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WO2008101469A2 - Pharmazeutische zubereitung zur bekämpfung von metastasen - Google Patents

Pharmazeutische zubereitung zur bekämpfung von metastasen Download PDF

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WO2008101469A2
WO2008101469A2 PCT/DE2008/000264 DE2008000264W WO2008101469A2 WO 2008101469 A2 WO2008101469 A2 WO 2008101469A2 DE 2008000264 W DE2008000264 W DE 2008000264W WO 2008101469 A2 WO2008101469 A2 WO 2008101469A2
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pharmaceutical preparation
phosphatidylcholine
liposomes
preparation according
peg
Prior art date
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PCT/DE2008/000264
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English (en)
French (fr)
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Reinhardt Zeisig
Iduna Fichtner
Jane Wenzel
Christian Nowak
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epo Experimentelle Pharmakologie & Onkologie Berlin-Buch GmbH
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Original Assignee
Epo Experimentelle Pharmakologie & Onkologie Berlin-Buch GmbH
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
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Publication date
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Publication of WO2008101469A3 publication Critical patent/WO2008101469A3/de
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Ceased legal-status Critical Current

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Definitions

  • the invention relates to a pharmaceutical preparation for combating metastases based on liposomes. Areas of application of the invention are the medicine and the pharmaceutical industry.
  • the success of tumor therapy thus depends essentially on a comprehensive prevention of metastasis, which is triggered by circulating tumor cells. Metastasis can occur via two processes. On the one hand, a single circulating tumor cell undergoes a complex cascade of different, causally dependent adhesion processes before it can be fixed in a distal tissue 1 .
  • the initial step of adhesion is mediated by the endothelial receptor E-selectin, which recognizes the carbohydrate ligands sialyl Lewis "(sLe x ) and sialyl Lewis a (sLe a ) found on various metastatic cancer cells, through ligand-receptor interactions weak affinity binding of the tumor cell to the endothelium as a prerequisite for the subsequent steps ("rolling along” the membrane, release of further mediators, firm adhesion and invasion into the surrounding tissue). Finally, the tumor cell nests in the secondary tissue, initiates the formation of a neovascular blood system and proliferates 2 .
  • the spontaneous formation of tumor cell microthrombi is relevant for the metastasis process 3 .
  • these complexes can contribute to a local accumulation of the tumor cells, which in turn leads to metastasis through individual cells 4 .
  • activated platelets in particular attach to tumor cells and thus contribute to the shielding of immune reactions and the formation of microthrombi 5 .
  • targets that play an essential role in this process include the adhesion molecules on the endothelial surface and / or the ligands that are expressed by the tumor cell.
  • targets can be switched off 7 by competitive binding of suitable inhibitors (antibodies, carbohydrates) 6 or by inhibition of its expression with antisense or gene knockout strategies.
  • Other approaches are aimed at inhibiting angiogenesis. This also essential process of formation of new blood vessels to supply the newly forming metastases follows the adhesion cascade.
  • the heart of the invention is a pharmaceutical preparation comprising liposomal formulations containing at least one substance with antitumor effect and at least one substance with anticoagulant activity and optionally other substances.
  • An important starting point of the invention is the elimination of the formation of aggregates of tumor cells with each other or from tumor cells and platelets, which is considered an essential prerequisite of tumor cell engraftment. This is to be achieved by surface-modified, drug-containing liposomes. In addition, under certain conditions, the adhesion of the tumor cells to the blood vessel wall can be prevented by liposomes as an alternative step of a secondary tumor cell colonization.
  • the substances with antitumor action used in the context of the invention are in particular those substances which negatively influence or inhibit the formation, growth and / or spread of tumors.
  • alkyl phospholipids such as tetradecylphosphatidylcholine (TPC), hexadecylphosphatidylcholine (HPC), heptadecylphosphatidylcholine (HpPC), octadecylphosphatidylcholine (OPC), hexadecyl (1, 1-dimethyl-piperidin-4-yl) -phosphate (HPP), octadecyl (1, 1-dimethyl-piperidin-4-yl) -phosphate (OPP), hexadecylphosphatidylserine (HPS), hexadecylphosphatidylethanolamine (HPE) or edelfo
  • TPC tetradecylphosphatidylcholine
  • HPC hexadecylphosphatidylcholine
  • HpPC heptadecylphosphatidylcholine
  • OPC
  • substances with anticoagulant effect are used: substances from the drug group of aggregation inhibitors, such as dipyridamole, acetylsalicylic acid, ticlopidine, resveratrol, anticoagulants, such as heparin, low molecular weight heparin, heparinoids, clopidogrel, the vitamin K antagonists, such as warfarin or phenprocoumone.
  • substances from the drug group of aggregation inhibitors such as dipyridamole, acetylsalicylic acid, ticlopidine, resveratrol
  • anticoagulants such as heparin, low molecular weight heparin, heparinoids, clopidogrel
  • the vitamin K antagonists such as warfarin or phenprocoumone.
  • Particularly suitable substances with anticoagulant activity in the context of the invention have proven to be the active substances dipyridamole and acetylsalicylic acid.
  • the liposomal formulation used to implement the invention is constructed from known ingredients. It consists of base lipids and additionally preferably contains helper lipids, membrane stabilizers and charge carriers, whereby a particularly favorable stability of the preparation is achieved.
  • base lipids in the context of the invention are in particular soya phosphatidylcholine, egg phosphatidylcholine (EggPC), hydrogenated phosphatidylcholine (HePC), dimyristoyl-phosphatidylcholine (DMPC), (dipalmitoyl-phosphatidylcholine) (DPPC), distearyl-phosphatidylcholine (DSPC), stearyl palmitoyl-phosphatidylcholine (SPPC), palmitoyl-stearyl-phosphatidylcholine (PSPC), dioleyl-phosphatidylcholine (DOPC), palmitoyl-oleyl-phosphatidylcholine (POPC) or sphingomyelin.
  • EggPC egg phosphatidylcholine
  • HePC hydrogenated phosphatidylcholine
  • DMPC dimyristoyl-phosphatidylcholine
  • DPPC dimyristoyl-phosphati
  • Helper lipids in the context of the invention are preferably dioleyl phosphatidylethanolamine (DOPE) and dioleyl phosphatidylcholine (DOPC).
  • DOPE dioleyl phosphatidylethanolamine
  • DOPC dioleyl phosphatidylcholine
  • cholesterol is used as a membrane stabilizer for the realization of the invention.
  • the charge carriers used are preferably negative charge carriers, such as e.g. Dicetyl phosphate (DCP), stearylamine (SA), phosphatidic acid (PA), phosphatidylglycerol (PG) or monosialoganglioside.
  • DCP Dicetyl phosphate
  • SA stearylamine
  • PA phosphatidic acid
  • PG phosphatidylglycerol
  • the liposomal formulation can be adapted to the requirements of a targeting.
  • the substance used for modifying the surface of the liposomal formulation is preferably polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine (PEG-PE).
  • PEG-PE polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine
  • PEG sterols, sialyl Lewis x -Peg-PE, sialyl Lewis A -PEG-PE, sialyl Lewis x -Peg sterols or sialyl Lewis A -PEG sterols are also effective. These compounds increase the hydrophilicity of the liposomal surface, thereby sterically shielding the vesicles from the monocyte / phagocyte system and preventing the vesicles from being recognized as foreign bodies and eliminated by the immune system.
  • such a surface increases the affinity for platelets, whereby a nonspecific targeting effect is achieved.
  • specific ligands such as Lewis x or A specific targeting to the site of action (platelets, endothelial membrane) is further increased.
  • liposomal formulations in which the liposomes have an average diameter smaller than 400 nm and the size distribution has a polydispersity index smaller than 0.4 to reduce the elimination by the monocyte / phagocytic system, thereby causing accumulation in the aggregates Platelets and tumor cells is promoted.
  • the liposomes are preferably prepared by classical methods, ie via lipid film hydration to produce the multilamellar vesicles, then extrusion to obtain small vesicles of defined size.
  • the stock solutions of the individual substances are mixed together and a lipid film is prepared by evaporation or other suitable methods. From this one obtains by the application of known methods, e.g. Rehydration, multilamellar vesicles, which are then subsequently converted by suitable methods, preferably extrusion, into a homogeneous suspension of small vesicles having a diameter of about 100-150 nm.
  • known methods e.g. Rehydration
  • the pharmaceutical preparation is suitable for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases such as thromboembolic disorders and coagulation disorders, preferably when metastatic tumor diseases occur in this context.
  • the pharmaceutical preparation for the treatment of metastatic liposomal-based tumors according to the invention is completely novel.
  • the combination liposomes contained in the pharmaceutical preparation are stable over a sufficient period of time, inhibit aggregate formation, inhibit the adhesion of tumor cells to the endothelial surface and endothelial components, influence the distribution of metastases in animal experiments, and restrict metastasis and thus the metastasis number and the metastasis Reduce total tumor weight.
  • the liposomes used have significant advantages over other drugs.
  • an accumulation in tumor cell platelet aggregates is achieved, whereby a targeted Release of the trapped drugs in close local proximity to the targets is achieved.
  • a second important advantage is the possibility of the simultaneous inclusion of several active ingredients with different active principles in the liposomes, whereby a targeted and simultaneous enrichment of all drugs (even with different pharmacokinetics of the individual components) is achieved in tumor cells and this can be attacked efficiently.
  • Novel and original to the combination liposomes according to the invention is that they have a modified surface and have included a cytostatic and an anticoagulant. This synergistically prevents both the binding to the endothelium (metastasis cascade) and the formation of tumor cell aggregates (embolic model). Despite the complexity of preparation of these vesicles, these liposomes can be prepared and modified in their properties (charge, stability and binding of ligands) and adapted to the requirements of a specific targeting.
  • This new drug system is that it can be used on a variety of tumors, thereby reducing the high metastatic mortality of tumors by synergistically inhibiting the process of metastasis through various mechanisms:
  • the pharmaceutical preparation according to the invention represents a completely novel approach to the inhibition of metastasis, which promises extraordinarily high efficacy through the complex and local approach.
