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CN120550135A - 抑制流感病毒的纳米颗粒ha-adh-gl及其制备方法和应用 - Google Patents

抑制流感病毒的纳米颗粒ha-adh-gl及其制备方法和应用

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CN120550135A
CN120550135A CN202510834629.4A CN202510834629A CN120550135A CN 120550135 A CN120550135 A CN 120550135A CN 202510834629 A CN202510834629 A CN 202510834629A CN 120550135 A CN120550135 A CN 120550135A
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adh
acid
hyaluronic acid
nanoparticle
influenza virus
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任志广
段少峰
厉梦宇
杨争艳
吕心瑞
崔大祥
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First Affiliated Hospital of Henan University
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Abstract

本发明属于医药领域，特别涉及抑制流感病毒的纳米颗粒HA‑ADH‑GL及其制备方法和应用。该纳米颗粒是将甘草酸（GL）与具有良好生物相容性与亲水性的透明质酸（HA）和连接子己二酸二酰肼（ADH）联接起来，合成的HA‑ADH‑GL缀合物。该纳米颗粒可以抑制流感病毒复制，抑制细胞因子风暴。本发明纳米颗粒的制备方法简单、成本低、提高甘草酸的水溶性，且无生物安全风险等问题，为将来抗病毒药物研发提供参考。

Description

抑制流感病毒的纳米颗粒HA-ADH-GL及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药领域，特别涉及抑制流感病毒的纳米颗粒HA-ADH-GL及其制备方法和应用。
背景技术
流感病毒为正粘病毒科，包膜结构，具有一个含有8个单链负义RNA片段的基因组，可编码血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、非结构蛋白(NS1)、和核转运蛋白(NEP)等17种蛋白质。该基因组与病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)和病毒核蛋白(NP)结合，以病毒核糖核蛋白(vRNP)复合物形式存在。流感病毒根据其NP和基质蛋白(M1)抗原特性不同可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四型，其中甲型流感病毒和乙型流感病毒易引起大流行。甲型流感病毒根据表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)结构不同分为不同亚型，其中H1N1、H3N2亚型感染较为常见。
