœmosa comprenant des hétéroglycanes sulfates.

Description

ARABI NOG ALACTAN ES SULFATES, APIOGALACTURONANES ET HETEROGLYCANES SULFATES POUR LE TRAITEMENT DES MALADIES CAUSEES PAR LES VIRUS INFLUENZA
La présente invention concerne le domaine technique des virus influenza. Plus précisément, l'invention concerne l'utilisation de certains polysaccharides, en tant que médicament pour le traitement, préventif ou curatif, d'un virus influenza.
La grippe est une infection respiratoire due aux virus influenza. Elle est observée partout dans le monde et réapparaît chaque année en vagues épidémiques hivernales De nos jours, c'est la deuxième cause de mortalité infectieuse après les pneumonies. Les virus influenza responsables de pathologies chez l'homme sont les virus influenza de type A et B. Alors que les virus influenza de type B circulent sous forme de lignage, les virus influenza de type A sont classés en sous types viraux en fonction des propriétés antigéniques des deux glycoprotéines majeures de surface, l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). Les virus circulants chez l'homme et responsables des épidémies saisonnières sont les virus A (H1N1) et A (H3N2).
La vaccination est, pour l'instant, le seul moyen efficace pour protéger les populations des virus influenza. Néanmoins, des solutions alternatives, sous la forme de médicaments anti-viraux font l'objet de nombreuses investigations.
Le document WO 2009/027057 décrit l'utilisation des Carraghénanes dans une composition pharmaceutique pour la prophylaxie et le traitement des maladies virales respiratoires causées par les orthomyxovirus, et en particulier par les virus influenza A et B.
La publication de M. Hosoya et al. dans Antimicrobial agents and chemotherapy, 1991, 35(12), 2515-2520 étudie l'effet de polysaccharides choisis parmi :
- le dextrane sulfate : Polymère de glucose sulfaté
- l'héparine : Polymère formé par l'enchaînement d'unité disaccharidiques composées d'un acide iduronique sulfaté et d'une galactosamine sulfatée - le pentosane polysulfate : Polymère de D-xylane sulfaté
- le mannane sulfate : polymère de mannane sulfaté.
Cependant, ce n'est pas parce que certains polysaccha rides présentent une activité vis-à-vis de certains virus, et notamment contre le virus influenza, que l'on peut envisager une même activité pour un autre polysaccharide, bien au contraire comme cela sera démontré dans les exemples avec les arabinogalactanes non sulfatés et les ulvanes.
La demande de brevet US 2010/0015248 propose une composition pour le traitement des rhumes et de l'influenza, qui comprend un mélange d'acétominophène, de diphénylhydramine, de dextrométhorphane, arabinogalactane, de vitamine C, de zinc, d'extrait d'huile d'olive, de resveratrol et d'extrait de baies de sureau. Il est précisé, dans ce document, que l'arabinogalactane, la vitamine C et le zinc sont présents pour stimuler le système immunitaire. L'extrait d'huile d'olive, le resveratrol et l'extrait de baies de sureau sont utilisés en tant qu'agents anti-viraux. L'acétominophène, la diphénylhydramine et le dextrométhorphane, quant à eux, sont utilisés pour soulager les symptômes influenza.
Le document WO 98/11778 décrit des compositions médicamenteuses pour le traitement de différentes maladies virales comprenant un inhibiteur de l'infection microbienne à l'origine de la maladie à traiter, sous la forme d'un isolât de différentes plantes. Le virus influenza est cité parmi une liste de différentes infections virales, mais l'invention est plutôt dirigée sur le traitement du virus de l'herpès auquel se rapportent tous les exemples et résultats.
Dans ce contexte, la présente invention repose sur la mise en évidence par les inventeurs, et ceux de façon totalement inattendue, que certains polysaccharides particuliers présentaient une activité anti-virale contre les virus influenza. L'invention a donc pour objet des polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates pour leur utilisation en tant que médicament dans le traitement préventif ou curatif d'une maladie causée par un virus influenza. Le terme « traitement » désigne toute mesure thérapeutique prophylactique ou suppressive d'une maladie due à un virus influenza conduisant à un effet clinique souhaitable ou à tout effet bénéfique, incluant notamment la suppression ou la diminution d'un ou plusieurs symptômes, la régression, le ralentissement ou la cessation de la progression de la maladie qui y est associée. Les maladies causées par un virus influenza sont généralement appelées grippes.
En particulier, l'invention concerne des polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates pour leur utilisation en tant qu'agent anti-viral contre le virus influenza dans un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'un virus influenza. En d'autres termes, la présente invention concerne l'utilisation d'un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement, préventif ou curatif, d'un virus influenza. Au sein du médicament, le polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates joue le rôle d'ingrédient actif, c'est-à-dire qu'il est utilisé pour son activité anti-virale contre les virus influenza. Selon un mode de réalisation particulier, dans le médicament ou la composition pharmaceutique contenant au moins un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates, l'activité anti-virale contre les virus influenza est assurée au moins à 70%, de préférence au moins à 90%, et préférentieliement au moins à 95% par les arabinogalactanes sulfatés, apiogalacturonanes ou hétéroglycanes sulfates présents. Selon un mode de réalisation particulier, ledit médicament ou composition pharmaceutique contenant au moins un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates ne contient pas d'autre composé, que le ou les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates, présentant une activité anti-virale significative. Par contre, il est possible d'utiliser dans une même composition une combinaison de polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates. Par composé présentant une activité anti-virale significative, on entend un composé qui entraine une inhibition significative de la réplication du virus cible. Par exemple, une inhibition d'au moins 25%, de préférence d'au moins 50%, et préférentiellement d'au moins 80% à une concentration de 250 g/mL, dans un test d'inhibition de la réplication du virus influenza cible, tels que ceux notamment décrits au paragraphe 1 des exemples ci- après. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont mis en évidence que des polysaccharides appartenant à la famille des arabinogalactanes sulfatés, des apiogalacturonanes ou des hétéroglycanes sulfates avaient une influence sur le cycle de réplication des virus influenza et permettaient d'inhiber l'infection de cellules sensibles à l'infection. Il a également été démontré que ces sucres permettaient d'inhiber l'entrée des virus influenza, à l'intérieur de pseudoparticules virales (PPV). L'activité inhibitrice des polysaccharides appartenant à la famille des arabinogalactanes sulfatés, des apiogalacturonanes ou des hétéroglycanes sulfates s'est montré équivalente, voire supérieure aux Carraghénanes déjà décrits dans la littérature pour ce type d'activité. Par contre, d'autres polysaccharides de la famille des ulvanes se sont montrés inactifs, mettant en évidence les propriétés spécifiques des polysaccharides sélectionnés dans le cadre de l'invention. Les inventeurs ont également démontré que contrairement aux arabinogalactanes sulfatés, les arabinogalactanes non sulfatés, tels que ceux extraits de l'écorce de mélèze (notamment étudiés dans WO 2010/117296, Alternative Médecine Reviews, 2002, vol.7, n°2, 138-149, J. Med. Food, 2005, 8(4), 446-453 et WO 2011/138898) ne présentaient pas d'activité, comme cela apparaîtra dans les exemples qui vont suivre.
Les arabinogalactanes sulfatés sont des polysaccharides sulfatés solubles dans l'eau composés d'unités Galactose liées entre elles par des liaisons glycosidiques Beta 1-3. Cette chaîne principale peut présenter des branchements de motifs Arabinose ou Galactose par des liaisons glycosidiques Alpha 1-6. Ces motifs peuvent présenter plusieurs motifs Arabinose et/ou Galactose liés entre eux par des liaisons glycosidiques 1-3 ou 1-6. Les Arabinoses ou Galactoses peuvent présenter des sulfatations sur des groupements alcools secondaires. Le rapport arabinose/galactose appartient, de préférence, à la gamme allant de 3/7 à 2/1, et correspond, par exemple à 1/1, 1/2 ou 2/1.
Dans le cadre de l'invention, seront de préférence utilisés des arabinogalactanes sulfatés présentant une taille appartenant à la gamme allant de 1 000 à 2. 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 3 000 à 1,1 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 50%, de préférence de 5 à 40 % des groupements sulfates.
Les apiogalacturonanes sont des polysaccharides qui peuvent être sulfatés, solubles dans l'eau formés par une chaîne linéaire d'unités Acide Galacturonique liées entre elles par des liaisons glycosidiques alpha 1-4. Cette chaîne principale peut présenter des motifs Apiose liés par des liaisons glycosidiques Beta 1-2. Ces motifs peuvent présenter plusieurs motifs Apiose liés entre eux par des liaisons glycosidiques Beta 1-5.
Dans le cadre de l'invention, seront de préférence utilisés des apiogalacturonanes présentant une taille appartenant à la gamme allant de 10 000 à 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 50 000 à 700 000 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 20%, de préférence de 4 à 12 % des groupements sulfates.
Les hétéroglycanes sulfatés utilisés dans le cadre de l'invention sont des polysaccharides solubles dans l'eau formés par une chaîne linéaire d'unités Galactose liées en alpha 1-3 et terminal, d'unités xylose liées en 1-4 et d'unités arabinose liées en 1-4. Les unités Galactose peuvent présenter des sulfatations en C6 et les unités arabinose des sulfatations en C3.
Dans le cadre de l'invention, seront de préférence utilisés des hétéroglycanes sulfatés présentant une taille appartenant à la gamme allant de 500 000 à 5.106 g/mol et, par exemple d'environ, 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 5 à 30%, de préférence de 13 à 22 % des groupements sulfates.
Les arabinogalactanes sulfatés, apiogalacturonanes et hétéroglycanes sulfates utilisés dans le cadre de l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou seront, de préférence, extraits d'une source naturelle telles que des algues ou des plantes. En particulier, ils peuvent correspondre :
- à un extrait de Codium fragile, Codium vermilara ou Codium qflindricum comprenant des arabinogalactanes sulfatés,
- à un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes,
- à un extrait de Cauierpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates.
Toute méthode d'extraction bien connue de l'homme du métier pourra être utilisée. En particulier, les méthodes d'extraction des sucres complexes par des solvants aqueux ou organiques, suivis ou non de purification par précipitation sélective, interactions ioniques, filtration, etc.. pourront être mises en œuvre. A titre d'exemple, on pourra utiliser une extraction comprenant une étape d'extraction à l'eau et une étape de précipitation avec un alcool tel que l'éthanol.
Il est, par exemple, possible d'utiliser les méthodes d'extraction à partir de Codium fragile, en milieu aqueux à température ambiante pour préserver les arabinogalactanes sulfatés. Notamment, les méthodes détaillées dans les exemples ci-après, ou des méthodes analogues, pourront être utilisées.
Les polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates, et en particulier ceux précédemment décrits, peuvent être utilisés pour le traitement, curatif ou préventif, de tout type de virus influenza. Par « virus influenza », on entend désigner tous les virus influenza, et notamment les virus influenza humains, aviaires, équins, porcins et félins. Lesdits virus influenza peuvent être sélectionnés parmi les types A, B et C. En particulier, le virus influenza peut être de type A et notamment correspondre aux souches de sous-type H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H5IM2, H7N1, H7N7 et H9N2. Selon un mode de réalisation particulier, le virus influenza est choisi parmi les virus de type B, A-H5N1, A-H7N1 et A-H3N2. La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques administrables aux animaux et, en particulier à l'homme, comprenant, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable selon notamment la Pharmacopée Européenne 7ème édition, :
- soit un extrait de Codium fragile, Codium vermilara ou Codium cy/indricum comprenant des arabinogalactanes sulfatés,
- soit un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes,
- soit un extrait de Caulerpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates.
Les excipients présents dans les médicaments et compositions pharmaceutiques selon l'invention sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intra- veineuse, intracartilage, topique, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale ou intraoculaire, les polyssacharides peuvent être administrés sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour la prophylaxie ou le traitement des maladies ci-dessus. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale, telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intranasale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire, intracartilage ou intraveineuse et les formes d'administration rectale. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des crèmes, pommades ou lotions.