  • the invention will be explained in more detail by exemplary embodiments.
  • Examples 1-6 It is shown in Examples 1-6 how various vesicles are prepared which have one or more active agents included in effective amount. This is followed by the characterization of physicochemical properties, storage stability and in vitro biological activity.
  • Example 1 Liposomes (vesicles with a diameter ⁇ 200 nm and uniform size distribution) are prepared by known methods.
  • a cytostatic, z.Bsp. included the alkylphospholipid octadecyl-1, 1-dimethylpiperidin-4-yl-phosphate (OPP), doxorubicin or mitoxantrone to specifically damage tumor cells.
  • OPP alkylphospholipid octadecyl-1, 1-dimethylpiperidin-4-yl-phosphate
  • AK anticoagulant
  • Size and size distribution quadsi-elastic light scattering
  • HPTLC current drug concentration
  • the following components are pipetted as stock solutions into a 50 ml round-bottomed flask: 31.2 ⁇ mol phosphatidylcholine (PC), 12 ⁇ mol octadecyl- (1.1-dimethylpiperidin-4-yl) -phosphate (OPP), 12 ⁇ mol cholesterol (CH), 2 , 8 ⁇ mol polyethylene glycol 2 ooo-phosphatidylethanolamine (PEG-PE), 6 ⁇ mol dicycetic phosphate (DCP) and 15.9 ⁇ mol dipyridamole (DIP).
  • PC phosphatidylcholine
  • OPP octadecyl- (1.1-dimethylpiperidin-4-yl) -phosphate
  • CH omol cholesterol
  • PEG-PE polyethylene glycol 2 ooo-phosphatidylethanolamine
  • DCP ⁇ mol dicycetic phosphate
  • DIP 15.9 ⁇ mol dipyridamole
  • the lipid film is prepared by evaporation of the solvent at 42 0 C in vacuo and then resuspended with 2 ml of PBS, pH 7.4 again.
  • the suspension becomes yellowish turbid and consists of MLV, which are shaken overnight.
  • the MLVs are then repeatedly forced through a mini extruder containing two pooled polycarbonate filters of 400 nm pore diameter. After 19-fold extrusion, completely large unilamellar vesicles (LUVs) with a mean diameter of 131 ⁇ 28 nm are present.
  • the suspension has a polydispersity index (PI) of 0.14 ⁇ 0.07.
  • the non-included DIP is separated by size exclusion chromatography on a Sephadex column (G50 fine).
  • the content of PC is determined by high performance thin-layer chromatography (HPTLC) and after column separation is 16.4 ⁇ 0.1 ⁇ mol / ml, while about 150 ⁇ 24 ⁇ g DIP /
  • the liposomes can be stored in the refrigerator for at least 8 weeks without their properties changing significantly (maximum size increase of 6% and a rise in the polydispersity index PI by a maximum of 30%).
  • liposomes having a total lipid content of 42.4 ⁇ mol / ml are prepared by a known method.
  • PC 6 .mu.mol PC
  • 12 .mu.mol CH 6 .mu.mol DCP
  • 2.8 .mu.mol PEG 8 .mu.mol dipyridamole
  • 4 mg mitoxantrone in the solvent mixture dichloromethane / methanol (7: 3, v / v) dissolved the solvent removed in vacuo to obtain a thin lipid film.
  • This is resuspended in PBS (without Ca, Mg), the suspension shaken overnight at room temperature to obtain multilamellar vesicles.
  • the liposomes are extruded 19 times by means of mini extruders equipped with two polycarbonate membranes with a pore diameter of 400 nm to obtain a uniform size distribution of the liposomes. Subsequently, the liposomes are passed through a Sephadex G50fine column to separate by size exclusion chromatography the unencapsulated DIP and mitoxantrone.
  • the size and polydispersity index (PI) of the liposomes is determined by PCS.
  • the mean size of the liposomes is 123 nm, the PI for these liposomes being 0.134.
  • the trapped MTX is determined by HPTLC. It is up to 850 ⁇ g / ml liposomal suspension for these liposomes. This corresponds to an inclusion rate of 20%.
  • liposomes having a total lipid content of 32 ⁇ mol / ml are prepared by a known method. For this purpose, first 15.6 mM PC, 6 mM CH, 3 mM DCP, 1.4 mM PEG and 8 mM dipyridamole are dissolved in a round bottom flask in an organic solvent and then the solvent is removed in vacuo to obtain a thin lipid film. This is in citrate buffer pH 3.8 resuspended, the suspension shaken overnight at room temperature
  • MLV multilamellar vesicles
  • the MLV are extruded 19 times by means of mini extruders equipped with two polycarbonate membranes with a pore diameter of 400 nm, to obtain small vesicles with a uniform size distribution.
  • Doxorubicin is encapsulated via the well-known pH-jumping technique.
  • 800 .mu.l of the liposome suspension are brought to a pH value of 7.6 by means of NaOH solution and subsequently heated in a water bath at 60 0 C. Then be
  • the size and polydispersity index (PI) of the liposomes is determined by PCS.
  • the mean size of the liposomes is 182 nm, with these liposomes having a value of 0.263.
  • the trapped doxorubicin is determined by HPTLC. It is up to 950 ⁇ g / ml liposomal suspension for these liposomes.
  • the effectiveness of the liposomes is characterized in vitro in various test systems.
  • the influence of liposomes on the adhesion of tumor cells and platelets is determined under static conditions in the binding assay.
  • the influence of liposomes on the aggregation behavior of tumor cells in the absence and presence of platelets, and the complex formation between tumor cells and platelets as an essential step of metastasis is used as test systems in vitro.
  • 100 ⁇ l of platelet-rich plasma (PRP) with a platelet count of 2.5 ⁇ 10 8 / ml are added per well to a 96-well plate and activated with 0.05 ⁇ thrombin / well. In some wells, the activation is omitted in order to be able to carry unactivated platelets as a control.
  • PRP platelet-rich plasma
  • Inhibition of aggregation by the combination liposomes can be achieved by 40%, while no inhibition is observed by control liposomes (see Figure 1).
  • DlP as a free drug inhibits platelet aggregation by 30% at a concentration of 10 nmol / ⁇ l (data not shown).
  • Example 5.2 Inhibition of the adhesion of platelets to immobilized tumor cells
  • the tumor cells and platelets are incubated with liposomes (100 nmol total lipid / well) or 10 ⁇ l of a 1 M EDTA solution / well as control.
  • the seeding and serial dilution of fluorescently labeled platelets into a black Maxi-Sorp plate (Nunc) and their activation by 0.05 ⁇ thrombin are performed to obtain a standard series for the quantification of bound platelets.
  • Lysis buffer Add 2.5 g sodium dodecyl sulfate (SDS) with 1 ml 10 N NaOH and make up to 50 ml with PBS, filter. Result: The activation-related increase in the adhesion of platelets to HT29 colon carcinoma cells ( Figure 2A) and to MT-3 breast cancer cells ( Figure 2B) can be completely prevented by combination liposomes.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Tumor cells (MT3 and MT1 breast cancer cells, and Lewis lung lung carcinoma cells) are fluorescently labeled as described in 2.2.1, but the marker used is 282 nmol Hoechst 33258/75 cm 2 culture flask. The cells thus labeled are taken up in PBS (Ca, Mg) and adjusted to 1, 2 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the inhibition of the adhesion of the tumor cells by liposomes is then carried out as follows.
  • the quantification of the bound tumor cells then takes place via the mean fluorescence intensity from the standard series for each tumor cell line.
  • Figure 3 shows the results for the inhibition of the adhesion of MT3, MT1 and Lewis lung and tumor cells.
  • the combined liposomes inhibit the adhesion of MT3 to collagen and to fibronectin by 65 and 52%, respectively.
  • inhibition levels of 34% and 6% were achieved.
  • Example 5.4 Inhibition of complex formation from tumor cells and platelets by combination liposomes in vitro.
  • Tumor cells in the exponential growth phase are washed twice with Ca 2+ / Mg 2+ -PBS and incubated with 94 nmol of the Hoechst dye 33258 in 2 ml of Ca 2-1 VMg 2+ - PBS for 30 min at 37 0 C. After removal of the dye, the cells are washed with Ca 2-1 VMg 2+ PBS and harvested by trypsinization, taken up in 2 ml of medium, centrifuged at 200 g '1 for 2 min and then dissolved in 2 ml Ca 2 -VMg 2+ . PBS resuspended. The cell suspension is then adjusted to a defined cell number.
  • 1x10 4 MT3 tumor cells labeled with Hoechst 33258, 2.5 ⁇ 10 6 platelets and 10 nmol liposomes were taken up in 100 ⁇ l Thyrode buffer (TH buffer), activated with 0.01 ⁇ l thrombin and for 20 min under room temperature with uniform motion incubated.
  • the mixture is then diluted to 2 ml with TH buffer and applied to slides with the cytospin centrifuge at 1500 rpm for 20 min. Thereafter, the samples are covered with a drop of mounting medium (Fluorescent Mounting Medium) and a coverslip bubble-free.
  • THR platelets
  • aPt activated platelets
  • Kon-L blank control
  • DIP-L and DIP / OPP-L liposomes with encapsulated dipyridamole, OPP or both active ingredients
  • Combination liposomes completely prevent the aggregation (complex formation) of the tumor cells, whereas they increase to 172% without the addition of liposomes when the platelets are activated.
  • Example 7 Therapeutic efficacy of the liposomal formulations in the MT3 breast cancer model
  • the antimetastasis effect is tested in the mouse model in different tumor models with different potential for metastasis (eg in the human HT29 colon carcinoma and MT3 and the MT1 breast cancer model).
  • Example 7.1 Influence of the time of liposome application on the inhibition of metastasis development in MT3 mouse breast cancer
  • a group at the time - 6h (based on the tumor cell injection), another group at the times -6, -4 and -2 h, and a group at the times -6, - 2, +2 and +4 h each treated with 100 nmol total lipid liposomes per 20 g mouse iv.
  • the animals are killed, autopsied and the weights of the tumors and lungs determined.
  • Example 7.2 Influence of the dose of liposomes on the inhibition of metastasis development in the mouse
  • mice receive 50, 100 or 200 nmol total lipid combination liposomes per 20 g of mouse.
