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WO2011105507A1 - 細胞分析装置 - Google Patents

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WO2011105507A1
WO2011105507A1 PCT/JP2011/054174 JP2011054174W WO2011105507A1 WO 2011105507 A1 WO2011105507 A1 WO 2011105507A1 JP 2011054174 W JP2011054174 W JP 2011054174W WO 2011105507 A1 WO2011105507 A1 WO 2011105507A1
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WO
WIPO (PCT)
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cell
cells
flow path
sample
image
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2011/054174
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English (en)
French (fr)
Inventor
英之 寺薗
安田　賢二
真人 林
弘之 竹井
服部　明弘
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ON-CHIP CELLOMICS CONSORTIUM Co Ltd
Kanagawa Academy of Science and Technology
Tokyo Medical and Dental University NUC
ON CHIP CELLOMICS CONSORTIUM CO Ltd
Original Assignee
ON-CHIP CELLOMICS CONSORTIUM Co Ltd
Kanagawa Academy of Science and Technology
Tokyo Medical and Dental University NUC
ON CHIP CELLOMICS CONSORTIUM CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by ON-CHIP CELLOMICS CONSORTIUM Co Ltd, Kanagawa Academy of Science and Technology, Tokyo Medical and Dental University NUC, ON CHIP CELLOMICS CONSORTIUM CO Ltd filed Critical ON-CHIP CELLOMICS CONSORTIUM Co Ltd
Priority to JP2012501858A priority Critical patent/JP5807004B2/ja
Priority to US13/261,410 priority patent/US9023294B2/en
Publication of WO2011105507A1 publication Critical patent/WO2011105507A1/ja
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis

Definitions

  • the present invention relates to a cell analyzer.
  • cell differentiation 1) Visual morphological cell classification: For example, examination of bladder cancer and urethral cancer by examination of atypical cells appearing in urine, classification of atypical cells in blood, cancer examination by cytology in tissues, etc. Can give. 2) Cell classification by cell surface antigen (marker) staining by the fluorescent antibody method: Cell surface antigens generally called CD markers are stained with a specific fluorescently labeled antibody. Cell sorting by cell sorters, flow cytometers and tissues Used for cancer screening by staining. Of course, these are widely used not only for medical purposes but also for cell physiology research and industrial cell utilization.
  • stem cells containing stem cells are roughly separated using a fluorescent dye incorporated into the cells as a reporter, and then the target stem cells are separated by actually culturing. This is because an effective marker for stem cells has not yet been established, and the target cells are substantially separated by using only those actually cultured and differentiated.
  • Such separation and recovery of specific cells in the culture medium is an important technique in biological and medical analysis.
  • the cells When the cells are separated based on the difference in specific gravity of the cells, they can be separated by a velocity sedimentation method. However, if there is almost no difference in specific gravity between cells that distinguishes unsensitized cells from sensitized cells, the cells are separated one by one based on information stained with fluorescent antibodies or visual information. There is a need to.
  • the cell sorter isolates and drops cells after fluorescence staining in a charged droplet in units of one cell, and based on the presence or absence of fluorescence in the droplet and the amount of light scattering, In the process of dropping, a high electric field is applied in any direction in the normal direction to the direction of drop, and the drop direction of the drop is controlled and fractionated into multiple containers placed underneath.
  • Non-patent document 1 Kamarck, ME, Methods Enzymol. Vol. 151, p150-165 1987 (1987)).
  • the cell sorter created using this microfabrication technique has a slow response speed of sample separation to the observation means, and in order to put it to practical use, a separation processing method that does not damage the sample and has a faster response is required. there were.
  • the separation efficiency of the device cannot be sufficiently increased even at a dilute cell concentration. If the sample is concentrated in a separate device, it is not only difficult to recover the concentrated solution without loss, but it is also desirable for regenerative medicine where cells are contaminated in a complicated pretreatment stage. The problem was that no problems occurred.
  • Patent Document 1 JP 2003-107099; Patent Document 2: JP 2004-85323; Patent Document 3: WO 2004 / 101731).
  • This is a cell sorter that is sufficiently practical at the laboratory level, but for general use for regenerative medicine, new technological development is required for pretreatment such as liquid transport, recovery, and sample preparation. is there.
  • CTCs peripheral blood circulating cancer cells
  • anticancer agents for specific targets have been developed one after another, and if the type of malignant tumor in the blood can be identified, it has become possible to select an anticancer agent that effectively destroys the cells. If technology to monitor CTCs flowing in the blood is realized, the presence of malignant tumor cells that cause metastatic cancer flowing in the blood can be quantitatively measured, thereby quantifying the effect of the administered anticancer drug. This is the realization of the world's first method that can be continuously evaluated and can not only prevent the administration of unnecessary and excessive anticancer drugs, but also detect the presence or absence of recurrence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • DNA templates such as complementary DNA reverse transcribed from genomic DNA or messenger RNA in a mixture of various types of nucleic acids, two or more primers, a thermostable enzyme, a salt such as magnesium, and four types
  • dATP, dCTP, dGTP, dTTP deoxyribonucleoside triphosphates
  • the step of separating the nucleic acid into single strands the step of binding the primer to the separated nucleic acid, and the primer bound by a thermostable enzyme
  • a specific nucleic acid sequence can be amplified by repeating the hybridization step using a nucleic acid as a template at least once.
  • a thermal cycle is used by raising and lowering the temperature of a reaction vessel used for a DNA amplification reaction.
  • temperature change mechanisms used there, for example, a mechanism for changing the temperature of the reaction vessel containing the sample by a heater or Peltier element, heat exchange using hot air, and a heater block with different temperatures for the reaction vessel.
  • a mechanism for changing the temperature by alternately contacting the liquid bath and a mechanism for changing the temperature by flowing a sample in a flow path having regions of different temperatures.
  • a light cycler Light Cycler manufactured by Roche Corporation is one of the fastest commercially available devices.
  • the light cycler introduces a sample, a DNA polymerase, a DNA piece serving as a primer, and a fluorescent labeling dye for measurement into each of a plurality of glass capillary tubes, and the temperature of a minute droplet in the capillary tube is set to 55 degrees and 95 degrees, for example. These two temperatures are changed by blowing warm air at the same temperature as the droplet to be changed, and at the same time, this glass capillary tube is irradiated with excitation light of a fluorescent dye, and the obtained fluorescence intensity is measured. It has a mechanism that makes it possible.
  • the current analysis means using cells has a problem that it does not have a means for analyzing whether the target cell is in a state of apoptosis or the like at the time of cell recovery.
  • the contents of the cell must be used unless the cell shell can be removed by any method. Had a problem of not eluting into the sample solution.
  • the present inventors provide a cell analyzer capable of rapidly identifying the type and state of cancer cells flowing in the blood with metastatic ability and the number (concentration). That is, the present invention provides the following apparatus system and apparatus.
  • A a first device for concentrating, staining, and washing a cell sample solution from a subject;
  • B a second device for concentrating, separating and purifying the stained cell sample solution from the first device;
  • C a third device for performing gene analysis / expression analysis of purified cells in the cell sample solution from the second device;
  • D a fourth device for continuously feeding the cell sample solution over the first to third devices;
  • E A cell analyzer system comprising a control / analyzer that controls the operation of each of the devices and analyzes the cell sample,
  • the first device is A chamber with a filter for concentrating, staining, and washing cells in the cell sample solution; Containers for storing the cell sample solution, staining solution and washing solution, respectively;
  • the second device is A cell sorter chip having a flow path for flowing a cell sample solution containing cells including target cells, wherein the flow path includes a first flow path in which the cells are concentrated, and detection
  • a cell sorter chip including a second flow path branched from the first flow path, wherein the target cells are selected, and An external force is applied to the cells flowing through the channels so that the cells flowing through the channels are concentrated in the first channel and converged in a desired direction in the second channel.
  • a mechanism to give An optical system including light irradiation means for irradiating the cells flowing in the second flow path, and a high-speed camera for acquiring an image of the cells at an image capture rate of at least 200 frames / second;
  • the third device is A reaction vessel to which a sample solution is added and reacted;
  • a heat exchange tank for exchanging heat with the reaction tank;
  • a temperature control mechanism for controlling the temperature of the heat exchange tank;
  • a cell analyzer system comprising: (2) Contents of the cells conveyed by the fourth device for feeding the cell sample solution before the third device for performing gene analysis / expression analysis of purified cells in the cell sample solution A cell disruption mechanism that elutes the sample solution by cell disruption,
  • the control / analyzer transports the cell sample solution from the second device to the cell disruption mechanism by the fourth device for feeding the cell sample solution, and the sample solution is disrupted by the cell disruption mechanism.
  • the cell disruption mechanism is A container for containing the cell sample; A crushing rotating body for crushing cells in the container, An abrasive for crushing cells in the container, The cell sample and the abrasive are added to the inside of the container, and the cell sample is crushed by the movement of the crushing rotating body in which rotation and revolution are strictly controlled.
  • Cell analyzer system (4)
  • the cell disruption mechanism further includes a rotating shaft, When the crushing rotating body is pressed from above by the rotating shaft, the crushing rotating body rotates inside the container, and the frictional force and slippage between the crushing rotating body and the rotating shaft are different from those of the crushing rotating body.
  • the cell analyzer system according to (3) which is controlled by the pressure between the rotating shafts.
  • the cell crushing mechanism can generate a force for pressing the crushing rotating body in a direction perpendicular to the side surface of the container by shifting the rotating shaft of the crushing rotating body and the rotating shaft of the rotating shaft.
  • the cell analyzer system according to (4) above comprising a mechanism.
  • the cell crushing mechanism is a mechanism that allows the crushing rotating body to be lifted from the inside of the container and removed by the magnetic force of the rotating shaft, electrostatic force, or suction force due to gas pressure difference.
  • the cell analyzer system according to (4) comprising: (7) In the cell disruption mechanism described above, contamination between different cell samples can be eliminated by providing a drive mechanism equipped with a plurality of containers capable of automatic replacement of the containers.
  • the cell analyzer system according to any one of (6).
  • the crushing rotator is sealed and sealed inside the unused container by a confidential seal, and the container and the crushing rotator are placed at the time of crushing the cell sample.
  • a cell sorter chip including a flow path for flowing a cell sample solution containing cells including target cells, wherein the flow path includes a first flow path in which the cells are concentrated, and the concentration A cell sorter chip including a second flow path branched from the first flow path, wherein the detection of the cells and the selection of the target cells are performed, (ii) The cells flowing through each of the channels are concentrated in the first channel and converged in a desired direction in the second channel.
  • a mechanism for applying external force to the (iii) an optical system including a light irradiation means for irradiating the cells flowing in the second flow path, and a high-speed camera for acquiring an image of the cells at an image capture rate of at least 200 frames / second; (iv) a control / analysis unit that controls the operation of each unit and analyzes an image of each cell captured by the optical system;
  • An image detection type single cell separation / purification apparatus comprising: (10) The apparatus according to (9), wherein the external force is ultrasonic radiation pressure, gravity, electrostatic force, or dielectric electrophoresis force. (11) The device according to (9) or (10), wherein the cell sample containing the target cell is derived from blood.
  • the device according to any one of (9) to (11), wherein the target cell includes a cancer cell.
  • the control / analysis unit binarizes the cell image obtained from the optical system, and is selected from the group consisting of the luminance centroid, area, perimeter, major axis, and minor axis of the binarized image.
  • the device according to any one of (9) to (12) above, wherein each of the cells is detected and identified at a single cell level by at least one index.
  • the cells in the cell sample solution are fluorescently labeled, the optical system further includes fluorescence detection means, and information on the fluorescence image of the cells is used as an additional index by the control / analysis unit.
  • the apparatus according to (13) above.
  • the present invention provides the following on-chip cell sorter and on-chip cell sorter system.
  • One sample channel having the same length and cross-sectional area and two buffer liquid channels disposed symmetrically on both sides of the sample channel are arranged to merge, and after the merge, the center of the same length and cross-sectional area is again downstream.
  • the ratio of the cross-sectional area of the sheath liquid reservoir that is distributed to the recovery flow path and the two waste liquid flow paths on both sides and covers the inlets of the three upstream flow paths and the sample liquid reservoir that fills the sample therein
  • the ratio of the number of channels is 2: 1, so that even if the liquid flows, the liquid level of both is the same.
  • the electric field is only applied to the cells that are placed in the I applied it was characterized by the on-chip cell sorter.
  • a stopper disposed on the top surface of the sheath liquid reservoir, means for applying compressed air through the stopper, means for continuously supplying liquid to the sheath liquid reservoir and the sample reservoir,
  • the cell sorter according to (15) above, further comprising an electric sensor capable of measuring the liquid level height in both the sheath liquid reservoir and the reagent reservoir.
  • the present invention it is possible to purify a minute amount of target cells in blood in units of one cell, and to analyze accurate gene information and expression information of the target cells.
  • the present invention it is possible to identify whether or not the cells to be examined are clustered (whether or not they are isolated single cells).
  • only the target cells can be separated and purified and collected in real time.
  • the present invention it is possible to measure the intracellular state of only the collected cells at the single cell level, and perform genome analysis and expression analysis at the single cell level.
  • the collected cells can be re-cultured.
  • cell information such as a difference in cell size, a size ratio between the nucleus inside the cell and the cytoplasm, etc. can be acquired, and the cell can be purified by discrimination based on the result.
  • the present invention by collecting cells that are dividing in the blood, it is possible to collect cells having a dividing ability such as blood cancer cells and stem cells.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows notionally an example of the means in the apparatus corresponding to the whole process of the cell analysis performed using the cell analyzer apparatus of this invention, and each process. It is a figure which shows typically one example of the whole structure of the cell analyzer system of this invention in FIG. It is a figure which shows typically an example of a structure of the cell concentration / staining / decolorization module in FIG. It is a figure which shows typically an example of a structure of the image detection type 1-cell separation and refinement
  • FIG. 7 It is a schematic diagram which shows notionally an example of the means in the apparatus corresponding to the whole process in the case of including the cell destruction process in the cell analysis performed using the cell analyzer apparatus of this invention, and each process. It is a figure which shows typically an example of the crushing mechanism comprised in the cell destruction process in the process shown in FIG. 7 comprised from a container, a rotary body, and a rotating shaft. It is a figure which shows typically the various variations of the basic cell crushing mechanism shown in FIG. The mechanism which ensures the adhesiveness of a container and a rotary body is illustrated. It is a schematic diagram which shows the example of the various shapes of the rotary body of a cell crushing mechanism used in this invention, and a rotating shaft.
  • FIG. 16 is a diagram schematically showing an example of a cell purification process in the image detection type 1-cell separation / purification (cell sorter) module of FIG. 15.
  • the cell analyzer of the present invention generally comprises: (1) Cell concentration / staining / decolorization part that continuously performs processes including cell concentration, fluorescent antibody labeling (or staining and washing with reversible fluorescent labeling markers such as aptamers if necessary) , (2) Obtain image data of about 10,000 images of cells per second from cells flowing through the microchannel formed on the chip substrate, and purify 10,000 cells per second in real time based on the analysis result of the image information An image detection type 1 cell separation / purification (cell sorter) unit, (3) a 1-cell genome analysis / expression analysis unit that measures the intracellular state at the 1-cell level; (4) a liquid feeding part for carrying the sample liquid between the above parts, (5) A control analysis unit for controlling the operation of each unit and performing the analysis.
  • a typical embodiment of the cell analyzer of the present invention is characterized in that the three modules (1) to (3) are continuously combined in the order described above, and the cells are continuously connected by the flow path. Therefore, a small amount of cells can be eliminated by contamination or manipulation.
  • the presence or absence of fluorescent labeling of the cells is detected and confirmed at the single cell level, and the fluorescence-labeled cells are confirmed to be isolated single cells that are not clustered. In addition, it can be determined whether apoptosis is occurring in the cells. Therefore, according to the cell analyzer of the present invention, cells can be separated and purified based on an index that cannot be identified by the conventional scattered light detection type cell sorter technique.
  • cells that are stained accurately in units of 1 cell are selectively collected, and cell states such as apoptosis of the cells to be collected are confirmed, and fluorescence information and cell state information of each cell are confirmed.
  • cell genetic information and expression information can be analyzed.
  • the cell concentration / staining / decoloring part (1) above a small amount of cells contained in the reaction solution continuously sent from the previous module by the non-contact force is continuously captured and concentrated, and a certain number of cells is obtained.
  • the cell label staining solution is introduced and the cells are stained, the unbound reagent is washed away, and then the cells are delivered to the next module at a constant concentration.
  • cell capture / concentration using the feature that cells gather by “dielectrophoretic force” created by an alternating electric field by a metal electrode created in a microchannel as a non-contact force
  • the means for performing separation / purification in units of one cell based on the result of the image detection of (2) above details such as the difference in cell size, the ratio of the nucleus inside the cell to the cytoplasm, etc.
  • Cell information is acquired as image information, and the cell is purified based on the result.
  • a high-speed camera is used, the light emission of the light source is adjusted in accordance with the shutter cycle of the high-speed camera, and light from the light source is emitted for a certain period of time during which each shutter is released.
  • the shutter speed is 1 / 10,000th of a second
  • illuminate the target cells with a light source capable of high-speed light emission control, such as an LED light source or a pulsed laser light source, for a period of 1 / 10th of the shutter speed.
  • a light source capable of high-speed light emission control such as an LED light source or a pulsed laser light source
  • the present invention makes it possible to completely prevent cross-contamination of the device by making the main part of the cell sorter into a chip, and to separate cells without cross-contamination essential in the medical field, particularly in the field of regenerative medicine. Provide a system.
  • the cells assumed as detection targets in the present invention are bacteria for small ones and animal cells (for example, cancer cells) for large ones. Therefore, the cell size typically ranges from about 0.5 ⁇ m to about 30 ⁇ m.
  • the first problem is the channel width (cross-sectional shape).
  • the channel is formed in a substantially two-dimensional plane using a space of about 10 to about 100 ⁇ m in the thickness direction of the substrate on one of the substrate surfaces. In terms of cell size, the most typical size is about 5 to about 10 ⁇ m in the thickness direction for bacteria, and about 10 to about 50 ⁇ m in the thickness direction for animal cells.
  • the cell analyzer of the present invention typically comprises a cell concentrating unit having a function of concentrating cells, a cell arrangement unit having a function of separating and purifying cells, and a cell separation / purification in the same chip. And an optical analysis unit for identifying and judging cells to be separated and purified.
  • a sample solution that has not been subjected to concentration treatment is introduced into the cell concentration section from one inlet, and the sample solution is discharged from a discharge section disposed downstream of the cell concentration section.
  • ultrasonic radiation pressure, gravity, electrostatic force, dielectric electrophoretic force and the like can be used, but are not limited thereto.
  • an arrangement is used in which these external forces can be applied in a direction perpendicular to the flow of the sample solution in the concentration section and in the direction of the concentrated cell recovery port.
  • all cells should flow in one of the two channels that are branched into two downstreams by applying external force to the cells so that the cells are arranged in the center of the channel where the cells are flowing. Subsequently, by applying an external force to only the cells to be collected out of the arranged cells and moving the flow position of the cells, the external force is applied to the flow path branched into the above two. Only when the cells are introduced into another channel.
  • the external force means for arranging cells into nodes of standing waves by ultrasonic radiation pressure can be used.
  • a means for arranging cells at the position of the apex of the wedge can be used by combining wedge-shaped electrode arrays.
  • the cell detection function of the cell analyzer of the present invention resides in the image detection type 1-cell separation / purification part (2) above.
  • a part to be observed by a CCD camera is provided upstream of the flow path branching part, and a cell separation region is provided downstream of the part if necessary.
  • the cells passing through the flow path are irradiated with a laser or the like, and when the cells cross and the scattered light or the cells are modified with fluorescence, the fluorescence can be detected with a photodetector.
  • a separation channel point that becomes a cell separation region is installed downstream of the detection unit.
  • the sorting unit which is a cell separation region
  • a pair of comb-shaped electrodes is used as a means for moving the cells by applying external force to the cells from the outside, for example, when using a dielectrophoretic force.
  • a pair of comb-shaped electrodes is used. Install and provide a flow path that can separate and drain cells.
  • electrostatic force a voltage is applied to the electrode to change the position of the cell in the flow path. At this time, since the cell is generally charged negatively, it moves toward the positive electrode.
  • the waste liquid outlet (outlet 213) of the cell concentrating unit 215 and the purified cell of the cell sorting unit 217 It is desirable that the pressure at the outlet (cell recovery unit 224) and the outlet of the waste liquid of the cell sorting unit (waste liquid recovery unit 223) be substantially the same (see FIG. 4B).
  • a flow path resistance adjusting portion for pressure adjustment is arranged immediately before each outlet such as a thin flow path or a long S-shaped flow path.
  • the cell recognition and separation algorithm has the following characteristics.
  • the cell image is first binarized and its center of gravity is obtained.
  • the luminance center of gravity, area, perimeter length, major axis, minor axis of the binarized cells are obtained, and each cell is numbered using these parameters. It is possible to automatically save each cell image as an image at this point because it is beneficial to the user.
  • the separation index may be information such as the luminance center of gravity, area, circumference length, major axis, minor axis, or the like, or information using fluorescence may be obtained by using fluorescence detection separately from the image. In any case, the cells obtained by the detection unit are separated according to the numbering.
  • the movement speed (V) of the numbered cells is calculated from the image captured every predetermined time, and the distance from the detection unit to the selection unit with respect to the cell movement speed (V) (L),
  • the application timing from (L / V) to (L / V + T) depending on the application time (T) the cells are electrically distributed and separated when the cells of the target number come between the electrodes.
  • the means for high-speed single-cell genome analysis / expression analysis of (3) used in the present invention for example, the reaction control device used, For a plurality of temperatures to be changed, means for changing a plurality of liquids having different heat capacities at a high speed at high speed using a liquid having a large heat capacity maintained at each temperature as a heat exchange medium, and a liquid having a large heat capacity And a microreaction tank in which heat exchange with the sample liquid is performed quickly.
  • the reaction control device used in the present invention includes a reaction vessel that has a structure and material suitable for heat exchange, and a reaction that circulates a liquid having a temperature suitable for each reaction outside the reaction vessel.
  • Liquid is transferred from any liquid reservoir tank to the outside of the reaction tank to rapidly change the temperature of the tank heat exchange tank, heat sources that maintain the temperature of the liquid with high accuracy, and the temperature of the micro reaction tank And a mechanism for preventing the mixing of liquids at different temperatures when the valve system is switched.
  • Advantages of controlling the temperature of the reaction vessel with the refluxing liquid include the following points. First, the temperature overshoot problem can be solved. Since the temperature of the liquid that is constantly refluxing is constant, the temperature of the reaction vessel surface and the temperature of the liquid are instantaneously equilibrated. Since the heat capacity of the reaction vessel and the sample is insignificant compared to the liquid being refluxed, the liquid flows continuously even if heat is locally deprived from the liquid. Basically does not occur. Of course, the temperature of the reaction vessel does not exceed the temperature of the liquid. It is possible to change the temperature by 30 degrees or more within 0.5 seconds by sequentially pouring liquids of different temperatures into the reaction tank heat exchange tank.
  • FIG. 1 illustrates an example of a procedure from collection of a blood sample to analysis performed using the cell analyzer of the present invention.
  • the blood sample collected from the patient is directly introduced into the cell concentration / staining part.
  • a fluorescent labeling agent such as a fluorescent cancer marker
  • the excess fluorescent labeling agent that did not react is washed away.
  • the cells are introduced into the image detection type 1-cell separation and purification unit in a form adjusted to the optimum cell concentration and solution for the next image detection type 1-cell separation and purification unit.
  • the primary detection the presence or absence of fluorescence emission based on the fluorescent label at the 1-cell level is confirmed. Thereby, it can be confirmed by a conventional labeling technique whether the cell is a target cell.
  • the cells emitting fluorescence are isolated cells or become cell clusters with other cells 2) Determine whether the cells emitting fluorescence are in a healthy state or in a state such as apoptosis in which the cell nucleus and cell shape are deformed, and depending on the purpose, Recover healthy cells or recover cells that are undergoing apoptosis, and perform gene analysis and expression analysis on the next stage so that gene analysis and expression analysis can be performed separately for each cell morphology. Can be introduced into the department. In particular, in the case of a cell mass, since cells other than the target cell are mixed, collection is not performed even when there are cells that emit fluorescence.
  • the cells identified and purified at this stage can be re-cultured in a contamination-free manner in purified cells, in addition to being introduced into the gene analysis / expression analysis section.
  • the gene analysis / expression analysis unit converts the introduced cells into a small amount of cells, as one cell that is identified as the same cell based on information from the image detection type 1 cell separation and purification unit, or a group of the same cells Gene identification or expression identification is performed in units.
  • FIG. 2 shows an example of an overall image of the cell analyzer system 1 that realizes the procedure shown in FIG.
  • the apparatus system 1 includes a concentration / staining / decoloring module 10 that introduces a blood sample and pretreats cells, an image detection type 1-cell separation / purification module 20 that identifies and purifies cells in units of cells, and is purified.
  • 1-cell genome analysis / expression analysis module 30 for performing gene analysis and expression analysis of the collected cells
  • liquid feeding module 40 for transporting samples between modules, and controlling the operation of the entire system and analyzing the analysis results
  • a control / analysis module (computer) 50 is provided.
