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WO2009115629A1 - Método de producción de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos - Google Patents

Método de producción de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos Download PDF

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Publication number
WO2009115629A1
WO2009115629A1 PCT/ES2009/070025 ES2009070025W WO2009115629A1 WO 2009115629 A1 WO2009115629 A1 WO 2009115629A1 ES 2009070025 W ES2009070025 W ES 2009070025W WO 2009115629 A1 WO2009115629 A1 WO 2009115629A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
phytofluene
paracoccus
phytoene
fal
carotenoids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2009/070025
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Juan Luis De La Fuente Moreno
Marta RODRIGUEZ SÁIZ
Javier Costa Pérez
Antonio Estrella De Castro
José Luis BARREDO FUENTE
Juan Francisco López Ortiz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vitatene SA
Original Assignee
Vitatene SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vitatene SA filed Critical Vitatene SA
Publication of WO2009115629A1 publication Critical patent/WO2009115629A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention describes a logical biotech method that makes it possible to obtain, in a simple, effective and large-scale manner, stabilized preparations of phytoene and / or phytofluene, or mixtures of carotenoids with high content thereof, by using mutated strains of Paracoccus sp. Phytoenne and / or phytofluene super producers Therefore, the present invention is capable of being applied in various fields of life sciences, such as in the food, pharmaceutical or cosmetic fields.
  • Carotenoids are pigments of an isoprenoid nature synthesized by certain bacteria, fungi and photosynthetic organisms. They can be classified into two types:
  • Carotenes they are pure hydrocarbons, among which are compounds such as ⁇ -carotene, ⁇ -carotene, ⁇ -carotene, lycopene, phytoene or phytofluene; Y
  • Xanto rows they are molecules that contain oxygen in different forms (hydroxy, epoxy groups, etc.), among which are compounds such as astaxanthin, zeaxanthin, capsantin, canthaxanthin, lutein, etc.
  • Biosynthesis begins with the isomerization of isopentenyl pyrophosphate (IPP, C 5 ) to dimethylalkyl pyrophosphate (DMAPP, C 5 ), catalyzed by the enzyme IPP isomerase.
  • IPP isopentenyl pyrophosphate
  • DMAPP dimethylalkyl pyrophosphate
  • a DMAPP molecule is condensed with an IPP molecule to generate geranyl pyrophosphate (GPP, Cio), which is condensed again with an IPP molecule to generate farnesyl pyrophosphate (FPP, Ci 5 ); both reactions are catalyzed by the enzyme FPP synthase.
  • GPP geranyl pyrophosphate
  • FPP farnesyl pyrophosphate
  • a new condensation of an FPP molecule with an IPP molecule results in geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP, C20); This reaction is catalyzed by the enzyme GGPP synthase (encoded by the crtE gene).
  • GGPP synthase encoded by the crtE gene
  • the condensation of two GGPP molecules catalyzed by the enzyme phytoeno synthase generates phytoen (C 40 ), a precursor molecule of the biosynthetic pathway of carotenoids.
  • the enzyme phytoene desaturase (encoded by the crtl gene) introduces four double bonds in the phytoen molecule to synthesize phytofluene, ⁇ -carotene, neurosporene and lycopene (C 40 ) consecutively.
  • the lycopene cyclase enzyme (encoded by the crtY gene) is responsible for converting the acyclic ends of the lycopene molecule into ⁇ rings to sequentially form ⁇ -carotene and ⁇ -carotene (C 40 ).
  • the present invention describes a logical biotech method, hereinafter the method of the invention, which makes it possible to obtain, in a simple, effective and large-scale manner, stabilized preparations of phytoene and / or phytophane, or mixtures of carotenoids with high content thereof, by using of new mutated strains of Paracoccus sp. (FAl and FA3) superproducers of phytoen and / or phytofluene.
  • the technical problem solved by the present invention is to obtain, in a simple, effective and large-scale manner, stabilized preparations of phytoene and phytofluene, or mixtures of carotenoids with a high phytoene and phytofluene content, which can be applied directly in the food fields , pharmaceutical and cosmetic.
  • the method of the invention allows simple, effective and large-scale stabilized preparations of phytoene and / or phytofluene, or mixtures of carotenoids with high content thereof, to be obtained by using mutated strains of Paracoccus sp. superproducers of phytoen and / or phytofluene (FAl and FA3).
  • the method of the invention comprises:
  • the mutated cells were washed three times with saline.
  • the method of mutation with NTG consisted of incubating about November 10 cells / mL in a solution containing 250 g / mL of NTG and 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.0 at room temperature environment for 90 minutes, achieving mortality rates of around 99%.
  • the mutated cells were washed three times with saline.
  • the mutated cells were seeded Petri dishes with solid medium and incubated at 28 0 C for 4 days to obtain isolated colonies.
  • the strategy used for the selection of superproductive strains of phytoene and phytofluene from a strain of Paracoccus sp. Xanthophyll producer was based on the color of the colony. To do this, the mutated cells of Paracoccus sp. were sown in Petri dishes and once grown at 28 0 C, those colonies that possessed cream were selected (the parent strain has orange). After analyzing about 100,000 colonies, 2 cream-colored colonies called FAl and FA3 producing phytoene and phytophenol were isolated.
  • the Paracoccus sp. FAl and Paracoccus sp. FA3 were fermented in a flask in order to determine the production level of phytoen and phytofluene in liquid medium.
  • the analysis of phytoene and phytofluene was determined by reverse phase HPLC liquid chromatography, demonstrating that with both strains it is possible to produce phytoene and phytofluene together with a mixture of carotenoids in which phytoen is the majority carotenoid.
  • the strains Paracoccus sp. FAl and Paracoccus sp. FA3 were fermented in pre-industrial fermenters in order to determine the production level of phytoene and phytofluene.
  • the extraction and purification of phytoene and phytofluene was performed by centrifuging the fermentation broth to obtain a wet biomass, which was extracted with isopropyl alcohol.
  • the extract obtained was concentrated and purified by two successive chromatographic separations on silica gel.
