ES2252009T3

ES2252009T3 - Metodo de produccion de licopeno.

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Publication number: ES2252009T3
Application number: ES00935226T
Authority: ES
Inventors: Ana Teresa Marcos; Antonio Estrella De Castro; Bina Mehta; Bruno Diez Garcia; Javier Costa Perez; Carmelita Rodriguez Otero; Enrique Peiro Cezon; Enrique Cerda Olmedo; Alfonso J. Collados De La Vieja; Francisco Salto Maldonado; Manuel Esteban Morales; Ermanno Bernasconi
Original assignee: Vitatene SA
Current assignee: Vitatene SA
Priority date: 1999-06-09
Filing date: 2000-06-06
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2020-06-06
Also published as: JP3904924B2; AU5079200A; DE60023693T2; DE60023693D1; EP1184464A2; JP2003502052A; WO2000077234A3; ATE308622T1; ES2156735A1; ES2156735B1; CN1252276C; CN1353765A; EP1184464B1; WO2000077234A2

Abstract

Procedimiento para la producción de licopeno. La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la obtención de carotenoides, especialmente como Blakeslea. Se describe un método de fermentación que permite obtener un incremento en la producción de licopeno, basado en la adición de ácidos trispóricos. El proceso se lleva a cabo a partir de estirpes silvestres o mutantes de las mismas, en cultivo simple o mixto. La adición de ácidos trispóricos puede hacerse al inicio de la fermentación o durante la misma y su origen puede ser una preparación parcialmente purificada o una fuente no purificada de los mismos.

Description

Método de producción de licopeno.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la producción de carotenoides, especialmente licopeno, a partir de cultivos sumergidos de hongos mucorales tipo Blakeslea. Se describe un método de fermentación mediante el cual es posible obtener un incremento en la producción de licopeno, basado en la adición de extractos enriquecidos en ácidos trispóricos. El proceso se lleva a cabo a partir de estirpes silvestres, o mutantes de las mismas, en cultivo simple o mixto. La adición de ácidos trispóricos puede hacerse al inicio de la fermentación o durante la misma.

Estado de la técnica

Los carotenoides son compuestos abundantes en frutas y vegetales, y han sido sujeto de numerosos estudios debido a sus propiedades como antioxidantes y como precursores de vitamina A. El licopeno, además de su propiedad antioxidante, previene las enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer como el cáncer de próstata y el cáncer gastrointestinal y actúa en el control del crecimiento (Stahl W. y Sies, H. 1996. Arch. Biochem. Biophys. 336:1-9; Clinton, SK. 1998. Nutr. Rev. 56:35-51). Los carotenoides, debido a su coloración amarilla a roja, son utilizados también como suplemento y colorante alimenticio de margarina, mantequilla, aceites para ensaladas, sopas y salsas (Ninet L. y Renaut J. 1979. En: Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial Technology, 2ª Edn., Vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-544).

El licopeno es un carotenoide que se produce como intermediario en la ruta biosintética de \beta-caroteno (patentes GB 1034944 y GB 1114043) y xantofilas.

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Las preparaciones de licopeno se obtienen a partir de tomate (Patentes PCT WO 97/48287, EP 608027), o mediante la fermentación de hongos mucorales como Phycomyces, Blakeslea y Choanephora (Patentes GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190 y RU 2102416).

Las patentes GB 1008469 y US 3097146 describen un método de fermentación del hongo Blakeslea trispora que consiste en un medio de cultivo cuyo pH se mantiene por encima de 7,0 y hasta 9,5. Después de siete días de incubación se obtienen 9,97 mg de licopeno por cada 100 ml de medio.