  • a single treatment with 100 nmol combination liposomes / mouse can significantly reduce metastasis.
  • lung metastases no longer occur. While no other organs are affected, muscle metastases occur in some mice.
  • Example 7.3 Inhibition of metastasis development in MT3 mouse breast cancer
  • mice of the control group receive physiological saline once, while the mice in the other groups receive 100 nmol of total lipid of the specified liposomes or corresponding amounts of active ingredients iv injected.
  • the animals are killed, an autopsy performed and the weights of the tumors and the metastatic number in the lung are determined.
  • mice of the control group receive a single saline solution while the mice in the second group receive combination liposomes injected with 100 nmol of total lipid iv.
  • the animals are killed, an autopsy and determined the metastatic number in the lung and outside the lungs.
  • Example 7.5 Inhibition of metastasis development in HT29 colon carcinoma in the mouse
  • the control group receives saline while the mice in the second group receive liposomes injected with 100 nmol of total lipid iv.
  • the animals are killed, autopsied and the weights of the tumors and the number of metastases determined.
  • Platelets activated platelets without liposomes as controls.
  • Comb-Lip aggregation in the presence of DIP-OPP-liposomes (combination liposomes).
  • Each value represents the mean +/- S.D. for a quadruple determination of at least 8 independently performed experiments.
  • Platelets Platelets without liposomes as controls
  • Kon Lip Adhesion in the presence of control liposomes.
  • Comb Lip Adhesion in the presence of DIP-OPP liposomes.
  • Collagen or fibronectin were immobilized in a 96-well cell culture plate. Subsequently, 6 ⁇ 10 4 tumor cells / well were added and incubated with 100 nmol TL liposomes for 1 hour at 37 ° C.
  • Tumor cells quantified by fluorescence measurement at: ⁇ Ex : 355 nm and XEM: 460 nm. Given the percent inhibition of adhesion in the presence of liposomes compared to the control. Each value represents the mean +/-
  • MT1 Human breast cancer cells
  • the control group received physiological saline once, while the mice in the other groups at the indicated times (based on the tumor cell injection) in each case 100 nmol
  • Fig. 4 Number of visible metastases
  • Fig. 5 Weight of extrapulmonary metastases
  • the control group received a single saline solution while the mice in the other groups received the indicated amounts (total lipid) of liposomes injected iv.
  • the animals were killed, an autopsy made and the weights of the tumors as well as the metastasis! in the
  • Fig. 7 Weight of extrapulmonary metastases
  • Liposomes DIP / OPP-L: combination liposomes with dipyridamole and OPP
  • DIP-L liposomes with dipyridamole
  • OPP-L liposomes with OPP
  • OPP free octadecyl- (1, 1-dimethyl-piperidin-4-yl) -phosphate
  • Scores [indicated is the diameter (in mmy.core): 1: 1; 1-2: 8; 2-3: 27; 3-4: 64; 4-5: 125; 5-8: 512.
  • Figure 10 Inhibition of metastasis by combination liposomes in the MT1 breast cancer model in vivo
  • mice were treated with physiological NaCl solution (control group) or combination liposomes with 100 nmol total lipid iv.
  • the animals were killed, autopsied and metastatic numbers determined in the lung and outside the lungs.
  • mice were injected with 2.5x10 6 HT29 colon carcinoma cells at time t ⁇ O. Six and two hours before, the mice were given physiological saline (control) or liposomes with 100 nmol of total lipid iv. 8 mice were used per group. After 36 days, the animals were killed, an autopsy performed and the weights of the tumors and the metastatic count were determined.
  • DOPC dioleyl phosphatidylcholine

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Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige pharmazeutische Zubereitungen und deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Bekämpfung von Metastasen auf Liposomenbasis. Bei diesen Zubereitungen handelt es sich um liposomale Formulierungen. Erfindungsgemäß umfassen diese Formulierungen, neben eventuellen zusätzlichen Stoffen, mindestens eine Substanz mit Antitumorwirkung und mindestens eine Substanz mit gerinnungshemmender Wirkung. Insbesondere sind sie aus Basislipiden und gegebenenfalls weiteren Bestandteilen, wie Helferlipiden, Membranstabilisatoren und Ladungsträgern aufgebaut, und können zur Verbesserung ihrer Wirksamkeit eine modifizierte Oberfläche enthalten.

Description

Pharmazeutische Zubereitung zur Bekämpfung von Metastasen
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung zur Bekämpfung von Metastasen auf Liposomenbasis. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Ursache für eine immer noch hohe Mortalitätsrate bei Tumorerkrankungen ist - trotz verbesserter Früherkennung und Therapie des Primärtumors - die Metastasierung, die mit lokaler chirurgischer oder strahlentherapeutischer Behandlung kaum, und mit systemischer Chemotherapie nur bedingt zu beeinflussen ist. Der Erfolg einer Tumortherapie hängt damit wesentlich von einer umfassenden Prävention der Metastasenbildung, die durch zirkulierende Tumorzellen ausgelöst wird, ab. Metastasierung kann über zwei Prozesse ablaufen. Zum einen durchläuft eine einzelne zirkulierende Tumorzelle eine komplexe Kaskade aus verschiedenen, kausal sich bedingenden Adhäsionsprozessen, bevor eine Festsetzung in einem distanten Gewebe stattfinden kann1. Der initiale Schritt der Adhäsion wird durch den endothelialen Rezeptor E-Selektin vermittelt, der die auf verschiedenen metastasierenden Krebszellen vorkommenden Kohlenhydrat-Liganden Sialyl Lewis" (sLex) und Sialyl Lewisa (sLea) erkennt. Über Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen kommt es zu einer schwach affinen Bindung der Tumorzelle an das Endothel als Voraussetzung für die sich anschließenden Schritte („Entlangrollen" an der Membran, Freisetzung weiterer Mediatoren, feste Adhäsion und Invasion ins umliegende Gewebe). Schließlich nistet sich die Tumorzelle im Sekundärgewebe ein, initiiert die Bildung eines neovaskulären Blutsystems und proliferiert2.
Neben diesem, für einzelne zirkulierende Zeilen beschriebenen Mechanismus hat zum anderen die spontane Bildung von Tumorzellmikrothromben Relevanz für das Metastasierungsgeschehen3. Insbesondere in engen Kapillarsystemen (Lunge, Lymphknoten) können diese Komplexe dazu beitragen, dass es zu einer lokalen Anreicherung der Tumorzellen kommt, aus der es wiederum durch einzelne Zellen zur Metastaseneinnistung kommt4. Darüber hinaus haben mehrere Studien gezeigt, dass sich insbesondere aktivierte Thrombozyten an Tumorzellen anlagern und so zur Abschirmung von Immunreaktionen und zur Bildung von Mikrothromben beitragen5. Als Möglichkeit für eine Blockade der Metastasierungskaskade bieten sich verschiedene Targets an, die in diesem Prozess eine essentielle Rolle spielen. Dazu gehören die Adhäsionsmoleküle auf der Endotheloberfläche und/oder die Liganden, die von der Tumorzelle exprimiert werden. Diese Targets können durch kompetitive Bindung geeigneter Inhibitoren (Antikörper, Kohlenhydrate)6 oder durch Hemmung ihrer Expression mit Antisense- oder Gen-Knockout Strategien7 ausgeschaltet werden. Andere Ansätze zielen auf die Hemmung der Angiogenese. Dieser ebenfalls essentielle Prozess der Bildung neuer Blutgefäße zur Versorgung der sich neu formierenden Metastasen schließt sich an die Adhäsionskaskade an.
Trotz dieser Fortschritte im Verständnis der Metastasierung hat die weltweite Suche nach neuen Strategien und Medikamenten zur Hemmung von Krebs bisher nicht zu routinemäßig einsetzbaren Präparaten geführt.
Gegenüber dem Stand der Technik stellt sich daher die Aufgabe, ein neuartiges Antitumormedikament auf der Basis von Liposomen zur Verhinderung der Metastasierung von Tumoren zu entwickeln.
Diese Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen 1 und 12 der vorliegenden Erfindung gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Kernpunkt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zubereitung, umfassend liposomale Formulierungen, die mindestens eine Substanz mit Antitumorwirkung und mindestens eine Substanz mit gerinnungshemmender Wirkung und gegebenenfalls weitere Stoffe beinhaltet.
Ein wichtiger Ansatzpunkt der Erfindung ist die Ausschaltung der Bildung von Aggregaten aus Tumorzellen untereinander bzw. aus Tumorzellen und Thrombozyten, die als wesentliche Voraussetzung eines Tumorzell-Engraftments angesehen wird. Dies soll durch Oberflächen-modifizierte, Wirkstoff enthaltende Liposomen erreicht werden. Zusätzlich lässt sich unter bestimmten Bedingungen durch Liposomen auch die Adhäsion der Tumorzellen an die Blutgefäßwand als alternativer Schritt einer sekundären Tumorzellansiedlung verhindern. Die im Sinne der Erfindung verwendeten Substanzen mit Antitumorwirkung sind insbesondere solche Stoffe, welche die Bildung, das Wachstum und/oder die Ausbreitung von Tumoren negativ beeinflussen bzw. hemmen. In Betracht kommen hierfür Substanzen aus der Gruppe der Zytostatika, wie Alkylantien, Mitosehemmstoffe, zytostatisch wirksamen Antimetabolite, Antibiotika, Hormone und Hormonantagonisten, sowie Alkylphospholipide. Besonders geeignet sind Alkylphospholipide, wie z.B. Tetradecylphosphatidylcholin (TPC), Hexadecylphosphatidylcholin (HPC), Heptadecylphosphatidylcholin (HpPC), Octadecylphosphatidylcholin (OPC), Hexadecyl-(1 ,1-dimethyl-piperidin-4-yl)- phosphat (HPP), Octadecyl-(1 ,1-dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat (OPP), Hexadecylphosphatidylserin (HPS), Hexadecylphosphatidylethanolamin (HPE) oder Edelfosine, da sie sich aufgrund ihrer Struktur günstig in die Membran der liposomalen Formulierung einfügen lassen.
