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WO2009052810A2 - Collagen fibril matrices - Google Patents

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WO2009052810A2
WO2009052810A2 PCT/DE2008/001745 DE2008001745W WO2009052810A2 WO 2009052810 A2 WO2009052810 A2 WO 2009052810A2 DE 2008001745 W DE2008001745 W DE 2008001745W WO 2009052810 A2 WO2009052810 A2 WO 2009052810A2
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WO
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kollagenfibrillenmatrices
collagen
solution
varied
matrices
Prior art date
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PCT/DE2008/001745
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German (de)
French (fr)
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WO2009052810A3 (en
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Babette Lanfer
Uwe Freudenberg
Ralf Zimmermann
Carsten Werner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leibniz Institut fuer Polymerforschung Dresden eV
Original Assignee
Leibniz Institut fuer Polymerforschung Dresden eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Leibniz Institut fuer Polymerforschung Dresden eV filed Critical Leibniz Institut fuer Polymerforschung Dresden eV
Publication of WO2009052810A2 publication Critical patent/WO2009052810A2/en
Publication of WO2009052810A3 publication Critical patent/WO2009052810A3/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the invention relates to collagen fibril matrices which are obtainable by a method for coating carriers with collagen fibril matrices of defined structure from flowing solutions, in which the size, shape and orientation of the resulting collagen fibrils and the coverage density of the carrier with collagen and the structure of the layers targeted by varying Parameters are controlled.
  • the invention is based in the field of biomaterials research, specifically the production of biological support materials as a scaffold for cell culture applications.
  • Collagen represents the quantitatively most abundant extracellular matrix fiber protein.
  • fibrillogenesis individual collagen molecules assemble into collagen fibrils. These collagen fibrils are usually heavily targeted in human and animal tissues. Examples include fiber bundles in muscle or tendon tissue.
  • the alignment of the fibrils fulfills special structural functions. For example, the load capacity of these tissues is significantly increased by the orientation.
  • the disadvantage of this method is, in particular, that the alignment of the collagen fibrils by use of the magnetic spheres results in significant changes in the properties of the collagen, whereby the resulting collagen gels are no longer in the native state. Thus, they are of limited use for cell experiments.
  • the aim of other methods is to directly generate collagen-oriented collagen structures, which systems can usually be defined as "collagen bands" in the form of a mononuclear layer with a layer thickness of about 3 nm over the substrate surface and a width of up to 20 nm et al., Journal of Structural Biology 148 (2004) 268-278 and Jiang et al., Microscopy Research and Technique 64 (2004) 435-440, alignment was accomplished in this approach by directionally pipetting collagen solution on a glow surface While the diameter of native collagen fibrils is 20 to 500 nm, the diameter range of the collagen bands thus obtained is only between 5 to 20 nm. On the other hand, for this method only surfaces of embers were used as surfaces.
  • the object underlying the invention is to provide collagen matrices for cell culture experiments in which cell-matrix interactions such as cell migration and adhesion can be investigated and a method for their production.
  • the method is intended to achieve the variation of the fibril shape, the density of the collagen fibrils on the substrate and the alignment of the fibrils, and in this way to adapt the collagen model surfaces to native conditions. Therefore, an essential part of the task is the targeted control of the morphology and orientation of the fibrils at the interface.
  • such model surfaces should be preparable on different carrier materials.
  • the object of the invention is to provide collagen fibril matrices obtainable from a process for coating carriers of collagen fibril matrices of defined structure from flowing solutions.
  • the group of parameters to be varied for control include:
  • the concentration of the solution the concentration of the solution
  • the collagen solution is conveyed by a pump through a microchannel, wherein the carrier to be coated forms the underside of the channel.
  • the fibrils of the collagen solution are aligned by the shearing action of the flowing liquid on the sample carrier.
  • the method according to the invention makes it possible to produce collagen fibril matrices that are controllable by setting defined parameters in their morphology.
  • the method is not limited only to the effect of aligning the collagen structures, but rather offers the possibility of producing different matrices in a collagen structure and by various parameters such as the shear conditions, the concentration / preparation of the solution and the substrate selection to control specifically.
  • the method according to the invention allows the targeted variation of the fibril form / morphology and thus offers the possibility of recreating native states by the generation of collagen model surfaces.
  • the methods mentioned in the prior art produce, inter alia, strongly artificial collagen matrices.
  • the "collagen band matrices" differ according to Jiang et al., Microscopy Research and Technique 64 (2004) 435-440, and those with magnetic spheres Guo and Kaufman's collagen matrices, Biomaterials 28 (2007) 1105-1114, are substantially different in structure and composition from native collagen fibril matrices.
  • Another advantage of the method according to the invention over the previously known methods is the significantly higher quality of the alignment. While the methods mentioned in the prior art achieve a coarse alignment of collagen gels, with the method according to the invention, individual fibrils can be specifically aligned on a preferably planar carrier.
  • the fibrillogenesis takes place in the flowing solution.
  • a cooled collagen solution is pumped from a reservoir through tempered tubes and heated at the same time. This leads to the beginning of the assembly process.
  • the collagen fibrils formed are then deposited by the defined overflow of the substrate surface in the microchannel and aligned at the same time.
  • the fibril size correlates with the fibrillation time and thus with the tube length and the flow rate in the system.
  • a prefibrated collagen solution is used.
  • the experimental setup is operated at constant temperature throughout the system. All other process parameters such as the shear rate and the dimensions of the channel are also constant. With this variant, matrices with very high orientation in the flow direction can be achieved.
  • the orientation of the collagen fibrils is controlled by the choice of flow rate.
  • the influencing of the occupation density is effected by the choice of the surface-active coating on the substrate.
  • the material for the surface-active coating is selected with regard to the hydrophobic or hydrophilic properties.
  • the substrate material used is glass.
  • a hydrophobic polymer thin film is used.
  • Poly (octadecene- ⁇ -maleic acid) (POMSA) is particularly suitable here.
  • the substrate material is provided with a surface-active coating in the form of a hydrophilic polymer thin film, preferably with poly (ethylene-aft-maleic acid) (PEMSA).
  • the resulting coverage density is influenced by the adjustment of the solution concentration.
  • solution concentrations for example, 0.2 mg / ml, 0.4 mg / ml or 0.8 mg / ml are used.
  • the collagen fibril matrices are applied by adsorption on preferably planar supports.
  • the occupation density is varied by the shear rate.
  • the orientation of the fibrils on the support can be varied while varying the fibril size by choosing different fibrillation times.
  • directed collagen fibrils are readjusted in vitro. These structures, as common extracellular matrix structures, are relevant to the study of cell-matrix interactions such as cell adhesion, proliferation, and differentiation.
  • FIG. 1 collagen matrices obtained from 0.8 mg / l of concentrated collagen solution at prefibrillation times of 5 min, 10 min and 30 min, FIG.
  • FIG. 2 collagen matrices obtained from 0.2 mg / ml, 0.4 mg / ml and 0.8 mg / ml concentrated collagen solution at a pre-fibrillation time of 5 minutes, FIG.
  • FIG. 3 collagen matrices obtained from prefibrillated collagen solution
  • FIG. 4 shows the influence of the substrate or of the surface-active coating on the occupation density on the basis of a diagram
  • Fig. 5 the alignment of collagen fibrils on various surface-active coatings.
  • the collagen fibril matrices according to the invention were obtained by two different process variants.
  • a cooled collagen solution is pumped out of the reservoir through tempered tubes and heated at the same time. This leads to the beginning of the assembly process.
  • the collagen fibrils formed are then deposited by the defined overflow of the substrate surface in the microchannel and aligned at the same time.
  • the fibril size correlates with the fibrillation time and thus with the tube length and the flow rate in the system. By increasing the collagen concentration, the density of collagen increases.
  • variant 2 an already fibrillated collagen solution is used.
  • the fibril solution is homogenized and centrifuged before use. This procedure ensures a uniform composition of the solution.
  • the experimental setup is operated at constant temperature throughout the system. All other process parameters such as the shear rate and the dimensions of the channel are also constant (see Table 1). With this variant, matrices with very high orientation in the flow direction can be achieved.
  • FIG. 1 shows images of collagen matrices produced with 0.8 mg / ml concentrated collagen solution according to Variant 1 initially cooled at 4 ° C. on a cleaned glass sample carrier with a hydrophobic polymer thin film poly (octadecene-aft-maleic acid) (POMSA) , The fibrils are formed during the flow in the tube, which was heated to 37 0 C.
  • the average residence time in the tube was two minutes in the experiments for the images in the first column (A) and 10 minutes in the experiments for the images in the second column (B); in the experiments to the figures of the third column (C) 30 min. This was followed by a one-hour flow through the canal.
  • FIG. 2 shows images of collagen matrices incubated with initially cooled at 4 ° C, (A) 0.2 mg / ml, (B) 0.4 mg / ml, (C) 0.8 mg / ml concentrated collagen solution
  • A 0.2 mg / ml
  • B 0.4 mg / ml
  • C 0.8 mg / ml concentrated collagen solution
  • POMSA hydrophobic polymer thin film poly
  • FIG. 3 contains images which show collagen matrices which were each produced with a collagen solution prefibrillated according to variant 2 on a cleaned glass sample carrier with a hydrophobic polymer thin film of poly (octadecene- ⁇ / f-maleic acid) (POMSA).
  • FIG. 4 shows a diagram showing the influence of the substrate or of the surface-active coating on the occupation density of collagen.
  • the following substrates were used in each case: cleaned glass sample carriers having a hydrophobic polymer thin film
  • FIG. 4 illustrates that as the hydrophobicity of the substrate surface increases, so does the resulting density of collagen.
  • Fig. 5 shows the respective orientation of collagen fibrils at the entrance, the center and the exit of the channel on the different surface active