Le médicament ou composition contient, en général, une quantité thérapeutiquement efficace de polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates. Par « quantité thérapeutiquement efficace », on désigne toute quantité d'une composition qui améliore un ou plusieurs des paramètres caractéristiques de l'affection traitée. Afin d'obtenir l'effet souhaité, la dose de polysaccharide varie, par exemple, entre 0,001 et 100 mg par kg de poids du corps et par jour. Néanmoins, dans le cadre de l'invention, les compositions pharmaceutiques incluent également les compositions homéopathiques.
Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique, tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique, ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif.
On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures.
Les compositions pharmaceutiques contenant un polysaccharide conformément à l'invention, peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple, des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops, et notamment sous une forme adaptée pour administration orale ou intranasale, par exemple. Les supports liquides appropriés peuvent être, par exemple, l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau.
Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir ou pour l'administration sous forme de gouttes peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, acalorique de préférence, du méthylparabène et du propylparabène comme antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, comme la polyvinylpyrrolidone, de même qu'avec des édulcorants ou des correcteurs de goût. Il est possible que les médicaments ou compositions comprenant au moins un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates soient à usage humain ou vétérinaire. Notamment, dans le cas du traitement des poulets, le polysaccharide pourra se trouver dans un additif alimentaire.
D'une façon générale, les mêmes variantes s'appliquent mutatis mutandis aux médicaments, compositions et utilisations mettant en œuvre les polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates.
Selon un mode de réalisation particulier, les médicaments et compositions antivirales contre le virus influenza, selon l'invention ne contiennent pas d'huile d'olive, ni de resveratrol, ni d'extrait de baie de sureau, en particulier lorsqu'ils ou elles contiennent un arabinogalatane tel que précédemment défini.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne également une méthode de traitement de l'homme ou l'animal, et notamment des poulets, comprenant l'administration l'utilisation d'un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates pour lutter, à titre préventif ou curatif, contre une maladie causée par un virus influenza.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne également l'utilisation d'un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates dans une composition alimentaire dans laquelle ledit polysaccharide est utilisé pour lutter à titre préventif ou curatif, contre une maladie causée par un virus influenza.
Selon un mode de réalisation particulier, la composition alimentaire comprend :
- soit un extrait de Codium fragile, Codium vermilara ou Codium cylindricum comprenant des arabinogalactanes sulfatés,
- soit un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes, - soit un extrait de Caulerpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates.
Selon un autre mode de réalisation particulier pouvant être combiné au précédent, la composition alimentaire ne contient pas d'huile d'olive, ni de resveratrol, ni d'extrait de baie de sureau.
Toutes les variantes de réalisation, en ce qui concerne notamment les définitions précédemment décrites en relation avec les médicaments et les compositions pharmaceutiques des sucres, des extraits et méthodes d'extraction pour les obtenir et des virus influenza ciblés s'appliquent mutatis mutandis aux compositions alimentaires et aux méthodes de traitement. Par composition alimentaire, on entend par exemple tout type d'alicament, de produits alimentaires sous la forme de yaourt ou breuvage lacté notamment, destinés à l'homme ou à l'animal.
Les exemples ci-après, en référence aux Figures annexées, permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif.
1. Procédés de production et caractérïsation phvsico- chimiaue des polvsaccharides testés Arabinogalactanes sulfatés extraits de Codium Fragile
L'obtention des extraits de Codium Fragile présentés dans l'invention consiste, dans une première étape, en la dépigmentation des algues broyées par un solvant organique, notamment l'éthanol. Le résidu dépigmenté est ensuite extrait, à température ambiante, en milieu aqueux pendant quelques heures à 24h. L'extrait ainsi obtenu peut être amélioré en utilisant des procédés de purification des polysaccharides, comme la précipitation sélective avec des solvants organiques comme l'éthanol et/ou par interaction ionique, et/ou la dialyse par ultrafiltration. L'extrait ainsi obtenu présente majoritairement la structure décrite de l'arabinogalactane sulfaté (Marina Ciancia et al. 2007 - International Journal of Biological Macromolecules 41 (2007) 641-649), à savoir une chaîne linéaire de Galactoses liés entre eux par des liaisons glycosidiques Beta 1-3. Cette chaîne principale peut présenter des branchements de motifs Arabinoses ou Galactoses par des liaisons glycosidiques Alpha 1-6. Ces motifs peuvent présenter plusieurs Arabinose et/ou Galactoses liés entre eux par des liaisons glycosidiques 1-3 ou 1-6. Les Arabinoses ou Galactoses peuvent présenter des sulfatations sur des groupements alcools secondaires.
La composition en monosaccharides des extraits obtenus dans le cadre de cette invention est confirmée par des dosages de monosaccharides par la technique de chromatographie HPAEC PAD suite à une hydrolyse acide totale. Les extraits présentent de l'Arabinose et du Galactose (3/7 à 1/1). Les signaux caractéristiques des liaisons glycosidiques de l'arabinogalactane sont mis en évidence par de la Résonnance Magnétique Nucléaire du Proton. Des dosages des groupements sulfates par méthode du Chlorure de Baryum permettent d'apprécier le taux de sulfatation des extraits entre 18 et 30% en masse. La chromatographie d'exclusion stérique (Size exclusion Chromatography - SEC) des polymères permet d'estimer la masse moléculaire moyenne des polysaccharides d'arabinogalactanes sulfatés présents dans les extraits. Celle-ci, en fonction des échantillons appartient à la gamme allant d'environ 3 000 à environ l,l.l0¾/mol.
Processus d'obtention des extraits Codium Fragile :
Les différents procédés permettant d'obtenir les différents échantillons testés sont présentés schématiquement Figure 1.
L'algue peut être dépigmentée. 50 g de Codium Fragile en Poudre peuvent être dépigmentés par 4 lavages successifs avec un solvant organique comme l'éthanol. Chaque lavage consiste à mettre en suspension les 50 g de poudre d'algue dans un litre d'éthanol pur et d'agiter 2h à 400 rpm avec une température de 20°C. Après chaque lavage, le résidu d'extraction est isolé par filtration sur papier Whatman. Cette opération est renouvelée trois fois. Suite à ces étapes de dépigmentation, le résidu d'extraction est séché une nuit à l'étuve 40°C.
Le résidu de dépigmentation peut être extrait en milieu aqueux. Le résidu correspondant aux 50 g de Codium Fragile dépigmentés est remis en suspension dans IL d'eau déionisée, agité pendant 16 h à 600 rpm et à température ambiante. Après 16h, l'extrait soluble est isolé par centrifugation (7000 rpm 4°C 40 minutes environ). Cet extrait aqueux est appelé extrait aqueux A.
L'échantillon extrait n°98 est obtenu par dessalage de l'extrait aqueux A par ultrafiltration tangentieile sur membrane de 10 kDa. Le dessalage est obtenu après diafiltration avec le passage de 6 volumes d'eau déionisée, soit 6L. Le rétentat d'ultrafiltration correspond à l'échantillon n°98.
L'échantillon extrait n°79 est obtenu par une nouvelle étape de raffinage de l'échantillon n°98 par ultrafiltration tangentieile sur membrane de 0,2 μηι. Cette ultrafiltration est réalisée à une concentration de 10 g/L avec une diafiltration en eau déionisée de 10 volumes. La fraction retenue correspond à l'échantillon extrait n°79.
L'extrait aqueux A peut aussi être traité par ultrafiltration tangentieile sur membrane de 0,2 μιτι. Cette ultrafiltration est réalisée à une concentration de 10 g/L avec une diafiltration en eau déionisée de 10 volumes. La fraction retenue correspond à l'échantillon extrait n°141.
L'algue peut être directement extraite avec un solvant aqueux. 50 g de Codium Fragile en Poudre sont mis en solution dans 1 L d'eau déionisée avec une agitation de 400 rpm, à température ambiante une nuit. L'extrait soluble est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 60 minutes). Cet extrait aqueux est appelé extrait aqueux B.
Les échantillons extraits n°109 et 238 sont obtenus par précipitation par un solvant organique, comme l'éthanol. Pour cela, l'extrait aqueux B est précipité avec 50% v/v d'éthanol pur. Le précipité est isolé par centrifugation (5000 rpm, 4°C, 10 minutes).
L'échantillon extrait n°294 est obtenu par une nouvelle étape de raffinage de l'échantillon n°109 ou 238 par interactions ioniques. Cette étape de purification par interactions ioniques est réalisée sur un support échangeur d'anions, notamment des microbiiles polysaccharidiques formées de chitosan réticulé. Dans un premier temps, l'échantillon n°109 ou 238 est mis en solution préférentiellement à un pH de 4-5 par acidification, notamment avec de l'acide chlorhydrique. L'échantillon est alors mis en contact avec le support échangeur d'ions, puis rincé avec de l'eau déionisée, préférentiellement acidifiée, notamment avec de l'acide chlorhydrique pour atteindre un pH de 4-5. Dans un second temps, le sucre d'intérêt est libéré du support avec un tampon basique, notamment un tampon bicarbonate / carbonate, préférentiellement ajusté à pH environ 10. La fraction soluble est isolée, préférentiellement par filtration. Cette fraction est ensuite dessalée, notamment par précipitation par un solvant organique, tel que l'éthanol. Pour cela, la fraction est concentrée, préférentiellement jusqu'à une concentration de 1 à 10 g/L en polysaccharides, puis précipitée avec 50% v/v d'éthanol pur. Le précipité est isolé par centrifugation (5000 rpm, 4°C, 10 minutes) puis séché à l'étuve. La fraction ainsi obtenue est l'échantillon n°294.
L'échantillon extrait n°242 est obtenu par une nouvelle étape de raffinage de l'échantillon n°109 ou 238 par ultrafiitration tangentielle sur membrane de 0,2 pm. Cette ultrafiitration est réalisée à une concentration de 10 g/L avec une diafiltration en eau déionisée de 10 volumes. La fraction retenue correspond à l'échantillon extrait n°242.
L'échantillon extraits n°152 est obtenu par hydrolyse acide, notamment avec de l'acide chlorydrique des échantillons extraits n°109 ou 238 suivie d'une sélection de la masse moléculaire sur deux membranes d'ultrafiltration 3 et 10 kDa. La sélection de masse est réalisée par une première ultrafiitration tangentielle sur membrane de 10 kDa réalisée à 10 g/L avec une diafiltration de 10 volumes avec de l'eau déionisée. Le permeat est ensuite passé par ultrafiitration tangentielle sur une membrane de 3 kDa, avec une première phase de concentration d'un facteur 10, puis une diafiltration de 10 volumes avec de l'eau déionisée. Le rétentat de cette deuxième ultrafiitration tangentielle sur membrane de 3 kDa constitue l'échantillon extrait n°152. Les échantillons extraits n°237 et 239 sont obtenus par traitement à la bentonite de l'extrait aqueux B suivi d'une précipitation à l'éthanol. L'extrait aqueux B issu de l'extraction de 50 g de Codium Fragile dans 1 L d'eau est traité par l'ajout de 10g de bentonite préalablement remis en suspension dans 100 ml d'eau déionisée. La solution est agitée, puis laissée au repos 1 h environ à température ambiante. La phase soluble est isolée par centrifugation (8000 rpm 4°C 15 minutes). La phase soluble isolée est précipitée par un solvant organique, notamment avec de l'éthanol à 50% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation (5000 rpm, 4°C, 10 minutes) et constitue les échantillons extraits n°237 et 239.
L'échantillon extrait n°240 est obtenu par une nouvelle étape de raffinage de l'échantillon n°237 ou 239 par ultrafiltration tangentielle sur membrane de 0,2 pm. Cette ultrafiltration est réalisée à une concentration de 10 g/L avec une diafiltration en eau déionisée de 10 volumes. La fraction retenue correspond à l'échantillon extrait n°240.
Caractérisation des extraits de Codium Fragile :
Les extraits obtenus présentent majoritairement la structure décrite de l'arabinogalactane sulfaté (Marina Ciancia et al. 2007 - International Journal of Biological Macromolecules 41 (2007) 641-649), à savoir une chaîne linéaire de Galactoses liés entre eux par des liaisons glycosidiques Beta 1-3. Cette chaîne principale peut présenter des branchements de motifs Arabinose ou Galactose par des liaisons glycosidiques Alpha 1-6. Ces motifs peuvent présenter plusieurs motifs Arabinose et/ou Galactose liés entre eux par des liaisons glycosidiques 1-3 ou 1-6. Les Arabinoses ou Galactoses peuvent présenter des sulfatations sur des groupements alcools secondaires.
