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WO2012076821A1 - Méthode de diagnostic in vitro inter-tissulaire pour diagnostiquer les tumeurs du cerveau - Google Patents

Méthode de diagnostic in vitro inter-tissulaire pour diagnostiquer les tumeurs du cerveau Download PDF

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Publication number
WO2012076821A1
WO2012076821A1 PCT/FR2011/052904 FR2011052904W WO2012076821A1 WO 2012076821 A1 WO2012076821 A1 WO 2012076821A1 FR 2011052904 W FR2011052904 W FR 2011052904W WO 2012076821 A1 WO2012076821 A1 WO 2012076821A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
measured
sample
hsa
mir
mirna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2011/052904
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Paul Issartel
François Berger
Elodie Lages
Audrey Guttin
Michèle EL ATIFI-BOREL
Hélène IPAS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble
Original Assignee
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Joseph Fourier Grenoble 1, Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble filed Critical Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Publication of WO2012076821A1 publication Critical patent/WO2012076821A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to an in vitro inter-tissue diagnostic method for diagnosing brain tumors using miRNAs as biomarkers.
  • CNS tumors of the central nervous system are mostly gliomas (50%), including glioblastoma (GBM) and oligodendroglioma (ODG). These tumors are a major cause of morbidity and mortality and represent a major public health problem. In fact, CNS tumors are the second leading cause of cancer death in children and the third leading cause in adult men (15-34 years). The overall incidence of CNS tumors is close to 7000 new cases detected each year in France. Finally, of the 6 million annual deaths worldwide due to some form of cancer, 1-2% are attributable to CNS tumors (World Health Organization data).
  • Gliomas or glial tumors are classified by the World Health Organization
  • oligodendrogliomas ODG grade II, developed from oligodendrocytes, are low-grade gliomas.
  • grade IV glioblastomas GBM, developed from astrocytes, are high-grade gliomas.
  • the median survival is about 7 years whereas it is only about 1 year for glioblastomas after treatment; accurately diagnosing the nature of the tumor is therefore of decisive importance.
  • Excision of the tumor is a means, a priori radical, to eradicate a tumor but in clinical practice, this strategy remains imperfect.
  • the removal of the tumor must be exhaustive, which is far from being the case either because infiltrating tumors have "irradiated" pre-tumor cells in the brain regions adjacent to the primary tumor, or because the boundaries of the tumor are poorly evaluated at diagnosis.
  • RNAs can regulate gene expression either by degradation of target messenger RNAs or by repression of their translation depending on the degree of complementarity between the RNAs. miRNA and its target mRNA.
  • the microRNAs represent a relatively recent identification class of single-stranded (21 to 25nt), endogenous, non-coding RNAs.
  • the genes responsible for the expression of these miRNAs are previously transcribed in the form of long precursors, themselves cleaved into pre-miRNAs by RNAse III Drosha.
  • the processing of these pre-miRNAs is performed by another RNAse, Dicer, which gives rise to an RNA duplex noted [miRNA: miRNA *].
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • RNAs Since these RNAs play an important role in translational regulation, they are therefore strongly involved in many cellular processes such as development, differentiation, proliferation, apoptosis and stress response, processes often deregulated in tumors.
  • miRNA precursors In humans, the number of genes encoding miRNA precursors currently identified is 1048 (Sanger miRBase version 16, September 2010). Some of these miRNAs have been detected as tumor markers in the context of breast and prostate cancer and are therefore considered to be oncogenic or tumor suppressor miRNAs depending on their expression in tumors and their post-transcriptional role.
  • the present invention is based on the unexpected finding made by the inventors during a scan to measure the expression levels of 847 human microRNAs.
  • the inventors have succeeded in identifying 28 microRNAs whose expression levels in one type of glial tumors are different from those measured in another type of glial tumors and / or in healthy tissue.
  • Group A in this group consisting of hsa-miR-200c, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-
  • Group B comprising hsa-miR-135a-star, hsa-miR-99a-star, hsa-miR-382, hsa- miR-409-3p and hsa-miR-191-star, whose expression levels measured in oligodendrogliomas are significantly different from those measured in healthy tissues.
  • Group C consisting of hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR-1301, hsa-miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa mR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p , hsa-miR-129-5p, hsa-miR-139-3p and hsa-miR-139-5p, whose expression levels measured respectively in glioblastomas or in oligodendrogliomas are significantly different from those measured in healthy tissues .
  • Group D consisting of hsa-miR-199a-3p, whose expression levels measured respectively in glioblastomas or in oligodendrogliomas are significantly different from those measured in healthy tissues. The level of expression of this miRNA measured in glioblastomas is also significantly different from that measured in oligodendrogliomas, respectively.
  • the miRNAs used in the present invention are referenced in the miRBase database (http://www.mirbase.org/) (miRBase: tools for microRNA genomic, Griffiths-Jones et al, NAR 2008 36 (Database Issue): D154 -D158) where the nucleic sequence of a miRNA can be found by a MIMAT accession number or a uniform annotation.
  • An annotation system was put in place to name the different miRNAs (A uniform ystem for microRNA annotation, Ambros et al, RNA 2003 9 (3): 277-279). In this system, microRNAs are designated by a number.
  • miR miRNA
  • miR mature microRNA
  • shsa-miR- 126 miRNAs bearing the same number are distinguished from each other by a lower case letter such as a, b, c, for example hsamR-26b.
  • a precursor loop can generate, on its side 5 'and its side 3', two mature microRNAs which are distinguished from each other by the annotation "5p” or "3p".
  • "hsa-miR-151-3p” means a mature miRNA from the 3 'side of its precursor.
  • a microRNA precursor loop can derive two mature miRNAs, namely a major product and a minor product. Such a minor miRNA is distinguished from the major miRNA derived from the same precursor by a star followed by the identification number, for example "hsa-miR-424 *" or hsa-miR-424-star.
  • the difference in expression levels of a miRNA between two tissues of different character is considered significant, when the level of expression of said miRNA measured in one of the two tissues is 5 times greater than that measured in the other.
  • the measurement of miRNA expression levels can be performed by any conventional method, such as
  • the level of expression of miRNAs can be measured by the "microarray” technique.
  • the technique of the "DNA chip” is well known to those skilled in the art. This is the hybridization of miRNAs extracted on a solid support composed of a nylon membrane, a surface of silicon or glass, optionally nano-beads or particles, comprising oligonucleotides of known sequences fixed on the support or adherents to it.
  • oligonucleotides fixed with the sequences of microRNAs or their conversion products makes it possible to generate a signal (fluorescence, luminescence, radioactivity, electrical signal, etc.) according to the techniques of labeling used at the level of immobilized oligonucleotides (DNA chips).
  • This signal is detected by a specific device and a value of intensity of this own signal for each miRNA is thus recorded.
  • chips for the detection of miRNAs are already on the market, such as GeneChip® miRNA marketed by Affymetrix, miRcury arrays by Exiqon, miRXplore microarrays by Miltenyi.
  • the miRNAs are extracted and purified from a sample, isolated from each other by methods provided by sequencing equipment suppliers such as Roche, Invitrogen.
  • This kind of analysis consists in individualizing the molecules of the various microRNAs, performing an amplification step and sequencing the products ("nucleic acid clones") thus generated.
  • the realization of many sequences to identify each of these "clones" makes it possible to generate a listing of the microRNAs present in a sample and to quantify each of these miRNAs simply by counting how many times each sequence is found in the listing. detailed.
  • the implementation of different sets of miRNAs from these groups can diagnose and distinguish directly and accurately the nature of a sample from a patient suspected of having a glioblastoma, or oligodendroglioma, or possibly diagnose and distinguish directly and precisely the nature of a sample from a patient suspected of having a glioma.
  • the measurement of at least 1 miRNA selected from the 28 miRNAs analyzed in the present invention, described above makes it possible to diagnose a cerebral tumor belonging to the group consisting of 2 types of tumors: ODG, GBM, and tumor type identification.
  • Said method of in vitro diagnosis of a tumor comprises
  • the present invention relates to a method of in vitro diagnosis of a brain tumor belonging to the group consisting of 2 types of tumors: ODG, GBM, and tumor type identification, comprising:
  • group 1 consisting of miAR s belonging to group A mentioned above, namely hsa-miR-200c, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-21-star, hsa-miR-146b-5p and hsa-miR-31,
  • group 2 consisting of miRNAs belonging to group B mentioned above, namely: hsa-miR-135a-star, hsa-miR-99a-star, hsa-miR-382, hsa-miR-409-3p and hsa-miR- 191-star,
  • group 3 consisting of miRNAs belonging to groups C and D mentioned above, namely: hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR-1301, hsa- miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431- star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-139- 3p, hsa-miR-139-5p and hsa-miR-199a-3p,
  • tissue sample in particular a brain tissue obtained for example by biopsy or excision, or a sample of biological fluids, in particular a blood sample.
  • a tissue sample corresponds to a fragment of fresh tissue, frozen or fixed and embedded in paraffin according to conventional pathology analysis techniques or which has been preserved by any other method of preservation and treatment.
  • a brain tissue sample may be central nervous system tissue from the cerebral cortex, cerebellar cortex, basal ganglia, or brainstem nuclei.
  • a biological fluid sample may be blood serum or blood plasma.
  • a biological sample from a patient suspected of having one of the above brain tumors is a brain tissue sample, it is tissue that has been removed, biopsied or excised from the operating room or any other intratumoral sampling method adapted from the tumoral seat suspected of a patient.
  • the suspected tumor site is previously identified by a conventional method, such as MRI (Magnetic Resonance Imaging), a Pet Scan (gamma ray image scanner), or a conventional scanner.
  • MRI Magnetic Resonance Imaging
  • Pet Scan gamma ray image scanner
  • a biological sample from a patient suspected of having one of the above brain tumors is a blood sample, this sample is obtained from a patient by blood sampling according to conventional methods.
  • a healthy reference tissue can be a brain tissue devoid of any tumor character after histological analysis by anatomopathologists.
  • the reference healthy tissue may be central nervous system tissue from the cerebral cortex, cerebellar cortex, basal ganglia, or brainstem nuclei.
  • the reference healthy tissue is preferably taken from the same patient (healthy tissue peripheral zone to the tumor). Alternatively it may consist of encephalic fragments obtained after surgery called cortectomy performed on individuals without brain tumors but in the context of intervention for the treatment of epilepsy or following traumatic brain injury.
  • Reference healthy tissue may also be a sample of body fluids, including blood serum or blood plasma collected from a healthy person, including a person who is not cancer-free.
  • Reference ODG tissue is tissue from a patient in which the presence of an oligodendroglioma has been certified by pathological analysis.
  • a reference GBM tissue is a tissue from a patient in which the presence of glioblastoma has been diagnosed by pathological analysis.
  • Reference ODG tissue or “reference GBM tissue” is brain tissue, the aforementioned tissue may be a tumor fragment (glioma) obtained by excision in a patient and whose tumor type has been certified by anatomo-pathological analysis.
  • oligodendrogliomas or glioblastomas can also be confirmed by molecular analyzes such as, for example, the analysis of the gene expression profiles of these tumor tissues.
  • molecular analyzes such as, for example, the analysis of the gene expression profiles of these tumor tissues.
  • a classification method based on the use of expression levels of 54 genes obtained by hybridization on a chip, can be used to classify tumors (Li A, Walling J, Ahn S, Kotliarov Y, Su Q, Quezado M, Oberholtzer JC, Park J, Zenklusen JC, Fine HA Cancer Res 2009 Mar. 69 (5): 2091-9).
  • Glioblastomas or oligodendrogliomas are classified respectively in groups G and O of the resulting publication.
  • the expression levels of miRNAs measured in the sample from the above patient can be compared only with those measured in a reference healthy tissue. This is the first method to compare miRNA expression levels.
  • the miAR expression levels measured in the above sample can be compared with a reference healthy tissue, a reference ODG tissue, and a reference GBM tissue, respectively.
  • the method consists in using a set of miRNAs comprising at least two specific miRNAs.
  • the level of expression of a miRNA measured in the sample from a patient suspected of having an ODG or GBM is compared with that measured in a healthy reference tissue.
  • the result of this comparison can be expressed as a ratio of levels of expression between that measured in the sample from said patient and that measured in the reference healthy tissue.
  • the ratio When the ratio is greater than 1, it means that said miRNA is overexpressed in the sample from said patient relative to its level of expression in the reference healthy tissue. In contrast, when this ratio is less than 1, said miRNA is under-expressed in the sample from said patient with respect to his level of expression in the reference healthy tissue.
  • the subexpression of said miRNA in the sample from said patient relative to the level of expression of said miRNA in healthy tissue is significant.
  • the level of expression of said miRNA measured in the sample coming from said patient is not considered to be significantly different from that measured in the reference healthy tissue. .
  • this in vitro diagnostic method comprises:
  • a first miRNA selected from one of the three groups of miRNAs
  • group 1 consisting of miRNAs belonging to group A
  • group 2 consisting of miRNAs belonging to group B,
  • the group 3 consisting of miRNAs belonging to groups C or D, a second miAR chosen from one of the three aforesaid groups,
  • the level of expression of a Group A miRNA in GBM tissue is significantly different from that in healthy tissue.