  • the FAl and FA3 mutants of the Paracoccus sp. Strain, useful for obtaining stabilized preparations of phytoene and / or phyto-fluphane in a simple, effective and large manner have been obtained and selected in the present invention. scale.
  • the data related to the deposit of biological material are the following:
  • Example 1 Obtaining mutants of Paracoccus sp.
  • a mutagenic procedure of a strain of Paracoccus sp. Xanthophyll producer for which we analyzed: (i) different types of mutagenic agents, (ii) concentration of the mutagen, (iii) concentration of cells, (iv) incubation pH and (v) treatment time.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • NTG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • the suspensions of cells to be mutated were obtained from cultures in a liquid medium, described in EP 1229126, whose composition is as follows: corn steep liquor 30.0 g / L, sucrose 30.0 g / L, KH 2 PO 4 0.54 g / L, K 2 HPO 4 2.78 g / L, MgSO 4 VH 2 O 12.0 g / L, CaCl 2 -2H 2 O 0.1 g / L, and FeSO 4 -7H 2 O 0.3 g / L, adjusted to a final pH of 7.2 with NaOH.
  • saline solution NaCl 9 g / L
  • the EMS mutation procedure consisted of the incubation of approximately 10 11 cells / mL in a 3% EMS solution in 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.0 at room temperature for 30 to 180 minutes, achieving mortality rates of about 90-99.9%.
  • the mutated cells were washed three times with saline, and centrifuged at 3000 rpm and 15 0 C for 5 minutes.
  • the NTG mutation procedure consisted of the incubation of approximately 10 11 cells / mL in a solution containing 250 ⁇ g / mL of NTG and 0.1 M sodium phosphate buffer pH 7.0 at room temperature for 90 minutes, achieving rates of mortality of about 99%.
  • the mutated cells were washed three times with saline, and centrifuged at 3000 rpm and 15 0 C for 5 minutes.
  • Petri dishes containing a solid medium with the following composition per liter were seeded: corn steep liquor 30.0 g / L, sucrose 30.0 g / L, KH 2 PO 4 0.54 g / L, K 2 HPO 4 2.78 g / L, MgSO 4 -7H 2 O 12.0 g / L, CaCl 2 -2H 2 O 0.1 g / L, FeSO 4 -7H 2 O 0.3 g / L, and 15 g / L agar, adjusted to a final pH of 7.2 with NaOH.
  • the seeded plates were incubated at 28 0 C for 4 days to obtain isolated colonies.
  • Example 2 Selection of mutants of Paracoccus sp. producers of phytoeno and ⁇ toflueno from a strain of Paracoccus sp. xanthophyll producer
  • the strain selection strategy of Paracoccus sp. producers of phytoeno and phytofluene from a strain of Paracoccus sp. Xanthophyll producer was based on the color of the colony.
  • the selection of mutants was performed cited from mutated with EMS and NTG cells as described in Example 1.
  • the mutated cells were plated on solid medium described in Example 1 and incubated at 28 0 C for 5 days. After this time, those colonies that had cream color were selected instead of the typical orange color of the parental strain Paracoccus sp. Xanthophyll producer. In this way, from approximately 100,000 colonies analyzed, 12 cream-colored colonies were isolated, which could be producers of phytoene and phytofluene.
  • an inoculum medium described in EP 1229126, was prepared with the following composition per liter: corn steep liquor 30.0 g / L, sucrose 30.0 g / L, KH 2 PO 4 0.54 g / L , K 2 HPO 4 2.78 g / L, MgSO 4 VH 2 O 12.0 g / L, CaCl 2 -2H 2 O 0.1 g / L, and FeSO 4 VH 2 O 0.3 g / L, adjusted to a final pH of 7.2 with NaOH.
  • Each flask inoculum of 250 mL with 50 mL of medium was seeded with 100 .mu.l of frozen culture and incubated at 28 0 C, 250 rpm and 5 cm eccentricity for 48 hours.
  • the fermentation medium described in EP 1229126, has the following composition per liter: corn steep liquor 30.0 g / L, glucose 30.0 g / L, KH 2 PO 4 1.5 g / L, Na 2 HPO 4 - 12H 2 O 3.8 g / L, MgSO 4 VH 2 O 3.0 g / L, CaCl 2 -2H 2 O 0.2 g / L, and FeSO 4 VH 2 O 1.0 g / L, adjusted at a final pH of 7.2 with NaOH.
  • the medium was distributed in 250 mL Erlenmeyer flasks at a rate of 20 mL per flask.
  • Flasks with fermentation medium were seeded with inoculum described above and incubated at 28 0 C and 250 rpm After completion of the fermentation (5-6 days), a mixture of fermentation broth and isoprop ⁇ llico alcohol (1 / was prepared one). The concentration and purity of phytoene and phytofluene was determined by the use of reverse phase HPLC liquid chromatography.
  • Example 4 Procedure for the production of phytoeno and phytofluene by fermentation in a fermentor tank of the Paracoccus sp. FAl and Paracoccus sp. FA3 using a specific glucose addition program
  • the Paracoccus sp. FAl and Paracoccus sp. FA3, selected as described in Examples 1, 2, and 3, were grown in pre-industrial fermenters for the purpose of determining the production level of phytoen and phytofluene.
  • a pre-inoculum medium was prepared with the composition described in Example 3 for the inoculum medium.
  • the pre-inoculums were seeded in 500 mL flasks with 100 mL of medium and incubated at 28 0 C and 250 rpm with 5 cm eccentricity for 48 hours.
  • inocula were seeded in 500 mL flasks with 100 mL of inoculation medium (Example 3) with the pre-inoculum culture and incubated at 28 0 C and 250 rpm with 5 cm eccentricity for 30 hours.
  • Example 5 Procedure for the production of phytoene and phytofluene by fermentation in fermentation tank of the Paracoccus sp. FAl and Paracoccus sp. FA3 using a specific glycerol addition program
  • the Paracoccus sp. FAl and Paracoccus sp. FA3, selected as described in Examples 1, 2, and 3, were grown in pre-industrial fermenters for the purpose of determining the production level of phytoen and phytofluene.
