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WO2007026860A1 - 光学活性α－ヒドロキシカルボン酸の製造方法 - Google Patents

光学活性α－ヒドロキシカルボン酸の製造方法 Download PDF

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WO2007026860A1
WO2007026860A1 PCT/JP2006/317303 JP2006317303W WO2007026860A1 WO 2007026860 A1 WO2007026860 A1 WO 2007026860A1 JP 2006317303 W JP2006317303 W JP 2006317303W WO 2007026860 A1 WO2007026860 A1 WO 2007026860A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
genus
rhodococcus
compound
general formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/317303
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Keiji Sakamoto
Shinji Kita
Akihiro Morii
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyowa Pharma Chemical Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Pharma Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Pharma Chemical Co Ltd filed Critical Kyowa Pharma Chemical Co Ltd
Priority to JP2007533348A priority Critical patent/JPWO2007026860A1/ja
Priority to EP06797245A priority patent/EP1930441A1/en
Priority to US12/065,006 priority patent/US20080311636A1/en
Publication of WO2007026860A1 publication Critical patent/WO2007026860A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing optically active a-hydroxycarboxylic acid or optically active a-hydroxycarboxylic acid ester. More specifically, the present invention relates to a method for efficiently producing optically active a-hydroxycarboxylic acid or optically active a-hydroxycarboxylic acid ester from a racemic mixture of ⁇ -hydroxycarboxylic acid ester using a microorganism. is there. Background art
  • a-Hydroxycarboxylic acids or derivatives thereof are useful as intermediates for the production of various pharmaceuticals and agricultural chemicals, and in particular, optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acids having an asymmetric center at the ⁇ -position or ester derivatives thereof are used.
  • optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acids having an asymmetric center at the ⁇ -position or ester derivatives thereof are used.
  • various methods for efficiently producing optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acid or its ester derivatives having high optical purity have been developed.
  • clopidgrel: (S) -2 (2-clonal mouth) -2- (4,5,6,7-) is expected to be highly useful as a platelet aggregation inhibitor as an antithrombotic agent.
  • optically active a-hydroxycarboxylic acid or an ester thereof optically active threo-1- (p-nitrophenol) -2-amino-1,3-propanediol or optically active lysine is used.
  • a method for producing optically active 2-chloromandelic acid by disolving a diastereomeric salt and optically resolving a racemic mixture of 2-chloromandelic acid is known (Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2004-530717).
  • this method has the disadvantage that it is necessary to use an expensive reagent as a resolving agent for optical resolution! /, And! /.
  • optically active cyanohydrin (2-chloromande mouth-tolyl) is produced using 2-chloro-bensaldehyde and cyanide donor (hydrogen cyanide, etc.) force hydroxy nitrile lyase.
  • An optically active 2-chloromandelic acid is obtained from this optically active cyanohydrin by hydrolysis (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-57005).
  • a microorganism having the ability to stereoselectively oxidize a mandelic acid derivative to produce an axo form is allowed to act on the racemic mixture of mandelic acid derivatives, and unreacted substances are taken out to increase the optical purity.
  • a method for obtaining a mandelic acid derivative has also been proposed (Japanese Patent Laid-Open No. 6-165695). However, in this method, the separation of ⁇ -oxo and ⁇ -hydroxy is complicated, and in some cases, separation itself becomes difficult!
  • Patent Document 1 JP 2001-519353 A
  • Patent Document 2 JP 2004-530717 A
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-57005
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 4-99496
  • Patent Document 5 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-199595
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-49028
  • Patent Document 7 JP-A-6-165695
  • Patent Document 8 Japanese Patent Laid-Open No. 2-53497
  • Patent Document 9 Japanese Patent Laid-Open No. 2-156892
  • Non-Patent Document 1 Canadian Journal of Chemistry, 68 (2), p.314, 1990
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing an optically active a-hydroxycarboxylic acid or an optically active a-hydroxycarboxylic acid ester. More specifically, a method for efficiently producing optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acid or optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acid ester from a racemic mixture of ⁇ -hydroxycarboxylic acid ester using microorganisms is provided. This is the subject of the present invention.
  • A represents a residue of a 5- or 6-membered cyclic compound, and the cyclic compound is selected from an aromatic compound, a partially saturated cyclic compound, or a saturated cyclic compound, It may have a substituent on the ring which may have more than one hetero atom (the substituent is a halogen atom, and optionally has 1 to 4 carbon atoms which may have a substituent). Or an alkyloxy group having 1 to 4 carbon atoms, a hydroxyl group that may be protected with a protecting group, and an amino group that may be protected with a protecting group.
  • substituents 1 or 2 or more substituents are selected, and when 2 or more substituents are present, they may be the same or different, and 2 or more substituents may be selected. They may combine to form a ring if present),
  • X represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, * has any configuration of S or R Is a method for producing a compound represented by the following general formula (II):
  • a and X are as defined above, and R represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms (the alkyl group may be substituted with an aryl group);
  • the compound represented by II) is a carbon atom represented by asterisk (*) and is not optically pure.
  • A is a black-and-white phenyl group, and R is 1 to 4 carbon atoms.
  • R is 1 to 4 carbon atoms.
  • X is a hydrogen atom.
  • the ester group of the compound in which the carbon atom represented by ** is in the R configuration is hydrolyzed.
  • the above method comprising the step of obtaining a compound having a carbon nuclear power configuration represented by * in the compound represented by I).
  • the ester group of the compound in which the carbon atom represented by ** is in the S configuration is hydrolyzed.
  • a method comprising the step of obtaining a compound represented by (I) wherein the carbon atom represented by * is in the S configuration.
  • A represents a 5- or 6-membered cyclic residue.
  • a residue is a monovalent group obtained by removing one hydrogen bonded to a ring atom of a cyclic compound.
  • the cyclic compound may be an aromatic compound, a partially saturated cyclic compound, or a saturated cyclic compound, and may have one or more hetero atoms as a ring constituent atom.
  • the type of heteroatom is not particularly limited. For example, a nitrogen atom, an oxygen atom, or a thio atom can be used. When two or more ring heteroatoms are present, they are the same or different. May be.
  • examples of the cyclic compound include benzene, 5-membered or 6-membered aromatic heterocyclic compounds (eg, furan, thiophene, pyridine, pyrimidine, etc.), 5-membered or 6-membered aliphatic cyclic compounds.
  • Compound eg, cyclopentane, cyclohexane, cyclohexene, etc.
  • 5-membered or 6-membered heterocyclic compound eg, pyrrolidine, piperidine, piperazine, monoreforin, dihydrofuran, tetrahydrofuran
  • benzene is preferred as the cyclic compound.
  • the cyclic compound may have a substituent.
  • the substituent may have a halogen atom, a substituent, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a substituent.
  • the number of substituents and the substitution position are not particularly limited. When it has two or more substituents, they may be the same or different.
  • the type, number, and substitution position of the substituent are not particularly limited.
  • the alkyl group or alkyloxy group has two or more substituents, they are the same or different.
  • substituent for the alkyl group or alkyloxy group include, for example, a hydroxyl group, a halogen atom, an amino group, and the like.
  • the cyclic compound has two or more substituents, these substituents may be bonded to each other to form a ring.
  • the ring structure may be aromatic, partially saturated, or fully saturated.
  • Protective groups include, for example, Protective Groups in Organic Chemistry O. FWMc Omiee tal "Plenum Press; Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition (Theodora W. Green, Peter GM Wuts, John Wily & Sons, Inc.
  • X represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the alkyl group may be linear, branched, or off.
  • R represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the alkyl group is an aryl group that may be substituted with one or more aryl groups.
  • a phenol group is preferable.
  • Examples of the case where the alkyl group is substituted with an aryl group such as a phenyl group include a benzyl group, a benzhydryl group, a phenethyl group, and the like.
  • the method of the present invention is a method for producing a compound represented by the above general formula (I), wherein the compound represented by the above general formula (II) is transformed into a microbial cell or culture of a microorganism belonging to the following genus: Or a process of treating with the treated product or the extract thereof.
  • * represents a carbon atom having a configuration of either S or R
  • the compound represented by the general formula (I) is substantially optically pure with respect to this asymmetric carbon. It is a compound.
  • the steric configuration is not particularly limited.
  • ** indicates that the compound represented by the general formula (II) is not substantially optically pure with respect to this carbon atom.
  • a mixture or racemic mixture of S and R isomers in any proportion with respect to this carbon atom can be used.
  • Microorganisms used in the method of the present invention include the following genera: Leifsonia, Cylindrum genus, Verticillium, Mycobacterium, Rhodococcus, Exophia, Rhodotorula, Bacillus, Brevendimonas, Syuduomo It is a microorganism belonging to the genus Eggplant, Rhizopium, Aspergillus, Bearuveria, Penicillium, Nocardia, Gordonia, Rinocladera, Lamicrolidium, and Porphylobacter. More specifically, the microorganisms used in the method of the present invention include Leifsonia aquatica, Sylindock carbon spices, and ylindrocarpon sp.
  • Microorganisms belonging to the genus Leifsonia, Cylindrum genus, Verticillium, Mycobacterium, Rhodococcus, Exophia, and Rhinocladera can be used. More specifically, examples of microorganisms belonging to these genera include, but are not limited to, the following microorganisms.
  • the microorganisms include, for example, the following genera: Rhodotorula, Bacillus, Brevendimonas, Syudomonas, Rhizopium, Aspergillus, Bearuberia, Penicillium, Nocardia, Gordoa, Rhodococcus , Microorganisms belonging to the genus Lamicrolidium and Borphyropacter can be used. More specifically, the microorganisms belonging to these genera are not limited to the ability to exemplify the following microorganisms.
  • the method of the present invention which provides another viewpoint, is a method for producing a compound represented by the general formula (III), wherein the compound represented by the general formula (II) is a microorganism belonging to the following genus: Ester group of a compound in which the carbon atom represented by ** is in the S configuration or the R configuration in the compound represented by the general formula (II) after being treated with the fungus body or culture, or the treated product or extract thereof And the step of isolating the optically pure unreacted ester compound remaining in the reaction solution.
  • Reifsonia sp Microorganisms belonging to the genus Aspergillus, Beauberia, Penicillium, Nocardia, Gordonia, Rinocladera, Lamicrolidium, and Borfuiro nocter can be used.
  • a preferred embodiment of this method includes a step of hydrolyzing the ester group of the compound represented by ** in the carbon nuclear power configuration represented by ** in the compound represented by the general formula (II).
  • the following genera Leifsoa, Cylindrum carbon, Verticillium, Mycobacterium, Rhodococcus, Exophiala, and Rinoclade Microorganisms belonging to the genus Iera can be used. More specifically, the microorganisms belonging to these genera are not limited to the ability to exemplify the following microorganisms.
  • the compound represented by the general formula (II) is a step of hydrolyzing the ester group of the compound in which the carbon atom represented by ** is in the S configuration.
  • the following genera Rhodotorula, Bacillus, Brevendimonas, Syudomonas, Rhizopium, Aspergillus, Bareberia, Persium, Nocardia, Gordoa, Rhodococcus, Microorganisms belonging to the genus Lamicrolidium and Porphyropacter can be used. More specifically, examples of microorganisms belonging to these genera include, but are not limited to, the following microorganisms.
  • Rhodotorula 'Aurantia Force Basilus' Cereus, Basil's 'Fuji Folmi Miss, Breven Dimonas' Deiminuta, Syudomonas 'Alenoreginosa, Rhizobium' Nocardia 'Astereuides, Nocardia' Gro Berla, Gordonia.Bronchiaris, Gordonia. One 'Sangineus.
  • microorganisms are shown for illustration, and two types of microorganism strains belonging to the same genus may exhibit opposite stereoselectivity in the above hydrolysis reaction.
  • a person skilled in the art can determine whether the compound represented by the general formula (I), which is a result of hydrolysis, has a desired configuration or a desired force according to the method specifically shown in the examples of the present specification. It can be easily confirmed whether or not the steric configuration is opposite to the steric configuration, and it is possible to easily identify the stereoselectivity of the selected microbial strain.
  • the reaction solution By separating and purifying the unreacted raw material compound from the inside and conducting a hydrolysis reaction, a compound of the general formula (I) having a desired configuration can be obtained.
  • a microorganism exhibiting such selectivity only the ester having a configuration opposite to the desired configuration is stereoselectively hydrolyzed by the ester compound combined force represented by the general formula (III). Then, by separating and purifying the unreacted raw material compound from the reaction solution and further carrying out a hydrolysis reaction, an ester compound of the general formula (III) having a desired configuration can be obtained. it can.
  • a compound of general formula (I) having a configuration opposite to the desired configuration was esterified.
  • a compound or a compound of general formula (III) having a configuration opposite to the desired configuration can be converted to a compound of general formula (III) which is not optically pure by a conventional method. For example, it can be racemized by heating in the presence of a strongly basic substance in the solution.
  • a compound having a configuration opposite to the desired configuration is discarded by subjecting the compound of general formula (II I), which is not optically pure, to a microbial reaction similar to that described above. Can be reused without
  • the microorganism used in the method of the present invention is a wild strain, a mutant strain, or a recombinant strain derived by a cell engineering technique such as cell fusion or a DNA engineering technique such as DNA cloning or genetic manipulation. Any of these may be used.
  • These microorganisms can be obtained from various microorganism storage institutions. For example, the University of Tokyo Institute for Applied Microbiology (OA M), the National Institute of Technology and Evaluation (NBRC) (formerly the Fermentation Research Institute (IFO)), and the National Institute for Science and Technology 0CM) Power is available.
  • the above-mentioned microorganism cells can be used.
  • the microbial cells include microbial cells obtained by harvesting the above microorganisms from the culture solution, microbial cells collected from the culture solution and washed, microbial cells that have been dried or treated with acetone powder, and the like. These cells can also be preferably used.
  • the bacterial cells can be fixed and used by an appropriate means. Immobilization can be performed by methods well known to those skilled in the art (for example, a crosslinking method, a physical adsorption method, a comprehensive method, etc.).