流感病毒生命周期包括附着、进入和脱壳、复制和转录、组装和释放。首先甲型流感病毒通过其表面糖蛋白HA1与宿主细胞表面唾液酸受体吸附病毒，接着激活细胞外Ca2+流入参与的网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞，M2离子通道蛋白介导流感病毒内部酸化，使基质蛋白M1在pH 5.5～6.0时溶解，血凝素(HA2)在晚期内体酸性条件下发生不可逆构象变化，使融合肽暴露激活病毒包膜与内体膜融合，将vRNP释放入细胞质，NP通过其核定位信号NLS介导vRNP复合物进入细胞核。在细胞核中进行复制、转录，转录后的mRNA出核，在核糖体中进行蛋白质翻译，在内质网和高尔基体中对蛋白质加工，并将蛋白子运输到细胞膜处，而加工后的NP、PA、PB1、PB2蛋白进入细胞核与复制的病毒RNA组装成vRNP并从细胞核中输出，在细胞膜处HA、NA和M1等病毒蛋白进行组装，囊泡包裹病毒粒子出芽，通过表面NA切割聚糖末端唾液酸释放子代病毒粒子。
由于甲型流感病毒的不断进化，化学合成药物在治疗期间或治疗后可能会出现抗病毒耐药性，急需开发一种可以替代或者辅助小分子化学合成药物抗病毒作用的药物。天然高分子由于较好的生物相容性和一定的抗病毒作用逐渐被人们认识。
发明内容
为了改善甘草酸(GL)的水溶性，提升GL的抗病毒效果，本发明提供一种HA-ADH-GL缀合物作为抑制流感病毒的纳米颗粒。本发明提供的价格低廉、且具有良好开发应用前景的HA-ADH-GL缀合物，旨在提高天然化学产物抗流感病毒的作用，利用天然产物优势来抑制流感病毒。
为了达到上述目的，本发明具体采用以下技术方案：
本发明提供的抑制流感病毒的纳米颗粒HA-ADH-GL，是将天然产物GL与具有良好生物相容性和亲水性的透明质酸(HA)通过易溶于水的双功能交联试剂己二酸二酰肼(ADH)联接起来得到的HA-ADH-GL缀合物。即纳米颗粒HA-ADH-GL是将GL与HA通过ADH联接后得到的缀合物。
抑制流感病毒的纳米颗粒HA-ADH-GL的制备方法，包括如下步骤；
步骤一：透明质酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)的合成：
将活化羧基后的透明质酸溶液与己二酸二酰肼在室温、惰性气体保护条件下反应，得到透明质酸-己二酸二酰肼。进一步的，反应时间为2h。所述透明质酸与己二酸二酰肼的摩尔比为0.5:1.58。
透明质酸的羧基的活化方法，包括：
将透明质酸溶液与1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺在0℃、惰性气体保护条件下反应，活化透明质酸上的羧基。进一步的，反应时间为30min；透明质酸溶液为透明质酸水溶液。所述透明质酸与1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为0.5:0.63:0.63。
步骤二：透明质酸-己二酸二酰肼-甘草酸(HA-ADH-GL)的合成：
将活化羧基后的甘草酸滴加到透明质酸-己二酸二酰肼中，在室温、惰性气体保护条件下反应得到透明质酸-己二酸二酰肼-甘草酸纳米颗粒。所述反应时间为12小时以上。所述透明质酸-己二酸二酰肼与甘草酸的摩尔比为0.61:0.64。
甘草酸的羧基的活化方法，包括：
将甘草酸溶液与1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺在0℃、惰性气体保护条件下反应，活化甘草酸上的羧基。进一步的，反应时间为30min；甘草酸溶液为甘草酸的DMSO溶液。所述甘草酸与1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:1:1。
上述步骤一和步骤二的反应液的纯化步骤如下：将反应液透析后离心，取上清，冻干。
随后，我们从体外实验和体内实验两方面评价了纳米颗粒HA-ADH-GL抑制流感病毒的作用。实验结果表明，该纳米颗粒在体外可降低甘草酸的细胞毒性，提高甘草酸水溶性，对流感病毒感染有抑制作用，且抑制率呈现剂量依赖性。该纳米颗粒有效提高小鼠感染病毒后生存率，并改善小鼠感染后肺部病变有效抑制炎性因子，降低肺部病毒NP水平。因此，本发明提供纳米颗粒HA-ADH-GL在制备治疗流感病毒药物中的应用。
作为本发明的一个发明点，纳米颗粒HA-ADH-GL能够降低肺组织和鼻甲骨病毒滴度，减少肺部病毒蛋白水平及病毒M基因水平。