  • the level of expression of a Group B miRNA in an ODG tissue is significantly different from that in healthy tissue.
  • the method according to the invention comprises:
  • a first miRNA selected from one of the three groups of miRNAs
  • group 1 consisting of miRNAs belonging to group A
  • group 2 consisting of miRNAs belonging to group B,
  • the group 3 consisting of miRNAs belonging to groups C or D,
  • the method according to the invention consists in using two miRNAs, one of which, selected from group A, makes it possible to signal the presence of a glioblastoma; the other, selected from group B, makes it possible to indicate the presence of an oligodendroglioma.
  • This in vitro diagnostic method comprising:
  • the level of expression of the first miRNA (selected from group A) measured in said sample is not at least 5 times greater or at least 5 times lower than that of said miRNA measured in a reference healthy tissue
  • the method according to the invention consists in using two miRNAs, one of which, selected from group C or D, makes it possible to signal the presence of a glioma; the other, selected from group A, confirms the presence of a glioblastoma.
  • this in vitro diagnostic method comprising:
  • the first miRNA being chosen from group C or D
  • the second miRNA being chosen from group A
  • the method according to the invention consists in using two miRNAs, one of which, selected from group C or D, makes it possible to signal the presence of a glioma; the other, selected from group B, confirms the presence of an oligodendroglioma.
  • this in vitro diagnostic method comprising:
  • the first miRNA being chosen from group C or D, and
  • the second miRNA being chosen from group B, (ii) comparing the levels of expression of the above miRNAs measured in the sample from the above-mentioned patient suspected of having one of the above-mentioned tumors with those of the above-mentioned miRNAs measured in a reference healthy tissue,
  • the level of expression of the second miRNA measured in said sample is also at least 5 times greater or at least 5 times lower than that of the above-mentioned 2 nd miRNA measured in a reference healthy tissue.
  • the invention consists in using a set of miRNAs comprising at least three specific miRNAs:
  • a third miRNA whose respective level of expression in glioblastoma and oligodendroglioma is significantly different from that measured in healthy tissue.
  • Expression levels of miRNAs measured in a sample from a patient suspected of having an ODG or GBM are compared only with a reference healthy tissue.
  • results of comparisons can be expressed as ratios of levels of expression between that measured in the sample from said patient and that measured in the reference healthy tissue.
  • the method comprises the measurement of expression levels
  • a third miRNA selected from group C consisting of hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR-1301, hsa-miR -1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star , hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-139-3p, hsa- miR-139-5p, or in group D consisting of hsa- mi miR-199a-3p, in a sample from a patient suspected of
  • the above method comprises:
  • the level of expression of a miRNA belonging to group C or D in ODG tissue or GBM tissue is significantly different from that in healthy tissue.
  • the deduction of the presence of ODG in the sample from a patient suspected of having one of the above-mentioned tumors is made, when the level of expression of the second miRNA measured in said sample is at least 5 times greater or 5 times lower than that measured in a reference healthy tissue, and
  • the method consists in using a set of miRNAs comprising at least two specific miRNAs.
  • the levels of expression of the above miRNAs measured in a sample from a patient suspected of having an ODG or GBM are compared with those measured in reference healthy tissue, reference GBM tissue and tissue respectively. 'ODG reference.
  • This in vitro diagnostic method according to the invention comprises:
  • the level of expression of a group A miRNA in a GBM tissue is significantly different from that in an ODG tissue
  • the deduction of the presence of GBM in the sample from a patient suspected of having one of the above-mentioned tumors is made,
  • step (i) of the aforesaid method further comprises measuring the level of expression of a third miRNA selected from group C or D, consisting of hsa-miR- 424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR-1301, hsa-miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR- 491-5p, hsa-miR-1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-
  • a third miRNA selected from group C or D, consisting of hsa-miR- 424-star, hsa-miR-503, hsa-
  • This group of miRNAs whose level of expression in an ODG tissue or in a GBM is significantly different from that in healthy tissue, can indicate the presence of a glioma in a sample from a suspected patient to present a glioma.
  • this in vitro diagnostic method comprising:
  • At least one third miRNA selected from group C or D (ii) comparing the levels of expression of the above miRNAs measured in the sample from the above patient with those of the above miRNAs measured in a reference healthy tissue, a reference ODG tissue and a reference GBM tissue.
  • the third miRNA used in the method according to the invention is chosen from group C, namely from hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR- 132, hrs-miR-1301, hrs-miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-1280, hsa-miR- 490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-139-3p, hsa-miR-139- 5p.
  • the third miRNA used in the method according to the invention above is selected from group D, namely hsa-miR-199a-3p.
  • the level of expression of the third miRNA measured in said sample is at least 5 times greater than that measured in a reference healthy tissue, and at least 5 times lower than that measured in a reference GBM tissue.
  • the level of expression of the third miRNA measured in said sample is at least 5 times greater than that measured in a reference healthy tissue, and at least 5 times lower than that measured in a reference GBM tissue.
  • a particular diagnostic method of a brain tumor belonging to the group consisting of 2 types of tumors: ODG, GBM, and tumor type identification, is to use miRNA hsa-miR-199a-3p alone.
  • This method includes:
  • Figure 1 respectively shows the profiles of expression levels of hsa-miR-21-star and hsa-miR-135a- star in a healthy tissue reference (N) represented by black dot, in a tissue d Reference ODG (ODG) represented by black triangle and in a reference GBM fabric (GBM) represented by black square.
  • N healthy tissue reference
  • ODG tissue d Reference ODG
  • GBM reference GBM fabric
  • Figure 2 respectively shows the profiles of expression levels of hsa-miR-21-star and hsa-miR-135a- star in a sample number 1 represented by black triangle, in a sample number 2 represented by point black and in a sample number 3 represented by black square.
  • the y-axis represents the absolute value of miRNA measured in a tissue.
  • Figure 3 shows respectively the profiles of expression levels of hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-99a-star and hsa-miR-328 in a healthy tissue reference (N) represented by black dot , in a reference ODG tissue (ODG) represented by black triangle and in a reference GBM fabric (GBM) represented by black square.
  • N healthy tissue reference
  • ODG ODG tissue
  • GBM fabric GBM fabric
  • Figure 4 shows respectively the profiles of expression levels of hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-99a-star and hsa-miR-328 in a sample number 4 represented by black triangle, in a sample number 5 represented by black square and in a sample number 6 represented by black dot.
  • the y-axis represents the absolute value of miRNA measured in a tissue.
  • Figure 5 shows respectively the expression levels of hsa-miR-424-star, hsa-miR-1301, hsa-miR-199a-5p and hsa-miR-99a-star in a healthy tissue.
  • reference (N) represented by black dot
  • ODG tissue ODG tissue
  • GBM GBM fabric
  • Figure 6 illustrates respectively the profiles of expression levels of hsa-miR-424-star, hsa-miR-1301, hsa-miR-199a-5p and hsa-miR-99a-star a sample number 7 shown by black triangle, in a sample number 8 represented by black square and in a sample number 9 represented by black dot.
  • the y-axis represents the absolute value of miRNA measured in a tissue.
  • Tumor samples of glioblastoma, oligodendrogliomas and meningiomas, as well as samples of healthy tissue (cortectomies), are obtained after neurosurgeon excision in the operating theater of Grenoble University Hospital and are immediately frozen at -80 ° C.
  • Tissue sections of approximately 40 .mu.m thick are then made using a cryotome in sufficient number to obtain about 80 mg of tissue and stored at -80.degree. C. until extraction of the RNA.
  • RNA samples are taken from patients on PAXGene Blood RNA sampling tubes (PreAnalytix-Qiagen - BD company). The total lysis of the circulating cells is carried out and the RNAs are collected by centrifugation and purified according to the indications of the supplier.
  • the method used is directly based on that described by Skog et al (Skog J, Wiingering T, van Rijn S, Meijer DH, Gainche Sena-Esteves M, Curry WT Jr, BS Carter, Krichevsky AM, Breakefield XO Glioblastoma microvesicles RNA transport and proteins that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers (Skog et al., Nat Cell Biol., 2008 Dec; 12): 1470-6, Epub 2008 Nov 16).
  • the microvesicles are purified from the sera by centrifugation and micro filtration.
  • the sera are centrifuged a first time for 10 min at 300 g, then the supernatants are then centrifuged for 20 min at 17000 g and filtered through a 0.22 micron filter.
  • the micro vesicles are obtained by ultracentrifugation of the filtrate at 110000g for 70 min.
  • the pellet is finally resuspended in phosphate buffer (PBS) and the RNAs are extracted according to the protocol described below.
  • PBS phosphate buffer
  • RNAs are extracted using the hsa-miRVana TM kit (Ambion, ABI) to separate long RNAs (size> 25 Ont) from short RNAs (size ⁇ 25 Ont) according to the supplier's recommendations. Briefly, the tissue is first lyzed, the RNA is then precipitated after addition of sodium acetate and ethanol, extracted in the presence of a phenol / chloroform mixture, separated according to their size on chromatographic columns and then eluted.
  • RNAs are then quantified by measuring the OD at 260 nm using the Nanodrop ND-1000 spectrophotometer and a quality control of these RNAs is carried out by electrophoretic migration in a polymer gel on the Bio Analyzer 2100 using the RNA 6000 kit. nano LabChip® (Agilent).
  • the short RNAs (less than 250 bases in size) obtained in the previous step are used for the GeneChip miRNA Affymetrix DNA microarray analysis.
  • the first step is to add a poly-A end at the 3 'position of the RNAs.
  • the second step is to carry out the labeling of the RNAs. For this, a ligation reaction will be made to add to the RNA biotinylated DNA (for example with the labeling and detection reagents of the HSR Flash Tag kit from Genisphere, Hatfield, USA). Once this step is completed, hybridization can take place with the probes on the chip. After the hybridization, there is a step of amplification of the marking and washing that are done before the chip is scanned. Finally the chip will be scanned and we get an image of each chip that will have to be processed to have an intensity value corresponding to the RNA / probe hybridization for each micro RNA.
  • the data are then processed and standardized with QC Tools software according to the methods proposed by Irizarry et al (RA Irizarry, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay Y, KJ Antonellis, U Scherf and P. Speed. Exploration, Normalization, and Summaries of High Density Oligonucleotide Array Probe Level Data, Biostatistics, April 2003; Vol 4; Number 2: 249-264).
  • the results can also be generated by assaying with RT-Q-PCR, any other type of DNA chip from any vendor or any other assay method.
  • the analyzes can be performed on biological fluids (blood or subfraction for example).
  • miRNAs The expression of miRNAs is quantified by the quantitative PCR technique using the Applied Biosystems distributed kits, specific for mature miRNAs. Initially, 80ng short rRNAs are inversely transcribed (in single-stranded cDNA) in the presence of loop primers, which confer specificity for the quantification of mature miRNA expression. Real-time PCR is then performed using the primers provided in the kits.
  • One of the primers comprises fluorescent groups (so-called Taqman® probe) which makes it possible to perform a quantitative measurement using a suitable fluorimeter such as the Stratagene Mx3005 station.
  • the detection threshold is determined initially by the user at the beginning of the exponential phase. The value of Ct corresponds to the number of cycles from which the fluorescence exceeds this detection threshold.
  • This Ct value is proportional to the amount of cDNA initially present in the sample. In the absence of a specific standard range for each cDNA, only relative quantification between samples is possible.
  • the assay values for each miRNA are normalized with the data obtained for a non-coding RNA, RNU24.
  • a scan of 847 human miRNAs identified 28 miRNAs with expression levels altered in at least one type of tumor belonging to the group consisting of ODG, and GBM.
  • Table 2 shows the levels of expression of these 28 miRNAs measured respectively in a reference healthy tissue (N), a reference oligodendroglioma tissue (ODG), and a reference glioblastoma tissue (GBM), as well as ratios of GBM / N, OGD / N and GBM / ODG expression levels.
  • the expression levels of 2 miRNAs are measured in a reference healthy tissue, a reference ODG tissue and a GBM tissue respectively. reference according to the method described in Examples 1.3, 1.4 and 1.5 above.
  • the expression levels of these two miRNAs are also measured in three samples from patients suspected of having an oligodendroglioma or glioblastoma.
  • the reference tissues as well as the samples from the patients are taken according to example 1.1 above.
  • the tumor character of the reference ODG tissue and the reference GBM tissue is confirmed by other diagnostic methods known to those skilled in the art.
  • the hsa-miR-21-star miRNA belonging to group A is overexpressed in glioblastoma tissue, whereas its level of expression in oligodendroglioma tissue is not significantly different from that in healthy tissue. A high level of expression of this miRNA in tissue indicates the presence of glioblastoma in this tissue.
  • the hsa-miR-135a-star miRNA belonging to group B is overexpressed in oligodendroglioma tissue, whereas its level of expression in glioblastoma tissue is not significantly different from that in healthy tissue.
