WO2008140127A1

WO2008140127A1 - 光学活性２－アルキル－１，１，３－トリアルコキシカルボニルプロパンの製造方法

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Publication number: WO2008140127A1
Application number: PCT/JP2008/058991
Authority: WO
Inventors: Norihiko Hirata; Kazuhiro Yamauchi
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2007-05-14
Filing date: 2008-05-09
Publication date: 2008-11-20
Anticipated expiration: 2009-11-14
Also published as: US20170145468A1; US20150218602A1; EP2154253A1; EP2154253A4; JP5157576B2; US8969051B2; EP2154253B1; US9970043B2; JP2009005682A; US20100240107A1

Abstract

２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）のうち一方のエナンチオマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素、あるいは該酵素の産生能を有する微生物の培養物あるいはその処理物を用いて、２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（１）を不斉加水分解する工程を含む光学活性２−アルキル−１，１，３−トリアルコキシカルボニルプロパン（２）の製造方法。

Description

明細書光学活性 2 _アルキル— 1， 1， 3 —トリアルコキシカルポニルプロパンの製造方法技術分野

本発明は、光学活性 2 —アルキル— 1， 1 , 3 —トリアルコキシカルポニルプロパンの製造方法に関する。背景技術

光学活性 2 —アルキル— 1 , 1， 3 _トリアルコキシカルポニルプロパンは、天然物や医薬などの合成において不斉炭素導入原料として有用な化合物である。

これまで、かかる光学活性 2 —アルキル一 1， 1 , 3 —トリアルコキシカルポニルプロパンを製造する方法としては、例えば、不斉銅触媒の存在下でシリルエノラー卜とアルキリデンマロネ一卜とを付加させる方法（非特許文献 1 ) が挙げられる。該製法により得られるチォエステルのエステル交換を行えば、光学活性 2 —アルキル一 1 , 1 , 3 —トリアルコキシカルポニルプロパンが得られる。しかしながら、かかる方法ではハロゲン化溶媒を用いており、また、目的物の光学純度を高めるには低温条件が必要であった。しかも— 7 8 °Cで反応を行っても光学純度は最高 9 3 % e e (光学活性中心の炭素原子に結合するアルキル基がメチル基の場合は 4 3 % e e ) であり、必ずしも工業的に満足できる方法であるとはいえなかった。

[非特許文献 1 ] J . Am. C h e m. S o c . , 1 2 2 , 9 1 3 4 ( 2 0 0 0 ) 発明の開示

そこで本発明者らは、ラセミ化合物である 2—アルキル一 1 , 1， 3 —トリアルコキシカルポニルプロパンを原料として、通常の酵素反応条件下、種々の酵素を用いて光学選択的に加水分解することにより光学活性 2 —アルキル一 1 ， 1 , 3 —トリアルコキシカルポニルプロパンを製造する方法について鋭意検討した結果、光学活性 2—アルキル一 1， 1， 3 —トリアルコキシカルボニルプロパンの両異性体をそれぞれ容易に効率よく製造できることを見出した。即ち、本発明は、以下の [ 1 ] ~ [ 1 1 ] を提供するものである。

(式中、、 R ₂ および R ₃ はそれぞれ同一または相異なり、炭素数 1 ~ 4 のアルキル基を示す。）

で示される 2 —アルキル— 1 , 1， 3 —トリアルコキシカルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素、あるいは該酵素の産生能を有する微生物の培養物あるいはその処理物を用いて、式（ 1 ) で示される 2 —アルキル一 1 , 1 , 3 —トリアルコキシ力ルポ不斉加水分解する工程を含むことを特徴とする式（2)

R₂OO

( £、

(式中、、 R₂ および R₃ はそれぞれ前記と同じ意味を示し、 *は当該炭素原子が不斉中心であることを示す。）

で示される光学活性 2—アルキル一 1 , 1， 3 トリアルコキシ力ルポニルプ口パンの製造方法。

[2] . 式（ 1 ) で示される 2一アルキル一 1, 1， 3一トリアルコキシカルポニルプロパンにおいて、がメチル基である [1] に記載の製造方法。

[3] . 式（1) で示される 2一アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパンにおいて、 R₂ がメチル基である [1] に記載の製造方法。

[4] . 式（1) で示される 2一アルキル一 1， 1, 3一トリアルコキシカルポニルプロパンにおいて、 R₃ がメチル基である [1] に記載の製造方法。

[5] . 式（ 1 ) で示される 2一アルキル一 1， 1, 3—トリアルコキシカルポニルプロパンにおいて、と R₂ が共にメチル基である [1] に記載の製造方法。

[6] . 式（1) で示される 2—アルキル- 1 , 1, 3—トリアルコキシカルポニルプロパンにおいて、 R₂ と R₃ が共【メチル基である [1] に記載の製造方法。

[7] . 式（1) で示される 2—アルキル一 1 , 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパンにおいて、尺ェ、 R₂ および R₃ のいずれもがメチル基である

[I] に記載の製造方法。

[8] . 酵素が、キャンディダ（C a n d i d a) 属またはバシラス（B a c i 1 1 u s ) 属の微生物を起源とする加水分解酵素である [1] 〜 [7] のいずれかに記載の製造方法。

[9] . 酵素が、ァルスロパクター · グロビフオルミス（A r t h r o b a c t e r g l o b i f o r m i s ) 、キャンディダ ' シリンダラセァ（C a n d i d a c y l i n d r a c e a) 、キヤンディダ ·ルゴサ（C a n d i d a r u g o s a) 、キャンディダ 'アンタクティカ (C a n d i d a a n t a c t i c a) 、パシラス ' リケニフォルミス（B a c i 1 1 u s 1 i c h e n i f o r m i s ) 、バシラス ·サブチリス（B a c i l l u s s u b t i l i s) またはクロモパクテリゥム ·チョコレータム（Ch r omo b a c t e r i um c o c o 1 a t urn) の微生物あるいは好熱性微生物（ t h e rmo p h i 1 i c m i c r o— o r g a n i s m) を起源とするカロ水分解酵素である [1] 〜 [7] のいずれかに記載の製造方法。