本发明的有益效果是：
本发明以透明质酸(HA)为药物载体，制备HA-己二酸二酰肼(ADH)，来改变甘草酸(GL)因溶解度差、吸收率低而限制临床应用的技术瓶颈，显著增强了GL抗病毒效果。为其在流感病毒的治疗中提供了高效、安全的新型制剂，为GL的工业化生产和临床转化奠定了坚实基础，同时也为天然产物的药物递送技术提供了新的思路和方法。
附图说明
图1、自组装纳米颗粒HA-ADH-GL合成路线。
图2、(A)-(D)分别为HA(D2O)、HA-ADH(D2O)、HA-ADH-GL(D2O)、GL(DMSO-d6)的核磁氢谱图(500MHz)。
图3、(A)为自组装纳米颗粒GL、HA-ADH-GL、HA-ADH、HA红外图谱。(B)为自组装纳米颗粒HA-ADH-GL及GL紫外图谱。
图4、(A)-(C)分别为HA-ADH-GL透射电镜图及局部放大图、粒径图、电位图。
图5、(A)、(B)分别为不同药物孵育MDCK细胞24h、48h细胞毒性。
图6、HA-ADH-GL孵育MDCK细胞48h细胞毒性及对流感病毒感染抑制率。
图7、100倍TCID50的H1N1攻毒MDCK细胞HA-ADH-GL药物治疗24h免疫荧光图。
图8、(A)、(B)分别为H1N1(5倍MLD50)攻毒小鼠HA-ADH-GL不同给药方式治疗第14天后的小鼠体重、生存率。
图9、(A)、(B)分别为H1N1(3倍MLD50)攻毒小鼠给药灌胃治疗第14天后的小鼠体重、生存率。
图10、(A)-(C)分别为H1N1(3倍MLD50)攻毒小鼠药物治疗第3、5天后肺中病毒滴度及药物治疗第3天后鼻甲骨中病毒滴度。
图11、H1N1(3倍MLD50)攻毒小鼠给药治疗第3、5天肺组织图片及第5天肺指数。
图12、H1N1(3倍MLD50)攻毒小鼠给药治疗第3、5天后苏木精-伊红染色结果。
图13、H1N1(3倍MLD50)攻毒小鼠给药治疗第3、5天后小鼠肺组织免疫组化图。
图14、(A)-(C)分别为H1N1(3倍MLD50)攻毒小鼠给药治疗5天后肺部病毒基因水平和促炎因子IL-6、IL-1β水平。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所用到的主要实验试剂及仪器设备简要介绍如下：透明质酸(HA,7kDa)、己二酸二酰肼(ADH)、甘草酸(GL)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI，CAS:25952-53-8)、透析袋(MW 3.6kDa)；全数字化超导核磁共振氢谱仪、冷冻干燥机等。
通过提高GL的水溶性可以提高其生物利用度，如将GL和亲水载体透明质酸进行耦连。但是GL和透明质酸直接耦连要发生酯化反应，条件要求较高。因此本发明以己二酸二酰肼为连接子来连接GL和透明质酸，连接过程中发生的是酰胺化反应，降低了反应条件严苛性。通过核磁氢谱、红外光谱进行透明质酸-己二酸二酰肼-甘草酸结构确证，通过紫外测甘草酸的载药量，通过透射电镜及马尔文粒径电位仪观察其形貌、粒径及荷电情况。
实施例1
本实施例的透明质酸-己二酸二酰肼-甘草酸(HA-ADH-GL)的合成路线如图1所示，具体步骤如下：
1.1、透明质酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)合成
称取200.0mg HA(0.50mmol)于反应瓶中，加入适量蒸馏水，并搅拌至溶解完全。接着加入120.1mg EDCI(0.63mmol)和72.8mg NHS(0.63mmol)，在0℃、氩气保护条件下反应30min，活化HA上的羧基。活化结束后加入275.5mg的ADH(1.58mmol)，在室温、氩气保护条件下反应2h。反应结束后，使用分子量为3.6kDa的透析袋在ddH2O进行透析24h。透析完成之后离心取上清液，冻干即得白色固体产物HA-ADH。
1.2、透明质酸-己二酸二酰肼-甘草酸(HA-ADH-GL)合成