  • any commonly used carrier may be used.
  • polysaccharides such as cellulose, agarose, dextran, ⁇ -strength laginan, alginic acid, gelatin, cellulose acetate
  • Natural polymer for example, active Inorganic substances such as charcoal, glass, clay, kaolinite, alumina, silica gel, bentonite, hydroxyapatite, calcium phosphate; for example, synthetic adsorbents such as polyacrylamide, polybutyl acetate, polypropylene glycol, urethane, and the like.
  • the cells can also be used in a form enclosed in a micropower cell.
  • the mode of use of the bacterial cells is not limited to the above, and it goes without saying that those skilled in the art can appropriately select and use the method power available in the art.
  • a culture of the above microorganism may be used.
  • the culture include those obtained by culturing the above microorganisms in an appropriate medium.
  • a processed product or extract of the above microorganism can also be used.
  • the treated product is a digested product obtained by suspending bacterial cells or cultures in a buffer solution as necessary, and the bacterial cells or cultured products are physically such as mortar, dynomill, French press, ultrasonic wave, homogenizer, etc.
  • Examples of the crushed material crushed by the method include certain crushed materials obtained by combining cells or cultures with an enzymatic method such as lysozyme.
  • the extract includes a precipitate obtained by salting out from the extract with ammonium sulfate, the extract A precipitate by alcohol, etc. of the product, gel filtration of the extract or the precipitate with cephadex, etc., hydrophobic chromatography using a carrier having a hydrophobic group such as butyl group, octyl group, phenyl group, etc. Purified by ion-exchange chromatography, dye gel chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography, high performance liquid chromatography, etc.
  • an extract containing an enzyme can be used.
  • extract should be interpreted in the broadest sense including enzyme solutions, isolated and Z or purified enzymes, and the like. Specifically, lipase, ⁇ -amylase, acylase and the like are preferably used as the enzyme.
  • the above-mentioned microorganism-derived purified enzymes may be used.
  • Various conditions in the culture of the microorganism are not particularly limited, and normal culture conditions suitable for the culture of the microorganism can be appropriately selected.
  • the type of the medium is not particularly limited, and a medium suitable for each of bacteria, fungi, or yeast can be appropriately selected.
  • a liquid medium containing a carbon source, a nitrogen source, and other nutrients can be used.
  • the carbon source of the culture medium is not particularly limited as long as the microorganism can be used, and any carbon source can be used. More specifically, examples of assimilating carbon sources include saccharides such as glucose, fructose, sucrose, dextrin, starch and sorbitol, alcohols such as methanol, ethanol and glycerol, fumarate. Organic acids such as acid, citrate, acetic acid and propionic acid and salts thereof, hydrocarbons such as paraffin, molasses, or a mixture thereof can be used.
  • the type of the nitrogen source is not particularly limited as long as the microorganism can be used, and any nitrogen source can be used.
  • Specific examples include assimilable substances, such as ammonium salts of inorganic acids such as salt ammonium, ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium phosphate, Ammonium salt of organic acids such as ammonium fumarate and ammonium citrate, nitrates such as sodium nitrate and potassium nitrate, meat extract, yeast extract, malt extract, peptone, corn steep liquor, soy protein hydrolysate, etc.
  • Inorganic or organic nitrogen-containing compounds or a mixture thereof can be used.
  • nutrient sources used for normal culture such as inorganic substances such as potassium phosphate, iron sulfate, zinc sulfate, and manganese sulfate, trace metal salts, and vitamins may be appropriately added to the medium.
  • the medium may be supplemented with a substance that induces the activity of microorganisms, a buffer substance effective for maintaining the pH of the medium, an antifoaming agent, silicon, Ade force nor, pull nick, and the like.
  • the culture of microorganisms can be performed under conditions suitable for the growth of each microorganism, and such conditions can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the culture medium can be cultured at a pH of 3 to 10, preferably 4 to 9, and a temperature of 0 to 50 ° C, preferably 20 to 40 ° C.
  • Microorganisms can be cultured under aerobic or anaerobic conditions depending on the properties of each microorganism.
  • the culture time can be appropriately determined depending on the force of each microorganism, which is 1 to 300 hours, preferably 10 to 150 hours.
  • the conditions for treating the compound represented by the general formula (II) with the above-mentioned microbial cell or culture, or a treated product thereof or an extract thereof are not particularly limited. Any compound can be used as long as the above-mentioned compound can sufficiently come into contact with the fungus body or culture, or its treated product or its extract, and as a result, the hydrolysis reaction of the ester site proceeds. It is also possible to select the following conditions. For example, a solution of the compound represented by the general formula (II) may be mixed with a bacterial cell or culture washed with a buffer solution or water, or a treated product thereof or an extract thereof.
  • the above steps can be performed in an aqueous homogeneous system or in a two-phase system of an organic solvent that is substantially insoluble or sparingly soluble in water and water, but is generally aqueous. It is preferable to carry out in a homogeneous system.
  • a solvent for forming an aqueous homogeneous system a force using only water as a solvent or a suitable organic solvent miscible with water, for example, a mixture of ethanol, methanol, dioxane, dimethyl sulfoxide and the like and water may be used. Good.
  • the compound represented by the general formula ( ⁇ ) is dissolved in the above organic solvent, and the obtained solution is dissolved in an aqueous solution or suspension in water containing the above microbial cell or culture, or a processed product thereof or an extract thereof. You can add it to the solution.
  • the microorganism and the extract may be those obtained by heat-treating cells or cultures as necessary, or those obtained by further subjecting the heat-treated product to one or more appropriate treatments.
  • the heat treatment can be performed by any method available in the field, and the heat treatment conditions can be appropriately determined by experiments or the like according to the purpose.
  • the heat treatment temperature is, for example, a force that includes a temperature of about 37 ° C or higher, preferably about 40 to 70 ° C, more preferably about 45 to 60 ° C.
  • the heat treatment time can be appropriately selected according to the treatment temperature. For example, the heat treatment time is about 5 minutes to about 24 hours, preferably about 30 minutes to 10 hours, more preferably about 1 to 5 hours.
  • a typical heat treatment includes, for example, a process of about 2 to 4 hours at a temperature of about 45 ° C, about 50 ° C, or about 55 ° C, more preferably about 45 to 55 ° C. Includes the process of processing for about 3 hours. In some cases, good results including selectivity and conversion rate can be obtained by using heat-treated cells or cultures.
  • the treatment conditions are not particularly limited as long as the asymmetric hydrolysis reaction of the ester proceeds.
  • the amount of cells used as dry cells or the amount used when using an extract or the like is not particularly limited, but is, for example, 1/100 to 100/100 with respect to the compound represented by the general formula (II). Times, preferably about 1/10 to 100 times.
  • the concentration of the compound represented by the general formula (II) as a substrate is 0.01 to 20% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight, based on the total weight of the reaction system.
  • the pH of the reaction solution is 4-9, preferably 5-8, and the reaction temperature is 10-50 ° C, preferably 20-40 ° C.
  • Buffers can be used to stabilize the pH
  • the buffer solution phosphate buffer solution, Tris buffer solution, acetate buffer solution and the like can be used. Furthermore, in order to adjust pH, it can also adjust using an acid and a base.
  • the reaction time can be appropriately selected according to each microorganism having a force of 1 to 200 hours, preferably 5 to 150 hours.
  • the substrate and Z or microbial cells or culture, or the processed product or extract thereof are added at once, or sequentially, or continuously, as necessary. It can also be added.
  • the reaction rate can be increased while continuously taking out the hydrolyzate as a product.
  • optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acid represented by the general formula (I) obtained by the reaction or the optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acid ester represented by the general formula (III) is a conventional separation and purification means. Can be isolated and purified.
  • the culture is subjected to membrane separation, extraction with an organic solvent (eg, toluene, black mouth form, etc.), column chromatography, vacuum concentration, distillation, crystallization, It is purified by an ordinary purification method such as recrystallization to obtain an optically active a-hydroxycarboxylic acid represented by the general formula (I) or an optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acid ester represented by the general formula (III).
  • an organic solvent eg, toluene, black mouth form, etc.
  • the product after completion of the reaction, can be extracted from the reaction solution with an organic solvent such as butyl acetate, ethyl acetate, toluene, chloroform, etc., and the crude product can be obtained by distilling off the solvent.
  • the crude product can be purified by silica gel chromatography, recrystallization ( ⁇ -hexane, ethyl acetate, etc.), vacuum distillation or the like, if necessary.
  • the optically active ⁇ -hydroxycarboxylic acid represented by the general formula (I) is not hydrolyzed in the reaction solution.
  • the remaining optically pure unreacted ester compound (optically active a-hydroxycarboxylic acid ester) exists.
  • hydrolysis of the ester group after this and the optically active ⁇ - hydroxy carboxylic acid ester to give the optically active represented by the general formula (I) alpha - can be produced hydroxamate Shikarubon acid.
  • the acid or base used for the hydrolysis is not particularly limited as long as it is used as an acid or base in a normal reaction.
  • mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, sodium hydroxide, and hydroxide Bases such as potassium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sodium hydride, lithium hydride or ammonia water, preferably sodium hydroxide or potassium hydroxide Can. It is desirable to select appropriate conditions so that the steric reversal of the compound represented by the general formula (I) does not occur during hydrolysis with a base.
  • the reaction solvent for hydrolysis is not particularly limited as long as it does not hinder the progress of the reaction and can sufficiently dissolve the raw materials.
  • the reaction temperature is usually ⁇ 20 to 150 ° C., preferably 10 to 30 ° C.
  • the reaction time varies depending on the raw materials used, the solvent, the reaction temperature and the like, and is usually 5 minutes to 36 hours, preferably 10 minutes to 16 hours.
  • Substrates can be prepared by conventional methods, such as inexpensively supplied optically impure ⁇ -hydroxycarboxylic acids and alcohols.
  • Exophylara dermatitis NBRC 8193 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 6 days. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add appropriate amount of water, 1M-MES buffer (pH 6.5) 50, racemic 2-chloromandelic acid methyl ester 10 mg (50 ⁇ L of 20% ethanol solution) to the cells, and mix to make 1 mL of reaction. The mixture was shaken at 30 ° C for 20 hours.
  • reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • Rhizobium radiopactor NBRC 13263 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 6 days at 25 ° C. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add an appropriate amount of water, 50 L of 1M-MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid methyl ester (50 ⁇ L of 20% ethanol solution), mix and mix. The reaction mixture was shaken at 30 ° C for 20 hours as an mL reaction solution.
  • reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • Rhizobium radiopactor NBRC 13263 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 6 days at 25 ° C. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add an appropriate amount of water, 50 L of 1M MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid methyl ester (50 L of 20% ethanol solution), mix, and add 1 mL. The reaction solution was shaken at 30 ° C for 72 hours.
  • reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • HPLC HPLC
  • n-Hexane / IPA 9/1, flow rate 1.0 mL / min, Detection wavelength UV 254 nm.
  • the product was (R) -2-chloromandelic acid methyl ester.
  • the above-mentioned microorganism was replaced with the microorganism shown in Table 3, and the reaction was performed in the same manner as described above, and the results shown in the table were obtained.
  • Exophylara dermatitis NBRC 8193 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 6 days. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add an appropriate amount of water, 50 L of 1M-MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid methyl ester (50 ⁇ L of 20% ethanol solution), and mix to obtain 1 mL. The reaction solution was shaken at 30 ° C for 72 hours.
  • reaction solution After completion of the reaction, the reaction solution is centrifuged or After filtration, the supernatant was analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / Min, detection wavelength UV 254 nm). As a result, it was confirmed that unreacted 2-chloromandelic acid methyl esterca .27 mg / mL remained.
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / Min, detection wavelength UV 254 nm.
  • Exophylara dermatitis NBRC 8193 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 6 days. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add appropriate amount of water, 50 L of 1M MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 4_chloromandelic acid methyl ester, and mix to prepare 1 mL of reaction solution at 30 ° C, 20 hours. Reacted with shaking.
  • reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • the sample was analyzed by HPLC (GEL PACKED COLUM N CRS10W, Mitsubishi Chemical, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent: 0.2 mM CuSO 85%, Cetonitrile 15%, flow rate 2.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GEL PACKED COLUM N CRS10W, Mitsubishi Chemical, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent: 0.2 mM CuSO 85%, Cetonitrile 15%, flow rate 2.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • Exophylara dermatitis NBRC 8193 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 6 days. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add appropriate amount of water, 1M-MES buffer (pH 6.5) 50 / z L, racemic 4-trifluoromethylmandelic acid methyl ester 10 mg, mix and mix 1 mL reaction. The solution was shaken at 30 ° C for 20 hours.
  • reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetate nitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer Liquid 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetate nitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer Liquid 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • the sample was analyzed by HPLC (GEL PACKED COLUMN CRS10W, Mitsubishi Chemical, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent: 0.2 mM CuSO 85%, acetonitrile 15%, flow rate 2.0 mL / Min, detection wavelength UV 254 nm)
  • Exophylara dermatitis NBRC 8193 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 6 days. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add an appropriate amount of water, 1M-MES buffer (pH 6.5) 50 / z L, racemic 4-methoxymandelic acid methyl ester 10 mg, mix and mix as 30 ml as 1 ml reaction solution. C, reacted for 20 hours with shaking.
  • the reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • HPLC GL Science Iner
  • Exophylara dermatitis NBRC 8193 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 6 days. Cells were obtained by centrifugation or filtration. To this, add an appropriate amount of water, 50 L of 1M-MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid ethyl ester, mix and shake as 30 ml at 30 ° C for 20 hours. I finally reacted.
  • 1M-MES buffer pH 6.5
  • 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid ethyl ester mix and shake as 30 ml at 30 ° C for 20 hours. I finally reacted.
  • the reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • Exophylara dermatitis NBRC 8193 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 6 days. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add an appropriate amount of water, 50 L of 1M-MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid isopropyl ester, and mix to prepare 1 ml reaction solution at 30 ° C. Reacted with shaking for 20 hours.