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Abstract

The invention relates to collagen fibril matrices, which can be obtained by a method for coating carriers with collagen fibril matrices having a defined structure and morphology of flowing solutions. To this end, the structure and morphology are controlled by the variation of one or more different parameters, wherein the group of the parameters to be varied comprises - the substrate materials, - the surface-active coatings on the substrate materials, - the concentration of the solution, - the fibrillation time, and - the fluid dynamics conditions during the deposition process.

Description

Kollagenfibrillenmatrices Kollagenfibrillenmatrices

Die Erfindung betrifft Kollagenfibrillenmatrices, die durch ein Verfahren zur Beschichtung von Trägem mit Kollagenfibrillenmatrices definierter Struktur aus strömenden Lösungen erhältlich sind, bei dem die Größe, Form und Ausrichtung der resultierenden Kollagenfibrillen sowie die Bedeckungsdichte der Träger mit Kollagen und die Struktur der Schichten gezielt durch Variation verschiedener Parameter gesteuert werden.The invention relates to collagen fibril matrices which are obtainable by a method for coating carriers with collagen fibril matrices of defined structure from flowing solutions, in which the size, shape and orientation of the resulting collagen fibrils and the coverage density of the carrier with collagen and the structure of the layers targeted by varying Parameters are controlled.

Die Erfindung ist angesiedelt im Gebiet der Biomaterialforschung, speziell geht es dabei um die Herstellung von biologischen Trägermaterialien als Gerüst (Scaffold) für Zellkulturanwendungen.The invention is based in the field of biomaterials research, specifically the production of biological support materials as a scaffold for cell culture applications.

Kollagen stellt das mengenmäßig am häufigsten vorkommende Faserprotein der extrazellulären Matrix dar. In einem Selbstassemblierungsprozess, der so genannten Fibrillogenese, lagern sich einzelne Kollagenmoleküle zu Kollagenfibrillen zusammen. Diese Kollagenfibrillen liegen in menschlichen und tierischen Geweben meist stark gerichtet vor. Beispielhaft sind Faserbündel in Muskel- bzw. Sehnengewebe zu nennen. Hierbei erfüllt die Ausrichtung der Fibrillen spezielle strukturelle Funktionen. So wird beispielsweise die Belastungsfähigkeit dieser Gewebe durch die Ausrichtung signifikant erhöht.Collagen represents the quantitatively most abundant extracellular matrix fiber protein. In a self-assembly process known as fibrillogenesis, individual collagen molecules assemble into collagen fibrils. These collagen fibrils are usually heavily targeted in human and animal tissues. Examples include fiber bundles in muscle or tendon tissue. The alignment of the fibrils fulfills special structural functions. For example, the load capacity of these tissues is significantly increased by the orientation.