Las patentes japonesas JP 73016189 Y JP 73016190 describen un método de fermentación con hongos mucorales como Phycomyces, Blakeslea y Choanephora, en el cual se adicionan aminas terciarias para impedir la formación de \beta-caroteno y favorecer la acumulación de licopeno. Como ejemplo de aminas terciarias se citan las siguientes: hordenina, 2-dimetilamino-etanol; 3-dimetilamino-1-propanol; 1-dimetilamino-2-propanol; 2-dietilamino-etanol; 3-dietilamino-1-propanol; 1-dietilamino-2-propanol; trietilamina; 2-diisopropilamino-etanol; 3-diisopropilamino-1-propanol; 1-diisopropilamino-2-propanol; 2-di-n-propilamino-etanol; 3-di-n-propilamino-1-propanol; 1-di-n-propilamino-2-propanol; 2-dimetilaminoetilbenceno; 2-dietilaminoetilbenceno; p-(2-dietilaminoetil)fenol. La patente RU 2102416 describe la adición de aminometilpiridinas y restos de tabaco para inducir la acumulación de licopeno. Además de las sustancias descritas en dichas patentes, se ha descrito el uso de otras bases nitrogenadas heterocíclicas capaces de bloquear la síntesis de carotenoides a nivel del licopeno, como nicotina (Patente japonesa JP 09313167), imidazol, piridina, morfolina, quinolina y algunos derivados sustituidos (Patente US 3369974; Ninet L., Renaut J. 1979. En: Peppler HJ, Perlman D (eds.). Microbial Technology, 2ª Edn., Vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-544).

Se han descrito también mutantes de B. trispora que acumulan licopeno sin la necesidad de adicionar aminas terciarias (Mehta B. y Cerdá-Olmedo E. 1995. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:836-838).

En cualquiera de los métodos de producción de \beta-caroteno con el hongo B. trispora se utilizan cultivos mixtos del hongo, como resultado de lo cual se obtienen rendimientos de \beta-caroteno muy superiores a los encontrados en las estirpes (+) y (-) por separado (Ciegler, A. 1965. Advances in Applied Microbiology 7:1-34; Plempel, M. 1965. Planta 65:225-231; Sutter, RP. y Rafelson, ME. 1968. J. Bacteriology 95:426-432). El incremento de producción de \beta-caroteno en cultivos mixtos está correlacionado con la producción de una familia de compuestos ácidos denominados factor \beta o ácidos trispóricos. (Caglioti L., Cainelli G., Camerino B., Mondelli R., Prieto A., Quilico A., Salvatori T, Selva A. 1966. Tetrahedron Supplement 7:175-187). Se ha propuesto que los ácidos trispóricos son hormonas sexuales en hongos mucorales como B. trispora, Phycomyces blakesleanus y Mucor mucedo, ya que además de estimular la producción de \beta-caroteno, estimulan la formación de zigóforos (van den Ende, H. 1968. J. Bacteriology 96:1298-1303; Austin DJ., Bu’Lock JD., Gooday G.W. 1969. Nature 223:1178-1179; Reschke, T. 1969. Tetrahedron Letters 29:3435-3439; van den Ende H., Wiechmann AHCA., Reyngoud DJ., Hendricks T. 1970. J. Bacteriology 101:423-428).

Químicamente, los ácidos trispóricos son derivados oxidados e insaturados de 1,1,3-trimetil-2-(3-metiloctil)ciclohexano. Dichos compuestos pueden ser clasificados como sesquiterpenos elaborados o productos de la degradación de diterpenos o carotenoides. Los ácidos trispóricos han sido caracterizados como una mezcla de tres sustancias: ácido trispórico A, B y C, también denominados factor \beta_{1}, \beta_{2} y \beta_{3} (debido a que estimulan la síntesis de \beta-caroteno)_{.} El más abundante es el ácido trispórico C, que se encuentra presente en un 80% en cultivos mixtos de B. trispora (Caglioti, L., Cainelli, G., Camerino, B., Mondelli, R., Prieto, A., Quilico, A., Salvatori, T, Selva, A. 1966. Tetrahedron Supplement 7:175-187).

2

Los ácidos trispóricos se sintetizan a partir de \beta-caroteno producido tanto por la estirpe (+) como por la estirpe (-). El \beta-caroteno es metabolizado vía retinal en 4-hidrotrisporol. Este compuesto es metabolizado por la estirpe (+) en ácido 4-dihidrotrispórico y en su metil éster, y la estirpe (-) convierte el 4-hidrotrisporol en trisporol. Estos dos intermediarios son convertidos en ácido trispórico sólo después de difundir en el medio hasta la estirpe del sexo opuesto (Recopilado por Gooday GW. y Carlile MJ. 1997. Mycologist 11:26-30). Es decir, la estirpe (-) produce los intermediarios que son convertidos en ácido trispórico por la estirpe (+) y viceversa, según el esquema anterior.