  • the reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • Exophylara dermatitis NBRC 8193 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 6 days. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add an appropriate amount of water, 50 L of 1M-MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid benzyl ester, and mix to prepare a 1 ml reaction solution at 30 ° C. Reacted with shaking for 20 hours.
  • the reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • the sample was analyzed by HP
  • Exofiara 'Gencermei NBRC 6857 was cultured with shaking in a medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 3 days. After culturing, 0.28 mL of the culture broth was centrifuged to obtain bacterial cells. To this, add an appropriate amount of water, 100 L of 0.5M-MES buffer ( ⁇ 6.5), 5 mg of racemic lactic acid methyl ester at 30 ° C for 30 minutes as a 0.5 mL reaction solution. Reacted with shaking.
  • reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2 .5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2 .5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • the sample was analyzed by HPLC (GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent 0.2 mM CuSO 90%, acetonitrile 10%, flow rate 2.0 mL
  • Exofiara 'Gencermei NBRC 6857 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone, and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 3 days. Centrifugation of 0.28 mL of the culture broth gave bacterial cells. Add an appropriate amount of water, 100 L of 1M MES buffer ( ⁇ 6.5), 5 mg of racemic 4-fluoromandelic acid methyl ester, mix and mix as a 0.5 mL reaction solution at 30 ° C for 30 minutes. Reacted with shaking.
  • reaction mixture was centrifuged, and the supernatant was analyzed by HPLC (Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2 .5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV254 nm). As a result, it was confirmed that 0.19 mg / mL of 4-fluoromandelic acid was produced.
  • the sample was analyzed by HPLC (GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent 2 mM CuSO 90%, acetonitrile 10%, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent 2 mM CuSO 90%, acetonitrile 10%, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent 2 mM CuSO 90%, acetonitrile 10%, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • the optical purity was 77% ee.
  • Exofiara 'Gencermei NBRC 6857 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone, and 0.3% yeast extract at 25 ° C for 3 days. Cells were obtained by centrifugation of 0.28 mL of the culture solution. Add an appropriate amount of water, 100 L of 0.5 M MES buffer ( ⁇ 6.5), 5 mg of 3-chloromandelic acid methyl ester, mix and shake as 30 mL at 30 ° C for 30 min. I finally reacted.
  • reaction solution was centrifuged, and the supernatant was analyzed by HPLC (Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5 , Flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm). As a result, it was confirmed that 0.094 mg / mL of 3-chloromandelic acid was produced.
  • the sample was analyzed by HPLC (GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent 0.2 mM CuSO 90%, acetonitrile 10%, flow rate 1.0
  • Rhizobium radiopactor NBRC 13263 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 6 days at 25 ° C. Cells were obtained by centrifugation or filtration. To this, add an appropriate amount of water, 50 L of 1M MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 4-chloromandelic acid methyl ester, mix and mix as a 1 ml reaction solution at 30 ° C for 20 hours. Shake I finally reacted.
  • 1M MES buffer pH 6.5
  • the reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • Rhizobium radiopactor NBRC 13263 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 6 days at 25 ° C. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add an appropriate amount of water, 50 L of 1M-MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 4_trifluoromethylmandelic acid methyl ester, and mix to prepare 30 ml of 1 ml reaction solution. The reaction was carried out at 20 ° C for 20 hours.
  • reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HP LC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 2 54 nm).
  • HP LC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 2 54 nm.
  • the sample was analyzed by HPLC (GEL PACKED COLUMN CRS10W, Mitsubishi Chemical, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent: 0.2 mM CuSO 85%, acetonitrile 15%, flow rate 2.0 mL / Min, detection wavelength UV 254 nm)
  • Rhizobium radiopactor NBRC 13263 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 6 days at 25 ° C. Cells were obtained by centrifugation or filtration. To this, add an appropriate amount of water, 1M-MES buffer (pH 6.5) 50 / z L, racemic 4-methoxymandelic acid methyl ester 10 mg, and mix to prepare 1 ml reaction solution at 30 ° C, Reacted with shaking for 20 hours.
  • 1M-MES buffer pH 6.5
  • racemic 4-methoxymandelic acid methyl ester 10 mg racemic 4-methoxymandelic acid methyl ester 10 mg
  • the reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05 M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • Rhizobium radiopactor NBRC 13263 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 6 days at 25 ° C. Cells were obtained by centrifugation or filtration. To this, add an appropriate amount of water, 50 L of 1M MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid ethyl ester, mix and shake as 30 ml at 30 ° C for 20 hours. I finally reacted.
  • 1M MES buffer pH 6.5
  • 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid ethyl ester mix and shake as 30 ml at 30 ° C for 20 hours. I finally reacted.
  • reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • Rhizobium radiopactor NBRC 13263 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 6 days at 25 ° C. Cells were obtained by centrifugation or filtration. Add an appropriate amount of water, 50 L of 1M-MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid isopropyl ester, and mix to prepare 1 ml of reaction solution at 30 ° C. Reacted with shaking for 20 hours.
  • reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • the sample was analyzed by HPLC (GEL PACKED COLU MN CRS10W, manufactured by Mitsubishi Chemical, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent: 0.2 mM CuSO 85%,
  • Rhizobium radiopactor NBRC 13263 was cultured with shaking in 5 mL of medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 6 days at 25 ° C. Cells were obtained by centrifugation or filtration. To this, add an appropriate amount of water, 50 L of 1M-MES buffer (pH 6.5), 10 mg of racemic 2-chloromandelic acid benzyl ester, mix and mix as a 1 ml reaction solution at 30 ° C for 20 hours. Reacted with shaking.
  • reaction solution is centrifuged or filtered, and the supernatant is analyzed by HPLC (GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC GL Science Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent: acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75 %, PH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm.
  • the sample was analyzed by HPLC (GEL PACKED COLUMN CRS10W, manufactured by MCI, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent: 0.2 mM CuSO 85%, acetonitrile.
  • Rhizobium 'Radiopactor NBRC13263 was cultured with shaking in a medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 3 days at 25 ° C. After culturing, the cells were centrifuged from 9.1 mL of the culture solution to obtain bacterial cells. To this was added an appropriate amount of water, 100 L of 0.5 M-MES buffer ( ⁇ 6.5), 5 mg of atto-mouth lactate methyl ester, and mixed to react as a 0.5 mL reaction solution at 30 ° C for 30 minutes. .
  • the reaction mixture is centrifuged and the supernatant is analyzed by HPLC (Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent acetononitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm). As a result, it was confirmed that 0.15 mg / mL of atohuctolactic acid was produced.
  • the sample was analyzed by HPLC (GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent 2 mM CuSO 90%, acetonitrile 10%, flow rate 1.0 mL / min. , Detection wavelength UV 254 nm)
  • Rhizobium 'Radiopactor NBRC13263 was cultured with shaking in a medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 3 days at 25 ° C. After culture, centrifuge from 9.1 mL of culture broth Separated to obtain bacterial cells. Add an appropriate amount of water, 100 M of 0.5 M-MES buffer ( ⁇ 6.5), 5 mg of 4-fluoromandelic acid methyl ester, and mix to give a 0.5 mL reaction solution at 30 ° C for 30 minutes. did.
  • the reaction mixture is centrifuged and the supernatant is analyzed by HPLC (Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent acetononitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm). As a result, it was confirmed that 0.22 mg / mL of 4-fluoromandelic acid was produced.
  • the sample was analyzed by HPLC (GEL PACKED COLUMN CRSIOW MCI, diameter 4.6 mm, length 50 mm, eluent 2 mM CuSO 90%, acetonitrile 10%, flow rate 1.0 mL / min, detection
