EA009326B1 - Способ определения качества клеточной культуры - Google Patents
Способ определения качества клеточной культуры Download PDFInfo
- Publication number
- EA009326B1 EA009326B1 EA200700942A EA200700942A EA009326B1 EA 009326 B1 EA009326 B1 EA 009326B1 EA 200700942 A EA200700942 A EA 200700942A EA 200700942 A EA200700942 A EA 200700942A EA 009326 B1 EA009326 B1 EA 009326B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- cell
- cell culture
- qualitative characteristics
- analysis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title abstract description 13
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 26
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 15
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 18
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 13
- 238000011398 antitumor immunotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 130
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 25
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 9
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 9
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000000448 cultured tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000005085 air analysis Methods 0.000 description 2
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000007417 hierarchical cluster analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 101100495328 Mus musculus Cdk7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 108010036066 hemoglobin AA Proteins 0.000 description 1
- 210000004124 hock Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000694 mesotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001303 quality assessment method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области клеточных технологий, а именно к анализу культивируемых in vitro клеток, и может быть использовано в биотехнологии, косметологии, медицине (клеточной трансплантологии), для получения охарактеризованного клеточного материала, обладающего лечебными или косметологическими свойствами. Способ определения качества клеточной культуры включает масс-спектрометрический анализ поверхностных клеточных белков. Предварительно промытые живые клетки исследуемой клеточной культуры подвергают витальному воздействию протеазы, отбирают отщепленные фрагменты поверхностных белков и масс-спектрометрически определяют их массы. Контролируют наличие качественных характеристик у исследуемой культуры клеток путем сравнения совокупности полученных масс с совокупностью масс-спектрометрически определенных масс фрагментов поверхностных белков живых клеток с известными качественными характеристиками. Технический результат, достигаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в повышении объективности (точности) идентификации культивируемых in vitro клеток для отбора качественных (с ожидаемыми полезными свойствами) клеток при снижении временных и материальных затрат.
Description
Изобретение относится к области клеточных технологий, а именно к анализу культивируемых ίη νίίτο клеток и может быть использовано в биотехнологии, косметологии, медицине (клеточной трансплантологии), для получения охарактеризованного клеточного материала, обладающего лечебными или косметологическими свойствами.
Проблема анализа клеточного материала, а именно контроля изменчивости, является актуальной задачей во всех областях, где применяются культивируемые клетки. Так, эксперименты на клеточных культурах являются неотъемлемой частью исследований в биологии и медицине. На клеточных моделях исследуют такие биологические процессы, как апоптоз, дифференцировка, онкологическая трансформация клеток, изучают многие аспекты метаболизма, выявляют механизмы действия лекарств и т.д. Последние достижения клеточных технологий позволяют использовать культивируемые клетки в качестве лекарственных препаратов, перспективных, по мнению многих ученых, в лечении многих ранее неизлечимых болезней (Теткк1кй Α.ν. е1 а1., Матшайап к1ет се11к, РеЛай. Рек., 2006, ν. 59, 13-20).
Однако фенотип культивируемых клеток изменчив. Перенос клеток из физиологичных условий ίη νίνο в культуральные флаконы приводит к стрессу клеток и существенной перестройке их метаболизма. Причина тому - невозможность воссоздания в пробирке естественной для клеток среды обитания ^пдй νΗ., 8йау IV., Н1к1опса1 с1а1тк апб сиггеп1 1п(егрге1а11оп5 ой герНса(1ме адтд, №11. Вю1есйпо1., 2002, ν. 20, 682-688; СегкНоп Н., СегкНоп Ό., Сг111са1 аккекктеп! о£ рагаб1дтк ίη адтд текеатсй, Ехр. Сегоп1о1., 2001, ν. 36, 1035-1047), что ведет к изменению в экспрессии генов (Сатрт 1., РерНсаЛ'е кепексепсе апб 1ттойа11ха1юп, ίη: §1е1п С.8., Вакегда Α., Сюгбапо Α., ЭепНагб! Ό.Τ. (ебк.). ТНе Мо1еси1аг Вак1к о£ Се11 Сус1е апб Сго\\Л Соп1го1, νί^-Εί^, №е\т Уотк, 1999, рр. 348-373; Сг1к1оГа1о ν.1. еί а1., Лде-берепбеп! тобйюакопк о£ депе ехртеккюп ίη Нитап йЬгоЬ1ак1к, СгН. Рет. Еикатуойс Сепе Ехртеккюп, 1998, ν. 8, 43- 80);
активации лизосомальных гидролаз (ВаутеиЛет К. еί а1., Нитап ккт Г1ЬгоЬ1ак1к ίη νίίΐΌ б1ГГегеп(1а1е а1опд а 1етт1па1 се11 йпеаде, Ргос. №а11. Асаб. δα. ϋ8Α, 1988, ν. 85, 5112-5116);
деградации гормонзависимого метаболизма, сдвигам в изоферментном составе (СгаЬЬ Ό.ν., Роерке 1., Ьокк ой дго\\Й1 Ногшопе-берепбеп! сйагас1ег1к(1ск ой га1Нера1осу1ек ίη си11иге, Ιη νίΙΐΌ Се11 Оег. Вю1., 1987, ν. 23, 303-307; Роерке 1.Е., СгаЬЬ Ό.ν., Ьокк ой кехиа1 бййетепйакоп ой га( Нера1осу1ек ίη кНогНегш си11иге, Л1сοНο1 ΑΡ^Μ 8ирр1., 1987, ν. 1, 263-264);
изменениям в синтезе глутатиона (Рететк 1.1.1т. еί а1., Эер1е11оп ой се11и1аг д1и1аЛюпе Ьу сопбйюпк икеб йог Ле раккадшд ой абНегеп! сийитеб се11к, Тохюо1. Ьей., 2000, ν. 115, 153-163);
потере в процессе культивирования экстрацеллюлярных белков и деградации рецепторного аппарата (Ниддшк IV. еί а1., Мо1еси1аг сНапдек ίη се11 кигйасе тетЬгапек геки111пд йот ЦуркНихайоп ой кагсота 180 Лтог се11к, ВюсЫт. ВюрНук. ΑοΕ, 1976, ν. 426, 630-637);
повышению в клетках с каждым пассированием активности теломеразы и укорочению теломеров (Вобпаг ΑΌ. еί а1., Ех1епкюп ой 1йе-крап Ьу тйобископ ой 1е1отегаке 1п(о погта1 Нитап се11к, 8аепсе, 1998, ν. 279, 349-352), что, в конечном счете, приводит к неспособности клеток пролиферировать (Науйюк Ь., МооЛеаб Р.8., ТНе кепа1 сиИАайоп ой Нитап б1р1о1б се11 кйатк, Ехр. Се11 Рек., 1961, ν. 25, 585-621);
потере комплекса гистосовместимости (СоШпк Т. е1 а1., Ьокк ой ΗΕΑ ίη си11ите, Ргос. №111. Αсаб. δα. υδΑ, 1986, ν. 83, 446-450; Αηдик Р., е1 а1., Ехртеккюп ой та) о г Ык1осотра11ЬЛ1у сотр1ех (МНС) апйдепк апб Лей 1окк оп си11иге ίη гепа1 сагстота, Еиг. 1. Сапсег, 1993, ν. 29, 2158-2160).
