WO2010075824A1

WO2010075824A1 - Uso de peptido tipo apl para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales y diabetes tipo i

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Publication number: WO2010075824A1
Application number: PCT/CU2009/000009
Authority: WO
Inventors: Ariana BARBERÁ BETANCOURT; María del Carmen DOMÍNGUEZ HORTA; Norailys Lorenzo Perez; Gabriel Ramón PADRÓN PALOMARES; Viviana FALCÓN CAMA; Ivón MENÉNDEZ VALDÉS
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2008-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2010-07-08
Anticipated expiration: 2011-06-29
Also published as: BRPI0923832A2; US20120035106A1; KR20110119677A; DK2374468T3; ZA201105320B; JP2012514013A; CU23701A1; AU2009335405A1; ES2438096T3; MX2011007033A; RU2524630C2; EP2374468A1; CA2748493C; CN102307587A; KR101620341B1; EP2374468B1; US8410057B2; CA2748493A1; CN102307587B; JP5646506B2

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la medicina, particularmente con el uso de un péptido tipo APL, derivado de la proteína de estrés térmico de 60 kDa humana, o sus análogos para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y la diabetes mellitus tipo I. Dicho péptido se biodistribuye al tracto gastrointestinal y promueve la inducción de apoptosis de células T activadas de la lámina propia intestinal y de la sangre periférica de pacientes con la enfermedad de Crohn. Además, este péptido induce apoptosis en células mononucleares de pacientes con diabetes mellitus tipo I.

Description

USO DE PEPTIDO TIPO APL PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS INTESTINALES Y DIABETES TIPO I

Campo de Ia técnica

La presente invención está relacionada con Ia rama de Ia medicina, particularmente con el uso de un péptido modificado tipo APL (del inglés Altered Peptide Ligand, abreviado APL) o sus análogos en el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales (como Ia enfermedad de Crohn y Ia colitis ulcerosa) y de Ia diabetes mellitus tipo I.

Estado de Ia técnica anterior

Las enfermedades inflamatorias intestinales, como Ia enfermedad de Crohn y Ia colitis ulcerosa, se producen como resultado de Ia activación de linfocitos T de Ia lámina propia del tracto gastrointestinal que ejercen funciones efectoras potentes dirigidas contra Ia flora comensal. Sin embargo, el mecanismo exacto que guía a Ia activación crónica de estos linfocitos no se conoce (Balfour R (2006) Mechanism of Disease: pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative colitis. Nature clinical practice. Gastroenterology and Hepatology 3 (7): 390-407). Aproximadamente 2x10⁴ bacterias residen en el tracto gastrointestinal, y esta presión inmunológica representa un gran reto al sistema inmune que tiene que realizar un balance entre una respuesta apropiada a organismos patogénicos y Ia tolerancia a organismos no patogénicos. El sistema inmune mucosal posee mecanismos para evitar una respuesta inflamatoria innecesaria e incontrolada. Dentro de estos mecanismos, Ia disminución de linfocitos T activados por apoptosis es muy importante (Peppelenbosch MP and van Deventer SJH (2004) T cell apoptosis and inflammatory bowel disease. Gut 53: 1556-1558). El sistema inmune en condiciones normales es capaz de eliminar rápidamente Ia infección de bacterias entéricas patogénicas, disminuir Ia respuesta inmune innata y reparar Ia mucosa afectada sin estimular una respuesta de células T. Sin embargo, el sistema inmune de hospederos susceptibles genéticamente, no es capaz de montar una respuesta innata apropiada, y/o generar una respuesta inmune tolerogénica a agentes microbianos comensales, por Io que se activa Ia respuesta de células T patogénicas a bacterias comensales, Io que conduce a Ia inflamación intestinal crónica (Podolsky DK (2002) Inflammatory bowel disease. N Engl J Med 347: 417-29). Por tanto, en las enfermedades inflamatorias intestinales se produce un fallo en los mecanismos que controlan apropiadamente los procesos inflamatorios iniciados por factores ambientales, como puede ser una infección intestinal aguda. La resistencia a Ia apoptosis de las células T, Ia pérdida de señales inhibitorias y Ia exposición continua a antígenos luminales y adyuvantes ayudan a sustentar Ia respuesta inflamatoria (Mudter J and Neurath MF (2007) Apoptosis of T cells and the control of inflammatory bowel disease: therapeutic implications. Gut 56:293-303). En Ia enfermedad de Crohn ocurre un reclutamiento activo de macrófagos, neutrófilos y células T hacia el intestino, Io cual conlleva a un incremento en Ia expresión de moléculas co-estimulatorias y de adhesión, así como de citocinas proinflamatorias relacionadas con Ia respuesta celular de tipo TH1 (del inglés T cell helper 1 , abreviado TH1 ), como por ejemplo: interleucina (IL)-6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral alfa (del inglés Tumor Necrosis Factor, abreviado TNF) TNF-α y con Ia respuesta celular de tipo TH17 (del inglés T cell helper 17, abreviado TH17) como: IL-12, IL-23 e IL-27 (Balfour R (2006) Mechanism of Disease: pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative colitis. Nature clinical practice. Gastroenterology and Hepatology 3 (7): 390-407). El número de células inflamatorias en el intestino está determinado por el reclutamiento, proliferación y muerte por necrosis o apoptosis de estas células. En Ia mucosa intestinal normal, las células T de Ia lámina propia son susceptibles a Ia muerte celular inducida por activación (a través del sistema del Fas/Fas ligando), Io que logra controlar Ia proliferación linfocitaha (Bu P et al. (2001 ) Apoptosis: one of the mechanisms that maintains unresponsiveness of the intestinal mucosal immune system. J Immunol 166: 6399-6403). Sin embargo, existen numerosos reportes en Ia literatura que indican que las células T de Ia lámina propia de pacientes con Ia enfermedad de Crohn son resistentes a Ia apoptosis, Io cual puede conducir a una población expandida de células TH1 efectoras activadas que pueden contribuir a perpetuar Ia enfermedad y Ia inflamación crónica (Boirivant M et al. (1999) Lamina propria T cells in Crohn's disease and other gastrointestinal inflammation show defective CD2 pathway-induced apoptosis. Gastroenterology 116: 557-565). Por otra parte, en las células T mucosales de pacientes con Ia enfermedad de Crohn existe un desequilibrio entre Ia proporción de moléculas anti-apoptóticas como el Bcl-2 y pro-apoptóticas como Bax, a favor de las moléculas anti-apoptóticas, Io que favorece Ia sobrevida de estas células (Ina K et al. (1999) Resistence of Crohn's disease T cells to múltiple apoptotic signáis is associated with Bcl2/Bax mucosal imbalance. J Immunol 163:1081-90; ltoh J et al. (2001 ) Decreased Bax expression by mucosal T cells favours resistance to apoptosis in Crohn's disease. Gut 49: 35- 41 ). Por otra parte, Sturm y colaboradores estudiaron las propiedades del ciclo celular de células T mucosales de pacientes con Ia enfermedad de Crohn, con colitis ulcerosa y de controles sanos. Ellos comprobaron que las células T mucosales de pacientes con Ia enfermedad de Crohn tienen una gran capacidad para expandirse debido a que su ciclo celular progresa más rápidamente que el de las células de los pacientes con colitis ulcerosa o el de los controles sanos. Lo anterior pudiera explicar por qué Ia mucosa de pacientes con Ia enfermedad de Crohn contiene un exceso de células T, Io que indica un estado de hiperreactividad y de que se produzca Ia pérdida de Ia tolerancia a las bacterias comensales. (Sturm A et al. (2004) Divergent cell cycle kinetics underlies the distinct functional capacity of mucosal T cells in Crohn's disease and ulcerative colitis. Gut 53:1624-1631 ). Estas evidencias experimentales sustentan el hecho de que Ia enfermedad de Crohn es un desorden en el que los eventos de proliferación celular superan a los de muerte por apoptosis, Io que conlleva a Ia acumulación de células T reactivas en el sitio de Ia inflamación, Io que parece ser un factor importante en Ia patogénesis de Ia enfermedad. En este sentido, los agentes terapéuticos más potentes empleados en el tratamiento de esta enfermedad son aquellos que inducen apoptosis de células T y en algunos casos de monocitos, como por ejemplo: anticuerpos anti-TNFα (Lügering A et al. (2001 ) Infliximab induces apoptosis in monocytes from patients with chronic active Crohn's disease by using a caspase dependent pathway. Gastroenterology 121 : 1145-57), anticuerpos anti-IL-12 (Stallmach A et al. (2004) An interleukin 12 p40-lgG2b fusión protein abrogates T cell mediated inflammation: anti-inflammatory activity in Crohn's disease and experimental colitis in vivo. Gut 53: 339-45) o anticuerpos contra el receptor de IL-6 (Atreya R et al. (2000) Blockade of interleukin 6 trans-signaling suppresses T-cell resistance against apoptosis in chronic intestinal inflammation: evidence in Crohn's disease and experimental colitis in vivo. Nat Med 6: 583-588). En particular, los anticuerpos anti-TNFα son una opción importante para inducir largos períodos de remisión en pacientes refractarios a Ia terapia con esteroides.