Différentes méthodologies de caractérisation des sucres complexes ont pu être mises en œuvre pour confirmer la présence de l'arabinogalactane sulfaté dans les extraits utilisés pour cette invention :
-Dosage colorimétrique des sucres réducteurs suivant la méthode au DNS après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N.
-Dosage colorimétrique des protéines suivant la méthode de Lowry-Folin. -Dosage tubidimétrique des sulfates suivant la méthode du Chlorure de Baryum.
-Profil des monosaccharides suivant la méthode HPAEC-PAD après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA.
-Spectre de Résonnance Magnétique Nucléaire du proton.
-Estimation de la plage de masse moléculaire par SEC des polymères. Dosages Colorimétriques
Figure imgf000016_0001
(1) Sucres totaux exprimés en % p/p eq Gai
(2) Protéines exprimées en % p/p eq BSA
(3) Suifates exprimés en % SO3 P/P Profil des Monosaccharides
Figure imgf000017_0001
Masse Moléculaire des polysaccharides
Echantillon
Estimation par SEC Extrait
98 900 000 g/mol
109 600 000 g/mol
141 400 000 g/mol
152 3 000 à 10 000 g/moi
237 50 000 g/mol
238 700 000 g/mol
239 1 100 000 g/mol
240 950 000 g/mol
242 1 100 000 g/mol RMN du proton
Les signaux observés correspondent aux signaux caractéristiques des structures décrites des arabinogalactanes sulfatés. Apioaalacturonane de Zostera marina :
L'obtention des extraits de Zostera marina présentés dans l'invention consiste dans une première étape en la dépigmentation de la plante par un solvant organique, notamment l'éthanol. Le résidu dépigmenté est ensuite extrait à chaud en milieu aqueux pendant quelques heures à 24h. Le résidu d'extraction subit une seconde extraction en milieu acide, notamment en milieu TFA. Le polysaccharide d'extraction est obtenu par précipitation suivant le pH du filtrat obtenu précédemment. Ce polysaccharide peut être amélioré en utilisant des procédés de purification des polysaccharides comme la précipitation sélective avec des solvants organiques comme l'éthanol, et/ou la dialyse par ultrafiltration.
L'extrait ainsi obtenu présente majoritairement la structure décrite de l'apiogalacturonane (Véronique BRUDIEUX- 2007 Thèse de doctorat - Université de Limoges - Extraction, modification enzymatique et caractérisation chimique de nouvelles structures pectiques. Application de la relation structure / activité à la dermocosmétique.), à savoir une chaîne linéaire d'Acides Galacturoniques liés entre eux par des liaisons glycosidiques alpha 1-4. Cette chaîne principale peut présenter en ramification des motifs Apiose liés par des liaisons glycosidiques Beta 1-2. Ces motifs peuvent présenter plusieurs Apioses liés entre eux par des liaisons glycosidiques Beta 1-5.
La composition en monosaccharides des extraits obtenus dans le cadre de cette invention est confirmée par des dosages de monosaccharides par la technique de chromatographie HPAEC PAD suite à une hydrolyse acide totale et par la technique de chromatographie en phase gazeuse après dérivation des monosaccharides par acétylation. Les extraits présentent de l'Acide Galacturonique et de l'Apiose. Les signaux caractéristiques des liaisons glycosidiques de l'apiogalacturonane sont mis en évidence par de la Résonnance Magnétique Nucléaire du Proton, notamment la chaîne d'Acide Galacturonique en alpha 1-4 après hydrolyse acide partielle des Apioses. Des dosages des groupements sulfates par méthode du Chlorure de Baryum permettent d'évaluer ie taux de sulfatation des extraits entre 4 et 12 % en masse. La SEC des polymères permet d'estimer la masse moléculaire moyenne des polysaccha rides d'arabinogalactanes sulfatés présents dans les extraits qui varie de 50 000 à 700 000 g/mol.
Processus d'obtention des extraits de Zostera marina
Les différents procédés permettant d'obtenir les différents échantillons testés sont présentés schématiquement Figure 2.
Le premier procédé permet d'obtenir l'échantillon extrait n°138. La plante marine, Zostera marina en poudre est lavée à l'eau. 40 g de poudre de Zostera marina sont mis en solution dans 1 L d'eau déionisée, 5 heures environ à 95°C sous agitation de 500 rpm. Le résidu du lavage est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 20 minutes).
Le culot obtenu est alors extrait en milieu acide, par exemple avec du TFA. Le résidu du lavage est remis en solution dans IL de TFA 0,5 N, agité à 500 rpm pendant 2 heures environ à 25°C. La fraction soluble est isolée par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minutes). La fraction soluble ainsi isolée est neutralisée à pH 7,5, un précipité apparaît. Le précipité est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minutes). Ce précipité est remis en solution avec IL d'eau déionisée. Cette solution est ensuite précipitée avec de l'éthanol préalablement placé à -20°C, jusqu'à 60% v/v final. Le précipité formé est isolé par centrifugation (7000 rpm, 4°C, 10 minutes). Le précipité est remis en solution à raison de 10 g/L pour être dessalé par ultrafiltration tangentielle sur membrane de 650 Da. Une diafiltration de 10 volumes est réalisée avec de l'eau déionisée. Le rétentat obtenu est lyophilisé pour donner l'échantillon extrait n°138.
Le culot obtenu lors de la première extraction à l'eau chaude peut également être extrait en milieu acide avec de l'acide chlorhydrique. Le résidu du lavage est remis en solution dans IL de HCI 0,5 N, agité à 500 rpm pendant 2 heures environ à 25°C. La fraction soluble est isolée par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minutes). La fraction soluble ainsi isolée est neutralisée à pH 7,5, un précipité apparaît. Le précipité est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minutes). Ce précipité est remis en solution avec IL d'eau déionisée. Cette solution est ensuite précipitée avec de l'éthanol préalablement placé à -20°C, jusqu'à 60% v/v final. Le précipité formé est isolé par centrifugation (7000 rpm, 4°C, 10 minutes). Le précipité séché à l'étuve donne l'échantillon extrait n°296.
Le second procédé concerne une extraction de Zostera marina avec de l'oxalate après une dépigmentation avec un solvant organique tel que l'éthanol. 50 g de Zostera marina en poudre sont mis en suspension dans IL d'éthanol pur. Le mélange est porté à 78°C sous agitation de 500 rpm pendant 5 heures environ. Le résidu de dépigmentation est isolé par filtration sur filtre Bûchner de 20-25 pm et séché à l'étuve 40°C une nuit. La plante marine dépigmentée est alors remise en solution dans IL d'oxalate d'ammonium 1% sous agitation de 750 rpm à 70°C pendant 2 heures environ. L'extrait soluble est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minute). La fraction extraite peut être dessalée par ultrafiltration tangentielle sur membranes de 10 kDa. Une diafiltration de 10 volumes environ est réalisée avec de l'eau déionisée. Le rétentat est lyophilisé pour donner l'échantillon extrait n°158.
Le troisième procédé concerne une extraction de Zostera marina avec du carbonate de sodium à 3% après une dépigmentation avec un solvant organique tel que l'éthanol. 50 g de Zostera marina en poudre sont mis en suspension dans IL d'éthanol pur. Le mélange est porté à 78°C sous agitation de 500 rpm pendant 5 heures environ. Le résidu de dépigmentation est isolé par filtration sur filtre Bûchner de 20-25 pm et séché à l'étuve à 40°C une nuit. La plante marine dépigmentée est alors remise en solution dans IL de carbonate de sodium à 3% sous agitation de 500 rpm à 70°C pendant 2 heures environ. L'extrait soluble est isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minutes), puis neutralisé avec de l'acide chlorhydrique. Le produit ainsi isolé est précipité avec de l'éthanol préalablement placé à - 20°C, jusqu'à 50% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation (6000 rpm, 4°C, 5 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve 40°C une nuit environ. Le précipité séché peut ensuite être dessalé par ultrafiltration tangentielle sur membranes de 10 kDa. Une diafiltration de 10 volumes environ est réalisée avec de l'eau déionisée. Le rétentat est lyophilisé pour donner l'échantillon extrait n°160. Le rétentat peut aussi être précipité par un solvant organique tel que l'éthanol préalablement placé à - 20°C, jusqu'à 50% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation 6000 rpm 4°C 5 minutes environ. Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve 40°C une nuit environ. Le précipité séché constitue l'échantillon extrait n°161. Caractérisation des extraits de Zostera marina :
Les extraits ainsi obtenus présentent majoritairement la structure décrite de l'apiogalacturonane (Véronique BRUDIEUX- 2007 Thèse de doctorat - Université de Limoges - Extraction, modification enzymatique et caractérisation chimique de nouvelles structures pectiques. Application de la relation structure / activité à la dermocosmétique), à savoir une chaîne linéaire d'acides galacturoniques liés entre eux par des liaisons glycosidiques alpha 1-4. Cette chaîne principale peut présenter des motifs d'apiose liés par des liaisons glycosidiques Beta 1-2. Ces motifs peuvent présenter plusieurs Apioses liés entre eux par des liaisons glycosidiques Beta 1-5.
Différentes méthodologies de caractérisation des sucres complexes ont pu être mises en œuvre pour confirmer la présence de l'apiogalacturonane dans les extraits utilisés pour cette invention :
-Dosage colorimétrique des sucres réducteurs suivant la méthode au DNS après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N ou H2S0 2N.
-Dosage colorimétrique des protéines suivant la méthode de Lowry-Folin. -Dosage par turbidimetrie des sulfates suivant la méthode au Chlorure de Baryum.
-Profil des monosaccharides suivant la méthode HPAEC-PAD après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N ou H2S04 2N. -Identification du monosaccharide apiose par la technique de chromatographie en phase gazeuse après dérivation des monosaccharides par acétylation.
-Spectre de Résonnance Magnétique Nucléaire du proton.
-Estimation de la plage de masse moléculaire par SEC des polymères.
Dosages Colorimétriques
Figure imgf000022_0001
(4) Sucres totaux exprimés en % p/p eq Gai
(5) Protéines exprimées en % p/p eq BSA
(6) Sulfates exprimés en % SOj p/p
Profil des Monosaccharides
Monosaccharides
Echantillon
Fuc Gai Glc Man Apiose Ac Ac Ac Ac Extrait
Gai Gui Glc Man
158 3 2 0 1 3 5 14 3 33
160 3 1 1 1 3 3 12 3 28
161 2 1 0 0 3 4 18 2 37
138 0 1 0 0 18 18 0 1 0
294 2 1 1 0 29 62 0 1 0 Masse Moléculaire des polysaccharides
Figure imgf000023_0001
RMN du proton
Les spectres RMN du proton des échantillons n°158, 160 et 161 laissent apparaître la structure caractéristique de l'apiogalacturonane avec la présence des deux monosaccharides apiose et acide galacturonique en quantités équivalentes. La présence d'acide mannuronique et d'acides guluronique suggère la présence d'alginates.
Pour l'échantillon extrait n°138, les spectres RMN du proton mettent en évidence les signaux caractéristiques de l'apiose. Après hydrolyse partielle au TFA, les spectres de RMN du proton mettent en évidence les signaux caractéristiques de la chaîne principale d'acides galacturoniques liés en alpha 1-4. Cet extrait présente le polysaccharide d'apiogalacturonane. Hétéroglvcane sulfaté extrait de Caulerpa racemosa :
L'obtention des extraits de Caulerpa racemosa présentés dans l'invention consiste dans une première étape en la dépigmentation des algues broyées par un solvant organique, notamment l'éthanol. Le résidu dépigmenté est ensuite extrait à chaud en milieu aqueux pendant quelques heures à 24h. L'extrait ainsi obtenu peut être amélioré en utilisant des procédés de purification des polysaccharides comme la précipitation sélective avec des solvants organiques comme l'éthanol et/ou par interaction ionique, et/ou la dialyse par ultrafiltration.
L'extrait ainsi obtenu présente majoritairement la structure décrite de l'Hétéroglycane sulfaté (CHATTOPADHYAY Kausik et al. 2006 - Carbohydrate polymers 2007, vol. 68, no3, pp. 407-415), à savoir des Galactoses liés en alpha 1-3 et terminal, des xyloses liés en 1-4 et des arabinoses en 1-4. Les Galactoses peuvent présenter des sulfatations en C6 et les arabinoses des sulfatations en C3.