Der Selbstassemblierungsprozess in vitro führt jedoch zu Fibrillensystemen, den so genannten Fibrillenmatrices, die eine willkürliche Anordnung der einzelnen Fibrillen aufweisen. Aus diesen Gründen können derartige Systeme nur begrenzt körperrelevante Funktionen nachbilden.However, the in-vitro self-assembly process leads to fibril systems, the so-called fibril matrices, which have an arbitrary arrangement of individual fibrils. For these reasons, such systems can only emulate body-relevant functions to a limited extent.

Im Stand der Technik sind mehrere Verfahren zur Ausrichtung von Kollagenfibrillen bekannt. Bei Guo und Kaufman, Biomaterials 28 (2007)Several methods for aligning collagen fibrils are known in the art. Guo and Kaufman, Biomaterials 28 (2007)

1105-1114, wurde gezeigt, dass mit Streptavidin/Amin/Carboxyl-beschichtete Magnetkugeln in einer gelierenden Kollagenlösung bei gleichzeitigem Einsatz eines externen Magneten eine parallele Orientierung der sich bildenden Kollagenfibrillen zur Folge hat. Diese Technik erfordert nur eine Kollagenlösung, Oberflächen-geänderte Magnetperlen, einen kleinen Magneten und einen Inkubator. Die Kollagengele werden mit Konfokalreflektionsmikroskopie abgebildet, wobei die Ausrichtungsstufe der Kollagenfibrillen unter Benutzung von Bildanalysetechniken quantitativ bestimmt wird, die die Bestimmung der Faserposition und der Winkelverteilung erlauben. Zahlreiche Experimente zeigen, dass mit Streptavidin bedeckte Magnetperlen zu den am meisten ausgerichteten Gelen führen. Der Nachteil dieser Methode besteht jedoch insbesondere darin, dass die Ausrichtung der Kollagenfibrillen durch Einsatz der Magnetkugeln signifikante Eigenschaftsänderungen des Kollagens zur Folge hat, wodurch die resultierenden Kollagengele nicht länger im nativen Zustand sind. Somit sind sie für Zellexperimente nur bedingt einsetzbar.1105-1114, was shown to be streptavidin / amine / carboxyl coated Magnetic balls in a gelling collagen solution with simultaneous use of an external magnet has a parallel orientation of the forming collagen fibrils result. This technique only requires a collagen solution, surface-modified magnetic beads, a small magnet and an incubator. The collagen gels are imaged with confocal reflection microscopy, wherein the alignment level of the collagen fibrils is quantified using image analysis techniques that allow determination of fiber position and angular distribution. Numerous experiments show that streptavidin-coated magnetic beads lead to the most aligned gels. However, the disadvantage of this method is, in particular, that the alignment of the collagen fibrils by use of the magnetic spheres results in significant changes in the properties of the collagen, whereby the resulting collagen gels are no longer in the native state. Thus, they are of limited use for cell experiments.

Andere Verfahren haben zum Ziel, parallel orientierte Kollagenstrukturen direkt zu erzeugen, wobei diese Systeme meist als „Kollagenbänder" in Form einer mononuklearen Schicht mit einer Schichtdicke von etwa 3 nm über der Substratfläche und einer Breite von bis zu 20 nm definiert werden können. Gemäß Jiang et al., Journal of Structural Biology 148 (2004) 268-278 und Jiang et al., Microscopy Research and Technique 64 (2004) 435-440, erfolgte die Ausrichtung bei diesem Ansatz durch gerichtetes Pipettieren von Kollagenlösung auf einer Glimmoberfläche. Wesentliche nachteilige Einschränkungen dieses Ansatzes bestehen einerseits in der Fibrillenform und -große. Während der Durchmesser nativer Kollagenfibrillen 20 bis 500 nm beträgt, liegt der Bereich des Durchmessers der so erhaltenen Kollagenbänder nur zwischen 5 bis 20 nm. Andererseits wurden für diese Methode als Oberflächen ausschließlich Glimmoberflächen eingesetzt. Der Einsatz von Fluidsystemen ist Gegenstand der Publikation von Lee et al. Biomed Microdevices 8 (2006), 35-41, die eine Methode zum Ausrichten von Kollagengelen offenbart. Durch kurzes Einströmen einer noch nicht fibrillierten, gekühlten Kollagenlösung in einen Mikroflusskanal und anschließendes Ruhen der Lösung bei Raumtemperatur wurden Kollagenmatrices erzeugt, bei denen die Mehrzahl der Fibrillen in Flussrichtung ausgerichtet ist. Die Qualität der Ausrichtung dieser Matrices ist bei dieser Methode jedoch noch unbefriedigend. Darüber hinaus ist die Anwendung der Methode lediglich auf Kanäle mit geringer Breite, das heißt maximal 30 μm beschränkt. Aufgrund dieser geringen Breite, die im Größenbereich des durchschnittlichen Zelldurchmessers (10 bis 30 μm) liegt, ist diese Methode für die Erzeugung von viel größeren, für die Zellkultur notwendigen Flächen nicht anwendbar.The aim of other methods is to directly generate collagen-oriented collagen structures, which systems can usually be defined as "collagen bands" in the form of a mononuclear layer with a layer thickness of about 3 nm over the substrate surface and a width of up to 20 nm et al., Journal of Structural Biology 148 (2004) 268-278 and Jiang et al., Microscopy Research and Technique 64 (2004) 435-440, alignment was accomplished in this approach by directionally pipetting collagen solution on a glow surface While the diameter of native collagen fibrils is 20 to 500 nm, the diameter range of the collagen bands thus obtained is only between 5 to 20 nm. On the other hand, for this method only surfaces of embers were used as surfaces. The use of fluid systems is the subject of the publication by Lee et al. Biomed Microdevices 8 (2006), 35-41, which discloses a method for aligning collagen gels. By brief inflow of a not yet fibrillated, cooled collagen solution into a microfluidic channel and subsequent resting of the solution at room temperature, collagen matrices were generated in which the majority of the fibrils are oriented in the direction of flow. However, the quality of alignment of these matrices is still unsatisfactory with this method. In addition, the application of the method is limited only to channels with a small width, that is a maximum of 30 microns. Because of this small width, which is in the size range of the average cell diameter (10 to 30 microns), this method is not applicable for the production of much larger surfaces necessary for cell culture.