Таким образом, ίη ν йго клетки подвержены морфофункциональной дегенерации, ведущей к их гибели. Более того, действующие ίη νίίΐΌ дестабилизирующие условия и естественный отбор клеточного материала приводят к возникновению спектра отличающихся друг от друга популяций клеток.
В медицинских клеточных технологиях вопрос изменчивости клеточных культур стоит наиболее остро. Возьмем, к примеру, создание противоопухолевых вакцин на основе культивируемых опухолевых клеток пациента. При культивировании существенно искажается антигенный фенотип клеток ^пд^ Р., е1 а1., Ехртеккюп ой ша)ог ЫкЮсотрайЬПНу сотр1ех (МНС) апйдепк апб Лей 1окк оп си11иге ίη гепа1 сагстота, Еиг. 1. Сапсег, 1993, ν. 29, 2158-2160; №апсНаНа1 1. е1 а1., Си11игеб сотрокйе ккт дгайк: Ью1одюа1 ккт ес.|ийа1еп1к рептШпд таккйе ехрапкюп, Ьапсе1, 1989, ν. 22, 191-193), что ведет к несовпадению антигенов вакцины и опухоли. Вероятно, именно с этим связан тот факт, что в большинстве проведенных в последнее десятилетие рандомизированных исследований таких вакцин не было получено очевидной противоопухолевой активности (ЕЬНег Р.1. е1 а1., Αб^иνаη1 1ттипоЛетару ог сйетоЛетару йог тайдпап1 те1апота, Ргейттату герой ой Ле №Шопа1 Сапсег 1пкЛи1е гапботпхеб сйшса1 1па1. 8итд. Сйп. №отЛ Αт., 1981, ν. 61, 1267-1277; Мйсйе11 М.8., РегкресЛ'е оп а11одепею те1апота 1ука1ек ίη асЛ'е кресйю 1ттипоЛегару, 8етт. Опсо1., 1998, ν. 25, 623-635).
Не менее актуален вопрос изменчивости клеток при использовании клеточных трансплантатов, полученных путем размножения клеток самого пациента. В частности, известны способы лечения аутологичными фибробластами (см., например, Биотрансплантат и способ коррекции дефектов мягких тканей, способ получения биотрансплантата, заявка: 2005127087/15, опубл. 20.08.2006, МПК А61К35/36; А61К35/36, а также ν09840027, опубл. 17.09.1998, МПК Α61Ε2/10; Α61Ε27/24; Α61Ε27/38; С12№5/00; υδ5660850, опубл. 26.08.1997, МПК С12№5/06; Α61Ε2/00). Изменение в процессе культивирования анти
- 1 009326 генов (СоШп8 Т. е! а1., Ьокк оГ НЬЛ ίη сийиге, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 1986, ν. 83, 446-450) или, например, утрата возможности пролиферировать (НауПюк Ь., Моогйеаб Р.8., Тйе кепа1 сиИВайоп оГ йитап б1р1о1б се11 кйшпк, Ехр. Се11 Кек., 1961, ν. 25, 585-621) делает подобные биотрансплантанты бессмысленными, а, возможно, и вредными.
Таким образом, культивированные клетки, используемые в медицинских и косметологических препаратах, должны в обязательном порядке подвергаться качественному анализу.
Сегодня к оценке качества культивируемых клеток относят способы, направленные на выявление контаминаций, определение количества живых клеток, их тканевой принадлежности, выявление кроссконтаминаций (загрязнение клетками другого вида), а также абсолютную их идентификацию.
Существуют различные методы обнаружения контаминаций клеточных препаратов микоплазмой, грибами и вирусами. Данные способы позволяют характеризовать качество клеточного препарата, но не характеризуют качество самих клеток препарата.
Существуют различные методы оценки качества культуры, основанные на исключении красителя живыми клетками, эффективности клонирования и пролиферации в массовой культуре (Хэй Р. Сохранение и оценка качества клеток, в кн.: Культура животных клеток, под ред. З. Фрешни, М.: Мир, 1989, с. 108-164). Данные методы позволяют только определять процент живых клеток в клеточном препарате и их жизнеспособность, но не дают представления о качественных (специальных) характеристиках самих клеток.
Известны различные способы определения тканевой принадлежности клеточных линий, а именно основанные на тонком структурном анализе клеток с помощью электронного микроскопа; иммунологическом тесте белков цитоскелета (Катаекегк Е.С.8. е! а1., Со1б 8рппд НагЬог 8утр. Оиап1. Вю1, 1982, ν. 46, 331); выявлении тканеспецифических антигенов (№)\ге1бе Р.1. апб Ми1бег КЕР., 'Тбепййсайоп оГ ок!еосу!ек ίη ок!еоЬ1ак!-11ке се11 си1!игек иктд а топос1опа1 апбйобу крес1Пса11у бйес!еб адатк! ок!еосу!ек, 1986, ν. 84, 342-347); биохимическом тестировании специфических функций клеток (применим для клеток со специфическими функциями, см., например, Нау К.1. е! а1., Атепсап Туре Си1!ше Со11ес!юп Са!а1одие I I, 4'1' ебп., 1983, ВоскуШе, МО, р. 12), количественной оценке иммунологических продуктов (применим для идентификации гибридом).
Недостатком тестов на тканеспецифичность при оценке клеточных препаратов является невозможность определить источник клеток. В частности, фибробласты, применяемые в клеточных препаратах, могут быть как фетального (эмбрионального) происхождения, так и выделенными из тканей взрослого человека, например из кожи или жировой клетчатки (адипогенные фибробласты). Таким образом, фибробласты, полученные из различных источников, хоть и относятся к одному типу ткани, обладают различными полезными качествами.
В настоящее время известно несколько способов выявления кроссконтаминаций и идентификации клеточных культур.