  • Rhizobium 'Radiopactor NBRC13263 was cultured with shaking in a medium containing 1% glucose, 0.5% peptone and 0.3% yeast for 3 days at 25 ° C. After culturing, the cells were centrifuged from 9.1 mL of the culture solution to obtain bacterial cells. An appropriate amount of water, 100 L of 0.5 M-MES buffer ( ⁇ 6.5), 5 mg of 3-chloro mandelic acid methyl ester were added and mixed to make 0.5 mL, and the mixture was shaken at 30 ° C. for 30 minutes.
  • the reaction solution is centrifuged and the supernatant is analyzed by HPLC (Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • HPLC Inertsil ODS-3, diameter 4.6 mm, length 75 mm, eluent acetonitrile 25%, 0.05M sodium phosphate buffer 75%, pH 2.5, flow rate 1.0 mL / min, detection wavelength UV 254 nm).
  • an optically active a-hydroxycarboxylic acid or optically active a-hydroxycarboxylic acid ester having an extremely high optical purity can be produced easily and inexpensively.
  • An optically active a-hydroxycarboxylic acid or optically active a-hydroxycarboxylic acid ester having an extremely high optical purity can be produced easily and inexpensively.
  • a variety of physiologically active compounds can be produced using the optically active a-hydroxycarboxylic acid or ester derivative thereof produced by the method of the present invention.

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Abstract

　下記の一般式(I)〔Ａは５又は６員の環状化合物の残基を示し、＊はＳ又はＲのいずれかの立体配置を有する炭素原子を示し、Ｘは水素原子又は炭素数１～４個のアルキル基を示す〕で表される光学活性α－ヒドロキシカルボン酸の効率的な製造方法であって、対応のエステル化合物（光学的に純粋ではない）をレイフソニア属、シリンドロカーポン属、又はバーチシリウム属などの微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む方法。                                                                                 

Description

明 細 書
光学活性 α—ヒドロキシカルボン酸の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は光学活性 aーヒドロキシカルボン酸又は光学活性 aーヒドロキシカルボン 酸エステルの製造方法に関する。より具体的には、微生物を用いて α—ヒドロキシカ ルボン酸エステルのラセミ混合物カゝら光学活性 a—ヒドロキシカルボン酸又は光学活 性 aーヒドロキシカルボン酸エステルを効率的に製造する方法に関するものである。 背景技術
[0002] aーヒドロキシカルボン酸又はその誘導体は、各種の医薬や農薬の製造用中間体 として有用であり、特に α位に不斉中心を有する光学活性 α—ヒドロキシカルボン酸 又はそのエステル誘導体を用いて様々な生理活性ィ匕合物を製造することができるこ とから、高い光学純度を有する光学活性 α—ヒドロキシカルボン酸又はそのエステル 誘導体を効率的に製造する方法の開発が鋭意行なわれている。例えば、血小板凝 集阻害剤ゃ抗血栓剤として高 、有用性が期待されるクロピドグレル (clopidgrel: (S)-2 (2-クロ口フエ-ル)- 2-(4,5,6,7-テトラヒドロチエノ [3,2-c]- 5-ピリジル)酢酸メチル)を光 学活性 a—ヒドロキシカルボン酸エステルカゝら効率よく製造できることが知られている (特開 2001-519353号公報）。この方法は、（R) -2-クロロマンデル酸メチルの α -ヒドロ キシル基をスルホ-ル化し、 4,5,6,7-テトラヒドロチエノ [3,2-c]- 5-ピリジンと反応させる 工程を含んでいる。
[0003] 光学活性 aーヒドロキシカルボン酸又はそのエステルの製造方法としては、光学活 性スレオ- l-(p-二トロフエ-ル)- 2-ァミノ- 1,3-プロパンジオールや光学活性リジンを 用い、ジァステレオマー塩をたて 2-クロロマンデル酸ラセミ混合物を光学分割して光 学活性 2-クロロマンデル酸を製造する方法が知られて ヽる（特開 2004-530717号公 報)。し力しながら、この方法では光学分割のための分割剤として高価な試薬を使わ なければならな!/、と!/、う欠点がある。
[0004] また、 2-クロ口べンズアルデヒドとシアニドドナー（シアン化水素など）力 ヒドロキシ 二トリルリアーゼを用いて光学活性シァノヒドリン (2-クロロマンデ口-トリル)を製造す る方法が提案されており、この光学活性シァノヒドリンから加水分解により光学活性 2- クロロマンデル酸が得られる（特開 2004-57005号公報）。 2-クロ口べンズアルデヒドと シアニドドナー（シアン化水素など）力も得たシァノヒドリン（2-クロロマンデ口-トリル） に対して不斉加水分解を行って光学活性 2_クロロマンデル酸を得る方法も提案され ている（特開平 4-99496号公報)。し力しながら、これらの方法で用いるシアニドドナー (シアンィ匕水素など）は取り扱いに危険性を伴うという欠点がある。
[0005] フエ-ルグリオキシル酸誘導体に対して a位カルボ-ル基を立体選択的に還元す る能力のもつ微生物を用いて光学活性なマンデル酸誘導体を得る方法も提案されて いる（特開 2003-199595号公報及び特開 2004-49028号公報)。しかしながら、原料と して用いる OCケト酸 (フエニルダリオキシル酸誘導体）が高価であり、補酵素の再生系 も必要となることから、この方法は製造コストが高いという欠点がある。さらに、マンデ ル酸誘導体を立体選択的に酸化して aォキソ体を生成する能力を有した微生物を マンデル酸誘導体のラセミ混合物に対して作用させ、未反応物を取り出して光学純 度の高 ヽマンデル酸誘導体を得る方法も提案されて!ヽる（特開平 6-165695号公報） 。し力しながら、この方法では、 αォキソ体と αヒドロキシ体の分離が煩雑であり、場 合によっては分離自体が困難になると!/、う欠点がある。
[0006] なお、 α -ァリール - α -ヒドロキシ酸エステルの酵素的加水分解を特徴とする光学 活性体の製法に関する技術としては特開平 2-53497号公報及び特開平 2-156892号 公報に記載された方法が知られて 、るが、これらの特許公報に具体的に開示された 実施例はマンデル酸を用いた方法に限定されており、有用性が低 、と 、う問題があ る。また、 Canadian Journal of Chemistry, 68(2), p.314, 1990には各種置換基を有す る a -ァリール- a -ヒドロキシ酸エステルを酵素的に加水分解する方法が開示されて いるが、使用される酵素は炭酸脱水酵素に限定されており、生成物の光学純度も 40 〜50% ee程度であり選択性が低 、ために有用性が低 、と 、う問題がある。
特許文献 1：特開 2001-519353号公報
特許文献 2：特開 2004-530717号公報
特許文献 3：特開 2004-57005号公報
特許文献 4：特開平 4-99496号公報 特許文献 5：特開 2003-199595号公報
特許文献 6：特開 2004-49028号公報
特許文献 7：特開平 6-165695号公報
特許文献 8：特開平 2-53497号公報
特許文献 9：特開平 2-156892号公報
非特許文献 1 : Canadian Journal of Chemistry, 68(2), p.314, 1990
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の課題は、光学活性 aーヒドロキシカルボン酸又は光学活性 aーヒドロキシ カルボン酸エステルの効率的な製造方法を提供することにある。より具体的には、微 生物を用いて α—ヒドロキシカルボン酸エステルのラセミ混合物カゝら光学活性 α—ヒ ドロキシカルボン酸又は光学活性 αーヒドロキシカルボン酸エステルを効率的に製造 する方法を提供することが本発明の課題である。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、特定の属に属す る微生物又はその抽出物などを用いて α—ヒドロキシカルボン酸エステルのラセミ混 合物を加水分解するとエステルの加水分解が立体選択的に進行すること、及びその 加水分解反応を利用して光学活性 aーヒドロキシカルボン酸又は光学活性ヒドロキ シカルボン酸エステルを極めて効率的に製造できることを見出した。本発明は上記の 知見を基にして完成された。
[0009] すなわち、本発明は、下記の一般式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000004_0001
〔式中、 Aは 5員又は 6員の環状化合物の残基を示し、該環状化合物は芳香族化合 物、部分飽和環状化合物、又は飽和環状化合物から選択され、環構成原子として 1 個以上のへテロ原子を有していてもよぐ環上には置換基を有していてもよく（該置換 基はハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数 1〜4個のアルキル基、置換基 を有して!/、てもよ 、炭素数 1〜4個のアルキルォキシ基、及び保護基で保護されて ヽ てもよい水酸基、保護基で保護されていてもよいアミノ基、ニトロ基力もなる群力も選 ばれる 1又は 2個以上の置換基であり、 2個以上の置換基が存在する場合にはそれら は同一でも異なっていてもよぐ 2個以上の置換基が存在する場合にはそれらが結合 して環を形成してもよい）、 Xは水素原子又は炭素数 1〜4個のアルキル基を示し、 * は S又は Rの 、ずれかの立体配置を有する炭素原子を示す〕で表される化合物の製 造方法であって、下記の一般式 (II) :
[化 2]
Figure imgf000005_0001
〔式中、 A及び Xは上記定義と同義であり、 Rは炭素数 1〜4個のアルキル基 (該アル キル基はァリール基で置換されていてもよい）を示し、ただし、一般式 (II)で表される 化合物は * *で示される炭素原子にっ 、て光学的に純粋ではな 、〕で表される化合 物を下記の属：レイフソニァ (Leifsonia)属、シリンド口カーボン (Cylindrocarpon)属、ノ ーチシリウム (Verticillium)属、マイコバクテリゥム (Mycobacterium)属、ロドコッカス (Rho dococcus)属、ェクソフィアラ (Exophiala)属、ロドトルラ (Rhodotorula)属、バシルス (Bacil lus)属、ブレブンディモナス (Brevundimonas)属、シユードモナス (Pseudomonas)属、リ ゾビゥム (Rhizobium)属、ァスペルギルス (Aspergillus)属、ベアウベリア (Beauveria)属、 ぺニシリウム (Penidllium)属、ノカルディア (Nocardia)属、ゴルドニァ (Gordonia)属、リノ クラディエラ (Rhinocladiella)属、ラミクロリディウム (Ramichloridium)属、及びボルフイロ パクター (Porphyrobacter)属に属する微生物力もなる群力 選ばれる微生物の菌体 若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む方法が 提供される。
上記発明の好ましい態様によれば、 Aがクロ口フ ニル基であり、 Rが炭素数 1〜4 個のアルキル基又はべンジル基であり、 Xが水素原子である上記の方法が提供され る。また、本発明の別の好ましい態様によれば、一般式 (II)で表される化合物におい て * *で表される炭素原子が R配置である化合物のエステル基を加水分解して一般 式 (I)で表される化合物にぉ 、て *で表される炭素原子力 ¾配置である化合物を得る 工程を含む上記の方法が提供される。また、本発明のさらに別の好ましい態様によ れば、一般式 (II)で表される化合物において * *で表される炭素原子が S配置である 化合物のエステル基を加水分解して一般式 (I)で表される化合物にぉ 、て *で表さ れる炭素原子が S配置である化合物を得る工程を含む方法が提供される。
別の観点からは、下記の一般式 (III) :
[化 3]
Figure imgf000006_0001
(式中、 A、 R、 X、及び *は上記定義と同義である）で表わされる化合物の製造方法 であって、上記一般式 (II) (式中、 A、 R、 X、及び * *は上記定義と同義である）で表 わされる化合物を下記の属：レイフソ-ァ属、シリンド口カーボン属、バーチシリウム属 、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属、ェクソフィアラ属、ロドトルラ属、バシルス属、 ブレブンディモナス属、シユードモナス属、リゾピウム属、ァスペルギルス属、ベアウベ リア属、ぺニシリウム属、ノカルディア属、ゴルドニァ属、リノクラディエラ属、ラミクロリ ディウム属、及びボルフイロパクター属に属する微生物力もなる群力も選ばれる微生 物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理して一般式 (II) で表される化合物において * *で表される炭素原子が S配置又は R配置である化合 物のエステル基を加水分解し、反応液中に残留した光学的に純粋な未反応エステ ル化合物を単離する工程を含む方法が提供される。
上記発明の好ましい態様によれば、 Aがクロロフヱニル基であり、 Rが炭素数 1〜4 個のアルキル基又はべンジル基であり、 Xが水素原子である上記の方法が提供され る。 発明を実施するための最良の形態
[0012] 一般式 (I)で表される化合物において、 Aは 5員又は 6員の環状ィ匕合物の残基を示 す。残基とは環状ィヒ合物の環構成原子に結合する水素を 1つ除いて得られる 1価の 基のことである。該環状化合物は芳香族化合物、部分飽和環状化合物、又は飽和環 状ィ匕合物のいずれであってもよぐ環構成原子として 1個以上のへテロ原子を有して いてもよい。ヘテロ原子の種類は特に限定されないが、例えば、窒素原子、酸素原 子、又はィォゥ原子などを用いることができ、 2個以上の環構成へテロ原子を有する 場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。環状ィ匕合物としては、より具体的 には、ベンゼン、 5員又は 6員の芳香族へテロ環化合物（例えばフラン、チォフェン、 ピリジン、ピリミジンなど）、 5員又は 6員の脂肪族環状ィ匕合物（例えば、シクロペンタン 、シクロへキサン、シクロへキセンなど）、あるいは 5員又は 6員のへテロ環化合物（例 えば、ピロリジン、ピぺリジン、ピぺラジン、モノレホリン、ジヒドロフラン、テトラヒドロフラ ンなど)などを挙げることができる。これらのうち、環状ィ匕合物としてはベンゼンが好ま しい。
[0013] 環状ィ匕合物は置換基を有していてもよぐ該置換基は、ハロゲン原子、置換基を有 して 、てもよ 、炭素数 1〜4個のアルキル基、置換基を有して!/、てもよ 、炭素数 1〜4 個のアルキルォキシ基、及び保護基で保護されていてもよい水酸基、保護基で保護 されていてもよいアミノ基、ニトロ基力もなる群力も選ばれる 1又は 2個以上の置換基 である。環状化合物が置換基を有する場合、置換基の個数及び置換位置は特に限 定されない。 2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていても よい。上記アルキル基又はアルキルォキシ基が置換基を有する場合、置換基の種類 、個数、及び置換位置は特に限定されず、 2個以上の置換基を有する場合には、そ れらは同一でも異なって 、てもよ 、。上記アルキル基又はアルキルォキシ基の置換 基としては、例えば、水酸基、ハロゲン原子、又はアミノ基などを例示することができる 力 これら〖こ限定されることはない。環状化合物が 2個以上の置換基を有する場合に は、それらの置換基は互いに結合して環を構成してもよい。この場合、環構造は芳香 族、部分飽和、又は完全飽和のいずれであってもよい。例えば、 2個のアルキル基が 結合して炭素環を形成する場合や、 1個のアルキルォキシ基と水酸基とが結合してァ ルキレンジォキシ基の環構造を形成する場合などを例示することができる力 これら に限定されることはない。
[0014] 保護基としては、例えば、 Protective Groups in Organic ChemistryO.F.W.McOmiee tal" Plenum Press; Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition (Theodora W. Green, Peter G.M. Wuts, John Wily & Sons, Inc. (ISBN 0—471— 16019— 9),April 1999)に記載の保護基が挙げられ、具体的には、メチル基、ェチル基、イソプロピル 基、 t-ブチル基、メトキシメチル基、ベンジルォキシメチル基、メトキシェトキシメチル 基、メチルチオメチル基、フエ-ルチオメチル基、テトラヒドロビラ-ル基、 p-ブロモフ ェナシル基、ァリル基、シクロへキシル基等のエーテル型保護基;ベンジル基、 2,6- ジメチルベンジル基、 4-メトキシベンジル基、 2, 6-ジクロロべンジル基、 9-アントラ-ル メチル基、ジフエ-ルメチル基、フエネチル基、トリフエ-ルメチル基等のベンジル型 保護基、トリメチルシリル基、トリェチルシリル基、ジメチルェチルシリル基、 t-ブチル ジメチルシリル基等のシリル型保護基;ァセチル基、クロロアセチル基、トリフルォロア セチル基、ビバロイル基等のァシル型保護基；ベンゾィル基、 p-メチルベンゾィル基 、 p-クロ口べンゾィル基、 0-クロ口ベンゾィル基、 p-二トロベンゾィル基等のァロイル型 保護基;メトキシカルボ-ル基、エトキシカルボ-ル基、 t-ブトキシカルボニル基、ベン ジルォキシカルボ-ル基、 p-メチルベンジルォキシカルボ-ル基等のカーボネート 型保護基；ジメチルホスフィエル基、ジェチルホスフィエル基等のホスフィネート型保 護基；メタンスルホ-ル基、エタンスルホ-ル基、クロロメタンスルホ-ル基、クロ口エタ ンスルホ-ル基、トリクロロメタンスルホ-ル基、トリフルォロメタンスルホ-ル基、ベン ゼンスノレホ-ノレ基、 p-トノレエンスノレホ-ノレ基、。-二トロベンゼンスノレホニノレ基、 m- -ト 口ベンゼンスノレホニノレ基、 p--トロベンゼンスノレホニノレ基、 0-クロ口ベンゼンスノレホニ ノレ基、 m-クロ口ベンゼンスノレホニノレ基、 p-クロ口ベンゼンスノレホニノレ基等のスノレホニ ル型保護基などが挙げられる。