Daher besteht die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe in der Bereitstellung von Kollagenmatrices für Zellkulturexperimente, in denen ZeII- Matrix-Interaktionen wie die Zellmigration und -adhäsion erforscht werden können und einem Verfahren zu deren Erzeugung. Durch das Verfahren soll die Variation der Fibrillenform, die Belegungsdichte der Kollagenfibrillen auf dem Substrat und der Ausrichtung der Fibrillen erreicht werden und die Kollagenmodelloberflächen auf diese Weise gezielt an native Gegebenheiten angepasst werden. Ein wesentlicher Teil der Aufgabe besteht demnach in der gezielten Steuerung der Morphologie und Ausrichtung der Fibrillen an der Grenzfläche. Darüber hinaus sollen derartige Modelloberflächen auf verschiedenen Trägermaterialien präparierbar sein.Therefore, the object underlying the invention is to provide collagen matrices for cell culture experiments in which cell-matrix interactions such as cell migration and adhesion can be investigated and a method for their production. The method is intended to achieve the variation of the fibril shape, the density of the collagen fibrils on the substrate and the alignment of the fibrils, and in this way to adapt the collagen model surfaces to native conditions. Therefore, an essential part of the task is the targeted control of the morphology and orientation of the fibrils at the interface. In addition, such model surfaces should be preparable on different carrier materials.

Die Lösung der Aufgabe der Erfindung besteht in Kollagenfibrillenmatrices, die aus einem Verfahren zur Beschichtung von Trägern mit Kollagenfibrillenmatrices definierter Struktur aus strömenden Lösungen erhältlich sind. Erfindungsgemäß werden die Größe, Form und Ausrichtung der resultierenden Kollagenfibrillen sowie die Bedeckungsdichte der Träger mit Kollagen und die Struktur der Schichten gezielt durch die Variation von einem oder mehreren verschiedenen Parametern gesteuert. Zu der Gruppe der zu variierenden Parameter zur Steuerung zählen:The object of the invention is to provide collagen fibril matrices obtainable from a process for coating carriers of collagen fibril matrices of defined structure from flowing solutions. According to the invention, the size, shape and orientation of the resulting collagen fibrils and the coverage density of the carrier with collagen and the structure of the layers targeted by the variation of a or several different parameters controlled. The group of parameters to be varied for control include:

- die Substratmaterialien,- the substrate materials,

- die oberflächenaktiven Beschichtungen auf den Substratmaterialien, - die Konzentration der Lösung,the surface-active coatings on the substrate materials, the concentration of the solution,

- die Fibrillierzeit und- the fibrillation time and

- die fluiddynamischen Randbedingungen im Abscheideprozess.- the fluid dynamic boundary conditions in the deposition process.

Mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die in vitro Abscheidung von Kollagenfibrillen auf verschiedenen Materialgrenzflächen möglich.By means of the method according to the invention, the in vitro deposition of collagen fibrils on different material interfaces is possible.

Vorzugsweise wird die Kollagenlösung mittels einer Pumpe durch einen Mikrokanal gefördert, wobei der zu beschichtende Träger die Unterseite des Kanals bildet. Die Fibrillen der Kollagenlösung werden durch die Scherwirkung der strömenden Flüssigkeit auf dem Probenträger ausgerichtet.Preferably, the collagen solution is conveyed by a pump through a microchannel, wherein the carrier to be coated forms the underside of the channel. The fibrils of the collagen solution are aligned by the shearing action of the flowing liquid on the sample carrier.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von Kollagenfibrillenmatrices, die durch das Einstellen von definierten Parametern in ihrer Morphologie kontrollierbar sind. Nach der Konzeption der Erfindung ist das Verfahren nicht allein auf den Effekt des Ausrichtens der Kollagenstrukturen beschränkt, sondern bietet vielmehr die Möglichkeit, in einer Kollagenstruktur verschiedene Matrices zu erzeugen und durch verschiedene Parameter, wie die Scherbedingungen, die Konzentration/Präparation der Lösung und die Substratauswahl, gezielt zu kontrollieren.The method according to the invention makes it possible to produce collagen fibril matrices that are controllable by setting defined parameters in their morphology. According to the concept of the invention, the method is not limited only to the effect of aligning the collagen structures, but rather offers the possibility of producing different matrices in a collagen structure and by various parameters such as the shear conditions, the concentration / preparation of the solution and the substrate selection to control specifically.