  • a high level of expression of this miRNA in a tissue makes it possible to indicate the presence of an oligodendroglioma in this tissue.
  • the profiles of the expression levels of these two miRNAs in the three reference tissues are established from the absolute values of the expression levels of these two miRNAs measured in the three reference tissues (FIG. 1).
  • sample number 1 is not significantly different from those measured in the reference healthy tissue and in the reference ODG tissue, but is significantly different from the one measured in the fabric of GBM reference. These results mean that sample number 1 is not a glioblastoma.
  • hsa-miR-135a-star measured in sample number 1 is significantly higher than those measured in the reference healthy tissue and in the reference GBM tissue. This means the presence of an oligodendroglioma in sample number 1.
  • sample number 2 is not significantly different from those measured in the reference healthy tissue and in the reference ODG tissue, but is significantly different from that measured in the reference GBM tissue. These results mean that sample number 2 is not a glioblastoma.
  • sample number 2 The expression level of hsa-miR-135a star measured in sample number 2 is not significantly different from that measured in the reference healthy tissue or in a reference GBM tissue, but is significantly different from that of measured in the standard ODG tissue. This means that sample number 2 is not an oligodendroglioma.
  • sample number 2 is a normal tissue.
  • sample number 3 is significantly higher than those measured in the reference healthy tissue or the reference ODG tissue, but is not significantly different from that measured in the reference GBM tissue. These results show that sample number 3 is probably a glioblastoma.
  • sample number 3 The expression level of hsa-miR-135a star measured in sample number 3 is not significantly different from those measured in the reference healthy tissue, but significantly different from that measured in the reference oligodentroglioma tissue. . This shows that sample number 1 is not an oligodendroglioma. The combination of all these results makes it possible to diagnose the presence of glioblastoma in sample number 3.
  • the expression levels of three miRNAs namely hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-99a-star, and hsa-miR-328, are measured respectively in a reference healthy tissue, an ODG tissue of reference and a reference GBM tissue according to the method described in Examples 1.3, 1.4 and 1.5 above.
  • the expression levels of these two miRNAs are also measured in three samples from patients suspected of having an oligodendroglioma or glioblastoma.
  • the reference tissues as well as the samples from the patients are taken according to example 1.1 above.
  • the tumor character of the reference ODG tissue and the reference GBM tissue is confirmed by other diagnostic methods known to those skilled in the art.
  • the hsa-miR-146b-5p miRNA belonging to group A is overexpressed in glioblastoma tissue, whereas its level of expression in oligodendroglioma tissue is not significantly different from that in healthy tissue. A high level of expression of this miRNA in tissue indicates the presence of glioblastoma in this tissue.
  • Hsa-miR-99a-star miRNA belonging to group B is overexpressed in oligodendroglioma tissue, whereas its level of expression in glioblastoma tissue is not significantly different from that in healthy tissue.
  • a high level of expression of this miRNA in a tissue makes it possible to indicate the presence of an oligodendroglioma in this tissue.
  • Hsa-miR-328 miRNA belonging to group C is under-expressed both in glioblastoma tissue and in oligodendroglioma tissue compared to healthy tissue. A very low level of expression of this miRNAs in a tissue makes it possible to indicate the presence of a glioma in this tissue.
  • the profiles of the expression levels of these three miRNAs in the three reference tissues are established from the absolute values of the expression levels of these three miRNAs measured in the three reference tissues (FIG. 3).
  • sample number 4 is not significantly different from those measured in the reference healthy tissue and in the reference ODG tissue, but is significantly different from that measured in the reference GBM tissue. These results mean that sample number 4 is not a glioblastoma.
  • the expression level of hsa-miR-99a-star measured in sample number 4 is significantly higher than those measured in the reference healthy tissue and in the reference GBM tissue. This means the presence of an oligodendroglioma in sample number 4.
  • sample number 4 is significantly lower than that measured in the reference healthy tissue, but is not significantly different from those measured in the reference ODG tissue. or in the reference GBM fabric. These results indicate that sample number 4 is not normal tissue, but most likely has a glial type tumor.
  • sample number 5 is significantly higher than that measured in the reference healthy tissue or the reference ODG tissue, but is not significantly different from that measured in the reference GBM tissue.
  • sample number 5 The expression level of hsa-miR-99a-star measured in sample number 5 is not significantly different from that measured in the reference healthy tissue, but is significantly different from that measured in the ODG tissue of reference. This shows that sample number 5 is not an oligodendroglioma.
  • sample number 5 The expression level of hsa-miR-328 measured in sample number 5 is significantly lower than that measured in the reference healthy tissue, but is not significantly different from those measured in the reference ODG tissue. or in the reference GBM fabric. These results indicate that sample number 5 is not normal tissue, but most likely has a glial type tumor. The combination of all these results makes it possible to diagnose the presence of glioblastoma in sample number 5.
  • sample number 6 is not significantly different from those measured in the reference healthy tissue and in the reference ODG tissue, but is significantly different from that measured in the reference GBM tissue. These results mean that sample number 6 is not a glioblastoma.
  • sample number 6 The expression level of hsa-miR-99a-star measured in sample number 6 is not significantly different from those measured in the reference healthy tissue or in a reference GBM tissue, but is significantly different from that of measured in the standard ODG tissue. This means that sample number 6 is not an oligodendroglioma.
  • sample number 6 is significantly higher than those measured in the reference ODG tissue or in the reference GBM tissue, but is not significantly different from that measured in the reference healthy tissue.
  • Expression levels of four miRNAs namely hsa-miR-424-star, hsa-miR-1301, hsa-miR199a-5p and hsa-miR-99a-star, are measured in a reference healthy tissue, respectively.
  • reference ODG tissue and reference GBM tissue according to the method described in Examples 1.3, 1.4 and 1.5 above.
  • the expression levels of these two miRNAs are also measured in three samples from patients suspected of having an oligodendroglioma or glioblastoma.
  • the reference tissues as well as the samples from the patients are taken according to example 1.1 above.
  • the tumor character of the reference ODG tissue and the reference GBM tissue is confirmed by other diagnostic methods known to those skilled in the art.
  • Hsa-miR199a-5p miRNA belonging to group A is overexpressed in glioblastoma tissue, whereas its level of expression in oligodendroglioma tissue is not significantly different from that in healthy tissue.
  • a high level of expression of this miRNA in tissue indicates the presence of glioblastoma in this tissue.
  • the hsa-miR-99a-star miRNA belonging to group B is overexpressed in oligodendroglioma tissue, whereas its level of expression in glioblastoma tissue is not significantly different from that in healthy tissue.
  • a high level of expression of this miRNA in a tissue makes it possible to indicate the presence of an oligodendroglioma in this tissue.
  • Hsa-miR-424-star miRNA belonging to group C is overexpressed in both glioblastoma tissue and oligodendroglioma tissue.
  • a high expression level of this miRNAs in a tissue indicates the presence of a glioma in this tissue.
  • Hsa-miR-1301 miRNA belonging to group C, is under-expressed in both glioblastoma tissue and oligodendroglioma tissue.
  • a very low level of expression of this miRNAs in a tissue means the presence of a glioma in this tissue.
  • the profiles of the expression levels of these four miRNAs in the three reference tissues are established from the absolute values of the expression levels of these two miRNAs measured in the three reference tissues (FIG. 5).
  • the profiles of the expression levels of these four miRNAs in the three patient samples are derived from the absolute values of the expression levels of these two miRNAs measured in these three samples ( Figure 6).
  • sample number 7 is not significantly different from those measured in the reference healthy tissue and in the reference ODG tissue, but is significantly different from that measured. in the reference GBM fabric. These results mean that sample number 7 is not a glioblastoma.
  • hsa-miR-99a-star measured in sample number 7 is significantly higher than those measured in the reference healthy tissue and in the reference GBM tissue. This means the presence of an oligodendroglioma in sample number 7.
  • sample number 7 The level of hsa-miR-1301 expression measured in sample number 7 is significantly lower than that measured in the reference healthy tissue, but is not significantly different from those measured in the reference ODG tissue or in the fabric reference GBM. These results indicate that sample number 7 is not normal tissue, but most likely has a glial type tumor.
  • sample number 7 The level of hsa-miR-424-star expression measured in sample number 7 is significantly higher than that measured in the reference healthy tissue, but is not significantly different from those measured in the ODG tissue of reference or in the reference GBM fabric. These results indicate that sample number 7 is not normal tissue, but most likely has a glial type tumor.
  • sample number 8 The expression level of hsa-miR199a-5p measured in sample number 8 is significantly higher than that measured in the reference healthy tissue or the reference ODG tissue, but is not significantly different from that measured. in the reference GBM fabric. These results show that sample number 8 is probably a glioblastoma.
  • sample number 8 The expression level of hsa-miR-99a-star measured in sample number 8 is not significantly different from those measured in the reference healthy tissue and the reference GBM tissue, but is significantly different from the measured one. in the reference ODG tissue. This shows that sample number 8 is not an oligodendroglioma.
  • sample number 8 is significantly lower than that measured in the reference healthy tissue, but is not significantly different from those measured in the reference ODG tissue. or in the reference GBM fabric.
  • sample number 8 is significantly higher than that measured in the reference healthy tissue, but is not significantly different from those measured in the ODG tissue of reference or in the reference GBM fabric.
  • sample number 9 Diagnosis of sample number 9
  • the expression level of hsa-miR199a-5p measured in sample number 9 is not significantly different from those measured in the reference healthy tissue and in the reference ODG tissue, but is significantly different from that measured. in the reference GBM fabric. These results mean that sample number 9 is not a glioblastoma.
  • sample number 9 The expression level of hsa-miR-99a-star measured in sample number 9 is not significantly different from those measured in the reference healthy tissue or in a reference GBM tissue, but is significantly different from that of measured in the standard ODG tissue. This means that sample number 9 is not an oligodendroglioma.
  • sample number 9 is significantly higher than those measured in the reference ODG tissue or in the reference GBM tissue, but is not significantly different from that measured in the reference healthy tissue.
  • sample number 9 is significantly lower than those measured in the reference ODG tissue or in the reference GBM tissue, but is not significantly different from that measured in the reference healthy tissue.

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Abstract

La présente invention concerne une;éthode de diagnostic in vitro d'une tumeur cérébrale appartenant au groupe constitué de 2 types de tumeurs : ODG, GBM, et d'identification du type de la tumeur, comprenant la mesure des niveaux d'expression d'au moins un premier et un deuxième miARNs appartenant respectivement à deux groupes de miARNs différents, dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales.

Description

Méthode de diagnostic in vitro inter-tissulaire pour diagnostiquer les tumeurs du cerveau
La présente invention concerne une méthode de diagnostic in vitro inter-tissulaire pour diagnostiquer les tumeurs du cerveau, utilisant des miARNs comme biomarqueurs.
Les tumeurs du système nerveux central (SNC) sont pour la plupart des gliomes (50%), regroupant les glioblastomes (GBM) et les oligodendrogliomes (ODG). Ces tumeurs constituent une cause importante de morbidité et de mortalité et représentent un problème important de santé publique. En effet, les tumeurs du SNC constituent la deuxième cause de décès par cancer chez les enfants et la troisième cause chez l'homme adulte (15-34 ans). L'incidence globale des tumeurs du SNC est voisine de 7000 nouveaux cas dépistés chaque année en France. Enfin, sur 6 millions de décès annuels dans le monde à cause d'une forme quelconque de cancer, 1 à 2 % sont imputables aux tumeurs du SNC (Données de l'Organisation Mondiale de la Santé).
Les gliomes ou tumeurs gliales sont classés par l'Organisation Mondiale de la Santé
(OMS) en 4 grades histologiques, le grade indiquant principalement le degré de malignité. Les oligodendrogliomes (ODG) de grade II, développés à partir des oligodendrocytes, sont des gliomes de bas grade. En revanche, les glioblastomes (GBM) de grade IV, développés à partir des astrocytes, sont des gliomes de haut grade. Pour les oligodendrogliomes, la médiane de survie est d'environ 7 ans alors qu'elle n'est que d'environ 1 an pour les glioblastomes après traitement ; diagnostiquer précisément la nature de la tumeur est donc d'une importance décisive.
L'exérèse de la tumeur constitue un moyen, a priori radical, pour éradiquer une tumeur mais dans la pratique clinique, cette stratégie reste imparfaite. L'ablation de la tumeur se doit d'être exhaustive, ce qui est loin d'être le cas soit parce que les tumeurs au caractère infiltrant ont « irradié» des cellules pré-tumorales dans les régions cérébrales voisines à la tumeur primitive, soit parce que les limites de la tumeur sont mal évaluées lors du diagnostic.
A l'heure actuelle, en dehors de l'analyse histologique réalisée par l'anatomo- pathologiste, il n'existe que quelques rares tests-diagnostics basés sur des approches moléculaires. Les observations microscopiques de la morphologie des cellules sont complétées dans quelques laboratoires par la recherche de certains marqueurs protéiques à l'aide d'anticorps spécifiques. Ces tests immunohistochimiques présentent néanmoins de nombreux inconvénients pour l'instant. Ils n'ont qu'un faible débit de productivité (ils ne permettent la détection que d'un seul antigène à la fois), ne permettent pas de distinguer sans ambiguïté les différents types de cellules tumorales et n'offrent que de médiocres possibilités de détection quantitative des marqueurs. Les diagnostics réalisés sur la détection de marqueurs génétiques (tels que les pertes d'hétérozygotie lp et 19q dans les oligodendrogliomes) sont actuellement peu usités.