Los ácidos trispóricos obtenidos a partir de cultivos mixtos de B. trispora pueden utilizarse para incrementar la producción de \beta-caroteno en cultivos con estirpes independientes. Por ejemplo, la adición de 21,8 unidades de factor b incrementa un 422% el rendimiento de \beta-caroteno de la estirpe (-) y un 71% el rendimiento de la estirpe (+). Sin embargo, la estimulación de la carotenogénesis por unidad de factor \beta en cultivos de estirpe (-) fue sólo un 20-30% de la carotenogénesis producida en cultivos mixtos y con cantidades similares de factor \beta. (Sutter RP. y Rafelson ME. 1968. J. Bacteriology 95:426-432).

La purificación de ácidos trispóricos puede realizarse por diversos métodos, tales como los descritos por Sutter, R. 1970. Science 168:1590-1592 ó Sutter RP., Capage DA., Harrison TL., Keen WA. 1973. J. Bacteriology 114:1074-1082.

No se conoce que se haya descrito un efecto positivo de incremento del rendimiento de licopeno mediante la adición de ácidos trispóricos. La producción de licopeno se basa en suprimir la actividad licopeno ciclasa que convierte licopeno en \beta-caroteno, lo que trae como consecuencia bajos niveles de \beta-caroteno en la fermentación. Los ácidos trispóricos, que son las hormonas sexuales que inducen la carotenogénesis, se sintetizan a partir de \beta-caroteno. Es por tanto, la ausencia de precursor (\beta-caroteno) la que inhibe la formación de dichas hormonas y la que permite incrementar la producción de licopeno mediante el uso de ácidos trispóricos, ya que en cultivos mixtos que producen \beta-caroteno (como en el caso del mutante SB34(-) con ASA2(+) de los ejemplos 5 y 6), la adición de ácidos trispóricos no tiene ningún efecto.

Descripción detallada de la invención

El objeto de la presente invención pretende incrementar la producción de carotenoides, especialmente de licopeno, en un proceso de fermentación con hongos mucorales (Blakeslea, Choanephora o Phycomyces), más específicamente en B. trispora. La invención consiste en cultivar el hongo B. trispora en un medio de fermentación y adicionar ácidos trispóricos (o factor \beta) parcialmente purificados (PTA) o bien no purificados (NPTA) de cualquier otra fuente, como por ejemplo, de un medio para la producción de \beta-caroteno.

El efecto de los ácidos trispóricos sobre la fermentación de licopeno se fundamenta en el hecho de que dichas hormonas son sintetizadas a partir de \beta-caroteno, compuesto que no puede formarse en la fermentación de licopeno. En estas condiciones el hongo carece de precursor para la síntesis de dichas hormonas y la carotenogénesis no está inducida en su grado máximo.

Los organismos utilizados para la fermentación pueden ser estirpes aisladas o una mezcla de las estirpes (+) y (-) de hongos mucorales, más específicamente B. trispora, o alternativamente mutantes de B. trispora capaces de acumular licopeno. Varias mezclas de estirpe (+) y (-) del hongo pueden ser utilizadas en el proceso de fermentación de esta invención. En el caso de utilizar estirpes de B. trispora que son productoras de \beta-caroteno, se adicionan compuestos que son capaces de bloquear la carotenogénesis a nivel de licopeno (por ejemplo aminas terciarias y otros citados anteriormente). En el caso de utilizar mutantes bloqueados en la biosíntesis de carotenoides a partir de licopeno, no será necesaria la adición de aminas terciarias y compuestos relacionados. En cualquiera de los dos casos citados, los ácidos trispóricos se adicionan parcialmente purificados (PTA) o no purificados (NPTA) a partir de alguna fuente de los mismos, como por ejemplo a partir de medio de cultivo procedente de una fermentación de \beta-caroteno, y en ambos casos en una concentración aproximada de 0,35 mg/ml. El término NPTA corresponde a un medio de \beta-caroteno. En la Fig. 1 se pueden calcular, en función del día de incubación, la concentración en dichos medios de ácidos trispóricos (al 4º día estaría entre los 350-400 \mug/ml).