El Infliximab es un anticuerpo monoclonal (AcM) quimérico que contiene Ia región variable murina y Ia región constante de una molécula IgGI humana, que se une con gran afinidad y especificidad al TNFα circulante y al que se produce en las membranas (Knight DM et al. (1993) Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody. Mol Immunol 30: 1443-1453).

El Etanercept es una proteína de fusión recombinante que contiene dos cadenas monoméricas de Ia porción soluble del receptor tipo Il del TNFα humano, unidas a Ia porción Fc de Ia inmunoglobulina G1 (IgGI ) humana (Mohler KM et al. (1993) Soluble tumor necrosis factor (TNF) receptors are effective therapeutic agents in lethal endotoxemia and function simultaneously as both TNF carriers and TNF antagonists. J Immunol 151 : 1548-1561 ). Dicha molécula de fusión ha sido empleada exitosamente en el tratamiento de otras enfermedades inflamatorias como Ia artritis reumatoide (AR) (Moreland LW et al. (1999) Etanercept therapy in rheumatoid arthritis. A randomized, controlled trial. Ann Intern Med 130: 478-486). Sin embargo, el Etanercept a diferencia del Infliximab, no ofrece beneficios clínicos en Ia enfermedad de Crohn. Van den Brande y colaboradores demostraron que Ia diferencia en Ia efectividad de ambas drogas, en el tratamiento de Ia enfermedad de Crohn, se debe a Ia capacidad del Infliximab de inducir apoptosis de monocitos y de células T activadas de Ia lámina propia (Van den Brande JMH et al. (2003) Infliximab but not Etanercet induces apoptosis in lamina propia T- Lymphocytes from patients with Crohn's disease. Gastroenterology 124: 1774-1785). El Etanercept no induce Ia apoptosis de estas células, Io cual ha sugerido que el Infliximab es efectivo en Ia enfermedad de Crohn debido a sus efectos pro-apoptóticos.