  • a pre-inoculum medium was prepared with the composition described in Example 3 for the inoculum medium.
  • the pre-inoculums were seeded in 500 mL flasks with 100 mL medium and incubated at 28 0 C and 250 rpm with 5 cm eccentricity for 48 hours.
  • inocula were seeded in 500 mL flasks with 100 mL of inoculation medium (Example 3) with the pre-inoculum culture and incubated at 28 0 C and 250 rpm with 5 cm eccentricity for 30 hours.
  • Example 2 The titration of the concentration and purity of phytoene and phytofluene at the end of the fermentation was performed as described in Example 2.
  • the production levels of phytoene, phytofluene and other carotenoids obtained are shown in Table 4. This Example clearly demonstrates that with both strains and the described procedure it is possible to produce phytoene and phytofluene together with a mixture of carotenoids in which phytoene is the majority carotenoid.
  • Example 6 Procedure for recovery and purification of phytoen and phytofluene from the fermentation broths of Paracoccus sp. FAl and Paracoccus sp. FA3
  • the fermentation broth obtained as described in Examples 3, 4 and 5 was centrifuged, recovering the wet biomass, which was extracted with at least 2 volumes by weight of isopropyl alcohol, preferably 6 volumes by weight.
  • the mixture was stirred for 1 hour at room temperature and then filtered through a Büchner funnel.
  • the liquid obtained was concentrated under vacuum to dryness, obtaining an extract that was analyzed spectrophotometrically at 286 nm [Britton G., Liaaen-Jensen S. and Pfander H. (1995) Carotenoids. Volume IB: Spectroscopy, p. 60, Birkhauser, Basel] showing the presence of 15-25% phytoene and 0.5-1% phytofluene.
  • the first chromatographic purification was carried out on silica gel using at least 5 grams per gram of extract to be purified, preferably 10 grams per gram.
  • the column preparation was done by mixing silica gel and dichloromethane.
  • the concentrated extract, obtained as described above, was dissolved in dichloromethane and loaded on the column.
  • the fractions eluted after the graphical chromate process were analyzed spectrophotometrically and those with the UV / visible spectrum coinciding with the presence of phytoene and phytofluene evaporated to dryness.
  • the pre-purified product obtained was analyzed spectrophotometrically showing the presence of 70-80% phytoene and 1.0-2.0% phytofluene.
  • Said pre-purified product must be stored at -2O 0 C in an inert atmosphere to avoid chemical degradation.
  • the second chromatographic purification was performed on silica gel using at least 10 grams of silica gel per gram of pre-purified product, preferably 20 grams per gram.
  • the column preparation was performed mixing silica gel and hexane or n-hexane cycle.
  • the pre-purified product, obtained as described above, was dissolved in cyclohexane or n-hexane and loaded onto the column.
  • it is necessary to increase the polarity by adding ethyl acetate, eluting with mixtures of increasing polarity cyclohexane or n-hexane: ethyl acetate 98: 2, 97: 3, or 96: 4.
  • the fractions eluted after the chromatographic process were analyzed spectrophotometrically and those that presented the UV / visible spectrum coinciding with the presence of phytoene and phytofluene evaporated to dryness.
  • the product obtained was analyzed spectrophotometrically showing the presence of 80-90% phytoene and 0.5-1.5% phytofluene.
  • Table 3 Production of phytoene, phytofluene and other carotenoids of the FAl and FA3 strains in a 30 L fermenter with added glucose at 96 hours of fermentation. The production values of each carotenoid are expressed as a percentage of the total carotenoids produced.
  • Table 5 Values (mg / L) of phytoene and phytofluene production obtained by the FAl strain in flask. These values are represented in Figure 3A.
  • Table 7 Values (mg / L) of phytoene and phytofluene production obtained by the FAl strain in a fermentation tank with glucose. These values are represented in Figure 4A.
  • Table 8 Values (mg / L) of phytoene and phytofluene production obtained by the FA3 strain in glucose fermentor tank. These values are represented in Figure 4B.

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Abstract

Método de producción de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos. La presente invención describe un método biotecnológico que permite obtener de forma simple, efectiva y a gran escala preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos, mediante la utilización de nuevas cepas mutadas de Paracoccus sp. (FA1 y FA3) superproductoras de fitoeno y/o fitoflueno.

Description

MÉTODO DE PRODUCCIÓN DE FITOENO Y/O FITOFLUENO, O MEZCLAS DE CAROTENOIDES CON ALTO CONTENIDO EN LOS
MISMOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe un método biotecno lógico que permite obtener de forma simple, efectiva y a gran escala, preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos, mediante la utilización de cepas mutadas de Paracoccus sp. superproductoras de fitoeno y/o fitoflueno. Por lo tanto, la presente invención es susceptible de ser aplicada en diversos campos de las ciencias de la vida, como por ejemplo en el campo alimentario, el farmacéutico o el cosmético.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los carotenoides son pigmentos de naturaleza isoprenoide sintetizados por ciertas bacterias, hongos y organismos fotosintéticos. Pueden clasificarse en dos tipos:
(i) Carotenos: son hidrocarburos puros entre los que se encuentran compuestos como β-caroteno, α-caroteno, γ-caroteno, licopeno, fitoeno o fitoflueno; y
(ii) Xanto filas: son moléculas que contienen oxígeno en diferentes formas (grupos hidroxi, epoxi, etc.), entre las que se encuentran compuestos como astaxantina, zeaxantina, capsantina, cantaxantina, luteína, etc.
Todos estos compuestos juegan un papel importante en la dieta humana como antioxidantes y como precursores de la vitamina A. Por lo tanto, debido a sus características, los carotenoides son eficaces contra el cáncer y otras enfermedades. Debido a sus efectos beneficiosos para la salud y a sus atractivos colores, los carotenoides poseen una gran importancia comercial como colorantes y aditivos alimentarios [Ninet L. y Renaut J. (1979) En: Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial Technology, 2nd. Edn, vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-544].