Als Substanzen mit gerinnungshemmender Wirkung werden eingesetzt: Substanzen aus der Wirkstoffgruppe der Aggregationshemmer, wie Dipyridamol, Azetylsalizylsäure, Ticlopidin, Resveratrol, der Antikoagulantien, wie Heparin, niedermolekulares Heparin, Heparinoide, Clopidogrel, der Vitamin K Antagonisten, wie Warfarin oder Phenprocoumon.
Als besonders geeignete Substanzen mit gerinnungshemmender Wirkung im Rahmen der Erfindung haben sich die Wirkstoffe Dipyridamol und Azetylsalizylsäure erwiesen.
Die zur Realisierung der Erfindung verwendete liposomale Formulierung wird aus bekannten Bestandteilen aufgebaut. Sie besteht aus Basislipiden und enthält zusätzlich bevorzugt Helferlipide, Membranstabilisatoren und Ladungsträger, wodurch eine besonders günstige Stabilität der Zubereitung erreicht wird.
Als Basislipide im Sinne der Erfindung haben sich insbesondere Soja- Phosphatidylcholin, Ei-Phosphatidylcholin (EggPC), Hydriertes Phosphatidylcholin (HePC), Dimyristoyl-Phosphatidylcholin (DMPC), (Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin) (DPPC), Distearyl-Phosphatidylcholin (DSPC), Stearyl-Palmitoyl-Phosphatidylcholin (SPPC), Palmitoyl-Stearyl-Phosphatidylcholin (PSPC), Dioleyl-Phosphatidylcholin (DOPC), Palmitoyl-Oleyl-Phosphatidylcholin (POPC) oder Sphingomyelin bewährt.
Als Helferlipide im Sinne der Erfindung werden vorzugsweise Dioleyl- Phosphatidylethanolamin (DOPE) und Dioleyl-Phosphatidylcholin (DOPC) eingesetzt.
Als Membranstabilisator zur Realisierung der Erfindung wird Cholesterol (CH) eingesetzt.
Als Ladungsträger werden bevorzugt negative Ladungsträger eingesetzt, wie z.B. Dicetylphosphat (DCP), Stearylamin (SA), Phosphatidylsäure (PA), Phosphatidylglycerol (PG) oder Monosialogangliosid.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, auch eine Substanz zur Modifizierung der Oberfläche hinzuzusetzen. Damit kann die liposomale Formulierung auf die Erfordernisse eines Targetings angepasst werden.
Vorzugsweise wird als Substanz zur Modifizierung der Oberfläche der liposomaleή Formulierung Polyethylenglycol-Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) eingesetzt. Aber auch PEG-Sterole, Sialyl-Lewisx-Peg-PE, Sialyl-LewisA-PEG-PE, Sialyl-Lewisx-Peg- Sterole oder Sialyl-LewisA-PEG-Sterole sind wirksam. Diese Verbindungen erhöhen die Hydrophilie der liposomalen Oberfläche, schirmen die Vesikel dadurch sterisch gegenüber dem Monozyten/Phagozytensystem ab und verhindern, dass die Vesikel als Fremdkörper erkannt und vom Immunsystem eliminiert werden. Darüber hinaus erhöht eine solche Oberfläche die Affinität zu Thrombozyten, wodurch ein unspezifischer Targetingeffekt erzielt wird. Durch zusätzliche Konjugation von spezifischen Liganden wie Lewisx oder A wird das spezifische Targeting zum Wirkort (Thrombozyten, Endothelmembran) weiter erhöht.
In einer besonders geeigneten Ausführungsform der Erfindung wird die pharmazeutische Zubereitung aus den Bestandteilen Phosphatidylcholin (30-35 μmol), Octadecyl-(1.1-dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat (10-15 μmol), Cholesterol (10-15 μmol), Po!yethylenglykol2ooo-Phosphatidylethanolamin (2-3 μmol), Dicetylphosphat (5-8 μmol) und Dipyridamol (15-20 μmol) hergestellt. Besonders geeignet sind liposomale Formulierungen, in denen die Liposomen einen mittleren Durchmesser besitzen, der kleiner als 400 nm ist und die Größenverteilung einen Polydispersitätsindex kleiner 0,4 aufweist, um die Eliminierung durch das Monozyen/Phagozytensystem zu verringern, wodurch eine Akkumulation in den Aggregaten aus Thrombozyten und Tumorzellen gefördert wird.
Die Liposomen werden bevorzugt über klassische Verfahren hergestellt, also über Lipidfilmhydratisierung zur Herstellung der multilamellaren Vesikel, dann Extrusion zur Gewinnung von kleinen Vesikeln definierter Größe.
Im Einzelnen werden dazu die Stammlösungen der einzelnen Substanzen miteinander gemischt und es wird durch Verdampfen oder andere geeignete Methoden ein Lipidfilm hergestellt. Aus diesem erhält man durch die Anwendung bekannter Verfahren, wie z.B. Rehydratisierung, multilamellare Vesikel, welche dann anschließend mittels geeigneter Verfahren, vorzugsweise Extrusion, in eine homogene Suspension kleiner Vesikel mit einem Durchmesser von etwa 100-150 nm umgewandelt werden.
Die pharmazeutische Zubereitung ist zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Krankheiten, wie thromboembolische Erkrankungen und Gerinnungsstörungen geeignet, vorzugsweise dann, wenn in diesem Zusammenhang metastasenbildende Tumorerkrankungen auftreten.
Die pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung metastasenbildender Tumorerkrankungen auf Liposomenbasis gemäß der Erfindung ist völlig neuartig.
Es konnte gezeigt werden, dass die in der pharmazeutischen Zubereitung enthaltenen Kombinationsliposomen über einen ausreichenden Zeitraum stabil sind, die Aggregatbildung hemmen, die Adhäsion von Tumorzellen an Endotheloberfläche und Endothelbestandteile hemmen, im Tierversuch die Metastasenverteilung beeinflussen, sowie die Metastasierung einschränken und damit die Metastasenzahl und das Tumorgesamtgewicht reduzieren.
Die eingesetzten Liposomen haben wesentliche Vorteile gegenüber anderen Wirkstoffen. Bei der Verwendung von Oberflächen-modifizierten Liposomen wird eine Anreicherung in Tumorzell-Thrombozytenaggregaten erreicht, wodurch eine gezielte Freisetzung der eingeschlossenen Wirkstoffe in unmittelbarer lokaler Nähe zu den Targets erzielt wird.
Ein zweiter wichtiger Vorteil ist die Möglichkeit des gleichzeitigen Einschlusses von mehreren Wirkstoffen mit unterschiedlichen Wirkprinzipien in die Liposomen, wodurch eine zielgerichtete und gleichzeitige Anreicherung aller Wirkstoffe (auch bei unterschiedlicher Pharmakokinetik der Einzelkomponenten) an Tumorzellen erreicht wird und diese dadurch effizient attackiert werden können.
Neuartig und originell an den erfindungsgemäßen Kombinationsliposomen ist, dass sie eine veränderte Oberfläche besitzen und ein Zytostatikum sowie ein Antigerinnungsmittel eingeschlossen haben. Damit lässt sich synergistisch sowohl die Bindung an das Endothel (Metastasierungskaskade) als auch die Bildung von Tumorzellaggregaten (Emboliemodell) verhindern. Trotz der Komplexität der Zubereitung dieser Vesikel lassen sich diese Liposomen herstellen, und in ihren Eigenschaften (Ladung, Stabilität und Anbindung von Liganden) modifizieren und auf die Erfordernisse eines spezifischen Targetings anpassen.
Durch die Kombination von Blockade der Bindungsfähigkeit, zytotoxischer Wirkung und Hemmung der Komplexbildung durch ein Antikoagulanz in einem Vesikel tritt eine starke, weil additive oder sogar synergistische Wirkung ein.
Der Vorteil dieses neuen Wirkstoffsystems besteht darin, dass es bei verschiedenen Tumoren eingesetzt werden kann, wodurch die hohe, durch Metastasen verursachte Mortalität bei Tumorerkrankungen verringert wird, indem der Prozess der Metastasierung über verschiedene Mechanismen synergistisch gehemmt wird, durch:
- Verringerung der Aggregationsfähigkeit der Thrombozyten.
- Blockade der Bindungsfähigkeit der zirkulierenden Tumorzellen
- Unterdrückung der Bildung von Tumorzell- bzw. Tumorzeil/Thrombo- zytenaggregaten,
- Abtötung der Tumorzellen durch Freisetzung von Kanzerostatika in direkter Umgebung der Zelle.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung stellt einen völlig neuartigen Ansatz zur Metastasierungshemmung dar, der durch die komplexe und lokale Herangehensweise eine außerordentlich hohe Wirksamkeit verspricht. Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiele 1 - 7
Es wird an den Beispielen 1-6 gezeigt, wie verschiedene Vesikel hergestellt werden, die einen oder mehrere Wirkstoffe in effektiv wirkender Menge eingeschlossen haben. Daran schließt sich die Charakterisierung der physikochemischen Eigenschaften, der Lagerstabilität, sowie die der biologischen Aktivität in vitro.
Beispiel 1: Es werden Liposomen (Vesikel mit einem Durchmesser < 200 nm und einheitlicher Größenverteilung) nach bekannten Verfahren hergestellt. In diese Vesikel wird ein Zytostatikum, z.Bsp. das Alkylphospholipid Octadecyl-1 ,1- dimethyIpiperidin-4-yl-phosphat (OPP), Doxorubicin oder Mitoxantron eingeschlossen, um Tumorzellen spezifisch zu schädigen. Zusätzlich wird in diese Liposomen ein Antikoagulans (AK) verkapselt, um Tumorzellaggregate aufzulösen. Größe und Größenverteilung (quasielastische Lichtstreuung) und die aktuelle Wirkstoffkonzentration (HPTLC) werden bestimmt. Darüber hinaus wird die Stabilität der Liposomen bei 40C in Puffer und bei 37°C im Serum über Größenveränderungen und Wirkstofffreisetzung charakterisiert.