称取300.0mg已冻干的HA-ADH(0.61mmol)于反应瓶中，加入适量蒸馏水溶解。同时将529.7mg甘草酸(0.64mmol)放入另一个反应瓶中，加入DMSO溶解，然后加入123.4mg EDCI(0.64mmol)和74.0mg NHS(0.64mmol)，在0℃、氩气保护条件下反应0.5h；反应结束后，将活化羧基后的甘草酸在室温、氩气保护条件下缓慢滴加到HA-ADH反应瓶中，边滴加边搅拌，加入完毕后反应过夜。将反应液加入到3.6kDa的透析袋中，在ddH2O中透析12h后冻干得自组装纳米颗粒HA-ADH-GL。
1.3、表征方法及结果分析
(1)使用核磁共振仪验证HA-ADH-GL连接成功
将5～10mg GL溶解在DMSO-d6中，HA、HA-ADH和HA-ADH-GL溶解在D2O中，使用核磁共振仪验证HA-ADH-GL连接成功，如图2所示。
(2)使用傅里叶红外光谱仪验证HA和GL结构
取适量待测固体样品HA、HA-ADH、GL、HA-ADH-GL分别与干燥的溴化钾按照1:100的比例混匀后研磨、压片，使用傅里叶红外光谱仪(FT-IR)测红外图谱，如图3A所示，结果表明HA-ADH-GL中含有GL且HA-ADH和GL以酰胺键连接。
(3)使用紫外-可见光谱仪计算GL载药量
将HA-ADH-GL用水溶解后配制为110μg/mL溶液置于比色皿中，使用紫外-可见分光光度计在249nm处测OD值。并将该OD值带入GL标曲中，计算载药量，将HA-ADH-GL在249nm波长处吸光度值带入GL甲醇溶液标准曲线中得GL载药量为46％。如图3B所示。
(4)使用透射电镜观察HA-ADH-GL结构
取3～4mg HA-ADH-GL溶解在4mL ddH2O中，超声处理20min，吸取5μL溶液以液滴状态滴在铜网上，烘干，做透射电镜检测。余下HA-ADH-GL溶液取1mL加至比色皿中检测粒径，再取1mL加至电位仪中检测电位。如图4所示，通过透射电镜图和粒径图可得出HA-ADH-GL形貌为疏水结构在内、亲水结构在外的球形纳米颗粒结构。电位图表明该纳米颗粒带有负电荷。
实施例2对比实施例
本实施例计划合成透明质酸-己二酸二酰肼-熊果酸(HA-ADH-UI)和透明质酸-根皮素，结果显示熊果酸和HA-ADH未连接成功，根皮素载药量低于甘草酸。具体如下：
2.1、透明质酸-己二酸二酰肼-熊果酸(HA-ADH-UI)合成
2.1.1透明质酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)合成
按照实施例1中透明质酸-己二酸二酰肼的合成方法合成透明质酸-己二酸二酰肼。
2.1.2透明质酸-己二酸二酰肼-熊果酸(HA-ADH-UI)的合成
称取200.0mg已冻干的HA-ADH(0.41mmol)于反应瓶中，加入适量蒸馏水溶解。同时将207mg熊果酸放入另一个反应瓶中，加入DMSO溶解，然后加入130mg EDCI和78.3mg NHS，在0℃、氩气保护条件下搅拌0.5h。反应结束后，将活化羧基后的熊果酸在室温、氩气保护条件下缓慢滴加到HA-ADH反应瓶中，边滴加边搅拌，加入完毕后反应过夜。将反应液加入到3.6kDa的透析袋中，在ddH2O中透析12h后冻干，未得到纳米颗粒HA-ADH-UI，表明熊果酸和HA-ADH未连接成功。
2.2、透明质酸-根皮素合成
称取500mg透明质酸溶于5mL水中，搅拌至溶解完全。接着加入575.1mg的EDCI、345.3mg的NHS，在0℃、氩气保护下反应2h，活化HA上的羧基。
称取根皮素411.4mg溶于二甲亚砜(DMSO)，完全溶解后加入到羧基活化后的透明质酸中，在室温、氩气保护下，用磁力搅拌器300rpm搅拌反应24h。将反应液加入到3.6kDa的透析袋中，在ddH2O中透析24h后冻干得到透明质酸-根皮素缀合物。
实施例3
1、实验材料
选用以下材料研究本发明抑制甲型流感病毒感染水平：