El proceso para la producción de carotenoides a partir de hongos mucorales, y más específicamente de licopeno con estirpes seleccionadas o mutantes de B. trispora, puede realizarse en cualquier medio de cultivo que contenga una o más fuentes de carbono, una o más fuentes de nitrógeno, sales minerales y tiamina. Las fuentes de carbono se pueden añadir como nutrientes sencillos o complejos e incluyen carbohidratos o grasas, tales como dextrinas, almidones, glucosa, sacarosa, fructosa, aceites animales o vegetales. El medio de cultivo debe llevar también una fuente asimilable de nitrógeno, orgánico o inorgánico, tal como harina de soja, harina de maíz, destilados solubles, extracto de levadura, harina de semilla de algodón, peptona, caseína, sulfato amónico, etc. Entre las sales minerales que pueden adicionarse al medio de cultivo se encuentran fosfatos, sulfatos, cloruros, sodio, potasio, amonio, calcio y magnesio. Las proporciones de los nutrientes se determinan en base a las necesidades de crecimiento del microorganismo y a los niveles de producción. La fermentación se lleva a cabo preferiblemente en condiciones aeróbicas y en cultivo sumergido. La temperatura de fermentación puede oscilar entre 20 y 32ºC, aunque se prefiere entre 25 y 28ºC.

La adición de ácidos trispóricos en una concentración que oscila entre 0,001-1000 mg/ml puede realizarse a partir de una preparación parcialmente purificada o a partir de cualquier fuente de los mismos, como por ejemplo de medio de cultivo procedente de una fermentación de \beta-caroteno de cualquier hongo mucoral. La adición se realiza preferiblemente entre 72-144 h del comienzo de la fermentación.

La extracción del licopeno se realiza mediante cualquier método descrito de ruptura celular que permita liberar el contenido intracelular, que se disuelve en cualquier disolvente en el que sea soluble. Su concentración se puede determinar mediante medida espectrofotométrica, pero se prefiere el uso de cromatografía líquida (HPLC), mediante cualquiera de los métodos descritos en la bibliografía.

Las estirpes utilizadas son las siguientes: Mutantes productores de \beta-caroteno: ASA2(+) y ASA25(-). Mutante productor de licopeno SB34(-). Este último mutante produce también un 25% de \beta-caroteno (ver Tabla 1). La selección de los mutantes es irrelevante desde el punto de vista del efecto de incremento de la producción de caroteno debido a los ácidos trispóricos per se. Es decir, el efecto debido a dichos compuestos sería reproducible en cualquier otra cepa mutante análoga, aunque tuviera una menor producción basal de licopeno, como ocurre con las cepas parentales, por ejemplo. Las cepas parentales están depositadas en una colección y son viables y accesibles al público.

Ejemplo 1 Determinación de la concentración de ácidos trispóricos a lo largo de una fermentación de \beta-caroteno y de licopeno

Se prepara un medio de inóculo que contiene por litro: harina de soja, 23 g; harina de maíz, 47 g; fosfato monopotásico 0,5 g; hidrocloruro de tiamina, 0,002 g. Su pH inicial es de 6,3. El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 500 ml a razón de 67 ó 100 ml. Después de esterilizar, se siembran a partir de suspensiones de esporas las estirpes B. trispora ASA2(+) y B. trispora ASA25(-) en matraces separados y se incuban a 25ºC durante 48 horas.

Las estirpes mutantes B. trispora ASA2(+) y B. trispora ASA25(-) se obtienen por mutación con NTG a partir de las estirpes silvestres de B. trispora F208(-) y F117(+) depositadas en la Colección de Microorganismos Industriales (VKM), sita en Moscú, Rusia, siendo ambas cepas accesibles al público.

Se prepara un medio base de fermentación que contiene por litro: harina de soja, 44 g; harina de maíz, 19 g; fosfato dibásico 0,55 g; hidrocloruro de tiamina, 0,002 g; aceite vegetal 10%. Su pH inicial se ajusta a 7,5 con hidróxido potásico. El medio se reparte en matraces Erlenmeyer de 250 ml a razón de 20 ml.

Para la fermentación de \beta-caroteno se inoculan matraces que contienen medio base con un 10% de un cultivo mixto de las estirpes B. trispora ASA2(+) y B. trispora ASA25(-). Para la fermentación de licopeno se añade al medio base un agente químico con el fin de bloquear la ruta biosintética a nivel del licopeno, como por ejemplo 2 ml/l de piridina. Este medio se inocula con un 10% de un cultivo mixto de las estirpes B. trispora ASA2(+) y B. trispora ASA25(-). Todos los matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm. A partir del segundo día de fermentación se toma una muestra cada 24 horas y se determina la concentración de ácidos trispóricos en matraces productores de \beta-caroteno y en matraces productores de licopeno.