La composition en monosaccharides des extraits obtenus dans le cadre de cette invention est confirmée par des dosages de monosaccharides par la technique de chromatographie HPAEC PAD suite à une hydrolyse acide totale. Les extraits présentent de l'Arabinose, du Galactose et du Xylose (10/10/0,5 à 13/13/1). Les signaux caractéristiques des liaisons glycosidiques de xyloarabinogalactane sont mis en évidence par de la Résonnance Magnétique Nucléaire du Proton. Des dosages des groupements sulfates par méthode du Chlorure de Baryum permettent d'évaluer le taux de sulfatation des extraits entre 22 et 13 % en masse. La SEC des polymères permet d'estimer la masse moléculaire moyenne des polysaccharides d'arabinogalactanes sulfatés présents dans les extraits à environ 106 g/mol.
Processus d'obtention des extraits de Caulerpa racemosa
Les différents procédés permettant d'obtenir les différents échantillons testés sont présentés schématiquement Figure 3.
Une extraction en phase aqueuse est faite sur l'algue en poudre. 70 g de Caulerpa Racemosa en poudre sont mis en suspension dans IL d'eau déionisée, agités une nuit, sous agitation à 650 rpm et à 80°C. L'extrait soluble est ensuite isolé par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 30 minutes). Cet extrait est appelé Y extrait aqueux.
Les échantillons extraits n°162 et 234 sont obtenus par précipitation à froid de l'extrait aqueux par un solvant organique, comme l'éthanol. Pour cela l'extrait aqueux est précipité avec 50% v/v d'éthanol pur préalablement mis à -20°C. Le précipité est isolé par centrifugation (4000 rpm, 4°C, 10 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve à 40°C une nuit.
L'échantillon extrait n°295 est obtenu par une nouvelle étape de raffinage de l'échantillon n°162 ou 234 par interactions ioniques. Cette étape de purification par interactions ioniques est réalisée sur un support échangeur d'anions, notamment des microbilles polysaccharidiques formées de chitosan réticulé. Dans un premier temps, l'échantillon n°162 ou 234 est mis en solution préférentiellement à un pH de 4-5 par acidification, notamment avec de l'acide chlorhydrique. L'échantillon est alors mis en contact avec le support échangeur d'ions, puis rincé avec de l'eau déionisée, préférentiellement acidifiée, notamment avec de l'acide chlorhydrique pour atteindre un pH de 4-5. Dans un second temps, le sucre d'intérêt est libéré du support avec un tampon basique, notamment un tampon bicarbonate / carbonate, préférentiellement ajusté à pH environ 10. La fraction soluble est isolée, préférentiellement par filtration. Cette fraction est ensuite dessalée, notamment par précipitation par un solvant organique, tel que l'éthanol. Pour cela, la fraction est concentrée, préférentiellement jusqu'à une concentration de 1 à 10 g/L en polysaccharides, puis précipitée avec 50% v/v d'éthanol pur. Le précipité est isolé par centrifugation (5000 rpm, 4°C, 10 minutes) puis séché à l'étuve. La fraction ainsi obtenue est l'échantillon n°295.
L'extrait aqueux peut aussi être traité à la bentonite pour améliorer sa purification, puis précipité avec un solvant organique, notamment l'éthanol. L'extrait aqueux issu de l'extraction de 70 g de Caulerpa racemosa dans 1 L d'eau est traité par l'ajout de 6,5 g de bentonite préalablement remis en suspension dans 65 ml d'eau déionisée. La solution est agitée, puis laissée au repos 1 h environ à température ambiante. La phase soluble est isolée par centrifugation (8000 rpm, 4°C, 15 minutes). Le produit ainsi isolé est précipité avec de l'éthanol préalablement placé à -20°C, jusqu'à 50% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation (5000 rpm, 4°C, 10 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve à 40°C une nuit. Le résidu de précipitation constitue l'échantillon extrait n°233. Caractérisation des extraits de Caulerpa racemosa :
Les extraits ainsi obtenus présentent majoritairement la structure décrite de l'Hétéroglycane sulfaté (CHATTOPADHYAY Kausik et al. 2006 - Carbohydrate polymers 2007, vol. 68, no3, pp. 407-415), à savoir des Galactoses liés en alpha 1-3 et terminal, des xyloses liés en 1-4 et des arabinoses en 1-4. Les Galactoses peuvent présenter des sulfatations en C6 et les arabinoses des sulfatations en C3.
Différentes méthodologies de caractérisation des sucres complexes ont pu être mises en œuvre pour confirmer la présence de l'hétéroglycane sulfaté dans les extraits utilisés pour cette invention :
-Dosage colorimétrique des sucres réducteurs suivant la méthode au DNS après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N.
-Dosage colorimétrique des protéines suivant la méthode de Lowry-Folin. -Dosage par turbidimétrie des sulfates suivant la méthode au Chlorure de Baryum.
-Profil des monosaccharides suivant la méthode HPAEC-PAD après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA.
-Spectre de Résonnance Magnétique Nucléaire du proton.
-Estimation de la plage de masse moléculaire par SEC des polymères.
Dosages Colorimétriques
Figure imgf000026_0001
(1 JSucres totaux exprimés en % p/p eq Glc
(2) Protéines exprimées en % p/p eq BSA
(3) Sulfates exprimés en % SO3 p/p Profil des Monosaccharides
Figure imgf000027_0001
Masse Moléculaire des polysaccharides
Figure imgf000027_0002
RM du proton
Les signaux observés correspondent aux signaux caractéristiques des structures décrites des Hétéroglycanes sulfatés.
Ulvanes - Extraits de Ulva armoricana
Processus d'obtention des extraits d'Ulva armoricana
Les différents procédés permettant d'obtenir les différents échantillons testés sont présentés schématiquement Figure 4.
L'algue Ulva armoricana broyée est traitée par extraction en phase aqueuse. 70 g d'Ulva armoricana sont mis en suspension dans un litre d'eau déionisée, à 95°C pendant 12 heures environ avec une agitation de 850 rpm.
L'extrait soluble est isolé par centrifugatlon (8000 rpm, 4°C, 45 minutes). Le produit ainsi isolé est précipité avec de l'éthanol préalablement placé à - 20°C, jusqu'à 60% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugatlon (4000 rpm, 4°C, 5 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve à 40°C une nuit. L'extrait précipité est ensuite purifié sur membranes d'ultrafiltration tangentielle. Dans un premier temps l'extrait précipité est remis en solution à 5 g/L et diafiltré par 10 volumes d'eau déionisée sur une membrane de 300 kDa. Le permeat de cette ultrafiltration est concentré par 10 sur une deuxième membrane d'ultrafiltration tangentielle de 100 kDa, puis diafiltré par 10 volumes d'eau déionisée. Le rétentat de cette deuxième ultrafiltration est lyophilisé pour donner l'échantillon extrait n°244. Le permeat est lyophilisé après concentration pour donner l'échantillon extrait n°245.
Caractérisation des extraits d'Ulva armoricana :
L'extrait ainsi obtenu présente majoritairement la structure décrite de l'ulvane (Marc Lahaye, Carbohydrate Research 1998), à savoir une chaîne formée de motifs parmi les quatre motifs suivants :
-Ulvanobiuric 3-sulfate type A acid: p(l,4)-D-GlcA-a (1,4)-L-Rha 3 sulfate -Ulvanobiuric 3-sulfate type B acid: 3(l,4)-L-IdoA-a (1,4)-L-Rha 3 sulfate -Ulvanobiose 3-sulfate acid: (l,4)-D-Xyl-a (1,4)-L-Rha 3 sulfate
-Ulvanobiose 2', 3 disulfate acid: (1,4)-D-Xyl 2-sulfate-a(l,4)-L-Rha 3 sulfate
Différentes méthodologies de caractérisation des sucres complexes ont pu être mises en œuvre pour confirmer la présence de l'ulvane sulfaté dans les extraits utilisés pour cette invention :
-Dosage colorimétrique des sucres réducteurs suivant la méthode au DNS après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2N.
-Dosage colorimétrique des protéines suivant la méthode de Lowry-Folin. -Dosage par turbidimétrie des sulfates suivant la méthode au Chlorure de Baryum.
-Profil des monosaccharides suivant la méthode HPAEC-PAD après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA. Dosages Colorimétriques
Figure imgf000029_0001
(l)Sucres totaux exprimés en % p/p eq Gai
(2)Protéines exprimées en % p/p eq BSA
(3)Sulfates exprimés en % SO3 p/p
Profil des Monosaccharides
Figure imgf000029_0002
Carraghénane - Extraits ' Agardhiella tenera
Processus d'obtention des extraits û'Aaardhiella tenera
Les différents procédés permettant d'obtenir les différents échantillons testés sont présentés schématiquement Figure 5.
L'algue Agardhiella tenera broyée est traitée par extraction en phase aqueuse après une dépigmentation avec un solvant organique tel que l'éthanol. 200 g de Agardhiella tenera en poudre sont mis en suspension dans IL d'éthanol pur. Le mélange est porté à 78°C sous agitation de 500 rpm pendant 3 heures environ. Le résidu de dépigmentation est isolé par filtration sur filtre Buchner de 20-25 pm et séché à l'étuve 40°C une nuit. L'algue ainsi dépigmentée est alors remise en solution dans 10 litres d'eau déionisée, à 37°C pendant 6 heures environ avec une agitation de 850 rpm. L'extrait soluble est isolé par centrifugation (8000 rpm, 30°C, 30 minutes). Le produit ainsi isolé est précipité avec de l'éthanol préalablement placé à - 20°C, jusqu'à 67% v/v final. Le précipité est isolé par centrifugation (4000 rpm, 4°C, 5 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve 40°C formant l'échantillon extrait n°164. La partie soluble résultant de la première étape de précipitation est reprise avec une addition d"éthanol à - 20°C pour atteindre 83% v/v final d'éthanol. Le précipité est isolé par centrifugation (4000 rpm, 4°C, 5 minutes). Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve 40°C formant l'échantillon extrait n°165. A la partie soluble résultant de la deuxième étape de précipitation on ajoute de l'éthanol à -20°C pour atteindre 92% v/v final d'éthanol. Le précipité peut être lavé à plusieurs reprises, trois fois par exemple, avec de l'éthanol pur. Il est ensuite mis à sécher à l'étuve à 40°C formant l'échantillon extrait n°166.
Caractérisation des extraits 6'Aaardhiella tenera :
Ces extraits ainsi obtenus présentent majoritairement la structure décrite des carraghénane.
Différentes méthodologies de caractérisation des sucres complexes ont pu être mises en uvre pour confirmer la présence des carraghénanes dans les extraits utilisés pour cette invention :
-Dosage colorimétrique des sucres réducteurs suivant la méthode au DNS après hydrolyse acide de l'extrait 4h à 100°C avec du TFA 2IM.
-Dosage colorimétrique des protéines suivant la méthode de Lowry-Folin.
-Dosage par turbidimétrie des sulfates suivant la méthode au Chlorure de Baryum.
-Spectre de Résonnance Magnétique Nucléaire du proton.
-Estimation de la plage de masse moléculaire par SEC des polymères. Dosages Colorimétriques
Figure imgf000031_0001
(l)Sucres totaux exprimés en % p/p eq Gai
(2)Protéines exprimées en % p/p eq BSA
(3)Sulfates exprimés en % S03 ~ p/p
Masse Moléculaire des polysaccharides
Figure imgf000031_0002
RMIM du proton
Les spectres RMN du proton mettent en évidence les signaux caractéristiques des structures du carraghénane. 2. Activités
a. Neutralisation de la réplication de virus influenza
L'identification d'échantillons actifs repose sur l'évaluation de la capacité des molécules à bloquer la réplication virale du virus de la grippe sur un système cellulaire permissif à ce dernier. L'évaluation a été conduite vis-à-vis des virus influenza de type A et B, susceptibles d'induire des épidémies dans la population humaine. i). Mode opératoire
Les virus A/Brisbane/10/2007 H3N2, et B/Florida/4/06 ont été utilisés dans les tests de neutralisation. Ces derniers représentent antigéniquement les souches circulantes des saisons hivernales 2008-2009 pour l'hémisphère sud et nord. Elles ont été sélectionnées pour entrer dans la composition vaccinale des hivers correspondants.