Diversas investigaciones apoyan la teoría de que el daño oxidativo sobre el ADN, proteínas y lípidos está directamente relacionado con la esperanza de vida, y que los antioxidantes naturales tales como ascorbato, tocoferol y carotenoides son compuestos importantes en la prevención de estas oxidaciones [Stadtman ER (1992) Science 257: 1220-1222; Sohal et al. (1993) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 90: 7255-7256]. Particularmente, en el caso del fitoeno han sido descritos efectos beneficiosos para la salud al tratarse de un compuesto con actividad antitumoral [Mathews-Roth MM (1982) Oncology 39: 33-37].
La producción de carotenoides por biosíntesis microbiana es un ejemplo clásico de competencia entre los procesos químicos y los biológicos. Los procesos biotecnológicos muestran, entre otras, la ventaja de permitir obtener de forma simple los carotenoides de estructura más compleja, así como los isómeros conformacionales que sólo existen de forma natural.
A pesar de la diversidad estructural y funcional de los carotenoides y xantofilas, su ruta biosintética es similar en los diferentes organismos, siendo el fitoeno la molécula precursora en todos los casos [Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98: 1687-1692; Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519; Lee & Schmidt-Dannert (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 1-11; Sandmann G (2003) Chem. Biol. 10: 478-479; Umeno et al. (2005) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69: 51-78].
La biosíntesis (Esquema 1) se inicia con la isomerización de isopentenil pirofosfato (IPP, C5) a dimetilalil pirofosfato (DMAPP, C5), catalizada por la enzima IPP isomerasa. Seguidamente una molécula de DMAPP se condensa con una molécula de IPP para generar geranil pirofosfato (GPP, Cío), el cual se condensa nuevamente con una molécula de IPP para generar farnesil pirofosfato (FPP, Ci5); ambas reacciones están catalizadas por la enzima FPP sintasa. Una nueva condensación de una molécula de FPP con una molécula de IPP da lugar a geranilgeranil pirofosfato (GGPP, C20); esta reacción está catalizada por la enzima GGPP sintasa (codificada por el gen crtE). La condensación de dos moléculas de GGPP catalizada por la enzima fitoeno sintasa (codificada por el gen crtB) genera fitoeno (C40), molécula precursora de la ruta biosintética de carotenoides. La enzima fitoeno desaturasa (codificada por el gen crtl) introduce cuatro dobles enlaces en la molécula de fitoeno para sintetizar consecutivamente fitoflueno, ζ-caroteno, neurosporeno y licopeno (C40). Finalmente, la enzima licopeno ciclasa (codificada por el gen crtY) se encarga de convertir los extremos acíclicos de la molécula de licopeno en anillos β para formar secuencialmente γ-caroteno y β-caroteno (C40).
En el caso de Phycomyces blakesleeanus, el color amarillo de su micelio puede ser modificado mediante mutación dando lugar a cepas con micelio de color rojo, blanco o varias gradaciones de amarillo. Los mutantes rojos acumulan licopeno, mientras que los blancos carecen de producción de carotenoides o acumulan fitoeno [Metha BJ. y Cerda-Olmedo E. (1995) Applied Microbio lo gy and Biotechnology 42: 836-838].
La utilización de Paracoccus sp. para la producción de astaxantina, adonixantina, equinenona, 3-hidroxiequinenona, zeaxantina, β-caroteno, licopeno, o β-criptoxantina está recogida en las patentes EP 635576, EP 1138208, EP 1229126, EP 1676925, o US 5935808.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención
La presente invención describe un método biotecno lógico, en adelante método de la invención, que permite obtener de forma simple, efectiva y a gran escala preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos, mediante la utilización de nuevas cepas mutadas de Paracoccus sp. (FAl y FA3) superproductoras de fitoeno y/o fitoflueno. Así, el problema técnico resuelto por la presente invención es la obtención de forma simple, efectiva y a gran escala de preparaciones estabilizadas de fitoeno y fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en fitoeno y fitoflueno, las cuales puedan aplicarse directamente en los campos alimentario, farmacéutico y cosmético.
Tal y como se cita en el estado de la técnica, existen varios documentos de patente que describen el uso de Paracoccus sp. para la producción de diversos carotenoides distintos del fitoeno y del fitoflueno. Sin embargo, ninguno de ellos se refiere a la utilización de las cepas de Paracoccus sp. mutadas (FAl y FA3) conseguidas en la presente invención para la producción de fitoeno o fitoflueno. A la luz de los documentos citados en el estado de la técnica, se considera que la presente invención presenta: (i) novedad, ya que ninguno de los documentos del estado de la técnica divulga el uso de las cepas de Paracoccus sp. mutadas (FAl y FA3) para la producción simple, efectiva y a gran escala de preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno; y (ii) actividad inventiva, ya que un experto medio en la materia no podría combinar de forma obvia los documentos expuestos en el estado de la técnica y resolver el problema técnico arriba planteado.
Descripción de las figuras
Figura 1. Cromatogramas HPLC de los carotenoides acumulados por la cepa Paracoccus sp. FAl.
A: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 9,46 correspondiente a fitoeno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 9,46. El máximo de absorción obtenido (286 nm) es característico del fitoeno (ver Tabla 1).
B: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 8,23 correspondiente a fitoflueno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 8,23. El máximo de absorción obtenido (348 nm) es característico del fitoflueno (ver Tabla 1). Figura 2. Cromatogramas HPLC de los carotenoides acumulados por la cepa Paracoccus sp. FA3.
A: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 9,52 correspondiente a fitoeno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 9,52. El máximo de absorción obtenido (286 nm) es característico del fitoeno (ver Tabla 1).
B: Izquierda: Cromatograma HPLC que muestra un pico mayoritario con RT 8,29 correspondiente a fitoflueno. Derecha: Espectro de absorción obtenido por diodoarray del pico con RT 8,29. El máximo de absorción obtenido (348 nm) es característico del fitoflueno (ver Tabla 1).
Figura 3.
A: Producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en matraz de la cepa Paracoccus sp. FAl. Ordenadas: fitoeno (4) y fitoflueno (D) (mg/L). Abscisas: tiempo de fermentación (h). Los datos se representan en la Tabla 5.