Известен метод непрямой окраски клеток флуоресцентно-мечеными антителами. Данный способ позволяет верифицировать культуру клеток, определить кроссконтаминацию, установить изменчивость по определенным антигенам (8!и1Ьегд С.8. ш: Соп!атта!юп т Т1ккиге Си1!иге, Еодй 1. (еб.), Асабетю Ргекк, 1973, Ьопбоп апб №\ν Уогк, р. 1). Недостатком данного способа является необходимость предварительного получения видоспецифических антител для конкретной культуры, которые получают путем иммунизации животного тестируемыми клетками. Метод не может характеризовать утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования.
Известен метод, основанный на анализе изоферментного состава. Показано, что определение изоформ семи ферментов с помощью электрофореза достоверно позволяет определить принадлежность клеток человеку (О'Впеп 8.1. е! а1., Епхуте ро1утогрЫктк ак депейс к1дпа!игек т йитап се11 сийигек, 8с1епсе, 1977, ν. 195, 1345-1348). Недостатком данного метода является длительность его исполнения (электрофорез идет 16-18 ч) и применимость только для выявления межвидовых кроссконтаминаций. Метод не может характеризовать утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования.
Известен цитогенетический (кариологический) способ оценки наличия примесей других типов клеток в культуре. Метод основан на том, что хромосомные наборы могут значительно отличаться у клеток разных видов, что можно обнаружить с помощью микроскопа. Однако при наличии загрязнения клетками близкородственного вида анализ резко усложняется (применяется С-сегментирование, см., например, 8еаЬйдй! М., А гар1б Ьапбшд 1есйпк.|ие Гог йитап сйготокотек, Ьапсе!, 1971, ν.2, 971-972). Метод позволяет выявлять только межвидовую кроссконтаминацию и не может установить утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования.
Известен иммунологический тест на антигены группы крови (Нау К.1. 1п: Магкегк оГ Со1ошс Се11 ПгГГегепйайоп, \Уо1тап 8.К., Макйотайпо А.1. (ебк.), 1984, Катеп Ргекк, №\ν Уогк, р. 3) и антигены гистосовместимости (Ро11аск М.8. е! а1., НЬА-А, В, С апб ΌΚ айоапйдеп ехргеккюп оп Гойу-кгх сийшеб йитап !итог се11 йпек, 1. №11. Сапсег 1пк!., 1981, ν. 66, 1003-1012). Недостатком данного метода является частичное или полное отсутствие экспрессии этих антигенов у некоторых клеточных культур.
Известно использование полимеразной цепной реакции и ДНК секвенирования (Ьт М.У. е! а1, 'Тбепййсайоп апб аи!йепйсайоп оГ атта1 се11 сийиге Ьу ро1утегаке сйат геасйоп атрййсайоп апб ΩΝΛ
- 2 009326
5сс.|испстд. Ιη Уйго Се11и1аг & Осус1ортсп1а1 Вю1оду - Лшта1, 2003, ν. 39, 424-427; Рагоб1 В. е1 а1., Зреаек ίάοηΐίΠοαΙίοη апб сопйгтайоп ок йитап апб атта1 се11 йпек: а РСК-Ьакеб шс!йо6, Вю!есйшдиек, 2002, ν. 32, 432-434, 436, 438-440). Недостатком метода является применимость к клеточным линиям неблизкородственных видов, а также длительность исполнения, т.к. он требует проведение электрофореза. Метод не может характеризовать утрату полезных свойств клетками в процессе культивирования.
Известен ДНК фингерпринтинг (см., например, И82005123947, опубл. 09.06.2005; ^02005116257, опубл. 08.12.2005; И82006035261, опубл. 16.02.2006). ДНК фрагментируется рестриктазой, и полученные фрагменты ДНК отличаются по размеру и в совокупности формируют уникальный профиль, позволяющий идентифицировать источник происхождения ДНК. Подобный подход широко используется для идентификации клеточного материала. Для ДНК фингерпринтинга наиболее широко используют полиморфизм длины фрагментов рестрикции (КЕБР) (см., например, Кап1ет Е. е1 а1., Апа1укк ок ге81г1с(1оп ГгадтеШ 1епд!й роКтогрЫктк щ беохупЬописШс ас1б (ΌΝΑ) гесомегеб кгот бпеб Ь1ообк!атк, 1. Еогепкю 8с1, 1986, ν. 31, 403-408), вариабельные нуклеотидные тандемные повторы (ΥΝΤΚ8) (ВибоМе В. е1 а1., Апа1укк ок !йе ΥΝΤΡ 1осик Ό1880 Ьу 1йе РСК. Го11о\ус6 Ьу йщй-гекойПюп РАСЕ, Ат. 1. Нит. Сепе!., 1991, ν. 48, 137-144) или микросателлиты (1еккгеук АД. е! а1., НуретуапаЫе 'т1шка!е1й!е' теДопк ш йитап ΌΝΑ, №!иге, 1985, ν. 314, 67-73). За исключением монозиготных близнецов, подобный метод позволяет точно идентифицировать принадлежность клеточного материала индивидууму. Однако метод никак не характеризует изменение качества клеточной культуры в процессе культивирования.
Известен двумерный белковый электрофорез, позволяющий выявить до 2 тысяч белков (Апбегкоп Ν.Ο., Апбегкоп Ν.Ε., Т\теЩу уеагк ок 1\уо-бнпепкюпа1 е1ес!горйогек1к: рак!, ргекеп! апб ки!иге, Е1ес1горйогек1к, 1996, ν. 17, 443-453). Недостатком данного способа является сложность исполнения. Способ требует последовательного проведения двух электрофоретических разделений белков, в связи с чем не применяется в качестве рутинного метода для оценки качества культур клеток. Более того, двумерный белковый электрофорез не характеризует наиболее актуальную для клеточной терапии фракцию поверхностных антигенов клеток, ввиду того, что данным способом не анализируют мембранные белки.
Известно применение масс-спектрометрии для идентификации клеточных культур (2йапд X. е! а1., 1беп11Дса!юп ок Матшайап Се11 Ыпек иктд МАБО1-Т0Р апб ЬС-Е81-М8/М8 Макк 8рес1готе1ту, 1. Ат. 8ос. Макк 8рес!гот., 2006, ν. 17, 490-499). Быстрый и относительно простой метод профилирования белков клеток описан для клеток млекопитающих при непосредственном анализе времяпролетной (МАБН1 Τ0Ε) и других видов масс-спектрометрии. Используя МАБН1 масс-спектры как уникальный фингерпринт, можно дифференцировать клеточные линии млекопитающих.
Недостатком данного подхода является низкая специфичность, обуславливаемая присутствием в анализируемой пробе множества цитозольных (внутриклеточных) белков, чьи фрагменты, как правило, в массе своей не специфичны для типов клеток, засоряют масс-спектры и не позволяют провести чувствительный анализ и охарактеризовать клетки по наиболее актуальным для клеточной трансплантологии мембранным белкам.