Trois concentrations d'échantillons sont réalisées en milieu d'infection (250pg/ml ;
Figure imgf000032_0001
; 2,5Mg/ml). Chaque concentration est mise en contact avec un volume égal d'une quantité standardisée de virus. Ce mélange est déposé à raison de 4 cupules par concentration, dans des plaques 96 puits recouvertes de cellules MDCK. Des témoins négatifs sont réalisés afin de vérifier l'absence d'effet cytopathique des cellules MDCK non infectées. Un contrôle de la quantité de virus utilisé dans le test est également déposé. Après 48 heures d'incubation, le % de neutralisation est déterminé par la mise en évidence du virus dans le surnageant de culture par un test enzymatique. Dans cet essai la neuraminidase virale hydrolyse son substrat, le (2'(4 Methylumbelliferyl)-a D N-acetyl neuraminic acid) et libère de l'acide sialique et une molécule fluorescente le 4-methylumbelliferone. La quantité de 4-methylumbelliferone libérée est déterminée par une mesure fluorimétrique. La quantité mise en évidence est rapportée à la quantité du témoin positif. ii). Résultats
Six familles de sucre ont été testées ci-dessous :
Trois familles correspondant aux familles d'intérêt :
♦Arabinogalactane sulfaté (Codium fragile)
•Apiogalcturonane (Zostera marina)
•Hétéroglycane Sulfaté (Caulerpa racemosa)
Deux autres familles à titre de comparaison :
•Carraghénanes (Agardhiella t) connus pour leur activité contre le virus influenza •Ulvane (Ulva a)
Les résultats d'activité biologique des polysaccha rides testés sont présentés Figures 6 et 7.
Les polysaccharides 79, 98, 109, 141, 237, 239, 240, et 242 appartiennent à la famille des arabinogalactanes sulfatés. Le polysaccharide 138 appartient à la famille des apiogalacturonanes. Les polysaccharides 233 et 234 appartiennent à la famille des hétéroglycanes sulfatés. Les polysaccharides 164 à 166, appartiennent à la famille des carraghénanes, et enfin les ulvanes sont représentés par les polysaccharides 244 et 245.
Les polysaccharides, à l'exception des ulvanes ont démontré une forte activité biologique vis-à-vis des virus de type B. L'ensemble des molécules inhibent plus de 70% de la réplication pour une concentration de 250Mg/ml. La concentration qui permet d'inhiber 50% de la réplication virale est comprise entre 25 et 250Mg/ml pour l'apiogalacturonane 138 et est inférieure à 2,5 g/ml pour l'ensemble des arabinogalactanes sulfatés et des hétéroglycanes sulfatés.
L'activité biologique vis-à-vis des virus de type A est beaucoup plus réduite. Cependant, les polysaccharides arabinogalactanes sulfatés et les hétéroglycanes sulfates qui présentent une activité vis-à-vis de ce type sont plus efficaces que les carraghénanes témoins. Ainsi les arabinogalactanes sulfatés 79, 98, 109, 141 inhibent entre 25 et 75 % de la réplication virale lorsqu'ils sont utilisés à 250μ9/ηιΙ.
Les résultats d'activité biologique d'autres polysaccharides sont présentés sur les Figures 8 et 9.
Le polysaccharide 152, appartient à la famille des arabinogalactanes sulfatés, les polysaccharides 158, 160 et 161 à la famille des apiogalacturonanes, et le polysaccharide 162 à la famille des hétéroglycanes sulfatés. L'ensemble de ces polysaccharides présentent une forte activité vis-à-vis du virus de type A puisque pour une concentration de 250 g/ml, le pourcentage d'inhibition est compris entre 75 et 100%. La concentration permettant d'inhiber 50% de la réplication virale est comprise entre 2,5 et 25Mg/ml. Les polysaccharides 152 et 162 se caractérisent également par une forte activité vis-à-vis du virus de type B, avec une concentration permettant d'inhiber 50% de la réplication virale inférieure à 2,5pg/ml. Bien que cette concentration soit comprise entre 2,5pg/ml et 25 g/ml, les polysaccharides 158, 160 et 161 ont également une forte capacité d'inhibition des virus B. iii) à titre de comparaison l'activité de l'inuline, du rhamnose et de l'acide Acide glucuronique cité comme agent actif dans la demande WO 98/11778 ont été testés. Leurs activités sont présentées sur les Figures ci- dessous. Comme le montrent les résultats présentés sur les Figures 10 à 15, aucun de ces composés ne présente d'activité significative contre les deux virus influenza testés. b. Pseudoparticules rétro vira tes i) L'importance des pseudoparticules rétrovirales
La capacité des glycoprotéines de surface des virus enveloppés à être incorporées sur des particules virales provenant des rétrovirus, a été décrite il y a longtemps et est appelée "pseudotypage". Brièvement, il est possible de contrôler l'incorporation de certaines glycoprotéines d'enveloppe de différents virus à la surface de rétrovirus recombinants dépourvus de leurs propres glycoprotéines et véhiculant un génome défectif doté d'un gène marqueur (dans le cas présent, la GFP ou « green fluorescent protein »). De tels virus hybrides, ou pseudo-particules rétrovirales (PPV), autorisent donc l'infection de cellules selon les récepteurs et routes suivies par les virus parentaux dont on utilise les glycoprotéines d'enveloppe. La liste des glycoprotéines capables de s'incorporer à la surface des particules rétrovirales et de former des PPV fonctionnelles (i.e. PPV capable d'infecter des cellules), est impressionnante (Sandrin V, et al. (2003) Targeting retroviral and lentiviral vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 281:137-78) et inclut de nombreux virus provenant de familles très éloignées. Le concept de pseudotypage a abouti à plusieurs applications dans les différents secteurs de la recherche biothérapeutique, et plus particulièrement, dans la recherche des antiviraux. En effet, en mimant les propriétés d'entrée cellulaires des virus parentaux dont les glycoproteines sont originaires, les PPVs permettent des nombreuses études fondamentales dans des conditions basses de confinement (L2, voire Ll) même pour les virus de la classe 4, dû au fait que de tels hybrides sont défectueux pour la réplication. L'infection par les PPV est limitée à la seule étape d'entrée cellulaire et d'intégration du génome recombinant, et induit l'insertion du marqueur génétique grâce aux propriétés de la particule rétrovirale utilisée (Nègre D, et al. (2000) Characterization of novel safe lentiviral vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) that efficiently transduce mature human dendritic cells. Gene Ther. 7:1613-23.). Par la suite, la mesure quantitative de l'expression consécutive du gène marqueur GFP par le biais de technique de cytofluorimétrie permet de déterminer très précisément la capacité infectieuse des PPV. Les PPVs sont donc particulièrement adaptées pour identifier des composés qui ont un effet antiviral dû à une interférence avec les fonctions des glycoprotéines de surface, comme par exemple, les inhibiteurs d'entrée cellulaire. ii) Le choix d'antigène
Dans les études décrites ci-dessous, des particules rétrovirales pseudotypées avec les glycoprotéines de surface de quatre différentes souches du virus influenza ont été utilisées. A la surface de ces PPV, les deux glycoprotéines majeurs du virus influenza ont été incorporées : l'hémagglutinin (HA) et la neuraminidase (IMA) (Bosch V, et al. (2001) Inhibition of release of lentivirus particles with incorporated human influenza virus haemagglutinin by binding to sialic acid-containing cellular receptors. J Gen Virol. 82:2485-94 et Sandrin V, et ai (2002) Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RDI 14 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates. Blood. 100:823- 32). Cela a permis obtenir une conformation entièrement fonctionnelle de ces glycoprotéines à la surface des PPV, en termes de l'entrée virale. Dans ces études, deux des souches virales représentent l'influenza aviaire hautement pathogène: l'influenza A H5N1 et H7N1. Les constructions génétiques qui permettent l'expression des glycoprotéines de ces deux virus influenza aviaire ont été décrites auparavant: « Fowl Plague Virus » (A/FPV/Rostock/34, H7N1. Ohuchi et al. (1994) Rescue of vector expressed fowl plague virus hemagglutinin in biologically active form by acidotropic agents and coexpressed M2 protein. J Virol 68:920-926, Hatziioannou T, et al. (1998) Incorporation of fowl plague virus hemagglutinin into murine leukemia virus particles and analysis of the infectivity of the pseudotyped retroviruses. J Virol. 72:5313-7 et Hatziioannou T, et al. (1999) Retroviral display of functional binding domains fused to the amino-terminus of influenza haemagglutinin. Human Gene Therapy 10:1533-44) et H5N1 (A/Thailand/l(KAN-l)/2004 ; Puthavathana et al., (2005) olecular characterization of the complète génome of human influenza H5N1 virus isolâtes from Thailand. J Gen Virol 86:423-433 et Szécsi J, et al. (2006) Induction of neutralising antîbodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virol J 3:70). L'intérêt spécifique d'utiliser FPV est que des essais standardisés d'infection/challenge sont disponibles chez la volaille et pourront être utilisés pour tester la protection conférée par les sucres candidats. Le développement de PPV avec des glycoprotéines provenant du virus Η5ΓΜ1 est très pertinent de nos jours, étant donné le risque actuel de pandémie .
De plus, des PPV qui incorporent à leur surface des glycoprotéines de deux souches humaines du virus influenza qui circulent régulièrement dans la population ont été développées : l'influenza A H3N2 et une souche influenza B. Ceci a permis d'identifier des composés qui, dans le futur, peuvent protéger la population humaine en cas d'épidémie causée par ces virus. iii) La production des particules rétrovirales pseudotypées avec des glycoprotéines du virus influenza.
Pour produire des particules virales pseudotypées avec des glycoprotéines de virus influenza, le mécanisme d'assemblage de ces glycoprotéines sur des particules rétrovirales (Flu-PPV, Sandrin V, Cosset FL. (2006) Intracellular versus cell surface assembly of retroviral pseudotypes is determined by the cellular localization of the viral glycoprotein, its capacity to interact with Gag, and the expression of the Nef protein. 3 Biol Chem. 281:528-42) a été utilisé. Brièvement, les glycoprotéines du virus influenza sont incorporées à la surface de rétrovirus déficients pour la réplication et originaires du virus de la leucémie murine (MLV). Ces Flu-PPV consistent en des protéines GagPol du MLV et un génome défectif doté du gène marqueur GFP (Hatziiannou et al., 1998, Szécsi et al., 2006). L'expression de la GFP dans les cellules infectées par ces PPV reflète précisément la capacité infectieuse des glycoprotéines à la surface des PPV. Ce système est donc un outil très adapté pour étudier l'entrée cellulaire et l'inhibition d'entrée de virus influenza. A la surface des PPV l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) des différents virus influenza mentionnés ci-dessus ont été incorporé. Des Flu-PPVs ont été produits par l'expression transitoire dans des cellules productrices, des composants viraux internes (GagPol, GFP) et de surface (HA, NA). Les Flu-PPVs ont été récoltées à partir du surnageant des cellules productrices 48h après la transfection.
Pour évaluer la concentration de la production Flu-PPV, leur titre infectieux a été déterminé, en ajoutant des dilutions en série de PPV porteur du gène marqueur GFP à des cellules TE671 (rhabdomyosarcoma humaine). Le titre infectieux a été déterminé 72 heures après infection en mesurant le pourcentage de cellules GFP-positives par cytométrie en flux (FACS) comme décrit précédemment (Nègre et al., 2000). iyl Développement d'un test d'inhibition pour identifier des composés de sucre avec une activité anti-virale anti-influenza. Des particules rétrovirales, porteuses du gène marqueur GFP et incorporant à leur surface des glycoprotéines provenant de quatre virus influenza mentionnés ci-dessus, ont été utilisées pour cribler une banque de sucres, afin d'identifier ceux qui peuvent inhiber efficacement l'entrée de ces virus influenza. Différentes concentrations de sucres ont été incubées avec les Flu-PPV à 4°C pendant 40 min. Les concentrations en sucres qui ont été testées sont : SOOpg/ml, 100pg/ml and 10pg/ml. Après 40 min, le mélange Flu-PPV- sucre a été mis en contact avec des cellules TE671, préalablement refroidies à 4°C. Les Flu-PPV ont été laissé pour se fixer sur les cellules pendant 2h à 4°C. Après cela, le mélange Flu-PPV- sucre a été retiré, les cellules ont été rincées avec du milieu de culture, puis incubées dans du milieu de culture pendant 72h à 37°C. Le niveau d'infectivité des cellules cibles par FACS a été mesuré en tirant profit de l'expression GFP dans les cellules infectées (Bartosch B, et al. (2003) In vitro assay for neutralizing antibody to hepatitis C virus: évidence for broadly conserved neutralization epitopes. Proc Natl Acad Sci U S A 100:14199-204). Le % d'inhibition qui reflète l'inhibition de l'entrée du virus, a été déterminé comme la diminution du titre infectieux en présence du sucre comparé au titre déterminé sans le sucre.