Los resultados obtenidos en Ia clínica, en pacientes con Ia enfermedad de Crohn, con el uso del Infliximab y otras drogas que inducen apoptosis de células T ha sugerido que el restablecimiento de este mecanismo en el compartimiento de células T mucosales puede ser un factor importante para el tratamiento exitoso de Ia enfermedad de Crohn.

En Ia actualidad, Ia terapia que con más éxito se aplica para el tratamiento de los pacientes con Ia enfermedad de Crohn es precisamente Ia administración del Infliximab. También esta terapia se ha aplicado con resultados alentadores en pacientes con colitis ulcerosa. Sin embargo, esta terapia produce un conjunto de reacciones adversas como es el aumento de Ia incidencia en estos pacientes de enfermedades como Ia tuberculosis y Ia micoplasmosis, debido a Ia inmunosupresión generalizada que produce (Kooloos WM. (2007) Potential role of pharmacogenetics in anti-TNF treatment of rheumatoid arthritis and Crohn's disease. Drug Discovery Today 12: 125-31 ). Es por ello que constituye un reto, en Ia actualidad, el desarrollo de variantes terapéuticas que puedan eliminar específicamente células patogénicas sin provocar una inmunosupresión generalizada.

Con este propósito, en los últimos años se ha retomado el uso de estrategias antígeno-específicas tratando de regular Ia respuesta inmune, no de suprimirla. En esta línea de trabajo, se han empleado péptidos de autoantígenos nativos o modificados tipo APL, administrados en condiciones tales que permitan Ia inducción de mecanismos reguladores de Ia tolerancia periférica (Prakken B et al. (2004) Epitope-specific immunotheraphy induces immune deviation of proinflamatory T cells in RA. PNAS 12 (101 ): 4228-33; Ben-David H et al. (2005) Down-regulation of myasthenogenic T cell response by a dual altered peptide ligand via CD4+CD25+- regulated events leading to apoptosis. PNAS 102 (6): 2028-33; Paas-Rozner M et al. (2001 ) The nature of the active suppression of responses associated with experimental autoimmune myasthenia gravis by a dual altered peptide ligand administered by different routes. PNAS 98 (22): 12642-7).

Los APL son análogos de péptidos inmunogénicos con una o varias sustituciones en las posiciones esenciales de contacto con el receptor de Células T o con el Complejo Mayor de Histocompatibilidad, Io cual interfiere o modifica Ia cascada de eventos necesarios para Ia completa activación de las células T (Bielekova B y Martin R (2001 ) Antigen-specific immunomodulation via altered peptide ligands. J Mol Med 79: 552-65). La capacidad de manipular experimentalmente las propiedades intrínsecas de ligandos peptídicos conocidos permite alterar apropiadamente Ia naturaleza, el curso y Ia potencia de Ia respuesta inmune celular. En Ia solicitud internacional de patente No. WO 2006/032216 se reivindican péptidos tipo APL, derivados de Ia proteína de estrés térmico de 60 kDa humana (abreviado Hsp60, del inglés 6OkDa heat shock protein), así como el uso de una preparación farmacéutica que comprende esos péptidos en el tratamiento de Ia AR. La diabetes mellitus tipo I, es una enfermedad autoinmune órgano específica mediada por células T que destruyen las células β del páncreas que producen Ia insulina, Io que conduce a una desregulación del metabolismo de Ia glucosa (Castaño L y Eisenbarth GS (1990) Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouse, and rat. Annu Rev Immunol 8: 647-79). Los síntomas clínicos de esta enfermedad ocurren después de que han sido inactivadas por el sistema inmune cerca del 80-90% de las células β del páncreas. Es por ello que Ia terapia actual está dirigida a encontrar un método seguro, específico y efectivo para apagar el proceso autoinmune antes de que ocurra un daño permanente en las células β del páncreas y preservar Ia producción endógena de insulina. La inducción de tolerancia ha sido un concepto que se ha extendido para el tratamiento de Ia diabetes tipo I. Irun Cohén y colaboradores han protegido el uso de péptidos de Ia Hsp60 humana para el diagnóstico y tratamiento de esta enfermedad (Patente No. US 6682897). Explicación de Ia invención La presente invención resuelve el problema antes mencionado, proporcionando un nuevo agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales (como Ia enfermedad de Crohn y Ia colitis ulcerosa) y Ia diabetes mellitus tipo I. La esencia de Ia invención es el uso de un péptido inmunomodulador tipo APL, derivado de Ia Hsp60 humana, o sus análogos para Ia fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales y diabetes mellitus tipo I. Dicho péptido, cuya secuencia es SIDLKDKYKNIGAKLVQLVANNTNEEA, se identifica en el Listado de Secuencias como Seq ID No. 1. Este péptido promueve Ia inducción de apoptosis de células T activadas de Ia lámina propia intestinal y de Ia sangre periférica de pacientes con Ia enfermedad de Crohn, Io que resulta en Ia inhibición de los clones de células T involucrados en Ia patogénesis de esta enfermedad, sin causar una inmunosupresión inespecífica como ocurre con el uso de los fármacos que bloquean el TNFα. El uso del péptido inmunomodulador tipo APL, o sus análogos, en el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales, está dirigido a neutralizar clones de células T que participan en el proceso inflamatorio característico de este tipo de enfermedad. La preparación farmacéutica de Ia invención se caracteriza por su alta especificidad, ya que está dirigida a Ia neutralización de células T patogénicas, cuando estas se encuentran en un estado de activación. Este hecho contribuye marcadamente a Ia seguridad de dicha preparación, ya que minimiza reacciones adversas como infecciones oportunistas causantes de tuberculosis y micoplasmosis asociadas a Ia inmunosupresión generalizada que causan fármacos como el Infliximab, o al desarrollo de procesos neoplásicos, como por ejemplo linfomas, que causa el uso del metotrexato.