  • 3 to 6 show an example of the configuration of each module in the example shown in FIG.
  • FIG. 3 shows an example of the configuration of the cell concentration / staining / decoloring module 10 that introduces a blood sample derived from a subject (eg, cancer patient) and pretreats the cells.
  • the cell concentration / staining / decoloring module 10 is integrally disposed on the chassis 114, and each solution of the sample cell sample, the staining agent, and the cleaning agent is held in the module.
  • a sample cell sample such as blood is introduced into the concentration chamber 108, and the liquid component is discharged through the filter to the waste liquid collection tube 110 by the pressure pump 109, whereby the cells are concentrated.
  • the dyeing solution is introduced using the dispensing head 104 and reacted for a predetermined time, and then the dyeing solution is discharged again by the pressure pump 109.
  • a decolorizing agent into the concentration chamber 108, excess dyeing agent is washed and discharged.
  • a diluent also serving as a cleaning agent is introduced to dilute the cells to a desired concentration, and the cells are introduced into the collection tube 112 through the collection head 111 having the collection tip 113 at the tip. Yes.
  • FIG. 4 shows an example of the configuration of the image detection type 1-cell separation / purification module 20 for identifying and purifying cells in units of one cell.
  • the image detection type 1-cell separation / purification module 20 includes a light source 201, a mirror 202, a condensing lens 203, a dichroic mirror 204, a filter 205, a light detection element 206 for fluorescence detection, a high-speed camera 207, And a cell sorter chip 209 for introducing a cell sample.
  • a light source 201 such as a pulse laser or a high-intensity LED light source
  • a light detection element 208 such as a photodiode that detects passage of cells with scattered light, and fluorescence are detected for cells passing through the cell sorter chip 209.
  • a plurality of pieces of information can be detected simultaneously by a high-sensitivity light detection element 206 such as a photomultiplier, a high-speed camera 207, or the like.
  • the light emitted from the light source continuous light may be emitted, but in order to increase the spatial resolution of the image without blurring, pulse light is generated in synchronization with the shutter cycle of the high-speed camera 207.
  • the processing using an image and the processing using fluorescence or scattered light may be used in combination.
  • the image data obtained by the high-speed camera 207 can be displayed on the monitor of the computer 50 for use by the user.
  • the filter 205 is appropriately adjusted to transmit a plurality of excitation lights, and a wavelength that does not overlap with the fluorescence wavelength for fluorescence detection in the lower stage is selected to light the cells.
  • a plurality of devices to which devices from the dichroic mirror 204 to the filter 205 and the fluorescence detector 206 are added in accordance with the type of fluorescence to be observed.
  • the cell recognition and separation algorithm has the following characteristics.
  • the cell image is first binarized and its center of gravity is obtained.
  • the luminance center of gravity, area, perimeter length, major axis, minor axis of the binarized cells are obtained, and each cell is numbered using these parameters. It is possible to automatically save each cell image as an image at this point because it is beneficial to the user.
  • the separation index may be information such as the luminance center of gravity, area, circumference length, major axis, minor axis, or the like, or information using fluorescence may be obtained by using fluorescence detection separately from the image. In any case, the cells obtained by the detection unit are separated according to the numbering.
  • the movement speed (V) of the numbered cells is calculated from the image captured every predetermined time, and the distance from the detection unit to the selection unit with respect to the cell movement speed (V) (L),
  • the application timing from (L / V) to (L / V + T) depending on the application time (T) the cells are electrically distributed and separated when the cells of the target number come between the electrodes.
  • An example of the configuration for cell separation and purification is as follows. A series of microfabricated channels arranged in a two-dimensional manner on a planar chip, from concentration to arrangement and purification of cells in the sample solution, and force applied to the cells incorporated in the chip Consists of means.
  • FIG. 4B schematically shows an example of a cell sorter chip 209 configured on such a chip.
  • a microchannel 211 is provided inside the chip substrate 210, and an opening communicating with the channel is provided on the upper surface to serve as a supply port for a sample and a necessary buffer solution (medium).
  • the flow path can be created by so-called injection molding in which a plastic such as PMMA is poured into a mold, or can be created by bonding a plurality of glass substrates.
  • the size of the chip is, for example, 50 ⁇ 70 ⁇ 1 mm (t), but is not limited thereto.
  • the cells envisaged in the present invention are bacteria at a small size, and animal cells at a large size, such as cancer cells. Therefore, the cell size is typically in the range of about 0.5 ⁇ m to 30 ⁇ m, but is not strictly limited to this range, and cells of any size can be used as long as the present invention is effectively used. Can be done.
  • the first problem is the flow channel width (cross-sectional shape).
  • the channel 211 is formed on one of the substrate surfaces in a substantially two-dimensional plane in a space typically 10 to 100 ⁇ m in the thickness direction of the substrate. The appropriate size is 5 to 10 ⁇ m in the thickness direction for bacteria and 10 to 50 ⁇ m in the thickness direction for animal cells based on the cell size.
  • the sample solution is introduced from the inlet 212 into the microchannel 211 by a syringe pump or cell introduction means that does not generate a pulsating flow such as air pressure.
  • the sample liquid containing the cells introduced into the microchannel 211 flows along the streamline of the particle flow 218 before application toward the outlet 213 downstream, and is discharged.
  • means for continuously applying an external force to the cells is introduced so that the cells are concentrated toward the cell concentrate inlet 214 arranged in a part of the side wall of the microchannel 211.
  • the cells are concentrated along the cell flow 219 after application, and a cell concentrate having a concentration 100 times or more the cell concentration introduced at the inlet 212 is introduced into the cell concentrate inlet 214.
  • ultrasonic radiation pressure gravity, electrostatic force, dielectric electrophoretic force
  • a traveling wave of ultrasonic waves is generated in the direction of the cell concentrate inlet 214 and orthogonal to the flow of the sample liquid, and is applied by the ultrasonic radiation pressure after application.
  • a cell stream 219 can be generated.
  • a PZT-based piezoelectric element may be adhered to the surface of the chip 209, or a comb-shaped electrode array is disposed on the surface of the piezoelectric element so that surface acoustic waves are generated in the cell concentration unit 215, This may be applied to the surface of the cell concentrating unit 215, and the fact that the soaked ultrasonic waves are introduced into the cell concentrating unit 215 may be used.
  • the spatial arrangement of the chip 209 may be adjusted so that the direction of the concentrated liquid inlet 214 is perpendicular to the flow of the sample liquid and the direction of the concentrated liquid inlet 214 is the direction of gravity, or
  • the chip 209 may be arranged on a disc that can rotate, perpendicular to the flow of the sample solution, and the cell concentrate in the same direction as the radial direction of the disc.
  • electrostatic force an electrode is arranged on the side wall of the microchannel 211 so that the cell receives an external force toward the side wall. In that case, the cell of the target cell It may be determined which charge is applied depending on whether the surface potential is positive or negative.
  • the flow path distance of the micro flow path 211 must be flexibly adjusted according to the type and strength of the external force applied to the cell, for example, sufficiently long in the case of electrostatic force It must be a thing.
  • the dielectrophoretic force is used as an external force, the dielectrophoretic force is applied in the cell concentration unit 215 so as to be orthogonal to the flow of the sample liquid and in the direction of the concentrate inlet 214.
  • An electrode may be disposed.
  • the concentrated cell liquid into which the cell concentrated liquid has been introduced into the concentrated liquid inlet 214 is arranged in a line along the flow in the solution at the converging unit 216. Specifically, it has means for generating an external force so that cells are attracted to the central part of the flow path of the converging unit 216 by using a dielectric electrophoretic force or a standing wave mode of ultrasonic radiation pressure. is there.
  • the cells arranged in a straight line in the center in this way are measured in the cell detection region 218 arranged in the preceding stage of the cell sorting unit 217, and after determining the type of each cell, from upstream to downstream.
  • the wedge-shaped electrodes (converging V-shaped comb electrodes) 225 are alternately arranged. And applying an alternating voltage to the converging V-shaped comb electrode contact allows the cell to be directed toward the position of the wedge-shaped apex, thereby applying an external force to the cell. As a result, the position of the wedge-shaped apex Cells can be continuously concentrated.
  • the shape of the electrode arranged in the flow path that the electrode has an angle toward the downstream side, and that this electrode has a sharp tip instead of a straight line, and Because of the comb-shaped electrode array that has the shape of the axis, the cell that receives the dielectric electrophoretic force is affected by the flow regardless of whether it receives a repulsive force or an attractive force.
  • the cells are guided and arranged at the acute electrode tip portion by the resultant force of the force swept downstream and the force applied to the cell toward the sharp tip portion.
  • the cell is forced to flow downstream by the flow and the dielectric electrophoresis directed toward this acute angle tip direction.
  • the resultant force and force gather at the acute angle tip.
  • FIG. 5 illustrates an example of the configuration of a one-cell genome analysis / expression analysis module 30 that performs gene analysis and expression analysis of purified cells.
  • the reaction tank 301 is composed of a thin plate of aluminum, nickel, or gold having a plurality of depressions. The thickness of the thin plate in the depression region is about 10 to 30 microns, and the region between adjacent depressions has a thickness of 100 to 500 microns in order to ensure overall strength.
  • the reaction vessel 301 is fixed to the bottom surface of a square or circular reaction vessel frame, and has a structure that can be easily detached from the reaction vessel heat exchange vessel 302. The temperature of the liquid introduced into the reaction tank heat exchange tank 302 is overheated by a heat source disposed inside the liquid reservoir tank 303.
  • An agitation mechanism is provided to quickly remove heat from the surface of the heat source and to make the temperature inside the liquid reservoir tank 303 uniform.
  • the liquid in the liquid reservoir tank is guided inside the flow path by the pump 304.
  • the liquid is led to the reaction tank heat exchange tank 302 by the switching valve 305 or directly returned to the liquid reservoir tank 303 by being led to the bypass flow path. If necessary, the temperature of the liquid is slightly controlled by the auxiliary temperature control mechanism 306 so as to suppress temperature fluctuation in the liquid reservoir tank 303.
  • the basic configuration of the reaction tank heat exchange tank 302 includes an inlet A (307) and an inlet B (308) for introducing liquids having different temperatures.
  • the number corresponding to the plurality of temperatures for which the temperature of the sample solution is to be changed will be prepared as a plurality of two temperatures or more.
  • the number is three. It is not limited to two.
  • a plurality of outlets, outlet A (309) and outlet B (310) are provided in order to return the liquid in the reaction tank heat exchange tank 302 to the liquid reservoir tank 303.
  • the number is not limited to two.
  • Various types of reaction vessels can be used, and reaction vessel A, reaction vessel B, reaction vessel C, and reaction vessel D are shown as an example.
  • water may be used, but a liquid having a large heat capacity and low viscosity may be used.
  • liquid ammonia For example, liquid ammonia.
  • the sample liquid is surely set to 100 degrees, or the liquid having a lower freezing point than water is used. It is also possible to reliably change the temperature up to the freezing point of water while preventing freezing of the circulating liquid.
  • the reaction vessel frame can measure the change in fluorescence intensity of the fluorescent dye in the sample solution, which changes due to the reaction of the sample solution 311 in the reaction vessel 301, for each of the one or more reaction vessels 301.
  • An optical window that transmits the excitation light of the fluorescent dye and the fluorescence is arranged, and the fluorescence detector 312 is arranged to measure the temporal change of the measured fluorescence intensity of each reaction vessel 301. it can.
  • each of the plurality of fluorescence detectors 312 includes an excitation light irradiation mechanism and a fluorescence detection mechanism, and each of a plurality of reaction vessels 301 to which different primers or different sample solutions are dropped.
  • the fluorescence intensity data acquired by the fluorescence detector 312 is recorded by the control analysis unit 313 and has a function of estimating the amount of DNA or mRNA in the sample solution obtained by the PCR reaction. Further, the control analysis unit 313 obtains the switching information of the switching valve 305, thereby estimating whether the temperature change of the sample liquid 311 after the valve switching has reached the target temperature from the change in fluorescence intensity over time, And a mechanism for controlling valve switching based on the result.
  • one detector is arranged in each reaction vessel 301.
  • the fluorescence intensity change in a plurality of reaction vessels can be changed by combining a fluorescent example light source and a camera capable of quantitative fluorescence detection such as a cooled CCD camera. You may measure.
  • the fluorescence intensity of all reaction vessels can be measured by combining a mechanical drive mechanism that can move at high speed on the XY plane with the detectors. You may do it.
  • a freeze-dried reagent it is convenient to freeze and dry the reagents necessary for the reaction. It is possible to prepare a freeze-dried reagent at the bottom of the reaction vessel. Further, if a plug-like freeze-dried reagent is formed inside a dispensing tip used when dispensing a sample, the reagent can be dissolved in the sample by moving the sample up and down. Alternatively, it is also possible to dissolve the freeze-dried reagent by forming a freeze-dried reagent on the surface of the fiber ball on which nylon fibers or the like are bundled, and inserting the sample into a sample inside the reaction vessel and stirring.
  • the reaction vessel frame is preferably formed of a heat insulating material such as polystyrene, polycarbonate, PEEK, acrylic, and the like, and the reaction area of the reaction vessel 301 can be controlled quickly and with high accuracy by reducing the bonding area with the reaction vessel 301. Is desirable.
  • a thread is formed on the surface of the reaction tank frame and the reaction tank frame is screwed. In order to maintain watertightness, it is desirable to attach a seal to the opening. Alternatively, it is possible to employ a tapered reaction vessel frame and attach it only by pressure.
  • valve switching mechanism There are an inlet valve A and an inlet valve B for introducing a liquid into the reaction tank 301, and an outlet valve A and an outlet valve B for introducing the liquid to the outside.
  • the liquid guided from the inlet valve A returns from the outlet valve A to the liquid reservoir tank, and the liquid guided from the inlet valve A returns from the outlet bawl B to another liquid reservoir tank.
  • the sample in the reaction vessel can be reacted.
  • the inlet valve B and the outlet valve A, or the inlet valve A and the outlet valve B are simultaneously opened for a moment so that liquids of different temperatures are mixed.
  • the conditions for PCR are, for example, reaction buffer 1.0 ⁇ L, 2 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1 ⁇ L, 25 mM magnesium sulfate 1.2 ⁇ L, 10% fetal bovine serum 0.125 ⁇ L, SYBR Green I 0.5 ⁇ L, primer Two types can be used: 0.6 ⁇ L each, sterilized water 3.725 ⁇ L, KOD plus polymerase 0.25 ⁇ L, and genomic DNA 1.0 ⁇ L.
  • As the temperature condition first, 95 ° C. for 10 seconds, and then temperature change of 95 ° C. for 1 second and 60 ° C. for 3 seconds can be measured in 40 cycles.
  • FIG. 6 illustrates an example of a configuration of a liquid feeding module 40 that transports a sample between the modules. It has a dispensing head 401 and a dispensing tip 402 for exchanging liquid between each module arranged on the chassis 406, and controls the height direction of the dispensing head in the Z-axis direction.
  • the Z-axis movement guide 403 and the Z-axis movement motor 404 as functions and the arm rotation motor 405 as an arm rotation mechanism have a function of controlling the position of the dispensing head 401 on the XY plane.
  • FIG. 7 shows cell expression of a sample in which a nucleic acid component in a cell is not easily eluted into a sample solution by a shell covering a cell such as an anthrax spore in a cell analysis performed using the cell analyzer of the present invention.
  • An example of a procedure from collection of a sample into which a procedure for crushing a shell covering a cell is introduced before an analysis procedure is shown.
  • the present cell analyzer can analyze cells such as spores of Bacillus anthracis by means similar to the means for analyzing blood cells described above.
  • FIG. 8 schematically shows an example of a basic structure for automatically crushing a shell of a spore or the like covering a small amount of sample cells in order to analyze intracellular genes and expression information for cells having spores such as anthrax.
  • a minute sample 802 is dispensed into the container 801, and a rotating body 803 for crushing is placed inside the container 801.
  • the rotating body 803 is pressed against the container 801 by the rotating shaft 804.
  • the sample 805 in the minute sample is ground by the abrasive 806.
  • the processed sample 805 can be easily recovered by removing the rotating body 803. Since the rotating body 803 and the container 1 have a simple structure, there is no problem even if they are handled as consumables.
  • FIG. 9 schematically shows various variations of the basic cell disruption mechanism shown in FIG.
  • the container 811 including the rotating body 810 is held by a flexible structure 812 such as rubber. Since the tip portion 814 of the shaft 813 is cut obliquely, when the shaft 813 is pressed against the rotating body 810, the rotating body 810 presses the container 811 downward and laterally, and the flexible structure 812 By deforming, pressure is absorbed. As a result, the sample can be crushed while holding the rotating body 810 and the container 811 closely without giving excessive stress to the rotating shaft 813.
  • FIG. 9B as a method of releasing stress, it is possible to incorporate a spring mechanism 815 that deforms vertically and laterally inside the rotating shaft.
  • FIG. 10 shows the possibility of rotating bodies and rotating shafts of various shapes in the cell disruption mechanism used in the present invention.
  • the shaft whose tip is cut obliquely (FIG. 10a)
  • it may be recessed in a gently curved surface (FIG. 10b), bowl-shaped (FIG. 10c), or the like.
  • the rotating body does not have to be a true sphere, and may have a structure in which the shaft and the rotating body are gently engaged with each other (FIG. 10d).
  • the hemisphere may be rotated with a rotating shaft cut diagonally (FIG. 10e).
  • it may have an egg-shaped rotating body (FIG. 10f) or a protruding structure that meshes with the rotating shaft (FIG. 10g). It is also possible to rotate a dish-like rotating body with a shaft (FIG. 10h).
  • FIG. 11 shows an example of the cell disruption step in the present invention.
  • a rotating body 831 and an abrasive 832 are enclosed in the container 830 (FIG. 11a).
  • the seal 833 is broken (FIG. 11b), and a sample 834 containing cells is dispensed into the container 830 (FIG. 11c).
  • the cells in the sample are crushed by the abrasive 832 and the component 836 is eluted (FIG. 11e).
  • the sample can be easily collected by removing the rotating body 831 from the container 830 (FIG. 11f).
  • negative pressure, magnetic force, and electrostatic force can be used, and such a mechanism can be incorporated in the rotating shaft.
  • a special mechanism may be prepared separately.
  • FIG. 12 shows a conceptual diagram of a mechanism that can be used when the cell disruption process in the present invention is automated.
  • a plurality of containers 840 are integrally formed, and a rotating body is sealed in advance in each container.
  • a rotating shaft In order to break the seal, it is possible to directly press and tear the rotating shaft (FIG. 12A), or to break with the opening cutter 841 attached to the rotating shaft (FIG. 12B).
  • the relative position of the shaft and the container can be automatically changed, and a plurality of samples can be crushed one after another.
  • FIG. 13 shows an example of the on-chip cell sorter chip of the present invention that can also be used in the cell analyzer system of the present invention.
  • the cell sorter chip 1301 three axial flow paths are arranged symmetrically on the upstream side (1302, 1304, 1306) and downstream side (1303, 1305, 1307) on the chip substrate.
  • the three flow paths merge while maintaining a laminar flow, and maintain the state as it is and branch to the three downstream flow paths. Therefore, the upstream side 1302 of the central flow path through which the sample flows is changed to the downstream central flow path 1303, and the upstream side flow path 1304 to the downstream side 1305, and the upstream flow path 1306, respectively, for the two side sheath flows.
  • the inlets of the three upstream channels are connected to inlet openings 1308, 1309, and 1310, respectively.
  • the inlet opening 1308 upstream of the flow path through which the sample flows is connected to the sample reservoir 1322, typically (but not limited to) by adding a small annular cap (or stopper).
  • the inlet openings 1309 and 1310 of the flow path for flowing the sheath liquid stored in the sheath liquid reservoir 1311 are separated from each other and are arranged so that the sample solution does not diffuse.
  • the downstream reservoir is also arranged in the same manner as the upstream side, and the waste liquid reservoir 1312 is connected to the outlet openings 1313 and 1314 of the flow path through which the two side sheath liquids flow. Is connected to the outlet opening 1315 of the recovered purified sample, and typically (but not limited to) a small annular cap is added to the outlet opening 1315 to recover the recovered purified sample. Does not diffuse into the waste reservoir.
  • the flow rate is generated using a gravity type that utilizes the difference between the liquid level of the sample reservoir and the sheath liquid reservoir and the liquid level of the waste / recovered liquid reservoir, or pressurized air with a cap attached to the upper surface of the reservoir.
  • a gravity type that utilizes the difference between the liquid level of the sample reservoir and the sheath liquid reservoir and the liquid level of the waste / recovered liquid reservoir, or pressurized air with a cap attached to the upper surface of the reservoir.
  • the ratio of the cross-sectional area of the side sheath flow (or waste liquid) reservoir to the cross-sectional area of the inner sample / recovery sample reservoir is 1 (sample / recovery reservoir): 2 (side sheath liquid reservoir / waste liquid reservoir). It is desirable. This is because if the change in the liquid level of each reservoir is different, the rate of decrease in the liquid level will be different, which will eventually destroy the generation of laminar flow at the confluence. It is. Therefore, since the flow rate of the liquid flow per unit time is 1: 2 in the sheath liquid having two inlets with respect to the sample inlet 1, the cross-sectional area of each reservoir is adjusted so that the liquid level is the same. The ratio was set to 1: 2. To make this universal, it is desirable that the ratio of the total cross-sectional areas of the flow paths coupled to the respective reservoirs matches the ratio of the cross-sectional areas of the respective reservoirs.
  • an electrode is arranged at a point where three laminar flows without walls join, where all six channels join.
  • the electrode is typically composed of a gel electrode.
  • a gel electrode for example, an agarose gel in which NaCl is dissolved so that the electrolyte becomes a current carrier is used.
  • the gel is placed in a Y-shaped channel 1316 for gel filling so that the gel tip can be in contact with the agarose gel in a sol state from the inlet 1317 so that the gel can be directed to the outlet 1318.
  • the gel does not penetrate into the cell sorter flow path and stops at the boundary line due to surface tension.
  • a wire 1319 such as a platinum wire connected to a power source 1320 to apply an electric field to this gel introduction point, at the gel electrode boundary in contact with the flow path, a normal metal electrode Even if the bubbles are raised to a voltage higher than the voltage generated in the flow path, no bubbles are generated and a current can be applied.
  • the on-off of the electric field application can be adjusted using the switch 1321, for example.
  • FIG. 14 schematically shows an example of the cross section of the upstream reservoir, particularly in the AA cross section of FIG.
  • a flow path 1409 is embedded in the cell sorter chip 1401.
  • the upper surface of the outer sheath fluid reservoir 1403 is blocked by the cap 1402, so that air pressure at an appropriate flow rate is supplied from the pressurized air introduction pipe 1405.
  • the flow path 1409 through which the sample flows is connected to the sample reservoir 1404 so that the sample liquid and the sheath liquid are not mixed.
  • the ratio of the cross-sectional area between the sample reservoir and the sheath fluid reservoir is 1: 2 because the ratio of the number of channels is 1: 2, and the ratio of each reservoir connected to each channel is The liquid level is adjusted to be the same.
  • a mechanism for supplying liquid can be added so that a larger amount of sample can be processed.
  • This includes a sample solution introduction tube 1406 or a sheath liquid introduction tube 1407, and a water level measurement sensor 1408 using conductivity measurement on the wall surface of each reservoir.
  • the water level measurement sensor 1408 can be configured by electrodes or electrode pairs disposed at the lower limit of the water level and the upper limit of the water level, which are desired to be set.
  • FIG. 15 shows an example of another configuration for handling a large amount of sample in the cell sorter of the present invention.
  • Three large reservoirs 1502 are arranged on the chip 1501 upstream of each of the three flow paths, and these are distributed more flexibly using the distribution valve 1505 from the air pressure application device 1503 through the pressure sensor 1504. can do.
  • sample collection both the sorted (purified) sample and the waste liquid are collected in the sorted sample collection reservoir 1506 and the waste liquid collection reservoir 1507, respectively, disposed at positions below the chip.
  • FIG. 16 schematically shows a procedure for collecting an actual sample in the chip.
  • the sample solution stream 1601 flowing from the upstream is sandwiched between the two side sheath solution streams 1602 and 1603 and proceeds to the cell monitor region 1604 while maintaining the arrangement. Therefore, the shape discrimination of each cell, the presence or absence of a fluorescent label, etc. are confirmed, and cell separation is performed downstream based on the results.
  • the cells to be collected flow, they flow as they are to the downstream sorted sample collection flow channel 1606, and when the cells or fine particles to be discarded flow, they are arranged to face each other regardless of whether the charge is positive or negative.
  • the two gel electrodes 1605 by applying a voltage to the two gel electrodes 1605, the gel can move to one of the two side sheath flows 1607 and be eliminated.
  • FIG. 17 is a schematic diagram for explaining one of the indices of cell recovery in the image processing cell sorter.
  • the cell is in the G0 cycle and has a nucleus (FIG. 17A (a)), which is clearly image-recognized as a black sphere inside the cell (FIG. 17B (a)).
  • FIG. 17A (b) since the nucleus of the cell in the division phase has disappeared (FIG. 17A (b)), the nucleus cannot be confirmed even if the cell is image-recognized (FIG. 17B (b)).
  • conventional labeling techniques such as antibody labeling, it is difficult to confirm the state of the cell.
  • the presence or absence of a nucleus in the cell Dividing cells can be recovered.
  • most normal cells that flow in the blood are already terminally differentiated, but by collecting cells that have undergone cell division in the blood according to the present invention, blood cancer cells, stem cells, etc. It becomes possible to collect cells having the ability to divide.
  • FIG. 18 is an example of an operation timing chart when using a flash light source when actually operating the image recognition type cell sorter of the present invention.
  • the pixel size of a 1/2000 second camera is 12 ⁇ m ⁇ 12 ⁇ m
  • the pixel resolution when viewed with a 20 ⁇ objective lens is 0.6 ⁇ m / pixel. If an LED light source that can perform flash firing at a high speed is used, it is possible to actually obtain an image without blurring.
  • the present invention is useful for purifying a minute amount of target cells in blood in units of one cell, and analyzing accurate gene information and expression information of the target cells.
  • the present invention is useful for purifying a very small amount of target cells having spores such as Bacillus anthracis per cell and analyzing accurate gene information and expression information of the target cells at high speed.