Ein typischer Ansatz wird an folgendem Beispiel näher ausgeführt:
Es werden folgende Komponenten als Stammlösungen in einen 50 ml Rundkolben pipettiert: 31 ,2 μmol Phosphatidylcholin (PC), 12 μmol Octadecyl-(1.1-dimethyl piperidin-4-yl)-phosphat (OPP), 12 μmol Cholesterol (CH), 2,8 μmol Polyethylenglykol2ooo-Phosphatidylethanolamin (PEG-PE), 6 μmol Dicetyiphosphat (DCP) und 15,9 μmol Dipyridamol (DIP). Der Lipidfilm wird durch Verdampfen des Lösungsmittels bei 42 0C im Vakuum hergestellt und anschließend mit 2 ml PBS, pH 7.4 wieder resuspendiert. Dabei wird die Suspension gelblich trüb und besteht aus MLV, die über Nacht geschüttelt werden. Die MLV werden anschließend wiederholt durch einen Miniextruder gedrückt, der zwei zusammengelegte Polykarbonatfilter mit 400 nm Porendurchmesser enthält. Nach 19facher Extrusion liegen vollständig große unilamellare Vesikel (LUVs) mit einem mittleren Durchmesser von 131 ±28 nm vor. Die Suspension hat einen Polydispersitätsindex (PI) von 0,14 ± 0,07. Das nicht eingeschlossene DIP wird durch Größenausschlusschromatographie über eine Sephadex-Säule (G50 fine) abgetrennt. Der Gehalt an PC wird mittels Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC) bestimmt und beträgt nach der Säulentrennung 16,4 ± 1 ,0 μmol/ml, während etwa 150 ± 24 μg DIP/ml Liposomen eingeschlossen sind.
Die Liposomen sind im Kühlschrank mindestens 8 Wochen lagerfähig, ohne dass sich ihre Eigenschaften wesentlich ändern (maximale Größenzunahme von 6 % und einem Anstieg des Polydispersitätsindex PI um maximal 30 %).
Beispiel 2: Liposomen mit Dipyridamol und Mitoxantron
In einem typischen Ansatz werden Liposomen mit einem Totallipidgehalt von 42,4 μmol/ml nach bekanntem Verfahren hergestellt. Dafür werden 21 ,6 μmol PC, 12 μmol CH, 6 μmol DCP, 2,8 μmol PEG, 8 μmol Dipyridamol und 4 mg Mitoxantron im Lösungsmittelgemisch Dichlormethan/Methanol (7:3, v/v) aufgelöst, das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen, um einen dünnen Lipidfilm zu erhalten. Dieser wird in PBS (ohne Ca, Mg) resuspendiert, die Suspension über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt, um Multilamellare Vesikel zu erhalten.
Die Liposomen werden mittels Miniextruder, ausgestattet mit zwei Polykarbonatmembranen mit Porendurchmesser von 400 nm, 19-mal extrudiert, um eine einheitliche Größenverteilung der Liposomen zu erhalten. Anschließend werden die Liposomen über eine Sephadex G50fine Säule gegeben, um mittels Größenausschlusschromatographie das nicht eingeschlossene DIP und Mitoxantron abzutrennen.
Die Größe und der Polydispersitätsindex (PI) der Liposomen wird mittels PCS ermittelt. Die mittlere Größe der Liposomen beträgt 123 nm, wobei der PI für diese Liposomen 0,134 betrug.
Die Bestimmung des eingeschlossenen MTX erfolgt mittels HPTLC. Sie beträgt für diese Liposomen bis zu 850 μg/ml liposomaler Suspension. Dies entspricht einer Einschlussrate von 20 %.
Beispiel 3: Liposomen mit Dipyridamol und Doxorubicin
In einem typischen Ansatz werden Liposomen mit einem Totallipidgehalt von 32 μmol/ml nach bekanntem Verfahren hergestellt. Dafür werden zunächst 15,6 mM PC, 6 mM CH, 3 mM DCP, 1,4 mM PEG und 8 mM Dipyridamol in einem Rundkolben in einem organischen Laufmittel gelöst und anschließend das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen, um einen dünnen Lipidfilm zu erhalten. Dieser wird in Zitratpuffer pH 3,8 resuspendiert, die Suspension über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt, um
Multilamellare Vesikel (MLV) zu erhalten.
Die MLV werden mittels Miniextruder, ausgestattet mit zwei Polykarbonatmembranen mit Porendurchmesser von 400 nm, 19-mal extrudiert, um kleine Vesikel mit einer einheitlichen Größenverteilung zu erhalten.
Doxorubicin wird über die bekannte pH-Sprungtechnik verkapselt. Dazu werden 800 μl der Liposomensuspension auf einen pH Wert von 7,6 mittels NaOH-Lösung gebracht und anschließend im Wasserbad auf 60 0C erhitzt. Anschließend werden
140 μl Lösung zugegeben, die 3,5 mg Doxorubicin in physiologischer
Kochsalzlösung, enthält. Unverkapseltes Doxorubicin wird durch
Größenausschlußchromatographie an Sephadex G50fine abgetrennt.
Die Größe und der Polydispersitätsindex (PI) der Liposomen wird mittels PCS ermittelt. Die mittlere Größe der Liposomen beträgt 182 nm, wobei diese Liposomen einen von 0,263 haben.
Die Bestimmung des eingeschlossenen Doxorubicin erfolgt mittels HPTLC. Sie beträgt für diese Liposomen bis zu 950 μg/ml liposomaler Suspension.
Beispiel 4: Stabilität der Liposomen
Nach Herstellung der Liposomen werden diese bei 4°C gelagert. Unter diesen
Bedingungen wurde über einen Zeitraum von mehr als 100 Tagen keine signifikante
Änderung in der mittleren Liposomengröße und im Polydispersitätsindex festgestellt.
Die Änderungen betrugen lediglich 7 % (Anstieg im Durchmesser) bzw. 11 %
(Polydispersitätsindex).
Beispiel 5: Wirksamkeit der Liposomen wird in vitro
Die Wirksamkeit der Liposomen wird in vitro in verschiedenen Testsystemen charakterisiert. Der Einfluß der Liposomen auf die Adhäsion von Tumorzellen und Thrombozyten wird unter statischen Bedingungen im Bindungsassay bestimmt. Zusätzlich wird der Einfluss der Liposomen auf das Aggregationsverhalten von Tumorzellen in Abwesenheit und Anwesenheit von Thrombozyten, sowie die Komplexbildung zwischen Tumorzellen und Thrombozyten als essentieller Schritt der Metastasierung wird als Testsysteme in vitro verwendet. Im Folgenden sind einige ausgewählte Beispiele für Testsysteme näher ausgeführt:
Beispiel 5.1. Hemmung der Thrombozytenaggregation durch Liposomen
100 μl Plättchenreiches Plasma (PRP) mit einer Thrombozytenzahl von 2,5x108/ml werden pro Well einer 96-WeII Platte gegeben und mit 0,05 u Thrombin/Well aktiviert. Bei einigen Wells wird auf die Aktivierung verzichtet, um nicht-aktivierte Thrombozyten als Kontrolle mitführen zu können. Zur Hemmung der Aggregation werden im nächsten Schritt die Liposomen (100 nmol Totallipid) bzw. die freien Substanzen in äquimolaren Mengen zugegeben und die Zunahme der Transmission photometrisch bei λ = 595 über einen Zeitraum von 120 Minuten wiederholt gemessen.
Durch die Aktivierung der Plättchen mit Thrombin kommt es in Folge der zunehmenden Thrombozytenaggregation zu einer Abnahme der Extinktion und zu einer Zunahme der Transmission. Die Ergebnisse sind als prozentuale Änderung der Transmission in Bezug auf den ersten Messwert (t = 0; Transmission = 0%) angegeben, die nach Formel (I) berechnet wird.
Figure imgf000011_0001
EMW= Extinktion zum gemessenen Zeitpunkt (t=x min) Extinktion zum Zeitpunkt der ersten Messung (t=0)
Ergebnis: Es kann eine Hemmung der Aggregation durch die Kombinationsliposomen um 40 % erreicht werden, während durch Kontrollliposomen keine Hemmung beobachtet wird (siehe Abb. 1). DlP als freier Wirkstoff hemmt in einer Konzentration von 10 nmolΛΛ/ell die Thrombozytenaggregation um 30 % (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 5.2. Hemmung der Adhäsion von Thrombozyten an immobilisierte Tumorzellen
5.2.1 Markierung der Thrombozyten mit Calcein-AM:
2,5χ108 Thrombozyten/ml werden mit 50 μl Calcein-AM Stocklösung 0,5mM, in DMSO) versetzt und für 90 min bei 37 0C inkubiert. Anschließend werden die Thrombozyten dreimal mit Pufferlösung (vorzugsweise mit TH-Puffer, pH 7,4) gewaschen. Die Fluoreszenz-markierten Thrombozyten werden durch Zentrifugation der Zellsuspension bei 1000 g"1 für je 10 min erhalten und können über die Messung der Fluoreszenzintensität im Fluostar bei einer Anregungswellenlänge von λex = 490 nm und der Emissionswellenlänge λ = 530 nm über eine Standardkurve quantifiziert werden.
5.2.2 Adhäsionstest
In eine 96-Well-Platte werden 100 μl einer Suspension von 1x106 Tumorzellen/ml RPMI-Medium mit 10% FCS einpipettiert und über Nacht zur Anheftung im Brutschrank bei 37 0C und 5 % CO2 inkubiert. Danach wird das Medium abgezogen und die angehefteten Zellen mit PBS gewaschen. Zur Blockade unspezifischer Bindungsstellen werden die Zellen eine Stunde mit 100 μl einer 1%igen BSA-Lösung bei RT inkubiert. Dann werden die Überstände entfernt und die Zellen erneut mit PBS gewaschen. Im nächsten Schritt werden dann 100 μl der Suspension mit 2,5x108/ml Thrombozyten in jedes Well gegeben und die Thrombozyten (PRP) durch zusätzliche Zugabe von 0,05 u Thrombin aktiviert. Zur Hemmung der Adhäsion werden im nächsten Schritt die Tumorzellen und Thrombozyten mit Liposomen (100 nmol Totallipid/Well) bzw. 10 μl einer 1 M EDTA-Lösung/Well als Kontrolle inkubiert. Parallel dazu erfolgt die Einsaat und serielle Verdünnung von Fluoreszenzmarkierten Thrombozyten in eine schwarze Maxi-Sorp-Platte (Nunc) und deren Aktivierung durch 0,05 u Thrombin, um eine Standardreihe für die Quantifizierung gebundener Thrombozyten zu erhalten.