El uso del mencionado péptido inmunomodulador en Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales también tiene Ia ventaja de que independientemente de que se emplee Ia vía de administración parenteral (intradérmica, subcutánea o intravenosa, por ejemplo), su principio activo se biodistribuye fundamentalmente hacia el tracto gastrointestinal: estómago, intestino delgado y colon. Además, el péptido permanece en estos órganos el tiempo necesario para ejercer sus mecanismos biológicos. Como se ha discutido, en las enfermedades inflamatorias intestinales Ia activación incontrolada de células T efectoras, dirigidas contra Ia flora comensal, ocurre precisamente en el tracto gastrointestinal. La biodistribución del péptido a este sitio, unido a Ia capacidad que tiene de inducir la apoptosis de células T patogénicas luminales, justifica Ia racionalidad de emplear este péptido tipo APL para el tratamiento de Ia enfermedad de Crohn y Ia colitis ulcerosa. El uso de Ia preparación farmacéutica de Ia invención se extiende a otras enfermedades inflamatorias que transitan por períodos de crisis-remisión, donde las células T autoreactivas también tienen un papel fundamental, como Ia diabetes tipo I.

En Ia solicitud internacional de patente No. WO 2006/032216 se reivindica el péptido tipo APL identificado en el Listado de Secuencias como Seq ID No. 1 , así como el uso de una preparación farmacéutica que comprende ese péptido en el tratamiento de Ia AR. Sin embargo, dicha solicitud de patente no reivindica ni sugiere que dicho péptido pueda emplearse para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales y diabetes mellitus tipo I. Las enfermedades inflamatorias intestinales no son consideradas enfermedades autoinmunes, pues Ia respuesta inmune dirigida contra autoantígenos no es Ia responsable del inicio y mantenimiento de Ia inflamación, al menos hasta el momento no se conoce que existan autoantígenos relacionados causalmente. El origen de estas enfermedades depende de Ia presencia de Ia flora comensal y Ia respuesta inmune es dirigida contra los organismos comensales. Una de las evidencias experimentales que sostiene este hecho es que en animales libres de patógenos no es posible inducir este tipo de enfermedades a menos que se reconstituya Ia flora intestinal (Chandran et al. (2003) Inflammatory bowel disease: dysfunction of GALT and gut bacterial flora (II). Surgeon 1 :125-136; Strober et al. (2002) The immunology of mucosal models of inflammation. Annu. Rev. Immunol 20:495-549).

En Ia Patente No. US 6682897, Irun Cohén y colaboradores revelaron el uso de péptidos de Ia Hsp60 humana para el diagnóstico y tratamiento de Ia diabetes tipo I. Ninguno de estos péptidos comprende Ia secuencia identificada como Seq ID No. 1 , ni se les describe similar actividad biológica a Ia del péptido de Seq ID No. 1. A diferencia de estos autores, en Ia presente invención se revela el uso del péptido de Seq ID No. 1 , que es un péptido tipo APL derivado de Ia Hsp60, para inducir apoptosis en células T patogénicas implicadas en el desarrollo de esta patología. Los ejemplos de Ia presente invención son los primeros en revelar propiedades del péptido de Seq ID No. 1 , relacionadas con su biodistribución hacia el tracto grastrointestinal y con su capacidad de inducir apoptosis en clones de células T patogénicas, que hacen posible su utilización en el tratamiento de Ia enfermedad de Crohn, Ia colitis ulcerosa y Ia diabetes tipo I. Basados en los elementos brindados en Ia solicitud internacional de patente No. WO 2006/032216, a las personas versadas en este campo de Ia técnica, no les era posible predecir el nuevo uso del péptido que se reivindica en Ia presente invención.

El péptido de secuencia identificada como Seq ID No. 1 o sus análogos pueden ser producidos por los métodos rutinarios de síntesis de péptidos y evaluados por el nivel y Ia calidad de Ia respuesta inmune que inducen, en experimentos como los que se describen en los ejemplos que se presentarán posteriormente.

En el contexto de esta invención, el término análogo se refiere a péptidos tipo APL que comprendan una o más desviaciones de Ia secuencia descrita (Seq ID. NO. 1 ), pero que retengan Ia misma actividad biológica que el péptido descrito. La desviación puede ser una sustitución, deleción o inserción de un solo aminoácido. Preferiblemente Ia desviación es una sustitución. El análogo comprenderá preferiblemente menos de 9 desviaciones, más preferiblemente menos de 6 desviaciones y más preferiblemente menos de 2 desviaciones del péptido descrito. Es también objeto de Ia invención una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales y Diabetes tipo I que comprende un péptido tipo APL, derivado de Ia hsp60 humana e identificado como Seq. ID. No. 1 , o sus análogos. Las cantidades de péptido presentes en las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención son las que producen Ia respuesta inmune efectiva en el hospedero. La cantidad efectiva es Ia cantidad que al ser administrada resulta en Ia inducción de apoptosis en los linfocitos T que disminuyen significativamente los signos inflamatorios característicos de Ia enfermedad de Crohn y detienen los focos inflamatorios del tracto gastrointestinal característicos del curso de estas enfermedades. En el curso del tratamiento, Ia cantidad de Ia composición farmacéutica administrada al paciente puede variar de acuerdo a determinados factores como: edad, sexo, salud general, así como el nivel de respuesta inmunológica en general.