H1N1流感病毒鼠适应株(A/Changchun/01/2009)和H3N2流感病毒鼠适应株(A/Baikalteal/Shanghai/SH-89/2013)由实验室保存。CCK-8试剂盒购买于MCE公司。病毒核蛋白抗体(Ab128193)及相关信号通路蛋白抗体购自Abcam和CST公司。荧光二抗购自碧云天。引物由长春库美和生工公司合成。RNA提取试剂盒为Magen生产。RT-qPCR试剂盒为TaKaRa(RR047A)。荧光染料购自TaKaRaA(RR082A)。所用6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自金泰美迪。
2、实验方法
2.1、CCK-8试剂盒测HA-ADH-GL对MDCK细胞毒性
将在培养瓶中长至80％～90％的MDCK细胞用PBS洗涤后胰酶消化、重悬，加入DMEM完全培养基获得细胞悬液，将其吹打均匀并计数；以每孔7000个细胞加至96孔细胞培养板中，培养箱培养12h。以基础培养基(购自Gibico)配制10、50、100、150、200、300、400、500、600μg/mL的药物(HA、HA-ADH、GL或HA-ADH-GL)。当细胞长至底面积60～70％时，每孔加入上述各组各浓度药物100μL，放入37℃、5％ CO2细胞培养箱中孵育24h、48h，每个浓度设置三个重复孔。采用CCK-8试剂盒检测药物对MDCK细胞毒性。空白组：无MDCK细胞只加基础培养基(100μL)。对照组细胞：MDCK细胞+基础培养基(100μL)。
细胞活性(％)＝(给药组细胞OD值-空白组细胞OD值)/(对照组细胞OD值-空白组细胞OD值)×100％。
2.2、CCK-8试剂盒测HA-ADH-GL对流感病毒H1N1感染MDCK细胞抑制率
将在培养瓶中长至80％～90％的MDCK细胞用PBS洗涤后胰酶消化、重悬，加入DMEM完全培养基获得细胞悬液，将其吹打均匀并计数；以每孔7000个细胞加至96孔细胞培养板中，培养箱培养10h。将H1N1用基础培养基稀释至100倍的TCID50。弃去96孔板中培养基，第一列加入基础培养基作为空白对照组，其余每孔加入100μL 100倍的TCID50的病毒稀释液，放入病毒培养箱孵育2h，每隔一定时间于二级生物安全柜中摇晃一次。将HA-ADH-GL加至基础培养基中，配制0.0316、0.1、0.316、1、3.16、10、31.6、100、316μg/mL的HA-ADH-GL药物。此试验设置空白对照组(Control组)、阴性对照组(Mock组)、上述不同浓度的药物实验组。每个浓度设置3个复孔。放入病毒培养箱中孵育48h。采用CCK-8试剂盒测定病毒抑制率。阴性对照组的MDCK细胞在攻毒后给予基础培养基。空白对照组的MDCK细胞不攻毒不给药。
病毒抑制率(％)＝(药物实验组OD值-阴性对照组平均OD值)/(空白对照组平均OD值-阴性对照组平均OD值)。
2.3、间接免疫荧光检测HA-ADH-GL治疗后H1N1病毒核蛋白水平
将MDCK细胞用DMEM完全培养基重悬后按每孔20％的细胞密度铺于24孔细胞培养板。待其长至50％～60％时攻毒。采用对数稀释法对H1N1、H3N2毒液进行稀释，以100倍的TCID50攻毒2h后换液，给阳性药物(Oseltamivir，60μg/mL)、HA-ADH-GL(100μg/mL)、以及HA-ADH-GL等效浓度的HA、HA-ADH、GL，于37℃、5％CO2病毒培养箱孵育24h。固定、透膜、封闭、孵育抗体、染核、拍照，分析荧光强度。另设置空白对照组(Control组)、阴性对照组(Mock组)，阴性对照组的MDCK细胞在攻毒后给予基础培养基。空白对照组的MDCK细胞不攻毒不给药。
2.5、小鼠攻毒后HA-ADH-GL不同给药方式保护水平
小鼠在接毒前饲养3天，使用耳标标记小鼠，随机分组(灌胃组、腹腔注射组、尾静脉注射组)，5倍的MLD50攻毒12h后通过灌胃(i.g)、腹腔注射(i.p)及尾静脉注射(i.v)方式给药HA-ADH-GL，其中灌胃(i.g)50mg/kg、一天两次；腹腔注射(i.p)20mg/kg、一天两次；尾静脉注射(i.v)20mg/kg、一天一次。另外设置阳性药物组(Oseltamivir，灌胃给药，一天2次，一次20mg/kg，共40mg/kg)。称量并记录给药0～14天的小鼠体重，并计算生存率。