Die erfindungsgemäße Methode erlaubt die gezielte Variation der Fibrillenform/Morphologie und bietet damit die Möglichkeit, native Zustände durch die Erzeugung von Kollagenmodelloberflächen nachzustellen. Die im Stand der Technik erwähnten Methoden erzeugen im Gegensatz dazu unter anderem dazu stark artifizielle Kollagenmatrices. So unterscheiden sich die „Kollagenbändermatrices" nach Jiang et al., Microscopy Research and Technique 64 (2004) 435-440, und die mit Magnetkugeln versetzten Kollagenmatrices nach Guo und Kauf man, Biomaterials 28 (2007) 1105- 1114, hinsichtlich ihrer Struktur und Zusammensetzung erheblich von nativen Kollagenfibrillenmatrices. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bisher bekannten Verfahren besteht in der signifikant höheren Qualität der Ausrichtung. Während die im Stand der Technik erwähnten Methoden eine grobe Ausrichtung von Kollagengelen erzielen, lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren einzelne Fibrillen gezielt auf einem vorzugsweise planaren Träger ausrichten.The method according to the invention allows the targeted variation of the fibril form / morphology and thus offers the possibility of recreating native states by the generation of collagen model surfaces. In contrast, the methods mentioned in the prior art produce, inter alia, strongly artificial collagen matrices. Thus, the "collagen band matrices" differ according to Jiang et al., Microscopy Research and Technique 64 (2004) 435-440, and those with magnetic spheres Guo and Kaufman's collagen matrices, Biomaterials 28 (2007) 1105-1114, are substantially different in structure and composition from native collagen fibril matrices. Another advantage of the method according to the invention over the previously known methods is the significantly higher quality of the alignment. While the methods mentioned in the prior art achieve a coarse alignment of collagen gels, with the method according to the invention, individual fibrils can be specifically aligned on a preferably planar carrier.

In einer ersten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die Fibrillogenese in der strömenden Lösung statt. Dazu wird vorzugsweise eine gekühlte Kollagenlösung aus einem Vorratsbehälter durch temperierte Schläuche gepumpt und gleichzeitig erwärmt. Dadurch kommt es zum Beginn des Assemblierungsprozesses. In einer vorteilhaften Ausführung beträgt die Temperatur der zunächst gekühlten Kollagenlösung 4 0C, während die Schläuche auf 37 °C temperiert werden. Die gebildeten Kollagenfibrillen werden im Anschluss durch das definierte Überströmen der Substratoberfläche im Mikrokanal abgeschieden und gleichzeitig ausgerichtet. Die Fibrillengröße korreliert mit der Fibrillierzeit und somit mit der Schlauchlänge und der Flussrate im System. Durch die Erhöhung der Kollagenkonzentration nimmt die Belegungsdichte an Kollagen zu.In a first variant of the method according to the invention, the fibrillogenesis takes place in the flowing solution. For this purpose, preferably a cooled collagen solution is pumped from a reservoir through tempered tubes and heated at the same time. This leads to the beginning of the assembly process. In an advantageous embodiment, the temperature of the initially cooled collagen solution 4 0 C, while the tubes are heated to 37 ° C. The collagen fibrils formed are then deposited by the defined overflow of the substrate surface in the microchannel and aligned at the same time. The fibril size correlates with the fibrillation time and thus with the tube length and the flow rate in the system. By increasing the collagen concentration, the density of collagen increases.

In einer zweiten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine vorfibri liierte Kollagenlösung eingesetzt. Die Fibrillenlösung wird vor der Anwendung homogenisiert und zentrifugiert. Vorzugsweise wird sechs Minuten lang bei 1000 g (g = mittlere Erdbeschleunigung) zentrifugiert. Durch diese Prozedur wird eine gleichmäßige Zusammensetzung der Lösung gewährleistet. Abweichend zu der oben genannten ersten Variante wird der Versuchsaufbau bei konstanter Temperatur im gesamten System betrieben. Alle anderen Verfahrensparameter wie die Scherrate und die Abmessungen des Kanals sind ebenfalls konstant. Mit dieser Variante können Matrices mit sehr hoher Orientierung in Flussrichtung erzielt werden.In a second variant of the method according to the invention, a prefibrated collagen solution is used. The fibril solution is homogenized and centrifuged before use. Preferably, it is centrifuged for six minutes at 1000 g (g = mean gravitational acceleration). This procedure ensures a uniform composition of the solution. Unlike the first variant mentioned above, the experimental setup is operated at constant temperature throughout the system. All other process parameters such as the shear rate and the dimensions of the channel are also constant. With this variant, matrices with very high orientation in the flow direction can be achieved.

Vorteilhafterweise wird die Ausrichtung der Kollagenfibrillen durch die Wahl der Flussrate gesteuert.Advantageously, the orientation of the collagen fibrils is controlled by the choice of flow rate.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Beeinflussung der Belegungsdichte durch die Wahl der oberflächenaktiven Beschichtυng auf dem Substrat. Vorzugsweise wird dabei das Material für die oberflächenaktive Beschichtung mit Blick auf die hydrophoben bzw. hydrophilen Eigenschaften ausgewählt. Die Möglichkeit, die Belegungsdichte mit Kollagen durch die Wahl des Substrats bzw. die oberflächenaktive Beschichtung zu steuern, bietet einen weiteren Vorteil gegenüber den bisherigen Verfahren, die mitunter ausschließlich auf ein Substrat limitiert sind, wie zum Beispiel - gemäß Jϊang et al., Microscopy Research and Technique 64 (2004) 435-440 - auf Glimmer.In a preferred embodiment of the invention, the influencing of the occupation density is effected by the choice of the surface-active coating on the substrate. Preferably, the material for the surface-active coating is selected with regard to the hydrophobic or hydrophilic properties. The possibility of controlling the occupation density with collagen by the choice of the substrate or the surface-active coating offers a further advantage over the previous methods, which are sometimes limited exclusively to a substrate, such as - according to Jϊang et al., Microscopy Research and Technique 64 (2004) 435-440 - on mica.

Vorzugsweise wird als Substratmaterial Glas verwendet. Als oberflächenaktive Beschichtung des Substratmaterials wird in einer Ausgestaltung der Erfindung ein hydrophober Polymerdünnfilm eingesetzt. Hierbei eignet sich insbesondere Poly(octadecen-a#-maleinsäure) (POMSA). In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird das Substratmaterial mit einer oberflächenaktiven Beschichtung in Form eines hydrophilen Polymerdünnfilms versehen, vorzugsweise mit Poly(ethylen-aft-maleinsäure) (PEMSA).Preferably, the substrate material used is glass. As a surface-active coating of the substrate material, in one embodiment of the invention, a hydrophobic polymer thin film is used. Poly (octadecene-α-maleic acid) (POMSA) is particularly suitable here. In another embodiment of the invention, the substrate material is provided with a surface-active coating in the form of a hydrophilic polymer thin film, preferably with poly (ethylene-aft-maleic acid) (PEMSA).