La presente invención, además, revela un método de tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales (como Ia enfermedad de Crohn y Ia colitis ulcerosa) y Ia diabetes tipo I, mediante Ia administración a un paciente de cantidades efectivas de composiciones farmacéuticas que comprenden el péptido identificado como Seq ID No. 1 o sus análogos.

En una realización de Ia invención, en el curso del tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales (como Ia enfermedad de Crohn y Ia colitis ulcerosa) y Ia diabetes tipo I, Ia composición farmacéutica se administra por vía parenteral o mucosal. En una materialización de Ia invención, Ia composición farmacéutica se administra por una vía parenteral seleccionada del grupo que comprende Ia vía intradérmica, Ia vía subcutánea, Ia vía intramuscular y Ia vía intravenosa. En otra materialización, Ia composición farmacéutica se administra por una vía mucosal seleccionada del grupo que comprende Ia vía rectal y Ia vía oral. Debido a Ia naturaleza de estas enfermedades, el péptido tipo APL o sus análogos pueden formar parte de formulaciones que se administran como enema, o como formas farmacéuticas apropiadas para Ia administración por vía oral. Breve descripción de las figuras Figura 1. Efecto del péptido de Seq ID No. 1 sobre Ia viabilidad de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con Ia enfermedad de Crohn (A) y donantes sanos (B). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre el control negativo (0 ug/mL) y cada una de las concentraciones del péptido evaluadas en ese grupo. Figura 2. Demostración por microscopía electrónica de transmisión de Ia inducción de apoptosis por el péptido de Seq ID No. 1 en células mononucleares de sangre periférica de pacientes con Ia enfermedad de Crohn. Paneles A, B: células mononucleares no estimuladas (control negativo). Paneles C-H: células mononucleares estimuladas con el péptido de Seq ID No. 1 (40 μg/mL). Vacuolización abundante (VA); fragmentación nuclear (FN); condensación y migración perinuclear de Ia cromatina (CCM); orgánulos citoplasmáticos intactos (OCI); cuerpo apoptótico (CA); fagocitosis de cuerpos apoptóticos (FCA). Figura 3. Demostración por microscopía electrónica de transmisión de Ia inducción de apoptosis por el péptido de Seq ID No. 1 en células mononucleares de Ia lámina propia intestinal de pacientes con Ia enfermedad de Crohn. Paneles A, B: células mononucleares no estimuladas (control negativo). Paneles C-E: células mononucleares estimuladas con el péptido de Seq ID No. 1 (40 μg/mL). Fragmentación nuclear (FN); condensación y migración perinuclear de Ia cromatina (CCM); cuerpo apoptótico (CA).

Figura 4. Efecto del péptido de Seq ID No. 1 sobre Ia viabilidad de células mononucleares de un paciente con Ia enfermedad de Crohn en estado de remisión. En el eje X, A: células no activadas con el anticuerpo anti-CD3, B: células activadas con el anticuerpo anti-CD3. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre el control negativo (0 ug/mL) y cada una de las concentraciones del péptido evaluadas en ese grupo.

Figura 5. Demostración por microscopía electrónica de transmisión de Ia inducción de apoptosis por el péptido de Seq ID No. 1 en células mononucleares de sangre periférica de pacientes con diabetes mellitus tipo I. Paneles A, B: células mononucleares no estimuladas (control negativo). Paneles C-D: células mononucleares estimuladas con el péptido de Seq ID No. 1 (40 μg/mL). Fragmentación nuclear (FN); condensación y migración perinuclear de Ia cromatina (CCM); cuerpo apoptótico (CA); fagocitosis de cuerpos apoptóticos (FCA). Figura 6. Estudio de biodistribución del péptido de Seq ID No. 1 en ratas Lewis. A: Vía intravenosa 0.25 mg /kg de peso. B: Vía intravenosa 1 mg /kg de peso. C Vía intradérmica 0.25 mg /kg de peso. D: Vía intradérmica 1 mg /kg de peso. Los tejidos analizados son: 1. Hígado; 2. Bazo; 3. Ríñones; 4. Corazón; 5. Pulmones; 6. Ganglios cervicales; 7. Ganglios axilares-braquiales; 8. Cadena ganglionar mesentérica; 9. Ganglios pélvicos; 10. Tiroides; 11. Estómago; 12. Intestino delgado; 13. Intestino Grueso.

Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización Ejemplo 1. Evaluación del efecto del péptido tipo APL sobre Ia viabilidad de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con Ia enfermedad de Crohn y de donantes sanos.

La sangre proveniente de pacientes con Ia enfermedad de Crohn y de donantes sanos se obtuvo por punción venosa y se depositó en tubos estériles que contenían una solución empleada como anticoagulante (citrato de sodio 123 mM, fosfato de sodio monobásico 18.5 mM, ácido cítrico 17 mM y dextrosa 141.5 mM). La sangre se diluyó 1 :2 en Solución Salina tamponada con Fosfato (abreviado PBS, del inglés Phosphate Buffered Saline) 1 X y se añadió 5 mL de Ia misma a 3 mL de Ficoll- Paque™ PLUS (Amersham Biosciences AB, Sweden) en tubos de centrifugación de 15 mL. A continuación, los tubos se centrifugaron a 1200 rpm durante 30 minutos. Posteriormente, se extrajo el anillo correspondiente a las células mononucleares y se realizaron dos lavados con PBS 1 X. Seguidamente, el precipitado celular se resuspendió en medio RPMI 1640 conteniendo suero fetal bovino (SFB) al 10% y suplementado con gentamicina (100 U/mL) y L-glutamina (2 mM) (Gibco BRL, EEUU). El número de células se contó en una cámara de Neubauer a partir de una dilución 1 :20 en medio RPMI suplementado y 1 :2 con azul tripán (Boehringer Mannheim, Alemania).