Ces dernières années, les scientifiques ont découvert qu'une classe d'ARN, désignés miARNs ou microARNs, peut réguler l'expression des gènes soit par dégradation d'ARN messagers cibles, soit par répression de leur traduction suivant le degré de complémentarité entre le miARN et son ARNm cible.
Les microARNs (miARN) représentent une classe d'ARN simple brin de petite taille (21 à 25nt), endogènes, non codants, d'identification relativement récente. Les gènes responsables de l'expression de ces miARNs sont préalablement transcrits sous forme de longs précurseurs, eux-mêmes clivés en pré-miARN par la RNAse III Drosha. La maturation de ces pré-miARN est effectuée par une autre RNAse, Dicer, qui donne lieu à un duplex d'ARN noté [miARN : miARN*]. Seul l'un des 2 brins, le brin mature, participe au complexe ribonucléoprotéique RISC (RNA-induced silencing complex) pour fonctionner comme régulateur post-transcriptionnel (Bartel et al., Cell, 2004. 116(2) : 281-97).
Ces ARNs jouant un rôle important dans la régulation traductionnelle, ils sont donc fortement impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que le développement, la différenciation, la prolifération, l'apoptose et la réponse aux stress, processus souvent dérégulés dans les tumeurs.
De nombreux travaux scientifiques ont été consacrés au rôle des miARN dans les processus d'oncogenèse (Benard, J. and S. Douc-Rasy, Bull Cancer, 2005. 92(9) : p. 757-62; Hammond Curr Opin Genêt Dev, 2006. 16(1) : p. 4-9). Maintenant, il est reconnu que des miARNs sont activement impliqués dans le développement des cancers.
Chez l'Homme, le nombre de gènes codant les précurseurs de miARNs actuellement identifiés est de 1048 (Sanger miRBase version 16, septembre 2010). Certains de ces miARNs ont été détectés comme marqueurs tumoraux dans le contexte des cancers du sein et de la prostate et sont donc considérés comme des miARNs oncogènes ou suppresseurs de tumeur suivant leur expression dans les tumeurs et leur rôle post-transcriptionnel.
Dans les dernières années, l'altération éventuelle des niveaux d'expression des miARNs dans les tumeurs gliales a déjà fait l'objet de plusieurs publications scientifiques.
Une publication de Ciafre et al. en 2005 (Biochem Biophys Res Commun. 2005. Sep 9 ; 334(4) : 1351-8) compare les niveaux d'expression de 245 miARNs dans les glioblastomes et dans les tissus normaux, et met en évidence un profil d'expression distinct de ces miARNs dans les glioblastomes par rapport au profil d'expression dans les tissus normaux. Cette publication décrit que miR-221 est surexprimé dans les glioblastomes, alors que miR-128, miR-181a, miR181b et miR181c sont sous exprimés dans les glioblastomes.
Au même moment, Chen (N Engl J Med, 2005. 353 (17) : 1768-71) décrit que miR-21 est fortement surexprimé dans les glioblastomes par rapport aux tissus normaux.
Un autre balayage des niveaux d'expression de 192 miARNs, dans les tissus de tumeurs gliales et des tissus normaux, a été effectué par Silber et al. en 2008 (BMC Med. 2008. Jun 24 ; 6 : 14.). Cette étude vise à analyser une modification éventuelle du profil d'expression des miARNs dans les astrocytomes anaplasiques (grade III) ou les glioblastomes (grade IV), de tumeurs de différents grades ayant les mêmes origines cellulaires. Cette étude montre un profil d'expression modifié des miARNs dans les astrocytomes anaplasiques et les glioblastomes, par rapport aux tissus normaux. Les miARNs mentionnés dans cette publication, dont l'expression est modifiée, ne sont pas identiques à ceux déjà mentionnés dans les publications antérieures.
Cependant, jusqu'à présent, aucune étude antérieure n'a fait un balayage exhaustif, car l'ensemble des microARNs exprimés dans les cellules humaines n'est jamais exploré.
De plus, dans la plupart des cas, ces études ne permettent que de diagnostiquer un gliome vis-à-vis de tissu sain ou tissu péritumoral, mais ne permettent pas de distinguer un glioblastome d'un oligodendrogliome, deux tumeurs dont les origines cellulaires et pronostics sont très différents, et nécessitant également des traitements bien distincts.
Bien que l'étude de Silber et al. (BMC Med. 2008. Jun 24 ; 6 : 14.) ait montré que les profils d'expression de miARNs mesurés dans les astrocytomes anaplasiques et ceux mesurés dans les glioblastomes sont différents, ces tumeurs sont en effet des tumeurs de même nature, mais de grade différent, car elles sont développées toutes les deux à partir des astrocytes.
En effet, aucune de ces études antérieures ne permet de diagnostiquer précisément et rapidement la présence d'un glioblastome ou d'un oligodendrogliome à partir de l'analyse d'un groupe de biomarqueurs.
Il existe une grande nécessité de développer une méthode de diagnostic capable de distinguer entre un oligodendrogliome et un glioblastome, permettant à un patient de recevoir des soins correspondant à son état physique et d'augmenter ses chances de survie.
La présente invention repose sur la constatation inattendue faite par les Inventeurs au cours d'un balayage permettant de mesurer les niveaux d'expression de 847 microARNs humains. Les Inventeurs ont réussi à identifier 28 microARNs dont les niveaux d'expression dans un type de tumeurs gliales sont différents de ceux mesurés dans un autre type de tumeurs gliales et/ou dans un tissu sain.
Ces 28 microARN se repartissent dans les groupes suivant (cf tableau 2) :
Le groupe A dans ce groupe composé de hsa-miR-200c, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-
21 -star, hsa-miR-146b-5p et hsa-miR-31 , dont les niveaux d'expression mesurés dans les glioblastomes sont significativement différents de ceux mesurés dans les tissus sains et dans les oligodendrogliomes.
Le groupe B comportant hsa-miR- 135a- star, hsa-miR-99a-star, hsa-miR-382, hsa- miR-409-3p et hsa-miR-191-star, dont les niveaux d'expression mesurés dans les oligodendrogliomes sont significativement différents de ceux mesurés dans les tissus sains.
Le groupe C constitué de hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR- 1301, hsa-miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR- 1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR- 129-5p, hsa-miR-139-3p et hsa-miR- 139-5p, dont les niveaux d'expression mesurés respectivement dans les glioblastomes ou dans les oligodendrogliomes sont significativement différents de ceux mesurés dans les tissus sains.
Le groupe D constitué du hsa-miR- 199a-3p, dont les niveaux d'expression mesurés respectivement dans les glioblastomes ou dans les oligodendrogliomes sont significativement différents de ceux mesurés dans les tissus sains. Le niveau d'expression de ce miARN mesuré dans les glioblastomes est également significativement différent de celui mesuré respectivement dans les oligodendrogliomes.
Les miARNs utilisés dans la présente invention sont référencés dans la base de données miRBase (http://www.mirbase.org/) (miRBase : tools for microRNA genomic, Griffiths- Jones et al, NAR 2008 36(Database Issue):D154-D158) où la séquence nucléique d'un miARN peut être retrouvée par un numéro d'accession MIMAT ou une annotation uniforme. Un système d'annotation a été mis en place pour nommer les différents miARNs (A uniform ystem for microRNA annotation, Ambros et al, RNA 2003 9(3):277-279). Dans ce système, les microARNs sont désignés par un numéro. Précédent ce numéro d'identification, se trouve l'abréviation « miR » ou « mir », qui permet une distinction entre le microARN mature (miR) et la boucle précurseur (hairpin) du microARN (mir), correspondant respectivement à un numéro d'accession MIMAT et MI. Un préfixe de trois ou quatre lettres est utilisé pour distinguer les origines génomiques de ce miARN. Par exemple « hsa-miR- 126» signifie que ce miARN mature provient du génome humain. Parfois, les microARN matures peuvent être très proches (une seule base de différence). Dans ce cas, les micro ARNs portant un même numéro sont distingués entre eux par une lettre minuscule comme a, b, c .par exemple hsa- miR-26b. Parfois une boucle précurseur peut générer, de son côté 5' et son coté 3', deux micro ARNs matures qui sont distingués l'un de l'autre par l'annotation « 5p » ou « 3p ». Par exemple « hsa-miR-151-3p » signifie un miARN mature provenant du côté 3' de son précurseur. Parfois, une boucle précurseur du microARN peut dériver deux miARNs matures, à savoir un produit majeur et un produit mineur. Un tel miARN mineur est distingué du miARN majeur dérivé du même précurseur par une étoile suivie du numéro d'identification, par exemple « hsa-miR-424* » ou hsa-miR-424-star.
Les séquences d'acides nucléiques des miARNs mentionnés ci-dessus et utilisés dans la présente invention ainsi que leurs numéros d'accession sont présentés ci-dessous dans le tableau 1.
intitulés des N° de Séquence N° d'accession miRNA séquence miRBase
Sanger hsa -m R-199a-3p SEQ ID NO 1 ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA M IMAT0000232 hsa -m R-139-3p SEQ ID NO 2 GGAGACGCGGCCCUGUUGGAGU M I MAT0004552 hsa -m R-424-star SEQ ID NO 3 CAAAACGUGAGGCGCUGCUAU M IMAT0001341 hsa -m R-503 SEQ ID NO 4 UAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAG M IMAT0002874 hsa -m R-132 SEQ ID NO 5 UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG M IMAT0000426 hsa -m R-1301 SEQ ID NO 6 UUGCAGCUGCCUGGGAGUGACUUC M IMAT0005797 hsa -m R-1231 SEQ ID NO 7 GUGUCUGGGCGGACAGCUGC MIMAT0005586 hsa -m R-328 SEQ ID NO 8 CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU M IMAT0000752 hsa -m R-1 180 SEQ ID NO 9 UUUCCGGCUCGCGUGGGUGUGU M IMAT0005825 hsa -m R-149 SEQ ID NO 10 UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC M IMAT0000450 hsa -m R-491 -5p SEQ ID NO 1 1 AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG M IMAT0002807 hsa -m R-1280 SEQ ID NO 12 UCCCACCGCUGCCACCC M IMAT0005946 hsa -m R-490-5p SEQ ID NO 13 CCAUGGAUCUCCAGGUGGGU M IMAT0004764 hsa -m R-431 -star SEQ ID NO 14 CAGGUCGUCUUGCAGGGCUUCU M IMAT0001625 hsa -m R-770-5p SEQ ID NO 15 UCCAGUACCACGUGUCAGGGCCA M IMAT0003948 hsa -m R-769-3p SEQ ID NO 16 CUGGGAUCUCCGGGGUCUUGGUU M IMAT0003887 hsa- -m R-129-5p SEQ ID NO 17 CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC M IMAT0000242 hsa- -m R-139-5p SEQ ID NO 18 UCUACAGUGCACGUGUCUCCAG M IMAT0000250 hsa- -m R-135a-star SEQ ID NO 19 UAUAGGGAUUGGAGCCGUGGCG M IMAT0000428 hsa- -m R-99a-star SEQ ID NO 20 CAAGCUCGCUUCUAUGGGUCUG M IMAT0000097 hsa- -m R-382 SEQ ID NO 21 GAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCG M IMAT0000737 hsa- -m R-409-3p SEQ ID NO 22 GAAUGUUGCUCGGUGAACCCCU M IMAT0001639 hsa- -m R-191 -star SEQ ID NO 23 GCUGCGCUUGGAUU UCGUCCCC M IMAT0000440 hsa- -m R-200c SEQ ID NO 24 UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA M IMAT0000617 hsa- -m R-199a-5p SEQ ID NO 25 CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC M IMAT0000231 hsa- -m R-21 -star SEQ ID NO : 26 CAACACCAGUCGAUGGGCUGU M IMAT0000076 hsa-miR-146b-5p SEQ ID NO : 27 UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU M IMAT0002809 hsa-miR-31 SEQ ID NO : 28 AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU M IMAT0000089
Tableau 1
La différence des niveaux d'expression d'un miARN entre deux tissus de caractère différent est considérée comme significative, lorsque le niveau d'expression dudit miARN mesuré dans l'un des deux tissus est 5 fois supérieur à celui mesuré dans l'autre.
La mesure des niveaux d'expression des miARNs peut être réalisée par toute méthode conventionnelle, telle que
- l'hybridation sur « puces à ADN »,
- des méthodes de séquençage à haut débit d'un grand nombre de miARN individualisés,
- la PCR en temps réel,
- le Northern blot,
ou encore par toute autre méthode spécifique des miARNs.