B: Producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en matraz de la cepa Paracoccus sp. FA3. Ordenadas: fitoeno (4) y fitoflueno (D) (mg/L). Abscisas: tiempo de fermentación (h). Los datos se representan en la Tabla 6.
Figura 4.
A: Producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en tanque fermentador de la cepa Paracoccus sp. FAl. Ordenadas: fitoeno (4) y fitoflueno (D) (mg/L). Abscisas: tiempo de fermentación (h). Los datos se representan en la Tabla 7.
B: Producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en tanque fermentador de la cepa Paracoccus sp. FA3. Ordenadas: fitoeno (4) y fitoflueno (D) (mg/L). Abscisas: tiempo de fermentación (h). Los datos se representan en la Tabla 8. Descripción detallada de la invención
Tal y como se ha comentado anteriormente, el método de la invención permite obtener de forma simple, efectiva y a gran escala preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o mezclas de carotenoides con alto contenido en los mismos, mediante la utilización de cepas mutadas de Paracoccus sp. superproductoras de fitoeno y/o fitoflueno (FAl y FA3).
El método de la invención comprende:
(i) obtención y selección de mutantes superproductores de fitoeno y fitoflueno a partir de una cepa de Paracoccus sp. productora de xantofilas;
(ii) desarrollo de condiciones mejoradas de fermentación para conseguir una máxima producción de fitoeno y/o fitoflueno, y
(iii) extracción y purificación del fitoeno y del fitoflueno producido.
OBTENCIÓN Y SELECCIÓN DE MUTANTES DE Paracoccus sp.
Obtención:
En primer lugar y con la finalidad de obtener cepas de Paracoccus sp. superproductoras de fitoeno y fitoflueno, se desarrolló un procedimiento mutagénico de Paracoccus sp. utilizando los agentes mutagénicos etilmetanosulfonato (EMS) y N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Las suspensiones de células a mutar se obtuvieron a partir de cultivo en medio líquido, lavando con solución salina para eliminar restos del medio. El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de aproximadamente 1011 células/mL en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 30 a 180 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de entre el 90 y el 99,9%. Las células mutadas se lavaron tres veces con solución salina. El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de aproximadamente 1011 células/mL en una solución que contenía 250 μg/mL de NTG y tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 90 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%. Las células mutadas se lavaron tres veces con solución salina. Con las células mutadas se sembraron placas Petri con medio sólido y se incubaron a 280C durante 4 días para obtener colonias aisladas.
Selección:
La estrategia utilizada para la selección de cepas superproductoras de fitoeno y fitoflueno a partir de una cepa de Paracoccus sp. productora de xantofilas se basó en el color de la colonia. Para ello, las células mutadas de Paracoccus sp. se sembraron en placas Petri y, una vez crecidas a 280C, se seleccionaron aquellas colonias que poseían color crema (la cepa parental posee color naranja). Tras analizar alrededor de 100.000 colonias se aislaron 2 colonias con color crema denominadas FAl y FA3 productoras de fitoeno y fitoflueno.
DESARROLLO DE CONDICIONES MEJORADAS DE FERMENTACIÓN
Las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3 se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de fitoeno y fitoflueno en medio líquido. El análisis de fitoeno y fitoflueno se determinó mediante cromatografía líquida HPLC en fase reversa, demostrándose que con ambas cepas es posible producir fitoeno y fitoflueno junto con una mezcla de carotenoides en la que el fitoeno es el carotenoide mayoritario. Asimismo, las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3 se fermentaron en fermentadores pre-industriales con la finalidad de determinar el nivel de producción de fitoeno y fitoflueno. En este caso se desarrollaron dos condiciones de fermentación diferentes: una basada en la utilización de glucosa como fuente de carbono y otra basada en la utilización de glicerol como fuente de carbono. En ambos casos se demuestra que las cepas FAl y FA3 producen fitoeno y fitoflueno junto con una mezcla de carotenoides en la que el fitoeno es el carotenoide mayoritario. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE FITOENO Y FITOFLUENO
La extracción y purificación de fitoeno y fitoflueno se realizó mediante la centrifugación del caldo de fermentación para obtener una biomasa húmeda, la cual se extrajo con alcohol isopropílico. El extracto obtenido se concentró y se purificó mediante dos separaciones cromatográficas sucesivas en gel de sílice.
DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS
Tal y como se ha expuesto anteriormente, en la presente invención se han obtenido y seleccionado los mutantes FAl y FA3 de la cepa de Paracoccus sp., útiles para la obtención de preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno de forma simple, efectiva y a gran escala. Los datos relativos al depósito de material biológico son los siguientes:
Autoridad Internacional de Depósito: Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
Dirección de la Autoridad Internacional de Depósito: Universidad de Valencia; Edificio de investigación; Campus de Burjassot; 46100 Burjassot (Valencia).
Número y fecha de depósito de la cepa Paracoccus sp. FAl : CECT 7383; depositada en la fecha 4 de Marzo de 2008.
Número y fecha de depósito de la cepa Paracoccus sp. FA3: CECT 7384; depositada en la fecha 4 de Marzo de 2008.
A continuación se disponen los Ejemplos de realización, los cuales tienen el objetivo de ilustrar la presente invención sin limitar la misma.
Ejemplo 1: Obtención de mutantes de Paracoccus sp.
En primer lugar se desarrolló un procedimiento mutagénico de una cepa de Paracoccus sp. productora de xantofilas, para lo cual se analizaron: (i) diferentes tipos de agentes mutagénicos, (ii) concentración del mutágeno, (iii) concentración de células, (iv) pH de incubación y (v) tiempo de tratamiento. De esta forma se seleccionaron como agentes mutagénicos etilmetanosulfonato (EMS) y N-metil-N'- nitro-N-nitrosoguanidina (NTG).