Las células mononucleares se sembraron (1 x10⁵ células/pocilio) en placas de 96 pocilios con fondo plano (Costar, EEUU), en un volumen final de 100 ul y se estimularon (por triplicado) con el péptido tipo APL (Seq ID No. 1 ) a diferentes concentraciones: 10, 40 y 160 ug/mL por 72 horas. Las células no estimuladas con el péptido se emplean como control del crecimiento celular basal. El efecto del péptido sobre Ia viabilidad de las células se determinó con el ensayo del bromuro de 3-[4,5- dimetiltiazol 2-il]-2,5 difenil tetrazolio (MTT, Sigma, EEUU), siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. El MTT es reducido por Ia acción de una deshidrogenasa mitocondrial en un producto coloreado (formazán) que no es soluble en el medio de cultivo. La cantidad de producto formado es directamente proporcional a Ia cantidad de células vivas en el cultivo celular. Al término de las 24 horas de cultivo se añadieron 20 uL/pocillo de MTT preparado a una concentración de 5 mg/mL. A continuación, las placas se incubaron durante 4 horas en iguales condiciones de cultivo. Una vez concluido este tiempo, se añadieron 100 uL de una solución de 2-butanol (SDS al 20% (del inglés, sodium dodecyl sulphate), 2-butanol al 50% y 5 ml_ de ácido clorhídrico 2N) y se homogenizó el contenido de los pocilios por pipeteo suave. Para disolver completamente el precipitado formado, las placas se mantuvieron en agitación continua por 30 minutos a 37 ⁰C. Finalmente, las placas se leyeron a una longitud de onda de 562 nm en un lector de placas. El promedio de las densidades ópticas de las células no estimuladas con el péptido se consideró el 100% de viabilidad celular. A partir de este valor se calculó el porciento de viabilidad de las células cultivadas con el péptido según el promedio de densidades ópticas en cada caso. Para el análisis de los resultados se empleó el programa estadístico GraphPad Prism Software. La prueba estadística empleada fue Ia de Kruskal-Wallis, que es una prueba de comparación múltiple no paramétrica. A continuación, se empleó Ia prueba de Dunn para identificar los grupos cuyas medias diferían estadísticamente. Como se puede apreciar en Ia Figura 1 , Ia disminución de Ia viabilidad celular en las células de pacientes con Ia enfermedad de Crohn es muy significativa en los tres niveles de dosis del péptido que se evaluaron en el estudio, con respecto a las células sin estimular [p<0.001]. Sin embargo, el tratamiento con este péptido no afecta Ia viabilidad de las células mononucleares de donantes sanos (en ninguna de las concentraciones del péptido evaluadas). Este resultado refleja una especificidad en el mecanismo de muerte celular inducido por este péptido en las células de pacientes con Ia enfermedad de Crohn. Los resultados que se muestran son representativos de cinco pacientes con Ia enfermedad de Crohn (en estado de crisis) y de cinco donantes sanos. Ejemplo 2. Identificación del mecanismo de muerte celular inducido por el péptido tipo APL en células mononucleares de sangre periférica de pacientes con Ia enfermedad de Crohn, mediante microscopía electrónica de transmisión. Con e! objetivo de identificar si el mecanismo de muerte celular inducido por el péptido tipo APL (identificado como Seq ID No. 1 en esta invención) en células mononucleares de sangre periférica de pacientes con Ia enfermedad de Crohn es mediado por apoptosis, se realizó el análisis de las muestras por microscopía electrónica de transmisión (MET). Esta técnica permite visualizar las características morfológicas de las células apoptóticas que, una vez identificadas, son una prueba irrefutable de Ia ocurrencia de apoptosis en las mismas. Estas características son: núcleo electrón-denso (migración perinuclear de Ia cromatina en Ia fase temprana), fragmentación nuclear, orgánulos citoplasmáticos desorganizados e intactos, 5 vacuolas grandes y distinguibles, cambio de Ia superficie celular y desintegración de Ia célula en cuerpos apoptóticos. El proceso de fagocitosis de los cuerpos apoptóticos por las células vecinas puede también observarse con esta técnica (White M et al. (2004) A morphologic approach to detect apoptosis based on electrón microscopy. Methods Mol Biol 285: 105-11 ). ío Las células mononucleares de pacientes con Ia enfermedad de Crohn, aisladas de Ia sangre periférica (10x10⁶ células), se cultivaron con y sin el péptido tipo APL a una concentración de 40 ug/mL durante 72 horas. Las células cultivadas sin péptido se emplearon como control del ensayo. Pasadas las 72 horas de incubación, las muestras fueron fijadas empleando una solución de glutaraldehído al 1 % y i5 paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0.1 M durante 1 hora. A continuación, las células se lavaron en PBS 1X y se trataron con una solución de tetraóxido de osmio al 2% por 1 h. Posteriormente, se realizaron dos lavados con tampón cocodilato 0.1 M y las muestras se deshidrataron en concentraciones crecientes de alcoholes (30-100%). Seguidamente, las células se infiltraron empleando una resina epóxica 0 Spurr (Spurr AR (1969) A low-viscosity epoxy resin embeddiπg médium for electrón microscopy. J Ultrastruct Res 26(1 ): 31 -43) y Ia polimerización se llevó a cabo a 70⁰C por 24 h. Las secciones ultrafinas (40 nm), fueron cortadas empleando un ultramicrótomo (Nova, LKB) y fueron montadas en rejillas de níquel. Posteriormente, las muestras se tiñeron con una solución de acetato de uranilo sobresaturado en 5 metanol por 5 minutos. El análisis de las muestras se realizó en un Microscopio Electrónico JEOL/JEM 2000 EX (JEOL, Japón).