[0015] 一般式 (1)、（11)、及び (III)で表される化合物において Xは炭素数 1〜4のアルキル基 を示す。該アルキル基は直鎖状であっても分枝鎖状の 、ずれであってもよ 、。
一般式 (II)で表される化合物において、 Rは炭素数 1〜4個のアルキル基を示す。該 アルキル基は 1個又は 2個以上のァリール基で置換されていてもよぐァリール基とし てはフエ-ル基などが好適である。該アルキル基がフエニル基などのァリール基で置 換された場合の例としては、ベンジル基、ベンズヒドリル基、フエネチル基などを挙げ ることがでさる。
本発明の方法は、上記の一般式 (I)で表される化合物の製造方法であって、上記の 一般式 (II)で表される化合物を下記の属に属する微生物の菌体若しくは培養物、又 はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含むことを特徴として 、る。一般 式 (I)において、 *は S又は Rのいずれかの立体配置を有する炭素原子を示し、一般 式 (I)で表される化合物は、この不斉炭素に関して実質的に光学的に純粋な化合物 である。一般式 (I)で表される化合物が他の不斉炭素を有する場合には、その立体配 置は特に限定されない。また、一般式 (II)で表される化合物において、 * *はこの炭 素原子について一般式 (II)で表される化合物が実質的に光学的に純粋ではないこと を示す。例えば、この炭素原子に関して S体と R体との任意の割合の混合物やラセミ 体などを用いることができる。本発明の方法に用いられる微生物は、下記の属：レイフ ソニァ属、シリンド口カーボン属、バーチシリウム属、マイコバクテリウム属、ロドコッカ ス属、ェクソフィアラ属、ロドトルラ属、バシルス属、ブレブンディモナス属、シユードモ ナス属、リゾピウム属、ァスペルギルス属、ベアウベリア属、ぺニシリウム厲、ノカルデ ィァ属、ゴルドニァ属、リノクラディエラ属、ラミクロリディウム属、及びポルフィロバクタ ー属に属する微生物である。本発明の方法に用いられる微生物としては、より具体的 には、レイフソ-ァ 'アクアチカ (Leifsonia aquatica)、シリンド口カーボン 'スピーシーズ ( し ylindrocarpon sp.入 ノ ~~チンリウム 'レフ。トノヽクァリム (Verticillium leptobactrum)、 マ ィコバタテリゥム.スメグマチス (Mycobacterium smegmatis)、マイコバクテリゥム 'フレイ（ Mycobacterium phlei)、マイコノ クァリウム'ノ力ェ (Mycobacterium vaccae)、ロドコッ力 ス'ェクイ (Rhodococcus equi)、ロドコッカス 'ファシアンス (Rhodococcus fascians)、ロド コッカス'ラテイスラビエンシス (Rhodococcus wratislaviensis)、ェクソフィアラ 'ジーンセ ノレメイ (Exophiala jeanselmei)、ェクソフィァフ'テノレマチチンス (Exophiala dermatitidis 、ロドトノレラ'ァウランチア力 (Rhodotorula aurantiaca)、バシノレス'セレウス (Bacillus cer eus)、バシルス'フジフオルミス (Bacillus fosiformis)、ブレブンディモナス ·ディミヌタ (Br evundimonas diminuta)ゝンュ ~~トモナス · /'ェノレキノサ (Pseudomonas aeruginosa) ^リン ビゥム ·ラジオパクター (Rhizobium radiobacter),ァスペルギルス ·オクラセウス (Aspergi llus ochraceus)ゝァスぺノレギノレス'オリザェ (Aspergillus oryzae)、ベアウベリア'バシァ ナ (Beauvena bassiana)ゝベニンリウム'スヒメ口サム (Penicillium spinulosum)、ノカノレア ィァ'ァステロイテス (Nocardia asteroides)、ノカノレティア'グロべノレラ (Nocardia globeru la)、ゴルド-ァ 'ブロンキアリス (Gordonia bronchialis)、ゴルド-ァ 'スプチ (Gordonia sp uti)、ゴルド-ァ 'ルブリパーチンクタ (Gordonia rubripertincta)、ロドコッカス'スピーシ ーズ (Rhodococcus sp.)、ロドコッカス ·ロドクロウス (Rhodococcus rhodochrous)、ロドコ ッカス ·エリス口ポリス (Rhodococcus erythropolis),リノクラディエラ ·エリシィ (Rhinocladi ella ellisii),リノクラディエラ'アトロビレンス (Rhinocladiella atrovirens)、ラミクロリディウ ム 'アンセプス (Ramichloridium anceps)、及びボルフイロパクター 'サンギネウス (Porph yrobacter sanguineus)などを例示することができる力 これらに限定されることはな！/、。
[0017] 上記の方法の好ましい一態様として、上記一般式 (II)で表される化合物において *
*で表される炭素原子が R配置である化合物のエステル基を加水分解して上記一般 式 (I)で表される化合物にお 、て *で表される炭素原子力 ¾配置である化合物を分離 精製する工程を含む方法を挙げることができる。この態様においては、微生物として 例えば下記の属：
レイフソニァ属、シリンド口カーボン属、バーチシリウム属、マイコバクテリウム属、ロド コッカス属、ェクソフィアラ属、及びリノクラディエラ属に属する微生物を用いることが できる。これら属に属する微生物としては、より具体的には、下記の微生物を例示す ることができるが、これらに限定されることはない。レイフソ-ァ ·アクアチカ、シリンド口 カーボン'スピーシーズ、バーチシリウム'レプトバクテリム、マイコバクテリゥム 'スメグ マチス、マイコバクテリゥム 'フレイ、マイコバクテリゥム 'バカェ、ロドコッカス 'ェクイ、口 ドコッカス .ファシアンス、ロドコッカス'ラテイスラビエンシス、ェクソフィアラ 'ジーンセ ルメイ、ェクソフィアラ 'デルマチチジス、リノクラディエラ'エリシィ、及びリノクラディェ ラ 'アトロビレンス。
[0018] また、上記の方法の別の好ましい態様として、上記一般式 (II)で表される化合物に お 、て * *で表される炭素原子が S配置である化合物のエステル基を加水分解して 上記一般式 (I)で表される化合物にお 、て *で表される炭素原子が S配置である化合 物を得る工程を含む方法を挙げることができる。この態様においては、微生物として 例えば下記の属：ロドトルラ属、バシルス属、ブレブンディモナス属、シユードモナス 属、リゾピウム属、ァスペルギルス属、ベアウベリア属、ぺニシリウム属、ノカルディア 属、ゴルド-ァ属、ロドコッカス属、ラミクロリディウム属、及びボルフイロパクター属に 属する微生物を用いることができる。これらの属に属する微生物としては、より具体的 には、下記の微生物を例示することができる力 これらに限定されることはない。ロドト ルラ 'アウランチア力、バシルス 'セレウス、バシルス 'フジフオルミス、ブレブンディモ ナス'ディミヌタ、シユードモナス 'ァエノレギノサ、リゾビゥム 'ラジオパクター、ァスペル ギルス'オクラセウス、ァスペルギルス'オリザェ、ベアウベリア'バシアナ、ぺ-シリウ ム'スピヌ口サム、ノカルディア'ァステロイデス、ノカルディア 'グロべルラ、ゴルド-ア- ブロンキアリス、ゴルドニァ.スプチ、ゴルドニァ 'ルブリパーチンクタ、ロドコッカス .ス ピーシース、、ロドコッカス.ロドクロウス、ロドコッカス.エリス口ポリス、ラミクロリディゥム' アンセブス、及びポルフィロバクタ^ ~ ·サンギネウス。
[0019] 別の観点力も提供される本発明の方法は、上記一般式 (III)で表わされる化合物の 製造方法であって、上記一般式 (II)で表わされる化合物を下記の属に属する微生物 の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理して一般式 (II)で 表される化合物において * *で表される炭素原子が S配置又は R配置である化合物 のエステル基を加水分解し、反応液中に残留した光学的に純粋な未反応エステル 化合物を単離する工程を含むことを特徴としている。この方法においても、下記の属 ：レイフソニァ属、シリンド口カーボン属、バーチシリウム属、マイコバクテリウム属、ロド コッカス属、ェクソフィアラ属、ロドトルラ属、バシルス属、ブレブンディモナス属、シュ ードモナス属、リゾピウム属、ァスペルギルス属、ベアウベリア属、ぺニシリウム属、ノ カルディア属、ゴルドニァ属、リノクラディエラ属、ラミクロリディウム属、及びボルフイロ ノ クター属に属する微生物を用いることができる。
[0020] この方法の好まし ヽー態様として、一般式 (II)で表される化合物にお 、て * *で表 される炭素原子力 ¾配置である化合物のエステル基を加水分解する工程を含む。こ の好ましい態様においては、下記の属：レイフソ-ァ属、シリンド口カーボン属、バー チシリウム属、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属、ェクソフィアラ属、及びリノクラデ イエラ属に属する微生物を用いることができる。これらの属に属する微生物としては、 より具体的には、下記の微生物を例示することができる力 これらに限定されることは ない。レイフソ-ァ 'アクアチカ、シリンド口カーボン'スピーシーズ、バーチシリウム 'レ プトバクテリム、マイコバクテリゥム 'スメグマチス、マイコバクテリゥム 'フレイ、マイコバ クテリゥム 'ノカェ、ロドコッカス'ェクイ、ロドコッカス'ファシアンス、ロドコッカス'ラティ スラビエンシス、ェクソフィアラ 'ジーンセルメイ、ェクソフィアラ 'デルマチチジス、リノク ラディエラ ·エリシィ、及びリノクラディエラ ·アトロビレンス。
[0021] また、この方法の好まし 、態様では、一般式 (II)で表される化合物にぉ 、て * *で 表される炭素原子が S配置である化合物のエステル基を加水分解する工程を含む。 この好ましい態様においては、下記の属：ロドトルラ属、バシルス属、ブレブンディモ ナス属、シユードモナス属、リゾピウム属、ァスペルギルス属、ベアウベリア属、ぺ-シ リウム属、ノカルディア属、ゴルド-ァ属、ロドコッカス属、ラミクロリディウム属、及びポ ルフイロパクター属に属する微生物を用いることができる。これらの属に属する微生物 としては、より具体的には、下記の微生物を例示することができるが、これらに限定さ れることはない。ロドトルラ 'アウランチア力、バシルス 'セレウス、バシルス 'フジフオル ミス、ブレブンディモナス'デイミヌタ、シユードモナス 'ァェノレギノサ、リゾビゥム 'ラジオ パクター、ァスペルギルス'オクラセウス、ァスペルギルス'オリザェ、ベアウベリア.バ シアナ、ぺ-シリウム'スピヌ口サム、ノカルディア'ァステロイデス、ノカルディア 'グロ ベルラ、ゴルドニァ.ブロンキアリス、ゴルドニァ.スプチ、ゴルドニァ.ルブリパーチンク タ、ロドコッカス'スピーシーズ、ロドコッカス.ロドクロウス、ロドコッカス.エリス口ポリス、 ラミクロリディウム .アンセブス、及びポルフィロバクタ一'サンギネウス。
[0022] もっとも、上記の微生物は例示のために示したものであり、同じ属に属する 2種類の 微生物株において、上記の加水分解反応において逆の立体選択性を示す場合があ る。当業者は、本明細書の実施例に具体的に示された方法に従って、加水分解の結 果物である一般式 (I)で表される化合物が所望の立体配置を有する力否力 あるいは 所望の立体配置とは逆の立体配置を有するか否かを容易に確認することができ、用 Vヽた微生物株がどちらの立体選択性を有する微生物であるかを容易に特定できる。 後者の立体選択性を示す微生物を用いた場合には、上記に説明したとおり、反応液 中から未反応の原料化合物を分離，精製して、加水分解反応を行うことにより、所望 の立体配置を有する一般式 (I)の化合物を得ることができる。また、このような選択性を 示す微生物を用いることによって、一般式 (III)で表されるエステルイ匕合物力も所望の 立体配置とは逆の立体配置を有するエステルのみを立体選択的に加水分解し、反 応液中から未反応の原料化合物を分離'精製して、さらに加水分解反応を行うこと〖こ より、所望の立体配置を有する一般式 (III)のエステルイ匕合物を得ることができる。
[0023] 所望の立体配置とは反対の立体配置を有する一般式 (I)の化合物をエステルイ匕し た
化合物、あるいは所望の立体配置とは反対の立体配置を有する一般式 (III)の化合 物は、通常の方法によって光学的に純粋ではない一般式 (III)の化合物に変換する ことができる。例えば、溶液中で強塩基性物質の存在化で加熱することによってラセ ミ化させることが可能である。このようにして得られる光学的に純粋ではな 、一般式 (II I)の化合物を前述と同様の微生物反応に付することにより、所望の立体配置とは反 対の立体配置を有する化合物を廃棄することなく再利用することができる。
[0024] 本発明の方法で使用される上記の微生物は、野生株、変異株、または細胞融合等 の細胞工学的手法若しくは DNAクローニング、遺伝子操作等の遺伝子工学的手法 により誘導される組換え株などのいずれであってもよい。これらの微生物は、種々の 微生物保存機関より入手することができる。例えば、東京大学応用微生物研究所 OA M)、独立行政法人製品評価技術基盤機構 (NBRC) (旧名称:財団法人発酵研究所 (I FO) )、独立行政法人理ィ匕学研究所 0CM)など力 入手することができる。
[0025] 本発明の方法では、上記の微生物の菌体を用いることができる。菌体としては、上 記微生物を培養液より収穫した菌体、あるいは培養液より集菌して洗浄した菌体、乾 燥又はアセトンパウダー処理した菌体などを挙げることができ、これらの 、ずれの菌 体も好適に使用できる。また、菌体を適宜の手段で固定ィ匕して用いることもできる。固 定化は、当業者に周知の方法 (例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法等)で行うこ とができる。固定ィ匕担体としては、一般に用いられているものであれば何れでもよぐ 例えば、セルロース、ァガロース、デキストラン、 κ一力ラギーナン、アルギン酸、ゼラ チン、酢酸セルロース等の多糖類;例えば、ダルテン等の天然高分子;例えば、活性 炭、ガラス、白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ヒドロキシァパタイ ト、リン酸カルシウム等の無機物；例えば、ポリアクリルアミド、ポリビュルアセテート、ポ リプロピレングリコール、ウレタン等の合成吸着剤等が挙げられる。菌体はマイクロ力 プセルに封入した形で使用することもできる。菌体の使用態様は上記のものに限定さ れることはなく、当業者が当業界で利用可能な方法力 適宜選択して使用できること は言うまでもない。
[0026] 本発明の方法では、上記の微生物の培養物を用いてもよい。培養物としては、上 記微生物を適当な培地で培養したものを挙げることができる。また、本発明の方法で は、上記の微生物の処理物又は抽出物を用いることもできる。処理物としては、菌体 又は培養物を必要に応じて緩衝液に懸濁させて自己消化した消化物、菌体又は培 養物を乳鉢、ダイノミル、フレンチプレス、超音波、ホモジナイザー等の物理的方法で 破砕した破砕物、ある!/、は菌体又は培養物をリゾチーム等の酵素的方法を組み合わ せて破砕した破砕物などを挙げることができる。また、抽出物としては、菌体若しくは 培養物又はそれらの処理物から、水もしくは適当な緩衝液で抽出した抽出液のほか 、該抽出液から硫安により塩析させて得られる沈殿物、該抽出物のアルコール等によ る沈殿物、及び該抽出液又は該沈殿物をセフアデックス等によるゲルろ過、ブチル基 、ォクチル基、フエニル基等の疎水性基を持つ担体等を用いた疎水クロマトグラフィ 一、ジェチルアミノエチル基又はカルボキシルメチル基を持つ担体等を用いたイオン 交換クロマトグラフィー、色素ゲルクロマトグラフィー、電気泳動、透析、限外ろ過、ァ フィ-ティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により精製したものを挙げ ることもでき、例えば酵素を含む抽出物などが挙げられる。本明細書において用いら れる「抽出物」の用語は、酵素溶液、単離及び Z又は精製された酵素などを含めて 最も広義に解釈する必要がある。酵素としては、具体的にはリパーゼ、 α -アミラーゼ 、アシラーゼなどが好適に用いられる。これらの酵素としては上記の微生物由来の精 製酵素 (例えば市販の酵素）を使用してもよ ヽ。
[0027] 上記の微生物の培養における諸条件は特に制限されず、微生物の培養に適した 通常の培養条件を適宜選択できる。培地の種類も特に限定されず、細菌、真菌、又 は酵母それぞれに適した培地を適宜選択することができる。培地としては、通常は、 炭素源、窒素源、及びその他の栄養素を含む液体培地を使用することができる。培 地の炭素源は、上記微生物が利用可能であればその種類は特に限定されず、任意 の炭素源を用いることができる。より具体的には、炭素源として資化性のものが挙げら れ、例えば、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デンプン、ソルビト ールなどの糖類、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマル 酸、クェン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びその塩類、パラフィンなどの炭 化水素類、糖蜜、又はこれらの混合物などが使用できる。
[0028] 窒素源は、上記微生物が利用可能であればその種類は特に限定されず、任意の 窒素源を用いることができる。具体的には、資化性のものが挙げられ、例えば、塩ィ匕 アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、硝酸アンモ-ゥム、リン酸アンモ-ゥムなどの無機 酸のアンモニゥム塩、フマル酸アンモニゥム、クェン酸アンモニゥムなどの有機酸のァ ンモ -ゥム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、肉エキス、酵母エキス、麦 芽エキス、ペプトン、コーンスティープリカ一、大豆タンパク加水分解物などの無機ま たは有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物などが使用できる。また、培地には 、リン酸カリウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸マンガン等の無機物、微量金属塩、ビタミ ン類などの通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。必要に応じて、培 地には微生物の活性を誘導する物質、培地の pH保持に有効な緩衝物質、消泡剤、 シリコン、アデ力ノール、プル口ニックなどを添カ卩してもよい。
[0029] 微生物の培養は、それぞれの微生物の生育に適した条件下で行うことができ、その ような条件は当業者に適宜選択可能である。一例を挙げれば、培地の pHを 3〜10、 好ましくは 4〜9とし、温度 0〜50°C、好ましくは 20〜40°Cで培養を行うことができる。微 生物の培養は、それぞれの微生物の性質に応じて好気的又は嫌気的条件下で行う ことができる。培養時間は、 1〜300時間、好ましくは、 10〜150時間である力 それぞ れの微生物により適宜決定することができる。