Las suspensiones de células a mutar se obtuvieron a partir de cultivos en un medio líquido, descrito en EP 1229126, cuya composición es la siguiente: corn steep liquor 30,0 g/L, sacarosa 30,0 g/L, KH2PO4 0,54 g/L, K2HPO4 2,78 g/L, MgSO4 VH2O 12,0 g/L, CaCl2-2H2O 0,1 g/L, y FeSO4-7H2O 0,3 g/L, ajustado a un pH final de 7,2 con NaOH. Una vez crecidas las células se lavaron dos veces en solución salina (NaCl 9 g/L) y se ajustó la concentración de células en la suspensión a aproximadamente 1011 células/mL.
El procedimiento de mutación con EMS consistió en la incubación de aproximadamente 1011 células/mL en una solución de EMS al 3% en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 30 a 180 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 90-99,9%. Las células mutadas se lavaron tres veces con solución salina, centrifugando a 3.000 r.p.m. y 150C durante 5 minutos.
El procedimiento de mutación con NTG consistió en la incubación de aproximadamente 1011 células/mL en una solución que contenía 250 μg/mL de NTG y tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente durante 90 minutos, consiguiendo tasas de mortalidad de alrededor del 99%. Las células mutadas se lavaron tres veces con solución salina, centrifugando a 3.000 r.p.m. y 150C durante 5 minutos.
Con las células mutadas se sembraron placas Petri que contenían un medio sólido con la siguiente composición por litro: corn steep liquor 30,0 g/L, sacarosa 30,0 g/L, KH2PO4 0,54 g/L, K2HPO4 2,78 g/L, MgSO4-7H2O 12,0 g/L, CaCl2-2H2O 0,1 g/L, FeSO4-7H2O 0,3 g/L, y agar 15 g/L, ajustado a un pH final de 7,2 con NaOH. Las placas sembradas se incubaron a 280C durante 4 días para obtener colonias aisladas. Ejemplo 2: Selección de mutantes de Paracoccus sp. productores de fitoeno y Ωtoflueno a partir de una cepa de Paracoccus sp. productora de xantofilas
La estrategia de selección de cepas de Paracoccus sp. productoras de fitoeno y fitoflueno a partir de una cepa de Paracoccus sp. productora de xantofilas se basó en el color de la colonia. La selección de los citados mutantes se realizó a partir de células mutadas con EMS y NTG tal y como se describe en el Ejemplo 1. Las células mutadas se sembraron en el medio sólido descrito en el Ejemplo 1 y se incubaron a 280C durante 5 días. Transcurrido este tiempo se seleccionaron aquellas colonias que poseían color crema en lugar del color naranja típico de la cepa parental Paracoccus sp. productora de xantofilas. De esta forma, a partir de aproximadamente 100.000 colonias analizadas se aislaron 12 colonias con color crema, las cuales podrían ser productoras de fitoeno y fitoflueno. Con la finalidad de determinar los carotenoides producidos por estos mutantes se realizó una extracción de la biomasa obtenida directamente del medio sólido con una mezcla de tetrahidrofurano metano l:hexano (20:1 :40) (v/v) y el extracto se analizó mediante cromatografía líquida HPLC con los siguientes métodos: (I) Para el análisis de β-caroteno, licopeno, fitoeno y fitoflueno se empleó una columna Hypersil ODS 5 μm (100 x 4,6 mm) con una fase móvil de metano l:acetonitrilo: cloro formo (47:47:6) (v/v) a un flujo de 1 mL/min. (II) Para el análisis de xantofilas se empleó una columna nucleosil 100 NH2 5 μm (250 x 4,6 mm) con una fase móvil de hexano: acetato de etilo (1:1) (v/v) a un flujo de 1 mL/min. Se utilizó un detector de diodoarray para adaptarse a las longitudes de onda de máxima absorción de los distintos carotenoides, las cuales se muestran en la Tabla 1.
De los 12 mutantes inicialmente aislados se seleccionaron 2, denominados FAl y FA3, los cuales acumulaban fitoeno y fitoflueno, siendo fitoeno el carotenoide principal. Las Figuras 1 y 2 muestran los cromatogramas HPLC de los carotenoides acumulados por ambas cepas. El nivel de producción de fitoeno y fitoflueno de las cepas FAl y FA3 se analizó posteriormente en medio líquido tal y como se describe en los Ejemplos 3, 4 y 5. Ejemplo 3: Procedimiento de producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en matraz de las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3
Las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3, seleccionadas tal y como se describe en los Ejemplos 1 y 2, se fermentaron en matraz con la finalidad de determinar el nivel de producción de fitoeno y fitoflueno en medio líquido. Para ello, se preparó un medio de inoculo, descrito en EP 1229126, con la siguiente composición por litro: corn steep liquor 30,0 g/L, sacarosa 30,0 g/L, KH2PO4 0,54 g/L, K2HPO4 2,78 g/L, MgSO4 VH2O 12,0 g/L, CaCl2-2H2O 0,1 g/L, y FeSO4 VH2O 0,3 g/L, ajustado a un pH final de 7,2 con NaOH. Cada matraz de inoculo de 250 mL con 50 mL de medio se sembró con 100 μl del cultivo congelado y se incubó a 280C, 250 r.p.m. y 5 cm de excentricidad durante 48 horas.
El medio de fermentación, descrito en EP 1229126, posee la siguiente composición por litro: corn steep liquor 30,0 g/L, glucosa 30,0 g/L, KH2PO4 1,5 g/L, Na2HPO4- 12H2O 3,8 g/L, MgSO4 VH2O 3,0 g/L, CaCl2-2H2O 0,2 g/L, y FeSO4 VH2O 1,0 g/L, ajustado a un pH final de 7,2 con NaOH. El medio se repartió en matraces Erlenmeyer de 250 mL a razón de 20 mL por matraz. Los matraces con el medio de fermentación se sembraron con el inoculo anteriormente descrito y se incubaron a 280C y 250 r.p.m. Una vez concluida la fermentación (5-6 días), se preparó una mezcla de caldo de fermentación y alcohol isopropíllico (1/1). La concentración y pureza de fitoeno y fitoflueno se determinó mediante el uso de cromatografía líquida HPLC en fase reversa.