Ce test d'inhibition est particulièrement sensible et robuste, et les résultats sont reproductibles. Ce test peut être facilement adapté au format de plaque 96 puits qui peut être facilement analysé avec notre cytomètre (HTS/CantoII, Becton-Dickinson), qui possède un adaptateur pour passer des échantillons à haut débit. Ce test d'inhibition a été miniaturisé pour augmenter la capacité de criblage : le test d'inhibition a été réalisé dans des plaques 96 puits qui nous a permis de tester 96 différents échantillons à la fois. y _Familles des composées qui inhibent l'entrée des virus influenza modèle des pseudoparticules rétrovirales. Arabinogalactanes
La Figure 16 présente l'activité inhibitrice des arabinogalactanes sulfatés testés sur l'entrée des PPV influenza A H3N2.
La majorité des arabinogalactanes sulfatés testés a inhibé l'entrée des PPV influenza A H3N2 (79, 237-240, 242), même à la concentration la plus faible (lOpg/ml). L'efficacité de l'inhibition a été entre 90 et 60%. L'inhibition obtenue avec ces composés arabinogalactanes sulfatés a été plus efficace que l'inhibition par les sucres contrôles, les carraghénanes.
La Figure 17 présente l'activité inhibitrice des arabinogalactanes sulfatés testés sur l'entrée des PPV influenza B.
Tous les arabinogalactanes sulfatés testés, à l'exception de 152, ont inhibé l'entrée des PPV influenza B à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition pour la majorité des ces composés sucre a été entre 90 et 60%. L'inhibition obtenue avec ces composés arabinogalactanes sulfatés a été plus efficace que l'inhibition par les sucres contrôles, les carraghénanes.
La Figure 18 présente l'activité inhibitrice des arabinogalactanes sulfatés testés sur l'entrée des PPV influenza A H5N1.
Tous les arabinogalactanes sulfatés testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H5N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml, et la majorité a même été efficace à la concentration de lOpg/ml. L'efficacité de l'inhibition pour la majorité des ces composés sucre a été entre 90 et 60%. L'inhibition obtenue avec ces composés arabinogalactanes sulfatés a été plus efficace que l'inhibition par les sucres contrôles, les carraghénanes.
La Figure 19 présente l'activité inhibitrice des arabinogalactanes sulfatés testés sur l'entrée des PPV influenza A H7N1.
Tous les arabinogalactanes sulfatés testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H7N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition pour la majorité de ces composés sucre a été entre 90 et 60%. L'inhibition obtenue avec ces composés arabinogalactanes sulfatés a été plus efficace que l'inhibition par les sucres contrôles, les carraghénanes. En résumé, une grande efficacité d'inhibition d'entrée a été détectée en utilisant les arabinogalactanes sulfatés, sur les quatre types de PPV influenza. L'inhibition de l'entrée virale a été légèrement plus efficace quand les glycoproteines virales provenaient des virus influenza aviaires hautement pathogènes. Les arabinogalactanes sulfatés ont été très efficace pour empêcher l'entrée virale, même à une concentration faible (i.e. 10pg/ml). L'inhibition obtenue avec ces composés arabinogalactanes sulfatés a été plus efficace que l'inhibition par les sucres contrôles, les carraghénanes.Par ailleurs, il a été mis en évidence que la sulfatation des arabinogalactanes étaient nécessaires pour l'obtention de l'activité anti-grippale. La Figure 20 montre les % d'inhibition d'entrée des PPV influenza A H5N1 obtenus avec les arabinogalactanes sulfatés extrait de Codium fragile (79, 98, 109, 141, 152, 237, 238, 239, 240, 242) en comparaison avec ceux obtenus dans le cas de deux arabinogalactanes extraits de Codium fragile, mais qui ont été désulfatés (278, 279) et d'un arabinogalactane non sulfaté extrait de mélèze (206). Il apparaît clairement, qu'en l'absence de sulfatation, aucune activité n'est constatée.
Apioaalacturonanes
La Figure 21 présente l'activité inhibitrice des apiogalacturonanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H3N2. Les deux échantillons d'apiogalacturonane 160 et 161 ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H3N2 à des concentrations de 500 et lOOpg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces sucres a été entre 50 et 60%.
La Figure 22 présente l'activité inhibitrice des apiogalacturonanes testés sur l'entrée des PPV influenza B. Tous les échantillons d'apiogalacturonane testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza B à des concentrations de 500 et 100 g/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 40 et 65%.
La Figure 23 présente l'activité inhibitrice des apiogalacturonanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H5N1. Tous les échantillons d'apiogalacturonane testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H5N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 40 et 55%.
En résumé, l'efficacité de l'inhibition de l'entrée virale par les apiogalacturonanes testés a été modérée ou haute, selon les PPV utilisées. Trois types de PPV influenza (H3N2, influenza B et H5N1) ont été inhibées par ces sucres.
Hétéroalvcanes sulfatés
La Figure 24 présente l'activité inhibitrice des hétéroglycanes sulfatés testés sur l'entrée des PPV influenza A H3N2. Tous les hétéroglycanes sulfatés testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H3N2 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 50 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces composés hétéroglycanes sulfatés a été similaire à celle obtenue avec les sucres contrôles, les carraghénanes.
La Figure 25 présente l'activité inhibitrice des hétéroglycanes sulfatés testés sur l'entrée des PPV influenza B. Tous les hétéroglycanes sulfatés testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza B à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 90 et 65%. L'inhibition obtenue avec ces composés hétéroglycane sulfatés a été similaire à celle obtenue avec les sucres contrôles, les carraghénanes.
La Figure 26 présente l'activité inhibitrice des hétéroglycanes sulfatés testés sur l'entrée des PPV influenza A H5N1. Tous les hétéroglycanes sulfatés testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H5N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 55 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces composés hétéroglycanes sulfatés a été similaire à celle obtenue avec les sucres contrôles, les carraghénanes.
La Figure 27 présente l'activité inhibitrice des hétéroglycanes sulfatés testés sur l'entrée des PPV influenza A H7N1. Tous les hétéroglycanes sulfatés testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H7N1 à des concentrations de 500 et 100 g/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 60 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces composés hétéroglycanes sulfatés a été similaire à celle obtenue par les sucres contrôles, les carraghénanes.
En résumé, une très haute efficacité d'inhibition d'entrée des PPV influenza a été obtenue en utilisant les hétéroglycanes sulfatés, sur les quatre types de PPV.
Carraahénane (sucres contrôles positifs1!
La Figure 28 présente l'activité inhibitrice des carraghénanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H3N2. Tous les carraghénanes testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H3IM2 à des concentrations de 500 et 100 g/ml.
L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 60 et 70%.
L'inhibition obtenue avec ces carraghénanes a été inférieure à celle obtenue avec les arabinogalactanes sulfatés.
La Figure 29 présente l'activité inhibitrice des carraghénanes testés sur l'entrée des PPV influenza B. Tous les carraghénanes testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza B à des concentrations de 500 et 100 pg/ml.
L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 90 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces carraghénanes a été inférieure à celle obtenue avec les arabinogalactanes sulfatés.
La Figure 30 présente l'activité inhibitrice des carraghénanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H5N1. Tous les carraghénanes testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H5N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 90 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces composés carraghénanes a été inférieure à celle obtenue avec les arabinogalactanes sulfatés.
La Figure 31 présente l'activité inhibitrice des carraghénanes testés sur l'entrée des PPV influenza A H7N1. Tous les carraghénanes testés ont inhibé l'entrée des PPV influenza A H7N1 à des concentrations de 500 et 100 pg/ml. L'efficacité de l'inhibition obtenue avec ces composés sucre a été entre 60 et 80%. L'inhibition obtenue avec ces composés carraghénanes a été inférieure à celle obtenue avec les arabinogalactanes sulfatés.
En résumé, un très haut niveau d'inhibition d'entrée a été obtenu avec les carraghénanes, sur les quatre types de PPV influenza. Néanmoins, les carraghénanes ont été efficaces qu'à des concentrations élevées (500 et lOOpg/ml), et l'efficacité de l'inhibition d'entrée a été plus faible que celle obtenue avec les arabinogalactanes sulfatés. iv) Résultats in vivo
L'activité antigrippale des polysaccharides d'arabinogalactanes sulfatés
(294), d'hétéroglycanes sulfatés (295) et d'apiogalacturonanes (296) est évaluée dans un modèle d'infection grippale murin.
Considérations éthiques
Des souris femelles BALB/c âgées de 6-8 semaines et exemptes de pathogènes spécifiés (16-20 g) ont été fournies par Charles Rivers Laboratories (France). Les souris ont passé une période d'acclimatation et d'observation de plus de 48 h (avant l'inoculation du virus) permettant d'écarter éventuellement les animaux présentant des signes de maladie et / ou des anomalies physiques. Tous les soins des animaux et les procédures expérimentales ont été approuvés par le comité d'éthique animale de l'Université de Lyon.
Protocole des expérimentations in vivo
La Figure 32 présente l'effet des traitements par les polysaccharides d'ara binogalactane sulfaté 294, d'hétéroglycane sulfaté 295 et d'apiogalacturonane 296 sur la survie de souris infectées par le virus influenza H1N1 A/Puerto Rico/8/34 (25 MLD50). Les polysaccharides ont été administrés par voie orale en une seule application de 20 mg/kg 4 heures après l'inoculation du virus puis, 24 heures après l'inoculation, 2 fois par jour par application de 10 mg/kg.
Les souris ont été anesthésiées à l'isoflurane et exposés par instillation intranasale à 20 μΙ de différentes dilutions dans un tampon phosphate salin (PBS) au 1/10 d'un virus de grippe A (HlNl) A/Puerto Rico/8/1934. La dose létale 50% (MLD50) du virus a été calculée après une période d'observation de 14 jours.
Trois groupes de 5 souris ont été constitués pour l'évaluation de l'activité de chacun des polysaccha rides : 1) Groupe non-infecté et traité par le polysaccharide, 2) Groupe infecté et non-traité par le polysaccharide, 3) Groupe infecté et traité par le polysaccharide.
Les souris des groupes infectés ont été obtenues après administration par voie nasale sous anesthésie à l'isoflurane de la charge virale correspondante à 25 MLD50.
Quatre heures après l'inoculation virale, les souris des groupes infectés et traités par le polysaccharide ont reçu une administration unique de 20 mg/kg par voie nasale ou par voie orale (per os), puis, 24 heures après l'infection par le virus, 10mg/kg deux fois par jour pendant 3 jours. Les groupes non-traités ont reçu une administration correspondante de solution saline (véhicule des polysaccharides).
Dans ce modèle murin d'infection par influenza A, l'infection grippale entraine la mort des animaux en quelques jours précédée par une perte de poids. Ainsi, l'activité antivirale est évaluée sur une période de 14 jours par la mesure des paramètres suivants : perte de poids, la réduction de la mortalité et / ou une augmentation de la durée de survie (mean day to death: MDD).
Le traitement par les polysaccharides d'arabinogalactane sulfaté 294, d'hétéroglycane sulfaté 295 et d'apiogalacturonane 296 permet de réduire la mortalité des animaux infectés par le virus influenza HlNl A/Puerto Rico/8/34. Alors que le pourcentage de survie est de 0% dans le groupe infecté non-traité, le pourcentage de survie dans les groupes infectés et traités par les polysaccharides d'arabinogalactane sulfaté, d'hétéroglycane sulfaté et d'apiogalacturonane sont de 20%, 40% et 20%, respectivement.