Nach 1 h Inkubation bei 37 0C werden die Überstände aus der Versuchsplatte entfernt und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Dann erfolgt die Zugabe von 50 μl Lysepuffer/Well in die Kontrollplatte und von 50 μl Lysepuffer und 50 μl PBS je Well der Versuchsplatte. Die Platten werden 3 Minuten geschüttelt, bevor der Inhalt der Versuchsplatte Well für Well in die Messplatte transferiert wird und die Messung im Fluostar bei einer Anregungswellenlänge von λεx = 490 nm und der Emissions- Wellenlänge λ = 530 nm durchgeführt wird. Die Zahl der gebundenen Thrombozyten wird über die Standardkurve bestimmt und ist in Prozent zugegebener Zellen angegeben.
Lysepuffer: 2,5 g Sodiumdodecylsulfat (SDS) mit 1 ml 10 N NaOH versetzen und mit PBS auf 50 ml auffüllen, filtrieren. Ergebnis: Die aktivierungsbedingte Steigerung der Adhäsion der Thrombozyten an HT29- Kolonkarzinomzellen (Abb. 2A) sowie an MT-3 Brustkrebszellen (Abb. 2B) kann durch Kombinationsliposomen komplett verhindert werden.
Beispiel 5.3. Hemmung der Adhäsion von Tumorzellen an immobilisierte Endothel- bestandteile durch Liposomen
5.3.1 Fluoreszenzmarkierung der Zellen:
Tumorzellen (MT3 - und MT1 - Brustkrebszellen, und Lewis Lung Lungenkarzinomzellen) werden wie unter 2.2.1 beschrieben Fluoreszenz-markiert, jedoch wird als Marker 282 nmol Hoechst 33258/75 cm2 Kulturflasche verwendet. Die so markierten Zellen werden in PBS (Ca, Mg) aufgenommen und auf 1 ,2χ106 Zellen/ml eingestellt.
5.3.2 Immobilisierung der Adhäsionskomponenten:
In eine 96-Well-lmmunoSorp-Platte werden pro Well jeweils 100 μl Ca/Mg-PBS mit den zu untersuchenden Endothelbestandteilen mit 200 ng Kollagen IV oder 1 μg Fibronektin pipettiert und über Nacht zur Anheftung bei 4°C stehen gelassen. Danach wird der Überstand abgezogen und zur Blockade unspezifischer Bindungsstellen mit 100 μl einer 1%igen BSA-Lösung bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Abschließend wird mit PBS gewaschen.
5.3.3 Bestimmung der Adhäsionshemmung
Die Hemmung der Adhäsion der Tumorzellen durch Liposomen wird anschließend wie folgt durchgeführt.
In die Wells werden 50 μl der Hoechst 33258 markierten Tumorzellen und 100 nmol
Kombinationsliposomen gegeben. Es wird für 1h bei 370C inkubiert, bevor nicht gebundene Tumorzellen durch Waschen mit Puffer entfernt werden. Dann werden zu den Wells mit Tumorzellen 50 μl PBS und 50 μl Lysepuffer gegeben und es wird 3
Minuten geschüttelt.
Parallel dazu wird eine Standardreihe mit Tumorzellen in einer schwarzen Maxi-Sorp
Platte mitgeführt, die ebenfalls durch 50 ml Lysepuffer aufgelöst werden. Zu dieser
Platte werden nun die Lysate der Inkubationsplatte Well für Well transferiert und anschließend die Fluoreszenzmessung im SLT Fluostar Mikroplattenreader bei %EX = 355 nm und XEM = 460 nm vorgenommen. Die Quantifizierung der gebundenen Tumorzellen erfolgt dann über die mittlere Fluoreszenzintensität aus der Standardreihe für jede Tumorzelllinie.
Ergebnis: In der Abbildung 3 sind die Ergebnisse für die Hemmung der Adhäsion von MT3- , MT1- und Lewis Lung- und Tumorzellen dargestellt. Mit den Kombinationsliposomen lässt sich die Adhäsion von MT3 an Kollagen und an Fibronektin um 65 bzw. 52% hemmen. Für MT1 Brustkrebszellen wurden Hemmwerte von 34% und 6% erzielt.
Beispiel 5.4. Hemmung der Komplexbildung aus Tumorzellen und Thrombozyten durch Kombinationsliposomen in vitro.
Tumorzellen in der exponentiellen Wachstumsphase werden zweimal mit Ca2+/Mg2+- PBS gewaschen und mit 94 nmol des Hoechst-Farbstoffes 33258 in 2 ml Ca2-1VMg2+- PBS für 30 min bei 37 0C inkubiert. Nach Entfernung des Farbstoffes werden die Zellen mit Ca2-1VMg2+-PBS gewaschen und durch Trypsinierung geerntet, in 2 ml Medium aufgenommen, bei 200 g'1 für 2 min zentrifugiert und anschließend in 2 ml Ca2-VMg2+-PBS resuspendiert. Die Zellsuspension wird dann auf eine definierte Zellzahl eingestellt.
Im Versuch werden 1x104 mit Hoechst 33258 markierte MT3 Tumorzellen, 2,5χ106 Thrombozyten und 10 nmol Liposomen in 100 μl Thyrode-Puffer (TH-Puffer) aufgenommen, mit 0,01 u Thrombin aktiviert und für 20 min unter Raumtemperatur mit gleichmäßiger Bewegung inkubiert. Anschließend wird das Gemisch mit TH- Puffer auf 2 ml verdünnt und mit der Zytospin-Zentrifuge bei 1500 rpm und 20 min auf Objektträger aufgebracht. Danach werden die Proben mit einem Tropfen Eindeckmittel (Fluorescent Mounting Medium) und einem Deckgläschen blasenfrei abgedeckt. Die Proben können dann unter dem Fluoreszenzmikroskop (Axiophot, Zeiss) ausgewertet werden. Um die mit Hoechst 33258 gefärbten Tumorzellen sichtbar zu machen, werden Filter mit einer Anregungswellenlänge von λ = 365 nm und einer Emissionswellenlänge von λ = 395 nm verwendet.
Für die in der Tabelle 1 zusammengefassten Ergebnisse wurden pro Versuch 2 Objektträger mit jeweils 2 Bildausschnitten ausgezählt, wobei 5 Versuche durchgeführt wurden. Tabelle 1 : Hemmung der Tumorzellkomplexbildung in Gegenwart von Thrombozyten durch Kombinationsliposomen in vitro
MT3 Zellen1 MT3 Zellen2 Aggregate3 MT3 Zellen in Aggregaten4 In Gegenwart von: n ± S.D. n + S.D. [%]
+THR 81 ± 35 2.3 ± 2.0* 18.1 ± 13.0*
+aTHR 140 ± 65 5.9 ± 3.2 31.3 + 13.9
+aTHR + Kon-L 157 ± 56 6.9 ± 2.9 35.6 ± 11.0
+aTHR + OPP-L 140 ± 48 5.1 ± 2.1 29.1 ± 10.0
+aTHR + DIP-L 103 ± 61 3.4 ± 3.0* 23.7 ± 13.4
+aTHR+DIP/OPP-L 82 ± 34 1.8 ± 1.5* 16.9 ± 11.7*
1 ' MT3 Zellen werden mit den angegeben Komponenten (Abk.: THR: Thrombozyten; aPt: aktivierte Thrombozyten; Kon-L: Leere Kontroll -; OPP-L; DIP-L and DIP/OPP-L: Liposomen mit eingeschlossenem Dipyridamol, OPP oder beiden Wirkstoffen).
2 Zahl der MT3 Zellen in dem ausgezählten Mikroskopiebild.
3 Mittlere Zahl der Aggregate mit mehr als fünf MT3 Tumorzellen.
4 Mittlere Zahl von MT3 Zellen [in %] in Bezug auf Totalzahl der Tumorzellen.
* Signifikant verschieden zu Kategorie"MT3 Zellen + aTHR" (Student's t-Test, p<0.05).
Ergebnis: Durch die Kombinationsliposomen lässt sich die Aggregation (Komplexbildung) der Tumorzellen komplett verhindern, während sie ohne Liposomenzusatz auf 172 % gesteigert wird, wenn die Thrombozyten aktiviert werden.
Beispiel 6: Verträglichkeitsstudie für die Kombinationsliposomen
Jeweils 6 Nudemäuse pro Gruppe wurden einmalig Kombinationsliposomen mit 50, 100 oder 200 nmol Totallipid intravenös injiziert und als Charakteristikum für toxische Effekte das allgemeine Verhalten, hämatologische und Körpergewichtsänderungen erfasst. Die Veränderungen im untersuchten Dosisbereich waren gering. Es trat keine Veränderung im Verhalten auf. Die Änderung des Körpergewichtes betrug zwischen 5 und 7% und war damit im Normalbereich und nicht Wirkstoff verursacht. Lediglich eine klare Leukopenie (Maximum nach 2 h mit Reduktion um 80%) und Thrombopenie (Maximum nach 6 h mit Reduktion um 30%) wurde beobachtet, beide Effekte waren nach 24 Stunden wieder normalisiert. Im nächsten Beispiel werden Liposomenformulierungen in therapeutischen Untersuchungen getestet.
Beispiel 7: Therapeutische Wirksamkeit der liposomalen Formulierungen im MT3 Brustkrebsmodell
Der Antimetastasierungeffekt wird im Mausmodell in verschiedenen Tumormodellen mit unterschiedlichem Metastasierungspotenzial getestet (z.Bsp. im humanen HT29 Kolonkarzinom- und MT3- und das MT1 -Brustkrebsmodell).