Los niveles de producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides obtenidos con las cepas FAl y FA3 se muestran en las Tablas 2, 5 y 6. En la Figura 3 se muestra la evolución de la producción de fitoeno y fitoflueno a lo largo de la fermentación en matraz.
Este Ejemplo demuestra con claridad que con ambas cepas y el procedimiento descrito es posible producir fitoeno y fitoflueno junto con una mezcla de carotenoides en la que fitoeno es el carotenoide mayoritario. Ejemplo 4. Procedimiento de producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en tanque fermentador de las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3 utilizando un programa específico de adición de glucosa
Las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3, seleccionadas tal y como se describe en los Ejemplos 1, 2, y 3, se cultivaron en fermentadores pre-industriales con la finalidad de determinar el nivel de producción de fitoeno y fitoflueno. Para ello, se preparó un medio de pre-inóculo con la composición descrita en el Ejemplo 3 para el medio de inoculo. Los pre-inóculos se sembraron en matraces de 500 mL con 100 mL de medio y se incubaron a 280C y 250 r.p.m. con 5 cm de excentricidad durante 48 horas. Posteriormente se sembraron inóculos en matraces de 500 mL con 100 mL de medio de inoculo (Ejemplo 3) con el cultivo de pre-inóculo, y se incubaron a 280C y 250 r.p.m. con 5 cm de excentricidad durante 30 horas.
Con el cultivo de inoculo se sembraron fermentadores de 30 L con 16 litros de un medio de fermentación con la siguiente composición por litro: corn steep liquor 30,0 g/L, glucosa 30,0 g/L, KH2PO4 1,5 g/L, Na2HPO4- 12H2O 3,8 g/L, MgSO4 VH2O 3,0 g/L, CaCl2-2H2O 0,2 g/L, FeSO4-7H2O 1,0 g/L, y antiespumante PPG 1 mL/L. El pH se ajustó a 7,2 con amoniaco. La fermentación se incubó durante 96-144 horas a una temperatura de 280C con agitación variable entre 150 y 500 r.p.m. y una aireación de 0,25-1 v/v/m.
Desde las 20 horas hasta las 90 horas se mantuvo una adición de glucosa al 70% para mantener un rango de 10 a 30 g/L de glucosa en el caldo de fermentación.
La valoración de la concentración y pureza de fitoeno y fitoflueno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el Ejemplo 2. Los niveles de producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides se muestran en la Tabla 3.
Este Ejemplo demuestra con claridad que con ambas cepas y el procedimiento descrito es posible producir fitoeno y fitoflueno junto con una mezcla de carotenoides en la que fitoeno es el carotenoide mayoritario. Ejemplo 5. Procedimiento de producción de fitoeno y fitoflueno mediante fermentación en tanque fermentador de las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3 utilizando un programa específico de adición de glicerol
Las cepas Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3, seleccionadas tal y como se describe en los Ejemplos 1, 2, y 3, se cultivaron en fermentadores pre-industriales con la finalidad de determinar el nivel de producción de fitoeno y fitoflueno. Para ello, se preparó un medio de pre-inóculo con la composición descrita en el Ejemplo 3 para el medio de inoculo. Los pre-inóculos se sembraron en matraces de 500 mL con 100 mL de medio y se incubaron a 280C y 250 r.p.m. con 5 cm de excentricidad durante 48 horas. Posteriormente se sembraron inóculos en matraces de 500 mL con 100 mL de medio de inoculo (Ejemplo 3) con el cultivo de pre-inóculo, y se incubaron a 280C y 250 r.p.m. con 5 cm de excentricidad durante 30 horas.
Con el cultivo de inoculo se sembraron fermentadores de 30 L con 16 litros de un medio de fermentación con la siguiente composición por litro: corn steep liquor 30 g/L, glicerol 30 g/L, KH2PO4 1,5 g/L, Na2HPO4- 12H2O 3,8 g/L, MgSO4 VH2O 3,0 g/L, CaCl2-2H2O 0,2 g/L, FeSO4 VH2O 1,0 g/L, y antiespumante PPG 1 mL/L. El pH se ajustó a 7,2 con amoniaco. La fermentación se incubó durante 96-144 horas a una temperatura de 280C con agitación variable entre 150 y 500 r.p.m. y una aireación de 0,25-1 v/v/m.
Desde las 20 horas hasta las 90 horas se mantuvo una adición de glicerol al 66% para mantener un rango de 10 a 30 g/L de glicerol en el caldo de fermentación.
La valoración de la concentración y pureza de fitoeno y fitoflueno al final de la fermentación se realizó tal y como se describe en el Ejemplo 2. Los niveles de producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides obtenidos se muestran en la Tabla 4. Este Ejemplo demuestra con claridad que con ambas cepas y el procedimiento descrito es posible producir fitoeno y fitoflueno junto con una mezcla de carotenoides en la que fitoeno es el carotenoide mayoritario.
Ejemplo 6: Procedimiento de recuperación y purificación de fitoeno y fitoflueno de los caldos de fermentación de Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3
El caldo de fermentación obtenido tal y como se describe en los Ejemplos 3, 4 y 5 se centrifugó, recuperando la biomasa húmeda, la cual se extrajo con al menos 2 volúmenes por peso de alcohol isopropílico, preferentemente 6 volúmenes por peso. La mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y seguidamente se filtró a través de un embudo Büchner. El líquido obtenido se concentró bajo vacío a sequedad, obteniendo un extracto que se analizó espectrofotométricamente a 286 nm [Britton G., Liaaen-Jensen S. and Pfander H. (1995) Carotenoids. Volume IB: Spectroscopy, pag. 60, Birkhauser, Basel] mostrando la presencia de 15-25% fitoeno y 0.5-1% fitoflueno.