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Abstract

　本発明は、細胞を連続濃縮する機能と、引き続き、連続して細胞を流路の特定の領域に連続配置する機能と、画像ベースで1細胞単位でその形状と蛍光の発光を同時認識する機能と、その形状と蛍光の発光の情報に基づいて認識を行って細胞を分離精製する機能を有する細胞濃縮精製装置を提供する。

Description

細胞分析装置
　本発明は、細胞分析装置に関する。
　多細胞生物における生体組織は種々細胞が役割を分担して全体として調和の取れた機能を維持している。あるいは、細胞の一部ががん化（ここでは腫瘍も含め、一括してがんと呼ぶことにする）すると、周辺領域と異なる新生物となるが、がん領域とそこから遠く離れた正常組織部分とはある境界を持って必ずしも区切れるものではなく、がん周辺領域も何らかの影響を受けている。したがって、臓器組織における機能を解析するには狭い領域に存在する少数の細胞を短時間のうちになるべく簡単に、かつ損失を最小にして分離して分析する必要がある。
　また、再生医療の分野では、組織の中から臓器幹細胞を分離し、これを再培養して分化誘導し目的の組織、ひいては臓器を再生しようとする試みがなされている。
　細胞を識別したり分離したりしようとすると、何らかの指標に従い区別する必要がある。一般に細胞の区別には、
１）目視による形態学的な細胞分類：例えば尿中に出現する異型細胞検査による膀胱がんや尿道のがんなどの検査や血中の異型細胞分類、組織中における細胞診によるがん検査などをあげることができる。
２）蛍光抗体法による細胞表面抗原（マーカー）染色による細胞分類：一般にＣＤマーカーと呼ばれる細胞表面抗原を、それに特異的な蛍光標識抗体で染色するもので、セルソーターによる細胞分離やフローサイトメーターや組織染色によるがん検査などに用いられている。もちろんこれらは、医療面のみならず、細胞生理研究用や、工業的な細胞利用の上でも多用されている。
３）あるいは、幹細胞の分離に関しては、細胞内に取り込まれる蛍光色素をレポーターとして幹細胞を含む細胞を大まかに分離し、更にその後で実際に培養を行うことで目的の幹細胞を分離する例がある。これは、幹細胞の有効なマーカーがまだ確立されていないので、実際に培養し、分化誘導したもののみを利用することで、実質的に目的細胞を分離しているのである。
　このように培養液中の特定の細胞を分離し回収することは、生物学・医学的な分析においては重要な技術である。細胞の比重の違いで細胞を分離する場合には速度沈降法によって分離することができる。しかし、未感作の細胞と感作した細胞とを見分けるような、細胞の比重の違いがほとんど無い場合には、蛍光抗体で染色した情報あるいは目視の情報を基に細胞を１つ１つ分離する必要がある。
　この技術については、例えば、セルソーターがある。セルソーターは、蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である（非特許文献１：Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)）。
　しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、一定以上の濃度まで濃縮された試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの問題がある。これらの問題を解決するため、近年、マイクロ加工技術を用いて微細な流路を作成し、流路内の層流中を流れる細胞を直接顕微鏡観察しながら分離するセルソーターが開発されている（非特許文献２：Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998)；非特許文献３：Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)）。しかし、このマイクロ加工技術を用いて作成するセルソーターでは観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、実用化するためには、試料に損傷を与えず、かつ、より応答の速い分離処理方法が必要であった。また、利用するサンプル溶液中の細胞濃度も一定以上の濃度に事前に高めることをしないと、希薄な細胞濃度であっては、十分に装置の分離効率を高めることができないという問題点、さらに微量なサンプルの濃縮を別装置で行った場合には、その濃縮液をロスなく回収することが困難であるだけでなく、煩雑な前処理段階において、細胞が汚染されるなどの再生医療等では望ましくない問題が発生することが課題となっていた。
　本発明者らは、このような問題点を解消するため、マイクロ加工技術を活用して、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる細胞分析分離装置を開発している（特許文献１：特開２００３－１０７０９９；特許文献２：特開２００４－８５３２３；特許文献３：ＷＯ２００４／１０１７３１）。これは実験室レベルでは十分に実用的なセルソーターであるが、再生医療のために汎用的に使用するには、液搬送法や回収法、試料調製などの前処理について新たな技術開発が必要である。
　現在、癌組織の検出はMRI (核磁気共鳴画像法)やCT (コンピュータ断層撮影法)の改良によって飛躍的に改善されているが、良性・悪性腫瘍の同定については、バイオプシーによる評価を超える手法は存在していない。悪性腫瘍の問題点として、癌細胞自身の組織から血管あるいはリンパ管に浸潤する能力により他臓器に転移すること知られている。このように末梢血を循環する悪性腫瘍細胞は末梢血循環癌細胞(Circulating Tumor Cells: CTCs)と呼ばれ、血液細胞（赤血球を含む）10万細胞に数百細胞程度の癌細胞が存在すると考えられている。近年、特定のターゲットに対する制癌剤が次々と開発されており、血液中の悪性腫瘍の種類が同定できれば、その細胞を効果的に破壊する制癌剤を選択できるようになってきた。もし、血液中を流れるCTCsをモニターする技術が実現すれば、血液中を流れる転移癌の原因となる悪性腫瘍細胞の存在を定量的に計測することができ、それによって投与した制癌剤の効果を定量的に継続して評価することができ、不要な制癌剤の投与、過剰な制癌剤の投与を防ぐことができるのみならず、再発の有無についても検知することができる世界初の手法の実現となる。
　遺伝子診断や発現解析について、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction以下、PCRと略記する。）は、様々な種類の核酸の混合物から特定の塩基配列を増幅する方法である。PCRにおいては、様々な種類の核酸の混合物中にゲノムDNA あるいはメッセンジャーRNAから逆転写した相補的DNA等のDNAテンプレート、２種類以上のプライマー、熱安定性酵素、マグネシウムなどの塩、および４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）を添加した後、核酸を一本鎖に分離させる工程と、プライマーを分離した核酸に結合させる工程と、熱安定性酵素によってプライマーが結合した核酸を鋳型としてハイブリダイゼーションさせる工程とを少なくとも一回繰り返すことによって、特定の核酸配列を増幅させることができる。PCRでは、DNA増幅反応に用いられる反応容器の温度を昇温、降温させることによる、熱サイクルを用いている。そこで用いられる温度変化用の機構は色々と挙げられるが、例えば、サンプルを含む反応容器の温度をヒーターないしペルチェ素子、温風を用いた熱交換で変化させる機構、反応容器を異なる温度のヒータブロックもしくは液体バスに交互に接触させることにより温度を変化させる機構、異なる温度の領域を有する流路中にサンプルを流して温度を変える機構などがある。現状の市販装置として最速なものとして、例えば、ロッシュ社のライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ）がある。ライトサイクラーは、複数のガラスキャピラリー管の各々に試料とＤＮＡポリメラーゼとプライマーとなるＤＮＡ小片および計測用の蛍光標識色素を導入し、このキャピラリー管内の微量液滴の温度を、例えば５５度と９５度の２つの温度など、変化させたい液滴の温度と同じ温度の温風を吹き付けることで変化させ、同時に、このガラスキャピラリー管に蛍光色素の励起光を照射し、得られた蛍光強度を計測することを可能にする機構を有する。
　これらの方法によりサンプルの温度を繰り返し変化させることが可能である。
特開２００３－１０７０９９号公報 特開２００４－８５３２３号公報 国際公開第２００４／１０１７３１号パンフレット
Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987) Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998) Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)
　臨床現場において、CTCsは癌転移に関して存在を確認する事が重要視されているにも拘わらず、これを癌転移の指標とした診断基準は、現状確立されていない。理由として、それ自体の多様性・希少性のため、採血後の試料を均一な組織と見なし、その中の稀少な変異遺伝子の存在の有無を検査する従来方法では検出感度の高さを非常に求められる点が挙げられる。
　特にこれまでは、蛍光標識した血中の癌細胞が他の細胞と細胞塊となっているか、あるいは孤立した1細胞であるかを確認せず細胞内の遺伝子、発現解析を行っていたため、ターゲットとなる癌細胞以外の細胞の情報を含んだ集団平均としての情報を獲得していた。そのため、対象となる癌細胞の正確な情報が得られないという課題があった。
　また、1細胞単位での回収手段に加えて、稀少な細胞を選別・濃縮後、微量の細胞単位で遺伝子診断、発現解析する手段によって、よりS/N比の高い診断を行う必要があった。
また、現在の、細胞を用いた解析手段については、対象となる細胞がアポトーシス等の状態となっているかどうか、細胞回収時に解析をする手段を有していないという課題があった。
　また、炭疽菌の芽胞等の細胞の表面に硬い殻を有する細胞については、細胞内容物の分析をするためには、細胞の殻を何らかの方法で除去することが出来ない限り、細胞の内容物は試料液に溶出しないという問題があった。そのため、通常は、芽胞細胞を培養することで発芽させて、発芽することで通常の細胞と同じ手順でも細胞の内容物が試料液に溶出できるようになることから、細胞培養を行う手段を分析手段に組み込むことで細胞分析が行われているが、この場合には、細胞培養に少なくとも数時間程度、長い場合には一昼夜の培養が必要となるため、培養過程による計測時間の遅延、手順の煩雑化、コンタミネーションの発生などの問題が発生していた。また、高速での分析を行う手法としてガラスボール等の破砕媒体とサンプルの混合物を破砕容器に入れ、超音波振動などを加えることでランダムに衝突をさせることで細胞破砕をする等の破壊手法が存在しているが、これらについては振動による試料溶液の加熱が発生するにも関わらず効果的な破砕効率が得られないという問題と、試料溶液およびサンプル量が多量に必要であり、極微量の細胞の細胞破砕を行う場合には、試料回収効率の問題があった。
　このような状況に鑑み、本発明者らは、転移能力を持って血中を流れる癌細胞の種類と状態、そして数（濃度）を高速に同定することができる細胞分析装置を提供する。
　すなわち、本発明は、以下の装置システムおよび装置を提供する。
（１）(A) 被験体からの細胞試料液を濃縮、染色、洗浄する第１の装置と、
　(B) 上記第１の装置からの染色された細胞の試料液を濃縮・分離・精製する第２の装置と、
　(C) 上記第２の装置からの細胞試料液中の精製された細胞の遺伝子解析・発現解析を行う第３の装置と、
　(D) 上記第１～第３の装置にわたって連続的に上記細胞試料液を送液する第４の装置と、
　(E) 上記各装置の動作を制御し、上記細胞試料の解析を行う制御・解析部と
を備える細胞分析装置システムであって、
　　(a) 上記第１の装置が、
　　　上記細胞試料液中の細胞を濃縮、染色、洗浄するフィルターを備えたチャンバーと、
　　　上記細胞試料液、染色液および洗浄液をそれぞれ収容する容器と、
　　　各上記容器中の各液を上記チャンバー中に順次導入する機構と、
　　を備え、
　　(b) 上記第２の装置が、
　　　対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す流路を備えるセルソーターチップであって、上記流路が、上記細胞の濃縮が行われる第一の流路と、上記濃縮された上記細胞の検出および上記対象細胞の選別が行われる、上記第一の流路から分岐する第二の流路とを含む、セルソーターチップと、
　　　各上記流路を流れる上記細胞が、上記第一の流路において濃縮され、かつ上記第二の流路において所望の方向に収束されるように、各上記流路を流れる上記細胞に対して外力を与える機構と、
　　　上記第二の流路中を流れる上記細胞に光を照射する光照射手段と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで該細胞の画像を取得する高速カメラとを含む光学系と、
　　を備え、
　　(c) 上記第３の装置が、
　　　試料液を添加して反応させる反応槽と、
　　　上記反応槽との間で熱を交換する熱交換槽と、
　　　上記熱交換槽の温度を制御する温度制御機構と、
　　を備える、細胞分析装置システム。
（２）上記細胞試料液中の精製された細胞の遺伝子解析・発現解析を行う第３の装置の前段に、上記細胞試料液を送液する第４の装置によって搬送された上記細胞の内容物を細胞破砕によって試料液に溶出させる細胞破砕機構をさらに含み、
　上記制御・解析部が、上記細胞試料液を送液する第４の装置によって上記第２の装置からの上記細胞試料液が上記細胞破砕機構へ搬送され、上記細胞破砕機構において破砕された試料液が、上記第４の装置によって上記第３の装置に搬送されるように上記各部を制御する、上記（１）に記載の細胞分析装置システム。
（３）上記細胞破砕機構が、
　上記細胞試料を容れるための容器と、
　上記容器内にて細胞を破砕するための破砕用回転体と、
　上記容器内にて細胞を破砕するための研磨剤とを含み、
　　上記細胞試料と上記研磨剤とが上記容器の内部に添加され、自転および公転運動が厳密に制御された上記破砕用回転体の動きにより、上記細胞試料が破砕される、上記（２）に記載の細胞分析装置システム。
（４）上記細胞破砕機構がさらに回転シャフトを含み、
　上記破砕用回転体が上記回転シャフトにより上から押し付けられることによって、上記容器の内部で回転し、上記破砕用回転体と上記回転シャフト間の摩擦力および滑りの程度が、上記破砕用回転体と回転シャフト間の圧力により制御される、上記（３）に記載の細胞分析装置システム。
（５）上記細胞破砕機構が、破砕用回転体の回転軸と回転シャフトの回転軸をずらすことにより、容器の側面に対して直角方向に破砕用回転体を押し付ける力を発生させることが可能な機構を備える、上記（４）に記載の細胞分析装置システム。
（６）上記細胞破砕機構が、上記回転シャフトの磁力、静電気力、または気体の圧力差による吸引力により上記破砕用回転体が上記容器の内部から持ち上げられ、除去されることが可能な機構を備える、上記（４）に記載の細胞分析装置システム。
（７）上記細胞破砕機構において、上記容器の自動交換を可能とする複数の容器を搭載した駆動機構を備えることにより異なる細胞試料間での汚染を排除できることを特徴とする、上記（３）～（６）のいずれかに記載の細胞分析装置システム。
（８）上記細胞破砕機構において、未使用の上記容器の内部には上記破砕用回転体が機密性シールにより封印して容れられており、上記細胞試料破砕時には上記容器および上記破砕用回転体が汚染されていないことが保証できることを特徴とする、上記（３）～（７）のいずれかに記載の細胞分析装置システム。
（９）(i) 対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す流路を備えるセルソーターチップであって、上記流路が、上記細胞の濃縮が行われる第一の流路と、上記濃縮された上記細胞の検出および上記対象細胞の選別が行われる、上記第一の流路から分岐する第二の流路とを含む、セルソーターチップと、
　(ii) 各上記流路を流れる上記細胞が、上記第一の流路において濃縮され、かつ上記第二の流路において所望の方向に収束されるように、各上記流路を流れる上記細胞に対して外力を与える機構と、
　(iii) 上記第二の流路中を流れる上記細胞に光を照射する光照射手段と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで該細胞の画像を取得する高速カメラとを含む光学系と、
　(iv）上記各部の動作を制御し、上記光学系により取り込まれた各上記細胞の画像を解析する制御・解析部と、
を備える、画像検出型一細胞分離・精製装置。
（１０）上記外力が、超音波放射圧、重力、静電力、または誘電電気泳動力である、上記（９）に記載の装置。
（１１）上記対象細胞を含む細胞試料が、血液に由来する、上記（９）または（１０）に記載の装置。
（１２）上記対象細胞が、癌細胞を含む、上記（９）～（１１）のいずれかに記載の装置。
（１３）上記制御・解析部が、上記光学系から得られる上記細胞の画像を２値化し、該２値化画像の輝度重心、面積、周囲長、長径、および短径からなる群から選択される少なくとも１つの指標によって、各上記細胞を一細胞レベルで検出し識別する、上記（９）～（１２）のいずれかに記載の装置。
（１４）上記細胞試料液中の上記細胞が蛍光標識されており、上記光学系が、蛍光検出手段をさらに含み、上記細胞の蛍光画像の情報が追加的な指標として上記制御・解析部により利用される、上記（１３）に記載の装置。
　さらに、本発明は、以下のオンチップ・セルソーターおよびオンチップ・セルソーターシステムを提供する。
（１５）同じ長さと断面積の１つの試料流路とその両脇に対称に配置された２つのバッファ液流路が合流するように配置され、合流後に下流で再び同じ長さと断面積の中央の回収用流路とその両脇の２つの廃液流路に分配され、上流の３つの流路の入り口を覆うシース液リザーバーと、その中に試料を満たす試料液リザーバーが、その断面積の比が、流路数の比と同じ２：１となるように配置されており液が流れても両者の液面高さが一致するように構成されており、同様に下流でも廃液リザーバーと回収細胞用リザーバーの断面積の比が２：１となるように配置されており、合流点の上流に高速カメラおよび蛍光検出によって細胞を同定する機構を有し、合流点に対称にゲル電極が接するように配置されており、排除したい細胞にのみ電場を印加することを特徴としたオンチップ・セルソーター。
（１６）上記セルソーターのリザーバーにおいて、シース液リザーバー上面に配置された栓と、栓を貫通して圧縮空気を印加する手段と、シース液リザーバーと試料リザーバーに液を連続して追加供給できる手段と、シース液リザーバーと試薬リザーバーの両者での液面高さを計測することができる電気センサーとを備えることを特徴とした上記（１５）に記載のセルソーター。
（１７）上記セルソーターのリザーバーにおいて、試薬液および２つのシース液を保存する個別の容器が、おのおの３つの流路の上流側入り口にそれぞれ配置されていることを特徴とした上記（１５）に記載のセルソーター
（１８）画像認識型セルソーターにおいて、細胞像の中での核の像の有無を基準として、選択的に細胞分裂中の細胞を回収することを特徴としたオンチップ・セルソーター。
（１９）画像処理型セルソーターにおいて、像のブレを防ぐために、高速カメラの撮影各フレームレート速度において、各フレームで一回発火する時間について、
 