[0030] 本発明の方法において、一般式 (II)で表される化合物を上記の微生物の菌体若しく は培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する条件は特に限定されず、 上記の化合物が菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物と十分に 接触でき、その結果、エステル部位の加水分解反応が進行する条件であれば、いか なる条件を選択することもできる。例えば、一般式 (II)で表される化合物の溶液に、緩 衝液又は水などで洗浄した菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出 物を混合すればよい。上記の工程は、水性の均一系中で行うか、あるいは水に実質 的に不溶性又は水に難溶性の有機溶媒と水との二相系中で行うことができるが、一 般的には水性の均一系中で行うことが好ましい。水性の均一系を形成する溶媒とし ては、水のみを溶媒として用いる力、あるいは水と混和する適当な有機溶媒、例えば 、エタノール、メタノール、ジォキサン、ジメチルスルホキシド等と水との混合物を用い てもよい。一般式 (Π)で表される化合物を上記の有機溶媒に溶解し、得られた溶液を 上記の微生物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物を含む水 溶液又は水中懸濁液に添加して用いてもょ 、。
[0031] また、該微生物及び抽出物としては、菌体又は培養物を必要に応じて熱処理した もの、あるいは該熱処理物にさらに 1又は 2以上の適宜の処理を施したものなどであ つてよい。熱処理は当該分野で利用可能な任意の方法で行うことができ、熱処理条 件は目的に合わせて実験などにより適宜決定することができる。熱処理の温度として は、例えば約 37°C以上の温度が挙げられる力 好ましくは約 40〜70°C、より好ましく は約 45〜60°Cである。熱処理の時間は処理温度に応じて適宜選択できる力 例えば 、約 5分間〜約 24時間、好ましくは約 30分間〜 10時間、より好ましくは約 1〜5時間で ある。代表的な熱処理は、例えば約 45°C、約 50°C、又は約 55°C程度の温度で約 2〜4 時問処理する工程を含むが、より好ましくは約 45〜55°Cで約 3時間程度処理するェ 程を含む。熱処理された菌体又は培養物を使用することにより、選択性や転換率な どを含めて良好な結果を得ることができる場合がある。
[0032] 処理条件は、エステルの不斉加水分解反応が進行する条件であれば特に限定さ れない。乾燥菌体としての菌体の使用量、又は抽出物などを用いる場合の使用加量 は特に限定されないが、例えば、一般式 (II)で表される化合物に対して 100分の 1〜10 00倍、好ましくは 10分の 1〜100倍程度である。また、基質である一般式 (II)で表される 化合物の濃度は、反応系の全重量に対して 0.01〜20重量％、好ましくは、 0.1〜10重 量％である。さらに、反応液の pHは、 4〜9、好ましくは 5〜8であり、反応温度は、 10〜5 0°C、好ましくは 20〜40°Cである。 pHを安定させるために緩衝液を使用することもでき る。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液などを用いることができ る。さらに、 pHを調節するために、酸、塩基を使用して調節することもできる。また、反 応時間は、 1〜200時間、好ましくは 5〜150時間である力 それぞれの微生物により適 宜選択することが可能である。反応系内には、必要に応じて、基質及び Z又は微生 物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物を一度に添加するか 、又は逐次添加するか、若しくは連続的に添加することもできる。生成物である加水 分解物を連続的に取り出しながら反応速度を高めることもできる。
[0033] 反応によって得られた一般式 (I)で表される光学活性 α—ヒドロキシカルボン酸又は 一般式 (III)で表される光学活性 α—ヒドロキシカルボン酸エステルは、慣用の分離精 製手段によって単離精製できる。例えば、反応液から必要に応じて菌体を分離した 後、培養物を膜分離、有機溶媒 (例えば、トルエン、クロ口ホルム等）による抽出、カラ ムクロマトグラフィー、減圧濃縮、蒸留、晶析、再結晶等の通常の精製方法により精 製して一般式 (I)で表される光学活性 aーヒドロキシカルボン酸又は一般式 (III)で表さ れる光学活性 α—ヒドロキシカルボン酸エステルを得ることができる。また、例えば、 反応終了後、酢酸プチル、酢酸ェチル、トルエン、クロ口ホルム等の有機溶媒で反応 液から生成物を抽出し、溶媒を留去することにより粗生成物を得ることができ、該粗生 成物は、必要によりシリカゲルクロマトグラフィー、再結晶（η-へキサン、酢酸ェチル等 )、減圧蒸留等により精製することができる。
[0034] また、不斉加水分解反応を行うことにより、反応液中には、一般式 (I)で表される光 学活性 α—ヒドロキシカルボン酸のほ力 加水分解されずに反応液中に残存した光 学的に純粋な未反応のエステル化合物（光学活性 aーヒドロキシカルボン酸エステ ル）が存在する。この光学活性 α—ヒドロキシカルボン酸エステルを分離精製した後 にエステル基を加水分解することにより、一般式 (I)で表される光学活性 α—ヒドロキ シカルボン酸を製造することができる。加水分解に使用する酸又は塩基としては、通 常の反応において酸又は塩基として使用されるものであれば特に制限はないが、例 えば、塩酸、硫酸などの鉱酸類、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、炭酸ナトリウム、 炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、水素化ナトリウム、水素化リチウム、又はアンモ- ァ水等の塩基が挙げられ、好ましくは水酸ィ匕ナトリウム又は水酸ィ匕カリウムなどを用い ることができる。塩基による加水分解の際には、一般式 (I)で表される化合物の立体反 転が生じな 、ように適宜の条件を選択することが望ま U、。加水分解のための反応溶 媒としては、反応の進行を妨げず、原料を十分に溶解できる溶媒であれば特に制限 はないが、例えば、アルコール類 (メタノール、エタノール等）、ジメチルホルムアミド (D MF)、ジメチルァセトアミド（DMAc)、ジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサ ン、水、アセトン、又はこれらの混合物などを挙げることができ、好ましくはアルコール 類、水、又はこれらの混合物を用いることができる。反応温度は、通常は— 20〜150 °Cであり、好ましくは 10〜30°Cである。反応時間は、使用する原料、溶媒、反応温度 などにより異なる力 通常 5分〜 36時間であり、好ましくは 10分〜 16時間である。
基質は安価に供給される光学的に純粋でない α—ヒドロキシカルボン酸とアルコー ルカ 通常の方法によって製造できる。
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの 実施例により限定されるものではない。
実施例 1
ェクソフィアラ 'デルマチチジス NBRC 8193をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又はろ過によつ て菌体を得た。この菌体に適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH 6.5)50 レラセミ体の 2 -クロロマンデル酸メチルエステル 10 mg (20%エタノール溶液 50 μ L)を加え、混合し て 1 mLの反応液として 30°C、 20時間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分 離又は濾過し、上清を HPLC分析 (GLサイエンス Inertsil ODS-3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液： ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1. 0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、 2-クロロマンデル酸が 1.92 mg /mL生成して 、ることを確認した。生成物の光学純度を確認するためサンプルを HPL C分析 (GEL PACKED COLUMN CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm 、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%、ァセトニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 2
4
54 nm)に付した。その結果、生成物は (R)-2_クロロマンデル酸であることが確認でき 上記微生物を表 1に示した微生物に換えて上記と同様に反応を行い、表に示した 結果を得た。
[0036] [表 1]
CI OH CI OH o O
(式中、 Meはメチル基を示す。 以下同様である。）
Figure imgf000019_0001
[0037] 実施例 2
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC 13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によって菌 体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 2-クロロマ ンデル酸メチルエステル 10 mg (20%エタノール溶液 50 μ L)をカ卩え、混合して 1 mLの 反応液として 30°C、 20時間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾 過し、上清を HPLC分析 (GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離 液： ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分 、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、 2-クロロマンデル酸が 1.71 mg/mL生成 して ヽることを確認した。生成物の光学純度を確認するためサンプルを HPLC分析 (G EL PACKED COLUMN CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%、ァセトニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に
4
付した。その結果、生成物は (S)-2-クロロマンデル酸であることが確認できた。 上記微生物を表 2に示した微生物に換えて上記と同様に反応を行い、表に示した 結果を得た。
[表 2]
Figure imgf000020_0001
菌名 菌 No. 生成量 絶対配置 光学純度 属 種 機関 No. (mg/mし) (% e.e.) ロドトルラ ァウランチア力 NBRC 0951 0.93 S 60.0 バシルス セレウス NBRC 13690 1 .50 s 99.2 バシルス セレウス NBRC 15305 0.94 s 100.0 パ'シルス セレウス NBRC 3514 1 .1 9 s 100.0 パ'シゾレス フジフオルミス NBRC 3528** 0.99 s 100.0 ブレブンディモナス ディミヌタ NBRC 1421 3 2.35 s 65.0 プレブンディモナス ディミヌタ NBRC 12697 1 .46 s 65.9 プレブンディモナス ディミヌタ JCM 2789 2.05 s 60.0 シユードモナス ァエルギノサ NBRC 391 8 1 .37 s 63.1 リゾビゥム ラジ才ノ《クタ一 NBRC 13263 5.37 s 94.9 ァスペルギルス オクラセウス JCM 1 958 0.30 s 100.0 ァスペルギルス オリザェ IA 2630 0.33 s 100.0 ベアウベリア バシアナ NBRC 4848 0.64 s 100.0 ぺニシリウム スピヌ口サム IAM 7047 0.27 s 100.0 ノカルディア ァステロイデス NBRC 3384 0.31 s 100.0 ノカルディア ァステロイデス NBRC 3424 0.51 s 100.0 ノカルディア グロべルラ NBRC 13510 0.37 s 100.0 ゴルドニァ ブロンキアリス JCM 31 98 0.32 s 1 00.0 ゴルドニァ スプチ JCM 6047 0.30 s 1 00.0 ロドコッカス エリス口ポリス JCM 6826 1.18 s 63.8 ゴルドニァ ルブリパーチンクタ JCM 31 99 0.58 s 63.0 ロドコッカス スピーシーズ NBRC 13162 0.49 s 100.0 ゴルドニァ スプチ JCM 3228 0.30 s 100.0 ロドコッカス ロドクロウス ATCC 12674 2.1 3 s 68.9 ロドコッカス エリス口ポリス IAM 141 4 0.35 s 100.0 ラミクロリディウム アンセプス NBRC 9448 0.87 s 100 ポルフィロバクタ一 サンギネウス NBRC 15763 0.65 s 64 [0039] 実施例 3
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC 13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によって菌 体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 2-クロロマ ンデル酸メチルエステル 10 mg (20%エタノール溶液 50 L)をカ卩え、混合して lmLの反 応液として 30°C、 72時間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過 し、上清を HPLC分析 (GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液 ：ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検 出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、未反応の 2-クロロマンデル酸メチルエステ ル 5.04 mg/mLが残存していることを確認した。残存物の光学純度を確認するため、 サンプルを HPLC分析 (CHIRALCEL OJ DAICEL社製、径 4.6 mm、長さ 250 mm、溶 離液: n- Hexane/ IPA = 9/ 1、流速 1.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。そ の結果、生成物が (R)- 2-クロロマンデル酸メチルエステルであることが確認できた。 上記微生物を表 3に示した微生物に換えて上記と同様に反応を行い、表に示した 結果を得た。
[0040] [表 3]
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
[0041] 実施例 4
ェクソフィアラ 'デルマチチジス NBRC 8193をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によつ て菌体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 2-クロ ロマンデル酸メチルエステル 10 mg (20%エタノール溶液 50 μ L)をカ卩え、混合して lmL の反応液として 30°C、 72時間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は 濾過し、上清を HPLC分析 (GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶 離液：ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分 、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、未反応の 2-クロロマンデル酸メチルェ ステルカ .27 mg/mLが残存していることを確認した。残存物の光学純度を確認する ためサンプルを HPLC分析 (CHIRALCEL OJ DAICEL社製、径 4.6 mm、長さ 250 mm 、溶離液: n- Hexane/ IPA = 9/ 1、流速 1.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した 。その結果、生成物は (S)- 2-クロロマンデル酸メチルエステルであることが確認できた 上記微生物を表 4に示した微生物に換えて上記と同様に反応を行い、表に示した 結果を得た。
[0042] [表 4]
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0002
[0043] 実施例 5— 1
ェクソフィアラ 'デルマチチジス NBRC 8193をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によつ て菌体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 4_クロ ロマンデル酸メチルエステル 10 mgを加え、混合して 1 mLの反応液として 30°C、 20時 間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC分析（ GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液：ァセトニトリル 25%、 0. 05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に 付した。その結果、 4-クロロマンデル酸が 2.25 mg/mL生成していることを確認した。 生成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COLUM N CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%、ァ セトニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、生成 物は (R)-4-クロロマンデル酸であることが判明した。
[0044] [表 5]
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0003
[0045] 実施例 5— 2
ェクソフィアラ 'デルマチチジス NBRC 8193をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によつ て菌体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 /z L、ラセミ体の 4-トリ フルォロメチルマンデル酸メチルエステル 10 mgをカ卩え、混合して 1 mLの反応液とし て 30°C、 20時間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清 を HPLC分析 (GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液：ァセト 二トリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、 4-トリフルォロメチルマンデル酸が 2.62 mg/mL生成 していることを確認した。生成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析（ GEL PACKED COLUMN CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液 : 0.2 mM CuSO 85%、ァセトニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に
4
付した。その結果、生成物は (R)-4-トリフルォロメチル-クロロマンデル酸であることが 判明した。
[0046] [表 6]
Figure imgf000023_0002
菌名 菌 No. 生成量 対 C置 光学純度 属 種 機関 No. (mg/mし) (% e.e.) ェクソフィアラ デルマチチジス NBRC 8193 2.62 R 53.2 [0047] 実施例 5— 3