2.6、小鼠攻毒保护
小鼠在接毒前饲养3天，使用耳标标记小鼠，随机分为六组，分别标记为阴性对照组(Mock组)、阳性药物组、HA、HA-ADH、HA-ADH-GL、GL给药组，称量并记录小鼠初始体重。
于生物安全柜中麻醉小鼠，单鼻孔攻毒50μL(3倍的MLD50滴鼻攻毒)，并于攻毒12h后进行灌胃给药，每天给药2次，连续给药5天，其中，纳米颗粒组药物按照HA-ADH-GL50mg/kg浓度进行配制，其余各组按照GL载药量进行配制。阴性对照组给予PBS处理，阳性药物组给予Oseltamivir。观察小鼠状态，称量记录给药0～14天的小鼠体重，并计算生存率。
2.7、鸡胚法测定小鼠肺组织和鼻甲骨病毒载量
研磨样品：将2.6项下攻毒后给药第5天后的小鼠肺组织和鼻甲骨分别加入含有钢珠的2mL研磨管中，然后向80mg肺组织中加入1mL opti-MEM、向单个小鼠的鼻甲骨中加入500μLopti-MEM，以4℃、50Hz、180min、4个循环的程序在研磨仪中研碎，12000rpm、4℃离心10min。取上清于新的离心管中，稀释样品：采用对数稀释法分别稀释肺组织研磨液和鼻甲骨研磨液。用注射器吸取感染小鼠肺组织研磨液、鼻甲骨研磨液，每枚鸡胚接100μL肺组织研磨液/鼻甲骨研磨液。接毒完毕后胶封口。放入37℃培养箱中48h。打开鸡胚气室，移液枪收获鸡胚的尿囊液50μL，进行红细胞凝集测定，测感染小鼠肺组织研磨液及鼻甲骨研磨液的鸡胚半数感染量(EID50)。
2.8、肺部病理变化
2.6项中攻毒后给药第3、5天后，解剖小鼠，取小鼠肺组织进行拍照。通过苏木精-伊红染色和免疫组化分析小鼠肺部病变和肺部病毒载量。
2.9、RT-qPCR分析HA-ADH-GL抑制感染小鼠肺部促炎因子及病毒M基因水平
对2.6项下攻毒后给药第5天后的小鼠，按照Magen试剂盒说明书进行肺组织RNA提取、定量，取1μL蛋白洗脱液校正仪器后，上样后检测组织内ssRNA，按照RT-qPCR试剂盒说明书配制体系，在Real Time PCR扩增仪上设置程序，反应结束后进行熔解曲线以验证qPCR扩增产物的特异性，将获得的Ct值带入2-ΔΔct计算。
上述所有动物试验条件和试验程序都遵从国际疼痛协会的道德准则，并且该试验程序经过了伦理委员会批准。所有试验均在生物二级安全实验室中进行，所用病毒株均得到许可，接触病毒医疗器具均高压处理。
3、结果分析
3.1、CCK-8试剂盒测HA-ADH-GL细胞毒性和流感病毒H1N1感染抑制率
在给予100μg/mL的甘草酸24h或48h后，均出现细胞毒性，如图5、图6所示，而HA-ADH-GL在50μg/mL～600μg/mL浓度范围内无明显细胞毒性，说明GL被HA修饰后，水溶性增加，且对MDCK细胞的细胞毒性降低。为了验证HA-ADH-GL在更大浓度范围内的安全性和有效性，将上述浓度范围扩大至1000μg/mL，利用对数稀释法稀释药物，与MDCK细胞孵育48h。结果表明，HA-ADH-GL纳米颗粒组在100μg/mL安全性较高，且抑制率达到峰值为43.89％，IC50＝0.2957μg/mL，选择指数SI为3304.13。
3.2、HA-ADH-GL治疗感染细胞后降低H1N1病毒核蛋白水平
采用间接免疫荧光法测定流感病毒感染细胞后细胞内病毒核蛋白水平，结果如图7所示。与未经药物处理的Mock组相比，药物处理组在体外有一定抑制病毒感染作用；各给药组之间相比，HA-ADH-GL处理组效果与阳性药物效果相当，优于单药组。
3.3、小鼠攻毒HA-ADH-GL不同给药方式保护水平
小鼠攻毒后，通过灌胃、腹腔和尾静脉给药方式进行治疗给药，结果如图8所示，综合安全性和有效性效果，纳米颗粒HA-ADH-GL灌胃给药效果优于腹腔和尾静脉给药，故后续采用灌胃给药。