[1 0] . 酵素が、ァルスロバクタ一 S C— 6— 98— 28株（？£1 B P— 3658 ) またはクロモバクテリゥム S C— YM— 1株（FERM BP - 6703) 由来のエステラーゼもしくはリパーゼである [1] 〜 [7] のいずれかに記載の製造方法。

[I I] . 酵素が、下記 a) ~e) のいずれかアミノ酸配列からなるタンパク質である [1] 〜 [7] のいずれかに記載の製造方法。

a) 配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列。

b) i ) 配列番号 2または 4で示される塩基配列からなる DN Aに対して少なくとも 90 %の配列相同性を有する DNAの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、 i i ) 2—アルキル一 1, 1， 3—トリアルコキシ力ルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。

c) i ) 配列番号 2または 4で示される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DN Aの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、 U) 2—アルキル— 1， 1， 3—トリアルコキシ力ルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。

d) i ) 配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、 ii

) 2—アルキル— 1， 1, 3—トリアルコキシカルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。

e) i ) 配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも 90 %のアミノ酸配列であって、かつ、 ii) 2—アルキル— 1， 1, 3—トリアルコキシカルボニルプロパンのうち一方のェナンチォマ一のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。発明を実施するための形態

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明方法において用いられる原料である式（1) で示される 2—アルキル — 1, 1， 3—トリアルコキシカルボニルプロパン（以下、 2一アルキル— 1 , 1, 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（1) と略記する。）は、塩基の存在下でマロン酸ジアルキルと ι8—アルキル— α, β—不飽和アルキルエステルとを反応させる方法（例えば、 T e t r a h e d r o n, 44, 1 1 9 ( 1 988 ) 参照。）等の任意の公知の方法にて製造して、本発明に用いることができる。本発明の式（1) および（2) で示される化合物における、 R₂ および R₃ で示される炭素数 1〜4のアルキル基として、具体的にはメチル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、 n—ブチル基、イソブチル基、 s e c—プチル基、 t e r t—ブチル基が例示される。かかる 2—アルキル一 1 , 1, 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（ 1 ) として、具体的には 2—メチル— 1 , 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパン、 2ーメチルー 1， 1 , 3—トリエトキシカルボニルプロパン、 2—メチル— 1， 1， 3—トリ n—プロポキシカルポニルプロパン、 2—ェチルー 1, 1， 3—トリメトキシカルポニルプロパン、 2—ェチルー 1 , 1, 3—トリエトキシカルポニルプロパン、 2— n—プロピル一 1 , 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパン、 2— n—プロピル— 1， 1， 3—トリエトキシカルポニルプロパン、 2—メチルー 1 , 1ージエトキシカルポ二ルー 3—メ卜キシカルポ二ループロパン、 2—メチルー 1, 1—ジ n—プロポキシ力ルポ二ルー 3—メトキシカルポ二ループロパン、 2—ェチル— 1, 1ージエトキシカルポ二ルー 3—メトキシカルポニル—プロパン、 2—ェチルー 1， 1ージ n—プロポキシ力ルポ二ルー 3—メトキシカルポ二ループロパン、 2— n—プロピル— 1， 1 —ジエトキシカルポニル— 3—メトキシカルポニル—プロパン、 2—メチル— 1, 1ージメトキシカルポ二ルー 3—エトキシカルポ二ループロパン、 2—メチルー 1 , 1—ジ n—プロポキシ力ルポ二ルー 3—エトキシカルポ二ループ口パン、 2—ェチルー 1, 1ージメトキシカルポ二ルー 3—エトキシカルポニル一プロパン、 2— n—プロピル一 1 , 1ージメトキシカルボニル— 3—ェトキシカルポニル—プロパン等が挙げられる。

2一アルキル一 1 , 1， 3—トリアルコキシカルボニルプロパン（1) のうち S体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素としては、例えば、キャンディダ · シリンダラセァ（C a n d i d a c y l i n d r a c e a) 、キャンディダ 'ルゴサ（C a n d i d a r u g o s a) 等のキャンディダ属の微生物、クロモバクテリゥム ·チョコレータム（Ch r omo b a c t e r i urn c h o c o 1 a t urn) の微生物、ブタ肝臓（P i g 1 i v e r ) または好熱性微生物（Th e rmo p h i l i c m i c r o— o r g a n i s m) 由来の酵素を挙げることができる。キャンディダ · シリンダラセァ、キャンディダ ·ルゴサ等のキャンディダ属の微生物、クロモバクテリウム ·チョコレータムの微生物または好熱性微生物由来の酵素が好ましい。かかる 2—アルキル— 1 , 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（1 ) のうち S体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素としてさらに具体的には、クロモバクテリゥム S C— YM— 1株（F E RM BP— 6703 ) 由来の酵素もしくは市販酵素として CH I RAZ YME (登録商標 ) E- 3 (好熱性微生物由来）、リバ一ゼ CH I RAZ YME (登録商標）

L - 3 (C a n d i d a r u g o s a由来）、コレステロールエステラ一ゼ (C a n d i d a c y l i n d r a c e a由来) (以上、 Ro c h e D i a g n o s t i c s社製）、リパ一ゼ C h i r o CLEC - CR (A 1 t u s B i o l o g i e s社製）、リパ一ゼ L i p a s e— MY (C a n d i d a c y l i n d r a c e a由来）（名糖産業社製）、リパーゼ L i p a s e OF (名糖産業社製）または PL E— A (天野ェンザィム社製）を挙げることができる。クロモバクテリゥム S C— YM— 1株（FERM BP— 6 7 03 ) 由来の酵素がより好ましい。

2—アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（1) のうち R体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素としては、例えば、パシラス · リケニフォルミス（B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s ) , バシラス ·サブチリス（B a c i l l u s s u b t i l i s) 等のバシラス属の微生物、ァルスロパクター · グロビフオルミス（A r t h r o b a c t e r g l o b i f o rm i s) の微生物、キャンディダ 'アンタクティカ（C a n d i d a an t a c t i c a) の微生物、ゥシ滕臓（B o v i n e p a n c r e a s) または好熱性微生物（Th e rmo p h i 1 i c m i c r o— o r g a n i s m) 由来の酵素を挙げることができる。バシラス · リケニフォルミス、パシラス ·サブチリス等のバシラス属の微生物、ァルスロパクター · グロビフオルミスの微生物または好熱性微生物由来の酵素が好ましい。かかる 2—アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（ 1 ) のうち R体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素としてさらに具体的にはァルスロパクター S C— 6— 98— 28株（FERM BP