En Ia Figura 2 se presentan los resultados obtenidos por MET en células mononucleares de pacientes con Ia enfermedad de Crohn. Como puede apreciarse, las células sin estimular con el péptido tienen una morfología normal (A, B). Sin 0 embargo, en las células cultivadas con el péptido tipo APL (Seq ID No. 1 ) se pueden apreciar los cambios morfológicos característicos de un proceso apoptótico (C-H). En particular, puede observarse en estas muestras Ia condensación y migración de Ia cromatina a Ia periferia del núcleo (CCM), que es uno de los cambios morfológicos más tempranos que ocurren durante Ia apoptosis en el núcleo (N) de las células. Además, ocurre Ia fragmentación nuclear (FN) y Ia formación de cuerpos apoptóticos (CA). Incluso, por Ia presencia de restos celulares puede conocerse que ha ocurrido Ia fagocitosis de estos cuerpos apoptóticos (FCA). Los orgánulos citoplasmáticos permanecen intactos (OCI) como se puede observar en Ia Figura 2F, Io cual es característico de Ia muerte celular por apoptosis. Estos resultados demuestran que el mecanismo de muerte celular inducido por este péptido tipo APL en células mononucleares de pacientes con Ia enfermedad de Crohn es mediado por apoptosis. El análisis de las células de estos pacientes por MET permitió además identificar Ia población celular dentro de las células mononucleares que cae en apoptosis. Lo anterior fue posible debido a que los diferentes tipos de leucocitos de Ia sangre (monocitos, linfocitos y polimorfonucleares) tienen morfologías diferentes. Dentro de las células mononucleares, se identificó a los linfocitos como Ia población que cae en apoptosis. Desde el punto de vista morfológico, los linfocitos son más pequeños que los monocitos, su núcleo es redondo y poseen menos citoplasma. Además, los linfocitos no presentan núcleo con cromatina laxa y en herradura, Io cual es característico de los monocitos (Junqueira LC y Cameiro J (2005) Histología básica. Sexta edición. Editorial Masson, Barcelona, España). Ejemplo 3. Identificación del mecanismo de muerte celular inducido por el péptido tipo APL en células mononucleares de Ia lámina propia de pacientes con Ia enfermedad de Crohn.

Las muestras de tejido intestinal correspondientes a parches de inflamación fueron obtenidas con el consentimiento informado de los pacientes. Estas muestras se transportaron al laboratorio en solución salina balanceada de Hank (del inglés Hank's balanced salt solution, abreviado HBSS) fría, libre de magnesio y calcio. Las células mononucleares de Ia lámina propia fueron aisladas de estos tejidos empleando el método del ditiotreitol/Acido etilediamino tetraacetico/Colagenasa descrito por BuII y Bookman (BuII DM and Bookman MA (1977) Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. J Clin Invest 59: 966-974) con las modificaciones realizadas por Van ToI y colaboradores (Van ToI EA et al. (1992) The CD56 adhesión molecule is the major determinant for detecting non-major histocompatibility complex-restricted cytotoxic mononuclear cells from the intestinal lamina propia. Eur J Immunol 22: 23-29). Las células mononucleares de Ia lámina propia de pacientes con Ia enfermedad de Crohn (10x10⁶ células) se cultivaron con y sin el péptido tipo APL (Seq ID No. 1 ) a una concentración de 40 ug/mL durante 72 horas. El análisis por MET (Figura 3) reveló que dicho péptido induce Ia muerte por apoptosis de una gran parte de esta población, al observarse en las células cultivadas con este péptido algunas de las características morfológicas de este tipo de muerte celular (C-E), como son: Ia migración de Ia cromatina a Ia periferia del núcleo (CCM), Ia fragmentación nuclear (FN) y Ia formación de los cuerpos apoptóticos (CA). Las células que se emplean como control del ensayo (células sin estimular con el péptido) tienen una morfología normal (A-B).

Ejemplo 4. Disminución de Ia viabilidad de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con Ia enfermedad de Crohn en estado de remisión, después de activadas con un anticuerpo anti-CD3. Las células mononucleares de sangre periférica, de un paciente con Ia enfermedad de Crohn en estado de remisión (también denominado no activo), fueron activadas con un anticuerpo anti-CD3 (e-Biosciences) durante 72 h. La adición del anticuerpo anti-CD3 produce Ia activación policlonal de los linfocitos presentes en esta población celular. Los linfocitos activados fueron lavados con solución de PBS 1X e incubados (1 x10⁵ células) por 1 h con diferentes concentraciones (10, 40 y 160 ug/ml) del péptido tipo APL (Seq ID No. 1 ). Como control del ensayo de activación se emplearon las células de este paciente cultivadas las primeras 72 h sin el anticuerpo anti-CD3 (células no activadas). Transcurrido este tiempo las células se cultivaron con las mismas concentraciones del péptido. La viabilidad celular se determinó con el método del MTT, según se describe en el Ejemplo 1. Como puede apreciarse en Ia Figura 4, el péptido tipo APL no afecta Ia viabilidad de las células no estimuladas con el anticuerpo anti-CD3. En este caso, es importante señalar que en el momento de Ia toma de muestra el paciente se encontraba en remisión de los signos y síntomas de Ia enfermedad. Sin embargo, este péptido afectó muy significativamente Ia viabilidad de estas células activadas previamente con el anti-CD3. Este resultado, en conjunto con los que se muestran en el Ejemplo 1 , donde se evidencia que este péptido no afecta Ia viabilidad de células mononucleares de donantes sanos, nos permite afirmar que el péptido tipo APL (Seq ID No. 1 ) induce apoptosis de células T patogénicas activadas, con una alta especificidad. Ejemplo 5. Evaluación del efecto del péptido tipo APL sobre Ia viabilidad de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con diabetes mellitus tipo I.