Le niveau d'expression des miARNs peut être mesuré par la technique de la « puce à ADN ». La technique de la « puce à ADN » est bien connue de l'homme du métier. Il s'agit de l'hybridation de miARNs extraits sur un support solide composé d'une membrane nylon, d'une surface de silicium ou de verre, éventuellement de nano-billes ou particules, comportant des oligonucléotides de séquences connues fixés sur le support ou adhérents à celui-ci. La complémentarité des oligonucléotides fixés avec les séquences des microARNs ou de leurs produits de conversion (produits d'amplification, cDNA, ARN ou cARN) permet de générer un signal (fluorescence, luminescence, radioactivité, signal électrique...) selon les techniques de marquage employées, au niveau des oligonucléotides immobilisés sur les supports (puces à ADN). Ce signal est détecté par un équipement spécifique et une valeur d'intensité de ce signal propre pour chaque miARN est ainsi enregistrée. Plusieurs types de puces destinées à la détection des miARNs sont déjà mis sur le marché, comme par exemple les GeneChip® miRNA commercialisés par Affymetrix, miRcury arrays par Exiqon, miRXplore microarrays par Miltenyi.
Dans le cas de l'analyse haut débit par séquençage, les miARNs sont extraits et purifiés d'un échantillon, isolés les uns des autres par des méthodes proposées par les fournisseurs d'équipements de séquençage tels que Roche, Invitrogen. Ce genre d'analyse consiste à individualiser les molécules des différents microARNs, de procéder à une étape d'amplification et de séquencer les produits (« clones d'acides nucléiques ») ainsi générés. La réalisation de très nombreuses séquences pour identifier chacun de ces « clones » (plusieurs milliers) permet de générer un listing des microARNs présents dans un échantillon et de quantifier chacun de ces miARNs en comptant tout simplement combien de fois chaque séquence est retrouvée dans le listing détaillé.
La mise en œuvre de différents jeux de miARNs issus de ces susdits groupes permet de diagnostiquer et distinguer directement et précisément la nature d'un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter un glioblastome, ou un oligodendrogliome, ou encore éventuellement diagnostiquer et distinguer directement et précisément la nature d'un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter un gliome.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la mesure d'au moins 1 miARN choisi dans les 28 miARNs analysés dans la présente invention, décrits ci-dessus, permet de diagnostiquer une tumeur cérébrale appartenant au groupe constitué de 2 types de tumeurs : ODG, GBM, et l'identification du type de la tumeur.
Ladite méthode de diagnostic in vitro d'une tumeur, comprend
(i) la mesure des niveaux d'expression d'au moins 1 miARN extrait d'un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, ledit miARN étant choisi dans les groupes, décrits ci-dessus,
(ii) la comparaison du niveau d'expression du susdit miARN mesuré dans l'échantillon provenant du susdit patient avec celui mesuré dans au moins un type du tissu de référence choisi parmi le groupe constitué d'au moins un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne une méthode de diagnostic in vitro d'une tumeur cérébrale appartenant au groupe constitué de 2 types de tumeurs : ODG, GBM, et d'identification du type de la tumeur, comprenant :
(i) la mesure des niveaux d'expression d'au moins un premier et un deuxième miARNs appartenant respectivement à deux groupes de miARNs différents faisant partie d'un ensemble de 3 groupes de miARNs, dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales : - le groupe 1 étant constitué de miAR s appartenant au groupe A mentionné ci-dessus, à savoir hsa-miR-200c, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-21-star, hsa-miR-146b-5p et hsa-miR-31,
- le groupe 2 étant constitué de miARNs appartenant au groupe B mentionné ci-dessus, à savoir : hsa-miR- 135a- star, hsa-miR-99a-star, hsa-miR-382, hsa-miR-409-3p et hsa-miR- 191-star,
- le groupe 3 étant constitué de miARNs appartenant aux groupes C et D mentionnés ci-dessus, à savoir : hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR-1301, hsa-miR- 1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-1280, hsa-miR- 490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR- 129-5p, hsa-miR-139- 3p, hsa-miR-139-5p et hsa-miR- 199a-3p,
- les deux susdits miARNs n'appartenant pas au même groupe,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans au moins un type du tissu de référence choisi parmi le groupe constitué d'au moins un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence (N, ODG, GBM).
Par « échantillon biologique », on entend un échantillon tissulaire, notamment un tissu cérébral obtenu par exemple par biopsie ou exérèse, ou un échantillon de liquides biologiques, notamment un échantillon sanguin. Un échantillon tissulaire correspond à un fragment de tissu frais, congelé ou fixé et inclus dans de la paraffine selon les techniques classiques d'analyse d'anatomopathologie ou qui aura été conservé par tout autre mode de conservation et traitement.
Un échantillon tissulaire cérébral peut être un tissu du système nerveux central provenant du cortex cérébral, du cortex cérébelleux, des noyaux gris centraux ou des noyaux du tronc cérébral.
Un échantillon de liquide biologique peut être du sérum sanguin ou du plasma sanguin.
Lorsque « un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales » est un échantillon tissulaire cérébral, il s'agit d'un tissu prélevé, par biopsie ou par exérèse au bloc opératoire ou toute autre méthode de prélèvement intratumoral adaptée, du siège tumoral soupçonné d'un patient. Le siège tumoral soupçonné est repéré préalablement par une méthode classique, telle qu'une IRM (Imagerie par résonance magnétique), un Pet Scan (Scanner par image de rayons gamma), ou un scanner classique. Lorsque « un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales » est un échantillon sanguin, cet échantillon est obtenu d'un patient par prélèvement du sang selon les méthodes conventionnelles.
« Un tissu sain de référence » peut être un tissu cérébral dépourvu de tout caractère tumoral d'après une analyse histologique réalisée par les anatomopathologistes. Le tissu sain de référence peut être un tissu du système nerveux central provenant du cortex cérébral, du cortex cérébelleux, des noyaux gris centraux ou des noyaux du tronc cérébral. Le tissu sain de référence est préférentiellement prélevé à partir d'un même patient (tissu sain de zone périphérique à la tumeur). Alternativement il peut être constitué de fragments encéphaliques obtenus après chirurgie dite de cortectomie réalisée sur des individus ne présentant pas de tumeurs du cerveau mais dans le cadre d'intervention pour traitement de l'épilepsie ou suite à des traumatismes crâniens.
« Un tissu sain de référence » peut être aussi un échantillon de liquides biologiques, notamment du sérum sanguin ou du plasma sanguin prélevé d'une personne saine, et notamment d'une personne ne présentant aucun cancer.
« Un tissu d'ODG de référence » est un tissu provenant d'un patient, dans lequel la présence d'un oligodendrogliome a été certifiée par l'analyse anatomo-pathologique.
« Un tissu de GBM de référence » est un tissu provenant d'un patient, dans lequel la présence d'un glioblastome a été diagnostiquée par l'analyse anatomo-pathologique.
« Un tissu d'ODG de référence », ou « un tissu de GBM de référence » est un tissu cérébral, le susdit tissu peut être un fragment de tumeur (gliomes) obtenu par exérèse chez un patient et dont le type de tumeur a été certifié par l'analyse anatomo-pathologique.
Idéalement, le diagnostic des oligodendrogliomes ou des glioblastomes peut également être confirmé par des analyses moléculaires telles que par exemple l'analyse des profils d'expression de gènes de ces tissus tumoraux. En effet, une méthode de classification, reposant sur l'utilisation des niveaux d'expression de 54 gènes obtenus par hybridation sur puce, peut être utilisée pour classer les tumeurs (Li A, Walling J, Ahn S, Kotliarov Y, Su Q, Quezado M, Oberholtzer JC, Park J, Zenklusen JC, Fine HA. Cancer Res. 2009 Mar l;69(5):2091-9). Les glioblastomes ou oligodendrogliomes sont classés respectivement dans les groupes G et O de la publication suscitée.
Les niveaux d'expression de miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient peuvent être comparés uniquement avec ceux mesurés dans un tissu sain de référence. Il s'agit de la première méthode de comparaison des niveaux d'expression de miARNs. Dans une deuxième méthode de comparaison, les niveaux d'expression de miAR s mesurés dans le susdit échantillon peuvent être comparés respectivement avec un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode consiste à utiliser un jeu de miARNs comprenant au moins deux miARNs spécifiques.
Le niveau d'expression d'un miARN mesuré dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter un ODG ou un GBM est comparé avec celui mesuré dans un tissu sain de référence.
Le résultat de cette comparaison peut être exprimé en ratio de niveaux d'expression entre celui mesuré dans l'échantillon provenant dudit patient et celui mesuré dans le tissu sain de référence.
Lorsque le ratio est supérieur à 1, cela signifie que ledit miARN est surexprimé dans l'échantillon provenant dudit patient par rapport à son niveau d'expression dans le tissu sain de référence. En revanche, lorsque ce ratio est inférieur à 1, ledit miARN est sous-exprimé dans l'échantillon provenant dudit patient vis-à-vis de son niveau d'expression dans le tissu sain de référence.
Lorsque le susdit ratio est supérieur à 5, la surexpression dudit miARN dans l'échantillon provenant dudit patient par rapport au niveau d'expression dudit miARN dans un tissu sain est significative.
Lorsque le susdit ratio est inférieur à 0,2, la sous-expression dudit miARN dans l'échantillon provenant dudit patient par rapport au niveau d'expression dudit miARN dans un tissu sain est significative.
En revanche, lorsque la valeur du susdit ratio est comprise entre 0,2 et 5, le niveau d'expression dudit miARN mesuré dans l'échantillon provenant dudit patient n'est pas considéré comme signifïcativement différent de celui mesuré dans le tissu sain de référence.
Plus particulièrement, cette méthode de diagnostic in vitro selon l'invention, comprend :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs,
- un premier miARN choisi dans l'un des trois groupes de miARNs,
* le groupe 1 étant constitué de miARNs appartenant au groupe A,
* le groupe 2 étant constitué de miARNs appartenant au groupe B,
* le groupe 3 étant constitué de miARNs appartenant aux groupes C ou D, - un deuxième miAR choisi dans l'un des trois susdits groupes,
- les deux susdits miARNs n'appartenant pas au même groupe,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence.
Le niveau d'expression d'un miARN appartenant au groupe A dans un tissu de GBM est signifîcativement différent de celui dans un tissu sain.
Le niveau d'expression d'un miARN appartenant au groupe B dans un tissu d'ODG est signifîcativement différent de celui dans un tissu sain.
Le niveau d'expression d'un miARN appartenant au groupe C ou D dans un tissu glial, c'est-à-dire un glioblastome ou un oligodendrogliome, est signifîcativement différent de celui dans un tissu sain. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode selon l'invention comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs,
- un premier miARN choisi dans l'un des trois groupes de miARNs,
* le groupe 1 constitué de miARNs appartenant au groupe A,
* le groupe 2 étant constitué de miARNs appartenant au groupe B,
* le groupe 3 étant constitué de miARNs appartenant aux groupes C ou D,
- un deuxième miARN choisi dans l'un des trois susdits groupes,
- les deux susdits miARNs n'appartenant pas au même groupe,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence.
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode selon l'invention consiste à utiliser deux miARNs, dont l'un, choisi dans le groupe A, permet de signaler la présence d'un glioblastome ; l'autre, choisi dans le groupe B, permet de signaler la présence d'un oligodendrogliome.
Cette méthode de diagnostic in vitro selon l'invention, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs, - d'un premier miARN choisi dans le groupe A, et
- d'un deuxième miARN choisi dans le groupe B,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence.
Dans cette méthode de diagnostic selon l'invention, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN (choisi dans le groupe B) mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN (choisi dans le groupe A) mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit miARN mesuré dans un tissu sain de référence,
En revanche, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN (choisi dans le groupe B) mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN (choisi dans le groupe A) mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui du susdit miARN mesuré dans un tissu sain de référence.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la méthode selon l'invention consiste à utiliser deux miARNs, dont l'un, choisi dans le groupe C ou D, permet de signaler la présence d'un gliome ; l'autre, choisi dans le groupe A, permet de confirmer la présence d'un glioblastome.
Plus particulièrement, cette méthode de diagnostic in vitro selon l'invention, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs,
- le premier miARN étant choisi dans le groupe C ou D, - le deuxième miARN étant choisi dans le groupe A,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence.
Dans cette méthode, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit premier miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit deuxième miARN mesuré dans un tissu sain de référence.
Dans cette méthode, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit premier miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui du susdit deuxième miARN mesuré dans un tissu sain de référence.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la méthode selon l'invention consiste à utiliser deux miARNs, dont l'un, choisi dans le groupe C ou D, permet de signaler la présence d'un gliome ; l'autre, choisi dans le groupe B, permet de confirmer la présence d'un oligodendrogliome.
Plus particulièrement, cette méthode de diagnostic in vitro selon l'invention, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs,
- le premier miARN étant choisi dans le groupe C ou D, et
- le deuxième miARN étant choisi dans le groupe B, (ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence,
Dans cette méthode, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit premier miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est également au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit 2eme miARN mesuré dans un tissu sain de référence.