Seguidamente se realizó la primera purificación cromatográfica en gel de sílice utilizando al menos 5 gramos por cada gramo de extracto a purificar, preferentemente 10 gramos por cada gramo. La preparación de la columna se realizó mezclando gel de sílice y dicloro metano. El extracto concentrado, obtenido tal y como se describe anteriormente, se disolvió en diclorometano y se cargó en la columna. Las fracciones eluidas tras el proceso cromato gráfico se analizaron espectrofotométricamente y aquellas que presentaban el espectro UV/visible coincidente con la presencia de fitoeno y fitoflueno se evaporaron a sequedad. El producto pre-purificado obtenido se analizó espectrofotométricamente mostrando la presencia de 70-80% fitoeno y 1.0- 2.0% fitoflueno. El citado producto pre-purificado debe ser almacenado a -2O0C en atmósfera inerte para evitar degradación química.
Por último se realizó la segunda purificación cromatográfica en gel de sílice utilizando al menos 10 gramos de gel de sílice por cada gramo de producto pre-purificado, preferentemente 20 gramos por cada gramo. La preparación de la columna se realizó mezclando gel de sílice y ciclo hexano o n-hexano. El producto pre-purificado, obtenido tal y como se describe anteriormente, se disolvió en ciclohexano o n-hexano y se cargó en la columna. Al final de la cromatografía es necesario incrementar la polaridad adicionando etil acetato, eluyendo con mezclas de polaridad creciente ciclohexano o n-hexano:etil acetato 98:2, 97:3, ó 96:4.
Las fracciones eluidas tras el proceso cromatográfico se analizaron espectrofotométricamente y aquellas que presentaban el espectro UV/visible coincidente con la presencia de fitoeno y fitoflueno se evaporaron a sequedad. El producto obtenido se analizó espectrofotométricamente mostrando la presencia de 80- 90% fitoeno y 0.5-1.5% fitoflueno.
Esquema 1. Ruta biosintética de carotenoides y xantofilas.
Mevalonato
I
(crtB) (crtl)
(crtY)
Figure imgf000018_0001
Tabla 1. Longitudes de onda de máxima absorción de los distintos carotenoides.
Figure imgf000019_0001
Tabla 2. Producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides de las cepas FAl y FA3 en matraz a las 120 horas de fermentación. Los valores de producción de cada carotenoide se expresan como porcentaje del total de carotenoides producidos.
Figure imgf000020_0001
Tabla 3. Producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides de las cepas FAl y FA3 en fermentador de 30 L con adición de glucosa a las 96 horas de fermentación. Los valores de producción de cada carotenoide se expresan como porcentaje del total de carotenoides producidos.
Figure imgf000021_0001
Tabla 4. Producción de fitoeno, fitoflueno y otros carotenoides de las cepas FAl y FA3 en fermentador de 30 L con adición de glicerol a las 96 horas de fermentación. Los valores de producción de cada carotenoide se expresan como porcentaje del total de carotenoides producidos.
Figure imgf000021_0002
Tabla 5. Valores (mg/L) de producción de fitoeno y fitoflueno obtenidos por la cepa FAl en matraz. Estos valores están representados en la Figura 3A.
Figure imgf000022_0001
Tabla 6. Valores (mg/L) de producción de fitoeno y fitoflueno obtenidos por la cepa FA3 en matraz. Estos valores están representados en la Figura 3B.
Figure imgf000022_0002
Tabla 7. Valores (mg/L) de producción de fitoeno y fitoflueno obtenidos por la cepa FAl en tanque fermentador con glucosa. Estos valores están representados en la Figura 4A.
Figure imgf000022_0003
Tabla 8. Valores (mg/L) de producción de fitoeno y fitoflueno obtenidos por la cepa FA3 en tanque fermentador con glucosa. Estos valores están representados en la Figura 4B.
Figure imgf000022_0004

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de obtención, de forma efectiva y a gran escala, de preparaciones estabilizadas de fitoeno y/o fitoflueno, o de mezclas de carotenoides que contengan alto porcentaje de fitoeno y/o fitoflueno, que comprende la fermentación de las cepas mutantes Paracoccus sp. FAl y/o Paracoccus sp. FA3.
2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la fermentación de las cepas mutantes Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3 se lleva a cabo en un fermentador utilizando un programa específico de adición de glucosa.
3. Método, según la reivindicación 2, caracterizado porque el programa específico de adición de glucosa comprende una adición de glucosa al 70% desde las 20 horas hasta las 90 horas para mantener de 10 a 30 g/1 de glucosa en el caldo de fermentación.
4. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la fermentación de las cepas mutantes Paracoccus sp. FAl y Paracoccus sp. FA3 se lleva a cabo en un fermentador utilizando un programa específico de adición de glicerol.
5. Método, según la reivindicación 4, caracterizado porque el programa específico de adición de glicerol comprende una adición de glicerol al 66% desde las 20 horas hasta las 90 horas para mantener de 10 a 30 g/1 de glicerol en el caldo de fermentación.
6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la proporción de fitoeno en la preparación estabilizada obtenida es de al menos el 10% del total de carotenoides.
7. Método, según la reivindicación 6, caracterizado porque la proporción de fitoeno en la preparación estabilizada obtenida es de al menos el 90% del total de carotenoides.
8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el nivel de producción de fitoeno de la cepa Paracoccus sp. FAl es de al menos 866 mg/L.
9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el nivel de producción de fitoflueno de la cepa Paracoccus sp. FAl es de al menos 7 mg/L.
10. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el nivel de producción de fitoeno de la cepa Paracoccus sp. FA3 es de al menos 2.066 mg/L.
11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el nivel de producción de fitoflueno de la cepa Paracoccus sp. FA3 es de al menos 19 mg/L.
12. Cepa mutante de Paracoccus sp. FAl caracterizada por ser productora de fitoeno y/o fitoflueno.
13. Cepa mutante de Paracoccus sp. FA3 caracterizada por ser productora de fitoeno y/o fitoflueno.
14. Uso de una cepa mutada de Paracoccus sp. para producir fitoeno y/o fitoflueno.
15. Uso, según la reivindicación 14, en que la cepa mutada de Paracoccus sp. utilizada para producir fitoeno y/o fitoflueno es FAl.
16. Uso, según la reivindicación 14, en que la cepa mutada de Paracoccus sp. utilizada para producir fitoeno y/o fitoflueno es FA3.
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