Из патента \УО2006115426 (Способ регулирования биохимических процессов и устройство для его осуществления, опубл. 02.11.2006, МПК С01К23/16; С12М3/00; 02Ν1/00) известен способ оценки качества культивирования клеточных культур на основе регистрации временных интервалов состояний клеток рост-размножение и накопление-мутация, в котором границы интервалов определяются радиосигналами в среднечастотном и низкочастотном диапазонах. Недостатком данного способа является необходимость применения специального оборудования, а также возможность определения параметров только в результате постоянного мониторирования роста клеток, что не применимо к оценке качества готовых клеточных препаратов.
Известен способ оценки свойств культуры клеток нейронов (см. патент И82004106101, опубл. 03.06.2004, МПК Ο01Ν33/487; С06Д10/00; Ο01Ν33/487) на основе измерения электрической активности клеток путем выращивания их на микроэлектродном чипе. Данный способ относится только к культуре нейронных клеток и не распространяется на другие клеточные культуры. Также известен способ сертификации культуры клеток хондроцитов (см. патент ^002095399, опубл. 28.11.2002, МПК С12Ц1/42; 001Ν33/50; Ο01Ν33/68). Недостатком данного способа является применимость его только в регенеративной терапии хрящевых тканей.
Известен способ определения качества клеточной культуры, включающий масс-спектрометрический анализ органических молекул клеток. Известный способ предусматривает применение масс-спектрометров, измеряющих массы молекул с высокой точностью за счет применения ионно-циклотронного резонанса, что позволяет увеличивать количество информации, получаемой с проб клеток (И86974702, опубл. 02.06.2005, МПК 601Ν27/62; 601Ν33/15; 601Ν33/483).
Недостатком данного метода является, с одной стороны, загрязненность получаемых спектров неинформативными цитозольными белками и другими биополимерами, т.к. для анализа используют целые клетки, и, во вторых, использование определенного и дорогостоящего масс-спектрометра, позволяющего с высокой точностью определять массы молекул. В связи с этим данный подход не получил распространение в качестве рутинного метода анализа качества культур.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ, основанный на масс-спект
- 3 009326 рометрическом анализе именно поверхностных белков клеток, раскрытый в патенте РтератаДоп о£ ЫдЫу-рипйеб р1акта тетЬгапек (№003025565, опубл. 27.03.2003, МПК-7 Ο01Ν27/62; С07К1/22; С07К16/28), в котором описан способ определения качества клеточной культуры, включающий массспектрометрический анализ предварительного выделенных мембранных белков.
Недостатком данного способа является необходимость использования специфичных для мембранных белков антител или их антигенсвязывающих фрагментов для формирования комплексов с белками мембраны для последующего их выделения и очистки. Подобная многостадийность не позволяет применять данный подход в качестве рутинного метода анализа качества культивируемых клеток.
В настоящем изобретении была поставлена задача разработки нового способа определения качества клеточной культуры, ориентированного на анализ клеточных препаратов, отличительными чертами которого являются быстрота исполнения (не более 2 ч), что позволит использовать его для оценки качества готовых клеточных препаратов перед их применением, учитывая малый срок их годности с момента изготовления (несколько часов);
чувствительность, позволяющая определять потерю качества клетками в процессе культивирования;
чувствительность, позволяющая дифференцировать морфофункционально идентичные клетки от одного донора, но обладающие при применении различными полезными свойствами;
ориентация на анализ поверхностных белков клеток, определение сохранности которых в процессе культивирования наиболее актуально;
интегрируемость в культивирование клеток, что подразумевает отсутствие специального оборудования и сложных манипуляций для подготовки проб для анализа;
относительная дешевизна, чтобы цена анализа была несопоставимо меньше стоимости клеточного препарата;
минимальное или отсутствие потребления клеток, что позволит многократно проводить анализ культивируемых клеток без их расхода;
возможность численного выражения результатов анализа, что необходимо для реализации стандарта ОМР, исключающего человеческий фактор при проведении оценки качества культуры клеток.
Технический результат, достигаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в повышении объективности (точности) идентификации культивируемых ίη νίΐτο клеток для отбора качественных (с ожидаемыми полезными свойствами) клеток при снижении временных и материальных затрат.
Указанный технический результат обеспечивается при реализации способа определения качества клеточной культуры, включающего масс-спектрометрический анализ поверхностных клеточных белков. Согласно настоящему изобретению предварительно промытые живые клетки исследуемой клеточной культуры подвергают витальному воздействию протеазы, отбирают отщепленные фрагменты поверхностных белков и масс-спектрометрически определяют их массы, контролируют наличие качественных характеристик у исследуемой культуры клеток путем сравнения совокупности полученных масс с совокупностью масс-спектрометрически определенных масс фрагментов поверхностных белков живых клеток с известными качественными характеристиками.
В предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве протеазы используют трипсин.
Для идентификации отношения клеточной культуры к определенной группе клеточных препаратов с полезными свойствами контролируют наличие качественных характеристик, определяющих источник клеток.
В предпочтительном варианте реализации изобретения контролируют наличие качественных характеристик, определяющих пригодность для проведения противоопухолевой иммунотерапии.
Для установления сохранности полезных свойств клетками контролируют наличие качественных характеристик, свидетельствующих об отсутствии изменений фенотипа клеток исследуемой клеточной культуры в процессе культивирования.
В качестве живых клеток с известными качественными характеристиками может быть использована первичная культура клеток.
В качестве живых клеток с известными качественными характеристиками могут быть использованы клетки, не претерпевшие изменений в фенотипе в процессе хранения и культивирования.
Отщепленные фрагменты поверхностных белков перед масс-спектрометрическим анализом могут быть дегликозилированы.
Обработка первичной культуры клеток витальным воздействием трипсина приводит к отщеплению с поверхности клеток фрагментов белков, состав которых специфичен для конкретных культур клеток. Таким образом, согласно данному изобретению действие трипсина, как и других протеаз, приводит к высвобождению в раствор специфичных для культивируемых клеток фрагментов поверхностных белков, совокупность измеренных масс которых является характеристической для культуры клеток. Для подобных характеризующих культивируемые клетки совокупностей масс был введен термин протеомный футпринт (белковый отпечаток).
Клетки при обработке витальным воздействием протеазы не погибают, что дает возможность избежать загрязнения анализируемых проб мажорными белками цитоплазмы клетки и избежать расхода кле
- 4 009326 точного материала при анализе.