En revanche, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit premier miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit deuxième miARN mesuré dans un tissu sain de référence.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention consiste à utiliser un jeu de miARNs comprenant au moins trois miARNs spécifiques :
- un premier miARN dont le niveau d'expression dans un glioblastome est signifïcativement différent de celui mesuré dans un tissu sain,
- un deuxième miARN dont le niveau d'expression dans un oligodendrogliome est signifïcativement différent de celui mesuré dans un tissu sain,
- un troisième miARN dont le niveau d'expression respectif dans un glioblastome et un oligodendrogliome est signifïcativement différent de celui mesuré dans un tissu sain.
Les niveaux d'expression de miARNs mesurés dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter un ODG ou un GBM sont comparés uniquement avec un tissu sain de référence.
Les résultats de comparaisons peuvent être exprimés en ratios de niveaux d'expression entre celui mesuré dans l'échantillon provenant dudit patient et celui mesuré dans le tissu sain de référence. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode comprend la mesure des niveaux d'expression
- d'un premier miARN choisi dans le groupe A,
- d'un deuxième miARN choisi dans le groupe B,
- et la mesure du niveau d'expression d'un troisième miARN choisi dans le groupe C constitué de hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR-1301, hsa-miR-1231 , hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-139-3p, hsa- miR-139-5p, ou dans le groupe D constitué de hsa-miR-199a-3p , dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales.
La susdite méthode comprend :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression d'au moins trois miARNs,
- au moins un premier miARN choisi dans le groupe A constitué de hsa-miR-200c, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-21-star, hsa-miR-146b-5p et hsa-miR-31
- au moins un deuxième miARN choisi dans le groupe B constitué de hsa-miR-135a- star, hsa-miR-99a-star, hsa-miR-382, hsa-miR-409-3p et hsa-miR-191-star, et
- au moins un troisième miARN choisi dans les groupes C+D, constitué de hsa-miR- 424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR-1301, hsa-miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-
1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star, hsa- miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-139-3p, hsa-miR-139-5p et hsa- miR-199a-3p,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence.
Le niveau d'expression d'un miARN appartenant au groupe C ou D dans un tissu d'ODG ou un tissu de GBM est signifïcativement différent de celui dans un tissu sain.
Dans cette méthode selon l'invention, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite, - lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
Dans cette méthode selon l'invention, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la méthode consiste à utiliser un jeu de miARNs comprenant au moins deux miARNs spécifiques.
Les niveaux d'expression de susdits miARNs mesurés dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter un ODG ou un GBM sont comparés respectivement avec ceux mesurés dans un tissu sain de référence, dans un tissu de GBM de référence et dans un tissu d'ODG de référence.
Cette méthode de diagnostic in vitro selon l'invention, comprend :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs,
- un premier miARN choisi dans le groupe A,
- un deuxième miARN choisi dans le groupe B,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence, et un tissu de GBM de référence.
Le niveau d'expression d'un miARN appartenant au groupe A dans un tissu de GBM est signifïcativement différent de celui dans un tissu d'ODG Dans cette méthode, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du deuxième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas 5 fois supérieurs ou 5 fois inférieurs à ceux mesurés dans un tissu de GBM de référence.
Plus particulièrement, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du deuxième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne présentent respectivement qu'une différence inférieure à 20% par rapport à ceux mesurés dans un tissu de GBM de référence.
Dans cette méthode, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence, et - lorsque les niveaux d'expression du premier et du deuxième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas 5 fois supérieurs ou 5 fois inférieurs à ceux mesurés dans un tissu d'ODG de référence.
Plus particulièrement, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du deuxième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne présentent respectivement qu'une différence inférieure à 20% par rapport à ceux mesurés dans un tissu d'ODG de référence. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'étape (i) de la susdite méthode comprend en outre la mesure du niveau d'expression d'un troisième miARN choisi dans le groupe C ou D, constitué de hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR- 1301, hsa-miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR- 1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-139-3p, hsa-miR-139-5p et hsa-miR-199a-3p , dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales.
Ce groupe de miARNs, dont le niveau d'expression dans un tissu d'ODG ou dans un GBM est signifîcativement différent de celui dans un tissu sain, permet d'indiquer la présence d'un gliome dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter un gliome.
Plus particulièrement, cette méthode de diagnostic in vitro selon l'invention, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression d'au moins trois miARNs,
- au moins un premier miARN choisi dans le groupe A,
- au moins un deuxième miARN choisi dans le groupe B, et
- au moins un troisième miARN choisi dans le groupe C ou D (ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le troisième miARN utilisé dans la méthode selon l'invention est choisi dans le groupe C, à savoir parmi hsa-miR-424- star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR-1301, hsa-miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR- 770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-139-3p, hsa-miR-139-5p.
Dans cette méthode, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence,
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du deuxième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas au moins 5 fois supérieurs ou 5 fois inférieurs à ceux mesurés dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
Plus particulièrement, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence, - lorsque les niveaux d'expression du premier et du deuxième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne présentent qu'une différence inférieure à 20% par rapport à ceux mesurés dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miAR mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
En revanche, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est respectivement 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression des premiers, deuxièmes et troisièmes miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas au moins 5 fois supérieurs ou 5 fois inférieurs à ceux mesurés dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
Plus particulièrement, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est respectivement 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression des premiers, deuxièmes et troisièmes miARNs mesurés dans ledit échantillon ne présentent qu'une différence inférieure à 20% par rapport à ceux mesurés dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le troisième miARN utilisé dans la méthode selon l'invention ci-dessus est choisi dans le groupe D, à savoir hsa-miR- 199a-3p.
Dans cette méthode, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, - lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence,
- lorsque les niveaux d'expression des premiers, deuxièmes et troisièmes miARNs mesurés dans ledit échantillon ne présentent ne sont pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à ceux mesurés dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence.
Plus particulièrement, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence,
- lorsque les niveaux d'expression des premiers, deuxièmes et troisièmes miARNs mesurés dans ledit échantillon ne présentent qu'une différence inférieure à 20% par rapport à ceux mesurés dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence.
En revanche, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est respectivement 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et - lorsque le niveau d'expression du deuxième miAR mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression des premiers, deuxièmes et troisièmes miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à ceux mesurés dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à ceux mesurés dans un tissu sain de référence et dans un tissu d'ODG de référence.
Plus particulièrement, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est respectivement 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du troisième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne présentent qu'une différence inférieure à 20% par rapport à ceux mesurés dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à ceux mesurés dans un tissu sain de référence et dans un tissu d'ODG de référence.
Plus particulièrement, étant donné que les niveaux d'expression de hsa-miR-199a-3p dans un tissu d'ODG, un tissu de GBM et un tissu sain sont signifïcativement différents entre eux, le dosage de ce seul miARN permettrait de confirmer que le tissu est tumoral ou non et permettrait de plus de spécifier que le gliome est soit un ODG soit un GBM.
Une méthode de diagnostic particulière d'une tumeur cérébrale appartenant au groupe constitué de 2 types de tumeurs : ODG, GBM, et d'identification du type de la tumeur, consiste à utiliser le miARN hsa-miR-199a-3p seul.
Cette méthode comprend :
(i) la mesure du niveau d'expression de hsa-miR-199a-3p, dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, (ii) la comparaison du niveau d'expression du susdit miARN mesuré dans l'échantillon provenant du susdit patient avec celui du susdit miARN mesuré dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence, et un tissu de GBM de référence. Dans cette méthode, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant dudit patient est faite,
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence, et
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence.
Plus particulièrement, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant dudit patient est faite,
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence, et
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon ne présente qu'une différence inférieure à 20% par rapport à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence.
Dans cette méthode, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant dudit patient est faite,
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence.
Plus particulièrement, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant dudit patient est faite,
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et * lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
* lorsque le niveau d'expression dudit miARN dans ledit échantillon ne présente qu'une différence inférieure à 20% par rapport à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence.
L'invention est illustrée davantage par les figures et exemples donnés ci-dessous. Le mode de réalisation de la présente invention n'est, en aucun cas, limité à ces figures et exemples.
Figures
Figure 1 : la figure 1 illustre respectivement les profils des niveaux d'expression de hsa-miR-21-star et de hsa-miR- 135a- star dans un tissu sain de référence (N) représenté par point noir, dans un tissu d'ODG de référence (ODG) représenté par triangle noir et dans un tissu de GBM de référence (GBM) représenté par carré noir. L'axe des ordonnées représente la valeur absolue de miARN mesuré dans un tissu.
Figure 2 : la figure 2 illustre respectivement les profils des niveaux d'expression de hsa-miR-21-star et de hsa-miR- 135a- star dans un échantillon numéro 1 représenté par triangle noir, dans un échantillon numéro 2 représenté par point noir et dans un échantillon numéro 3 représenté par carré noir. L'axe des ordonnées représente la valeur absolue de miARN mesuré dans un tissu.
Figure 3 : la figure 3 présente respectivement les profils des niveaux d'expression de hsa-miR- 146b-5p, hsa-miR-99a-star et hsa-miR-328 dans un tissu sain de référence (N) représenté par point noir, dans un tissu d'ODG de référence (ODG) représenté par triangle noir et dans un tissu de GBM de référence (GBM) représenté par carré noir. L'axe des ordonnées représente la valeur absolue de miARN mesuré dans un tissu.
Figure 4 : la figure 4 présente respectivement les profils des niveaux d'expression de hsa-miR- 146b-5p, hsa-miR-99a-star et hsa-miR-328 dans un échantillon numéro 4 représenté par triangle noir, dans un échantillon numéro 5 représenté par carré noir et dans un échantillon numéro 6 représenté par point noir. L'axe des ordonnées représente la valeur absolue de miARN mesuré dans un tissu.
Figure 5 : la figure 5 présente respectivement les profils des niveaux d'expression de hsa-miR-424-star, hsa-miR- 1301, hsa-miR- 199a-5p et hsa-miR-99a-star dans un tissu sain de référence (N) représenté par point noir, dans un tissu d'ODG de référence (ODG) représenté par triangle noir et dans un tissu de GBM de référence (GBM) représenté par carré noir. L'axe des ordonnées représente la valeur absolue de miAR mesuré dans un tissu.
Figure 6 : la figure 6 illustre respectivement les profils des niveaux d'expression de hsa-miR-424-star, hsa-miR-1301, hsa-miR-199a-5p et hsa-miR-99a-star un échantillon numéro 7 représenté par triangle noir, dans un échantillon numéro 8 représenté par carré noir et dans un échantillon numéro 9 représenté par point noir. L'axe des ordonnées représente la valeur absolue de miARN mesuré dans un tissu.
Exemples
Exemple 1 : Matériel et Méthodes
Cet exemple illustre les méthodes préférées des inventeurs mais ne constitue liste exhaustive des méthodes utilisables pour la réalisation de l'invention. 1.1 Echantillons tumoraux
Les échantillons tumoraux de glioblastomes, oligodendrogliomes et méningiomes ainsi que les échantillons de tissu sain (cortectomies) sont obtenus après exérèse par les neurochirurgiens au bloc opératoire du CHU de Grenoble et sont immédiatement congelés à - 80°C. Des coupes de tissu d'environ 40μιη d'épaisseur sont ensuite réalisées à l'aide d'un cryotome en nombre suffisant afin d'obtenir environ 80mg de tissu et conservées à -80°C jusqu'à extraction des ARN.
1.2 Liquides biologiques
Pour la purification des microARNs circulants dans le sang, des échantillons sanguins sont prélevés chez les patients sur des tubes de prélèvement de type PAXGene Blood RNA (PreAnalytix- Qiagen - BD company). La lyse totale des cellules circulantes est réalisée et les ARN sont collectés par centrifugation et purifiés selon les indications du fournisseur. En ce qui concerne les fractions de microARN contenus dans les microvésicules produites par les tumeurs et présentes dans le sang, la méthode utilisée est directement basée sur celle décrite par Skog et coll (Skog J, Wùrdinger T, van Rijn S, Meijer DH, Gainche L, Sena-Esteves M, Curry WT Jr, Carter BS, Krichevsky AM, Breakefield XO. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. (Skog et coll,, Nat Cell Biol. 2008 Dec;10(12): 1470-6. Epub 2008 Nov 16). Les microvésicules sont purifiées à partir des sérums par centrifugations et micro fîltration. Les sérums sont centrifugés une première fois pendant 10 min à 300g, puis les surnageants sont ensuite centrifugés pendant 20 min à 17000g et filtrés sur filtre de 0,22 microns. Les micro vésicules sont obtenues par ultracentrifugation du filtrat à 110000g pendant 70 min. Le culot est enfin resuspendu en tampon phosphate (PBS) et les ARN sont extraits selon le protocole décrit ci-après.