Le traitement par les polysaccharides d'arabinogalactane sulfaté et d'apiogalacturonane sont également efficace pour prévenir la perte de poids des animaux infectés et ils permettent d'augmenter le MDD de 1 jour. En effe,t le MDD du groupe infecté non-traité est de 6 jours alors que les MDD des groupes infectés et traités par les polysaccharides d'arabinogalactane sulfaté et d'apiogalacturonane sont de 7 jours, comme le montre la Figure 32. 3. Mécanisme d'action
Les résultats obtenus dans la modélisation de l'entrée virale par les PPV exposés au paragraphe 2 mettent en évidence que les sucres arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates peuvent avoir un effet préventif, en plus d'un effet curatif contre les virus influenza.
D'autres essais ont été réalisés a) pour mettre en évidence des interactions sucres-hémagglutine et b) sur un exemple de MOA pendant le cycle viral.
a. Mise évidence des interactions sucres-hémaaalutinine L'étude des mécanismes d'action des polysaccharides d'intérêt est effectuée au moyen d'une plateforme de criblage utilisant la technologie des puces à sucres.
Cette technologie - nécessitant une fonctionnalisation chimique préalable des sucres avant leur immobilisation - couplée à un procédé de détection par imagerie de Résonance Plasmonique de Surface (SPRi), est une méthode pertinente permettant d'étudier en temps réel et sans marquage des biomolécules, les interactions entre les polysaccharides immobilisés et des protéines en solution.
Pour le criblage des familles de sucres décrites dans la présente invention, le ligand choisi est la glycoprotéine d'enveloppe Hémagglutinine HA, plus précisément la sous-unité soluble HAÏ, nécessaire à l'attachement du virus Influenza à la cellule hôte.
Les études par SPR ont permis de mettre en évidence une interaction spécifique et dose-dépendante entre ces sucres et la protéine purifiée HAÏ, et soulignent que l'action antivirale de ces polysaccharides est réalisée par inhibition de la liaison de l'enveloppe virale à son récepteur. L'illustration de ce travail est réalisée pour différents sucres appartenant aux familles suivantes :
•Polysaccharides d'Apiogalacturonane : 158, 160, 161, 138 •Polysaccharides d'Arabinogalactane : 79, 98, 109, 141, 237, 239, 240, 242
•Polysaccharides d'Hétéroglycane sulfaté : 162, 233, 234 •Témoin d'efficacité : Polysaccharides de Carraghénane: 164, 165, 166 i. Fonctionnalisation chimique des sucres
L'immobilisation covalente des sucres sur une surface d'or nécessite au préalable leur fonctionnalisation chimique. Si de nombreuses fonctions sont disponibles sur la chaîne osidique, la fonction aldéhyde de l'extrémité réductrice possède l'avantage d'être unique, et le couplage sur cette position permet d'orienter les sucres de la même façon sur la surface.
Le couplage chimique se déroule en deux étapes. Premièrement, les sucres sont modifiés par un réactif bi-fonctionnel, l'adipate dihydrazide, dont la fonction aminé primaire libre peut ensuite réagir avec une molécule de pyrrole ramifiée par une chaîne d'ester activée (Pyrrole-NHS). Le principe général du couplage est résumé à la Figure 33.
1. Couplage des polysaccharides avec l'adipate dihydrazide
La forme pyranose du sucre situé à l'extrémité réductrice est en équilibre avec une forme tautomérique ouverte minoritaire, présentant une fonction aldéhyde. C'est cette fonction qui réagit dans un premier temps avec l'hydrazide de l'adipate dihydrazide, en milieu acide. Cette étape, limitée par le taux d'ouverture de cycle des oses (1% de forme ouverte), est déterminante. Lors de la réaction, un équilibre vers la forme cyclique du sucre est favorisé, ce qui permet de recouvrer la forme native de l'ose.
Pour réaliser le couplage : 4 mg de polysaccharides, pesés précisément, sont dissouts dans 1,8 mL de tampon de réaction Acétate de Sodium 0,1 M pH 5, auxquels sont ajoutés 200 d'une solution stock d'adipate dihydrazide à 500 mM. La réaction se déroule à 56°C, pendant 72 heures. Pour chaque polysaccharide couplé, une condition témoin, sans adipate dihydrazide est réalisée en parallèle. A l'issue de ce couplage, une purification par dialyse contre H20 permet de s'affranchir des sels et du réactif n'ayant pas réagi. Les sucres sont ensuite concentrés, lyophilisés et pesés afin de déterminer la quantité de sucre total recouvré.
2. Couplage des « polysaccharides-hydrazide » avec le N- Hydroxysuccinimidyl-6-(pyrrole-yl)-caproate (Pyrrole-NHS)
Dans un deuxième temps, les sucres réagissent avec le N-
Hydroxysuccinimidyl-6-(pyrrole-yl)-caproate (synthétisé comme en 1), par une réaction d'addition élimination entre l'ester activé et la fonction hydrazine libre du bras adipate dihydrazide du sucre.
Cette réaction doit avoir lieu dans un tampon 50 % PBS / 50% DMSO v/v, afin de favoriser la solubilité du Pyrrole-NHS, sans précipiter le polysaccharide.
Les sucres fonctionnalisés par l'adipate dihydrazide sont repris dans du PBS à 20 mg/mL. 100 μί de sucre, 60 μί de DMSO, et 40 μί d'une solution stock de Pyrrole-NHS à 50 mM (dans du DMSO) sont mélangés. La réaction se déroule pendant 2 heures, à température ambiante.
Des conditions témoins, avec les sucres non modifiés sont aussi effectuées. Au terme de la réaction, le volume réactionnel est complété à 500 μί par du tampon 50 % PBS / 50% DMSO v/v, et une étape de dialyse contre ce tampon permet d'éliminer le Pyrrole-NHS restant. Les sels sont ensuite éliminés par dialyse contre H20. Les sucres sont enfin lyophilisés, et pesés précisément. Ils sont repris à 20 mg/mL dans l'eau.
3. Estimation du rendement de couplage
Un dosage colorimétrique permet d'obtenir une estimation du rendement de couplage des deux réactions, et ainsi de pouvoir greffer sur la surface les différents polysaccharides d'intérêt à une même concentration de sucre-pyrrolylé. Cette méthode, utilisant le réactif TNBSA (P2297-10 mL, Sigma-Aldrich), est basée sur la détection des aminés primaires et hydrazines. Elle permet après la première réaction de couplage, de déterminer la proportion de sucres couplés avec l'adipate dihydrazide, et après la deuxième réaction, d'estimer la quantité de sucre-pyrrolylé, en mesurant une diminution des hydrazines dans la solution. La détection se fait à 450 nm (Victor 1420 Multilabel Counter), et la quantification est estimée au moyen d'une gamme étalon réalisée avec différentes solutions d'adipate dihydrazide. Dans une plaque 96 puits, 10 pL d'échantillon (sucre modifié ou non) ou de gamme étalon sont additionnés à 40 μΙ_ de tampon 0,1M a2C03/ NaHC03 pH 9,6. 10 μΙ de réactif TNBSA dilué au l/10ème dans ce tampon sont ajoutés dans chaque puits. Après 4 minutes d'incubation, la réaction colorimétrique est stoppée par l'addition de 100 μΙ_ de tampon d'arrêt 98,5 % NaH2P04 0,1M / 1,5 % Na2S04 0,1M v/v, et la lecture de l'absorbance est effectuée.
ii. Immobilisation des sucres : Electrospotting
L'immobilisation covalente des molécules de « Polysaccharide-pyrrole» s'effectue par électro copolymérisation avec des monomères de pyrrole. Ce processus, appelé electrospotting, permet le greffage très rapide d'une biomolécule sur une surface d'or via un film de polypyrrole (Livache T, et al. Synth. Met, 2001, 121 (2-3): 1443-1444).
Les puces sont constituées par des prismes de verre (n = 1,717 à λ3 633 nm) recouverts d'une fine couche d'or (50 nm) (Genoptics, Orsay). Le protocole, décrit par Mercey et al (Methods Mol Biol. 2007 385:159-75), consiste à préparer des mélanges réactionnels contenant du pyrrole à 20 mM et les sucres pyrnolylés à différentes concentrations (5 et 50 μΜ), dans du tampon d'électrocopolymérisation (50 mM NaH2P04, 50 mM IMaCI, 10 % (p/v) glycérol pH 6,8). La construction de la puce est ensuite effectuée grâce à un robot (Genomic solutions) et une carte d'acquisition U12 (LabJack), pilotés par un logiciel Labview. Le système électrochimique est constitué d'une aiguille en céramique (X-Tend Pin, Genoptics) contenant un fil de platine de 200 μιη, capable de prélever les solutions de sucres pyrrolylés contenues dans une plaque 96 puits et les déposant à un endroit précis sur le prisme. Une impulsion de tension de 2,4 V durant 100 ms entre l'aiguille (contre électrode) et la surface d'or (électrode de travail) provoque la synthèse du film de polypyrrole et son dépôt sur la surface. Quand tous les plots sont synthétisés, le prisme est rincé à l'eau, séché et conservé à 4°C
Une illustration du schéma de la disposition des plots sur la surface dorée d'un prisme, est donnée Figure 34. A gauche de la Figure 34 est présentée l'image différentielle obtenue en SPR, lors de l'injection de HAÏ (H1N1) à 600 nM. Famille A : Apiogalacturonanes ; Famille B : Arabinogalactanes sulfatés ; Famille C : Hétéroglycanes Sulfatés ; Famille D : Carraghénanes ; Famille E : Glucomannanes ; Hp : Héparine 15 kDa ; PPy : polypyrrole.
120 plots sont greffés sur la surface, représentant 29 polysaccharides de 5 familles à deux concentrations (5 et 50 μΜ en sucre pyrrolylé), et en doublet.
De l'héparine (HP) de 15 kDa (Sigma) fonctionnalisée est également déposée et tient lieu de témoin positif pour le dépôt, l'injection d'un des ligands connu de ce sucre, l'interféron-γ (IFNy) Sarrazin S, et ai. (2005) J Biol. Chem 280:37558-64) permettant de vérifier la présence du sucre greffé.
Quatre plots de polypyrrole sont aussi déposés, et servent de témoins négatifs.
îii. Etude des interactions entre HAÏ et les polysaccharides par
SPRi
1. Purification de l'Hémagglutinine
L'hémagglutinine HA est un homotrimère de 220 kDa, présente à la surface des virus Influenza, et responsable de leur attachement aux cellules cibles via sa liaison aux acides sialiques attachés aux glycoprotéines et glycolipides de l'hôte (Skehel JJ, Wiley DC. (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem 69: 531-69). Chaque monomère est composé de deux sous unités, reliées entre elles par un pont disulfure : HAÏ et HA2. HAÏ, qui est la partie soluble de la protéine, contient le site de liaison au récepteur. Les hémagglutinines inclues dans ces études proviennent de deux virus de grippe aviaire extrêmement pathogènes : H5N1 et H7N1. De plus, l'hémagglutinine HAÏ de la souche de virus pandémique H1N1, qui a circulée en 2009 au sein de la population humaine mondiale, a été inclus dans cette étude. Toutes les hémagglutinines ont été exprimées en tant que protéines solubles en fusion avec un Tag 6xHis, permettant leur purification. Les protéines ont été produites par transfection transitoire dans ces cellules de rein humaines 293T. Les protéines solubles ont été purifiées du surnageant des cellules productrices 48 heures après transfection. La purification des différentes HAÏ par leur tag 6xHis est réalisée au moyen d'une colonne de Nickel-NTA (Quiagen), puis par une colonne de gel filtration (Superdex 75, GE Healthcare), afin d'éliminer d'éventuels contaminants. La pureté de la protéine a été vérifiée par migration sur un gel SDS PAGE suivi d'une coloration des protéines au bleu de Coomassie, ainsi que par Western Blot, par révélation avec un anticorps monoclonal anti His-Tag (Sigma) ou un anticorps anti- HAÏ. L'évaluation de la quantité de protéine recueillie est effectuée au moyen d'un dosage colorimétrique (QuantiPro BCA assay kit, Sigma-AIdrich), et les protéines sont conservées à 4°C.