- 36 58) 由来の酵素、もしくは市販酵素としてエステラーゼ CH I RAZ YME (登録商標） E— 4 (好熱性微生物由来）、プロテアーゼ CH I RA Z YME (登録商標） P— 1 (B a c i 1 1 u s 1 i c h e n i f o rm i s由来）（以上、 Ro c h e D i a gn o s t i c s社製）、プロテア一ゼ P u r a f e c t (登録商標） 400 0 E (GENENCOR社製）、プロテアーゼ o!— Ch ymo t r yp s i n (S I GMA社製）、リパーゼ S P— 52 5 (ノポザィムズジャパン社製）を挙げることができる。ァルスロバクタ一 S C— 6— 98— 28株（FERM BP— 3 658) 由来の酵素がより好ましい。これらの 2—アルキル一 1 , 1， 3—卜リアルコキシカルボニルプロパン（ 1 ) のうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素（以下、本酵素と記す）としては、これらの微生物から突然変異剤もしくは紫外線等の処理により誘導された突然変異体由来の酵素であっても、これらの微生物が有する本酵素をコ一ドする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物により産生される酵素であっても、あるいは遺伝子工学的手法により上記本酵素のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸が 1個ないしは数個、欠失、付加あるいは置換されてなる変異型酵素であってもよく、 2—アルキル一 1， 1, 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（1) のうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有していれば本発明製造方法に使用することができる。本酵素をコードする遺伝子が導入され形質転換された組換え微生物は、例えば】 . S amb r o o k, E. F. F r i t s c h, T. Man i a t i s著；モレキュラークローニング第 2版（M o 1 e c u 1 a r C l o n i n g 2 n d e d i t i o n) 、コールドスプリングハーバ一ラボラトリー (Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y) 発行、 1 98 9年、等に記載の通常の遺伝子工学的手法、あるいはそれらに準じた方法により作製できる。さらに具体的には、特開 200 1— 46084号公報、特許第 38 5 5329号公報、特許第 387 5283号公報、または特許第 3 1 5 1 893号公報に記載の方法、あるいはそれらに準じた方法により作製できる。このようにして作製することのできる組換え微生物によって産生される本酵素の例としては、クロモパクテリゥム S C— YM— 1株（FERM B P— 6 703 ) 由来のエステラーゼ（特許第 38 7 5283号公報）またはァルスロバクタ一 S C— 6— 98— 28株（FERM BP— 3 6 58) 由来のエステラーゼ（特許第 3 1 5 1 893号公報）等を挙げることができる。クロモパクテリゥム S C— YM— 1株（FERM BP— 6703 ) 由来のエステラーゼの具体例としては、配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなる酵素が挙げられ、ァルスロパクター S C— 6— 98— 28株（FERM BP

— 3 6 58 ) 由来のエステラーゼの具体例としては、配列番号 3で示されるァミノ酸配列からなる酵素が挙げられる。また、本酵素をコードする遺伝子の例としては、クロモバクテリゥム S C— YM— 1株（FERM BP— 67 03) 由来のエステラーゼをコードする遗伝子としては、例えば、配列番号 2で示される塩基配列からなる DN Aが挙げられ、ァルスロパクター S C— 6— 98— 28株（ £1 ：^ BP— 36 58 ) 由来のエステラーゼをコードする遺伝子としては、例えば、配列番号 4で示される塩基配列からなる D N Aが挙げられる。本発明には、下記 a) 〜e) のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質からなる酵素を用いることが好ましい。

a) 配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列。

b) i ) 配列番号 2または 4で示される塩基配列からなる DNAに対して少なくとも 90 %の配列相同性を有する DNAの塩基配列がコ一ドするアミノ酸配列であって、かつ、 i i ) 2—アルキル一 1 , 1, 3—トリアルコキシ力ルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。

c ) i ) 配列番号 2または 4で示される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNAの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、 ii) 2一アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルボニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。

) 2一アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルボニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。

e) i ) 配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも 90 %のアミノ酸配列であって、かつ、 ii) 2—アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマ一のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。

なかでも、配列番号 1で示されるアミノ酸配列において 43番目の N (ァスパラギン）が S (セリン）に置換され、少なくとも 1番目から 362番目で示されるアミノ酸配列（特開 2000— 7 89 88号公報に記載の N 43 S A 3 6 3 t e r m) 、または、配列番号 1で示されるアミノ酸配列において 1 60 番目の G (グリシン）が S (セリン）に、 1 89番目の G (グリシン）が F ( フエ二ルァラニン）置換され、少なくとも 1番目から 362番目で示されるァミノ酸配列（特許第 3486942号公報に記載の 1 60 S 1 89 F 363 t e rm) からなるタンパク質からなる酵素を用いることが、より好ましい。