1.3 Extraction d'ARN
Les ARN sont extraits grâce au kit hsa-miRVana™ (Ambion, ABI) permettant de séparer les ARN longs (taille > 25 Ont) des ARN courts (taille < 25 Ont) en suivant les recommandations du fournisseur. Brièvement, le tissu est tout d'abord lysé, les ARN sont ensuite précipités après ajout d'acétate de sodium et d'éthanol, extraits en présence d'un mélange phénol / chloroforme, séparés selon leur taille sur colonnes chromatograpiques puis élués. Les ARN élués sont ensuite quantifiés par mesure de la DO à 260nm à l'aide du spectrophotomètre Nanodrop ND-1000 et un contrôle qualité de ces ARN est réalisé par migration électrophorétique dans un gel de polymère sur le Bio Analyser 2100 grâce au kit RNA 6000 nano LabChip® (Agilent).
1.4 Dosage des miARNs par hybridation sur puce à ADN
Les ARN courts (taille inférieure à 250 bases) obtenus à l'étape précédente sont utilisés pour l'analyse par hybridation sur puce à ADN GeneChip miRNA Affymetrix.
La première étape consiste à ajouter une extrémité poly-A en position 3' des ARN. La seconde étape consiste à réaliser le marquage des ARN. Pour cela, une réaction de ligature va être faite pour ajouter aux ARN de l'ADN biotinylé (par exemple avec les réactifs de marquage et détection du kit Flash Tag HSR de chez Genisphere, Hatfield, USA). Une fois cette étape réalisée, l'hybridation pourra avoir lieu avec les sondes se trouvant sur la puce. Après l'hybridation, il y a une étape d'amplification du marquage puis des lavages qui sont faits avant que la puce ne soit scannée. Enfin la puce sera scannée et on obtient une image de chaque puce qui devra être traitée pour avoir une valeur d'intensité correspondant à l'hybridation ARN/Sonde pour chaque micro ARN. Les données sont ensuite traitées et normalisées avec le logiciel QC Tools selon les méthodes proposées par Irizarry et al (RA. Irizarry, B Hobbs, F Collin, Y D. Beazer-Barclay, K J. Antonellis, U Scherf and T P. Speed. Exploration, Normalization, and Summaries of High Density Oligonucleotide Array Probe Level Data. Biostatistics, April 2003; Vol. 4; Number 2: 249-264). Alternativement, les résultats peuvent aussi être générés par dosage par RT-Q-PCR, tout autre type de puce à ADN d'un quelconque fournisseur ou toute autre méthode de dosage. Les analyses peuvent être réalisées sur les liquides biologiques (sang ou sous-fraction par exemple).
1.5 Dosage des miARNs par PCR en temps réel
L'expression de miARNs est quantifiée par la technique de PCR quantitative à l'aide des kits distribués par Applied Biosystems, spécifiques des miARNs matures. Dans un premier temps, 80ng dARNs courts sont inversement transcrits (en cDNA monobrin) en présence d'amorces en boucle, qui confèrent la spécificité pour la quantification de l'expression des miARNs matures. La PCR en temps réel est ensuite réalisée à l'aide des amorces fournies dans les kits. Une des amorces comporte des groupements fluorescents (sonde dite Taqman@) ce qui permet de réaliser une mesure quantitative en utilisant un fluorimètre adapté tel que la station Stratagene Mx3005. Le seuil de détection est déterminé dans un premier temps par l'utilisateur en début de phase exponentielle. La valeur de Ct correspond au nombre de cycles à partir duquel la fluorescence dépasse ce seuil de détection. Cette valeur de Ct est proportionnelle à la quantité de cDNA présent initialement dans l'échantillon. En l'absence de gamme-étalon spécifique pour chaque cDNA, seule une quantification relative entre échantillons est possible. Les valeurs de dosage pour chaque miARN sont normalisées avec les données obtenues pour un ARN non-codant, RNU24.
Exemple 2
Un balayage sur 847 miARNs humains permet de repérer 28 miARNs dont les niveaux d'expression sont modifiés dans au moins un type de tumeur appartenant au groupe constitué d'ODG, et GBM. Le tableau 2 ci-dessous présente les niveaux d'expression de ces 28 miARNs mesurés respectivement dans un tissu sain de référence (N), un tissu d'oligodendrogliomes de référence (ODG), et un tissu de glioblastomes de référence (GBM), ainsi que les ratios des niveaux d'expression GBM/N, OGD/N et GBM/ODG. O
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E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E Έ Exemple 3
Les niveaux d'expression de 2 miARNs, à savoir hsa-miR-21-star et hsa-miR-135a- star, sont mesurés respectivement dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence selon la méthode décrite dans les exemples 1.3, 1.4 et 1.5 ci-dessus.
Les niveaux d'expression de ces deux miARNs sont également mesurés dans trois échantillons provenant des patients suspectés de présenter un oligodendrogliome ou un glioblastome.
Les tissus de référence ainsi que les échantillons provenant des patients sont prélevés selon l'exemple 1.1 ci-dessus. Le caractère tumoral du tissu d'ODG de référence et du tissu de GBM de référence est confirmé par d'autres méthodes de diagnostic connues de l'homme du métier.
Le miARN hsa-miR-21-star appartenant au groupe A, est surexprimé dans un tissu de glioblastome, alors que son niveau d'expression dans un tissu d'oligodendrogliome n'est pas signifïcativement différent de celui dans un tissu sain. Un niveau d'expression élevé de ce miARN dans un tissu permet d'indiquer la présence d'un glioblastome dans ce tissu.
Le miARN hsa-miR-135a-star appartenant au groupe B, est surexprimé dans un tissu d'oligodendrogliome, alors que son niveau d'expression dans un tissu de glioblastome n'est pas signifïcativement différent de celui dans un tissu sain. Un niveau d'expression élevé de ce miARN dans un tissu permet d'indiquer la présence d'un oligodendrogliome dans ce tissu.
Les profils des niveaux d'expression de ces deux miARNs dans les trois tissus de référence sont établis à partir des valeurs absolues des niveaux d'expression de ces deux miARNs mesurés dans les trois tissus de référence (Figure 1).
Les profils des niveaux d'expression de ces deux miARNs dans trois échantillons provenant des patients sont établis à partir des valeurs absolues des niveaux d'expression de ces deux miARNs mesurés dans ces trois échantillons (Figure 2). Diagnostic de l'échantillon numéro 1
Le niveau d'expression de hsa-miR-21-star mesuré dans l'échantillon numéro 1 n'est pas signifïcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence et dans le tissu d'ODG de référence, mais est signifïcativement différent de celui mesuré dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats signifient que l'échantillon numéro 1 n'est pas un glioblastome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-135a-star mesuré dans l'échantillon numéro 1 est signifîcativement plus élevé que ceux mesurés dans le tissu sain de référence et dans le tissu de GBM de référence. Ceci signifie la présence d'un oligodendrogliome dans l'échantillon numéro 1.
La combinaison de tous ces résultats permet de diagnostiquer la présence d'oligodendrogliome dans l'échantillon 1. Diagnostic de l'échantillon numéro 2
Le niveau d'expression de hsa-miR-21-star mesuré dans l'échantillon numéro 2 n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence et dans le tissu d'ODG de référence, mais est signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats signifient que l'échantillon numéro 2 n'est pas un glioblastome.
Le niveau d'expression de hsa-miR- 135a- star mesuré dans l'échantillon numéro 2 n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence ou dans un tissu de GBM de référence, mais est signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu d'ODG de référence. Ceci signifie que l'échantillon numéro 2 n'est pas un oligodendrogliome.
La combinaison de tous ces résultats permet de diagnostiquer que l'échantillon numéro 2 est un tissu normal.
Diagnostic de l'échantillon numéro 3
Le niveau d'expression de hsa-miR-21-star mesuré dans l'échantillon numéro 3 est signifîcativement plus élevé que ceux mesurés dans le tissu sain de référence ou le tissu d'ODG de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats montrent que l'échantillon numéro 3 est probablement un glioblastome.
Le niveau d'expression de hsa-miR- 135a- star mesuré dans l'échantillon numéro 3 n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence, mais signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu d'oligodentrogliome de référence. Ceci montre que l'échantillon numéro 1 n'est pas un oligodendrogliome. La combinaison de tous ces résultats permet de diagnostiquer la présence de glioblastome dans l'échantillon numéro 3.
Exemple 4
Les niveaux d'expression de trois miARNs, à savoir hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-99a- star, et hsa-miR-328, sont mesurés respectivement dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence selon la méthode décrite dans les exemples 1.3, 1.4 et 1.5 ci-dessus.
Les niveaux d'expression de ces deux miARNs sont également mesurés dans trois échantillons provenant des patients suspectés de présenter un oligodendrogliome ou un glioblastome.
Les tissus de référence ainsi que les échantillons provenant des patients sont prélevés selon l'exemple 1.1 ci-dessus. Le caractère tumoral du tissu d'ODG de référence et du tissu de GBM de référence est confirmé par d'autres méthodes de diagnostic connues de l'homme du métier.
Le miARN hsa-miR-146b-5p appartenant au groupe A, est surexprimé dans un tissu de glioblastome, alors que son niveau d'expression dans un tissu d'oligodendrogliome n'est pas signifïcativement différent de celui dans un tissu sain. Un niveau d'expression élevé de ce miARN dans un tissu permet d'indiquer la présence d'un glioblastome dans ce tissu.
Le miARN hsa-miR-99a-star appartenant au groupe B, est surexprimé dans un tissu d'oligodendrogliome, alors que son niveau d'expression dans un tissu de glioblastome n'est pas signifïcativement différent de celui dans un tissu sain. Un niveau d'expression élevé de ce miARN dans un tissu permet d'indiquer la présence d'un oligodendrogliome dans ce tissu.
Le miARN hsa-miR-328 appartenant au groupe C, est sous-exprimé à la fois dans un tissu de glioblastome et dans un tissu d'oligodendrogliome par rapport au tissu sain. Un niveau d'expression très faible de ce miARNs dans un tissu permet d'indiquer la présence d'un gliome dans ce tissu.
Les profils des niveaux d'expression de ces trois miARNs dans les trois tissus de référence sont établis à partir des valeurs absolues des niveaux d'expression de ces trois miARNs mesurés dans les trois tissus de référence (Figure 3).
Les profils des niveaux d'expression de ces trois miARNs dans trois échantillons provenant des patients sont établis à partir des valeurs absolues des niveaux d'expression de ces trois miARNs mesurés dans ces trois échantillons (Figure 4). Diagnostic de l'échantillon numéro 4
Le niveau d'expression de hsa-miR-146b-5p mesuré dans l'échantillon numéro 4 n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence et dans le tissu d'ODG de référence, mais est signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats signifient que l'échantillon numéro 4 n'est pas un glioblastome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-99a-star mesuré dans l'échantillon numéro 4 est signifîcativement plus élevé que ceux mesurés dans le tissu sain de référence et dans le tissu de GBM de référence. Ceci signifie la présence d'un oligodendrogliome dans l'échantillon numéro 4.
Le niveau d'expression de hsa-miR-328 mesuré dans l'échantillon numéro 4 est signifîcativement plus faible que celui mesuré dans le tissu sain de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu d'ODG de référence ou dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats indiquent que l'échantillon numéro 4 n'est pas un tissu normal, mais très probablement présente un caractère tumoral de type glial.
La combinaison de tous ces résultats permet de diagnostiquer la présence d'un oligodendrogliome dans l'échantillon 4.
Diagnostic de l'échantillon numéro 5
Le niveau d'expression de hsa-miR-146b-5p mesuré dans l'échantillon numéro 5 est signifîcativement plus élevé que ceux mesurés dans le tissu sain de référence ou le tissu d'ODG de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats montrent que l'échantillon numéro 5 est probablement un glioblastome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-99a-star mesuré dans l'échantillon numéro 5 n'est pas signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu sain de référence, mais est signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu d'ODG de référence. Ceci montre que l'échantillon numéro 5 n'est pas un oligodendrogliome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-328 mesuré dans l'échantillon numéro 5 est signifîcativement plus faible que celui mesuré dans le tissu sain de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu d'ODG de référence ou dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats indiquent que l'échantillon numéro 5 n'est pas un tissu normal, mais très probablement présente un caractère tumoral de type glial. La combinaison de tous ces résultats permet de diagnostiquer la présence de glioblastome dans l'échantillon numéro 5.
Diagnostic de l'échantillon numéro 6
Le niveau d'expression de hsa-miR-146b-5p mesuré dans l'échantillon numéro 6 n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence et dans le tissu d'ODG de référence, mais est signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats signifient que l'échantillon numéro 6 n'est pas un glioblastome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-99a-star mesuré dans l'échantillon numéro 6 n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence ou dans un tissu de GBM de référence, mais est signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu d'ODG de référence. Ceci signifie que l'échantillon numéro 6 n'est pas un oligodendrogliome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-328 mesuré dans l'échantillon numéro 6 est signifîcativement plus élevé que ceux mesurés dans le tissu d'ODG de référence ou dans le tissu de GBM de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu sain de référence. Ces résultats indiquent que l'échantillon numéro 6 est un tissu normal, et ne présente pas de caractère tumoral de type glial.
La combinaison de tous ces résultats permet de diagnostiquer que l'échantillon 6 est un tissu normal.