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird die resultierende Belegungsdichte durch die Einstellung der Lösungskonzentration beeinflusst. Als mögliche unterschiedliche Lösungskonzentrationen werden zum Beispiel 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml oder 0,8 mg/ml verwendet.In a further embodiment of the invention, the resulting coverage density is influenced by the adjustment of the solution concentration. As possible different solution concentrations, for example, 0.2 mg / ml, 0.4 mg / ml or 0.8 mg / ml are used.

Der Kollagenfibrillenmatrices werden durch die Adsorption auf vorzugsweise planare Träger aufgebracht. In einer weiteren Ausführung der Erfindung wird durch die Scherrate die Belegungsdichte variiert. Außerdem kann durch die Wahl unterschiedlicher Scherraten die Ausrichtung der Fibrillen auf dem Träger variiert werden, während die Fibrillengröße durch die Wahl unterschiedlicher Fibrillierzeiten variiert wird.The collagen fibril matrices are applied by adsorption on preferably planar supports. In a further embodiment of the invention, the occupation density is varied by the shear rate. In addition, by choosing different shear rates, the orientation of the fibrils on the support can be varied while varying the fibril size by choosing different fibrillation times.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, einschließlich der oben beschriebenen Ausführungen, werden gerichtete Kollagenfibrillen in vitro nachgestellt. Diese Strukturen sind, als häufig vorkommende Strukturen der extrazellulären Matrix, für die Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen wie Zelladhäsion, - proliferation und -differenzierung relevant.With the method according to the invention, including the embodiments described above, directed collagen fibrils are readjusted in vitro. These structures, as common extracellular matrix structures, are relevant to the study of cell-matrix interactions such as cell adhesion, proliferation, and differentiation.

Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezugnahme auf die zugehörigen Zeichnungen. Es zeigen:Further details, features and advantages of the invention will become apparent from the following description of exemplary embodiments with reference to the accompanying drawings. Show it:

Fig. 1 : aus 0,8 mg/l konzentrierter Kollagenlösung erhaltene Kollagenmatrices bei Vorfibrillierzeiten von 5 min, 10 min und 30 min,FIG. 1: collagen matrices obtained from 0.8 mg / l of concentrated collagen solution at prefibrillation times of 5 min, 10 min and 30 min, FIG.

Fig. 2: aus 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml und 0,8 mg/ml konzentrierter Kollagenlösung erhaltene Kollagenmatrices bei einer Vorfibrillierzeit von 5 min,FIG. 2: collagen matrices obtained from 0.2 mg / ml, 0.4 mg / ml and 0.8 mg / ml concentrated collagen solution at a pre-fibrillation time of 5 minutes, FIG.

Fig. 3: aus vorfibrillierter Kollagenlösung erhaltene Kollagenmatrices,FIG. 3: collagen matrices obtained from prefibrillated collagen solution, FIG.

Fig. 4: den Einfluss des Substrats beziehungsweise der oberflächenaktiven Beschichtung auf die Belegungsdichte anhand eines Diagramms und4 shows the influence of the substrate or of the surface-active coating on the occupation density on the basis of a diagram and FIG

Fig. 5: die Ausrichtung von Kollagenfibrillen auf verschiedenen oberflächenaktiven Beschichtungen. Die erfindungsgemäßen Kollagenfibrillenmatrices wurden nach zwei verschiedenen Verfahrensvarianten erhalten.Fig. 5: the alignment of collagen fibrils on various surface-active coatings. The collagen fibril matrices according to the invention were obtained by two different process variants.

Variante 1 :Version 1 :

Eine gekühlte Kollagenlösung wird aus dem Vorratsbehälter durch temperierte Schläuche gepumpt und gleichzeitig erwärmt. Dadurch kommt es zum Beginn des Assemblierungsprozesses. Die gebildeten Kollagenfibrillen werden im Anschluss durch das definierte Überströmen der Substratoberfläche im Mikrokanal abgeschieden und gleichzeitig ausgerichtet. Die Fibrillengröße korreliert mit der Fibrillierzeit und somit mit der Schlauchlänge und der Flussrate im System. Durch die Erhöhung der Kollagenkonzentration nimmt die Belegungsdichte an Kollagen zu.A cooled collagen solution is pumped out of the reservoir through tempered tubes and heated at the same time. This leads to the beginning of the assembly process. The collagen fibrils formed are then deposited by the defined overflow of the substrate surface in the microchannel and aligned at the same time. The fibril size correlates with the fibrillation time and thus with the tube length and the flow rate in the system. By increasing the collagen concentration, the density of collagen increases.

Variante 2:Variant 2:

Für Variante 2 kommt eine bereits ausfibrillierte Kollagenlösung zur Anwendung. Die Fibrillenlösung wird vor der Anwendung homogenisiert und zentrifugiert. Durch diese Prozedur wird eine gleichmäßige Zusammensetzung der Lösung gewährleistet. Abweichend zu Variante 1 wird der Versuchsaufbau bei konstanter Temperatur im gesamten System betrieben. Alle anderen Verfahrensparameter wie die Scherrate und die Abmessungen des Kanals sind dabei ebenfalls konstant (siehe Tabelle 1). Mit dieser Variante können Matrices mit sehr hoher Orientierung in Flussrichtung erzielt werden. For variant 2, an already fibrillated collagen solution is used. The fibril solution is homogenized and centrifuged before use. This procedure ensures a uniform composition of the solution. Unlike variant 1, the experimental setup is operated at constant temperature throughout the system. All other process parameters such as the shear rate and the dimensions of the channel are also constant (see Table 1). With this variant, matrices with very high orientation in the flow direction can be achieved.