「配列番号 2または 4で示される塩基配列からなる DN Aとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNA」とは、例えば「クロ一ニングとシ一クエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、 1 989年、農村文化社発行）等に記載されているサザンハイブリダィゼーシヨン法において、（1) 高イオン濃度下 [例えば、 6XSSC (900mMの塩化ナトリウム、 90mMのクェン酸ナトリウム）が挙げられる。 ] に、 65ででハイブリダィズさせることにより配列番号 1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる DN Aと DNA—DN Aハイブリツドを形成し、（2) 低イオン濃度下 [例えば、 0.1 X SSC (15mMの塩化ナトリウム、 1.5mMのクェン酸ナトリウム）が挙げられる。 ] に、 65°Cで 30 分間保温した後でも該ハイブリッドが維持されうるような D N Aをいう。具体的には、例えば、配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる DNA、配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、その一部の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる D N A、配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる DN Aと、少なくとも 9 0 %の配列相同性、好ましくは少なくとも 95 %の配列相同性を有する DN A等が挙げられる。かかる DNAは、自然界に存在する DN Aの中からクロ一ニングされた DN Aであっても、このクローニングされた DNAの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなる DNAであっても、人為的に合成された DNAであってもよい。配列相同性は、例えば、 UWGC G P a c k a g eが供給する B E S T F I Tプログラム（D e v e r e u x e t a 1 、丄 984) Nu c l e i c Ac i d s R e s e a r c h 12, p 387— 39 5) や、 P I L E U Pや B L A S Tアルゴリズム（A 1 t s c u 1 S. F. ( 1 993 ) J Mo 1 Ev o l 3 6 : 290 - 300 ; A 1 t s c h u 1 S. F. ( 1 990 ) J Mo 1 B i o l 2 1 5 : 403 - 1 0) 等の配列分析用ツールを用いて算出し得る。また、「配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列において 1アミノ酸若しくは 2ァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましい。また、本酵素は配列番号 1または 2で示されるアミノ酸配列と、少なくとも 90 %の配列相同性、好ましくは少なくとも 9 5 %の配列相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。本酵素を産生する微生物は、いずれも通常の方法によって液体培養することができる。培地としては、通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無機物等を適宜含む各種の培地を使用することができる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、有機酸、糖蜜など、窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカ一、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニゥム、硝酸アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、尿素など、無機物としては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩類、硫酸塩類、およびリン酸塩類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムなどを使用することができる。また、上記微生物の有する 2 _アルキル一 1， 1， 3 _ トリアルコキシカルポニルプロパン（1) の不斉水解能を高めるために、オリーブ油またはトリブチリン等のトリグリセリドあるいは 2—アルキル一 1 , 1 , 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（1) を適宜培地に添加してもよいさらに、 tacプロモータ一、 trcプロモーターおよび lacプロモーター等のァロラクト一スで誘導されるタイプのプロモーターの下流に本酵素をコードする DN Aが接続されたプラスミドが導入されてなる形質転換体の場合には、本発明タンパク質の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、 isopropyl t i o-j3-D-galactoside (IPTG) を培地中に少量加えることもできる。培養は、通常、好気的に行うのが良く、振とう培養、または通気撹拌培養が適当である。培養温度は、 20〜40で程度、好ましくは、 25〜3 5で程度で、 pHは 6〜8程度が好ましい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、 1〜7日間程度が好ましい。

また、必要に応じて固体培養法も、 2一アルキル一 1 , 1, 3 _トリアルコキシカルポニルプロパン（1) の不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法であれば適宜採用することができる。本酵素を、上記のようにして培養された微生物培養物から精製するには、通常一般の酵素の精製において使用される方法に従って行えばよい。例えば、まず超音波処理、ダイノミル処理あるいはフレンチプレス処理等の方法により微生物培養物中の菌体の破砕を行う。得られた破碎液から遠心分離等により不溶物を除去した後、通常酵素の精製に使用される陽イオン交換カラムクロマトグラフィ一、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィ一、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー等をひとつまたは複数適当に組み合わせることによって目的の酵素を精製することができる。これらカラムクロマトグラフィ一に使用する担体の一例として、 DEAE— S e p h a r o s e (登録商標） ί a s t f 1 o w (GEヘルスケアバイオサイエンス社製）や Bu t y l— To y o p e a r l (登録商標） 65 O S (東ソ一株式会社製 ) 等を挙げることができる。本酵素は、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物など、種々の形態で用いることができる。ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、または菌体のアルカリ処理物等をいう。さらに、上記のような種々の純度あるいは形態の酵素を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法（例えばカラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法等の公知方法により固定化して用いてもよい。かかる本酵素の使用量は反応時間の遅延や選択性の低下が起こらないように適宜選択され、例えば精製酵素、粗酵素、または市販品酵素を用いる場合、その使用量は 2 _アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（ 1) に対して通常は 0. 00 1〜2重量倍、好ましくは 0. 002〜0. 5重量倍であり、微生物培養物、菌体、およびそれらの処理物を用いる場合、その使用量は 2—アルキル一 1 , 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（ 1 ) に対して通常は 0. 0 1 ~ 200重量倍程度、好ましくは 0. 1〜50重量倍程度である。不斉加水分解反応に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などといつたリン酸アル力リ金属塩水溶液などの無機酸塩の緩衝水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液などといった酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩の緩衝水溶液などが挙げられる。かかる水の使用量は 2—アルキル一 1 , 1 , 3 —トリアルコキシカルポニルプロパン（1 ) に対して通常 0 . 5モル倍以上であればよく、場合によっては溶媒量用いられ、通常は 2 0 0重量倍以下である。不斉加水分解反応は、疎水性有機溶媒、親水性有機溶媒などの有機溶媒の存在下に行われてもよい。疎水性有機溶媒としては、例えば t e r t 一プチルメチルェ一テル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、へキサン、シクロへキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタンなどの炭化水素類などが、親水性有機溶媒としては、例えば t e r tーブタノ一ル、メタノール、ェタノ一ル、ィソプロパノール、イソブタノール、 n—ブタノ一ルなどのアルコール類、テトラヒドロフランなどのェ一テル類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトンなどのケトン類、ァセトニトリルなどの二トリル類、 N， N—ジメチルホルムアミドなどのアミド類などがそれぞれ挙げられる。これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒はそれぞれ単独または 2種以上を組み合わせて用いられ、疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを組み合わせて用いてもよい。かかる有機溶媒を用いる場合、その使用量は通常 2 —アルキル _ 1， 1 , 3 —トリアルコキシカルポニルプロパン（1 ) に対して 2 0 0重量倍以下、好ましくは 0 . 1〜 1 0 0重量倍程度の範囲である。不斉加水分解反応は、例えば水、 2—アルキル— 1 , 1， 3 —トリアルコキシカルポニルプロパン（1 ) および本酵素を混合する方法により行われ、有機溶媒を用いる場合には該有機溶媒、水、 2 —アルキル— 1 , 1 , 3 —トリアルコキシカルボニルプロパン（1 ) および本酵素を混合すればよい。反応系の p Hは本酵素による不斉加水分解が選択性よく進行する値が適宜選択され、特に限定されないが、通常は p H 4 ~ 1 0程度、好ましくは p H 6〜 8程度の範囲である。反応中、塩基を加えることにより p Hを適宜選択された範囲内に調整してもよい。かかる塩基としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどのアル力リ金属およびアル力リ土類金属の炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属重炭酸塩、リン酸 2水素ナトリウム、リン酸水素 2ナトリウム、リン酸 2水素カリウム、リン酸水素 2 カリウムなどのリン酸塩、トリェチルァミン、ピリジンなどの有機塩基、アンモニァなどが使用される。かかる塩基は単独もしくは 2種類以上を組み合わせて用いてもよい。かかる塩基は通常水溶液として用いられるが、反応に有機溶媒を使用する場合は有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合溶液として用いてもよい。かかる有機溶媒は反応で使用するものと同じものを使用することができる。さらに塩基は固体もしくは溶液に懸濁させた状態で用いてもよい。反応温度は、本酵素による不斉加水分解が選択性よく進行する温度が適宜選択され、特に限定されないが、高すぎると酵素の安定性が低下する傾向にあり、また低すぎると反応速度が低下する傾向にある。一方、温度が低いほど選択性は向上する傾向にある。通常一 1 0〜6 5で程度であり、好ましくは— 5〜 5 0で程度の範囲である。かくして式（2 ) で示される光学活性 2 —アルキル _ 1 , 1 , 3 —トリアルコキシカルポニルプロパン（以下、光学活性 2 —アルキル— 1 , 1 , 3 —トリアルコキシカルポニルプロパン（2 ) と略記する。）の溶液が得られるが、通常、反応で使用した酵素や緩衝剤あるいは加水分解反応により生じたカルボン酸などと分離するためにさらに後処理操作を行う。かかる後処理として例えば、反応溶液中の溶媒を留去した後シリ力ゲルク口マトグラフィ一を用いて分離精製する方法、同様に溶媒を留去した後蒸留により分離精製する方法、分液操作により分離精製する方法などが挙げられる。分液操作により分離精製する際に、反応時に水と疎水性有機溶媒のいずれにも溶解する有機溶媒を用いた場合これを留去により除去してから用いてもよい。また、溶液に不溶酵素や固定化担体などが存在する場合はこれらをろ過により除去してもよい。目的物である光学活性 2 —アルキル一 1 , 1， 3 —トリアルコキシ力ルポ二ルプロパン（2 ) と酵素や緩衝剤やその他の水溶性成分と分離するには疎水性有機溶媒を用いて有機層に光学活性 2—アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（2 ) を抽出し水層と分液すればよい。