3.4、HA-ADH-GL攻毒保护研究
如图9所示，与阴性对照组(Mock组)相比，HA-ADH-GL能提高感染小鼠生存率、一定程度上降低小鼠体重下降幅度，HA-ADH-GL治疗感染小鼠的生存率为60％，高于单药GL组的生存率，攻毒给HA-ADH-GL和GL组药物后小鼠体重在第9天回升。
3.5、HA-ADH-GL降低H1N1感染小鼠肺组织和鼻甲骨病毒滴度
与Mock组肺组织病毒载量相比，HA和HA-ADH对小鼠肺部病毒载量并无显著影响，如图10所示，单药GL组和HA-ADH-GL组在治疗3、5天明显降低肺部病毒载量，且HA-ADH-GL组效果优于单药GL组。
与Mock组鼻甲病毒载量相比，HA-ADH-GL治疗后3天后降低感染鼠鼻甲骨病毒滴度。
3.6、HA-ADH-GL治疗H1N1感染小鼠后明显改善肺部病变
Mock组大面积肺泡隔膜增厚(黑色箭头所示)并伴有炎症细胞浸润(蓝色箭头所示)，用药物HA-ADH-GL和GL治疗后，改善肺泡隔膜增厚，降低炎症因子浸润，减少出血和水肿，如图11、图12所示。此外通过免疫组组化结果可得出，如图13所示，纳米颗粒HA-ADH-GL治疗后明显降低小鼠肺部病毒载量。
3.7、HA-ADH-GL治疗肺部抑制促炎因子基因水平和病毒基因复制
结果如图14所示，对于感染治疗后5天的小鼠，HA-ADH-GL组和GL组可以降低肺部病毒M基因复制水平；对于感染治疗第5天的小鼠，HA-ADH-GL组和GL组可以降低肺部炎症因子IL-6、IL-1β水平。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.抑制流感病毒的纳米颗粒HA-ADH-GL，其特征在于，所述纳米颗粒HA-ADH-GL是将甘草酸与透明质酸通过己二酸二酰肼联接后得到的缀合物。
2.权利要求1所述的抑制流感病毒的纳米颗粒HA-ADH-GL的制备方法，其特征在于，包括如下步骤；
步骤一：将活化羧基后的透明质酸溶液与己二酸二酰肼在室温、惰性气体保护条件下反应，得到透明质酸-己二酸二酰肼；
步骤二：将活化羧基后的甘草酸滴加到透明质酸-己二酸二酰肼中，在室温、惰性气体保护条件下反应得到透明质酸-己二酸二酰肼-甘草酸纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中的反应时间为2h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中透明质酸的羧基的活化方法，包括：
将透明质酸溶液与1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺在0℃、惰性气体保护条件下反应，活化透明质酸上的羧基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述透明质酸溶液为透明质酸水溶液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中所述反应时间为12小时以上。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中甘草酸的羧基的活化方法，包括：
将甘草酸溶液与1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺在0℃、惰性气体保护条件下反应，活化甘草酸上的羧基。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，甘草酸溶液为甘草酸的DMSO溶液。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一和步骤二的反应液的纯化步骤如下：将反应液透析后离心，取上清，冻干。
10.权利要求1所述的纳米颗粒HA-ADH-GL在制备治疗流感病毒药物中的应用。
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