[go: up one dir, main page]

WO2008123793A1 - Procédé pour tester la qualité d'une culture de cellules - Google Patents

Procédé pour tester la qualité d'une culture de cellules Download PDF

Info

Publication number
WO2008123793A1
WO2008123793A1 PCT/RU2007/000571 RU2007000571W WO2008123793A1 WO 2008123793 A1 WO2008123793 A1 WO 2008123793A1 RU 2007000571 W RU2007000571 W RU 2007000571W WO 2008123793 A1 WO2008123793 A1 WO 2008123793A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
cell culture
mass
fragments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2007/000571
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Petr Genrievich Lokhov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of WO2008123793A1 publication Critical patent/WO2008123793A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Definitions

  • the invention relates to the field of cellular technologies, namely to the analysis of cultured ip vitro cells and can be used in biotechnology, cosmetology, medicine (cell transplantology) to obtain the characterized cellular material with therapeutic or cosmetic properties.
  • biotechnology namely to the analysis of cultured ip vitro cells and can be used in biotechnology, cosmetology, medicine (cell transplantology) to obtain the characterized cellular material with therapeutic or cosmetic properties.
  • cosmetology cell transplantology
  • ip Steep GS, Vaserga A., Giordapo A., Dephardt D.T. (eds.). “The Molesular Basis of CeIl Susl apd Grövth Soptrol”, Wileu-Liss, New Yörk, 1999, pp.
  • in vitro cells are susceptible to morphofunctional degeneration leading to their death.
  • the existing in vitro destabilizing conditions and the natural selection of cellular material leads to the appearance of a spectrum of different cell populations.
  • the issue of cell culture variability is most acute. Take, for example, the creation of antitumor vaccines based on cultured tumor cells of a patient. During cultivation, the antigenic phenotype of cells is significantly distorted (Apgus R., et al., "Expresiop of major histocompotibilit complex (MHC) aptigeps apd th Sprintir loss on cultural ip repalcipoma", ⁇ ur. J. Sapser, 1993, v.
  • MHC major histocompotibilit complex
  • cultured cells used in medical and cosmetic preparations must undergo a qualitative analysis.
  • tissue affiliation of cell lines There are various methods for determining the tissue affiliation of cell lines, namely based on: fine structural analysis of cells using an electron microscope; an immunological test of cytoskeletal proteins (Ramakers F.C.S. et al., CoId Srripg Narbo Sr. Quapt. Biol., 1982, v. 46, 331); detection of tissue-specific antigens (Nij Weide PJ. and Mulder R. J.P.,
  • tissue specificity tests in evaluating cell preparations is the inability to determine the source of the cells.
  • the fibroblasts used in cell preparations can be either fetal (embryonic) in origin or isolated from adult tissues, for example, from the skin or adipose tissue (adipogenic fibroblasts).
  • adipogenic fibroblasts adipogenic fibroblasts
  • CS ip "Soptamiptiop ip Tissure Culture", Fog J. (ed.), Academis Press, 1973, Lopd add New York, p.l).
  • the disadvantage of this method is the need for preliminary obtaining species-specific antibodies for a particular culture, which are obtained by immunization of the animal with test cells. The method cannot characterize the loss of useful properties by cells during cultivation.
  • cytogenetic (karyological) method for assessing the presence of impurities of other types of cells in culture.
  • the method is based on the fact that chromosome sets can significantly differ in cells of different types, which can be detected using a microscope.
  • G-segmentation is used, see, for example, S Smithbright M., “ ⁇ parid b Economicspdi ⁇ g t survey ⁇ réelle ⁇ maneuver h ⁇ réelle ⁇ till”, Lapset, 1971, v.2, 971-972).
  • the method allows revealing only interspecific cross-contamination and cannot establish the loss of useful properties by cells during cultivation.
  • Known immunological test for antigens of the blood group (Nau RJ. In:
  • DNA fingerprinting is known (see, for example, US2005123947, publ. 06/03/2005; WO2005116257, publ. 12/08/2005; US2006035261, publ. 02.16.2006).
  • DNA is fragmented by restrictase and the resulting DNA fragments are different in size and together form a unique profile that allows you to identify the source of DNA origin.
  • a similar approach is widely used to identify cellular material.
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • VNTRS variable nucleotide tandem repeats
  • the known method involves the use of mass spectrometers that measure the mass of molecules with high accuracy due to the use of ion-cyclotron resonance, which allows to increase the amount of information obtained from cell samples (US6974702, published 02.06.2005, MTTK G01N27 / 62; G01N ⁇ / 15; G01N ⁇ / 483).
  • the closest analogue of the claimed invention is a method based on mass spectrometric analysis of precisely surface cell proteins, disclosed in the patent "R réelleraratiop schreibf highl- motivationurifikosd jackeriel réellem matterss m Economicsmbr Maisp réelles” (WO03025565, publ. 03/27/2003, MPK-7 G01N27 / 62; C07K1 / 27/62; C07K1 / 22/62; ; C07K16 / 28), which describes a method for determining the quality of a cell culture, including mass spectrometric analysis of pre-isolated membrane proteins.
  • the present invention was tasked with developing a new method for determining the quality of cell culture, focused on the analysis of cell preparations, the hallmarks of which are:
  • - sensitivity allowing to determine the loss of quality by cells during cultivation
  • - sensitivity allowing to differentiate morphofunctionally identical cells from one donor, but possessing various useful properties when applied;
  • the technical result achieved by using the patented invention is to increase the objectivity (accuracy) of identification of cultured ip vitro cells for the selection of high-quality (with expected useful properties) cells while reducing time and material costs.
  • the specified technical result is provided by the implementation of a method for determining the quality of cell culture, including mass spectrometric analysis of surface cell proteins.
  • a method for determining the quality of cell culture including mass spectrometric analysis of surface cell proteins.
  • pre-washed living cells of the studied cell culture are exposed to vital proteases, cleaved fragments of surface proteins are selected and their masses are determined spectrometrically, the presence of qualitative characteristics of the studied cell culture is monitored by comparing the totality of the obtained masses with the totality of spectrometrically determined masses of fragments of surface proteins of living cells with known qualitative characteristics.
  • trypsin is used as the protease.
  • trypsin is used as the protease.
  • the presence of quality characteristics that determine the suitability for antitumor immunotherapy is monitored.
  • the cells are monitored for the presence of qualitative characteristics indicating the absence of changes in the phenotype of cells of the studied cell culture during cultivation.
  • a primary cell culture can be used.
  • the cleaved fragments of surface proteins can be deglycosylated before mass spectrometric analysis.
  • FIG. 1 is a diagram of the preparation of a proteomic footprint of cultured cells according to the present invention.
  • FIG. 2 proteomic footprints of fibroblasts from various human tissues, classified by hierarchical cluster analysis.
  • FIG. 3 is a mass spectrum of surface protein fragments and a corresponding footprint obtained according to the second embodiment of the invention from a freshly initiated primary culture of human tumor cells (3A); the mass spectrum of surface protein fragments and the corresponding footprint obtained from the same cell culture after a short cultivation (ST); the mass spectrum and the corresponding footprint obtained from the same cell culture after a longer cell culture (3B).
  • fibroblasts are almost identical (have a fusiform shape).
  • fibroblasts obtained from various sources differ significantly in their properties, and accordingly, have different indications for use in cell therapy.
  • fibroblasts derived from human adipose tissue are pluripatent similar to stem cells (see, for example, Zuk P.A. et al, "Numap adiroce tens ise source of multitett sells", MoI. Biol. CeIl., 2002, v. 13, 4279-4295).
  • Fibroblasts of human skin have a weak potential for reproduction, but are suitable for mesotherapy with large doses of multiplied cells of the patient himself.