Exemple 5
Les niveaux d'expression de quatre miARNs, à savoir hsa-miR-424-star, hsa-miR- 1301, hsa-miR199a-5p et hsa-miR-99a-star, sont mesurés respectivement dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence selon la méthode décrite dans les exemples 1.3, 1.4 et 1.5 ci-dessus.
Les niveaux d'expression de ces deux miARNs sont également mesurés dans trois échantillons provenant des patients suspectés de présenter un oligodendrogliome ou un glioblastome.
Les tissus de référence ainsi que les échantillons provenant des patients sont prélevés selon l'exemple 1.1 ci-dessus. Le caractère tumoral du tissu d'ODG de référence et du tissu de GBM de référence est confirmé par d'autres méthodes de diagnostic connues de l'homme du métier. Le miARN hsa-miR199a-5p appartenant au groupe A, est surexprimé dans un tissu de glioblastome, alors que son niveau d'expression dans un tissu d'oligodendrogliome n'est pas signifîcativement différent de celui dans un tissu sain. Un niveau d'expression élevé de ce miARN dans un tissu permet d'indiquer la présence d'un glioblastome dans ce tissu.
Le miARN hsa-miR-99a-star appartenant au groupe B, est surexprimé dans un tissu d'oligodendrogliome, alors que son niveau d'expression dans un tissu de glioblastome n'est pas signifîcativement différent de celui dans un tissu sain. Un niveau d'expression élevé de ce miARN dans un tissu permet d'indiquer la présence d'un oligodendrogliome dans ce tissu.
Le miARN hsa-miR-424-star, appartenant au groupe C, est surexprimé à la fois dans un tissu de glioblastome et dans un tissu d'oligodendrogliome. Un niveau d'expression élevé de ce miARNs dans un tissu permet d'indiquer la présence d'un gliome dans ce tissu.
Le miARN hsa-miR-1301, appartenant au groupe C, est sous-exprimé à la fois dans un tissu de glioblastome et dans un tissu d'oligodendrogliome. Un niveau d'expression très faible de ce miARNs dans un tissu signifie la présence d'un gliome dans ce tissu.
Les profils des niveaux d'expression de ces quatre miARNs dans les trois tissus de référence sont établis à partir des valeurs absolues des niveaux d'expression de ces deux miARNs mesurés dans les trois tissus de référence (Figure 5).
Les profils des niveaux d'expression de ces quatre miARNs dans les trois échantillons provenant des patients sont établis à partir des valeurs absolues des niveaux d'expression de ces deux miARNs mesurés dans ces trois échantillons (Figure 6).
Diagnostic de l'échantillon numéro 7
Le niveau d'expression de hsa-miR199a-5p mesuré dans l'échantillon numéro 7 n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence et dans le tissu d'ODG de référence, mais est signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats signifient que l'échantillon numéro 7 n'est pas un glioblastome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-99a-star mesuré dans l'échantillon numéro 7 est signifîcativement plus élevé que ceux mesurés dans le tissu sain de référence et dans le tissu de GBM de référence. Ceci signifie la présence d'un oligodendrogliome dans l'échantillon numéro 7.
Le niveau d'expression hsa-miR-1301 mesuré dans l'échantillon numéro 7 est signifîcativement plus faible que celui mesuré dans le tissu sain de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu d'ODG de référence ou dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats indiquent que l'échantillon numéro 7 n'est pas un tissu normal, mais très probablement présente un caractère tumoral de type glial.
Le niveau d'expression hsa-miR-424-star mesuré dans l'échantillon numéro 7 est signifîcativement plus élevé que celui mesuré dans le tissu sain de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu d'ODG de référence ou dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats indiquent que l'échantillon numéro 7 n'est pas un tissu normal, mais très probablement présente un caractère tumoral de type glial.
La combinaison de tous ces résultats permet de diagnostiquer la présence d'un oligodendrogliome dans l'échantillon 7.
Diagnostic de l'échantillon numéro 8
Le niveau d'expression de hsa-miR199a-5p mesuré dans l'échantillon numéro 8 est signifîcativement plus élevé que ceux mesurés dans le tissu sain de référence ou le tissu d'ODG de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats montrent que l'échantillon numéro 8 est probablement un glioblastome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-99a-star mesuré dans l'échantillon numéro 8 n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence et le tissu de GBM de référence, mais est signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu d'ODG de référence. Ceci montre que l'échantillon numéro 8 n'est pas un oligodendrogliome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-1301 mesuré dans l'échantillon numéro 8 est signifîcativement plus faible que celui mesuré dans le tissu sain de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu d'ODG de référence ou dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats indiquent que l'échantillon numéro 8 n'est pas un tissu normal, mais très probablement présente un caractère tumoral de type glial.
Le niveau d'expression hsa-miR-424-star mesuré dans l'échantillon numéro 8 est signifîcativement plus élevé que celui mesuré dans le tissu sain de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu d'ODG de référence ou dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats indiquent que l'échantillon numéro 8 n'est pas un tissu normal, mais très probablement présente un caractère tumoral de type glial.
La combinaison de tous ces résultats permet de diagnostiquer la présence de glioblastome dans l'échantillon numéro 8.
Diagnostic de l'échantillon numéro 9 Le niveau d'expression de hsa-miR199a-5p mesuré dans l'échantillon numéro 9 n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence et dans le tissu d'ODG de référence, mais est signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu de GBM de référence. Ces résultats signifient que l'échantillon numéro 9 n'est pas un glioblastome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-99a-star mesuré dans l'échantillon numéro 9 n'est pas signifîcativement différent de ceux mesurés dans le tissu sain de référence ou dans un tissu de GBM de référence, mais est signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu d'ODG de référence. Ceci signifie que l'échantillon numéro 9 n'est pas un oligodendrogliome.
Le niveau d'expression de hsa-miR-1301 mesuré dans l'échantillon numéro 9 est signifîcativement plus élevé que ceux mesurés dans le tissu d'ODG de référence ou dans le tissu de GBM de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu sain de référence. Ces résultats indiquent que l'échantillon numéro 9 est un tissu normal, et ne présente pas de caractère tumoral de type glial.
Le niveau d'expression de hsa-miR-424-star mesuré dans l'échantillon numéro 9 est signifîcativement plus faible que ceux mesurés dans le tissu d'ODG de référence ou dans le tissu de GBM de référence, mais n'est pas signifîcativement différent de celui mesuré dans le tissu sain de référence. Ces résultats indiquent que l'échantillon numéro 9 est un tissu normal, et ne présente pas de caractère tumoral de type glial.
La combinaison de tous ces résultats permet de diagnostiquer que l'échantillon 9 est un tissu normal.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de diagnostic in vitro d'une tumeur cérébrale appartenant au groupe constitué de 2 types de tumeurs : ODG, GBM, et d'identification du type de la tumeur, comprenant :
(i) la mesure des niveaux d'expression d'au moins un premier et un deuxième miARNs appartenant respectivement à deux groupes de miARNs différents faisant partie d'un ensemble de 3 groupes de miARNs, dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales :
- le groupe 1 étant constitué de hsa-miR-200c, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-21-star, hsa-miR- 146b-5p et hsa-miR-31 ,
- le groupe 2 étant constitué de parmi hsa-miR- 135a- star, hsa-miR-99a-star, hsa-miR- 382, hsa-miR-409-3p et hsa-miR-191-star,
- le groupe 3 étant constitué hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR- 1301, hsa-miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR- 1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR- 129-5p, hsa-miR- 139-3p, hsa-miR-139-5p et hsa-miR- 199a-3p,
- les deux susdits miARNs n'appartenant pas au même groupe,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans au moins un type du tissu de référence choisi parmi le groupe constitué d'au moins un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
2. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 1, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs,
- un premier miARN choisi dans l'un des trois groupes de miARNs,
* le groupe 1 étant constitué de hsa-miR-200c, hsa-miR- 199a-5p, hsa-miR-21-star, hsa-miR- 146b-5p et hsa-miR-31 ,
* le groupe 2 étant constitué de hsa-miR- 135a- star, hsa-miR-99a-star, hsa-miR-382, hsa-miR-409-3p et hsa-miR- 191 -star,
* le groupe 3 étant constitué de hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa- miR-1301, hsa-miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa- miR-1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR- 129-5p, hsa-miR- 139-3p, hsa-miR-139-5p et hsa-miR- 199a-3p, - un deuxième miAR choisi dans l'un des trois susdits groupes,
- les deux susdits miARNs n'appartenant pas au même groupe,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence.
3. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 2, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs,
- d'un premier miARN choisi dans le groupe 1, et
- d'un deuxième miARN choisi dans le groupe 2,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence.
4. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 3, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs,
- le premier miARN étant choisi dans le groupe 1 ,
- le deuxième miARN étant choisi dans le groupe 2,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence,
(iii) - la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs étant faite
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit miARN mesuré dans un tissu sain de référence,
- la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs étant faite * lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui du susdit miARN mesuré dans un tissu sain de référence.
5. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 2, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs,
- le premier miARN étant choisi dans le groupe 3,
- le deuxième miARN étant choisi dans le groupe 1 ,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence,
(iii) - la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs étant faite
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit premier miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit deuxième miARN mesuré dans un tissu sain de référence,
- la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs étant faite
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit premier miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui du susdit deuxième miARN mesuré dans un tissu sain de référence.
6. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 2, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de deux miARNs, - le premier miARN étant choisi dans le groupe 3, et
- le deuxième miARN étant choisi dans le groupe 2,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence,
(iii) la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs étant faite
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit premier miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est également au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit 2eme miARN mesuré dans un tissu sain de référence,
- la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs étant faite
* lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit premier miARN mesuré dans un tissu sain de référence, et
* lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui du susdit deuxième miARN mesuré dans un tissu sain de référence.
7. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 1, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression de trois miARNs,
- d'un premier miARN choisi dans le groupe 1,
- d'un deuxième miARN choisi dans le groupe 2, et
- d'un troisième miARN choisi dans le groupe 3,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence.
8. Méthode selon la revendication 7, dans laquelle la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite, - lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et - lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
9. Méthode selon la revendication 7, dans laquelle la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite, - lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
10. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 1 , comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression d'au moins deux miARNs,
- un premier miARN choisi dans le groupe 1 ,
- un deuxième miARN choisi dans le groupe 2,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence, et un tissu de GBM de référence.
11. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 10, dans laquelle la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et - lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du deuxième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à ceux mesurés dans un tissu de GBM de référence.
12. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 10, dans laquelle la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du deuxième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas au moins 5 fois supérieurs ou 5 fois inférieurs à ceux mesurés dans un tissu d'ODG de référence.
13. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 10, dans la quelle l'étape (i) comprend en outre la mesure du niveau d'expression d'un miARN choisi dans le groupe 3.
14. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 13, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression d'au moins trois miARNs,
- au moins un premier miARN choisi dans le groupe 1,
- au moins un deuxième miARN choisi dans le groupe 2, et
- au moins un troisième miARN choisi dans le groupe 3,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
15. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 14, comprenant : (i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression d'au moins trois miARNs,
- au moins un premier miARN choisi dans le groupe 1,
- au moins un deuxième miARN choisi dans le groupe 2, et
- au moins un troisième miARN choisi dans le groupe 4, un sous groupe du groupe 3, le groupe 4 étant constitué de hsa-miR-424-star, hsa-miR-503, hsa-miR-132, hsa-miR-1301, hsa-miR-1231, hsa-miR-328, hsa-miR-1180, hsa-miR-149, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-1280, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-431-star, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-129-5p, hsa- miR-139-3p, hsa-miR-139-5p,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
16. Méthode selon la revendication 15, dans laquelle :
(i) la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence,
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du deuxième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à ceux mesurés dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence ; ou
(ii) la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est respectivement 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et - lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du troisième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à ceux mesurés dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
17. Méthode selon la revendication 14, comprenant :
(i) la mesure dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, des niveaux d'expression d'au moins trois miARNs,
- au moins un premier miARN choisi dans le groupe 1,
- au moins un deuxième miARN choisi dans le groupe 2, et
- au moins un troisième miARN choisi dans le groupe 5, un sous groupe du groupe 3, le groupe 5 étant constitué de hsa-miR-199a-3p,
(ii) la comparaison des niveaux d'expression des susdits miARNs mesurés dans l'échantillon provenant du susdit patient avec ceux des susdits miARNs mesurés dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
18. Méthode selon la revendication 17, dans laquelle :
(i) la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et - lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence,
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du deuxième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à ceux mesurés dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et au moins 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu de GBM de référence ; (ii) la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite,
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est respectivement 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du deuxième miARN mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du premier miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque les niveaux d'expression du premier et du troisième miARNs mesurés dans ledit échantillon ne sont pas au moins 5 fois supérieur ou 5 fois inférieur à ceux mesurés dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le niveau d'expression du troisième miARN mesuré dans ledit échantillon est au moins 5 fois supérieur à ceux mesurés dans un tissu sain de référence et dans un tissu d'ODG de référence.
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