La determinación de la concentración de ácidos trispóricos se lleva a cabo mediante la extracción con un volumen de cloroformo después de acidificar la muestra a pH 2. La fracción orgánica se extrae con un volumen de una solución de bicarbonato sódico al 4%, se recoge la fase acuosa, que se acidifica para extraerla nuevamente con cloroformo. Posteriormente el cloroformo es evaporado hasta sequedad y el residuo constituido por ácidos trispóricos se disuelve en etanol o tampón Tris-sulfato. Los ácidos trispóricos se cuantifican mediante espectrometría de absorción a 325 nm, asumiendo una absortividad de 70 ml x mg^{-1} x cm^{-1} (Sutter RP., Capage DA., Harrison TL., Keen WA. 1973. J. Bacteriology 114:1074-1082).

La concentración de ácidos trispóricos resultó ser diferente a lo largo de la fermentación de \beta-caroteno y de licopeno, siendo significativamente inferior en esta última. La máxima diferencia se encontró al 4º día, con una concentración de 378 \mug/ml en la fermentación de \beta-caroteno y de 46 \mug/ml en la fermentación de licopeno (una diferencia de 8 veces aproximadamente) (Fig. 1).

Ejemplo 2 Efecto de la adición de ácidos trispóricos sobre la fermentación de un mutante bloqueado parcialmente en la biosíntesis de \beta-caroteno de forma que acumula licopeno

El medio de inóculo se prepara del modo descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se siembra a partir de una suspensión de esporas la estirpe B. trispora SB34(-) y se incuba a 25ºC durante 48 horas.

La estirpe mutante B. trispora SB34(-) se obtuvo por mutación con NTG a partir de la estirpe silvestre B. trispora F921(-) depositada en la colección de cultivos VKM, Moscú, Rusia y accesible al público.

Se prepara un medio de fermentación del mismo tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar se inocula una serie de matraces con un 10% de la estirpe B. trispora SB34(-), que se caracteriza por ser un mutante bloqueado parcialmente en la biosíntesis de \beta-caroteno de forma que acumula licopeno. Todos los matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm.

Los matraces control son aquellos que no reciben adición de ácidos trispóricos. El grupo de matraces que recibe adición de ácidos trispóricos se mantiene en las mismas condiciones que el control hasta el 4º día, en que se adiciona una preparación enriquecida en ácidos trispóricos, purificada como se describe en el Ejemplo 1, a una concentración final de 350 \mug/ml.

Con la adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA) se consigue un incremento de 0,11 a 0,24 mg de licopeno por gramo de peso seco (un incremento de 2,18 veces con respecto al control al 6º día de fermentación, Fig. 2).

Ejemplo 3 Efecto de la adición de ácidos trispóricos sobre la fermentación de licopeno con un mutante productor de \beta-caroteno cuya biosíntesis se bloquea a nivel del licopeno mediante un agente químico

El medio de inóculo se prepara del modo descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se siembra a partir de una suspensión de esporas la estirpe B. trispora ASA25(-) y se incuba a 25ºC durante 48 horas.

Se prepara un medio de fermentación del mismo tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se añade un agente químico que bloquea la biosíntesis de carotenoides a nivel del licopeno, como por ejemplo imidazol a una concentración final de 0,75 mg/ml. Este medio se suplementa también con tampón fosfato de pH 7,5 a una concentración final de 25 mM y se inocula con un 10% de la estirpe B. trispora ASA25(-). Los matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm.

Los matraces control son aquellos que no reciben adición de ácidos trispóricos. El grupo de matraces que recibe adición de ácidos trispóricos se mantiene en las mismas condiciones que el control hasta el 4º día, en que se adiciona una preparación enriquecida en ácidos trispóricos a una concentración final de 350 \mug/ml. La purificación de ácidos trispóricos se realiza del mismo modo descrito en el Ejemplo 1.

Con la adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA) se consigue un incremento de 0,16 a 1,09 mg de licopeno por gramo de peso seco (un incremento de 6,8 veces con respecto al control al 6º día de fermentación, Fig. 3).

Ejemplo 4 Efecto de la adición de ácidos trispóricos, parcialmente purificados (PTA) o no purificados (NPTA), sobre la fermentación del mutante de B. trispora ASA25(-) en cultivo mixto con B. trispora ASA2(+)

El medio de inóculo se realiza del modo descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se siembran a partir de suspensiones de esporas las estirpes B. trispora ASA25(-) y B. trispora ASA2(+) en matraces separados y se incuban a 25ºC durante 48 horas.