Alle Kollagenmatrices wurden unter den Bedingungen nach Tabelle 1 erzeugt:All collagen matrices were generated under the conditions of Table 1:

Tabelle 1 : Parameter für die Erzeugung von KollagenmatricesTable 1: Parameters for the generation of collagen matrices

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Figure imgf000011_0001

Die Fig. 1 zeigt Abbildungen von Kollagenmatrices, die mit anfangs bei 4 °C gekühlter, 0,8 mg/ml konzentrierter Kollagenlösung nach Variante 1 auf einem gereinigten Glasprobenträger mit einem hydrophoben Polymerdünnfilm Poly(octadecen-aft-maleinsäure) (POMSA) erzeugt wurden. Die Fibrillen entstehen während des Strömens im Schlauch, der auf 37 0C temperiert wurde. Die mittlere Verweildauer im Schlauch betrug bei den Versuchen zu den Abbildungen der ersten Spalte (A) zwei Minuten, bei den Versuchen zu den Abbildungen der zweiten Spalte (B) 10 min; bei den Versuchen zu den Abbildungen der dritten Spalte (C) 30 min. Im Anschluss daran erfolgte ein einstündiges Durchströmen des Kanals. Die Fig. 2 zeigt Abbildungen von Kollagenmatrices, die mit anfangs bei 4 °C gekühlter, (A) 0,2 mg/ml, (B) 0,4 mg/ml, (C) 0,8 mg/ml konzentrierter Kollagenlösung nach 5 min Vorströmen nach Variante 1 auf einem gereinigten Glasprobenträger mit einem hydrophoben Polymerdünnfilm Poly(octadecen-aft- maleinsäure) (POMSA) erzeugt wurden. Die Fibrillen entstehen während des Strömens im Schlauch, der auf 37 0C temperiert wurde.FIG. 1 shows images of collagen matrices produced with 0.8 mg / ml concentrated collagen solution according to Variant 1 initially cooled at 4 ° C. on a cleaned glass sample carrier with a hydrophobic polymer thin film poly (octadecene-aft-maleic acid) (POMSA) , The fibrils are formed during the flow in the tube, which was heated to 37 0 C. The average residence time in the tube was two minutes in the experiments for the images in the first column (A) and 10 minutes in the experiments for the images in the second column (B); in the experiments to the figures of the third column (C) 30 min. This was followed by a one-hour flow through the canal. Fig. 2 shows images of collagen matrices incubated with initially cooled at 4 ° C, (A) 0.2 mg / ml, (B) 0.4 mg / ml, (C) 0.8 mg / ml concentrated collagen solution For 5 min pre-flow according to variant 1 on a cleaned glass sample carrier with a hydrophobic polymer thin film poly (octadecene-aft-maleic acid) (POMSA) were generated. The fibrils are formed during the flow in the tube, which was heated to 37 0 C.

Die Fig. 3 beinhaltet Abbildungen, die Kollagenmatrices zeigen, welche jeweils mit einer nach Variante 2 vorfibrillierten Kollagenlösung auf einem gereinigten Glasprobenträger mit einem hydrophoben Polymerdünnfilm Poly(octadecen-a/f- maleinsäure) (POMSA) erzeugt wurden. Die vorfibrillierte Kollagenlösung wurde homogenisiert und für 6 Minuten bei 1000 g (g = mittlere Erdbeschleunigung) zentrifugiert. Die Abbildungen wurden entlang der Mittelachse des beschichteten Trägers aufgenommen.FIG. 3 contains images which show collagen matrices which were each produced with a collagen solution prefibrillated according to variant 2 on a cleaned glass sample carrier with a hydrophobic polymer thin film of poly (octadecene-α / f-maleic acid) (POMSA). The prefibrillated collagen solution was homogenized and centrifuged for 6 minutes at 1000 g (g = mean gravitational acceleration). The images were taken along the central axis of the coated backing.

Die Fig. 4 zeigt ein Diagramm, aus dem der Einfluss des Substrats beziehungsweise der oberflächenaktiven Beschichtung auf die Belegungsdichte an Kollagen hervorgeht. Als unterschiedliche Substrate wurden jeweils verwendet: - gereinigte Glasprobenträger mit einem hydrophoben PolymerdünnfilmFIG. 4 shows a diagram showing the influence of the substrate or of the surface-active coating on the occupation density of collagen. The following substrates were used in each case: cleaned glass sample carriers having a hydrophobic polymer thin film

Poly(octadecen-aft-maleinsäure) (POMSA),Poly (octadecene-aft-maleic acid) (POMSA),

- gereinigte Glasprobenträger mit einem hydrophilen Polymerdünnfilm Poly(ethylen-a/f-maleinsäure) (PEMSA) und- cleaned glass sample carrier with a hydrophilic polymer thin film poly (ethylene-a / f-maleic acid) (PEMSA) and

- Glas.- Glass.

Die Fig. 4 verdeutlicht, dass mit der Erhöhung der Hydrophobizität der Substratoberfläche auch die resultierende Belegungsdichte an Kollagen steigt.FIG. 4 illustrates that as the hydrophobicity of the substrate surface increases, so does the resulting density of collagen.

Die Fig. 5 zeigt die jeweilige Ausrichtung von Kollagenfibrillen am Eingang, der Mitte und dem Ausgang des Kanals auf den verschiedenen oberflächenaktivenFig. 5 shows the respective orientation of collagen fibrils at the entrance, the center and the exit of the channel on the different surface active

Beschichtungen Poly(octadecen-a/f-maleinsäure) (POMSA), Poly(ethylen-a#- maleinsäure) (PEMSA) und Glas nach einem Verfahren nach Variante 2. Dabei entspricht die Ausrichtung mit dem Betrag 0° der Flussrichtung parallel zu den Kanalwänden. Coatings Poly (octadecene-a / f-maleic acid) (POMSA), poly (ethylene-a # - maleic acid) (PEMSA) and glass according to a method according to variant 2. The alignment with the amount 0 ° corresponds to the flow direction parallel to the channel walls.