  • Embryonic fibroblasts of human skin have good potential for reproduction and are suitable for allogeneic cell transplantation (Sukhikh G.T., “Fetal cell transplantation in medicine: present and future”, Bull. Exp. Biol. Med., 1998, 126, Appl. , 3-13).
  • Dermal papilla fibroblasts hair follicle possess trichogenic properties and can be used in cell therapy of alopecia (see, for example, the patent "Biotransplant, method for its preparation (options) and method for the treatment of alopecia", application: 2004125092/15, publ. 18.08.2004).
  • adipogenic, fetal fibroblasts and fibroblasts of the dermal papilla of the hair follicle were obtained from appropriate sources according to the previously described methods.
  • Primary skin fibroblast cultures were obtained according to the Rittié and Fishér methods (“Isolatiop apulture of ski ski fibroblasts”, Methods MoI. Med. 2005, v. 117, 83-98).
  • Primary cultures of adipogenic fibroblasts were obtained according to the methodology of Zuk et al.
  • a cell preparation containing the tested fibroblasts is poured into a culture bottle under sterile conditions. Fill growth vial medium (DMEM with 10% fetal bovine serum) and incubated at 37 ° C in
  • a 0.0001% trypsin solution is added to the cells using 1 ml of a solution per 25 cm 2 of the surface of the culture vial.
  • a trypsin solution taken from the cells is used for mass spectrometric determination of the aggregate mass of fragments of surface proteins corresponding to the analyzed cells.
  • the measured set of masses of fragments of surface proteins of the analyzed cells is compared with the set of masses of fragments of surface proteins of cell cultures obtained in a similar way with known qualitative characteristics.
  • Mass spectrometric analysis is carried out as follows. Samples obtained during the incubation of cells with trypsin (see paragraph N ° 4 of the protocol) are desalted using tips for automatic pipettes with reversed phase ZipTipc 18 (Milliroe Corp., USA), in accordance with the manufacturer's protocol. The masses of peptide fragments contained in the sample are measured by time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. 2 ⁇ l of the desalted solution is mixed on a mass spectrometric target in a 1: 1 ratio with a saturated solution of ⁇ -cyano-4-hydroxy-hydroxyquinamine acid containing 50% acetonitrile and 0.5% trifluoroacetic acid.
  • MALDI-TOF time-of-flight
  • the sample droplets obtained on the target are dried in air and mass spectrometric analysis is carried out in the mass range of peptides from 600 to 4000 Da.
  • the resulting mass spectra corresponding to different cell lines are pre-processed for subsequent classification by hierarchical cluster analysis.
  • the list of masses of peptides is translated into binary code ("1" - is a certain mass of the peptide in the spectrum and, accordingly, “O” means the absence of the mass of the peptide), thus generating a proteomic footprint of the cell culture.
  • the classification (grouping) of footprints is carried out by clustering according to the Ward method, using the squares of Euclidean distances to calculate the distance matrix.
  • FIG. Figure 2 shows that the footprints of 42 fibroblast preparations from various sources, such as the dermal papilla of the hair follicle, adipose tissue, adult forearm skin, and fetal skin are clearly classified into four groups according to the origin of fibroblasts (1, 2, 3, and 4 groups in FIG. . 2, respectively).
  • having a test cell preparation of fibroblasts it is possible to accurately determine its origin by the fact that its footprint belongs to one or another cluster. For example, if the test cell preparation is matched with an asterisk (*) in FIG.
  • the so-called proteomic footprint is a kind of "barcode” characterizing cells for their relation to fibroblasts with certain properties of interest for cell therapy.
  • the protease treatment conditions of the cells are determined experimentally for each cell type and the activity of the used protease, and can vary significantly from 0.00001% to 0.05%, for the protease concentration, and from 30 seconds to 10 minutes for the processing time of the cells. In the case of using trypsin with a different activity, its concentration changes in direct proportion to an increase or decrease in activity.
  • any other mass spectrometry option is used.
  • Trypsin solution can be prepared both in sterile physiological saline and in any suitable saline or buffer solution.
  • proteases can be used, for example, chymotrypsin, proteinase K, etc.
  • the cleaved fragments of surface proteins can be deglycosylated, for example, pronase, before mass spectrometric analysis.
  • proteases instead of trypsin, a combination of proteases can be used.
  • cells In the case of using a cell suspension culture, cells must be sedimented to the bottom before sampling, for example by centrifugation, or any other suitable method may be used to remove cells from the test sample.
  • Desalting and concentration of the sample peptides for mass spectrometric analysis can be carried out by any suitable method. In other embodiments of the invention, if the applied mass spectrometric analysis protocol does not require desalination and / or concentration of the analyzed sample containing fragments of surface proteins, no desalination and / or concentration is carried out.
  • any suitable mathematical processing of the measured masses of protein fragments is used, which allows one to correctly classify cellular material according to the properties of interest, for example, by applying regression analysis, K-mes clustering, neural networks, PCA, SVM, SOM, etc., as well as their combinations.
  • the patented method can be applied to any type of cell preparation, in particular to a suspension of cells, mixed cultures, organotypic cultures and cell aggregates (granules, spheroids), as well as to freshly isolated cells and tissue fragments.
  • the invention is further illustrated by a second example of assessing the quality of a culture of human colon cancer tumor cells for their suitability for antitumor vaccination.
  • Cells isolated from a patient’s tumor, cultured and subsequently used for antitumor vaccination should be identical to the patient’s tumor cells.
  • cell cultivation significantly distorts the phenotype of the primary culture due to the impossibility of artificially reconstructing vitro conditions under which tumor cells grew in the patient's body.
  • the quality of cultured tumor cells used for vaccination is subject to mandatory control and is expressed in the degree to which they correspond to the patient’s tumor cells. A protocol for establishing such compliance is presented below.
  • the growth medium is removed from the vial with cultured tumor cells and the cells are washed three times with 0.9% sodium chloride solution or silane phosphate buffer, each time using a volume equal to at least half the volume of the growth medium poured into the culture vial. As a result of cell washing, traces of serum contained in the growth medium should be removed. 2. A 0.0001% trypsin solution (activity -3000 U / mg) is added to the cells using 1 ml of solution per 25 cm 2 of the surface of the culture vial.
  • Mass spectrometric analysis is carried out according to the protocol of mass spectrometry of glycosylated peptides (Tajiri M. et al., "Diffépal apulusis on situs on on paculum fibropesto: .15, 1332-1340).
  • 140 ⁇ l of the analyzed solution of surface protein fragments are mixed with 140 ⁇ l of ethanol, 720 ⁇ l of butanol and 15 ⁇ l of CL4B Sepharose are added. Incubate with slow stirring for 45 minutes. After incubation, Sepharose is washed twice with a solution with the same alcohol and butanol content and incubated for 30 min in a 50% ethanol solution. The ethanol solution was removed from sepharose and dried on a rotary evaporator. The resulting precipitate was dissolved in 10 ⁇ l of water and analyzed by time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry.
  • MALDI-TOF time-of-flight
  • the analyzed solution is mixed on a mass spectrometric target in a 1: 1 ratio with a saturated solution of 2,5-dihydroxybenzoic acid containing 50% acetonitrile and 0.5% trifluoroacetic acid.
  • the sample droplets obtained on the target are dried in air and mass spectrometric analysis is carried out in the peptide mass range from 1000 to 4000 Da.
  • a repeated (control) mass spectrometric analysis of cell culture reproduces at least 95% of the mass of protein fragments, which can be considered a criterion for the identity of the two compared cell preparations. It is proposed to evaluate the suitability of a cell preparation for vaccinating a patient based on the identity of at least 90% of the total mass of protein fragments in the analyzed cells and freshly isolated donor tumor cells.
  • FIG. 3A shows the time-of-flight spectrum of protein fragments and the corresponding footprint obtained according to the second embodiment of the invention from freshly isolated human colon cancer cells.
  • FIG. ZB shows the mass spectrum and the corresponding footprint of the same cells propagated by cultivation (1st passage) and suitable for antitumor vaccination. The spectrum taken from them is identical to the initial spectrum obtained from freshly isolated tumor cells.
  • the pollutant presents a mass spectrum of the same cells propagated by cultivation (2nd passage), but no longer suitable for antitumor vaccination. During cultivation, significant changes took place in the surface proteins of the cells (see, for example, the 1800-2000 Da footprint region in FIG. 3B), which allowed them to be considered non-identical to the cells of the original donor tumor.
  • barcode i.e. the indicator that most objectively characterizes cells.
  • control of the presence of qualitative characteristics of the studied cell culture by comparing the totality of the obtained masses of fragments of the surface proteins of its cells with the combination of mass spectrometrically determined masses of fragments of the surface proteins of living cells with known qualitative characteristics makes it possible to most accurately select high-quality (with expected useful properties) cells.
  • the obtained mass spectra can be transformed with the possibility of numerical expression of the analysis results, which is necessary to implement the GMP 5 standard, which excludes the human factor in assessing the quality of cell culture, and will ensure the necessary objectivity of the results.
  • the accuracy of determining the presence of qualitative characteristics of the studied cell culture during the implementation of the patented method is also ensured by the use of living cells of the studied cell culture, which are subjected to vital proteases. Cells during processing by vital exposure to proteases do not die, which makes it possible to avoid contamination of the analyzed samples with major proteins of the cell cytoplasm and significantly reduce the consumption of cellular material in the analysis of cell culture.
  • Pre-washing of cells which is necessary to remove traces of serum contained in the growth medium, also avoids contamination of the analyzed samples.
  • the patented method allows to characterize the cells according to the most relevant, including for cell transplantology, surface proteins.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯКАЧЕСТВАКЛЕТОЧНОЙКУЛЬТУРЫ
Область применения Изобретение относится к области клеточных технологий, а именно к анализу культивируемых iп vitrо клеток и может быть использовано в биотехнологии, косметологии, медицине (клеточной трансплантологии), для получения охарактеризованного клеточного материала, обладающего лечебными или косметологическими свойствами. Предшествующий уровень техники
Проблема анализа клеточного материала, а именно контроля изменчивости является актуальной задачей во всех областях, где применяются культивируемые клетки. Так эксперименты на клеточных культурах являются неотъемлемой частью исследований в биологии и медицине. На клеточных моделях исследуют такие биологические процессы как апоптоз, дифференцировка, онкологическая трансформация клеток, изучают многие аспекты метаболизма, выявляют механизмы действия лекарств и т.д. Последние достижения клеточных технологий позволяют использовать культивируемые клетки в качестве лекарственных препаратов, перспективных, по мнению многих ученых, в лечении многих ранее неизлечимых болезней (Теrskikh А.V. еt аl., "Маmmаliап stеm сеlls", Реdiаtr. Rеs., 2006, v.59, 13-20).
Однако, фенотип культивируемых клеток изменчив. Перенос клеток из физиологичных условий iп vivо в культуральные флаконы приводит к стрессу клеток и существенной перестройке их метаболизма. Причина тому - невозможность воссоздания "в пробирке" естественной для клеток среды обитания (Wright W.E., Shау J. W., "Нistоriсаl сlаims апd сurrепt iпtеrрrеtаtiопs оf rерliсаtivе аgiпg", Nаt. Вiоtесhпоl., 2002, v.20, 682-688; Gershon H., Gershon D., "Сritiсаl аssеssmепt оf раrаdigms iп аgiпg rеsеаrсh", Ехр. Gеrопtоl., 2001, у.36, 1035-1047), что ведет к: изменению в экспрессии генов (Саmрisi J., "Rерliсаtivе sепеsсепсе апd immоrtаlizаtiоп", iп: Stеiп G.S., Ваsеrgа А., Giоrdапо А., Dепhаrdt D.Т. (еds.). "Тhе Моlесulаr Ваsis оf CeIl Сусlе апd Grоwth Сопtrоl", Wilеу-Liss, Nеw Yоrk, 1999, рр.
348-373; Сristоfаlо VJ. еt аl., "Аgе-dерепdепt mоdifiсаtiопs оf gепе ехрrеssiоп iп humап fibrоblаsts", Сrit. Rеv. Еukаrуоtiс Gепе Ехрrеssiоп, 1998, v.8, 43- 80); активации лизосомальных гидролаз (Вауrеuthеr К. еt аl., "Нumап skiп fibrоblаsts iп vitrо diffеrепtiаtе аlопg а tеrmiпаl сеll Нпеаgе", Рrос. Nаtl. Асаd. Sсi. USA, 1988, v.85, 5112-5116); деградации гормон-зависимого метаболизма, сдвигам в изоферментном составе (Сrаbb D.W., Rоерkе J., "Lоss оf grоwth hоrmопе-dерепdепt сhаrасtеristiсs оf rаt hераtосуtеs iп сulturе", In Vitrо Сеll Dеv. Вiоl., 1987, v.23, 303-307;
Rоерkе J.E., Сrаbb D. W., "Lоss оf sехuаl diffеrепtiаtiоп оf rаt hераtосуtеs iп shоrt-tеrm сulturе", Аlсоhоl Аlсоhоl Suррl., 1987, v.l, 263-264); изменениям в синтезе rлутатиона (Rеiпеrs JJJr. еt аl., "Dерlеtiоп оf сеllulаr glutаthiопе bу сопditiопs usеd fоr thе раssаgiпg оf аdhеrепt сulturеd сеlls", Тохiсоl. Lеtt., 2000, v.115, 153-163); потере в процессе культивирования экстрацеллюлярных белков и деградации рецепторного аппарата (Нuggiпs J.W. еt аl., "Моlесulаr сhапgеs iп сеll surfасе mеmbrапеs rеsultiпg frоm trурsiпizаtiоп оf sаrсоmа 180 tumоr сеlls", Вiосhim. Вiорhуs. Асtа, 1976, v.426, 630-637); повышению в клетках с каждым пассированием активности теломеразы и укорочению теломеров (Воdпаr A. G. еt аl., "Ехtепsiоп оf lifе-sрап bу iпtrоduсtiоп оf tеlоmеrаsе iпtо поrmаl humап сеlls", Sсiепсе, 1998, v.279, 349-352), что, в конечном счете, приводит к неспособности клеток пролиферировать (Науfliсk L., Мооrhеаd P. S., "Thе sеriаl сultivаtiоп оf humап diрlоid сеll strаiпs", Ехр. Сеll Rеs., 1961, v.25, 585-621).
- потере комплекса гистосовместимости (Соlliпs T. еt аl., "Lоss оf HLA iп сulturе", Рrос. Nаtl. Асаd. Sсi. USA, 1986, v.83, 446-450; Апgus R., еt аl., "Ехрrеssiоп оf mаjоr histосоmраtibilitу соmрlех (MHC) апtigепs апd thеir lоss оп сulturе iп rепаl саrсiпоmа", Еur. J. Сапсеr, 1993, v.29, 2158-2160).
Таким образом, iп vitrо клетки подвержены морфофункциональной дегенерации, ведущей к их гибели. Более того, действующие iп vitrо дестабилизирующие условия и естественный отбор клеточного материала приводит к возникновению спектра отличающихся друг от друга популяций клеток. В медицинских клеточных технологиях вопрос изменчивости клеточных культур стоит наиболее остро. Возьмем, к примеру, создание противоопухолевых вакцин на основе культивируемых опухолевых клеток пациента. При культивировании существенно искажается антигенный фенотип клеток (Апgus R., еt аl., "Ехрrеssiоп оf mаjоr histосоmраtibilitу соmрlех (MHC) апtigепs апd thеir lоss on сulturе iп rепаl саrсiпоmа", Еur. J. Сапсеr, 1993, v.29, 2158-2160; Nanchahal J. еt аl., "Сulturеd соmроsitе sкiп grаfts: biоlоgiсаl sкiп еquivаlепts реrmittiпg mаssivе ехрапsiоп", Lапсеt, 1989, v.22, 191-193), что ведет к несовпадению антигенов вакцины и опухоли. Вероятно, именно с этим связан тот факт, что в большинстве проведенных в последнее десятилетие рандомизированных исследований таких вакцин не было получено очевидной противоопухолевой активности (Fishеr R.I. еt аl., "Аdjuvапt immшюthеrару оr сhеmоthеrару fоr mаligпапt mеlапоmа", Рrеlimiпаrу rероrt оf thе Nаtiопаl Сапсеr Iпstitutе rапdоmizеd сliпiсаl triаl. Surg. Сliп. Nоrth Am., 1981, v.61, 1267- 1277; Мitсhеll M.S., "Реrsресtivе оп аllоgепеiс mеlапоmа lуsаtеs iп асtivе sресifiс immuпоthеrару", Sеmiп. Опсоl., 1998, v.25, 623-635).
Не менее актуален вопрос изменчивости клеток при использовании клеточных трансплантатов, полученных путем размножения клеток самого пациента. В частности, известны способы лечения аутологичными фибробластами (см, например, "Биотрансплантат и способ коррекции дефектов мягких тканей, способ получения биотрансплантата", заявка: 2005127087/15, опубл. 20.08.2006, МПК A61K35/36; A61K35/36, а так же WO9840027 опубл. 17.09.1998, МПК A61F2/10; A61L27/24; A61L27/38; C12N5/00; US5660850, опубл. 26.08.1997, МПК C12N5/06; A61F2/00). Изменение в процессе культивирования антигенов (Соlliпs T. еt аl., "Lоss оf HLA iп сulturе", Рrос. Nаtl. Асаd. Sсi. USA, 1986, v.83, 446-450) или, например, утрата возможности пролиферировать (Науfliсk L., Мооrhеаd P. S., "Thе sеriаl сultivаtiоп оf humап diрlоid сеll strаiпs", Ехр. CeIl Rеs., 1961, v.25, 585-621) делает подобные биотрансплантанты бессмысленными, а возможно и вредными.
Таким образом, культивированные клетки, используемые в медицинских и косметологических препаратах, должны в обязательном порядке подвергаться качественному анализу.
Сегодня к оценке качества культивируемых клеток относят способы, направленные на выявление контаминации, определение количества живых клеток, их тканевой принадлежности, выявление кросс-контаминаций (загрязнение клетками другого вида), а также абсолютная их идентификация.
Существуют различные методы обнаружения контаминации клеточных препаратов микоплазмой, грибами и вирусами. Данные способы позволяют характеризовать качество клеточного препарата, но не характеризуют качество самих клеток препарата.
Существуют различные методы оценки качества культуры, основанные на исключении красителя живыми клетками, эффективности клонирования и пролиферации в массовой культуре (Хэй P. "Сохранение и оценка качества клеток", в кн.: "Культура животных клеток", под ред. 3. Фрешни, M.: Мир, 1989, с. 108-164). Данные методы позволяют только определять процент живых клеток в клеточном препарате и их жизнеспособность, но не дают представления о качественных (специальных) характеристиках самих клеток.
Известны различные способы определения тканевой принадлежности клеточных линий, а именно основанные на: тонком структурном анализе клеток с помощью электронного микроскопа; иммунологическом тесте белков цитоскелета (Rаmаеkеrs F.С.S. еt аl., CoId Sрriпg Наrbоr Sуmр. Quапt. Вiоl., 1982, v.46, 331); выявлении тканеспецифических антигенов (Nij wеidе PJ. and Mulder R. J.P.,
"Idепtifiсаtiоп оf оstеосуtеs iп оstеоblаst-likе сеll сulturеs usiпg а mопосlопаl апtibоdу sресifiсаllу dirесtеd аgаiпst оstеосуtеs", 1986, v.84, 342-347); биохимическом тестирования специфических функций клеток (применим для клеток со специфическими функциями, см., например, Нау RJ. еt аl., "Аmеriсап Туре Сulturе Collection Catalogue 11", 4th еdп., 1983, Rосkvillе, MD, р.12), количественной оценке иммунологических продуктов (применим для идентификации гибридом).
Недостатком тестов на тканеспецифичность при оценке клеточных препаратов является невозможность определить источник клеток. В частности фибробласты, применяемые в клеточных препаратах, могут быть как фетального (эмбрионального) происхождения, так и выделенными из тканей взрослого человека, например из кожи или жировой клетчатки (адипогенные фибробласты). Таким образом, фибробласты, полученные из различных источников, хоть и относятся к одному типу ткани, обладают различными полезными качествами.
В настоящее время известно несколько способов выявления кросс- контаминаций и идентификации клеточных культур.
Известен метод непрямой окраски клеток флуоресцентно-мечеными антителами. Данный способ позволяет верифицировать культуру клеток, определить кросс-контаминацию, установить изменчивость по определенным антигенам (Stulbеrg
CS. iп: "Сопtаmiпаtiоп iп Тissurе Сulturе", Fоgh J. (еd.), Асаdеmiс Рrеss, 1973, Lопdоп апd Nеw Yоrk, р.l). Недостатком данного способа является необходимость предварительного получения видоспецифических антител для конкретной культуры, которые получают путем иммунизации животного тестируемыми клетками. Метод не может характеризовать утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования.
Известен метод, основанный на анализе изоферментного состава. Показано, что определение изоформ семи ферментов с помощью электрофореза достоверно позволяет определить принадлежность клеток человеку (О'Вriеп SJ. еt аl., "Епzуmе роlуmоrрhisms аs gепеtiс sigпаturеs iп hшпап сеll сulturеs", Sсiепсе, 1977, v.195, 1345- 1348). Недостатком данного метода является длительность его исполнения (электрофорез идет 16-18 часов) и применимость только для выявления межвидовых кросс-контаминаций. Метод не может характеризовать утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования.
Известен цитогенетический (кариологический) способ оценки наличия примесей других типов клеток в культуре. Метод основан на том, что хромосомные наборы могут значительно отличаться у клеток разных видов, что можно обнаружить с помощью микроскопа. Однако при наличии загрязнения клетками близкородственного вида анализ резко усложняется (применяется G-сегментирование, см., например, Sеаbright M., "А rарid bапdiпg tесhпiquе fоr hшпап сhrоmоsопiеs", Lапсеt, 1971, v.2, 971-972). Метод позволяет выявлять только межвидовую кросс- контаминацию и не может установить утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования. Известен иммунологический тест на антигены группы крови (Нау RJ. In:
"Маrkеrs оf Colonic CeIl Diffеrепtiаtiоп", Wolman S. R., Mastromarino AJ. (еds.), 1984, Rаvеп Рrеss, Nеw Yоrk, р.З) и антигены гистосовместимости (Роllасk М.S. еt аl., "HLA- A, В, С апd DR аllоапtigеп ехрrеssiоп оп fоrtу-siх сulturеd hшпап tumоr сеll liпеs", J. Nаtl. Сапсеr Iпst, 1981, v.66, 1003-1012). Недостатком данного метода является частичное или полное отсутствие экспрессии этих антигенов у некоторых клеточных культур.
Известно использование полимеразной цепной реакции и ДНК секвенирования (Liu М.Y. еt аl., "Idепtifiсаtiоп апd аuthепtiсаtiоп оf апimаl сеll сulturе bу роlуmеrаsе сhаiп rеасtiоп аmрlifϊсаtiоп апd DNA sеquепсiпg", In Vitго Сеllulаr & Dеvеlорmепtаl Biology - Апimаl, 2003, v.39, 424-427; Раrоdi В. еt аl., "Sресiеs idепtifiсаtiоп апd сопfirmаtiоп оf humап апd апimаl сеll liпеs: а РСR-bаsеd mеthоd", Вiоtесhпiquеs, 2002, v.32, 432-434, 436, 438-440). Недостатком метода является применимость к клеточным линиям неблизкородственных видов, а также длительность исполнения, т.к. он требует проведение электрофореза. Метод не может характеризовать утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования.
Известен ДНК фингерпринтинг (см, например, US2005123947, опубл. 09.06.2005; WO2005116257, опубл. 08.12.2005; US2006035261, опубл. 16.02.2006). ДНК фрагментируется рестриктазой и полученные фрагменты ДНК отличаются по размеру и в совокупности формируют уникальный профиль, позволяющий идентифицировать источник происхождения ДНК. Подобный подход широко используется для идентификации клеточного материала. Для ДНК фингерпринтинга наиболее широко используют полиморфизм длины фрагментов рестрикции (RFLP) (см., например, Kanter E. еt аl., "Апаlуsis оf restriction frаgmепt lепgth роlуmоrрhisms iп dеохугibопuсlеiс асid (DNA) rесоvеrеd frоm driеd blооdstаiпs", J. Forensic ScL, 1986, v.Зl, 403-408), вариабельные нуклеотидные тандемные повторы (VNTRS) (Вudоwlе В. еt аl., "Апаlуsis оf thе VNTR lосus D1S80 bу thе PCR fоllоwеd bу high-rеsоlutiоп PAGE", Am. J. Нum. Gепеt, 1991, v.48, 137-144) или микросателлиты (Jеffrеуs AJ. еt аl., "Нуреrvаriаblе 'miпisаtеllitе' rеgiопs iп humап DNA", Nаturе, 1985, v.314, 67-73). За исключением монозиготных близнецов подобный метод позволяет точно идентифицировать принадлежность клеточного материала индивидууму. Однако метод никак не характеризует изменение качества клеточной культуры в процессе культивирования.
Известен двумерный белковый электрофорез, позволяющий выявить до 2 тысяч белков (Апdеrsоп N.G., Апdеrsоп N.L., "Тwепtу уеаrs оf twо-dimепsiопаl еlесtrорhоrеsis: раst, рrеsепt апd futurе", Еlесtrорhоrеsis, 1996, v.17, 443-453). Недостатком данного способа является сложность исполнения. Способ требует последовательное проведение двух электрофоретических разделений белков, в связи с чем не применяется в качестве рутинного метода для оценки качества культур клеток. Более того, двумерный белковый электрофорез не характеризует наиболее актуальную для клеточной терапии фракцию поверхностных антигенов клеток, ввиду того, что данным способом не анализируют мембранные белки. Известно применение масс-спектрометрии для идентификации клеточных культур (Zhапg X. еt аl, "Idепtifiсаtiоп оf Маmmаliап CeIl Lines Using MALDI-TOF апd LС-ЕSI-МS/МS Маss Sресtrоmеtrу", J. Am. Sос. Маss Sресtrоm., 2006, v.17, 490-499). Быстрый и относительно простой метод профилирования белков клеток описан для клеток млекопитающих при непосредственном анализе времяпролетной (MALDI TOF) и другими видами масс-спектрометрии. Используя MALDI масс-спектры как уникальный фингерпринт можно дифференцировать клеточные линии млекопитающих.
Недостатком данного подхода является низкая специфичность, обуславливаемая присутствием в анализируемой пробе множества цитозольных (внутриклеточных) белков, чьи фрагменты, как правило, в массе своей не специфичны для типов клеток, засоряют масс-спектры и не позволяют провести чувствительный анализ и охарактеризовать клетки по наиболее актуальным для клеточной трансплантологии мембранным белкам. Из патента WO2006115426 ("Способ регулирования биохимических процессов и устройство для его осуществления", опубл. 02.11.2006, МПК G01R23/16; C12MЗ/00; С 12Nl /00) известен способ оценки качества культивирования клеточных культур на основе регистрации временных интервалов состояний клеток "рост-размножение" и "накопление-мутация", в котором границы интервалов определяются радиосигналами в среднечастотном и низкочастотном диапазонах. Недостатком данного способа является необходимость применения специального оборудования, а так же возможность определения параметров только в результате постоянного мониторирования роста клеток, что не применимо к оценке качества готовых клеточных препаратов. Известен способ оценки свойств культуры клеток нейронов (см. патент
US2004106101, опубл. 03.06.2004, МПК G01NЗЗ/487; G06Q10/00; G01NЗЗ/487) на основе измерения электрической активности клеток путем выращивания их на микроэлектродном чипе. Данный способ относиться только к культуре нейронных клеток и не распространяется на другие клеточные культуры. Так же известен способ сертификации культуры клеток хондроцитов (см. патент WO02095399, опубл. 28.11.2002, МПК C12Q1/42; G01NЗЗ/50; G01NЗЗ/68). Недостатком данного способа является применимость его только в регенеративной терапии хрящевых тканей. Известен способ определения качества клеточной культуры, включающий масс- спектрометрический анализ органических молекул клеток. Известный способ предусматривает применение масс-спектрометров, измеряющих массы молекул с высокой точностью за счет применения ионно-циклотронного резонанса, что позволяет увеличивать количество информации получаемой с проб клеток (US6974702, опубл. 02.06.2005, MTTK G01N27/62; G01NЗЗ/15; G01NЗЗ/483).
Недостатком данного метода является, с одной стороны загрязненность получаемых спектров неинформативными цитозольными белками и другими биополимерами, т. к. для анализа используют целые клетки, и, во вторых, использование определенного и дорогостоящего масс-спектрометра, позволяющего с высокой точностью определять массы молекул. В связи с этим данный подход не получил распространение в качестве рутинного метода анализа качества культур.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ, основанный на масс-спектрометрическом анализе именно поверхностных белков клеток, раскрытый в патенте "Рrераrаtiоп оf highlу-рurifiеd рlаsmа mеmbrапеs" (WO03025565, опубл. 27.03.2003, MПK-7 G01N27/62; C07K1/22; C07K16/28), в котором описан способ определения качества клеточной культуры, включающий масс- спектрометрический анализ предварительного выделенных мембранных белков.
Недостатком данного способа является необходимость использования специфичных для мембранных белков антител или их антигенсвязывающих фрагментов для формирования комплексов с белками мембраны для последующего их выделения и очистки. Подобная многостадийность не позволяет применять данный подход в качестве рутинного метода анализа качества культивируемых клеток.
В настоящем изобретении была поставлена задача разработки нового способа определения качества клеточной культуры, ориентированного на анализ клеточных препаратов, отличительными чертами которого являются:
- быстрота исполнения (не более 2-х часов), что позволит использовать его для оценки качества готовых клеточных препаратов перед их применением, учитывая малый срок их годности с момента изготовления (несколько часов);
- чувствительность, позволяющая определять потерю качества клетками в процессе культивирования; - чувствительность, позволяющая дифференцировать морфофункционально идентичные клетки от одного донора, но обладающие при применении различными полезными свойствами;
- ориентация на анализ поверхностных белков клеток, определение сохранности которых в процессе культивирования наиболее актуально;
- интегрируемость в культивирование клеток, что подразумевает отсутствие специального оборудования и сложных манипуляций для подготовки проб для анализа;
- относительная дешевизна, чтобы цена анализа была несопоставимо меньше стоимости клеточного препарата;
- минимальное или отсутствие потребления клеток, что позволит многократно проводить анализ культивируемых клеток без их расхода;
- возможность численного выражения результатов анализа, что необходимо для реализации стандарта GMP, исключающего человеческий фактор при проведении оценки качества культуры клеток.
Раскрытие изобретения
Технический результат, достигаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в повышении объективности (точности) идентификации культивируемых iп vitrо клеток для отбора качественных (с ожидаемыми полезными свойствами) клеток при снижении временных и материальных затрат.
Указанный технический результат обеспечивается при реализации способа определения качества клеточной культуры, включающего масс-спектрометрический анализ поверхностных клеточных белков. Согласно настоящему изобретению предварительно промытые живые клетки исследуемой клеточной культуры подвергают витальному воздействию протеазы, отбирают отщепленные фрагменты поверхностных белков и масс-спектрометрически определяют их массы, контролируют наличие качественных характеристик у исследуемой культуры клеток путем сравнения совокупности полученных масс с совокупностью масс- спектрометрически определенных масс фрагментов поверхностных белков живых клеток с известными качественными характеристиками.
В предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве протеазы используют трипсин. Для идентификации отношения клеточной культуры к определенной группе клеточных препаратов с полезными свойствами контролируют наличие качественных характеристик, определяющих источник клеток.
В предпочтительном варианте реализации изобретения контролируют наличие качественных характеристик, определяющих пригодность для проведения противоопухолевой иммунотерапии.
Для установления сохранности полезных свойств клетками контролируют наличие качественных характеристик, свидетельствующих об отсутствии изменений фенотипа клеток исследуемой клеточной культуры в процессе культивирования.
В качестве живых клеток с известными качественными характеристиками может быть использована первичная культура клеток.
В качестве живых клеток с известными качественными характеристиками могут быть использованы клетки, не претерпевшие изменений в фенотипе в процессе хранения и культивирования.
Отщепленные фрагменты поверхностных белков перед масс- спектрометрическим анализом могут быть дегликозилированы.
Обработка первичной культуры клеток витальным воздействием трипсина приводит к отщеплению с поверхности клеток фрагментов белков, состав которых специфичен для конкретных культур клеток. Таким образом, согласно данному изобретению, действие трипсина, как и других протеаз, приводит к высвобождению в раствор специфичных для культивируемых клеток фрагментов поверхностных белков, совокупность измеренных масс которых являются характеристической для культуры клеток. Для подобных характеризующих культивируемые клетки совокупностей масс был введен термин протеомный футпринт (белковый отпечаток). Клетки при обработке витальным воздействием протеазы не погибают, что дает возможность избежать загрязнения анализируемых проб мажорными белками цитоплазмы клетки и избежать расхода клеточного материала при анализе. И Краткое описание чертежей
Далее изобретение поясняется конкретными примерами реализации изобретения и прилагаемыми фигурами, на которых изображено следующее:
На фиг. 1 - схема получения согласно данному изобретению протеомного футпринта культивируемых клеток.
На фиг. 2 - протеомные футпринты фибробластов из различных тканей человека, классифицированные иерархическим кластерным анализом.
На фиг. 3 — масс-спектр фрагментов поверхностных белков и соответствующий ему футпринт, полученный согласно второму примеру реализации изобретения со свежеинициированной первичной культуры опухолевых клеток человека (ЗА); масс- спектр фрагментов поверхностных белков и соответствующий ему футпринт, полученный с той же культуры клеток после непродолжительного их культивирования (ЗБ); масс-спектр и соответствующий ему футпринт полученный с той же культуры клеток после более длительного культивирования клеток (3B).
Лучшие варианты осуществления изобретения
Пример 1. НА ФИБРОБ ЛАСТАХ ЧЕЛОВЕКА
Морфологически все типы фибробластов практически идентичны (имеют веретенообразную форму). Однако фибробласты, полученные из различных источников, существенно отличаются по своим свойствам, и соответственно, имеют различные показания к применению в клеточной терапии. В частности, фибробласты, полученные из жировой ткани человека, отличаются плюрипатентностью подобно стволовым клеткам (см., например, Zuk Р.А. еt аl, "Нumап аdiроsе tissuе is а sоurсе оf multiроtепt stеm сеlls", MoI. Вiоl. CeIl., 2002, v.13, 4279-4295). Фибробласты кожи человека обладают слабым потенциалом к размножению, но пригодны для мезотерапии большими дозами размноженных клеток самого пациента. Эмбриональные фибробласты кожи человека обладают хорошим потенциалом к размножению и пригодны для аллогенной клеточной трансплантации (Сухих Г.T., "Трансплантация фетальных клеток в медицине: настоящее и будущее", Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1998, 126, Прил.l, 3-13). Фибробласты дермального сосочка волосяного фолликула обладают трихогенными свойствами и могут использоваться в клеточной терапии алопеции (см., например, патент "Биотрансплантант, способ его получения (варианты) и способ лечения алопеции", заявка: 2004125092/15, опубл. 18.08.2004).
Ниже приведен пример определения согласно данному изобретению качественных характеристик тестируемой культуры фибробластов, путем установления идентичности ее протеомного футпринта полученным аналогичным образом футпринтам культур фибробластов известного происхождения и с установленными полезными свойствами.
Сорок две первичные культуры кожных, адипогенных, фетальных фибробластов и фибробластов дермального сосочка волосяного фолликула получали из соответствующих источников согласно описанным ранее методикам. Первичные культуры кожных фибробластов получали согласно методике Rittiе и Fishеr ("Isоlаtiоп апd сulturе оf skiп fibrоblаsts", Меthоds MoI. Меd., 2005, v.117, 83-98). Первичные культуры адипогенных фибробластов получали согласно методике Zuk и соавт. ("Мultiliпеаgе сеlls frоm lшmап аdiроsе tissuе: imрliсаtiопs fоr сеll-bаsеd thеrарiеs", Тissuе Епg., 2001, v.7, 211-288). Первичные культуры фибробластов дермального сосочка волосяного фолликула получали согласно методике Zhопg-fа и соавт. ("Вiоlоgiсаl сhаrасtеrizаtiоп оf сulturеd dеrmаl рарillа сеlls апd hаir fоlliсlе rеgепеrаtiоп iп vitrо апd iп vivо", Сhiпеsе Меdiсаl Jоurпаl, 2006, v.119, 275-281). Первичные культуры фетальных фибробластов человека получали из абортивного материала согласно методике Sаlvаtоri и соавт. ("Rеtrоvirаl vесtоr-mеdiаtеd gепе trапsfеr iпtо humап рrimаrу mуоgепiс сеlls lеаds tо ехрrеssiоп iп musсlе flbеrs iп vivо", Нum. Gепе Тhеr., 1993, v.4, 713-723). Культивирование первичных культур проводили в идентичных условиях (ростовая среда ДМЕМ, 5% CO2, 370C, 10% фетальной бычьей сыворотки). На 20-25 день после инициации культур делали стерильный клеточный препарат (1 млн фибробластов в 1 мл физиологического раствора), который анализировали по следующему протоколу:
1. Клеточный препарат, содержащий тестируемые фибробласты, в стерильных условиях выливают в культуральный флакон. Во флакон доливают ростовой среды (ДМЕМ с 10% фетальной бычьей сыворотки) и инкубируют при 370C в
CO2-инкyбaтope в течение 30-45 мин.
2. Удаляют ростовую среду из флакона и трижды промывают прикрепившиеся ко дну флакона клетки стерильным физиологическим раствором, используя объем равный половине ростовой среды.
3. Добавляют к клеткам 0,0001% раствор трипсина, используя 1 мл р-ра на 25 см2 поверхности культурального флакона.
4. Инкубируют флакон при 370C. Между пятой и седьмой минутами инкубации отбирают из флакона раствор трипсина, содержащий отщепленные от клеток фрагменты белков.
5. Раствор трипсина, отобранный от клеток, используют для масс- спектрометрического определения совокупности масс фрагментов поверхностных белков, соответствующей анализируемым клеткам.
6. Измеренную совокупность масс фрагментов поверхностных белков анализируемых клеток сравнивают с полученной аналогичным способом совокупностью масс фрагментов поверхностных белков клеточных культур с известными качественными характеристиками.
Масс-спектрометрический анализ проводят следующим образом. Пробы, полученные в процессе инкубации клеток с трипсином (см. пункт N°4 протокола) обессоливают, применяя наконечники для автоматических пипеток с обращенной фазой ZipTipc18 (Мilliроrе Соrр., США), в соответствии с протоколом производителя. Массы пептидных фрагментов, содержащиеся в пробе, измеряют методом времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. 2 мкл обессоленного раствора смешивают на масс-спектрометрической мишени в соотношении 1:1 с насыщенным раствором α-циaнo-4-гидpoкcиcинaминoвoй кислоты, содержащей 50% ацетонитрила и 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученные на мишени капли проб высушивают на воздухе и проводят масс-спектрометрический анализ в диапазоне масс пептидов от 600 до 4000 Да. Полученные масс-спектры, соответствующие разным клеточным линиям, предварительно обрабатывают для последующей классификации иерархическим кластерным анализом. Список масс пептидов переводят в бинарный код ("1"- есть определенная масса пептида в спектре и, соответственно, "О"- отсутствие массы пептида), генерируя таким образом протеомный футпринт клеточной культуры. Классификацию (разбиение на группы) футпринтов проводят кластеризацией по методу Варда, с использованием квадратов евклидовых расстояний для расчета матрицы дистанций.
Из фиг. 2 видно, что футпринты 42-х препаратов фибробластов из различных источников, таких как дермального сосочка волосяного фолликула, жировой клетчатки, кожи предплечья взрослого человека и фетальной кожи четко классифицируются по четырем группам соответственно происхождению фибробластов (1, 2, 3 и 4 группы на фиг. 2, соответственно). Таким образом, имея тестируемый клеточный препарат фибробластов, можно точно установить его происхождение по принадлежности его футпринта к тому или иному кластеру. К примеру, если тестируемому клеточному препарату соответствует отмеченный звездочкой (*) на фиг. 2 футпринт, то достоверно можно утверждать, что фибробласты тестируемого препарата были выделены из дермального сосочка волосяного фолликула, размножены соответствующим образом и в процессе культивирования не были утрачены качественные характекристики, позволяющие отнести данные фибробласты к фибробластам с трихогенными свойствами. В случае, если тестируемая культура клеток не будет принадлежать ни одному из кластеров (см, например, футпринт адипогенных фибробластов в кластере 2' на фиг. 2), можно утверждать, что клетки не принадлежат ни одному из определяемых источников, либо в процессе культивирования их фенотип изменился и ассоциировать их с качественными клеточными препаратами установленного происхождения и с известными свойствами уже нельзя.
Из приведенного примера видно, что совокупность (набор) молекулярных масс фрагментов поверхностных белков, т.н. протеомный футпринт, является своеобразным "штрих-кодом" характеризующим клетки на предмет отношения к фибробластам с определенными, представляющими интерес для клеточной терапии, свойствами.
Следует отметить, что забор раствора трипсина, содержащего отщепленные от клеток фрагменты поверхностных белков, желательно осуществлять до момента открепления клеток от дна культурального флакона под воздействием трипсина, что позволит предотвратить попадание клеток в пробу и избежать дополнительной стадии очистки пробы.
Условия обработки протеазой клеток определяют экспериментально для каждого типа клеток и активности используемой протеазы, и могут существенно варьировать от 0,00001% до 0,05%, для концентрации протеазы, и от 30 секунд до 10 минут для времени обработки клеток. В случае использования трипсина с другой активностью, концентрация его меняется прямо пропорционально увеличению или уменьшению активности.
В других вариантах реализации изобретения используют любой другой вариант масс-спектрометрии.
Раствор трипсина можно готовить как на стерильном физиологическом растворе, так и на любом подходящем для этого солевом или буферном растворе.
Вместо трипсина могут быть использованы другие протеазы, например, химотрипсин, протеиназа К и т.д. Отщепленные фрагменты поверхностных белков могут перед масс- спектрометрическим анализом быть дегликозилированы, например проназой.
Вместо трипсина может быть использована комбинация протеаз.
В случае использования суспензионной культуры клеток необходимо перед забором пробы клетки осадить на дно, например центрифугированием или использовать любой другой подходящий способ для удаления клеток из тестируемой пробы.
Обессоливание и концентрирование пептидов пробы для масс- спектрометрического анализа можно осуществлять любым подходящим для этого способом. В других вариантах реализации изобретения, если применяемый протокол масс-спектрометрического анализа не требует обессоливания и/или концентрирования анализируемой пробы, содержащей фрагменты поверхностных белков, обессоливание и/или концентрирование не проводиться.
В случае использования трипсина для снятия клеток прикрепленной культуры с подложки при получении клеточного препарата, необходимо перед анализом провести дополнительное инкубирование клеток в соответствующих условиях 18-20 часов для репарации клетками поверхностных белков. В других вариантах реализации изобретения используют для формирования характеристической совокупности масс не появление той или иной массы фрагмента поверхностного белка, а изменение его интенсивности в масс-спектре, что соответствует изменению его концентрации в анализируемой пробе. В других вариантах реализации изобретения используется любая подходящая математическая обработка измеренных масс белковых фрагментов, позволяющая корректно классифицировать клеточный материал по интересующим свойствам, к примеру, применив регрессионный анализ, к-mеапs кластеризацию, нейросети, PCA, SVM, SOM, и т.д., а также их комбинации. Патентуемый способ может применяться к любым типам клеточных препаратов, в частности к суспензии клеток, смешанным культурам, органотипным культурам и клеточным агрегатам (гранулы, сфероиды), а также к свежевыделенным клеткам и тканевым фрагментам.
Пример 2. НА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА
Далее изобретение поясняется вторым примером оценки качества культуры опухолевых клеток рака толстого кишечника человека на предмет пригодности использования их для противоопухолевой вакцинации. Выделенные из опухоли больного, культивируемые и впоследствии используемые для противоопухолевой вакцинации клетки, должны быть идентичны опухолевым клеткам больного. Однако культивирование клеток существенно искажает фенотип первичной культуры по причине невозможности искусственного воссоздания iп vitrо условий, при которых опухолевые клетки росли в организме больного. Таким образом, качество используемых для вакцинации культивированных опухолевых клеток подлежит обязательному контролю и выражается в степени их соответствия клеткам опухоли больного. Протокол установления подобного соответствия представлен ниже.
1. Из флакона с культивируемыми опухолевыми клетками удаляют ростовую среду и трижды промывают клетки 0,9%-ым раствором хлорида натрия или фосфатным буфером силана, используя каждый раз объем равный не менее половины объема заливаемой в культуральный флакон ростовой среды. В результате промывки клеток должны быть удалены следы сыворотки, содержащейся в ростовой среде. 2. К клеткам добавляют 0,0001% раствор трипсина (активность -3000 Ед/мг), используя 1 мл р-ра на один 25 см2 поверхности культурального флакона.
3. Инкубируют флакон при 370C. Между 5-ой и 7-ой минутами инкубации отбирают из флакона раствор, содержащий отщепленные от клеток фрагменты поверхностных белков. Опухолевые клетки в момент отбора раствора должны быть прикреплены к дну культурального флакона. Если под воздействием трипсина часть клеток открепилась и стала свободно плавать, то ростовую среду надо отцентрифугировать при 400 g в течение 5 мин и использовать супернатант свободный от примеси клеток. 4. Для инактивации остатков трипсина в культуральном флаконе добавляют свежеприготовленную культуральную среду, содержащую фетальную бычью сыворотку и продолжают культивирование клеток при 370C и 5% CO2.
5. Раствор, полученный в пункте NаЗ анализируют масс-спектрометрически и сравнивают со спектром полученным аналогичным образом (пп. 1-4), но ранее для свежевыделенных опухолевых клеток.
Масс-спектрометрический анализ проводят по протоколу масс-спектрометрии гликозилированных пептидов (Таjiri M. еt аl., "Diffеrепtiаl апаlуsis оf sitе-sресifiс glусапs on рlаsmа апd сеllulаr fibrопесtiпs: аррliсаtiоп оf а hуdrорhiliс аffiпitу mеthоd fоr glусорерtidе епriсhmепt", Glусоbiоlоgу, 2005, v.15, 1332-1340). Это объясняется с одной стороны тем, что внеклеточные фрагменты белков, как правило, гликозилированы, с другой стороны, именно гликозилированные фрагменты поверхностных белков опухолевых клеток наиболее иммуногены и являются вероятными антигенами вакцины (см., например, Franco A., "СТL-Ваsеd сапсеr Рrеvепtivе/Тhеrареutiс Vассiпеs fоr Саrсiпоmаs: RoIe оf Тumоur-Аssосiаtеd Саrbоhуdrаtе Апtigепs", Sсапd. J. Immuпоl., 2005, v.61, 391-397).
140 мкл анализируемого раствора фрагментов поверхностных белков смешивают со 140 мкл этанола, 720 мкл бутанола и добавляют 15 мкл сефарозы CL4B. Инкубируют при медленном перемешивании 45 мин. После инкубации сефарозу дважды промывают раствором с тем же содержанием спирта и бутанола и инкубируют 30 мин в 50%-oм растворе этанола. Раствор этанола отбирают от сефарозы и высушивают на роторном испарителе. Полученный осадок растворяют в 10 мкл воды и анализируют времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрией. 2 мкл анализируемого раствора смешивают на масс-спектрометрической мишени в соотношении 1:1 с насыщенным раствором 2,5-диrидpoкcибeнзoйнoй кислоты, содержащей 50% ацетонитрила и 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученные на мишени капли проб высушивают на воздухе и проводят масс-спектрометрический анализ в диапазоне масс пептидов от 1000 до 4000 Да.
Согласно полученным данным, при повторном (контрольном) масс- спектрометрическом анализе культуры клеток воспроизводится не менее 95% масс фрагментов белков, что можно считать критерием идентичности двух сравниваемых клеточных препаратов. Предлагается оценивать пригодность клеточного препарата для вакцинации больного на основе идентичности не менее 90% общих масс фрагментов белков у анализируемых клеток и свежевыделенных опухолевых клеток донора.
На фиг. ЗА показан времяпролетный спектр белковых фрагментов и соответствующий футпринт, полученные согласно второму варианту реализации изобретения со свежевыделенных опухолевых клеток рака толстого кишечника человека. На фиг. ЗБ показан масс-спектр и соответствующий футпринт тех же самых клеток, размноженных культивированием (1-ый пассаж) и пригодных для противоопухолевой вакцинации. Снятый с них спектр идентичен исходному спектру, полученному со свежевыделенных опухолевых клеток. На фиг. ЗВ представлен масс- спектр тех же самых клеток, размноженных культивированием (2-ой пассаж), но уже не пригодных для противоопухолевой вакцинации. В процессе культивирования произошли существенные изменения в поверхностных белках клеток (см., например, область 1800-2000 Да футпринта на фиг. ЗВ), что позволило считать их неидентичными клеткам исходной опухоли донора.
В случае использования протеазы для диссоциации ткани опухоли, с целью высвобождения опухолевых клеток, необходимо проводить масс-спектрометрический анализ для получения образца футпринта исходной (неизмененной) культуры клеток не раньше чем через сутки после инициации опухолевой культуры, чтобы клетки успели восстановить поврежденные при выделении поверхностные белки. Совокупность масс фрагментов поверхностных белков является своеобразным
"штрих-кодом", т.е. показателем, наиболее объективно характеризующим клетки.
Поэтому контроль наличия качественных характеристик у исследуемой клеточной культуры путем сравнения совокупности полученных масс фрагментов поверхностных белков ее клеток с совокупностью масс-спектрометрически определенных масс фрагментов поверхностных белков живых клеток с известными качественными характеристиками дает возможность наиболее точно произвести отбор качественных (с ожидаемыми полезными свойствами) клеток.
Применение при реализации способа масс-спектрометрического анализа позволяет определять качество клеточной культуры достаточно быстро - в течение не более 2-х часов. Это позволит использовать его для оценки качества готовых клеточных препаратов перед их применением, учитывая малый срок их годности с момента изготовления (несколько часов).
Кроме этого полученные масс-спектры могут быть преобразованы с возможностью численного выражения результатов анализа, что необходимо для реализации стандарта GMP5 исключающего человеческий фактор при проведении оценки качества культуры клеток, и позволит обеспечить необходимую объективность результатов.
Точность определения наличия качественных характеристик у исследуемой культуры клеток при реализации патентуемого способа обеспечивается также за счет использования живых клеток исследуемой клеточной культуры, которые подвергают витальному воздействию протеазы. Клетки при обработке витальным воздействием протеазы не погибают, что дает возможность избежать загрязнения анализируемых проб мажорными белками цитоплазмы клетки и значительно уменьшить расход клеточного материала при анализе культуры клеток.
Загрязнения анализируемых проб позволяет избежать также предварительная промывка клеток, которая необходима для удаления следов сыворотки, содержащейся в ростовой среде.
Промышленная применимость
Таким образом, патентуемый способ позволяет охарактеризовать клетки по наиболее актуальным, в том числе и для клеточной трансплантологии, поверхностным белкам.