かかる疎水性有機溶媒としては例えば t e r t —ブチルメチルエーテル、ィソプロピルエーテルなどのエーテル類、トルエン、へキサン、シクロへキサン、ヘプタン、オクタン、ィソオクタンなどの炭化水素類、ジクロロメタン、ジクロロェタン、クロロホルム、クロ口ベンゼン、オルトジクロロベンゼンなどの八ロゲン化炭化水素類、酢酸ェチル、酢酸メチル、酢酸ブチルなどのエステル類などが挙げられる。反応時にこれらの疎水性有機溶媒を使用した場合はそのまま分液操作を行なうこともできる。また、反応時に疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、その使用量が少ないために容易には分液できない場合、あるいは水の使用量が少ないために容易には分液できない場合には、疎水性有機溶媒または水などを適宜加えた後に分液すればよい。疎水性有機溶媒の使用量は特に限定されるものではないが、通常 2 —アルキル _ 1， 1 , 3 —トリアルコキシカルポニルプロパン（1 ) に対して 0 . 1〜2 0 0重量倍、好ましくは 0 . 2〜 1 0 0重量倍程度の範囲である。

かかる目的物の抽出時の p Hは通常 6〜 1 0程度の範囲、好ましくは 7 ~ 9 程度の範囲である。

溶液をかかる p Hに調整するために酸および塩基を適宜使用することもできる。かかる酸としては例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸などの無機酸およびその塩、酢酸、クェン酸、メタンスルホン酸などの有機酸およびその塩などが挙げられる。かかる塩基としては反応時の p H調整に用いたものと同様の塩基が使用可能である。

水層からの目的物の抽出が不十分な場合、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。また、同様に有機層からの水溶性成分の除去が不十分な場合も、同じ抽出、分液操作を複数回繰り返してもよい。次いで得られた有機層中の有機溶媒を留去することで目的物である光学活性 2 —アルキル— 1， 1 , 3 —トリアルコキシカルポニルプロパン（2 ) を単離することができる。

得られた光学活性 2—アルキル一 1， 1, 3—トリアルコキシ力ルポニルプ口パン（2) はさらにカラムクロマトグラフィーや蒸留などによって精製されてもよい。本発明において、本酵素として、 2—アルキル— 1， 1, 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（1) のうち S体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いれば、上記の分液処理の有機層から得られる光学活性 2—アルキル一 1 , 1 , 3—トリアルコキシカルボニルプロパン (2) は R 体に富み、 2一アルキル一 1 , 1, 3—卜リアルコキシカルポニルプロパン（ 1 ) のうち R体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いれば、上記の分液処理の有機層から得られる光学活性 2—アルキル一 1， 1 ， 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（2) は S体に富む。また、上記の分液操作後の水層には、通常、有機層から得られた目的物とは逆の立体の加水分解生成物が含まれている。すなわち、 S体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いた場合、該水層には光学活性（ S) — 2—アルキル— 1， 1, 3—トリアルコキシカルボニルプロパンの加水分解生成物が、 R体のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素を用いた場合、該水層には光学活性（R) — 2—アルキル一 1, 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパンの加水分解生成物が、それぞれ含まれる。該水層から水を留去したり、該水層を酸性に調整した後に有機溶媒を用いて抽出処理し、得られた有機層を濃縮処理したりすることによって、これらの加水分解生成物を回収することができ、得られた加水分解生成物をエステル化すれば、対応する光学活性 2—アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（2) を得ることもできる。かかるエステル化は、例えば、硫酸存在下で加水分解生成物とアルコールとを反応させる方法；アジ化トリメチルシランあるいは塩化トリメチルシラン存在下で加水分解生成物とアルコールとを反応させる方法；等の常法により行えばよい。かくして得られる光学活性 2—アルキル一 1 , 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパン（2) として、具体的には（R) — 2—メチルー 1， 1， 3— トリメトキシカルポニルプロパン、 (R) 一 2—メチル— 1 , 1, 3 -卜リエトキシカルポニルプロパン、 (R) 一 2ーメチルー 1 , 1, 3—トリ n—プロポキシカルポニルプロパン、（R) — 2—ェチル— 1， 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパン、（R) — 2—ェチルー 1, 1 , 3—トリエトキシカルポニルプロパン、（R) 一 2— n—プロピル— 1， 1 , 3—トリメトキシカルポニルプロパン、（R) — 2— n—プロピル一 1, 1， 3—トリエトキシカルポニルプロパン、（R) — 2—メチルー 1, 1ージエトキシカルポニル— 3—メトキシカルポ二ループロパン、（R) — 2—メチル— 1， 1—ジ n—プロポキシカルポニル— 3—メトキシカルボ二ループロパン、 (R) 一 2—ェチルー 1 ， 1—ジエトキシカルポ二ルー 3—メトキシカルポ二ループロパン、（R) — 2ーェチルー 1， 1ージ n—プロポキシ力ルポ二ルー 3—メ卜キシカルポニル一プロパン、（R) — 2— n—プロピル一 1 , 1—ジエトキシカルポニル— 3 ーメトキシカルポ二ループロパン、 (R) 一 2ーメチルー 1 , 1ージメトキシ力ルポニル— 3—エトキシカルポ二ループロパン、（R) — 2—メチルー 1， 1ージ n—プロポキシ力ルポニル— 3—エトキシカルポ二ループロパン、（R ) 一 2—ェチルー 1, 1—ジメトキシカルポ二ルー 3 _エトキシカルポ二ループロパン、（R) — 2— n—プロピル一 1 , 1—ジメトキシカルポ二ルー 3— エトキシカルポニル—プロパン、および、上記の（R) が（S) に置き換わつた化合物等が挙げられる。実施例

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例 1〜 14

2—メチル一 1， 1， 3—トリメトキシカルポニルプロパン 3 5mgと表 1 に示した種々の酵素をそれぞれ表 2に示した量を量り取ったところへ、 1 00 mMリン酸カリウム緩衝液（p H 7. 0) 2m lを加えた。この溶液を 2 5でで、 20時間攪拌した後、ァセトニトリル 2. 5mLを添加し、メンブランフィルターにて濾過した。濾液を高速液体クロマトグラフィー〔カラム： CH I RAL CEL (登録商標） OB— H、 4. 6 mm X 1 5 cm、 5 /xm (ダィセル化学工業社製）〕にて光学純度を分析し、また、高速液体クロマトダラフィー〔カラム： SUM I PAX ODS D- 2 1 0 FF, 4. 6 mm X 1 5 cm, 3 urn. (住化分析センタ一社製）〕にて化学純度を分析して、得られた光学活性 2—メチルー 1， 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表 2に示す。実施例 1 5、 1 6

2—メチル— 1, 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパン 70 mgと表 1 に示した酵素を表 2に示した量を量り取ったところへ、 1 0 OmMリン酸カリゥム緩衝液（PH7. 0) 4m lを加えた。この溶液を 2 5°Cで、 3. 5時間攪拌した後、ァセトニトリル 5mLを添加し、メンブランフィルタ一にて濾過した。濾液を実施例 1〜 14と同様に分析して、得られた光学活性 2—メチル — 1， 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。結果を表 2に示す。

表 1

表 2

実施例収率鏡像異性体過剰となる

(mg) (%) 過剰率 ee) 光学異性体

1 2. 2 9. 6 1 00 (R) 一体

2 2. 1 9. 6 1 00 (R) 一体

3 2. 1 5. 6 1 00 (R) 一体

4 2. 1 2. 8 1 00 (R) —体

5 2. 0 24 4 5 1. 5 (R) 一体

6 2. 0 7 7 0 7. 3 (R) —体

7 2. 2 6 1 3 1 8. 7 (R) 一体

8 2. 4 7 7 5 8. 2 (R) —体

9 74 . 8 14 4 1 00 (S) 一体

1 0 2. 0 46 9 46. 5 (S) 一体

1 1 2. 1 53 0 36. 3 (S) —体

1 2 1 0 . 2 62 6 3 1. 3 (S) —体

1 3 1. 4 53 8 14. 0 (S) —体

14 2. 1 7 1 2 6. 6 (S) 一体

1 5 7. 0 3 7 5 95. 0 (R) —体

1 6 7. 0 36 5 96. 5 (R) 一体

実施例 1 7、 1 8

2—メチル— 1， 1， 3—トリメトキシカルボニルプロパン 7 Omgとクロモバクテリゥム S C- YM- 1株由来のエステラーゼ（1 6 0 S 1 89 F 36 3 t e r m) 7. 0 m gを量り取ったところへ、それぞれ p H 5、 p H 9の 1 0 OmMリン酸カリウム緩衝液 4m 1を加えた。この溶液を 2 5°Cで、 3. 5 時間攪拌した後、ァセトニトリル 5mLを添加し、メンブランフィルタ一にて濾過した。濾液を実施例 1〜 14と同様に分析して、得られた光学活性 2—メチルー 1， 1, 3 _トリメトキシカルポニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。実施例 1 5 (pH 7) と比較した結果を表 3に示す。表 3

実施例 1 9、 20

2—メチルー 1, 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパン 7 Omgとクロモパクテリゥム S C— YM— 1株由来のエステラーゼ（1 60 S 1 89 F 36 3 t e rm) 7. 0 m gを量り取ったところへ、 1 00 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7. 0) 4m lを加えた。この溶液を、それぞれ 1 0°C、 0°Cで、表 4に記載した時間攪拌した後、ァセトニトリル 5 mLを添力口し、メンブランフィルタ一にて濾過した。濾液を実施例 1〜 1 4と同様に分析して、得られた光学活性 2—メチルー 1， 1， 3—トリメ卜キシカルポニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。実施例 1 5 (2 5で）と比較した結果を表 4 に示す。表 4

実施例 2 1〜 2 9

表 5に示した各エステラーゼ遺伝子を含むプラスミドを用いて E. coli JM10 5株を形質転換した。得られた形質転換体を 0. I mMの I P TGと 5 0 g /m 1のアンピシリンとを含有する滅菌 L B ( 1 %バクトートリプトン、 0. 5 %パクト—酵母エキス、 1 %塩化ナトリゥム）培地（1 0 0m l ) にそれぞれ接種し、振盪培養した（3 7 °C、 2 4時間）。得られた培養液を遠心分離し、湿菌体約 0. 6 gを得た。湿菌体約 0. 6 ^を0. 1 Mリン酸カリウムパッファ一（p H 7. 0 ) 5 m lで懸濁し、直径 1 mmのガラスビーズを 5 g 添加後、マルチビーズショッカー（安井器械社製、 2 5 0 0 r pm、 2 0分）で破碎した。得られた破碎液を遠心分離（ 1 0 0 0 0 rpm、 4°C、 1 0分）し、上清を粗酵素液とした。

2—メチル— 1， 1， 3—トリメトキシカルポニルプロパン 7 0 mgを量り取り、そこへ、上記の粗酵素液を、それぞれ表 6に示した酵素量を量り取って加え、更に 1 7 O mMリン酸カリウム緩衝液（p H 7. 0 ) 4m lを加えた。この溶液を 2 5°Cで、 5時間攪拌した後、ビフエニル（内部標準物質）を含むァセトニトリル 2 mLを添加し、メンブランフィルタ一にて濾過した。濾液を実施例 1 ~ 1 4と同様に分析して、得られた光学活性 2—メチル _ 1 , 1， 3 ートリメトキシカルポニルプロパンの収率および鏡像異性体過剩率を求めた。結果を表 6に示す。

表 5

表 6

実施例 30 - 1 ：酵素加水分解

2ーメチル一 1， 1， 3—トリメトキシカルポニルプロパン 1 1. 37 gと 1 0 OmMリン酸ナトリウム緩衝液（p H 7. 0) 68. 4 gを量り取ったところへ、プラスミド（p CCN43 SA363 t e rm) を含む E. coli JM10 5株の形質転換体から実施例 2 1〜29と同様にして調製した粗酵素液 1. 0 gを加えた。この溶液を 0°Cで、 23時間攪拌した。攪拌中、 1 0重量％水酸化ナトリゥム水溶液を滴下することにより、溶液の pHを 7に維持していた。攪拌終了後の溶液に、 t e r t—ブチルメチルエーテル 20 gを添加し、得られた混合物をグラスフィルタ一にて濾過した。濾液を有機層と水層に分液し、水層に t e r t一ブチルメチルエーテル 20 gを添加して分液した。水層 8 1 . 8 gを得た。得られた有機層を合一し、 5重量％炭酸水素ナトリウム水溶液 5. l gで洗浄した。洗浄された有機層を減圧濃縮して、黄色油状物として（ R) — 2—メチル— 1， 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパン 4. 49 g を得た。収率 47. 7 %、鏡像異性体過剰率 1 00 % e e。実施例 30 - 2 ：加水分解物の回収

実施例 30— 1で得られた水層のうち 7 9. 8 gに、 3 5重量％塩酸 3. 1 2 gを添加することにより pH 2. 0に調整した。そこに、酢酸ェチル 20. 0 gと塩化ナトリウム 2 5. 0 gを添加して攪拌した後、得られた混合物を分液した。得られた水層に酢酸ェチル 2 5. O gを添加して抽出した。得られた有機層を合一し、 2 5重量％塩化ナトリウム水溶液 2 5. O gで洗浄した。洗浄された有機層を減圧濃縮して、黄褐色油状物 5. l gを得た。実施例 30— 3 ：エステル化

実施例 30一 2で得られた黄褐色油状物のうち 1. 0 gをメタノール 20. 0 gに溶解させた。得られた溶液を 0でに冷却し、そこに塩化トリメチルシラン 1. 0 gを約 1 0分かけて滴下した。滴下終了後、得られた反応液を 20〜 2 5でに昇温し、同温度で 45. 5時間保温した。得られた反応液を t e r t 一ブチルメチルエーテル 32 gで希釈した。そこに 5重量％炭酸水素ナトリウム水溶液 40 gを添加して攪拌した後、分液して有機層 36. 2 gと水層 57 . 8 gを得た。得られた有機層と水層について、それぞれ高速液体クロマトグラフィ一にて化学純度を分析し、また、有機層について高速液体クロマトダラフィ一にて光学純度を分析して、得られた光学活性な 2—メチルー 1, 1， 3 —トリメトキシカルポニルプロパンの収率および鏡像異性体過剰率を求めた。上記の化学純度および光学純度の分析は、実施例 1〜 14と同様に行った。上記有機層および水層に含まれていた 2—メチルー 1 , 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパンの収率は 46. 8%、上記有機層に含まれていた 2—メチル - 1 , 1， 3—トリメトキシカルポニルプロパンの鏡像異性体過剰率は 8 6. 8 % e e (S体）であった。実施例 3 1— 1 :酵素加水分解

2—メチルー 1 , 1 , 3—トリメトキシカルポニルプロパン 1 50 gと 1 0 OmMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7. 0) 1 03 5 gを量り取ったところへ、プラスミド（p CC 1 60 S 1 89 F 3 63 t e rm) を含む E. coli JM 105株の形質転換体から実施例 2 ：!〜 29と同様にして調製した粗酵素液 1 7 . 0 gを加えた。この溶液を 0でで、 42時間攪拌した。攪拌中、 1 0重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下することにより、溶液の p Hを 7に維持していた。攪拌終了後の溶液に、酢酸ェチル 6 1 3 gを添加し、得られた混合物をグラスフィルタ一にて濾過した。濾液を有機層と水層に分液し、水層に酢酸ェチル 7 50 gを添加して分液した。得られた有機層を合一し、有機層 1 500 g と水層 132 l gを得た。さらに有機層を 5重量％炭酸水素ナトリウム水溶液 1 50 gで洗浄した。洗浄された有機層を減圧濃縮して、黄色油状物として（ R) - 2ーメチル一 1 , 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパン 67. 6 g を得た。収率 39. 1 %、鏡像異性体過剰率 1 00 % e e。実施例 3 1 - 2 ：加水分解物の回収

実施例 3 1一 1で得られた水層のうち 1 3 1 5 gに、 3 5重量％塩酸 6 1 を添加することにより pH2. 0に調整した。そこに、酢酸ェチル 300 gと塩化ナトリウム 41 5 gを添加して攪袢した後、得られた混合物を分液した。得られた水層に酢酸ェチル 37 5 gを添加して抽出した。得られた有機層を合一し、 25重量％塩化ナトリウム水溶液 37 5 gで洗浄した。洗浄された有機層を減圧濃縮して、黄褐色油状物 1 0 5 gを得た。実施例 31— 3 ：エステル化

実施例 3 1一 2で得られた黄褐色油状物のうち 1. O gをメタノール 20. l gに溶解させた。得られた溶液を 0°Cに冷却し、そこに塩化トリメチルシラン 1. 0 gを約 1 0分かけて滴下した。滴下終了後、得られた反応液を 20〜 2 5でに昇温し、同温度で 45時間保温した。得られた反応液を t e r t—ブチルメチルエーテル 32 gで希釈した。そこに 5重量％炭酸水素ナトリゥム水溶液 40 gを添加して攪拌した後、分液して有機層 3 7. 0 gと水層 57. 3 gを得た。実施例 30— 3と同様に分析したところ、上記有機層および水層に含まれていた 2—メチルー 1， 1 , 3—トリメトキシカルポニルプロパンの収率は 5 1. 1 %、上記有機層に含まれていた 2—メチルー 1 , 1, 3—トリメトキシカルポニルプロパンの鏡像異性体過剩率は 7 0. 6 % e e (S体）であつた。産業上の利用可能性本発明の方法によれば、低温条件を用いることなく、高い光学純度で光学活性 2 —アルキル— 1， 1， 3 —トリアルコキシカルボニルプロパンを製造することができる。

Claims

請求の範囲

1.

R₂OO

( ι、

(式中、、 R₂ および R₃ はそれぞれ同一または相異なり、炭素数 1〜4 のアルキル基を示す。）

で示される 2—アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有する酵素、あるいは該酵素の産生能を有する微生物の培養物あるいはその処理物を用いて、式（1) で示される 2—アルキル— 1， 1， 3—トリアルコキシ力ルポ不斉加水分解する工程を含むことを特徴とする式（2)

R₂OO

( £、

で示される光学活性 2—アルキル— 1 , 1 , 3—トリアルコキシ力ルポニルプ口パンの製造方法。

2. 式（1 ) で示される 2一アルキル一 1， 1 3 ―トリアルコキシ力ルポ二ルプロパンに：おいて、がメチル基であるクレム 1に記載の製造方法。

3. 式（1) で示される 2一アルキル— 1 , 1 ， 3 ——トリアルコキシ力ルポ二ルプロパンに：おいて、 R₂ がメチル基であるクレム 1に記載の製造方法。

4. 式（1) で示される 2一アルキル— 1 , 1 3 ——トリアルコキシ力ルポ二ルプロパンに：おいて、 R₃ がメチル基であるクレ ―ム 1に記載の製造方法。

5. 式（ 1 ) で示される 2一アルキル一 1 , 1 3 ―トリアルコキシ力ルポ二ルプロパンにおいて、と R₂ が共にメチル基であるクレーム 1に記載の製造方法。

6. 式（1) で示される 2—アルキル一 1， 1 , 3—トリアルコキシ力ルポ二ルプロパンにおいて、 R₂ と R₃ が共にメチル基であるクレーム 1に記載の製造方法。

7. 式（1) で示される 2—アルキル一 1 , 1， 3—トリアルコキシ力ルポ二ルプロパンにおいて、、 R₂ および R₃ のいずれもがメチル基であるクレ —ム 1に記載の製造方法。

8. 酵素が、キヤンディダ（C a n d i d a) 属またはパシラス（B a c i 1 1 u s ) 属の微生物を起源とする加水分解酵素であるクレーム 1〜 7のいずれかに記載の製造方法。

9. 酵素が、ァルスロパクター ·グロビフオルミス（A r t h r o b a c t e r g 1 o b i f o rm i s ) 、キャンディダ 'シリンダラセァ（C an d i d a c y l i n d r a c e a) 、キャンディダ ·ルゴサ（C a n d i d a r u g o s a) 、キャンディダ 'アンタクティカ（C a n d i d a a n t a c t i c a) 、バシラス ' リケニフォルミス（B a c i 1 1 u s 1 i c h e n i f o r m i s ) 、バシラス ·サブチリス（B a c i l l u s s u b t i l i s) またはクロモバクテリゥム ·チョコレータム（Cli r omo b a c t e r i urn c h o c o 1 a t um) の微生物あるいは好熱性微生物（ t h e rmo p h i l i c m i c r o— o r g a n i sm) 起源とするカロ水分角军酵素であるクレーム 1〜 7のいずれかに記載の製造方法。

1 0. 酵素が、ァルスロバクタ一 S C— 6— 98— 28株（FERM BP— 36 58 ) またはクロモパクテリゥム S C— YM— 1株（FERM B P - 6 703) 由来のエステラーゼもしくはリパ一ゼであるクレーム 1〜 7のいずれかに記載の製造方法。

1 1. 酵素が、下記 a) 〜e) のいずれかアミノ酸配列からなるタンパク質であるクレーム 1〜 7のいずれかに記載の製造方法。

a) 配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列。

b) 1 ) 配列番号 2または 4で示される塩基配列からなる DNAに対して少なくとも 90 %の配列相同性を有する DN Aの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、 i i ) 2—アルキル一 1 , 1, 3—トリアルコキシ力ルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマ一のエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。

c) i ) 配列番号 2または 4で示される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下で八イブリダイズする DNAの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、かつ、 ii) 2—アルキル一 1, 1, 3—トリアルコキシ力ルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。

d) i ) 配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、 ii ) 2一アルキル一 1， 1， 3—トリアルコキシカルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。

e) i ) 配列番号 1または 3で示されるアミノ酸配列と配列相同性が少なくとも 90 %のアミノ酸配列であって、かつ、 ii) 2—アルキル— 1， 1, 3—トリアルコキシカルポニルプロパンのうち一方のェナンチォマーのエステル部位を選択的に加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列。