Далее изобретение поясняется конкретными примерами реализации изобретения и прилагаемыми фигурами, на которых изображено следующее:
на фиг. 1 - схема получения согласно данному изобретению протеомного футпринта культивируемых клеток;
на фиг. 2 - протеомные футпринты фибробластов из различных тканей человека, классифицированные иерархическим кластерным анализом;
на фиг. 3 - масс-спектр фрагментов поверхностных белков и соответствующий ему футпринт, полученный согласно второму примеру реализации изобретения со свежеинициированной первичной культуры опухолевых клеток человека (3А); масс-спектр фрагментов поверхностных белков и соответствующий ему футпринт, полученный с той же культуры клеток после непродолжительного их культивирования (3Б); масс-спектр и соответствующий ему футпринт полученный с той же культуры клеток после более длительного культивирования клеток (3В).
Пример 1. На фибробластах человека.
Морфологически все типы фибробластов практически идентичны (имеют веретенообразную форму). Однако фибробласты, полученные из различных источников, существенно отличаются по своим свойствам и, соответственно, имеют различные показания к применению в клеточной терапии.
В частности, фибробласты, полученные из жировой ткани человека, отличаются плюрипатентностью подобно стволовым клеткам (см., например, 2ик Р.А. с1 а1., Нитап аб1роке Нккие 1к а коигсе оГ ιηιιΐΐίροίοηΐ к1ет се11к, Мо1. Βΐοΐ. Се11., 2002, ν. 13, 4279-4295). Фибробласты кожи человека обладают слабым потенциалом к размножению, но пригодны для мезотерапии большими дозами размноженных клеток самого пациента. Эмбриональные фибробласты кожи человека обладают хорошим потенциалом к размножению и пригодны для аллогенной клеточной трансплантации (Сухих Г.Т., Трансплантация фетальных клеток в медицине: настоящее и будущее, Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 1998, 126, прил. 1, 3-13). Фибробласты дермального сосочка волосяного фолликула обладают трихогенными свойствами и могут использоваться в клеточной терапии алопеций (см., например, патент Биотрансплантант, способ его получения (варианты) и способ лечения алопеции, заявка: 2004125092/15, опубл. 18.08.2004).
Ниже приведен пример определения согласно данному изобретению качественных характеристик тестируемой культуры фибробластов путем установления идентичности ее протеомного футпринта полученным аналогичным образом футпринтам культур фибробластов известного происхождения и с установленными полезными свойствами.
Сорок две первичные культуры кожных, адипогенных, фетальных фибробластов и фибробластов дермального сосочка волосяного фолликула получали из соответствующих источников согласно описанным ранее методикам. Первичные культуры кожных фибробластов получали согласно методике КтШе и Икйет (1ко1а11оп апб сийите οί ккш Г1ЬтоЬ1ак1к, Мебюбк Мо1. Меб., 2005, ν. 117, 83-98). Первичные культуры адипогенных фибробластов получали согласно методике 2ик и соавт. (МиНШпеаде се11к Ггот Нитап аб1роке йккие: ппрйсаЦопк Гог се11-Ьакеб 1йегар1ек, Т1ккие Епд., 2001, ν. 7, 211-288). Первичные культуры фибробластов дермального сосочка волосяного фолликула получали согласно методике 2Нопд-Га и соавт. (Вю1одюа1 сйагасЮпхаНоп оГ сп11пгеб бегта1 рарШа се11к апб На1г ГоШс1е тедепегайоп ш мНго апб ш уАо, СЫпеке Меб1са1 1оитпа1, 2006, ν. 119, 275-281). Первичные культуры фетальных фибробластов человека получали из абортивного материала согласно методике 8аКа1оп и соавт. (РеЕоушб уес1ог-теб1а1еб депе 1гапкГег 1п1о Нитап рптагу туодешс се11к 1еабк 1о ехргеккюп ш тикс1е ПЬегк ш у|уо, Нит. Оепе ТНег., 1993, ν. 4, 713-723). Культивирование первичных культур проводили в идентичных условиях (ростовая среда ДМЕМ, 5% СО2, 37°С, 10% фетальной бычьей сыворотки). На 20-25 день после инициации культур делали стерильный клеточный препарат (1 млн фибробластов в 1 мл физиологического раствора), который анализировали по следующему протоколу.
1. Клеточный препарат, содержащий тестируемые фибробласты, в стерильных условиях выливают в культуральный флакон. Во флакон доливают ростовой среды (ДМЕМ с 10% фетальной бычьей сыворотки) и инкубируют при 37°С в СО2-инкубаторе в течение 30-45 мин.
2. Удаляют ростовую среду из флакона и трижды промывают прикрепившиеся ко дну флакона клетки стерильным физиологическим раствором, используя объем, равный половине ростовой среды.
3. Добавляют к клеткам 0,0001% раствор трипсина, используя 1 мл раствора на 25 см поверхности культурального флакона.
4. Инкубируют флакон при 37°С. Между 5-й и 7-й минутами инкубации отбирают из флакона раствор трипсина, содержащий отщепленные от клеток фрагменты белков.
5. Раствор трипсина, отобранный от клеток, используют для масс-спектрометрического определения совокупности масс фрагментов поверхностных белков, соответствующей анализируемым клеткам.
6. Измеренную совокупность масс фрагментов поверхностных белков анализируемых клеток сравнивают с полученной аналогичным способом совокупностью масс фрагментов поверхностных белков клеточных культур с известными качественными характеристиками.
Масс-спектрометрический анализ проводят следующим образом. Пробы, полученные в процессе
- 5 009326 инкубации клеток с трипсином (см. п.4 протокола), обессоливают, применяя наконечники для автоматических пипеток с обращенной фазой ΖίρΤίρ(·Ι8 (М1Шроте Согр., США), в соответствии с протоколом производителя. Массы пептидных фрагментов, содержащиеся в пробе, измеряют методом времяпролетной (МАЙШ-ТОР) масс-спектрометрии. 2 мкл обессоленного раствора смешивают на масс-спектрометрической мишени в соотношении 1:1 с насыщенным раствором а-циано-4-гидроксисинаминовой кислоты, содержащей 50% ацетонитрила и 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученные на мишени капли проб высушивают на воздухе и проводят масс-спектрометрический анализ в диапазоне масс пептидов от 600 до 4000 Да.
Полученные масс-спектры, соответствующие разным клеточным линиям, предварительно обрабатывают для последующей классификации иерархическим кластерным анализом. Список масс пептидов переводят в бинарный код (1- есть определенная масса пептида в спектре и, соответственно, 0- отсутствие массы пептида), генерируя таким образом протеомный футпринт клеточной культуры. Классификацию (разбиение на группы) футпринтов проводят кластеризацией по методу Варда с использованием квадратов евклидовых расстояний для расчета матрицы дистанций.