Las células mononucleares de Ia sangre periférica de pacientes con diabetes mellitus tipo I fueron aisladas mediante un gradiente de densidad con Ficoll- Paque™ PLUS, como se describe en el Ejemplo 1. Para realizar el análisis de estas células por MET, se cultivaron 10x10⁶ células con el péptido tipo APL a una concentración de 40 ug/mL durante 72 horas. Las células no estimuladas con el péptido se emplearon como control del ensayo. Como se muestra en Ia Figura 5, las células cultivadas con este péptido tienen Ia morfología anteriormente descrita (en el Ejemplo 2) de las células en apoptosis (Paneles C-D), en tanto las células sin estimular (Paneles A-B) tienen una morfología normal. Este resultado demuestra que este péptido tipo APL induce apoptosis en células mononucleares de pacientes con diabetes mellitus tipo I. Ejemplo 6. Estudio de biodistribución del péptido tipo APL (identificado como Seq ID No. 1) en ratas Lewis.

El péptido tipo APL (identificado como Seq ID No. 1 ) se marcó con el isótopo I¹²⁵ y se administró en ratas Lewis a las dosis de 0.25 mg y 1 mg/ Kg de peso, por vía intravenosa e intradérmica. Se sacrificaron seis animales de cada grupo experimental a las 4 y 24 h después de Ia inoculación del péptido y se determinaron los niveles de radioactividad en los diferentes órganos. Los resultados se expresan en porciento de dosis de radioactividad/gramo de tejido.

Este estudio indicó que este péptido se biodistribuye fundamentalmente hacia el tracto gastrointestinal: estómago, intestino delgado y colon, permaneciendo en estos órganos un tiempo que Ie posibilita ejercer sus mecanismos biológicos. Este resultado avala el uso de este péptido en el tratamiento de las enfermedades inflamatorias intestinales, como Ia enfermedad de Crohn y Ia colitis ulcerosa. Por otra parte, este péptido puede ser empleado para el tratamiento de otras enfermedades autoinmunes como Ia diabetes mellitus tipo I, debido a que el tracto gastrointestinal es el sitio por excelencia de inducción de Ia tolerancia periférica.

Claims

REIVINDICACIONESUSO DE PEPTIDO TIPO APL PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS INTESTINALES Y DIABETES TIPO I

1. Uso de un péptido tipo APL, derivado de Ia hsp60 humana e identificado como Seq. ID. No. 1 , o sus análogos para Ia fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales y Diabetes tipo I.

2. El uso del péptido tipo APL según Ia reivindicación 1 , en el que las enfermedades inflamatorias intestinales son seleccionadas del grupo que comprende Ia enfermedad de Crohn y Ia colitis ulcerosa.

3. El uso del péptido tipo APL según Ia reivindicación 1 , en el que Ia composición farmacéutica comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

4. El uso de un péptido tipo APL, derivado de Ia hsp60 humana e identificado como Seq. ID. No. 1 , o sus análogos para Ia inducción de apoptosis en clones de células T patogénicos de pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales y Diabetes tipo I.

5. El uso del péptido tipo APL según Ia reivindicación 4, en el que las enfermedades inflamatorias intestinales son seleccionadas del grupo que comprende Ia enfermedad de Crohn y Ia colitis ulcerosa.

6. El uso del péptido tipo APL según Ia reivindicación 1 , en el que Ia composición farmacéutica se administra por vía parenteral o mucosal.

7. El uso del péptido tipo APL según Ia reivindicación 6, en el que Ia composición farmacéutica se administra por una vía parenteral seleccionada del grupo que comprende Ia vía intradérmica, Ia vía subcutánea, Ia vía intramuscular y Ia vía intravenosa.

8. El uso del péptido tipo APL según Ia reivindicación 6, en el que Ia composición farmacéutica se administra por una vía mucosal seleccionada del grupo que comprende Ia vía rectal y Ia vía oral.

9. Un método de tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales y Diabetes tipo I que comprende Ia administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende el péptido tipo APL, derivado de Ia hsp60 humana e identificado como Seq. ID. No. 1 , o sus análogos.

10. El método de Ia reivindicación 9, en el que las enfermedades inflamatorias intestinales son seleccionadas del grupo que comprende Ia enfermedad de 5 Crohn y Ia colitis ulcerosa.

1 1 . El método de Ia reivindicación 9, en el que Ia composición farmacéutica se administra por vía parenteral o mucosal.

12. El método de Ia reivindicación 1 1 , en el que Ia composición farmacéutica se administra por una vía parenteral seleccionada del grupo que comprende Ia í o vía intradérmica, Ia vía subcutánea, Ia vía intramuscular y Ia vía intravenosa.

13. El método de Ia reivindicación 1 1 , en el que Ia composición farmacéutica se administra por una vía mucosal seleccionada del grupo que comprende Ia vía rectal y Ia vía oral.

14. Una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades 15 inflamatorias intestinales y Diabetes tipo I que comprende un péptido tipo

APL, derivado de Ia hsp60 humana e identificado como Seq. ID. No. 1 , o sus análogos.

1 5. La composición farmacéutica de Ia reivindicación 14, en Ia que las enfermedades inflamatorias intestinales son seleccionadas del grupo que 0 comprende Ia enfermedad de Crohn y Ia colitis ulcerosa.

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