Claims

PATENTANSPRÜCHE 1. Kollagenfibrillenmatrices, erhältlich durch ein Verfahren zur Beschichtung von Trägern mit Kollagenfibrillenmatrices definierter Struktur und Morphologie aus strömenden Lösungen, wobei die Steuerung von Struktur und Morphologie durch die Variation von einem oder mehreren verschiedenen Parametern erfolgt, wobei die Gruppe der zu variierenden Parameter o die Substratmaterialien, o die oberflächenaktiven Beschichtungen auf den Substratmaterialien, o die Konzentration der Lösung, o die Fibrillierzeit und o die fluiddynamischen Randbedingungen im Abscheideprozess umfasst.1. Collagen fibril matrices obtainable by a method of coating carriers of collagen fibril matrices of defined structure and morphology from flowing solutions, the control of structure and morphology being effected by the variation of one or more different parameters, the group of parameters to be varied being the substrate materials , o the surface-active coatings on the substrate materials, o the concentration of the solution, o the fibrillation time and o the fluid-dynamic boundary conditions in the deposition process. 2. Kollagenfibrillenmatrices nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kollagenlösung durch einen Mikrokanal bewegt wird, wobei der zu beschichtende Träger die Unterseite des Kanals bildet und dass die Fibrillen der Kollagenlösung durch die Scherwirkung der strömenden Flüssigkeit auf dem Probenträger ausgerichtet werden.2. Kollagenfibrillenmatrices according to claim 1, characterized in that the collagen solution is moved through a microchannel, wherein the carrier to be coated forms the underside of the channel and that the fibrils of the collagen solution are aligned by the shearing action of the flowing liquid on the sample carrier. 3. Kollagenfibrillenmatrices nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein planarer Träger verwendet wird.3. Kollagenfibrillenmatrices according to claim 1 or 2, characterized in that a planar carrier is used. 4. Kollagenfibrillenmatrices nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Substratmaterial Glas verwendet wird. 4. Kollagenfibrillenmatrices according to one of claims 1 to 3, characterized in that glass is used as the substrate material. 5. Kollagenfibrillenmatrices nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als oberflächenaktive Beschichtung des Substratmaterials ein hydrophober Polymerdünnfilm eingesetzt wird.5. Kollagenfibrillenmatrices according to one of claims 1 to 4, characterized in that a hydrophobic polymer thin film is used as the surface-active coating of the substrate material. 6. Kollagenfibrillenmatrices nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als hydrophober Polymerdünnfilm Poly(octadecen-a#-maleinsäure) (POMSA) verwendet wird.6. Kollagenfibrillenmatrices according to claim 5, characterized in that is used as the hydrophobic polymer thin film poly (octadecen-a # -maleic acid) (POMSA). 7. Kollagenfibrillenmatrices nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als oberflächenaktive Beschichtung des Substratmaterials ein hydrophiler Polymerdünnfilm eingesetzt wird.7. Kollagenfibrillenmatrices according to one of claims 1 to 4, characterized in that a hydrophilic polymer thin film is used as the surface-active coating of the substrate material. 8. Kollagenfibrillenmatrices nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als hydrophiler Polymerdünnfilm Poly(ethylen-a/f-maleinsäure) (PEMSA) verwendet wird.8. Kollagenfibrillenmatrices according to claim 7, characterized in that is used as the hydrophilic polymer thin film poly (ethylene-a / f-maleic acid) (PEMSA). 9. Kollagenfibrillenmatrices nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Fibrillogenese in der strömenden Lösung stattfindet.9. Kollagenfibrillenmatrices according to one of claims 1 to 8, characterized in that the fibrillogenesis takes place in the flowing solution. 10. Kollagenfibrillenmatrices nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass gekühlte Kollagenlösung aus einem Vorratsbehälter durch temperierte Schläuche gepumpt und gleichzeitig erwärmt wird.10. Kollagenfibrillenmatrices according to claim 9, characterized in that cooled collagen solution is pumped from a reservoir through tempered tubes and heated at the same time. 11. Kollagenfibrillenmatrices nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur der gekühlten Kollagenlösung 4 °C beträgt und die Schläuche auf 37 O temperiert werden. 11. Kollagenfibrillenmatrices according to claim 10, characterized in that the temperature of the cooled collagen solution is 4 ° C and the tubes are tempered to 37 O. 12. Kollagenfibrillenmatrices nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine vorfibrillierte Kollagenlösung eingesetzt wird.12. Kollagenfibrillenmatrices according to any one of claims 1 to 8, characterized in that a prefibrillated collagen solution is used. 13. Kollagenfibrillenmatrices nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die vorfibrillierte Kollagenlösung vor der Anwendung homogenisiert und zentrifugiert wird.13. Kollagenfibrillenmatrices according to claim 12, characterized in that the prefibrillated collagen solution is homogenized and centrifuged before use. 14. Kollagenfibrillenmatrices nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass im gesamten System die Temperatur konstant gehalten wird.14. Kollagenfibrillenmatrices according to claim 12 or 13, characterized in that the temperature is kept constant throughout the system. 15. Kollagenfibrillenmatrices nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Belegungsdichte durch die Scherrate variiert wird.15. Kollagenfibrillenmatrices according to one of claims 1 to 14, characterized in that the occupation density is varied by the shear rate. 16. Kollagenfibrillenmatrices nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Belegungsdichte durch die Lösungskonzentration variiert wird.16. Kollagenfibrillenmatrices according to one of claims 1 to 14, characterized in that the occupation density is varied by the solution concentration. 17. Kollagenfibrillenmatrices nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils als unterschiedliche Lösungskonzentrationen (A) 0,2 mg/ml, (B) 0,4 mg/ml und (C) 0,8 mg/ml angewendet werden.17. Kollagenfibrillenmatrices according to claim 16, characterized in that in each case as different solution concentrations (A) 0.2 mg / ml, (B) 0.4 mg / ml and (C) 0.8 mg / ml are applied. 18. Kollagenfibrillenmatrices nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Fibrillengröße durch die Fibrillierzeit variiert wird.18. Kollagenfibrillenmatrices according to one of claims 1 to 17, characterized in that the Fibrillengröße is varied by the Fibrillierzeit. 19. Kollagenfibrillenmatrices nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausrichtung durch die Scherrate variiert wird. 19. Kollagenfibrillenmatrices according to one of claims 1 to 18, characterized in that the orientation is varied by the shear rate.
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