Из фиг. 2 видно, что футпринты 42 препаратов фибробластов из различных источников, таких как дермального сосочка волосяного фолликула, жировой клетчатки, кожи предплечья взрослого человека и фетальной кожи, четко классифицируются по четырем группам соответственно происхождению фибробластов (1, 2, 3 и 4 группы на фиг. 2, соответственно). Таким образом, имея тестируемый клеточный препарат фибробластов, можно точно установить его происхождение по принадлежности его футпринта к тому или иному кластеру. К примеру, если тестируемому клеточному препарату соответствует отмеченный звездочкой (*) на фиг. 2 футпринт, то достоверно можно утверждать, что фибробласты тестируемого препарата были выделены из дермального сосочка волосяного фолликула, размножены соответствующим образом и в процессе культивирования не были утрачены качественные характеристики, позволяющие отнести данные фибробласты к фибробластам с трихогенными свойствами.
В случае, если тестируемая культура клеток не будет принадлежать ни одному из кластеров (см., например, футпринт адипогенных фибробластов в кластере 2' на фиг. 2), можно утверждать, что клетки не принадлежат ни одному из определяемых источников, либо в процессе культивирования их фенотип изменился и ассоциировать их с качественными клеточными препаратами установленного происхождения и с известными свойствами уже нельзя.
Из приведенного примера видно, что совокупность (набор) молекулярных масс фрагментов поверхностных белков, т.н. протеомный футпринт, является своеобразным штрих-кодом, характеризующим клетки на предмет отношения к фибробластам с определенными, представляющими интерес для клеточной терапии, свойствами.
Следует отметить, что забор раствора трипсина, содержащего отщепленные от клеток фрагменты поверхностных белков, желательно осуществлять до момента открепления клеток от дна культурального флакона под воздействием трипсина, что позволит предотвратить попадание клеток в пробу и избежать дополнительной стадии очистки пробы.
Условия обработки протеазой клеток определяют экспериментально для каждого типа клеток и активности используемой протеазы, и они могут существенно варьировать от 0,00001 до 0,05% для концентрации протеазы и от 30 с до 10 мин для времени обработки клеток. В случае использования трипсина с другой активностью концентрация его меняется прямо пропорционально увеличению или уменьшению активности.
В других вариантах реализации изобретения используют любой другой вариант масс-спектрометрии.
Раствор трипсина можно готовить как на стерильном физиологическом растворе, так и на любом подходящем для этого солевом или буферном растворе.
Вместо трипсина могут быть использованы другие протеазы, например химотрипсин, протеиназа К и т. д.
Отщепленные фрагменты поверхностных белков могут перед масс-спектрометрическим анализом быть дегликозилированы, например, проназой.
Вместо трипсина может быть использована комбинация протеаз.
В случае использования суспензионной культуры клеток необходимо перед забором пробы клетки осадить на дно, например, центрифугированием или использовать любой другой подходящий способ для удаления клеток из тестируемой пробы.
Обессоливание и концентрирование пептидов пробы для масс-спектрометрического анализа можно осуществлять любым подходящим для этого способом.
В других вариантах реализации изобретения, если применяемый протокол масс-спектрометрического анализа не требует обессоливания и/или концентрирования анализируемой пробы, содержащей фрагменты поверхностных белков, обессоливание и/или концентрирование не проводится.
В случае использования трипсина для снятия клеток прикрепленной культуры с подложки при получении клеточного препарата необходимо перед анализом провести дополнительное инкубирование клеток в соответствующих условиях 18-20 ч для репарации клетками поверхностных белков.
В других вариантах реализации изобретения используют для формирования характеристической
- 6 009326 совокупности масс не появление той или иной массы фрагмента поверхностного белка, а изменение его интенсивности в масс-спектре, что соответствует изменению его концентрации в анализируемой пробе.
В других вариантах реализации изобретения используется любая подходящая математическая обработка измеренных масс белковых фрагментов, позволяющая корректно классифицировать клеточный материал по интересующим свойствам, к примеру, применив регрессионный анализ, к-теапк кластеризацию, нейросети, РСА, 8УМ, 8ОМ и т.д., а также их комбинации.
Патентуемый способ может применяться к любым типам клеточных препаратов, в частности к суспензии клеток, смешанным культурам, органотипным культурам и клеточным агрегатам (гранулы, сфероиды), а также к свежевыделенным клеткам и тканевым фрагментам.
Пример 2. На опухолевых клетках человека.
Далее изобретение поясняется вторым примером оценки качества культуры опухолевых клеток рака толстого кишечника человека на предмет пригодности использования их для противоопухолевой вакцинации.
Выделенные из опухоли больного, культивируемые и впоследствии используемые для противоопухолевой вакцинации клетки должны быть идентичны опухолевым клеткам больного. Однако культивирование клеток существенно искажает фенотип первичной культуры по причине невозможности искусственного воссоздания ίη νίΐτο условий, при которых опухолевые клетки росли в организме больного. Таким образом, качество используемых для вакцинации культивированных опухолевых клеток подлежит обязательному контролю и выражается в степени их соответствия клеткам опухоли больного. Протокол установления подобного соответствия представлен ниже.
1. Из флакона с культивируемыми опухолевыми клетками удаляют ростовую среду и трижды промывают клетки 0,9% раствором хлорида натрия или фосфатным буфером силана, используя каждый раз объем, равный не менее половины объема заливаемой в культуральный флакон ростовой среды. В результате промывки клеток должны быть удалены следы сыворотки, содержащейся в ростовой среде.
2. К клеткам добавляют 0,0001% раствор трипсина (активность ~3000 Ед/мг), используя 1 мл раствора на 25 см2 поверхности культурального флакона.
3. Инкубируют флакон при 37°С. Между 5-й и 7-й минутами инкубации отбирают из флакона раствор, содержащий отщепленные от клеток фрагменты поверхностных белков. Опухолевые клетки в момент отбора раствора должны быть прикреплены к дну культурального флакона. Если под воздействием трипсина часть клеток открепилась и стала свободно плавать, то ростовую среду надо отцентрифугировать при 400 д в течение 5 мин и использовать супернатант, свободный от примеси клеток.
4. Для инактивации остатков трипсина в культуральном флаконе добавляют свежеприготовленную культуральную среду, содержащую фетальную бычью сыворотку, и продолжают культивирование клеток при 37°С и 5% СО2.