ェクソフィアラ 'デルマチチジス NBRC 8193をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地 5mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によつ て菌体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 /z L、ラセミ体の 4-メト キシマンデル酸メチルエステル 10 mgをカ卩え、混合して 1 mlの反応液として 30°C、 20 時間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC分 析 (GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液：ァセトニトリル 25% 、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm) に付した。その結果、 4-メトキシマンデル酸が 2.01 mg/mL生成していることを確認し た。生成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COL UMN CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%
4
、ァセトニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、 生成物は (R)-4-メトキシ-マンデル酸であることが確認できた。
上記菌株を表 7に示した微生物に換えて上記と同様に反応を行い、表に示した結 果を得た。
[0048] [表 7]
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
[0049] 実施例 5— 4
ェクソフィアラ 'デルマチチジス NBRC 8193をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によつ て菌体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 2-クロ ロマンデル酸ェチルエステル 10mgを加え、混合して 1 mlの反応液として 30°C、 20時 間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC分析（ GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液： ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm) に付した。その結果、 2-クロロマンデル酸が 2.03 mg/mL生成していることを確認した 。生成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COLU MN CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%、
4 ァセトニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、生 成物は (R)- 2-クロロマンデル酸であることが確認できた。
[0050] [表 8]
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
[0051] 実施例 5— 5
ェクソフィアラ 'デルマチチジス NBRC 8193をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によつ て菌体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 2-クロ ロマンデル酸イソプロピルエステル 10 mgをカ卩え、混合して 1 mlの反応液として 30°C、 20時間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC 分析 (GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液： ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、 2-クロロマンデル酸が 1.53 mg/mL生成していることを確認し た。生成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COL UMN CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%
4
、ァセトニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、 生成物は (R)- 2-クロロマンデル酸であることが確認できた。
上記菌株を表 9に示した微生物に換えて上記と同様に反応を行い、表に示した結 果を得た。
[0052] [表 9]
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0003
[0053] 実施例 5— 6
ェクソフィアラ 'デルマチチジス NBRC 8193をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によつ て菌体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 2-クロ ロマンデル酸べンジルエステル 10 mgをカ卩え、混合して 1 mlの反応液として 30°C、 20 時間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC分 析 (GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液： ァセトニトリル 25 %、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 n m)に付した。その結果、 2-クロロマンデル酸が 1.42 mg/mL生成していることを確認し た。生成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COL UMN CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%
4
、ァセトニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、 生成物は (R)- 2-クロロマンデル酸であることが確認できた。
上記菌株を表 10に示した微生物に換えて上記と同様に反応を行い、表 10に示し た結果を得た。
[0054] [表 10]
Figure imgf000026_0002
菌名 菌 No. 生成量 絶対配置 光学純度 属 種 機関 No. (mg/ mしノ (% e.e.) ェクソフィアラ デルマチチジス NBRC 81 93 1.42 R 83.8 シリンドロカーポン スピーシーズ NBRC 31 855 0.53 54.1 [0055] 実施例 5— 7
ェクソフィアラ 'ジーンセルメイ NBRC 6857をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地で 25°C、 3日間振とう培養した。培養後、培養液 0.28 mLを遠 心分離して菌体を得た。これに適当量の水、 0.5M- MESバッファ (ρΗ6.5)100 L、ラセ ミ体のアト口乳酸メチルエステル 5 mgを加え、混合して 0.5 mLの反応液として 30°C、 3 0分振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC分析 (Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液 ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸 ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254nm)に付した。その 結果、アト口乳酸が 0.11 mg/mL生成していることを確認した。生成物の光学純度を確 認するため、サンプルを HPLC分析（GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI社製、 径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液 0.2 mM CuSO 90%、ァセトニトリル 10%、流速 2.0 mL
4
/分、検出波長 UV 254應）に付した。その結果、生成物は (R)-アト口乳酸であること が確認できた。光学純度は 100%eeであった。
[化 4]
Figure imgf000027_0001
(R) -アト口乳酸
[0056] 実施例 5— 8
ェクソフィアラ 'ジーンセルメイ NBRC 6857をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 3日間振とう培養した。培養液 0.28 mLを遠心分 離して菌体を得た。これに適当量の水、 1M- MESバッファ (ρΗ6.5)100 L、ラセミ体の 4-フルォロマンデル酸メチルエステル 5 mgをカ卩え、混合して 0.5 mLの反応液として 30 °C、 30分間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離し、上清を HPLC分析 (I nertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液 ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナト リウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV254 nm)に付した。その結 果、 4-フルォロマンデル酸が 0.19 mg/mL生成していることを確認した。生成物の光 学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析（GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液 2mM CuSO 90%、ァセトニトリル 10%、流速 1.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、生成物は (R)- 4-フルォロマ ンデル酸であることが確認できた。光学純度は 77%eeであった。
[化 5]
Figure imgf000028_0001
(R) -4-フルォロマンデル酸
実施例 5— 9
ェクソフィアラ 'ジーンセルメイ NBRC 6857をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イースト エキス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 3日間振とう培養した。培養液 0.28 mLの遠心分 離によって菌体を得た。これに適当量の水、 0.5M- MESバッファ (ρΗ6.5)100 L、 3-ク ロロマンデル酸メチルエステル 5 mgをカ卩え、混合して 0.5 mLの反応液として 30°C、 30 分間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離し、上清を HPLC分析 (Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液 ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム 緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、 3 -クロロマンデル酸が 0.094 mg/mL生成していることを確認した。生成物の光学純度 を確認するため、サンプルを HPLC分析（GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI社 製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液 0.2 mM CuSO 90%、ァセトニトリル 10%、流速 1.0
4
mL /分、検出波長 UV 254應）に付した。その結果、生成物は (R)- 3-クロロマンデル 酸であることが確認できた。光学純度は 67.7%eeであった。
[化 6]
Figure imgf000028_0002
(R) -3-クロロマンデル酸
実施例 6—1
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC 13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によって菌 体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 4-クロロマ ンデル酸メチルエステル 10 mgを加え、混合して 1 mlの反応液として 30°C、 20時間振 とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC分析 (GLサ ィエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液： ァセトニトリル 25%、 0.05 Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付 した。その結果、 4-クロロマンデル酸が 1.46 mg/mL生成していることを確認した。生 成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COLUMN CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%、ァセ
4 トニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、生成物 は (S)-4-クロロマンデル酸であることが確認できた。
[0059] [表 11]
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
[0060] 実施例 6— 2
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC 13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によって菌 体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 4_トリフル ォロメチルマンデル酸メチルエステル 10 mgをカ卩え、混合して 1 mlの反応液として 30 °C、 20時間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HP LC分析 (GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6mm、長さ 75mm、溶離液： ァセトニトリ ル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 2 54 nm)に付した。その結果、 4-トリフルォロメチルマンデル酸が 1.21 mg/mL生成して いることを確認した。生成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COLUMN CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%、ァセトニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付し
4
た。その結果、生成物は (S)-4-トリフルォロメチルマンデル酸であることが確認できた [0061] [表 12]
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0003
[0062] 実施例 6— 3
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC 13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によって菌 体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 /z L、ラセミ体の 4-メトキシ マンデル酸メチルエステル 10 mgを加え、混合して 1 mlの反応液として 30°C、 20時間 振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC分析 (GL サイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液：ァセトニトリル 25%、 0.05 Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付 した。その結果、 4-メトキシマンデル酸が 1.08 mg/mL生成していることを確認した。生 成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COLUMN CRS10W、三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%、ァセ
4 トニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、生成物 は (S)-4-メトキシマンデル酸であることが確認できた。
[0063] [表 13]
Figure imgf000030_0002
菌名 菌 No. 生成量 絶対酉己直 光学純度 属 種 機関 No. (mg/mし) (% e.e.) リゾビゥム ラジオパクター NBRC 1 3263 1 .08 S 43.1 [0064] 実施例 6— 4
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC 13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によって菌 体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 2-クロロマ ンデル酸ェチルエステル 10 mgを加え、混合して 1 mlの反応液として 30°C、 20時間振 とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC分析 (GLサ ィエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液：ァセトニトリル 25%、 0.05M リン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付した 。その結果、 2-クロロマンデル酸が 1.96 mg/mL生成していることを確認した。生成物 の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COLUMN CRS1 0W三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%、ァセトニトリ
4
ル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、生成物は (S)- 2-クロロマンデル酸であることが確認できた。
[0065] [表 14]
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0002
[0066] 実施例 6— 5