フラッシュ時間　＝　画素サイズ／流速
 
の関係で決めることを特徴としたオンチップ・セルソーターシステム。
　本発明により、血中の微量な対象細胞を1細胞単位で精製して、その対象細胞の正確な遺伝子情報、発現情報の解析が実現できる。
　本発明により、被検対象の細胞が、クラスター化しているか否か（孤立一細胞であるか否か）を識別することができる。
　本発明により、細胞でアポトーシスが発生しているか否かを判定することができる。
　本発明により、リアルタイムで対象となる細胞のみを分離精製して回収することができる。
　本発明により、回収した細胞のみ、一細胞レベルで細胞内状態を計測し、一細胞レベルでゲノム解析および発現解析を行うことができる。
　本発明により、回収した細胞のみ、再培養することができる。
　本発明により、細胞のサイズの違い、細胞内部の核と細胞質とのサイズの比等の詳細な細胞の情報を取得して、その結果に基づいて判別をして細胞を精製することができる。
　本発明により、炭疽菌などの芽胞を有する細胞について、細胞内の物質の分析を高速にコンタミネーションを最小にして行うことができる。
　本発明により、血中で細胞分裂をしている細胞を回収することで、血中がん細胞や幹細胞などの分裂能をもった細胞を回収することが可能となる。
本発明の細胞分析装置システムを用いて行われる細胞分析の全体のプロセス、ならびに個々の工程に対応する装置内の手段の一例を概念的に示す模式図である。 図１における本発明の細胞分析装置システムの全体構成の１例を模式的に示す図である。 図２における細胞濃縮・染色・脱色モジュールの構成の１例を模式的に示す図である。 図２における画像検出型１細胞分離・精製（セルソーター）モジュールの構成の１例を模式的に示す図である。 図２における１細胞ゲノム解析・発現解析モジュールの構成の１例を模式的に示した図である。 図２における送液モジュールの構成の１例を模式的に示す図である。 本発明の細胞分析装置システムを用いて行われる細胞分析において細胞破壊工程を含む場合の全体のプロセス、ならびに個々の工程に対応する装置内の手段の一例を概念的に示す模式図である。 図７に示す工程の中の細胞破壊工程で用いられる、容器、回転体、回転シャフトから構成される破砕機構の一例を模式的に示す図である。 図８に示す基本的な細胞破砕機構の種々のバリエーションを模式的に示す図である。容器と回転体の密着性を担保する機構が例示されている。 本発明において使用される細胞破砕機構の回転体と回転シャフトのさまざまな形状の例を示す模式図である。 本発明における細胞破砕工程のサンプル破砕の全工程を模式的に示した図である。 本発明における細胞破砕工程での細胞の連続破砕用の自動化構造の概念図を示す。 本発明におけるセルソーターモジュールのチップ構成の１例を模式的に示す図である。 本発明におけるセルソーターモジュールのサンプルリザーバー領域のチップ構成の１例を模式的に示す図である。 画像検出型１細胞分離・精製（セルソーター）モジュールの構成の１例を模式的に示す図である。 図１５の画像検出型１細胞分離・精製（セルソーター）モジュールにおける細胞精製のプロセスの１例を模式的に示す図である。 図１５の画像検出型１細胞分離・精製（セルソーター）モジュールにおける細胞精製の識別指標のひとつである、細胞分裂時の核の消失プロセスの画像認識を模式的に示す図である。 画像検出型１細胞分離・精製（セルソーター）モジュールにおける画像ボケを防ぐための高速フラッシュ光源の発光タイミングの１例を模式的に示す図である。
　本発明の細胞分析装置は、概して、
（１）細胞の濃縮、蛍光抗体標識（あるいは再培養を行う場合は必要に応じてアプタマー等の可逆蛍光標識マーカー）での染色、洗浄を含むプロセスを連続で行う細胞濃縮・染色・脱色部と、
（２）チップ基板上に形成したマイクロ流路を流れる細胞から、毎秒1万画像程度の細胞像の画像データを取得して、その画像情報の分析結果に基づいてリアルタイムで毎秒1万細胞を精製する画像検出型１細胞分離・精製（セルソーター）部と、
（３）1細胞レベルでの細胞内状態を計測する１細胞ゲノム解析・発現解析部と、
（４）上記各部の間での試料液の搬送を行うための送液部と、
（５）上記各部の動作を制御し、上記解析を行うための制御解析部と
を備える。
　本発明の細胞分析装置の典型的な実施形態は、上記３つのモジュール（１）～（３）を、上記の順序で連続して組み合わせたことを特徴とし、かつ、流路によって連続して細胞が搬送されるため、微量の細胞をコンタミネーションや操作による消失を最小限に無くすることができる。
　本発明の細胞分析装置を用いることによって、細胞の蛍光標識の有無を1細胞レベルで検出して確認し、蛍光標識された細胞について、細胞がクラスター化していない孤立1細胞であることを確認し、さらに細胞でアポトーシスが発生しているかどうかを判定することができる。したがって、本発明の細胞分析装置によれば、従来の散乱光検出型セルソーター技術では識別できなかった指標に基づいて、細胞を分離・精製することができる。
　本発明の細胞分析装置によれば、正確に1細胞単位で染色された細胞を選択回収し、また、回収する細胞のアポトーシス等の細胞状態を確認し、各細胞の蛍光情報および細胞状態の情報と併せて細胞の遺伝子情報、発現情報を解析することができる。
　上記（１）の細胞濃縮・染色・脱色部においては、非接触力によって連続的に前モジュールから送られてくる反応液中に含まれる微量の細胞が連続的に捕獲濃縮され、一定の細胞数に達したところで、細胞標識染色液が導入されて細胞が染色された後に、結合しなかった試薬は洗浄除去され、その後、一定の濃度で細胞が次のモジュールに送出される。この細胞濃縮・染色・脱色部においては、例えば、非接触力として微量流路中に作成した金属電極によって交流電場によって作り出される「誘電泳動力」によって細胞が集まる特徴を利用した細胞の捕獲・濃縮の要素技術が用いられる。
　また、上記（２）の画像の検出の結果に基づいて１細胞単位での分離・精製を行う手段においては、細胞のサイズの違い、細胞内部の核と細胞質とのサイズの比等の詳細な細胞の情報が画像情報として取得され、その結果に基づいて細胞が精製される。画像取得については、高速カメラが用いられ、高速カメラのシャッター周期に合わせて、光源の発光が調整され、各シャッターが切られる期間のうちの一定の時間だけ光源の光を発光させる。例えば、シャッタースピードが1万分の1秒である場合は、その10分の1の期間だけ、ＬＥＤ光源あるいはパルスレーザー光源等の高速発光制御が可能な光源で対象となる細胞に光を照射することで、細胞の精細な形状を獲得することができる。
　上記の分離・精製手段としてセルソーターをチップ上に構築する場合、従来のセルソーターでは、セルソーターに導入する細胞を、別途、遠心分離機などの濃縮工程などを経て濃縮させたために、その過程でのコンタミネーションの問題があった。そこで、本発明においては光学系以外の機能はチップのみでクローズドで行うことにした。すなわち、細胞をチップ上で直接濃縮する構成とし、送液部分および分離した細胞の培養槽もチップ上に形成した。それによって、コンタミネーションや細胞のロスが発生しないだけでなく、手順が簡素化され、処理時間が短縮される使い勝手を改善することができる。また、クローズドにすることで、例えば、幹細胞の分離や臨床検査など、他の検体組織由来細胞のコンタミネーション防止が必須であるケースにおいても、コンタミネーションを考慮する必要が無くなる。このように、本発明は、セルソーターの主要部分をチップ化することで、装置のクロスコンタミネーションの完全な防止などを可能とし、医療分野、特に再生医療分野で必須なクロスコンタミネーションの無い細胞分離システムを提供する。
　本発明において検出対象として想定している細胞は、小さいものではバクテリア、大きいものでは動物細胞（例えば、がん細胞）などである。したがって、細胞サイズとしては典型的には約０．５μｍから約３０μｍ程度の範囲となる。細胞濃縮機能および細胞分離機能の両方を組み込んだ流路を基板の一面に形成して細胞濃縮および分離を連続して行う場合に、まず問題になるのが流路幅（断面形状）である。また、流路は基板表面の一つに基板の厚み方向で約１０～約１００μｍのスペースを使用して、実質２次元平面状に作成することとなる。細胞の大きさからしてバクテリア用では厚み方向で約５～約１０μｍ、動物細胞用では厚み方向で約１０から約５０μｍが最も典型的なサイズとなる。
　本発明の細胞分析装置は、典型的には、同一のチップ内に、細胞を濃縮する機能を持つ細胞濃縮部と、それに引き続き、細胞を分離精製する機能を持つ細胞配列部と細胞分離・精製部、そして分離精製する細胞を識別判断する光学的解析部を含む。細胞濃縮部へは、典型的には、濃縮処理がされていない試料溶液が１つの入り口から導入され、細胞濃縮部の下流に配置された排出部から試料溶液が排出される。このような基本構成に加えて、濃縮部側壁内に設置された濃縮細胞回収口に向けて細胞に対して外力を与えて細胞を濃縮する手段を有していてもよい。このときの外力としては、超音波放射圧、重力、静電力、誘電電気泳動力などを用いることができるが、これらに限定されない。この場合、濃縮部の試料溶液の流れに対して直交する方向で、かつ、濃縮細胞回収口の方向に向けてこれらの外力を与えることができる配置が利用される。
　細胞分離・精製部においては、細胞が流れている流路の中央に細胞が配列するように細胞に対して外力を加えて下流の２つに分岐した流路の一方にすべての細胞が流れることができるようにし、それに引き続いて、配列した細胞のうち回収したい細胞のみに、さらに外力を加えて細胞の流れる位置を移動させることで、上記２つに分岐する流路のうち、この外力を加えたときのみ細胞が別の流路に導入される。ここで、具体的には外力としては、超音波放射圧による定在波の節への細胞の配列手段を利用することができる。あるいは、楔形の電極アレイを組み合わせることで、楔形の頂点の位置に細胞を配列させる手段を利用することができる。あるいは、対になったヒゲ型電極を用いて細胞を２つの対電極の間に配列させる手段を用いることができる。また、この手段を用いれば、サイドシース液を添加すること無しに細胞を一直線に配置することができるため、前段でせっかく濃縮した細胞溶液が希釈されるという上記発明が解決しようとする課題に述べられた課題を合わせて解決できることとなる。
　本発明の細胞分析装置の細胞検出機能は、上記（２）の画像検出型１細胞分離・精製部にある。細胞を画像として捕らえて評価する場合は流路分岐部分の上流にＣＣＤカメラで観測する部位を設け、必要に応じてその下流に細胞分離領域を設置する構造とする。画像によらず、流路を通過する細胞にレーザーなどを照射し、細胞が横切るときの散乱光や細胞を蛍光で修飾している場合はその蛍光を光検出器で検出することもできる。この場合も、検出部の下流に細胞分離領域となる分離流路点を設置する構造とする。
　細胞分離領域である選別部で細胞を分離する場合、細胞選別部に外部から細胞に外力を加えて細胞を移動させる手段として、例えば、誘電電気泳動力を用いる場合には１対の櫛形電極を設置し、細胞を分離して排出することのできる流路を設ける。静電力による場合は、電極に電圧をかけて細胞の流路内での位置変更を行う。このとき、一般に細胞はマイナスにチャージしているのでプラスの電極に向かって動く。
　また、本発明では、試料液のチップ内への導入圧力が、液の移動の駆動力となっているため、細胞濃縮部２１５の廃液出口（流出口２１３）、細胞選別部２１７の精製細胞の出口（細胞回収部２２４）、細胞選別部の廃液の出口（廃液回収部２２３）の圧力がほぼ同じになるように構成することが望ましい（図４Ｂを参照）。そのために、細い流路や、S字状の長い流路など各出口の直前に圧力調整用の流路抵抗調整部を配置している。
　細胞認識と分離のアルゴリズムに関しては次のような特徴がある。
　細胞を画像として捕らえて評価する場合は合流後の流路部分をＣＣＤカメラで観測する部位を設け、測定範囲を面に広げ画像認識で細胞の識別を行い、追跡することでより確実な細胞分離を行う。このとき重要なのは、画像の取り込み速度である。一般の３０フレーム／秒のビデオレートのカメラでは、画像での細胞取りこぼしが生じる。最低２００フレーム／秒の取り込みレートがあれば、流路中をかなりの速度で流れる細胞を認識できる。
　次に画像処理法であるが、取り込みレートが早いということはあまり複雑な画像処理を行うことはできない。まず、細胞認識であるが、前記したとおり、細胞の移動速度や細胞によりまちまちで、場合によっては細胞の追い越しがある。このため、各細胞が最初に画像フレームに現れたときに細胞にナンバリングを施し、以下、画像フレームから消えるまで同一ナンバーで管理を行うこととする。すなわち、連続する複数枚のフレームで細胞像が移動する状況をナンバーで管理する。各フレーム内での細胞は上流側にあったものから順に下流側に移行し、画像中に認識されるナンバリングされた特定細胞の移動速度はある範囲に収まるとの条件でフレーム間の細胞をリンクさせる。このようにすることで、たとえ、細胞の追い抜きがあったとしても各細胞を確実に追跡できるようにする。
　これで、細胞の認識が可能となるが、細胞のナンバリングには、まず細胞像を２値化し、その重心を求める。２値化した細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径を求め、これらのパラメーターを用いて各細胞をナンバリングする。各細胞像をこの時点で画像として自動保存することも使用者にとって益があるので行えるようにする。
　つぎに、細胞分離に使用する場合であるが、ナンバリングした細胞のうち、特定の細胞のみを分離しなくてはならない。分離の指標は上記した輝度重心、面積、周囲長、長径、短径などの情報でもよいし、画像とは別に蛍光検出を行うことを併用して蛍光を利用した情報を得てもよい。いずれにせよ、検出部で得た細胞をナンバリングに従い分離する。具体的には、所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して検出部から選別部までの距離を（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとすることでちょうど目的のナンバーの細胞が電極間に来た時に細胞を電気的に振り分けて分離する。
　また、本発明において用いる上記（３）の高速での1細胞ゲノム解析・発現解析の手段については、上記目的を達成するために、例えば、使用する反応制御装置は、サンプル液の温度変化について、変化させたい複数の温度について、各温度が維持された熱容量の大きな液体を熱交換の媒体に用いて、この熱容量の大きな複数の異なる温度の液体を高速で変化させる手段と、この熱容量の大きな液体とサンプル液との熱交換が迅速に行われる微小反応槽を備える。具体的には、本発明において使用される反応制御装置は、熱交換に適した構造および材質で構成される微小反応槽と、各反応に適した温度の液体を微小反応槽外部に循環させる反応槽熱交換槽と、液体の温度を高精度で維持する熱源を含む複数の液体リザーバタンクと、微小反応槽の温度を迅速に変化させるために任意の液体リザーバタンクから反応槽外部へ液体を導くための切り替えバルブ系と、上記バルブ系の切り替えの際に異なる温度の液体の混合防止機構から構成されている。
　還流する液体で反応槽の温度を制御する利点としては、次の点を挙げることができる。まず温度のオーバーシュート問題を解決できる点が挙げられる。常に還流している液体の温度は一定であることから、反応槽表面の温度と液体の温度は瞬時に平衡化する。反応槽およびサンプルの熱容量は、還流している液体と比較して微々たるものであることから、局所的に液体から熱が奪われたとしても液体は連続して流れてくることから、熱勾配は基本的に発生しない。勿論、反応槽の温度は液体の温度を超えることはない。異なる温度の液体を反応槽熱交換槽に順次に流し込むことにより、0.5秒以内に30度以上温度を変化することが可能である。
　以下、図面を参照して本発明の実施形態をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲がこれらの実施形態に限定されるものではない。
　（細胞分析装置のシステム構成）
　図１は、本発明の細胞分析装置を用いて行う、血中サンプルの採取から分析までの手順の一例を図示したものである。
　患者から採取した血液サンプルはそのまま、細胞濃縮・染色部に導入される。ここで血液から細胞成分のみを抽出して、これに蛍光癌マーカーなどの蛍光標識剤を添加して、試料細胞と反応をさせた後、反応しなかった余剰の蛍光標識剤を洗浄除去し、次の画像検出型1細胞分離精製部に最適な細胞濃度、溶液に調整した形で、画像検出型1細胞分離精製部へと導入される。