Se prepara un medio de fermentación del mismo tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se añade imidazol a una concentración final de 0,75 mg/ml y tampón fosfato de pH 7,5 a una concentración final de 25 mM. Este medio se inocula con un 10% de una mezcla de las estirpes B. trispora ASA25(-) y B. trispora ASA2(+). Los matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm.

Para la obtención de una fuente de ácidos trispóricos no purificados (NPTA) se prepara un medio de fermentación del mismo tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar se siembra un cultivo mixto con un 10% de las estirpes B. trispora ASA2(+) y B. trispora ASA25(-), que son productoras de \beta-caroteno. Los matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm.

Los matraces control son aquellos que no reciben adición de ácidos trispóricos. El grupo de matraces que recibe adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA), se mantiene en las mismas condiciones que el control hasta el día 4º, en que se adicionan ácidos trispóricos a una concentración final de 350 \mug/ml. La purificación de ácidos trispóricos se realiza del mismo modo descrito en el Ejemplo 1. El grupo de matraces que recibe la adición de ácidos trispóricos no purificados (NPTA) se mantiene en las mismas condiciones que el control hasta el 4º día, para ser luego sometido a un proceso de filtración a través de un filtro de nylon de 20 mm que permite separar el micelio de las estirpes B. trispora ASA25(-) y B. trispora ASA2(+) del medio de cultivo donde han crecido en presencia de imidazol. Paralelamente se realiza la separación de micelio y medio de cultivo a través de un filtro de nylon de 20 \mum, pero en este caso de matraces que contienen las dos estirpes B. trispora ASA2(+) y B. trispora ASA25(-), en condiciones de producción de \beta-caroteno, cuyo medio de cultivo es considerado una fuente no purificada de ácidos trispóricos (NPTA). Finalizada la separación de micelio y medio de cultivo, se mezcla el micelio de las estirpes B. trispora ASA25(-) y ASA2(+) crecidas con imidazol, con el medio de cultivo de las mismas estirpes crecidas en ausencia de imidazol. Al medio de cultivo considerado como una fuente no purificada de ácidos trispóricos (NPTA) se le añade imidazol para obtener una concentración final de 0,75 mg/ml. Estos matraces se incuban a 25ºC y 250 rpm.

Con la adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA) se consigue un incremento de 29,14 a 43,58 mg de licopeno por gramo de peso seco (un incremento del 50% con respecto al control al 6º día de fermentación, Fig. 3) y mediante la adición de medio de cultivo de \beta-caroteno se consigue un incremento de 29,14 a 41,07 mg de licopeno por gramo de peso seco (un incremento del 41% con respecto al control al 6º día de fermentación, Fig. 4). Este ejemplo demuestra que el efecto de los ácidos trispóricos es independiente de su grado de purificación.

Ejemplo 5 Efecto de la adición de ácidos trispóricos sobre la fermentación del mutante de B. trispora SB34(-) en cultivo mixto con B. trispora ASA2(+)

El medio de inóculo se prepara del modo descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se siembran a partir de suspensiones de esporas las estirpes B. trispora SB34(-) y B. trispora ASA2(+) en matraces separados y se incuban a 25ºC durante 48 horas.

Se prepara un medio de fermentación del mismo tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar se inocula con un 10% de una mezcla de las estirpes B. trispora SB34(-) y B. trispora ASA2(+). Los matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm.

La adición de una preparación enriquecida en ácidos trispóricos no tiene efecto significativo sobre la producción de licopeno cuando la fermentación del mutante SB34(-) se realiza en cultivo mixto (Fig. 5).

Ejemplo 6 Análisis de la proporción de carotenoides en las fermentaciones mixtas de las estirpes B. trispora SB34(-) o B. trispora ASA 25(-) con B. trispora ASA2(+)

El medio de inóculo se prepara del modo descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, se siembran a partir de suspensiones de esporas las estirpes B. trispora SB34(-), B. trispora ASA25(-) y B. trispora ASA2(+) en matraces separados y se incuban a 25ºC durante 48 horas.