Ausgewählte Beispiele für die therapeutischen Studien:
Beispiel 7.1. Einfluß des Zeitpunktes der Liposomenapplikation auf die Hemmung der Metastasenentwicklung beim MT3 Brustkrebs in der Maus
5x106 MT3 Brustkrebszellen aus der Zellkultur werden zum Zeitpunkt t=0 in je 4 NMRl nu/nu - Mäuse pro Behandlungsgruppe i.v. injiziert. Neben der Kontrollgruppe, die einmalig physiologische Kochsalzlösung erhält, wird eine Gruppe zum Zeitpunkt - 6h (bezogen auf die Tumorzellinjektion), eine weitere Gruppe zu den Zeitpunkten -6, -4 und -2 h, sowie eine Gruppe zu den Zeitpunkten -6, -2, +2 und +4 h mit jeweils 100 nmol Totallipid an Liposomen pro 20 g Maus i.v. behandelt. Nach 29 d werden die Tiere abgetötet, eine Autopsie vorgenommen und die Gewichte der Tumoren sowie der Lungen bestimmt.
Ergebnis: Die Resultate sind in den Abbildungen 4 und 5 dargestellt und zeigen, dass bei einer einmaligen Behandlung 6 Stunden vor Tumorzellinjektion die stärkste Hemmung in der Zahl der sichtbaren Metastasen (Abb. 4) und im Gewicht der extrapulmonalen Metastasen (Abb. 5) erhalten wird. Trotz Verschiebung des Metastasierungsmusters von Lungen- zu mehr Muskelmetastasen wird die Gesamtzahl an Metastasen stark reduziert und es werden keine anderen Organe befallen.
Beispiel 7.2. Einfluss der Dosis der Liposomen auf die Hemmung der Metastasenentwicklung in der Maus
Das Experiment wird entsprechend 7.1 durchgeführt mit der Abwandlung, dass nur zum Zeitpunkt -6 h behandelt wird, jedoch mit unterschiedlichen Dosierungen von Liposomen. Die Mäuse erhalten 50, 100 oder 200 nmol Totallipid Kombinationsliposomen pro 20 g Maus.
Wie in den Abbildungen 6 und 7 dargestellt, kann mit einer einmaligen Behandlung mit 100 nmol Kombinationsliposomen/Maus eine signifikante Reduktion der Metastasierung erzielt werden. In einigen Tieren treten keine Lungenmetastasen mehr auf. Während auch keine anderen Organe befallen sind, treten bei einzelnen Mäusen Muskelmetastasen auf.
Beispiel 7.3. Hemmung der Metastasenentwicklung beim MT3 Brustkrebs in der Maus
5x106 MT3 Brustkrebszellen werden zum Zeitpunkt t=0 in je 6 NMRI nu/nu - Mäuse pro Behandlungsgruppe i.v. injiziert. Sechs Stunden vor Tumorzellinjektion erhalten die Mäuse der Kontrollgruppe einmalig physiologische Kochsalzlösung, während die Mäuse in den anderen Gruppen 100 nmol Totallipid der angegeben Liposomen bzw. korrespondierende Mengen an Wirkstoffen i.v. injiziert erhalten. Am Versuchsende werden die Tiere abgetötet, eine Autopsie vorgenommen und die Gewichte der Tumoren sowie die Metastasenzahl in der Lunge bestimmt.
Ergebnis: Durch die Behandlung mit DIP-OPP-Liposomen wird die Gesamtzahl der Metastasen um 79,1% von durchschnittlich 9.6 pro Tier auf 2.0 reduziert (Abbildung 8). Der Hemmeffekt zeigt sich auch in Vergleich der Scores, die neben der Zahl auch die Größe der Metastasen berücksichtigen. Während in der Kontrollgruppe die durchschnittliche Scorezahl 151 beträgt, wird nach Behandlung mit den angegeben DIP-OPP-Liposomen nur ein durchschnittlicher Score von 40 erhalten. Das entspricht einer Hemmwirkung von 73,4 %. Alle anderen Liposomen bzw. die unverkapselten Wirkstoffe haben keine oder eine deutlich geringere Wirkung (Abbildung 9).
Beispiel 7.4. Hemmung der Metastasenentwicklung beim MT1 Brustkrebs in der Maus
5x106 MT1 Brustkrebszellen werden zum Zeitpunkt t=0 in je 6 NMRI nu/nu - Mäuse pro Behandlungsgruppe i.v. injiziert. Sechs Stunden vor Tumorzellinjektion erhalten die Mäuse der Kontrollgruppe einmalig physiologische Kochsalzlösung, während die Mäuse in der zweiten Gruppe Kombinationsliposomen mit 100 nmol Totallipid i.v. injiziert erhalten. Am Versuchsende werden die Tiere abgetötet, eine Autopsie vorgenommen und die Metastasenzahl in der Lunge und ausserhalb der Lunge bestimmt.
Ergebnis: Durch die Behandlung mit DIP-OPP-Liposomen kann die mittlere
Lungenmetastasenzahl von 81,3 auf 10,8 (entspricht 86,7%) reduziert werden
(Abbildung 10).
Beispiel 7.5. Hemmung der Metastasenentwicklung beim HT29 Kolonkarzinom in der Maus
2,5x106 HT29 Kolonkarzinomzellen werden zum Zeitpunkt t=0 in je 6 NMRI nu/nu - Mäuse pro Behandlungsgruppe i.v. injiziert. Sechs und zwei Stunden vor Tumorzellinjektion erhält die Kontrollgruppe physiologische Kochsalzlösung, während die Mäuse in der zweiten Gruppe jeweils Liposomen mit 100 nmol Totallipid i.v. injiziert erhalten. Am Versuchsende werden die Tiere abgetötet, eine Autopsie vorgenommen und die Gewichte der Tumoren sowie die Metastasenzahl bestimmt.
Ergebnis: In einem typischen Versuch wiesen die Tiere in der Kontrollgruppe eine durchschnittliche Metastasenzahl von 19 auf, die in der Lunge (14,75), im Herz (3,75) und im Muskel (0,5) auftraten. Durch Behandlung mit DIP-OPP-Liposomen konnte die Gesamtzahl der Metastasen auf 7,5 und damit um 40% reduziert werden (Abbildung 11).
Alle in der vorangehenden Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und den Abbildungen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein. Legende zu den Abbildungen
Abbildung 1: Hemmung der Aggregation von Thrombozyten durch Kombinations- liposomen in Plasma
Dargestellt sind die Mittelwert der Transmission ± S.D. 80 min nach der Aktivierung in Bezug auf den ersten Messwert (Transmission= 0%). 2,5x107 Thrombozyten im Plasma (PRP) wurden mit 0,05 units Thrombin aktiviert und 100 nmol Liposomen zugegeben. Die Änderung der Extinktion in der Thrombozytensuspension wurde bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert +/- S.D. für eine Vierfachbestimmung von mindestens 10 unabhängig durchgeführten Experimenten.
Thrombozyten: aktivierte Thrombozyten ohne Liposomen als Kontrolle.
Kon Lip: Aggregation in Gegenwart von Kontrollliposomen.
Komb-Lip: Aggregation in Gegenwart von DIP-OPP-Liposomen (Kombinations- liposomen).
(*): signifikant verschieden zur Kontrolle (p < 0,05).
Abbildung 2: Hemmung der Adhäsion von aktivierten Thrombozyten an immobilisierte Tumorzellen durch Kombinationsliposomen
1 *105 Tumorzellen/Well (A: HT 29 Kolonkarzinom; B: MT3 Brustkrebs) wurden in einer 96-WeII Platte immobilisiert und nach Behandlung mit BSA mit 2,5 x 107 Calcein-AM-markierten Thrombozyten (mit/ohne Thrombinaktivierung) und 100 nmol DIP-OPP-Liposomen (Kombinationsliposomen) bei 37°C inkubiert. Nach der Zelllyse wurde die Fluoreszenzintensität der gebundenen Thrombozyten bei: λEX: 490 nm und λεivi: 530 nm gemessen.
Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert +/- S.D. für eine Vierfachbestimmung von mindestens 8 unabhängig durchgeführten Experimenten.
Thrombozyten: Thrombozyten ohne Liposomen als Kontrolle Kon Lip: Adhäsion in Gegenwart von Kontrollliposomen. Komb-Lip: Adhäsion in Gegenwart von DIP-OPP-Liposomen. (*): signifikant verschieden zur Kontrolle (p < 0,05).
Abbildung 3: Hemmung der Adhäsion von Tumorzellen an immobilisiertes Kollagen und Fibronektin durch Kombinationsliposomen
In einer 96-Well-Zellkulturplatte wurden Kollagen bzw. Fibronektin immobilisiert. Anschließend wurden 6x104 Tumorzellen/Well zugegeben und mit 100 nmol TL Liposomen für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Nach der Zelllyse der gebundenen Tumorzelle wurde der Anteil der gebunden
Tumorzellen mittels Fluoreszensmessung bei: λEx: 355 nm und XEM: 460 nm quantifiziert. Angegeben ist die prozentuale Hemmung der Adhäsion in Gegenwart von Liposomen im Vergleich zur Kontrolle. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert +/-
S.D. für eine Vierfachbestimmung von mindestens 5 unabhängig durchgeführten
Experimenten.
MT3: Humane Brustkrebszellen
MT1 : Humane Brustkrebszellen
LL: Murines Lungenkarzinom
Abbildungen 4 und 5 : Einfluss des Schedules und des Zeitpunktes der Behandlung mit Liposomen auf die Ausbildung von Metastasen in der Maus
5χ106 MT3 Brustkrebszellen wurden zum Zeitpunkt t=0 in je 4 NMRI nu/nu - Mäuse pro Behandlungsgruppe i.v. injiziert. Die Kontrollgruppe erhielt einmalig physiologische Kochsalzlösung, während die Mäuse in den anderen Gruppen zu den angegebenen Zeitpunkten (bezogen auf die Tumorzellinjektion) jeweils 100 nmol
Totallipid an Liposomen pro 20 g Maus i.v. injiziert erhielten. Nach 29 d wurden die
Tiere abgetötet, eine Autopsie vorgenommen und die Gewichte der Tumoren sowie die Metastasenzahl bestimmt.