2. Interactions HAl-polysaccharides
Les interactions entre la protéine purifiée, et les sucres d'intérêt immobilisés sur la puce, sont étudiées par SP i, en temps réel et sans marquage préliminaire des molécules. Le système optique (Genoptics), décrit par ercey E, et ai. (2008) Anal Chem 80:3476-82 et Guedon P, et al. (2000) Anal Chem 72:6003-9, permet de visualiser directement les interactions sur chaque plot, et d'obtenir les courbes d'association et de dissociation des complexes polysaccharides-protéines, au moyen d'un logiciel Genovision (Genoptics).
Les interactions ont lieu à l'intérieur d'une cellule d'interaction en PEEK de 7,2 pL, connectée à une pompe pousse-seringue, dans le tampon de rinçage (10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 0,005 % Tween 20, pH 7,4) délivré à un débit de 70 pL/min. Tous les tampons utilisés pour ces expériences sont au préalable filtrés et dégazés. Avant chaque étude d'interaction, le prisme est saturé par une injection de tampon de rinçage contenant 1 % de BSA (p/v). Après l'injection de la protéine durant 7 minutes, la surface est rincée avec du tampon de rinçage afin d'éliminer les molécules non liées, et de dissocier les complexes. La régénération est effectuée avec du tampon de rinçage contenant du NaCI 1M, ou bien de la Guanidine-HCI 2M, pendant 5 minutes.
Les protéines sont injectées à des concentrations croissantes, allant de 50 nM à 800 nM.
Sur la Figure 34, l'image de gauche représente le prisme vu en imagerie SPR, lors de l'injection de la protéine HAÏ (H1N1) à 600 nM. Les valeurs du pourcentage de réflectivité de chaque espèce - sucre ou pyrrole, qui est le témoin négatif de nos expériences - sont relevées en fin d'injection de la protéine.
Les résultats sont symbolisés sous la forme d'histogrammes, représentant le pourcentage de réflectivité du sucre (déposé à 50 μΜ) par rapport au pourcentage de réflectivité du pyrrole (relevés en fin d'injection), pour la concentration de 800 nM de protéine. Ces réponses ainsi normalisées, permettent de comparer les interactions obtenues pour chacun des polysaccharides étudiés. Plus la valeur est supérieure à 1, plus l'interaction observée est importante.
Pour un polysaccharide de chaque famille, les courbes d'interaction (association et dissociation) avec les trois protéines, injectées à différentes concentrations sont représentées sur les Figures 35 à 41. i. Etudes d'interaction avec les Arabinogalactanes
La Figure 35 présente les courbes d'interaction des arabinogalactanes sulfatés testés avec la protéine HAÏ. Tous les arabinogalactanes sulfatés testés ont démontré une interaction notable avec les hémagglutinines purifiées issues des trois souches de virus étudiées. On peut remarquer que, lorsque les trois protéines ont pu être testées, HAÏ (H5N1) est celle qui présente l'interaction la plus forte. Les interactions observées sont largement plus fortes que celles obtenues entre les protéines HAÏ et les Carraghénanes, polysaccharides brevetés pour leur activité antivirale. La Figure 36 présente les courbes d'association et de dissociation entre l'arabinogalactane 79 et ΙΉΑ1 des trois virus Influenza, à différentes concentrations, alors que la Figure 37 présente les courbes d'association et de dissociation entre le pyrrole (témoin négatif) et HAÏ issue des trois virus Influenza, à différentes concentrations.
Les interactions observées entre les hémagglutinines et le sucre 79, qui tient lieu d'exemple, sont doses-dépendantes : plus on augmente la concentration en HAÏ injectée, plus l'interaction est élevée. Nous avons vérifié que cette observation ne se fait pas pour les plots de pyrrole (cf ci- dessus). La phase d'association est relativement rapide, alors que la dissociation du complexe se déroule plus lentement. Une dissociation complète est obtenue suite à une injection de NaCI 1M dans le tampon de rinçage, ou de Guanidine-HCI 2 M suivant l'injection de la protéine à la plus forte concentration.
ii. Etudes d'interaction avec les Hétéroglycanes sulfatés
La Figure 38 présente les courbes d'interaction des hétéroglycanes sulfatés testés avec la protéine HAÏ. Les hétéroglycanes sulfatés actifs dans les tests biologiques, interagissent également de façon spécifique avec les protéines HAÏ purifiées des trois souches de virus étudiés, et ces interactions sont supérieures aux Carraghénanes.
La Figure 39 présente les courbes d'association et de dissociation entre l'hétéroglycane sulfaté 233 et l'HAl des trois virus Influenza, à différentes concentrations. Comme il est illustré avec le polysaccharide 233, les interactions observées sont spécifiques et dépendantes de la concentration en protéine injectée (témoin : cf pyrrole). iii. Etudes d'interaction avec les Carraghénanes
La Figure 40 présente les courbes d'interaction des Carraghénanes testés avec la protéine HAÏ. Les polysaccharides de Carraghénanes, déjà décrits pour leur activité antivirale, tiennent lieu de témoins d'efficacité pour les tests biologiques mis au point. Cependant, il a été constaté par cette technologie des puces à sucre, que les polysaccharides 164, 165 et 166 issus de cette famille, n'interagissaient pas ou très peu avec les hémagglutinines purifiées. Les interactions obtenues sont en effet faibles, alors que les activités antivirales sont similaires à celles des autres polysaccharides. Il peut donc être supposé que l'effet antiviral de ces polysaccharides n'est pas causé par la liaison avec la glycoprotéine HA de l'enveloppe du virus, mais se manifeste vis-à-vis d'une autre cible.
La Figure 41 présente les courbes d'association et de dissociation entre le Carraghénane 164 et ΗΑ1 des trois virus Influenza, à différentes concentrations. b. Exemple de MOA pendant le cycle virai
Le mécanisme d'action a été étudié avec l'arabinogalactane 152. Ce polysaccharide a été sélectionné en raison de sa forte activité, aussi bien vis-à-vis des virus de type A que de type B.
Afin de déterminer les phases du cycle infectieux neutralisées par l'arabinogalactane 152, cinq modalités d'infection ont été réalisées de manière à discriminer les phases précoces des phases tardives de l'infection.
Les différents essais ont été réalisés en présence de 30 CCID50/50pl de virus pour une concentration finale en arabinogalactane 152 de 62,5 pg/ml. Les différentes modalités utilisées sont résumés dans la Figure 42.
Les modalités 1 à 4, permettent de mettre en évidence une activité durant les phases précoces de l'infection. La modalité 5 permet l'étude d'une activité antivirale sur la phase tardive de l'infection.
Les Figures 43 et 44 représentent les résultats d'inhibition de la réplication virale selon les cinq modes d'infections. L'inhibition de la réplication est principalement observable dans la modalité n°5, aussi bien en présence du virus A/Brisbane/10/07 que du virus B/Florida/04/06 montrant que la molécule 152 inhibe principalement la fin du cycle réplicatif du virus.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Polysaccharides choisis parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates pour leur utilisation en tant que médicament dans le traitement, préventif ou curatif, d'une maladie causée par un virus influenza.
2 - Polysaccharides selon la revendication 1 pour leur utilisation en tant qu'agent anti-viral contre le virus influenza dans un médicament destiné au traitement, préventif ou curatif, d'une maladie causée par un virus influenza.
3 - Polysaccharides selon la revendication 1 ou 2 caractérisés en ce que l'activité anti-virale contre le ou les virus influenza est assurée au moins à
70%, de préférence au moins à 90%, et préférentiellement au moins à 95% par les arabinogalactanes sulfatés, apiogalacturonanes ou hétéroglycanes sulfates présents.
4 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisés en ce que ledit médicament ne contient pas d'autre composé, que le ou les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates, présentant une activité anti-virale significative.
5 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisés en ce qu'ils correspondent à un extrait de Codium fragile, Codium vermiiara ou Codium cylindricum comprenant des arabinogalactanes sulfatés.
6 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisés en ce qu'ils correspondent à des arabinogalactanes sulfatés présentant une taille appartenant à la gamme allant de 1 000 à 2. 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 3 000 à 1,1 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 50%, de préférence de 5 à 40 % des groupements sulfates.
7 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisés en ce qu'ils correspondent à un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes.
8 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 4 ou 7 caractérisés en ce qu'ils correspondent à des apiogalacturonanes présentant une taille appartenant à la gamme allant de 10 000 à 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 50 000 à 700 000 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 20%, de préférence de 4 à 12 % des groupements sulfates.
9 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisés en ce qu'ils correspondent à un extrait de Caulerpa /acemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates.
10 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 4 ou 9 caractérisés en ce qu'ils correspondent à des hétéroglycanes sulfatés présentant une taille appartenant à la gamme allant de 500 000 à 5.106 g/mol et, par exemple d'environ, 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 5 à 30%, de préférence de 13 à 22 % des groupements sulfates.
11 - Polysaccharides selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisés en ce que le médicament ne contient pas d'huile d'olive, ni de resveratrol, ni d'extrait de baie de sureau.
12 - Polysaccharides selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que le virus influenza est choisi parmi les virus influenza humains, aviaires, équins, porcins et félins.
13 - Polysaccharides selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce que le virus influenza correspond à un virus de type B, A-
H5N1, A-H7N1 ou A-H3IM2.
14 - Polysaccharides selon l'une des revendications précédentes pour son utilisation dans un médicament à usage vétérinaire, par exemple destiné à la population aviaire.
15 - Compositions pharmaceutiques comprenant en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable :
- soit un extrait de Codium fragile, Codium vermilara ou Codium cylindricum comprenant des arabinogalactanes sulfatés,
- soit un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes,
- soit un extrait de Caulerpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates. 16 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 15 caractérisées en ce qu'elles ne contiennent pas d'huile d'olive, ni de resveratrol, ni d'extrait de baie de sureau.
17 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 15 ou 16 pour leur utilisation en tant que médicament dans le traitement, préventif ou curatif, d'une maladie causée par un virus influenza.
18 - Utilisation d'un polysaccharide choisi parmi les arabinogalactanes sulfatés, les apiogalacturonanes et les hétéroglycanes sulfates dans une composition alimentaire dans laquelle ledit polysaccharide est utilisé pour lutter, à titre préventif ou curatif, contre une maladie causée par un virus influenza.
19 - Utilisation selon la revendication 18 caractérisé en ce que la composition alimentaire comprend :
- soit un extrait de Codium fragile, Codium vermilara ou Codium cylindricum comprenant des arabinogalactanes sulfatés,
- soit un extrait de Zostera marina ou de Lemna minor comprenant des apiogalacturonanes,
- soit un extrait de Caulerpa racemosa comprenant des hétéroglycanes sulfates.
20 - Utilisation selon l'une des revendications 18 ou 19 caractérisée en ce que la composition alimentaire ne contient pas d'huile d'olive, ni de resveratrol, ni d'extrait de baie de sureau.
21 - Utilisation selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisée en ce que le polysaccharide est choisi parmi les arabinogalactanes sulfatés présentant une taille appartenant à la gamme allant de 1 000 à 2. 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 3 000 à 1,1 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 50%, de préférence de 5 à 40 % des groupements sulfates.
22 - Utilisation selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisée en ce que le polysaccharide est choisi parmi les apiogalacturonanes présentant une taille appartenant à la gamme allant de 10 000 à 106 g/mol, de préférence à la gamme allant de 50 000 à 700 000 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 2 à 20%, de préférence de 4 à 12 % des groupements sulfates.
23 - Utilisation selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisés en ce que le polysaccharide est choisi parmi les hétéroglycanes sulfatés présentant une taille appartenant à la gamme allant de 500 000 à 5.106 g/mol et, par exemple d'environ, 106 g/mol et/ou une charge moyenne correspondant de 5 à 30%, de préférence de 13 à 22 % des groupements sulfates.
24 - Utilisation selon l'une des revendications 18 à 23 caractérisée en ce que le virus influenza est choisi parmi les virus influenza humains, aviaires, équins, porcins et félins.
25 - Utilisation selon l'une des revendications 18 à 24 caractérisée en ce que le virus influenza correspond à un virus de type B, A-H5N1, A-H7N1 ou A-H3N2.
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