Se prepara un medio de fermentación del mismo tipo que el descrito en el Ejemplo 1. Después de esterilizar, este medio se divide en dos grupos. Un grupo de matraces se inocula con un 10% de una mezcla de las estirpes B. trispora SB34(-) y B. trispora ASA2(+). Al otro grupo de matraces, después de esterilizar, se añade imidazol a una concentración final de 0,75 mg/ml y tampón fosfato de pH 7,5 a una concentración final de 25 mM. Este medio se inocula con un 10% de una mezcla de las estirpes B. trispora ASA25(-) y B. trispora ASA2(+). Todos los matraces se incuban a 25ºC en un agitador orbital a 250 rpm.

Los matraces control son aquellos que no llevan adición de ácidos trispóricos. El grupo de matraces que recibe adición de ácidos trispóricos se mantiene en las mismas condiciones que el control hasta el 4º día, en que se adiciona una preparación enriquecida en ácidos trispóricos a una concentración final de 350 \mug/ml. La purificación de ácidos trispóricos se realiza del mismo modo descrito en el Ejemplo 1.

Se recogen muestra de los cultivos al 5º y 6º día de fermentación con el fin de analizar la proporción de carotenoides mediante cromatografía líquida (HPLC). Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Porcentaje de carotenoides al 5º y 6º día de fermentación en cultivo mixto de las estirpes B. trispora SB34(-) o ASA25(-) con B. trispora ASA2(+)

Estirpes	Ácidos trispóricos	Día	Neurosporeno	Licopeno	\gamma-caroteno	\beta-caroteno
			(%)	(%)	(%)	(%)
SB34(-)xASA2(+)	No	5º	3	57	16	25
SB34(-)xASA2(+)	No	6º	3	64	12	21
SB34(-)xASA2(+)	Sí	5º	3	55	15	28
SB34(-)xASA2(+)	Sí	6º	2	62	12	23
ASA25(-)xASA2(+)	No	5º	1	88	9	2
ASA25(-)xASA2(+)	No	6º	1	89	8	2
ASA25(-)xASA2(+)	Sí	5º	1	85	10	3
ASA25(-)xASA2(+)	Si	6º	1	88	9	2

El análisis del porcentaje de carotenoides obtenido en la fermentación de licopeno utilizando un cultivo mixto de las estirpes B. trispora SB34(-) o B. trispora ASA25(-) con B. trispora ASA2(+) muestra una diferencia significativa en el porcentaje de licopeno y \beta-caroteno (Tabla 1). Dichas diferencias son independientes de la adición de ácidos trispóricos. La mezcla de carotenoides obtenida al 6º día mediante fermentación con B. trispora SB34(-) tiene un 63% de licopeno, mientras que la obtenida con B. trispora ASA25(-) posee un 88% (rindiendo un producto que es un 25% más puro). En la misma mezcla, la proporción de \beta-caroteno es 10 veces superior en la fermentación con B. trispora SB34(-) que con B. trispora ASA25(-).

Dado que el \beta-caroteno es el precursor de los ácidos trispóricos, estos datos podrían explicar:

1.: La diferencia de concentración de ácidos trispóricos entre una fermentación de \beta-caroteno y una fermentación de licopeno (Ejemplo 1).

2.: El hecho de que la adición de ácidos trispóricos (purificados o no purificados) incremente entre un 40 y 50% el rendimiento de licopeno al 6º día de fermentación en cultivo mixto cuando se usa como estirpe negativa B. trispora ASA25(-), cuya mezcla de carotenoides contiene sólo un 2% de \beta-caroteno (Ejemplos 4 y 6).

3.: El hecho de que la adición de ácidos trispóricos no tenga ningún efecto sobre el cultivo mixto cuando se usa como estirpe negativa B. trispora SB34(-), cuya mezcla de carotenoides contiene más de un 20% de \beta-caroteno (Ejemplos 5 y 6).

Estos resultados demuestran que el efecto de los ácidos trispóricos sobre la fermentación de licopeno en cultivos mixtos se debe a la ausencia de precursor para su biosíntesis. De ahí que su utilización en la producción industrial de licopeno de alta pureza sea altamente ventajosa.

Descripción detallada de las figuras

Fig. 1. Concentración de ácidos trispóricos a lo largo de una fermentación de \beta-caroteno y una fermentación de licopeno. En ambas fermentaciones se utiliza un cultivo mixto de las estirpes B. trispora ASA25(-) y B. trispora ASA2(+). En la fermentación de licopeno (cuadrados) se adiciona al medio de cultivo un agente químico que favorece la acumulación de licopeno, en este caso piridina. La fermentación de \beta-caroteno (rombos) se lleva a cabo en las mismas condiciones pero sin piridina. Abscisas: tiempo en días. Ordenadas: concentración de ácidos trispóricos (\mug/ml).

Fig. 2. Producción de licopeno por la estirpe mutante B. trispora SB34(-), bloqueada en la síntesis de \beta-caroteno a nivel de licopeno, con y sin adición de ácidos trispóricos. Los valores de producción de licopeno obtenidos en una fermentación control sin adición de ácidos trispóricos se representan mediante rombos. El efecto de la adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA) al 4º día de fermentación sobre la producción de licopeno se indica con cuadrados. Los valores representan la media de dos muestras independientes. Las barras de error representan la desviación estándar del promedio. Abscisas: tiempo en días. Ordenadas: mg licopeno/g peso seco.

Fig. 3. Producción de licopeno por la estirpe mutante B. trispora ASA25(-), superproductora de \beta-caroteno, con y sin adición de ácidos trispóricos. El medio de fermentación se suplementa con imidazol para favorecer la acumulación de licopeno. Los valores de producción de licopeno obtenidos en una fermentación control sin adición de ácidos trispóricos se representan mediante rombos. El efecto de la adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA) al 4º día de fermentación sobre la producción de licopeno se indica con cuadrados. Los valores representan la media de dos muestras independientes. Las barras de error representan la desviación estándar del promedio. Abscisas: tiempo en días. Ordenadas: mg licopeno/g peso seco.

Fig. 4. Producción de licopeno en cultivo mixto de las estirpes mutantes superproductoras de \beta-caroteno B. trispora ASA25(-) y B. trispora ASA2(+), con y sin adición de ácidos trispóricos. El medio de fermentación se suplementa con imidazol para favorecer la acumulación de licopeno. Los valores de producción de licopeno obtenidos en una fermentación control sin adición de ácidos trispóricos se representan mediante rombos. El efecto de la adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA) al 4º día de fermentación sobre la producción de licopeno se indica con cuadrados. La producción de licopeno obtenida mediante adición de ácidos trispóricos no purificados (NPTA) al 4º día de fermentación se representa mediante círculos. Los valores representan la media de dos muestras independientes. Las barras de error representan la desviación estándar del promedio. Abscisas: tiempo en días. Ordenadas: mg licopeno/g peso seco.

Fig. 5. Producción de licopeno en cultivo mixto de las estirpes B. trispora SB34(-) y B. trispora ASA2(+), con y sin adición de ácidos trispóricos. Los valores de producción de licopeno obtenidos en una fermentación control sin adición de ácidos trispóricos se representan mediante rombos. El efecto de la adición de ácidos trispóricos parcialmente purificados (PTA) al 4º día de fermentación sobre la producción de licopeno se indica con cuadrados. Los valores representan la media de dos muestras independientes. Las barras de error representan la desviación estándar del promedio. Abscisas: tiempo en días. Ordenadas: mg licopeno/g peso seco.

Claims

1. Un procedimiento de producción de licopeno por fermentación de estirpes (+) y (-) de hongos mucorales en condiciones inhibitorias para producir \beta-caroteno, caracterizado porque se adicionan ácidos trispóricos en cualquier momento durante la fermentación y se recupera el licopeno producido.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el hongo mucoral utilizado en la fermentación es Blakeslea trispora.

3. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por utilizarse un cultivo que contiene una estirpe mutante de B. trispora cuya capacidad de biosíntesis de \beta-caroteno está total o parcialmente bloqueada, debido a la mutación, y que acumula licopeno.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por adicionarse al cultivo, en cualquier momento de la fermentación, un inhibidor de la biosíntesis de \beta-caroteno, para inducir la acumulación de licopeno.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la adición de ácidos trispóricos se realiza de forma que se alcance una concentración de los mismos que oscile entre 0,001 y 1000 mg/ml.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la adición de ácidos trispóricos al cultivo se produce entre 72 y 144 h del inicio de la fermentación.

7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los ácidos trispóricos se añaden parcialmente purificados.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los ácidos trispóricos se añaden sin purificar, preferentemente a partir de un medio de cultivo recuperado de una fermentación de \beta-caroteno.