Abb. 4: Anzahl sichtbarer Metastasen
Abb. 5: Gewicht extrapulmonaler Metastasen
Abbildungen 6 und 7: Einfluss der Liposomendosis auf die Ausbildung von Metastasen in der Maus
5x106 MT3 Brustkrebszellen wurden zum Zeitpunkt t=0 in je 4 NMRI nu/nu - Mäuse pro Behandlungsgruppe i.v. injiziert. Sechs Stunden vor Tumorzellinjektion erhielt die Kontrollgruppe einmalig physiologische Kochsalzlösung, während die Mäuse in den anderen Gruppen die angegeben Mengen (Totallipid) an Liposomen i.v. injiziert erhielten. Am Versuchsende wurden die Tiere abgetötet, eine Autopsie vorgenommen und die Gewichte der Tumoren sowie die Metastasenzah! in der
Lunge bestimmt.
Abb. 6: Anzahl sichtbarer Metastasen
Abb. 7: Gewicht extrapulmonaler Metastasen
Abbildungen 8 und 9: Vergleich der Wirksamkeit verschiedener Liposomen auf die Metastasenentwicklung in der Maus beim MT3 Brustkrebs
5x106 MT3 Brustkrebszellen wurden zum Zeitpunkt t=0 in je 6 NMRI nu/nu - Mäuse pro Behandlungsgruppe i.v. injiziert. Sechs Stunden vor Tumorzellinjektion erhielt die Kontrollgruppe einmalig physiologische Kochsalzlösung, während die Mäuse in den anderen Gruppe die angegeben Liposomen mit 100 nmol Totallipid bzw. korrespondierenden Mengen an Wirkstoffen i.v. injiziert erhielten. Am Versuchsende wurden die Tiere abgetötet, eine Autopsie vorgenommen und die Gewichte der Tumoren sowie die Metastasenzahl in der Lunge bestimmt. Abb. 8: Anzahl der pulmonalen und extrapulmonalen Metastasen Abb. 9: Scores der Metastasen
Liposomen: DIP/OPP-L: Kombinationsliposomen mit Dipyridamol und OPP
DIP-L: Liposomen mit Dipyridamol
OPP-L: Liposomen mit OPP
CON-L: Leere Kontrollliposomen
OPP: freies Octadecyl-(1 , 1 -dimethyl-piperidin-4-yl)- phosphat
DIP: freies Dipyridamol
Scores [angegeben ist der Durchmesser (in mmy.Score]: 1: 1; 1-2: 8; 2- 3: 27; 3-4: 64; 4-5: 125; 5-8: 512.
Abbildung 10: Hemmung der Metastasenbildung durch Kombinationsliposomen im MT1 Brustkrebsmodel in vivo
NMRI nu/nu - Mäuse erhielten zum Zeitpunkt t=0 je 5x106 MT1 Brustkrebszellen i.v. injiziert. Sechs Stunden vor Tumorzellinjektion wurden die Mäuse mit physiologischer NaCI-Lösung (Kontrollgruppe) oder Kombinationsliposomen mit 100 nmol Totallipid i.v. behandelt. Nach 48 Tagen wurden die Tiere abgetötet, eine Autopsie vorgenommen und die Metastasenzahl in der Lunge und außerhalb der Lunge bestimmt.
Pro Gruppe wurden 6 Mäuse eingesetzt. * Signifikant verschieden zur Kontrollgruppe (P< 0,05) Abbildung 11 : Hemmung der Metastasenbildung durch Liposomen im HT29 Kolonkarzinommodel in vivo
NMRI nu/nu - Mäuse erhielten zum Zeitpunkt t^O je 2,5x106 HT29 Kolonkarzinomzellen i.v. injiziert. Sechs und zwei Stunden davor erhielten die Mäuse physiologische Kochsalzlösung (Kontrollgruppe) oder Liposomen mit 100 nmol Totallipid i.v. verabreicht. Pro Gruppe wurden 8 Mäuse eingesetzt. Nach 36 Tagen wurden die Tiere abgetötet, eine Autopsie vorgenommen und die Gewichte der Tumoren sowie die Metastasenzahl bestimmt.
E
Abkürzungsverzeichnis
CH Cholesterol
DCP Dicetylphosphat
DMPC, Dimyristoyl-Phosphatidylcholin
DOPC, Dioleyl-Phosphatidylcholin
DOPE Dioleyl-Phosphatidylethanolamin
DPPC, Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin
DSPC, Distearyl-Phosphatidylcholin
EggPC, Ei-P hosphatidylcholin
HePC, Hydriertes Phosphatidylcholin
HPC Hexadecylphosphatidylcholin
HPE Hexadecylphosphatidylethanolamin
HPP Hexadecyl-(1 , 1 -dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat
HpPC Heptadecylphosphatidylcholin
HPS Hexadecylphosphatidylserin
Kon-Lip Kontroll-Liposomen
LUV Large unilamellar vesicles (Große unilamellare Vesikel)
MLV Multilamellare Vesikel
OPC Octadecylphosphaüdylcholin
OPP Octadecyl-(1 , 1 -dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat
PA Phosphatidylsäure
PE Phosphatidylethanolamin
PEG Polyethylenglykol
PG Phosphatidylglycerol
PI Polydispersitätsindex
POPC, Palmitoyl-OIeyl-Phosphatidylcholin
PSPC1 Palmitoyl- Stearyl-Phosphatidylcholin
SA Stearylamin
SPPC, Stearyl-Palmitoyl-Phosphatidylcholin
TPC, Tetradecylphosphatidylcholin Literaturverzeichnis
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Claims

Patentansprüche
1. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine liposomale Formulierung, welche
- mindestens eine Substanz mit Antitumorwirkung und
- mindestens eine Substanz mit gerinnungshemmender Wirkung, sowie
- gegebenenfalls weitere Stoffe enthält.
2. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass die liposomale Formulierung mindestens ein Basislipid, bevorzugt alle der folgenden Bestandteile umfasst:
Basislipid,
Helferlipid,
Membranstabilisatoren,
Ladungsträger und gegebenenfalls eine Substanz zur Modifizierung der Oberfläche.
3. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2, wobei als Basislipide Soja- Phosphatidylcholin, EggPC (Ei-Phosphatidylcholin), HePC (Hydriertes Phosphatidylcholin), DMPC (Dimyristoyl-Phosphatidylcholin), DPPC (Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin), DSPC (Distearyl-Phosphatidylchoiin), SPPC (Stearyl-Palmitoyl-Phosphatidylcholin), PSPC (Palmitoyl-Stearyl- Phosphatidylcholin), DOPC (Dioleyl-Phosphatidylcholin), POPC (Palmitoyl- Oleyl-Phosphatidylcholin) oder Sphingomyelin eingesetzt werden.
4. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2-3, wobei als Helferlipide DOPE (Dioleyl-Phosphatidylethanolamin) oder DOPC (Dioleyl- Phosphatidylcholin) eingesetzt werden.
5. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2-4, wobei als Membranstabilisator CH (Cholesterol) eingesetzt wird.
6. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2-5, wobei als Ladungsträger ein negativer Ladungsträger eingesetzt wird.
7. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2-6, wobei als negativer Ladungsträger DCP (Dicetylphosphat), SA (Stearylamin), PA (Phosphatidylsäure), PG (Phosphatidylglycerol) oder Monosialogangliosid eingesetzt werden.
8. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2-7, wobei als Substanz zur Modifizierung der Oberfläche der liposomalen Formulierung PEG-PE (Polyethylenglycol-Phosphatidylethanolamin), PEG -Sterole, Sialyl-Lewisx- Peg-PE , Sialyl-LewisA-PEG-PE, Sialyl-Lewisx-Peg-Sterole oder Sialyl-LewisA- PEG-Sterole eingesetzt werden.
9. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1-8, wobei der Durchmesser der Liposomen der liposomalen Formulierung kleiner als 400 nm ist und die Größenverteilung einen Polydispersitätsindex kleiner 0,4 aufweist.
10. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1-9, wobei als Substanzgruppen mit Antitumorwirkung
Zytostatika, wie Alkylantien, Mitosehemmstoffe, zytostatisch wirksame Antimetabolite und Antibiotika, Hormone und Hormonantagonisten, sowie Alkylphospholipide, eingesetzt werden.
11. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1-10, wobei als Substanzgruppen mit Antitumorwirkung Alkylphospholipide eingesetzt werden.
12. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1-11, wobei als Alkylphospholipide TPC (Tetradecylphosphatidylcholin), HPC (Hexadecylphosphatidylcholin), HpPC (Heptadecylphosphatidylcholin), OPC (Octadecylphosphatidylcholin), HPP (Hexadecyl-(1 ,1-dimethyl-piperidin-4-yl)- phosphat), OPP (Octadecyl-(1,1-dimethyl-piperidin-4-yl)-phosphat), HPS (Hexadecylphosphatidylserin), HPE (Hexadecylphosphatidylethanolamin) und/oder Edelfosine eingesetzt werden.
13. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1-12, wobei als Wirkstoffgruppen mit gerinnungshemmender Wirkung Aggregationshemmer (Dipyridamol, Azetylsalizylsäure, Ticlopidin, Resveratrol); Antikoagulantien (Heparin, niedermolekulares Heparin, Heparinoide, Clopidogrel). Vitamin K Antagonisten (Warfarin, Phenprocoumon) eingesetzt werden.
14. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1-13, wobei bevorzugt als Wirkstoff Dipyridamol und/oder Azetylsalizylsäure eingesetzt wird.
15. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1-14, welche bevorzugt die Bestandteile Phosphatidylcholin (30-35 μmol), Octadecyl-(1.1- dimethyl piperidin-4-yl)-phosphat (10-15 μmol), Cholesterol (10-15 μmol), Poiyethylenglykobooo-phosphatidylethanolamin (2-3 μmol), Dicetylphosphat (5- 8 μmol) und Dipyridamol (15-20 μmol) umfasst.
16. Verwendung einer pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1-15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von metastasenbildenden Tumorerkrankungen.
17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen.
18. Verwendung nach Anspruch 16 zur Behandlung von Gerinnungsstörungen.
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