5. Раствор, полученный в п.3, анализируют масс-спектрометрически и сравнивают со спектром, полученным аналогичным образом (пп.1-4), но ранее для свежевыделенных опухолевых клеток.
Масс-спектрометрический анализ проводят по протоколу масс-спектрометрии гликозилированных пептидов (Та.)ш М. е! а1., ”01ГГегеп11а1 апа1ук18 оГ кке-креаПс д1усапк οη р1акта апб се11и1аг йЬтопесбпк: аррксайоп оГ а НубгорНШс аГйпйу тебюб Гог д1усорерббе еппсйтеп!, О1усоЬю1оду, 2005, ν. 15, 13321340). Это объясняется, с одной стороны, тем, что внеклеточные фрагменты белков, как правило, гликозилированы, с другой стороны, именно гликозилированные фрагменты поверхностных белков опухолевых клеток наиболее иммуногенны и являются вероятными антигенами вакцины (см., например, Етапсо А., СТЬ-Вакеб Сапсег Р^еνеηΐ^νе/Тйе^ареиΐ^с Уассшек Гог Сатсшотак: Ко1е оГ Титоиг-А88ос1а!еб СагЬоНубШе Апйдепк, 8сапб. I. 1ттипо1., 2005, ν. 61, 391-397).
140 мкл анализируемого раствора фрагментов поверхностных белков смешивают со 140 мкл этанола, 720 мкл бутанола и добавляют 15 мкл сефарозы СЬ4В. Инкубируют при медленном перемешивании 45 мин. После инкубации сефарозу дважды промывают раствором с тем же содержанием спирта и бутанола и инкубируют 30 мин в 50% растворе этанола. Раствор этанола отбирают от сефарозы и высушивают на роторном испарителе. Полученный осадок растворяют в 10 мкл воды и анализируют времяпролетной (МАЬП1-ТОЕ) масс-спектрометрией. 2 мкл анализируемого раствора смешивают на масс-спектрометрической мишени в соотношении 1:1 с насыщенным раствором 2,5-дигидроксибензойной кислоты, содержащей 50% ацетонитрила и 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученные на мишени капли проб высушивают на воздухе и проводят масс-спектрометрический анализ в диапазоне масс пептидов от 1000 до 4000 Да.
Согласно полученным данным при повторном (контрольном) масс-спектрометрическом анализе культуры клеток воспроизводится не менее 95 мас.% фрагментов белков, что можно считать критерием идентичности двух сравниваемых клеточных препаратов. Предлагается оценивать пригодность клеточного препарата для вакцинации больного на основе идентичности не менее 90% общих масс фрагментов белков у анализируемых клеток и свежевыделенных опухолевых клеток донора.
На фиг. 3А показаны времяпролетный спектр белковых фрагментов и соответствующий футпринт, полученные согласно второму варианту реализации изобретения со свежевыделенных опухолевых кле
- 7 009326 ток рака толстого кишечника человека. На фиг. 3Б показаны масс-спектр и соответствующий футпринт тех же самых клеток, размноженных культивированием (1-й пассаж) и пригодных для противоопухолевой вакцинации. Снятый с них спектр идентичен исходному спектру, полученному со свежевыделенных опухолевых клеток. На фиг. 3В представлен масс-спектр тех же самых клеток, размноженных культивированием (2-й пассаж), но уже не пригодных для противоопухолевой вакцинации. В процессе культивирования произошли существенные изменения в поверхностных белках клеток (см., например, область 1800-2000 Да футпринта на фиг. 3В), что позволило считать их неидентичными клеткам исходной опухоли донора.
В случае использования протеазы для диссоциации ткани опухоли с целью высвобождения опухолевых клеток необходимо проводить масс-спектрометрический анализ для получения образца футпринта исходной (неизмененной) культуры клеток не раньше чем через сутки после инициации опухолевой культуры, чтобы клетки успели восстановить поврежденные при выделении поверхностные белки.
Совокупность масс фрагментов поверхностных белков является своеобразным штрих-кодом, т.е. показателем, наиболее объективно характеризующим клетки.
Поэтому контроль наличия качественных характеристик у исследуемой клеточной культуры путем сравнения совокупности полученных масс фрагментов поверхностных белков ее клеток с совокупностью масс-спектрометрически определенных масс фрагментов поверхностных белков живых клеток с известными качественными характеристиками дает возможность наиболее точно произвести отбор качественных (с ожидаемыми полезными свойствами) клеток.
Применение при реализации способа масс-спектрометрического анализа позволяет определять качество клеточной культуры достаточно быстро - в течение не более 2 ч. Это позволит использовать его для оценки качества готовых клеточных препаратов перед их применением, учитывая малый срок их годности с момента изготовления (несколько часов).
Кроме этого, полученные масс-спектры могут быть преобразованы с возможностью численного выражения результатов анализа, что необходимо для реализации стандарта СМР, исключающего человеческий фактор при проведении оценки качества культуры клеток, и позволит обеспечить необходимую объективность результатов.
Точность определения наличия качественных характеристик у исследуемой культуры клеток при реализации патентуемого способа обеспечивается также за счет использования живых клеток исследуемой клеточной культуры, которые подвергают витальному воздействию протеазы. Клетки при обработке витальным воздействием протеазы не погибают, что дает возможность избежать загрязнения анализируемых проб мажорными белками цитоплазмы клетки и значительно уменьшить расход клеточного материала при анализе культуры клеток.
Загрязнения анализируемых проб позволяет избежать также предварительная промывка клеток, которая необходима для удаления следов сыворотки, содержащейся в ростовой среде.
Таким образом, патентуемый способ позволяет охарактеризовать клетки по наиболее актуальным, в том числе и для клеточной трансплантологии, поверхностным белкам.