　次に、画像検出型1細胞分離精製部では、1次検出として、1細胞レベルでの蛍光標識に基づいた蛍光の発光の有無を確認する。これによって細胞が対象となる細胞かどうかを従来の標識技術で確認することができる。そのうえで、蛍光を発して対象となる細胞について、高速カメラによって採取した画像をリアルタイムで分析することで、１）蛍光を発する細胞が、孤立細胞であるか、あるいは他の細胞との細胞塊となっているかを判別し、また、２）蛍光を発する細胞が健常な状態であるか、細胞の核と細胞形状が変形しているアポトーシス等の状態となっているかを判別し、目的に応じて、健常な細胞の回収、あるいは、アポトーシスを起こしている細胞の回収を行って、それぞれの細胞の形態について別々に遺伝子解析、発現解析ができるように次段の高速・微量対応の遺伝子解析・発現解析部に導入することができる。特に、細胞塊となっている場合には、ターゲットとなっている細胞以外の細胞が混入することとなるので、蛍光を発する細胞がある場合であっても回収は行わない。
　また、この段階で識別し、精製された細胞については、遺伝子解析・発現解析部に導入する以外に、精製された細胞単位で、コンタミネーションフリーにて再培養を行うこともできるものとする。
　遺伝子解析・発現解析部は、導入された細胞を、微量の細胞単位で、画像検出型1細胞分離精製部の情報に基づいて同一の細胞と判別された細胞1細胞として、あるいは同一細胞の集団単位で遺伝子の同定、あるいは、発現の同定を行うものである。
　図２は、上記図１で示した手順を実現する細胞分析装置システム１の全体像の一例を示したものである。装置システム１は、血液サンプルを導入して細胞の前処理を行う濃縮・染色・脱色モジュール１０、細胞の１細胞単位での識別・精製を行う画像検出型１細胞分離・精製モジュール２０、精製された細胞の遺伝子解析、発現解析を行う１細胞ゲノム解析・発現解析モジュール３０、各モジュール間での試料の搬送を行う送液モジュール４０、およびシステム全体の動作を制御し、かつ、解析結果を分析する制御・解析モジュール（コンピュータ）５０を備える。
　図３から図６のそれぞれに、図２で示した例における、各モジュールの構成の一例を示す。
　まず図３は、被験体（例：癌患者）由来の血液サンプルを導入して細胞の前処理を行う細胞濃縮・染色・脱色モジュール１０の構成の一例を示したものである。図３の例において、細胞濃縮・染色・脱色モジュール１０は、シャーシ１１４の上に一体となって配置されており、モジュール内には、試料細胞サンプル、染色剤、洗浄剤の各溶液を保持する容器またはリザーバ（１０１、１０２、１０３）があり、ここから回転アーム１１２に取り付けられた分注ヘッド１０４によって、溶液をターンテーブル１０５上に配置した底面に濃縮・脱色フィルター１０６が配置されたチャンバー１０７（合わせて濃縮チャンバー１０８）に導入することができる。濃縮チャンバー１０８には、まず血液などの試料細胞サンプルが導入され、圧力ポンプ１０９によって液体成分をフィルターを通じて廃液回収チューブ１１０に排出することによって、細胞の濃縮が行われる。次に、分注ヘッド１０４を使って、染色液が導入され、一定の時間反応させた後に、再度、圧力ポンプ１０９によって染色液は排出される。次に、脱色剤を濃縮チャンバー１０８に導入することで、過剰な染色剤は洗浄されて排出される。その後、一般には洗浄剤を兼ねる希釈液を導入して、細胞を希望の濃度に希釈して、先端に回収チップ１１３を備えた回収ヘッド１１１を通じて、細胞を回収チューブ１１２に導入する構成となっている。
　図4は、細胞の1細胞単位での識別・精製を行う画像検出型1細胞分離・精製モジュール２０の構成の一例を示したものである。図４Ａに示すように、画像検出型１細胞分離・精製モジュール２０は、光源２０１、ミラー２０２、集光レンズ２０３、ダイクロイックミラー２０４、フィルター２０５、蛍光検出用の光検出素子２０６、高速カメラ２０７、および散乱光検出用フォトダイオード２０８から構成される光学系、ならびに細胞試料を導入するセルソーターチップ２０９から構成されている。図４Ａのモジュールでは、セルソーターチップ２０９を通過する細胞に対して、パルスレーザーや高輝度ＬＥＤ光源などの光源２０１、細胞の通過を散乱光で検出するフォトダイオードなどの光検出素子２０８、蛍光を検出するフォトマルチプライヤーなどの高感度光検出素子２０６、高速カメラ２０７などで同時に複数の情報を検出することが出来るようになっている。そして、光源の照射光については、連続光を照射しても良いが、ブレの無いより画像の空間分解能を高めるために、高速カメラ２０７のシャッター周期に同期して、パルス光を発生させることで、より短時間の光照射で、より項時間分解能の像を取得することが出来る構成となっている。
　ここで、画像による処理と、蛍光あるいは散乱光による処理とを併用してもよいことは言うまでもない。また、高速カメラ２０７で得られた画像データはコンピュータ５０のモニターに表示して、使用者の観察に供することもできる。また、観察したい蛍光が複数の場合には、フィルター２０５を適切に調整し、複数の励起光を透過させるとともに、下段での蛍光検出のための蛍光波長に重ならない波長を選んで、細胞に光を照射し、観察したい蛍光の種類に合わせてダイクロイックミラー２０４から、フィルター２０５、蛍光検出器２０６までの装置を付加したものを複数組み合わせれば良い。また、この構成を用いることで、細胞像についての蛍光観察結果をデータとして用いることもできる。
　細胞認識と分離のアルゴリズムに関しては次のような特徴がある。
　細胞を画像として捕らえて評価する場合は合流後の流路部分をＣＣＤカメラで観測する部位を設け、測定範囲を面に広げ画像認識で細胞の識別を行い、追跡することでより確実な細胞分離を行う。このとき重要なのは、画像の取り込み速度である。一般の３０フレーム／秒のビデオレートのカメラでは、画像での細胞取りこぼしが生じる。最低２００フレーム／秒の取り込みレートがあれば、流路中をかなりの速度で流れる細胞を認識できる。
　次に画像処理法であるが、取り込みレートが早いということはあまり複雑な画像処理を行うことはできない。まず、細胞認識であるが、前記したとおり、細胞の移動速度や細胞によりまちまちで、場合によっては細胞の追い越しがある。このため、各細胞が最初に画像フレームに現れたときに細胞にナンバリングを施し、以下、画像フレームから消えるまで同一ナンバーで管理を行うこととする。すなわち、連続する複数枚のフレームで細胞像が移動する状況をナンバーで管理する。各フレーム内での細胞は上流側にあったものから順に下流側に移行し、画像中に認識されるナンバリングされた特定細胞の移動速度はある範囲に収まるとの条件でフレーム間の細胞をリンクさせる。このようにすることで、たとえ、細胞の追い抜きがあったとしても各細胞を確実に追跡できるようにする。
　これで、細胞の認識が可能となるが、細胞のナンバリングには、まず細胞像を２値化し、その重心を求める。２値化した細胞の輝度重心、面積、周囲長、長径、短径を求め、これらのパラメーターを用いて各細胞をナンバリングする。各細胞像をこの時点で画像として自動保存することも使用者にとって益があるので行えるようにする。
　次に、細胞分離に使用する場合であるが、ナンバリングした細胞のうち、特定の細胞のみを分離しなくてはならない。分離の指標は上記した輝度重心、面積、周囲長、長径、短径などの情報でもよいし、画像とは別に蛍光検出を行うことを併用して蛍光を利用した情報を得てもよい。いずれにせよ、検出部で得た細胞をナンバリングに従い分離する。具体的には、所定時間毎に取り込まれる前記画像からナンバリングされた細胞の移動速度（Ｖ）を計算し、細胞移動速度（Ｖ）に対して検出部から選別部までの距離を（Ｌ）、印加時間（Ｔ）によって、印加タイミングを（Ｌ／Ｖ）から（Ｌ／Ｖ＋Ｔ）までとすることでちょうど目的のナンバーの細胞が電極間に来た時に細胞を電気的に振り分けて分離する。
　細胞の分離精製についての構成の一例は以下のとおりである。入れられた試料溶液中の細胞の濃縮から配列、精製までを平面チップ上に２次元に展開して配置された一連の微細加工された流路と、チップに組み込まれた細胞に力を作用させる手段からなる。
　細胞分離精製モジュールはチップ上に構成されている。図４Ｂは、そのようなチップ上に構成されたセルソーターチップ２０９の例を模式的に示す。チップ基板２１０の内部にマイクロ流路２１１を、上面にこの流路に連通する開口を設け、試料や必要な緩衝液（培地）の供給口とする。流路の作成はＰＭＭＡなどのプラスチックを金型に流し込むいわゆる射出成型で作成することで作成することもできるし、あるいは、複数のガラス基板を接着することで作成することもできる。チップのサイズは、例えば５０×７０×１ｍｍ（ｔ）であるがこれに限定されない。チップの内面に刻まれた溝や貫通穴を流路やウェルを流れる細胞を、高倍率の光学顕微鏡で観察できるように、ＰＭＭＡプラスチックを用いた場合には、例えば、０．１ｍｍ厚のラミネートフィルムを熱圧着して用いており、また、ガラスの場合は同様に０．１ｍｍのガラスを光学接着することで用いている。例えば、開口数１．４、倍率１００倍の対物レンズを用いて、０．１ｍｍのラミネートフィルムを通して流路内を流れる細胞を観察できる。プラスチックの場合、プラスチックを透光性の高いものとすれば、チップ基板２１０の上面側からも観測できる。また、本発明で想定している細胞は、小さいものではバクテリア、大きいものでは動物細胞でがん細胞のようなものである。したがって、細胞サイズとしては典型的には０．５μｍから３０μｍ程度の範囲となるが、厳密にこの範囲に限定されるわけではなく、本発明が有効に使用される限り任意のサイズの細胞が使用されうる。細胞濃縮と細胞分離を基板の一面に組み込んだ流路を用いて連続して行おうとすると、まず問題になるのが流路幅（断面形状）である。また、流路２１１は基板表面の一つに基板の厚み方向で典型的には１０～１００μｍ内外のスペースに実質２次元平面状に作成することとなる。細胞の大きさからしてバクテリア用では厚み方向で５～１０μｍ、動物細胞用では厚み方向で１０から５０μｍが適当なサイズとなる。
　チップ２０９上で、まず、試料溶液は、流入口２１２からシリンジポンプあるいは、空気圧などの脈流が発生しない、細胞導入手段によってマイクロ流路２１１に導入される。マイクロ流路２１１に導入された細胞を含む試料液は、そのまま下流にある流出口２１３に向けて印加前の粒子の流れ２１８の流線に沿って流れて行き排出される。このときマイクロ流路２１１の側壁の一部に配置された細胞濃縮液入り口２１４に向けて細胞が濃縮されるように細胞に対して連続して外力を加える手段が導入されており、その外力によって、細胞は印加後の細胞の流れ２１９に沿って濃縮されてゆき、流入口２１２で導入された細胞濃度の１００倍以上の高濃度の細胞濃縮液が細胞濃縮液入り口２１４に導入される。
　このとき細胞に加える外力としては、超音波放射圧、重力、静電力、誘電電気泳動力を用いることができる。例えば、超音波放射圧を用いる場合には、試料液の流れに直交し、かつ、細胞濃縮液入り口２１４の方向に超音波の進行波を発生させて、その超音波の放射圧によって印加後の細胞の流れ２１９を発生させることができる。超音波の導入手段については、ＰＺＴ系圧電素子をチップ２０９表面に接着しても良いし、あるいは、細胞濃縮部２１５に表面弾性波が発生するように櫛形電極アレイを圧電素子表面に配置し、これを細胞濃縮部２１５表面に張り付けて、浸み出した超音波が細胞濃縮部２１５に導入されることを利用しても良い。重力を用いる場合には、試料液の流れに直交し、かつ、細胞濃縮液が濃縮液入り口２１４の方向が重力の方向となるように、チップ２０９の空間配置を調整しても良いし、あるいは、回転することができる円盤上に、チップ２０９を、試料液の流れに直交し、かつ、細胞濃縮液が濃縮液入り口の方向が円盤の動径方向と同じ方向に配置しても良い。静電力を用いる場合には、マイクロ流路２１１の側壁に電極を配置することで、細胞が側壁に向かって外力を受けるように配置すれば良く、その場合には、対象となる細胞の持つ細胞表面の電位が正となるか負となるかに応じて、どちらの電荷を印加するかを決めればよい。ただし、静電力を発生させる場合は、電流を加える電極表面の電位が過酸素化電位、あるいは過水素化電位などの一定の電位を超えると気泡が電極から発生することとなるため、印加する電圧は非常に弱いものとなり、それ故、マイクロ流路２１１の流路距離は、細胞に加える外力の種類と強さに応じて柔軟に調整しなければならず、例えば静電力の場合は十分に長いものとならなければならない。誘電電気泳動力を外力として用いる場合には、細胞濃縮部２１５内に、試料液の流れに直交し、かつ、細胞濃縮液が濃縮液入り口２１４の方向に誘電電気泳動力が加えられるように、電極を配置すれば良い。
　次に、図４Ｃに示すように、細胞濃縮液が濃縮液入り口２１４に導入された濃縮細胞液は、収束部２１６において、溶液中で流れに沿って一列に配列される。具体的には、誘電電気泳動力、あるいは超音波放射圧の定在波モードを用いることで、収束部２１６の流路の中央部に細胞が引き寄せられるように外力を発生させる手段を有するものである。このようにして中央に一直線に配列された細胞は、細胞選別部２１７の前段に配置された細胞検出領域２１８において、細胞を計測して、その各細胞の種類を判定した後に、上流から下流への流れに垂直な方向への外力を加えることの有無によって、細胞選別部分岐部２２０において分岐する２つの下流域である第一の流出口２２１と第二の流出口２２２のいずれかに誘導するものとなる。
　実際の収束部２１６の構成の例として、誘電電気泳動力によって外力を実現する場合の、電極配置の構成の一例としては、楔形の交互に配置した形状の電極（収束用V字櫛形電極）２２５を配置し、収束用V字櫛形電極接点に交流電圧を印加することで、細胞をこの楔形の頂点の位置に向けて細胞に対して外力を加えることができ、その結果、楔形の頂点の位置に細胞を連続して濃縮することができる。この実施例の電極で重要なのは、流路中に配置された電極の形状であり、下流側に向けて角度をもった電極であることと、この電極が一直線ではなく鋭角な先端を持ち、かつ、軸対象な形状を持つ、くし型電極アレイであることで、誘電電気泳動力を受ける細胞は、それによって斥力を受ける場合であっても、引力を受ける場合であっても、流れによって細胞が下流に押し流されてゆく力と、鋭角な先端部分に向けて細胞が受ける力の合力によって、細胞は、この鋭角な電極先端部分に誘導されて配列することとなる。言い換えると、流路中の細胞を濃縮させたい位置に、電極アレイの鋭角の頂点の位置を配置することで、細胞は、流れによって下流に進む力と、この鋭角先端方向に向けた誘電電気泳動力との合力によって、鋭角先端部に集まることとなる。
　図５に、精製された細胞の遺伝子解析、発現解析を行う１細胞ゲノム解析・発現解析モジュール３０の構成についての一例を図示する。反応槽３０１は窪みを複数個有するアルミ、ニッケル、ないし金の薄板から構成されている。窪み領域における薄板の厚さは10から30ミクロン程度であり、隣り合った窪みの間の領域は全体的に強度を担保するために、厚さが100ミクロンから500ミクロンとする。反応槽３０１は四角もしくは円形の反応槽枠の底面に固定されており、反応槽熱交換槽３０２との脱着が容易である構造となっている。反応槽熱交換槽３０２に導入される液体の温度は液体リザーバタンク３０３の内部に配置されている熱源により過熱されている。熱源の表面から迅速に熱を奪い、液体リザーバタンク３０３内部の温度を均一にするために、攪拌機構が用意されている。液体リザーバタンク中の液体はポンプ３０４により流路内部を導かれる。切り替えバルブ３０５によって、液体は反応槽熱交換槽３０２に導かれるか、バイパス流路に導かれることにより直接液体リザーバタンク３０３に戻る。必要に応じて、補助温度制御機構３０６によって、液体の温度が僅かに制御され、液体リザーバタンク３０３内部の温度変動を抑制するようになっている。反応槽熱交換槽３０２の基本構成としては、異なる温度の液体を導入するインレットＡ（３０７）、インレットＢ（３０８）を有している。数はサンプル液の温度を変化させたい複数の温度に一致する数だけ2温度分以上の複数を用意することとなり、例えば3温度系を達成したい場合には3つとなり、本実施例で示した２個に限定されない。また、反応槽熱交換槽３０２の液体を液体リザーバタンク３０３に戻すために、複数のアウトレット、アウトレットＡ（３０９）、とアウトレットＢ（３１０）を有する。数は２に限定されない。色々な形状の反応槽を用いることが可能であり、一つの例として反応槽Ａ、反応槽Ｂ、反応槽Ｃ、反応槽Ｄを示す。ここで、反応槽熱交換槽３０２の液体については、水を用いても良いが、熱容量が大きく、かつ、粘性が低い液体を用いても良い。例えば、液体アンモニアなどがある。また、反応槽熱交換槽３０２の液体については、水より沸点の高い液体を用いることで、確実に、サンプル液を１００度にしたり、あるいは、水より凝固点の低い液体を用いることで、装置内で循環する液体の凝固を防ぎながら水の凝固点までの温度の変化を確実に行うこともできる。
　また、反応槽枠には、反応槽３０１内のサンプル液３１１の反応によって変化する、サンプル液中の蛍光色素の蛍光強度の変化を、１つあるいは複数の反応槽３０１の各々について計測できるように、蛍光色素の励起光ならびに蛍光を透過する光学窓が配置されており、また、蛍光検出器３１２が配置されることで、計測された各反応槽３０１の蛍光強度の時間変化を計測することができる。図５の実施例では、複数の蛍光検出器３１２各々の内に、励起光照射機構と、蛍光検出機構が具有しており、異なるプライマー、あるいは異なるサンプル液を滴下した複数の反応槽３０１の各々の異なるＰＣＲ増幅情報を独立して計測することができる構成となっている。また、蛍光検出器３１２で取得された蛍光強度データは、制御解析部３１３で記録され、ＰＣＲ反応によって得られたサンプル液内のＤＮＡ量、あるいは、ｍＲＮＡ量を見積もる機能を有する。さらに、制御解析部３１３では、切り替えバルブ３０５の切り替え情報を取得することで、バルブ切り替え後のサンプル液３１１の温度変化が目的の温度に達したかどうかを、蛍光強度の時間変化から見積もる機能、およびその結果に基づいてバルブ切り替えを制御する機構も有する。これは、蛍光色素が普遍的にもつ水分子の運動に基づいた蛍光消光が液温に依存することを利用して、蛍光強度の単位時間での変化量が小さくなること、あるいは、ゼロとなることから見積もるものであり、特に、ＤＮＡを変性させる高温状態の達成の確認に有効である。
　また、本実施例では、各反応槽３０１に１つの検出器を配置したが、蛍光例起用光源と冷却ＣＣＤカメラなどの蛍光定量検出が可能なカメラを組み合わせて複数の反応槽の蛍光強度変化を計測しても良い。あるいは、反応槽３０１の数より少ない検出器を用いる場合には、Ｘ－Ｙ面で高速に移動することができる機械式駆動機構を検出器と組み合わせることで、すべての反応槽の蛍光強度を計測しても良い。
　反応に必要な試薬は凍結乾燥しておくと便利である。反応槽の底部に凍結乾燥試薬を調製しておくことは可能である。また、サンプルを分注する際に用いられる分注チップ内部にプラグ状の凍結乾燥試薬を形成しておけば、サンプルを上下に移動させることにより試薬をサンプル中に溶解することが可能である。または、ナイロン繊維等が束ねられている繊維玉表面に凍結乾燥試薬を形成しておき、反応槽内部のサンプル中に挿入して攪拌することにより凍結乾燥試薬を溶解することも可能である。
　薄膜から構成されている反応槽３０１を直接ハンドリングするのは不便であるので、反応槽３０１を反応槽枠に固定すると便利である。反応槽枠は断熱性材質であるポリスチレン、ポリカーボネート、ＰＥＥＫ，アクリル等で形成することが望ましく、また反応槽３０１との結合面積を抑えることが、反応槽３０１の迅速かつ高精度な昇温、降温に望ましい。反応槽３０１を反応槽熱交換槽３０２に装着するにあたって、反応槽枠の表面にネジ山を形成しておき、反応槽枠をねじ込む方法がある。水密性の保持のために、開口部にシールを装着することが望ましい。または、テーパー状反応槽枠を採用し、圧力のみで装着することも可能である。
　次に、バルブの切り替え機構の具体例を示す。反応槽３０１に液体を導入するためのインレットバルブＡ、インレットバルブＢ、外部に導くためのアウトレットバルブＡとアウトレットバルブＢがある。インレットバルブＡから導かれる液体はアウトレットバルブＡから液体リザーバタンクに戻り、インレットバルブＡから導かれる液体はアウトレットバウルＢから別の液体リザーバタンクに戻る。この二つの状態を交互に繰り替えることにより、反応槽中のサンプルを反応することができる。さらに望ましいバルブ切り替え方法としては、上記の二つの状態以外に、インレットバルブＢとアウトレットバルブＡ、もしくはインレットバルブＡとアウトレットバルブＢが一瞬の間同時に開放することにより、異なる温度の液体が混合することを抑制でき、それぞれの系の液体リザーバタンクの温度制御が容易になる。PCRを行うときの条件は、例えば、反応バッファー 1.0 μL、2mM dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP) 1μL、25 mM 硫酸マグネシウム 1.2 μL、10％牛胎仔血清 0.125μL、SYBR Green I 0.5 μL、プライマー2種類各0.6μL、 滅菌水 3.725μL、KOD plus polymerase 0.25μL、ゲノムDNA1.0 μLの割合で混ぜ合わせたものを使うことができる。温度条件としては、まず95℃ 10 sec行い、次に95℃ 1 sec、60℃ 3 secの温度変化を40サイクルで計測することが出来る。
　図6は、各モジュール間での試料の搬送を行う送液モジュール４０の構成の一例を図示したものである。シャーシ４０６上に配置された各モジュール間での液体のやり取りを行う分注ヘッド４０１、分注チップ４０２を有しており、また、Ｚ軸方向での分注ヘッドの高さ方向の制御をする機能としてのＺ軸移動ガイド４０３及びＺ軸移動モータ４０４と、アームの回転機構としてのアーム回転モータ４０５とによる、Ｘ－Ｙ面での分注ヘッド４０１の位置の制御機能を有している。
　図７は、本発明の細胞分析装置を用いて行う細胞分析のうち、炭疽菌の芽胞等の細胞を覆う殻によって細胞中の核酸成分が容易に試料溶液中に溶出しない試料について、細胞の発現解析をする手順の前に、細胞を覆う殻を破砕する手順が導入されているサンプルの採取から分析までの手順の一例を図示したものである。この細胞破砕を行う手順を加えることで、本細胞分析装置は、上で述べた血液細胞の分析手段とまったく同様の手段によって、炭疽菌の芽胞等の細胞の分析を行うことが可能となる。
　図８は、炭疽菌などの芽胞を有する細胞について、細胞内の遺伝子、発現情報を分析するために微量サンプルの細胞を覆う芽胞等の殻を自動的に破砕するための基本構造の一例を模式的に示す。容器８０１に微量サンプル８０２を分注し、破砕用の回転体８０３を容器８０１の内部に置く。容器８０１の内部で回転体８０３を回転させるためには、回転体８０３を回転シャフト８０４で容器８０１に押し付ける。回転体８０３が容器内部で自転および公転することにより、微量サンプル中の試料８０５が研磨剤８０６によって磨り潰される。工程終了後には、回転体８０３を除去することにより処理後の試料８０５を容易に回収することができる。回転体８０３および容器１は簡単な構造であるため、消耗品として扱っても問題もない。
　図９は、図８で示した基本的な細胞破砕機構の種々のバリエーションを模式的に示す。高い効率で試料を破砕するためには、回転体が容器に密接に触れることが必要である。図９Aに示す例では、回転体８１０を含む容器８１１はゴム等の柔軟性構造体８１２に保持されている。シャフト８１３の先端部位８１４は斜めにカットされていることから、シャフト８１３が回転体８１０に押し付けられると、回転体８１０は容器８１１を下方向および横方向に押し付けることになり、柔軟性構造８１２が変形することにより、圧力が吸収されることになる。結果として、回転シャフト８１３に過剰なストレスを与えることなく、回転体８１０と容器８１１を密接に保持しながら、試料を破砕することができる。図９Bに示すように、ストレスを逃がす方法として、回転シャフト内部に垂直および横方向に変形するバネ機構８１５を組み込むことも可能である。
　図１０は、本発明において使用する細胞破砕機構のさまざまな形状の回転体および回転シャフトの可能性を示す。シャフト先端が斜めにカットされているもの(図１０a)以外にも、緩やかな曲面に窪んでいる（図１０b）、擂鉢状である（図１０c）などでも良い。また、回転体は真球である必要はなく、シャフトと回転体が緩やかに噛み合う様な構造であってもよい（図１０d）。半球を、斜めにカットされた回転シャフトで回転しても良い（図１０e）。さらに、卵型の回転体や（図１０f）、回転シャフトに噛み合うような突起構造を有しても良い（図１０g）。また、お皿状の回転体をシャフトで回転させることも可能である（図１０h）。
　図１１に、本発明における細胞破砕工程の一例を示す。容器８３０の中には、回転体８３１と研磨剤８３２が封入されている（図１１a）。破砕する直前に、封印８３３を破り（図１１b）、細胞を含むサンプル８３４を容器８３０内に分注する（図１１c）。回転体８３１を回転シャフト８３５で押し付けながら回転することにより（図１１d）、サンプル中の細胞が研磨剤８３２で破砕され、成分８３６が溶出する（図１１e）。破砕作業の終了後には、回転体８３１を容器８３０から除去するとサンプルの回収が容易となる（図１１f）。回転体の除去方法としては、負圧、磁力、静電気力を利用することが可能であり、回転シャフト内にその様な機構を組み込むことも可能である。勿論、特化された機構を別に用意しても構わない。
　図１２に、本発明における細胞破砕工程が自動化された場合に使用され得る機構の概念図を示す。複数の容器８４０が一体化されて形成されていて、それぞれの容器内には、予め回転体が封印されている。封を破るためには、回転シャフトを直接押し付けて破る（図１２A）、回転シャフトに装着された開封用カッター８４１にて破る（図１２B）等の方法が可能である。シャフトと容器の相対位置を自動的に変更することが可能で、複数のサンプルを次々と破砕できる。
　図１３に、本発明の細胞分析装置システムにおいても使用されうる本発明のオンチップ・セルソーターチップの一例を示す。セルソーターチップ１３０１においては、チップ基板上に軸対象な3つの流路がそれぞれ上流側（１３０２，１３０４，１３０６）、下流側（１３０３，１３０５，１３０７）に対称に配置されており、これら３つの流路の合流点では、３つの流路は層流を保ちながら合流し、そのままの状態を維持して下流の３つの流路に分岐してゆく。したがって、試料が流れる中央の流路の上流側１３０２は、下流側中央の流路１３０３へ、２つのサイドシースフローについてもそれぞれ、上流側流路１３０４が下流側１３０５へ、また上流側流路１３０６から下流側流路１３０７へと誘導されるようになっている。また、３つの上流側流路の入り口は、それぞれ入り口開口部１３０８、１３０９、１３１０につながっている。特に、試料液リザーバー１３２２につながった、試料が流れる流路上流の入り口開口部１３０８については、典型的には（しかし、限定されないが）、小型の円環状キャップ（または栓）を付加することで、シース液リザーバー１３１１に蓄えられたシース液を流す流路の入り口開口部１３０９、１３１０とは切り離されており、試料溶液が拡散することが無いように配置されている。下流側のリザーバーも上流側と同じように配置されており、廃液リザーバー１３１２は、２つのサイドシース液が流れる流路の出口開口部１３１３、１３１４とつながっているが、精製試料回収用のリザーバー１３２３は、回収精製サンプルの出口開口部１３１５とつながっており、出口開口部１３１５には、典型的には（しかし、限定されないが）、小型の円環状キャップが付加されており、回収された精製試料は、廃液リザーバーに拡散しないようになっている。
　また、流速の発生に試料リザーバーとシース液リザーバーの液面の高さの廃液・回収液リザーバーの液面高さとの差を利用した重力型、あるいはリザーバー上面にキャップを付けて加圧空気を用いて液面に圧力を加えて流速を発生させる場合には、合流点で理想的な層流が発生するために、３つの流れの速度が同じになるように、合流点からの上流側、下流側それぞれの３つの流路については、その流路断面の形状、合流点から溶液入り口までの距離が一致しているものとすることが好適である。また、サイドシースフロー（あるいは廃液）のリザーバーの断面積と、内側の試料／回収サンプルのリザーバーの断面積の比を１（試料・回収リザーバー）：２（サイドシース液リザーバー・廃液リザーバー）とすることが望ましい。これは、各リザーバーの液面高さの変化が異なる場合には、液面の高さの減少率が異なってしまい、これが最終的に合流点での層流の発生を破壊することとなるからである。したがって、試料入り口１に対して入り口が２つあるシース液で単位時間当たりの液の流れ出し量が１：２であることから、液面の高さが一致するように、各リザーバーの断面積の比を１：２とすることとした。これを普遍化すると、各リザーバーに結合している流路の総断面積の比が、各リザーバーの断面積の比に一致するようにすることが望ましい。
　次に、６つの流路のすべてが合流する、壁のない３つの層流が合流している地点に、電極が配置されている。電極は、典型的には、ゲル電極で構成される。ゲルについては、たとえば電解質が電流キャリアーとなるようにＮａＣｌが溶け込まされたアガロースゲルを用いている。ゲルの先端が流路に直接接触できるように、ゲルは、ゲル充填のためのY字型の流路１３１６に、入り口１３１７からゾル状態のアガロースゲルを入れ、これが出口１３１８に向かうことできるために、ゲルはセルソーター流路の中に侵入しないで境界線で表面張力によって静止する。ゲル電極を使用する利点として、電場を印加するために電源１３２０に接続された白金線などの電線１３１９をこのゲル導入点に差し込むことで、流路に接するゲル電極境界では、通常の金属電極では気泡が流路内で発生してしまう電圧以上に上げても気泡の発生はなく、電流を印加できる。電場印加のｏｎ－ｏｆｆは、例えば、スイッチ１３２１を利用して調節できる。
　図１４は、特に図１３のA-A断面での、上流側のリザーバーの断面の一例を模式的に示したものである。セルソーターチップ１４０１には流路１４０９が埋め込まれている。典型的な実施形態では、キャップ１４０２によって外側のシース液リザーバー１４０３の上面が塞がれることで、加圧空気導入パイプ１４０５から適切な流速になる空気圧が供給される。図からもわかるように、試料が流れる流路１４０９は試料リザーバー１４０４につながっており、試料液とシース液は混ざらないようになっている。また、好適かつ典型的な実施形態では、試料リザーバーとシース液リザーバーとの断面積比は、流路数の比が１：２のため、１：２とされ、各流路につながる各リザーバーの液面高さが同じになるように調整されている。
　さらにより大量の試料を処理できるように、液を供給する機構を付加することができる。これは、試料溶液導入チューブ１４０６、あるいはシース液導入チューブ１４０７、および各リザーバーの壁面に導電性計測を用いた水位計測センサー１４０８が組み込まれている。これによって、水位が一定以下になると、一定の高さになるまで試料液をチューブを介して供給することができる。水位計測センサー１４０８は、それぞれ設定したい高さの水位の下限および水位の上限に配置した電極または電極対等で構成することができる。
　図１５は、本発明のセルソーターにおいて、大量試料を扱うための別の構成の一例を示した例である。チップ１５０１上に３つの大型リザーバー１５０２が３つの流路のそれぞれの上流に配置されており、これらについては空気圧印加装置１５０３から圧力センサー１５０４を経て、分配バルブ１５０５を使って圧力をより柔軟に分配することができる。また、試料の回収については、選別（精製）された試料も廃液もチップより下の位置に配置された選別試料回収リザーバー１５０６および廃液回収リザーバー１５０７でそれぞれ回収されることとなる。
　図１６は、実際の試料がチップ中で回収される手順を模式的に示したものである。上流から流れてきた試料溶液流１６０１は、２つのサイドシース溶液の流れ１６０２と１６０３に挟まれて、その配置を維持しながら、細胞モニター領域１６０４に進む。そこで各細胞の形状判別、蛍光標識の有無などを確認して、その結果に基づいて下流で細胞分離を行う。回収したい細胞が流れてきたときには、そのまま下流の選別試料回収流路１６０６に流し、廃棄したい細胞あるいは微粒子が流れてきた場合には、その電荷が正負のどちらであっても、対向して配置された２つのゲル電極１６０５に電圧を印加することで、２つのサイドシース流１６０７のどちらかに移動して、排除することできる。
　図１７は、画像処理型セルソーターにおける細胞回収の指標のひとつを説明する模式図である。通常、細胞はG0周期にあり、核が存在しており（図１７Ａ(a)）、これは明確に細胞内での黒い球として画像認識される（図１７B(a)）。他方、分裂期にある細胞は、核が消失しているため（図１７A(b)）、細胞を画像認識しても核を確認することができない（図１７B(b)）。従来の抗体標識等の標識技術は、細胞の状態を確認することは困難なため、本発明においては、このような画像認識によって、細胞の形状の確認に加えて、細胞内の核の有無によって分裂中の細胞を回収することができる。一般に、血中を流れる正常細胞はすでに最終分化しているものが大半であるが、本発明により、血中で細胞分裂をしている細胞を回収することで、血中がん細胞や幹細胞などの分裂能をもった細胞を回収することが可能となる。
　図１８は、実際に本発明の画像認識型セルソーターを動作させるときのフラッシュ光源を用いた時の動作タイミングチャートの一例である。高速カメラを用いてチップ中を移動する細胞を観察する場合、そのブレを防ぐためには、対物レンズの倍率に基づいてカメラの1画素の空間分解能を算出し、試料の流れについての移動速度が決まっている場合、その流速で１画素サイズ分の移動量を算出し、その移動にかかる時間だけフラッシュライトをONにすればよい。すなわち、
 
　フラッシュ時間　＝　画素サイズ／流速
 
で、各シャッターのインターバルにおいてフラッシュを1回発光させれば良い。たとえば、1/2,000秒カメラの画素サイズは12 μm×12 μmであり、20倍の対物レンズで観察した場合の画素分解能は0.6 μm/pixelであることから、60cm/sの流れで、１μｓの速度でフラッシュ発火を行うことができるLED光源を用いれば、実際にブレの無い画像を取得することができる。
　本発明は、血中の微量な対象細胞を1細胞単位で精製して、その対象細胞の正確な遺伝子情報、発現情報の解析等を行うために有用である。本発明は、炭疽菌などの芽胞を有する微量な対象細胞を1細胞単位で精製し、高速で、その対象細胞の正確な遺伝子情報、発現情報の解析等を行うために有用である。
１　細胞分析装置システム
１０　細胞濃縮・染色・脱色モジュール
１０１　細胞サンプル容器
１０２　染色剤容器
１０３　洗浄剤容器
１０４　分注ヘッド
１０５　ターンテーブル
１０６　濃縮・脱色フィルター
１０７　濃縮チャンバー
１０８　チャンバー
１０９　圧力ポンプ
１１０　廃液回収チューブ
１１１　回収ヘッド
１１２　回収チューブ
１１３　回収チップ
１１４　シャーシ
２０　画像検出型１細胞分離・精製モジュール
２０１　レーザー
２０２　ミラー
２０３　集光レンズ
２０４　ダイクロイックミラー
２０５　フィルター
２０６　蛍光検出用フォトマルチプライヤー
２０７　高速カメラ
２０８　前方散乱光検出用フォトダイオード
２０９　セルソーターチップ
２１０　チップ基板
２１１　マイクロ流路
２１２　流入口
２１３　流出口
２１４　細胞濃縮液入り口
２１５　細胞濃縮部
２１６　収束部
２１７　選別部
２１８　細胞検出領域
２１９　印加後の細胞の流れ
２２０　印加前の粒子の流れ
２２１　流出口
２２２　流出口
２２３　廃液回収部
２２４　細胞回収部
２２５　Ｖ字櫛形電極
３０　１細胞ゲノム解析・発現解析モジュール
３１　第一の温度制御ユニット
３２　第二の温度制御ユニット
３０１　反応槽
３０２　熱交換槽
３０３　液体リザーバタンク
３０４　ポンプ
３０５　切り替えバルブ
３０６　補助温度制御機構
３０７　インレットＡ
３０８　インレットＢ
３０９　アウトレットＡ
３１０　アウトレットＢ
３１１　サンプル液
３１２　蛍光検出器
３１３　制御解析部
３１４　逆支弁
３１５　制御信号
４０　送液モジュール
４０１　分注ヘッド
４０２　分注チップ
４０３　Ｚ軸移動ガイド
４０４　Ｚ軸移動モータ
４０５ａ，ｂ　アーム回転モータ
４０６　シャーシ
５０　制御・解析モジュール（コンピュータ）
８０１　容器
８０２　微量サンプル
８０３　回転体
８０４　回転シャフト
８０５　試料
８０６　研磨剤
８１０　回転体
８１１　容器
８１２　柔軟性構造体
８１３　回転シャフト
８１４　先端部位
８１５　バネ機構
８２０　曲面カット
８２１　擂鉢状カット
８２２　噛み合い構造
８２３　半球型回転体
８２４　卵状回転体
８２５　突起型回転体
８２６　お碗状回転体
８３０　容器
８３１　回転体
８３２　研磨剤
８３３　封印
８３４　サンプル
８３５　回転シャフト
８３６　成分
８４０　一体化容器
８４１　開封用カッター
１３０１　セルソーターチップ
１３０２，１３０４，１３０６　上流側流路
１３０３，１３０５，１３０７　下流側流路
１３０８　試料液用入り口開口部
１３０９，１３１０　シース液用入り口開口部
１３１１　シース液リザーバー
１３１２　廃液リザーバー
１３１３，１３１４　シース液用出口開口部
１３１５　精製試料液用出口開口部
１３１６　ゲル充填のための流路
１３１７　ゲル充填のための入り口開口部
１３１８　ゲル充填のための出口開口部
１３１９　電線
１３２０　電源
１３２１　スイッチ
１３２２　試料液リザーバー
１３２３　精製試料回収用リザーバー
１４０１　セルソーターチップ
１４０２　キャップ
１４０３　シース液リザーバー
１４０４　試料液リザーバー
１４０５　加圧空気導入パイプ
１４０６　試料溶液導入チューブ
１４０７　シース液導入チューブ
１４０８　水位計測センサー
１４０９　流路
１５０１　セルソーターチップ
１５０２　大型リザーバー
１５０３　空気圧印加装置
１５０４　圧力センサー
１５０５　分配バルブ
１５０６　選別試料回収リザーバー
１５０７　廃液回収リザーバー
１６０１　試料溶液の流れ
１６０２，１６０３　サイドシース流
１６０４　細胞モニター領域
１６０５　ゲル電極
１６０６　選別試料回収流路
１６０７　サイドシース流

Claims (19)

  1. 　(A) 被験体からの細胞試料液を濃縮、染色、洗浄する第１の装置と、
    　(B) 前記第１の装置からの染色された細胞の試料液を濃縮・分離・精製する第２の装置と、
    　(C) 前記第２の装置からの細胞試料液中の精製された細胞の遺伝子解析・発現解析を行う第３の装置と、
    　(D) 前記第１～第３の装置にわたって連続的に前記細胞試料液を送液する第４の装置と、
    　(E) 前記各装置の動作を制御し、前記細胞試料の解析を行う制御・解析部と
    を備える細胞分析装置システムであって、
    　　(a) 前記第１の装置が、
    　　　前記細胞試料液中の細胞を濃縮、染色、洗浄するフィルターを備えたチャンバーと、
    　　　前記細胞試料液、染色液および洗浄液をそれぞれ収容する容器と、
    　　　各前記容器中の各液を前記チャンバー中に順次導入する機構と、
    　　を備え、
    　　(b) 前記第２の装置が、
    　　　対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す流路を備えるセルソーターチップであって、前記流路が、前記細胞の濃縮が行われる第一の流路と、前記濃縮された前記細胞の検出および前記対象細胞の選別が行われる、前記第一の流路から分岐する第二の流路とを含む、セルソーターチップと、
    　　　各前記流路を流れる前記細胞が、前記第一の流路において濃縮され、かつ前記第二の流路において所望の方向に収束されるように、各前記流路を流れる前記細胞に対して外力を与える機構と、
    　　　前記第二の流路中を流れる前記細胞に光を照射する光照射手段と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで該細胞の画像を取得する高速カメラとを含む光学系と、
    　　を備え、
    　　(c) 前記第３の装置が、
    　　　試料液を添加して反応させる反応槽と、
    　　　前記反応槽との間で熱を交換する熱交換槽と、
    　　　前記熱交換槽の温度を制御する温度制御機構と、
    　　を備える、細胞分析装置システム。
  2. 　前記細胞試料液中の精製された細胞の遺伝子解析・発現解析を行う第３の装置の前段に、前記細胞試料液を送液する第４の装置によって搬送された前記細胞の内容物を細胞破砕によって試料液に溶出させる細胞破砕機構をさらに含み、
    　前記制御・解析部が、前記細胞試料液を送液する第４の装置によって前記第２の装置からの前記細胞試料液が前記細胞破砕機構へ搬送され、前記細胞破砕機構において破砕された試料液が、前記第４の装置によって前記第３の装置に搬送されるように前記各部を制御する、請求項１に記載の細胞分析装置システム。
  3. 　前記細胞破砕機構が、
    　前記細胞試料を容れるための容器と、
    　前記容器内にて細胞を破砕するための破砕用回転体と、
    　前記容器内にて細胞を破砕するための研磨剤とを含み、
    　　前記細胞試料と前記研磨剤とが前記容器の内部に添加され、自転および公転運動が厳密に制御された前記破砕用回転体の動きにより、前記細胞試料が破砕される、請求項２に記載の細胞分析装置システム。
  4. 　前記細胞破砕機構がさらに回転シャフトを含み、
    　前記破砕用回転体が前記回転シャフトにより上から押し付けられることによって、前記容器の内部で回転し、前記破砕用回転体と前記回転シャフト間の摩擦力および滑りの程度が、前記破砕用回転体と回転シャフト間の圧力により制御される、請求項３に記載の細胞分析装置システム。
  5. 　前記細胞破砕機構が、破砕用回転体の回転軸と回転シャフトの回転軸をずらすことにより、容器の側面に対して直角方向に破砕用回転体を押し付ける力を発生させることが可能な機構を備える、請求項４に記載の細胞分析装置システム。
  6. 　前記細胞破砕機構が、前記回転シャフトの磁力、静電気力、または気体の圧力差による吸引力により前記破砕用回転体が前記容器の内部から持ち上げられ、除去されることが可能な機構を備える、請求項４に記載の細胞分析装置システム。
  7. 　前記細胞破砕機構において、前記容器の自動交換を可能とする複数の容器を搭載した駆動機構を備えることにより異なる細胞試料間での汚染を排除できることを特徴とする、請求項３～６のいずれかに記載の細胞分析装置システム。
  8. 　前記細胞破砕機構において、未使用の前記容器の内部には前記破砕用回転体が機密性シールにより封印して容れられており、前記細胞試料破砕時には前記容器および前記破砕用回転体が汚染されていないことが保証できることを特徴とする、請求項３～７のいずれかに記載の細胞分析装置システム。
  9. 　(i) 対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す流路を備えるセルソーターチップであって、前記流路が、前記細胞の濃縮が行われる第一の流路と、前記濃縮された前記細胞の検出および前記対象細胞の選別が行われる、前記第一の流路から分岐する第二の流路とを含む、セルソーターチップと、
    　(ii) 各前記流路を流れる前記細胞が、前記第一の流路において濃縮され、かつ前記第二の流路において所望の方向に収束されるように、各前記流路を流れる前記細胞に対して外力を与える機構と、
    　(iii) 前記第二の流路中を流れる前記細胞に光を照射する光照射手段と、少なくとも２００フレーム／秒の画像取り込みレートで該細胞の画像を取得する高速カメラとを含む光学系と、
    　(iv）前記各部の動作を制御し、前記光学系により取り込まれた各前記細胞の画像を解析する制御・解析部と、
    を備える、画像検出型一細胞分離・精製装置。
  10. 　前記外力が、超音波放射圧、重力、静電力、または誘電電気泳動力である、請求項９に記載の装置。
  11. 　前記対象細胞を含む細胞試料が、血液に由来する、請求項９または１０に記載の装置。
  12. 　前記対象細胞が、癌細胞を含む、請求項９～１１のいずれかに記載の装置。
  13. 　前記制御・解析部が、前記光学系から得られる前記細胞の画像を２値化し、該２値化画像の輝度重心、面積、周囲長、長径、および短径からなる群から選択される少なくとも１つの指標によって、各前記細胞を一細胞レベルで検出し識別する、請求項９～１２のいずれかに記載の装置。
  14. 　前記細胞試料液中の前記細胞が蛍光標識されており、前記光学系が、蛍光検出手段をさらに含み、前記細胞の蛍光画像の情報が追加的な指標として前記制御・解析部により利用される、請求項１３に記載の装置。
  15. 　同じ長さと断面積の１つの試料流路とその両脇に対称に配置された２つのバッファ液流路が合流するように配置され、合流後に下流で再び同じ長さと断面積の中央の回収用流路とその両脇の２つの廃液流路に分配され、上流の３つの流路の入り口を覆うシース液リザーバーと、その中に試料を満たす試料液リザーバーが、その断面積の比が、流路数の比と同じ２：１となるように配置されており液が流れても両者の液面高さが一致するように構成されており、同様に下流でも廃液リザーバーと回収細胞用リザーバーの断面積の比が２：１となるように配置されており、合流点の上流に高速カメラおよび蛍光検出によって細胞を同定する機構を有し、合流点に対称にゲル電極が接するように配置されており、排除したい細胞にのみ電場を印加することを特徴としたオンチップ・セルソーター。
  16. 　前記セルソーターのリザーバーにおいて、シース液リザーバー上面に配置された栓と、栓を貫通して圧縮空気を印加する手段と、シース液リザーバーと試料リザーバーに液を連続して追加供給できる手段と、シース液リザーバーと試薬リザーバーの両者での液面高さを計測することができる電気センサーとを備えることを特徴とした請求項１５に記載のセルソーター。
  17. 　前記セルソーターのリザーバーにおいて、試薬液および２つのシース液を保存する個別の容器が、おのおの３つの流路の上流側入り口にそれぞれ配置されていることを特徴とした請求項１５に記載のセルソーター
  18. 　画像認識型セルソーターにおいて、細胞像の中での核の像の有無を基準として、選択的に細胞分裂中の細胞を回収することを特徴としたオンチップ・セルソーター。
  19. 　画像処理型セルソーターにおいて、像のブレを防ぐために、高速カメラの撮影各フレームレート速度において、各フレームで一回発火する時間について、
     
    フラッシュ時間　＝　画素サイズ／流速
     
    の関係で決めることを特徴としたオンチップ・セルソーターシステム。
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