Claims

Формула изобретения
1. Способ определения качества клеточной культуры, включающий масс- спектрометрический анализ поверхностных клеточных белков, отличающийся тем, что предварительно промытые живые клетки исследуемой клеточной культуры подвергают витальному воздействию протеазы, отбирают отщепленные фрагменты поверхностных белков и масс-спектрометрически определяют их массы, контролируют наличие качественных характеристик у исследуемой культуры клеток путем сравнения совокупности полученных масс с совокупностью масс- спектрометрически определенных масс фрагментов поверхностных белков живых клеток с известными качественными характеристиками.
2. Способ по п.l, отличающийся тем, что в качестве протеазы используют трипсин.
3. Способ по п.l, отличающийся тем, контролируют наличие качественных характеристик, определяющих источник клеток.
4. Способ по п.l, отличающийся тем, что контролируют наличие качественных характеристик, определяющих пригодность для проведения противоопухолевой иммунотерапии.
5. Способ по п.l, отличающийся тем, что контролируют наличие качественных характеристик, свидетельствующих об отсутствии изменений фенотипа клеток исследуемой клеточной культуры в процессе культивирования.
6. Способ по п.l, отличающийся тем, что в качестве живых клеток с известными качественными характеристиками используют первичную культуру клеток.
7. Способ по п.l, отличающийся тем, что в качестве живых клеток с известными качественными характеристиками используют клетки, не претерпевшие изменений в фенотипе.
8. Способ по п.l, отличающийся тем, что отщепленные фрагменты поверхностных белков перед масс-спектрометрическим анализом дегликозилируют.
PCT/RU2007/000571 2007-04-06 2007-10-16 Procédé pour tester la qualité d'une culture de cellules Ceased WO2008123793A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200700942 2007-04-06
EA200700942A EA009326B1 (ru) 2007-04-06 2007-04-06 Способ определения качества клеточной культуры

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008123793A1 true WO2008123793A1 (fr) 2008-10-16

Family

ID=39831177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2007/000571 Ceased WO2008123793A1 (fr) 2007-04-06 2007-10-16 Procédé pour tester la qualité d'une culture de cellules

Country Status (2)

Country Link
EA (1) EA009326B1 (ru)
WO (1) WO2008123793A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12366580B2 (en) 2018-09-11 2025-07-22 Juno Therapeutics, Inc. Methods for mass spectrometry analysis of engineered cell compositions
US12379375B2 (en) 2017-04-14 2025-08-05 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing cell surface glycosylation

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2670001C1 (ru) * 2017-12-25 2018-10-17 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук Способ получения белков клеточной поверхности

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU944580A1 (ru) * 1980-02-07 1982-07-23 Кировский научно-исследовательский институт переливания крови Способ получени поверхностного антигена гепатита В
WO2003025565A2 (en) * 2001-09-21 2003-03-27 Caprion Pharmaceuticals Inc. Preparation of highly-purified plasma membranes
US6861234B1 (en) * 2000-04-28 2005-03-01 Mannkind Corporation Method of epitope discovery
KR20060015604A (ko) * 2003-05-13 2006-02-17 모노퀀트 피티와이 리미티드 Ｔ-세포 수용체 ｖ/ｄ/ｊ 유전자 내의 반복 서열에 의한클론 세포의 확인 방법
WO2006051405A2 (en) * 2004-11-12 2006-05-18 Cambridge University Technical Services Ltd. Methods and means related to cancer stem cells

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100622203B1 (ko) * 1997-07-23 2006-09-07 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 생성시키는 사람 세포주를 확인하는 방법
JP2001249125A (ja) * 2000-03-06 2001-09-14 Suntory Ltd 組織または細胞における物質分析のための方法
US7164552B2 (en) * 2003-09-29 2007-01-16 Hitachi Global Storage Technologies Netherlands B.V. Method for self-servo writing a disk drive with dual-stage actuator

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU944580A1 (ru) * 1980-02-07 1982-07-23 Кировский научно-исследовательский институт переливания крови Способ получени поверхностного антигена гепатита В
US6861234B1 (en) * 2000-04-28 2005-03-01 Mannkind Corporation Method of epitope discovery
WO2003025565A2 (en) * 2001-09-21 2003-03-27 Caprion Pharmaceuticals Inc. Preparation of highly-purified plasma membranes
KR20060015604A (ko) * 2003-05-13 2006-02-17 모노퀀트 피티와이 리미티드 Ｔ-세포 수용체 ｖ/ｄ/ｊ 유전자 내의 반복 서열에 의한클론 세포의 확인 방법
WO2006051405A2 (en) * 2004-11-12 2006-05-18 Cambridge University Technical Services Ltd. Methods and means related to cancer stem cells

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12379375B2 (en) 2017-04-14 2025-08-05 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing cell surface glycosylation
US12366580B2 (en) 2018-09-11 2025-07-22 Juno Therapeutics, Inc. Methods for mass spectrometry analysis of engineered cell compositions

Also Published As

Publication number Publication date
EA200700942A1 (ru) 2007-12-28
EA009326B1 (ru) 2007-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Notaras et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids
CN108707604B (zh) 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行CNE10基因敲除
Deng et al. Quantitative comparison of proteomes using SILAC
Baharvand et al. Concise review: trends in stem cell proteomics
Maurer et al. Comprehensive proteome expression profiling of undifferentiated versus differentiated neural stem cells from adult rat hippocampus
Nagano et al. Cell surface biomarkers of embryonic stem cells
WO2017117547A1 (en) Methods for generating neural tissue and uses thereof
CN109682978B (zh) 一种肿瘤突变肽mhc亲和力预测方法及其应用
Bertucci et al. Improved protocol for reproducible human cortical organoids reveals early alterations in metabolism with MAPT mutations
Meyfour et al. The quest of cell surface markers for stem cell therapy
WO2008123793A1 (fr) Procédé pour tester la qualité d'une culture de cellules
Ali et al. Generation and proteome profiling of PBMC-originated, iPSC-derived lentoid bodies
Gundry et al. A novel role for proteomics in the discovery of cell‐surface markers on stem cells: Scratching the surface
WO2017158610A9 (en) Methods of isolating barrel-like proteases and identifying peptides processed thereby
Ahn et al. Stem cell markers: insights from membrane proteomics?
Danačíková et al. In vitro human cell culture models in a bench‐to‐bedside approach to epilepsy
Hathout et al. Metabolic labeling of human primary retinal pigment epithelial cells for accurate comparative proteomics
Cooper et al. Characterization and criteria of embryonic stem and induced pluripotent stem cells for a dopamine replacement therapy
López et al. Protein expression profiling analysis in hematopoietic stem cells: phenotypic characterization of mesenchymal stem cells
Lazarević et al. Influence of chemical fixation process on primary mesenchymal stem cells evidenced by Raman spectroscopy
US11981930B2 (en) Supercentenarian induced pluripotent stem (sciPS) cells and methods of making and using thereof
US20250092438A1 (en) Method for the identification of the whole sequence of the variable region of the heavy and light chains of immunoglobulins
Colpo et al. Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Technology: Potential Targets for Depression
Petelski Quantifying Protein Modulation in Mammalian Development and Ribosome Specialization Using Mass Spectrometry
Lokhov et al. Cell Proteomic Footprint

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07852027

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07852027

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1