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC 13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によって菌 体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 2-クロロマ ンデル酸イソプロピルエステル 10 mgをカ卩え、混合して 1 mlの反応液として 30°C、 20時 間振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC分析（ GLサイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液： ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm) に付した。その結果、 2-クロロマンデル酸が 1.91 mg/mL生成していることを確認した 。生成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COLU MN CRS10W三菱化学社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%、
4 ァセトニトリル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、生 成物は (S)- 2-クロロマンデル酸であることが確認できた。
上記菌株を表 15に示した微生物に換えて上記と同様に反応を行!、、表に示した結 果を得た。
[0067] [表 15]
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0002
[0068] 実施例 6— 6
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC 13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地 5 mLで 25°C、 6日間振とう培養した。遠心分離又は濾過によって菌 体を得た。これに適当量の水、 1M- MES緩衝液 (pH6.5)50 L、ラセミ体の 2-クロロマ ンデル酸べンジルエステル 10 mgを加え、混合して 1 mlの反応液として 30°C、 20時間 振とう反応した。反応終了後、反応液を遠心分離又は濾過し、上清を HPLC分析 (GL サイエンス Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液： ァセトニトリル 25%、 0.0 5Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付 した。その結果、 2-クロロマンデル酸が 1.62 mg/mL生成していることを確認した。生 成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分析 (GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液： 0.2 mM CuSO 85%、ァセトニトリ
4
ル 15%、流速 2.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、生成物は (S)- 2-クロロマンデル酸であることが確認できた。
上記菌株を表 16に示した微生物に換えて上記と同様に反応を行!、、表に示した結 果を得た。 [0069] [表 16]
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0003
[0070] 実施例 6— 7
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地で 25°C、 3日間振とう培養した。培養後、培養液 9.1 mLより遠心分 離して菌体を得た。これに適当量の水、 0.5M- MESバッファ (ρΗ6.5)100 L、アト口乳 酸メチルエステル 5 mgを加え、混合して 0.5 mLの反応液として 30°C、 30分振とう反応 した。反応終了液を遠心分離し、上清を HPLC分析 (Inertsil ODS-3、径 4.6 mm,長さ 75 mm、溶離液 ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、アト口乳酸が 0.15 mg/mL生 成していることを確認した。生成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPLC分 析（GEL PACKED COLUMN CRS10W MCI社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離液 2 mM CuSO 90%、ァセトニトリル 10%、流速 1.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に付し
4
た。その結果、生成物は (S)_アト口乳酸であることが確認できた。光学純度は 55%eeで めつに。
[化 7]
Figure imgf000033_0002
(S) -アト口乳酸
実施例 6— 8
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地で 25°C、 3日間振とう培養した。培養後、培養液 9.1 mLより遠心分 離して菌体を得た。これに適当量の水、 0.5M- MESバッファ (ρΗ6.5)100 L、 4-フルォ ロマンデル酸メチルエステル 5 mgを加え、混合して 0.5 mLの反応液として 30°C、 30 分振とう反応した。反応終了液を遠心分離し、上清を HPLC分析 (Inertsil ODS-3、径 4.6 mm、長さ 75 mm、溶離液 ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75% 、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、 4-フルォロマ ンデル酸が 0.22 mg/mL生成していることを確認した。生成物の光学純度を確認する ため、サンプルを HPLC分析（GEL PACKED COLUMN CRSIOW MCI社製、径 4.6 m m、長さ 50 mm、溶離液 2 mM CuSO 90%、ァセトニトリル 10%、流速 1.0 mL /分、検出
4
波長 UV 254 nm)に付した。その結果、生成物は（S) _4_フルォロマンデル酸であるこ とが確認できた。光学純度は 100%eeであつた。
[化 8]
Figure imgf000034_0001
(S) -フルォロマンデル酸
実施例 6— 9
リゾビゥム 'ラジオパクター NBRC13263をグルコース 1%、ペプトン 0.5%、イーストェキ ス 0.3%を含む培地で 25°C、 3日間振とう培養した。培養後、培養液 9.1 mLより遠心分 離して菌体を得た。これに適当量の水、 0.5M- MESバッファ (ρΗ6.5)100 L、 3-クロ口 マンデル酸メチルエステル 5 mgを加え混合し 0.5 mLとし 30°C、 30分振とう反応した。 反応終了液を遠心分離し、上清を HPLC分析（Inertsil ODS- 3、径 4.6 mm、長さ 7 5m m、溶離液 ァセトニトリル 25%、 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液 75%、 pH2.5、流速 1.0 mL/分、検出波長 UV 254 nm)に付した。その結果、 3-クロロマンデル酸が 0.23 mg/ mL生成していることを確認した。生成物の光学純度を確認するため、サンプルを HPL C分析（GEL PACKED COLUMN CRSIOW MCI社製、径 4.6 mm、長さ 50 mm、溶離 液 2 mM CuSO 90%、ァセトニトリル 10%、流速 1.0 mL /分、検出波長 UV 254 nm)に
4
付した。その結果、生成物は (S) -3-クロロマンデル酸であることが確認できた。光学 純度は 76.9%eeであった。
[化 9]
Figure imgf000035_0001
(S) - 3-クロロマンデル酸
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、極めて高い光学純度を有する光学活性 aーヒドロキシカ ルボン酸又は光学活性 aーヒドロキシカルボン酸エステルを簡便かつ安価に製造す ることができるので、本発明の方法は光学活性 α—ヒドロキシカルボン酸又は光学活 性 α—ヒドロキシカルボン酸エステルの工業的製造に有用である。本発明の方法で 製造した光学活性 aーヒドロキシカルボン酸又はそのエステル誘導体を用いて多様 な生理活性ィ匕合物を製造することが可能である。

Claims

請求の範囲 [1] 下記の一般式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000036_0001
〔式中、 Aは 5員又は 6員の環状化合物の残基を示し、該環状化合物は芳香族化合 物、部分飽和環状化合物、又は飽和環状化合物から選択され、環構成原子として 1 個以上のへテロ原子を有していてもよぐ環上には置換基を有していてもよく（該置換 基はハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数 1〜4個のアルキル基、置換基 を有して!/、てもよ 、炭素数 1〜4個のアルキルォキシ基、及び保護基で保護されて ヽ てもよい水酸基、保護基で保護されていてもよいアミノ基、ニトロ基力もなる群力も選 ばれる 1又は 2個以上の置換基であり、 2個以上の置換基が存在する場合にはそれら は同一でも異なっていてもよぐ 2個以上の置換基が存在する場合にはそれらが結合 して環を形成してもよい）、 Xは水素原子又は炭素数 1〜4個のアルキル基を示し、 * は S又は Rの 、ずれかの立体配置を有する炭素原子を示す〕で表される化合物の製 造方法であって、下記の一般式 (II) :
[化 2]
Figure imgf000036_0002
〔式中、 A及び Xは上記定義と同義であり、 Rは炭素数 1〜4個のアルキル基 (該アル キル基はァリール基で置換されていてもよい）を示し、ただし、一般式 (II)で表される 化合物は * *で示される炭素原子にっ 、て光学的に純粋ではな 、〕で表される化合 物を下記の属：レイフソニァ属、シリンド口カーボン属、バーチシリウム属、マイコバク テリゥム属、ロドコッカス属、ェクソフィアラ属、ロドトルラ属、バシルス属、ブレブンディ モナス属、シユードモナス属、リゾピウム属、ァスペルギルス属、ベアウベリア属、ベニ シリウム属、ノカルディア属、ゴルド-ァ属、リノクラディエラ属、ラミクロリディウム属、 及びボルフイロパクター属に属する微生物力もなる群力も選ばれる微生物の菌体若 しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理する工程を含む方法。
[2] Aがクロロフヱ-ル基であり、 Rが炭素数 1〜4個のアルキル基又はべンジル基であり
、 Xが水素原子である請求項 1に記載の方法。
[3] Aが 0-クロロフヱ-ル基であり、 Rカ^チル基であり、 Xが水素原子である請求項 1に 記載の方法。
[4] 微生物がレイフソ-ァ 'アクアチカ、シリンド口カーボン 'スピーシーズ、バーチシリウム •レプトバクテリム、マイコバクテリゥム 'スメグマチス、マイコバクテリゥム 'フレイ、マイコ バクテリウム.ノカェ、ロドコッカス.ェクイ、ロドコッカス'ファシアンス、ロドコッカス .ラ テイスラビエンシス、ェクソフィアラ 'ジーンセルメイ、ェクソフィアラ 'デルマチチジス、 ロドトルラ 'アウランチア力、バシルス 'セレウス、バシルス 'フジフオルミス、ブレブンデ ィモナス'ディミヌタ、シユードモナス 'ァェノレギノサ、リゾビゥム 'ラジオパクター、ァス ペルギルス'オクラセウス、ァスペルギルス'オリザェ、ベアウベリア'バシアナ、ぺ-シ リウム'スピヌ口サム、ノカルディア'ァステロイデス、ノカルディア 'グロべルラ、ゴルド- ァ.ブロンキアリス、ゴルドニァ.スプチ、ゴルドニァ.ルブリパーチンクタ、ロドコッカス. スピーシーズ、ロドコッカス'ロドクロウス、ロドコッカス.エリス口ポリス、リノクラディエラ. エリシィ、リノクラディエラ'アトロビレンス、ラミクロリディウム 'アンセプス、及びポルフィ ロバクタ一 ·サンギネウスカもなる群力も選ばれる微生物である請求項 1な 、し 3の ヽ ずれか 1項に記載の方法。
[5] 一般式 (II)で表される化合物にお 、て * *で表される炭素原子が R配置である化合 物のエステル基を加水分解して一般式 (I)で表される化合物にぉ ヽて *で表される炭 素原子が R配置である化合物を得る工程を含み、微生物がレイフソ-ァ属、シリンド口 カーボン属、バーチシリウム属、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属、ェクソフィアラ 属、及びリノクラディエラ属に属する微生物力 なる群力 選ばれる微生物である請 求項 1な!、し 3の!、ずれか 1項に記載の方法。
[6] 微生物がレイフソ-ァ 'アクアチカ、シリンド口カーボン 'スピーシーズ、バーチシリウム •レプトバクテリム、マイコバクテリゥム 'スメグマチス、マイコバクテリゥム 'フレイ、マイコ バクテリウム.ノカェ、ロドコッカス.ェクイ、ロドコッカス'ファシアンス、ロドコッカス .ラ テイスラビエンシス、ェクソフィアラ 'ジーンセルメイ、ェクソフィアラ 'デルマチチジス、 リノクラディエラ'エリシィ、及びリノクラディエラ'アトロビレンス力もなる群力も選ばれる 微生物である請求項 5に記載の方法。
[7] 一般式 (II)で表される化合物において * *で表される炭素原子が S配置である化合 物のエステル基を加水分解して一般式 (I)で表される化合物にぉ ヽて *で表される炭 素原子が S配置である化合物を得る工程を含み、微生物がロドトルラ属、バシルス属 、ブレブンディモナス属、シユードモナス属、リゾピウム属、ァスペルギルス属、ベアゥ ベリア属、ぺニシリウム属、ノカルディア属、ゴルド-ァ属、ロドコッカス属、ラミクロリデ ィゥム属、及びボルフイロパクター属に属する微生物力もなる群力も選ばれる微生物 である請求項 1な 、し 3の 、ずれか 1項に記載の方法。
[8] 微生物がロドトルラ 'アウランチア力、バシルス 'セレウス、バシルス 'フジフオルミス、ブ レブンディモナス'デイミヌタ、シユードモナス 'ァエノレギノサ、リゾビゥム 'ラジオバクタ 一、ァスペルギルス'オクラセウス、ァスペルギルス'オリザェ、ベアウベリア'バシアナ 、ぺ-シリウム'スピヌ口サム、ノカルディア'ァステロイデス、ノカルディア 'グロべルラ、 ゴルドニァ.ブロンキアリス、ゴルドニァ.スプチ、ゴルドニァ 'ルブリパーチンクタ、ロド コッカス'スピーシーズ、ロドコッカス'ロドクロウス、ロドコッカス'エリス口ポリス、ラミクロ リディウム'アンセブス、及びポルフィロバクタ一 ·サンギネウスカもなる群力も選ばれる 微生物である請求項 7に記載の方法。
[9] 下記の一般式 (III) :
[化 3]
Figure imgf000038_0001
(式中、 A、 R、 X、及び *は上記定義と同義である）で表わされる化合物の製造方法 であって、上記一般式 (II) (式中、 A、 R、 X、及び * *は上記定義と同義である）で表 わされる化合物を下記の属：レイフソ-ァ属、シリンド口カーボン属、バーチシリウム属 、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属、ェクソフィアラ属、ロドトルラ属、バシルス属、 ブレブンディモナス属、シユードモナス属、リゾピウム属、ァスペルギルス属、ベアウベ リア属、ぺニシリウム属、ノカルディア属、ゴルドニァ属、リノクラディエラ属、ラミクロリ ディウム属、及びボルフイロパクター属に属する微生物力もなる群力も選ばれる微生 物の菌体若しくは培養物、又はその処理物若しくはその抽出物で処理して一般式 (II) で表される化合物において * *で表される炭素原子が S配置又は R配置である化合 物のエステル基を加水分解し、反応液中に残留した光学的に純粋な未反応エステ ル化合物を単離する工程を含む方法。
[10] Aがクロロフヱ-ル基であり、 Rが炭素数 1〜4個のアルキル基又はべンジル基であり 、 Xが水素原子である請求項 9に記載の方法。
[11] Aが 0-クロロフヱ-ル基であり、 R力メチル基であり、 Xが水素原子である請求項 9に 記載の方法。
[12] 微生物がレイフソ-ァ 'アクアチカ、シリンド口カーボン'スピーシーズ、バーチシリウム •レプトバクテリム、マイコバクテリゥム 'スメグマチス、マイコバクテリゥム 'フレイ、マイコ バクテリウム.ノカェ、ロドコッカス.ェクイ、ロドコッカス'ファシアンス、ロドコッカス .ラ テイスラビエンシス、ェクソフィアラ 'ジーンセルメイ、ェクソフィアラ 'デルマチチジス、 ロドトルラ 'アウランチア力、バシルス 'セレウス、バシルス 'フジフオルミス、ブレブンデ ィモナス'ディミヌタ、シユードモナス 'ァェノレギノサ、リゾビゥム 'ラジオパクター、ァス ペルギルス'オクラセウス、ァスペルギルス'オリザェ、ベアウベリア'バシアナ、ぺ-シ リウム'スピヌ口サム、ノカルディア'ァステロイデス、ノカルディア 'グロべルラ、ゴルド- ァ.ブロンキアリス、ゴルドニァ.スプチ、ゴルドニァ.ルブリパーチンクタ、ロドコッカス. エリス口ポリス、ロドコッカス'スピーシーズ、ロドコッカス.ロドクロウス、ロドコッカス.エリ スロポリス、リノクラディエラ'エリシィ、リノクラディエラ ·アト口ビレンス、ラミクロリディウ ム ·アンセブス、及びポルフィロバクタ一 ·サンギネウスカ なる群力 選ばれる微生物 である請求項 9な 、し 11の 、ずれか 1項に記載の方法。
[13] 一般式 (II)で表される化合物において * *で表される炭素原子が S配置である化合 物のエステル基を加水分解する工程を含み、微生物がロドトルラ属、バシルス属、ブ レブンディモナス属、シユードモナス属、リゾピウム属、ァスペルギルス属、ベアウベリ ァ属、ぺニシリウム属、ノカルディア属、ゴルド-ァ属、ロドコッカス属、ラミクロリディウ ム属、及びボルフイロパクター属に属する微生物からなる群力も選ばれる微生物であ る請求項 9な 、し 11の 、ずれか 1項に記載の方法。
[14] 微生物がロドトルラ 'アウランチア力、バシルス 'セレウス、バシルス 'フジフオルミス、ブ レブンディモナス'デイミヌタ、シユードモナス 'ァエノレギノサ、リゾビゥム 'ラジオバクタ 一、ァスペルギルス'オクラセウス、ァスペルギルス'オリザェ、ベアウベリア'バシアナ 、ぺ-シリウム'スピヌ口サム、ノカルディア'ァステロイデス、ノカルディア 'グロべルラ、 ゴルドニァ.ブロンキアリス、ゴルドニァ.スプチ、ゴルドニァ 'ルブリパーチンクタ、ロド コッカス'スピーシーズ、ロドコッカス'ロドクロウス、ロドコッカス'エリス口ポリス、ラミクロ リディウム'アンセブス、及びポルフィロバクタ一 ·サンギネウスカもなる群力も選ばれる 微生物である請求項 13に記載の方法。
[15] 一般式 (II)で表される化合物において * *で表される炭素原子が R配置である化合 物のエステル基を加水分解する工程を含み、微生物がレイフソ-ァ属、シリンドロカ ーポン属、バーチシリウム属、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属、ェクソフィアラ属、 及びリノクラディエラ属に属する微生物からなる群力 選ばれる微生物である請求項 9な!、し 11の!、ずれか 1項に記載の方法。
[16] 微生物がレイフソ-ァ 'アクアチカ、シリンド口カーボン'スピーシーズ、バーチシリウム •レプトバクテリム、マイコバクテリゥム 'スメグマチス、マイコバクテリゥム 'フレイ、マイコ バクテリウム.ノカェ、ロドコッカス.ェクイ、ロドコッカス'ファシアンス、ロドコッカス .ラ テイスラビエンシス、ェクソフィアラ 'ジーンセルメイ、ェクソフィアラ 'デルマチチジス、 リノクラディエラ'エリシィ、及びリノクラディエラ'アトロビレンス力もなる群力も選ばれる 微生物である請求項 15に記載の方法。
[17] 請求項 1な!、し 3又は請求項 9な 、し 11の 、ずれか 1項に記載の方法で得られる光 学活性ィ匕合物を用いて製造されるクロピドグレル又はその製造方法。
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