Claims (8)
1. Способ определения качества клеточной культуры, включающий масс-спектрометрический анализ поверхностных клеточных белков, отличающийся тем, что предварительно промытые живые клетки исследуемой клеточной культуры подвергают витальному воздействию протеазы, отбирают отщепленные фрагменты поверхностных белков и масс-спектрометрически определяют их массы, контролируют наличие качественных характеристик у исследуемой культуры клеток путем сравнения совокупности полученных масс с совокупностью масс-спектрометрически определенных масс фрагментов поверхностных белков живых клеток с известными качественными характеристиками.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеазы используют трипсин.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что контролируют наличие качественных характеристик, определяющих источник клеток.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что контролируют наличие качественных характеристик, определяющих пригодность для проведения противоопухолевой иммунотерапии.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что контролируют наличие качественных характеристик, свидетельствующих об отсутствии изменений фенотипа клеток исследуемой клеточной культуры в процессе культивирования.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве живых клеток с известными качественными характеристиками используют первичную культуру клеток.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве живых клеток с известными качественными характеристиками используют клетки, не претерпевшие изменений в фенотипе.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что отщепленные фрагменты поверхностных белков перед масс-спектрометрическим анализом дегликозилируют.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200700942A EA009326B1 (ru) | 2007-04-06 | 2007-04-06 | Способ определения качества клеточной культуры |
| PCT/RU2007/000571 WO2008123793A1 (fr) | 2007-04-06 | 2007-10-16 | Procédé pour tester la qualité d'une culture de cellules |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200700942A EA009326B1 (ru) | 2007-04-06 | 2007-04-06 | Способ определения качества клеточной культуры |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200700942A1 EA200700942A1 (ru) | 2007-12-28 |
| EA009326B1 true EA009326B1 (ru) | 2007-12-28 |
Family
ID=39831177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700942A EA009326B1 (ru) | 2007-04-06 | 2007-04-06 | Способ определения качества клеточной культуры |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA009326B1 (ru) |
| WO (1) | WO2008123793A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MA54103A (fr) | 2017-04-14 | 2021-09-15 | Juno Therapeutics Inc | Procédés d'évaluation de la glycosylation de surface cellulaire |
| RU2670001C1 (ru) * | 2017-12-25 | 2018-10-17 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук | Способ получения белков клеточной поверхности |
| US12366580B2 (en) | 2018-09-11 | 2025-07-22 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for mass spectrometry analysis of engineered cell compositions |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001249125A (ja) * | 2000-03-06 | 2001-09-14 | Suntory Ltd | 組織または細胞における物質分析のための方法 |
| WO2003025565A2 (en) * | 2001-09-21 | 2003-03-27 | Caprion Pharmaceuticals Inc. | Preparation of highly-purified plasma membranes |
| US20050068657A1 (en) * | 2003-09-29 | 2005-03-31 | Hitachi Global Storage Technologies Netherlands B | Servo self-write disk drive with dual-stage actuator |
| US20050090007A1 (en) * | 1997-07-23 | 2005-04-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Identification of human cell lines for the production of human proteins by endogenous gene activation |
| WO2006051405A2 (en) * | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Cambridge University Technical Services Ltd. | Methods and means related to cancer stem cells |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU944580A1 (ru) * | 1980-02-07 | 1982-07-23 | Кировский научно-исследовательский институт переливания крови | Способ получени поверхностного антигена гепатита В |
| US6861234B1 (en) * | 2000-04-28 | 2005-03-01 | Mannkind Corporation | Method of epitope discovery |
| AU2003902299A0 (en) * | 2003-05-13 | 2003-05-29 | Flinders Medical Centre | A method of analysing a marker nucleic acid molecule |
-
2007
- 2007-04-06 EA EA200700942A patent/EA009326B1/ru active IP Right Revival
- 2007-10-16 WO PCT/RU2007/000571 patent/WO2008123793A1/ru not_active Ceased
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050090007A1 (en) * | 1997-07-23 | 2005-04-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Identification of human cell lines for the production of human proteins by endogenous gene activation |
| JP2001249125A (ja) * | 2000-03-06 | 2001-09-14 | Suntory Ltd | 組織または細胞における物質分析のための方法 |
| WO2003025565A2 (en) * | 2001-09-21 | 2003-03-27 | Caprion Pharmaceuticals Inc. | Preparation of highly-purified plasma membranes |
| US20050068657A1 (en) * | 2003-09-29 | 2005-03-31 | Hitachi Global Storage Technologies Netherlands B | Servo self-write disk drive with dual-stage actuator |
| WO2006051405A2 (en) * | 2004-11-12 | 2006-05-18 | Cambridge University Technical Services Ltd. | Methods and means related to cancer stem cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008123793A1 (fr) | 2008-10-16 |
| EA200700942A1 (ru) | 2007-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7391911B2 (ja) | 発育期神経毒性予測ヒト多能性幹細胞系モデル | |
| CN108707604B (zh) | 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行CNE10基因敲除 | |
| JP6257520B2 (ja) | 人工多能性幹細胞または分化細胞を作製するための自動化されたシステム | |
| Wang et al. | Ipsilateral and contralateral retinal ganglion cells express distinct genes during decussation at the optic chiasm | |
| JP2016514950A (ja) | 標的細胞の選択的富化のための方法、組成物、キット、及びシステム | |
| Carelli et al. | HuR interacts with lincBRN1a and lincBRN1b during neuronal stem cells differentiation | |
| CN109682978B (zh) | 一种肿瘤突变肽mhc亲和力预测方法及其应用 | |
| Bertucci et al. | Improved protocol for reproducible human cortical organoids reveals early alterations in metabolism with MAPT mutations | |
| Williams et al. | Scalable measurements of intrinsic excitability in human iPS cell-derived excitatory neurons using all-optical electrophysiology | |
| EA009326B1 (ru) | Способ определения качества клеточной культуры | |
| JP6986054B2 (ja) | バイオセンサーを有するヒト細胞モデル | |
| JP2004166685A (ja) | ストレスにさらされている生細胞とさらされていない生細胞とを用いた少なくとも１つの生物学的パラメーターに結果的に生じた変化の同定法 | |
| EP2299259B1 (en) | Method and use of an apparatus for In-Vitro-Analysis of Biological Cells and/or Microorganisms | |
| Ahn et al. | Stem cell markers: insights from membrane proteomics? | |
| Qi et al. | In vitro differentiation of bone marrow stromal cells into neurons and glial cells and differential protein expression in a two-compartment bone marrow stromal cell/neuron co-culture system | |
| Danačíková et al. | In vitro human cell culture models in a bench‐to‐bedside approach to epilepsy | |
| Buttermore | Phenotypic assay development with iPSC-derived neurons: technical considerations from plating to analysis | |
| WO2023221853A1 (zh) | 一种衰老细胞的构建方法及评价抗衰老功效的方法 | |
| US8552383B2 (en) | Methods and systems for in-vitro analysis of biological cells and/or microorganisms | |
| Beyer et al. | Neuroproteomics in stem cell differentiation | |
| JP2009008607A (ja) | 皮膚色素沈着マーカーとその利用技術 | |
| Hajdú et al. | Isolation of the Surfaceome from Primary Human Epidermal Melanocytes Using Glycocapture and Shotgun Proteomics | |
| Chin et al. | Studying neurological disorders using induced pluripotent stem cells and optogenetics | |
| JP5542110B2 (ja) | 皮膚色素沈着マーカーとその利用技術 | |
| Rieskamp et al. | Stem cell secretome |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM MD TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): KZ TJ |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): KG |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AZ BY |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |