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WO2008035631A1 - Procédé de production d'une substance - Google Patents

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Publication number
WO2008035631A1
WO2008035631A1 PCT/JP2007/067941 JP2007067941W WO2008035631A1 WO 2008035631 A1 WO2008035631 A1 WO 2008035631A1 JP 2007067941 W JP2007067941 W JP 2007067941W WO 2008035631 A1 WO2008035631 A1 WO 2008035631A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dipeptide
culture
cell
cells
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2007/067941
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshinobu Konno
Kentaro Sakai
Masakazu Takagishi
Ken Takahashi
Shinji Sakae
Masamichi Koike
Toshiyuki Suzawa
Shinji Hosoi
Yasufumi Imamoto
Hisaya Tanaka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Publication of WO2008035631A1 publication Critical patent/WO2008035631A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing animal cells having an ability to produce a substance, characterized by adding a peptide and culturing in an animal cell culturing method having an ability to produce a substance,
  • a method for producing a substance by culturing animal cells having the ability to produce a substance the dipeptide is added and cultured, the substance is produced and accumulated in the culture, and the substance is removed from the culture.
  • a method for producing a substance characterized by collecting, and culturing by adding a dipeptide to an animal cell having the ability to produce the substance, and determining the productivity per cell of the substance produced from the cell.
  • a method for maintaining the viability of a cell a method for maintaining the viability of the substance, characterized by adding a dipeptide to an animal cell having an ability to produce a substance and culturing the animal cell.
  • dipeptide A method for suppressing an increase in the concentration of ammonium ions in the culture medium of the cell, and a method of culturing by adding a dipeptide to an animal cell having the ability to produce a substance. And a method for inhibiting apoptosis of the cell.
  • Non-patent Document 1 Among glycoproteins, antibodies have recently been approved as various pharmaceuticals, and many antibodies are under development (Non-patent Document 1). In the future, it is predicted that production of useful substances such as antibodies in animal cells is expected to become active S, and that the productivity of useful substances in animal cells is sufficiently high! / RU
  • CHO cells Chinese hamster ovary tissue-derived cells
  • hypridoma as host cells that produce antibodies and other glycoprotein substances is produced from such cells. This is because the sugar chains bound to the glycoproteins are relatively close to humans! (Patent Documents 1 and 2).
  • Cells use glucose and glutamine as energy sources.
  • glucose or glutamine is added to a medium used for cell culture and the cells are cultured, ammonia generated by the metabolism of glutamine by the cells accumulates in the medium.
  • Glutamine in the medium Ammonia generated by natural decomposition of the water also accumulates in the medium. Ammonia is known to affect the growth of animal cells and substances produced by animal cells (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Non-Patent Documents 2 and 3 As a method for reducing the accumulation of ammonia in the medium due to cell metabolism, it is known to construct cells that do not require glutamine as a substrate (Patent Document 3).
  • a basal medium supplemented with L-amino acid L-glutamine is known for the purpose of preventing the decomposition of glutamine due to heat sterilization of the medium (Patent Document 4).
  • L-alanil-L-glutamine is known to have higher thermal stability than L-glutamine, and is used in infusion preparations (Non-patent Documents 4 and 5).
  • Culture method of Hela cells using basal medium supplemented with L-alanil-L-glutamine (Patent Document 5), basal medium containing 300 mg / L L-alanil-L-glutamine for human cell culture Known (Patent Document 6).
  • a medium containing L-alanil-L-glutamine is also known as a cell freezing medium (Non-patent Document 6).
  • L-alanil-L-glutamine is sold as a supplement from Invitrogen, LLC H Biosciences, and it is known to suppress the generation of ammonia by adding the supplement to the basic medium (non- Patent Document 7).
  • Non-patent Document 8 it is known that conditioned cells are required because not all cells grow in a medium containing L-alanil-L-daltamin!.
  • Non-patent Document 9 As a dipeptide containing L-tyrosine, L-barilloux L-tyrosine, which is considered to have a blood pressure effect, is known (Non-patent Document 9).
  • Patent Document 1 W096 / 39488
  • Patent Document 2 US4724206
  • Patent Document 3 WO87 / 04462
  • Patent Document 4 JP-A 61-271985
  • Patent Document 5 EP0220379
  • Patent Document 6 US 5328844
  • Non-Patent Document 1 Nature Rev. Drug. Discov., 3, 383 (2004)
  • Non-Patent Document 2 Gastroenterology, 107, 429 (1994)
  • Non-Patent Document 3 Biotechnology Prog, 18, 3129 (2002)
  • Non-Patent Document 4 Biotechnology Bioeng, 68, 370 (2000)
  • Non-Patent Document 5 Infusionsther Transfusioned, 22, 317 (1995)
  • Non-Patent Document 6 Biotechnology Prog., 20, 1113 (2004)
  • Non-Patent Document 7 Quest, 1, 7 (2004)
  • Non-Patent Document 8 Biotechnology Bioeng, 64, 298 (1999)
  • Non-Patent Document 9 Hypertension Research, 28, 545 (2005)
  • the present invention provides the following (1) to (90).
  • a method for cultivating animal cells having the ability to produce a substance comprising culturing with the addition of a dipeptide.
  • a method for producing a substance by culturing animal cells having the ability to produce a substance the dipeptide is added and cultured, the substance is produced and accumulated in the culture, and the culture is used to produce the substance.
  • a method for producing a substance comprising collecting the substance.
  • a method for improving productivity per cell of a substance produced from the cell which comprises culturing by adding a dipeptide to an animal cell having the ability to produce the substance.
  • a method for maintaining the survival rate of a cell which comprises culturing an animal cell having the ability to produce a substance by adding a dipeptide.
  • (61) A method of suppressing an increase in the concentration of ammonium ions in a culture solution of a cell, characterized by adding a dipeptide to a cell having an ability to produce a substance and culturing the animal cell. How to make it.
  • a method for suppressing early apoptosis of a cell which comprises culturing an animal cell having the ability to produce a substance by adding a dipeptide.
  • the present invention relates to a method for culturing animal cells having the ability to produce a substance characterized by adding a dipeptide and culturing the animal cell in a method for culturing animal cells having the ability to produce a substance.
  • a method for producing a substance by culturing animal cells having the ability to cultivate, culturing with addition of a dipeptide, producing and accumulating the substance in the culture, and collecting the substance from the culture A method for improving the per-cell productivity of a substance produced from the cell, characterized by adding a dipeptide to an animal cell having the ability to produce the substance and culturing the animal cell Maintaining the viability of the cells, characterized by adding a dipeptide to an animal cell capable of producing a substance and culturing the cells.
  • a method for suppressing an increase in the concentration of ammonium ions in a culture solution of the cell and a method for producing the substance, characterized by adding a dipeptide to an animal cell capable of producing the substance and culturing the animal cell
  • a method for suppressing apoptosis of an animal cell which comprises culturing by adding a dipeptide to an animal cell having the ability.
  • FIG.l CHO cells
  • Figure 1 shows the time course of viable cell density (cells / mL) when batch culture was performed in Erlenmeyer flasks using BP-8472).
  • the mouth in the figure indicates Gin culture, and the country indicates AlaGln culture.
  • FIG. 2 shows changes over time in ammonium ion concentration (mmol / L), viability (%), and viable cell density (cells / mL) when fed batch culture with 2L bioreactor using BP-8472). Shown in The mouth in the figure indicates Gin Gin culture, and the country indicates Gin-AlaGln culture.
  • FIG. 3 shows the time-dependent change in the density of living cells (cells / mU over time) when FE cell culture was performed in an Erlenmeyer flask using the CHO cell line Ms704 / CD20 (FERM BP-10092). Mouth indicates Gin-Gin culture, ⁇ indicates Gin-AlaGln culture, and country indicates A1 aGln-AlaGln culture.
  • Fig. 4 shows the protein concentration (mg / mL, SPR g / 10 6 cells / day) when FE cells were cultured in Erlenmeyer flasks using CHO cells Ms704 / CD20 (FERM BP-10092). Shown in 4. The mouth in the figure indicates Gin-Gin culture, the hatched line indicates Gin-AlaGln culture, and the country indicates AlaGln-AlaGln culture.
  • FIG 5 CHO cells Ms704 / CD20 strain when (FERM BP- 10092) was performed Fuedobatchi culture in 2L Baioria Kuta one using, viable cell density (cells / m L), Anmoniu Ion Concentration (mmol / L Figure 5 shows the changes over time. The mouth in the figure indicates Gin-Gin culture, ⁇ indicates Gin-AlaGln culture, and the country indicates AlaGln-AlaGln culture.
  • FIG. 6 Protein concentration (mg / L), SPR g / 10 6 cells / day when FE cells were cultured in 2L bioreactor using CHO cell line Ms704 / CD20 (FERM BP-10092) The percentage of early apoptotic cells (%) is shown in FIG. The mouth in the figure indicates Gin-Gin culture, the hatched line indicates Gin-AlaGln culture, and the country indicates AlaGln-AlaGln culture. The
  • FIG. 7 L glutamine concentration (mmol / L) in culture medium when fed batch culture with 2L bioreactor using CHO cell line Ms704 / CD20 (FERM BP-10092), L-alanil-L-glutamine
  • ⁇ indicates Gin-AlaGln culture
  • country indicates AlaGln-AlaGln culture.
  • the dotted line in the figure indicates the L-glutamine concentration
  • the solid line indicates the L-alanyl-L-glutamine concentration.
  • FIG. 8 shows SPR g / 10 6 cells / day when fedbatch culture was performed in an Erlenmeyer flask using CHO cell strain Ms704 / CD20 (FERM BP-10092).
  • the mouth in the figure indicates Tyr culture, and the country indicates AlaTyr culture.
  • Fig. 9 shows the time course of viable cell density (cells / mU) when FE cell culture in an Erlenmeyer flask using the CHO cell line Ms704 / CD20 (FERM BP-10092) was performed.
  • ⁇ indicates culture without addition of ammonium chloride
  • mouth indicates culture with addition of ammonium chloride 1 Ommol / L
  • ⁇ indicates culture with addition of ammonium chloride 20 mmol / L
  • X indicates culture with addition of ammonium chloride 30 mmol / L * Indicates culture with addition of ammonium chloride 40 mmol / L
  • ⁇ indicates culture with addition of ammonium chloride 50 mmol / L
  • + indicates culture with addition of ammonium chloride 60 mmol / L.
  • FIG. 10 shows the specific growth rate QT 1 ) on the 4th day of culture when food batch culture was performed in triangular flasks using the CHO cell line Ms704 / CD20 (FERM BP-10092).
  • the country in the figure shows the culture without ammonium chloride, and the mouth shows the culture with ammonium chloride 10 mol / L, 20 mol / L, 30 mol / L, 40 mol / L, 50 mol / L, and 60 mol / L. .
  • FIG. Ll Changes in viable cell density (cells / mU, protein concentration (mg / L) over time when FE cells were cultured in 2L bioreactor using CHO cell line Ms704 / CD20 (FERM BP-10092).
  • Figure 11 shows the culture without addition of ammonium chloride
  • ⁇ shows the culture with addition of ammonium chloride 24 mmol / L.
  • the present invention relates to a method for culturing animal cells having the ability to produce a substance.
  • the present invention relates to a method for culturing animal cells, characterized by adding a cell and culturing.
  • the dipeptide used in the present invention is not particularly limited, and examples include dipeptides containing L-glutamine, dipeptides containing L-tyrosine, and the like. Dipeptides containing L-glutamine are preferably alanylglutamine. L-alanil L-glutamine is particularly preferred.
  • L-alanyl-L tyrosine which is preferably alanyl tyrosine, is particularly preferable.
  • a dipeptide containing L-glutamine can be produced by a known synthesis method, enzyme method or fermentation method.
  • a method for producing L-alanyl mono L-glutamine synthetic methods [Organic Process Research & Development 5, 132 (2001), JP 6-234715] and fermentation methods (WO2004 / 058960, WO2006 / 001379) S.
  • a dipeptide containing L-tyrosine can also be produced by a known synthesis method, enzyme method, or fermentation method.
  • methods for producing L-alanyl-L-tyrosine include synthesis methods and fermentation methods (WO2004 / 058960, WO2006 / 001379) and the like S.
  • the method of adding the dipeptide to the medium is not particularly limited! /, But it is preferable to add it to the basic medium and / or the feed medium to culture animal cells! / .
  • the dipeptide When added as a feed medium, the dipeptide may be added to the medium alone as the feed medium, or the dipeptide and other medium components may be added to the medium as a premixed feed medium. It may be added. Further, the feed medium may be divided and added to the medium discontinuously, or the feed medium may be continuously added to the medium.
  • the concentration of the dipeptide added to the medium may be appropriately selected depending on the type of animal cells used for culture, the type of substance to be produced, the type of dipeptide, the timing of addition of the dipeptide, etc., but preferably the final concentration is 0.01. To 1000 mmol / L, more preferably 0.1 to 500 mmol / L, and particularly preferably 1 to 100 mmol / L.
  • the final concentration of dipeptide refers to the concentration of the dipeptide in the medium immediately after being added to the medium.
  • the timing of adding the dipeptide is preferably added to the medium in the logarithmic growth phase, particularly preferably in the first half of the logarithmic growth phase.
  • the logarithmic growth phase varies depending on the cell line to be cultured and the culture control method. This refers to the period until the time when the number of cells to be obtained becomes constant.
  • the method for storing the feed medium is not particularly limited as long as the medium is maintained in a sterile state, and examples thereof include a method using a stainless steel tank and a disposable bag.
  • the medium used in the present invention may be any medium as long as it can be used for animal cell culture, and a basal medium used for normal animal cell culture is used. Glutamine and / or tyrosine may be previously contained as a medium component, or may not be contained.
  • the ability to use any medium such as a serum-containing medium, a medium that does not contain animal-derived substances such as serum albumin and serum fractions, a serum-free medium, a protein-free medium, etc. It is preferable to use a medium or a protein-free medium.
  • a basal medium used for normal animal cell culture used in the method of the present invention for example, RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical
  • EX—CELL TM 302 medium manufactured by GIA LEUTI Biosciences or their modified or mixed medium, preferably RPMI1640 medium, DMEM medium, F12 medium, IMDM medium and EX—CEL
  • L TM 302 medium or the like is used.
  • serum-free medium a basal medium containing a physiologically active substance, a nutrient factor, a carbon source that can be assimilated by animal cells, a nitrogen source and the like instead of serum is used.
  • additives necessary for the growth of animal cells to the serum-free medium as needed. These additives are preferably contained in the medium in advance before culturing.
  • Examples of nutritional factors include glucose, amino acids, vitamins and the like.
  • Examples of amino acids include L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cystine, L-glutamic acid, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-sip Icin, L-lysine , L-methionine, L-phenenolealanine, L-porporin, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, etc., which can be used alone or in combination. Also, solvates such as these salts and / or hydrates may be used.
  • vitamins include D biotin, D pantothenic acid, choline, folic acid, myo inositol, niacinamide, pyridoxal, riboflavin, thiamine, cyanocobalamin, DL-a tocopherol, etc., one or a combination of two or more Used. Also, solvates such as these salts and / or hydrates may be used! /.
  • physiologically active substances include insulin, transferrin, serum albumin, serum fractions containing growth factors, and the like.
  • substances added in place of animal-derived substances include physiologically active substances produced by genetic recombination methods, hydrolysates or animal-derived substances. And lipids.
  • hydrolyzate examples include hydrolysates such as soybean, wheat, rice, peas, cottonseed or yeast extract.
  • lipids that do not contain animal-derived substances include cholesterol, linoleic acid, linolenic acid, and the like. Also included are solvates such as salts and / or hydrates thereof.
  • ADPF medium (Animal derived protein free medium; manufactured by High Clone), CD—Hybridoma medium (Invitrogen), CD—CHO medium (Invitrogen), IS—CD—CHO medium (IS) Etc.).
  • a medium containing a high concentration of amino acids and vitamins for example, a medium in which RPMI1640 medium, DMEM medium and F12 medium are mixed at a ratio of 1: 1: 1, A medium in which DMEM medium and F12 medium are mixed at a ratio of 1: 1, hybridoma SFM medium (manufactured by Invitrogen) and the like are preferably used.
  • animal cells having the ability to produce the substances used in the present invention include cells belonging to any of mammals, birds, reptiles, amphibians, fish and insects.
  • animal cells belonging to mammals are preferably used, more preferably animal cells derived from humans or primates such as monkeys or animal cells derived from rodents such as mice, rats or hamsters.
  • Examples of cells belonging to mammals include myeloma cells or cells derived from myeloma cells, ovarian cells, kidney cells, blood cells, uterine cell connective tissue cells, mammary cells or embryonic retinoblasts.
  • myeloma cells or cells derived from myeloma cells and ovary cells are preferred.
  • the substance to be produced is an antibody, it is preferably an antibody-producing cell such as a hyperidoma.
  • Examples of cells belonging to mammals include human cell lines HL-60 (ATCC CCL-240), HT-1080 (ATCC CCL-121), HeLa (ATCC CCL-2), 293 (E CACC 85120602 ), Namalwa (ATCC CRL—1432), Namalwa KJM—1 (Cytotechnology, 1, 151 (1988), NM—F9 cells (DSM ACC2605, WO05 / 17130) and PER. C6 cells (ECACC No.
  • the cell lines VERO ATCC CCL-1651) and COS-7 (ATCC CRL-1651), the mouse cell lines C127I (ATCC CRL-1616), Sp2 / 0— Agl4 (ATC C CRL— 1581) NIH3T3 (ATCC CRL— 1658), NS0 (ATCC CRL—182 7), rat cell lines Y3 Agl.
  • VERO ATCC CCL-1651
  • COS-7 ATCC CRL-1651
  • the mouse cell lines C127I ATCC CRL-1616
  • Sp2 / 0— Agl4 ATC C CRL— 1581
  • NIH3T3 ATCC CRL— 1658
  • NS0 ATCC CRL—182 7
  • rat cell lines Y3 Agl Y3 Agl.
  • Examples include Spodoptera frugiperda cell line Sf9 (ATCC CRL-1711), etc.
  • primary monkey kidney cells, primary rabbit kidney cells, primary chicken embryos are used as primary culture cells for vaccine production. Cells, primary quail fetal cells, and the like.
  • Myeloma cells or cells derived from myeloma cells include Sp2 / 0—Agl4, NS0, Y3 Agl. 2. 3., YO or YB2 / 0.
  • Examples of ovarian cells or cells derived from ovarian cells include CHO—Kl, CHO / dhfr_, or CHO / DG44 isostatic S.
  • 293, VERO, COS-7, BHK21 or M DCK etc. are used for kidney cells
  • HL-60, Namalwa, Namalwa KJM-1 or NM-F9 etc. are used for blood cells
  • HeLa isotonic is used for uterine cells.
  • the connective tissue cell is HT-1080 or NIH3T3 isobaric mammary cell is C1271I isobaric embryonic retinoblast is PER. C6 and so on.
  • Animal cells having the ability to produce a substance used in the present invention include animal cells transformed with a recombinant vector containing a gene involved in the production of the substance, and a substance that is subjected to mutation treatment to produce the substance.
  • Hydridoma which is a fused cell of an antibody-producing cell such as a B cell or an antibody-producing cell and a myeloma cell. Animal cells and the like that have been subjected to a mutation treatment that increases the expression level of the substance are also included in the animal cells of the present invention.
  • Examples of cells that have been subjected to mutation treatment to produce substances include cells in which mutations have been introduced into protein modifying enzymes to enable production of desired substances.
  • the desired substance is a glycoprotein
  • cells in which mutations are introduced into various sugar chain-modifying enzymes may be used in order to change the structure of the sugar chain that binds to the protein. .
  • a cell transformed with a recombinant vector containing a gene involved in the production of the substance introduces the recombinant vector containing the DNA involved in the production of the substance and a promoter into the animal cell used in the present invention. Can be obtained.
  • DNA involved in the production of a substance for example, DNA encoding a substance such as a peptide, DNA encoding an enzyme or protein involved in the biosynthesis of the substance, and the like can be used.
  • the substance produced by the method of the present invention may be any substance that can produce animal cells, but is preferably a substance that can produce animal cells belonging to mammals, and examples thereof include peptides.
  • substances produced by the method of the present invention include biocatalytic molecules such as ribozyme, keratin, collagen, elastin, resilin, and hive mouth-in structures.
  • Vaccine such as formation / retention molecule, pressure ulcer vaccine, polio vaccine, measles vaccine, rubella vaccine, mumps vaccine, rabies vaccine, varicella vaccine, ushi epidemic fever vaccine, Ibaraki disease cutin and ushi infectious tracheitis vaccine Or viruses such as adenovirus and baculovirus.
  • Peptides produced by the method of the present invention include peptides derived from eukaryotic cells, preferably peptides derived from mammalian cells.
  • a peptide having physiological activity is preferred.
  • the peptide may be in any form as long as the desired peptide is contained.
  • the peptide may be an artificially modified peptide such as a fusion peptide fused with another peptide. It may be a partial fragment.
  • the peptides produced by the method of the present invention include glycoproteins.
  • glycoproteins include antibodies, erythropoietin (EPO). Biol. Chem., 252. 5558 (1977)], thrombopoietin ( ⁇ ) [Nature, 369. 533].
  • EPO erythropoietin
  • ⁇ thrombopoietin
  • Tissue type plasminogen activator t-PA
  • plow mouth kinase plow mouth kinase
  • thrombomodulin antithrombin
  • protein blood coagulation factor VII blood coagulation factor VIII
  • blood coagulation factor IX blood coagulation factor X
  • Blood coagulation factor XI blood coagulation factor XII
  • prothrombin complex fibrinogen, albumin, gonadotropin, thyroid stimulating hormone, epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor, activin, bone Forming factor, granulocyte colony stimulating factor (G—CSF) U. Biol. Chem., 25 8, 9017 (1983)], macrophage colony stimulating factor (M—CSF).
  • EGF epidermal growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • G—CSF granulocyte colony stimulating factor
  • the antibody may be any antigen-binding antibody, such as an antibody that binds to a tumor-related antigen, an antibody that binds to an antigen related to allergy or inflammation, an antibody that binds to an antigen related to cardiovascular disease, It is preferably an antibody that binds to an antigen associated with an autoimmune disease, or an antibody that binds to an antigen associated with a virus or bacterial infection, and the antibody class is preferably IgG.
  • the antibody produced by the method of the present invention includes a fragment containing a part of the antibody, such as Fab (abbreviation of Fragment of antigen binding), Fab, F (ab,),
  • Examples include single chain antibodies (single chain Fv; hereinafter referred to as scFv), disulfide stabilized antibodies (hereinafter referred to as dsFv), and fusion proteins containing the Fc region of antibodies.
  • scFv single chain Fv
  • dsFv disulfide stabilized antibodies
  • antibodies include antibodies produced by gene recombination techniques, in other words, antibody genes, in addition to antibodies secreted by hyperoma cells produced from spleen cells of immunized animals after immunization of animals with antigens.
  • an antibody obtained by introducing an antibody expression vector into which a vector has been introduced into a host cell.
  • Specific examples include antibodies produced by Hypridoma, human-type chimerized antibodies, humanized antibodies or human antibodies.
  • the human chimeric antibody is a non-human animal antibody heavy chain variable region (hereinafter, the heavy chain is also referred to as H chain, the variable region is also referred to as HV or VH) and an antibody light chain variable region (hereinafter referred to as "H chain”).
  • the light chain is also referred to as LV or VL as the light chain) and the heavy chain constant region of human antibodies (hereinafter, the constant region is also referred to as CH! /)
  • the light chain constant region of human antibodies hereinafter also referred to as CL! /, U
  • CL! /, U means an antibody consisting of As animals other than humans, any animal can be used as long as it can produce a hybridoma such as mouse, rat, mouse, muster, rabbit and the like.
  • cDNAs encoding VH and VL are obtained from hybridomas producing monoclonal antibodies, and inserted into expression vectors for host cells having genes encoding human antibody CH and human antibody CL, respectively.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed and introduced into a host cell for expression and production.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any of those belonging to human immunoglobulin (hereinafter referred to as “hlg”), but is preferably of the MgG class, and further hlg belonging to the MgG class. Any of the subclasses Gl, MgG2, MgG3, MgG4 can be used. As the CL of the human chimeric antibody, any ⁇ class or fly class can be used as long as it belongs to hlg.
  • VH and VL human type homology determining regions (hereinafter referred to as CDRs) of human non-human animal antibodies, amino acids ⁇ ⁇ ⁇ IJ are used for human antibody VH and VL.
  • CDRs VH and VL human type homology determining regions
  • Examples include CDR-grafted antibodies prepared by transplanting to appropriate positions.
  • the CDR-grafted antibody is constructed by constructing cDNA encoding the V region obtained by grafting the VH and VL CDR sequences of the non-human animal antibody to the VH and VL CDR sequences of any human antibody, and the human antibody CH and human antibody.
  • a CDR-grafted antibody expression vector is constructed by inserting each into a host cell expression vector having a gene encoding CL of, and the CDR-grafted antibody is expressed and produced by introducing the expression vector into the host cell. I can do it.
  • the CDR of the CDR-grafted antibody is preferably hlgG class if it belongs to hlg! /, But is also of the hlgG class, and MgGl, MgG2, MgG3, Any of the subclasses such as MgG4 can be used.
  • the CL of the CDR-grafted antibody any ⁇ class or e class can be used as long as it belongs to hlg.
  • Anti-GD2 antibodies Anticancer Res., 13, d31 (1993)], JTLGD3JTL [Cancer Immunol. Immunother., D, 26 0 (1993)], anti-GM2 antibodies [Cancer Res., 54, 1511 (1994)], anti-HER2 antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 (1992)], anti-CD52 antibody [Nature, 332, 323 (1988)], anti MAGE antibody (British J. Cancer, 83, 493
  • Anti-interleukin 6 antibody [Immunol. Rev., 127. 5 (1992)], anti-interleukin 6 receptor antibody [Molecular Immunol., 31 , 371 (1994)], anti-interleukin 5 antibody [Immunol. Rev., 127. 5 (1992)], anti-interleukin 5 receptor antibody, anti-interleukin 4 antibody [Cytokine, 3, 562 (1991)], Anti-interleukin 4 receptor antibody Qj. Immunol • Meth., 2 ⁇ 7, 41 (1998)], anti-tumor necrosis factor antibody [Hybridoma, 13, 183 (199 4)], anti-tumor necrosis factor receptor antibody [Molecular Pharmacol.
  • antibodies that bind to antigens associated with autoimmune diseases include anti-self DNA antibodies [Immu nol. Letters, 72, 61 (2000)], anti-CD1 la antibody, anti-ICAM3 antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD2 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-integrin ⁇ 4/3 7 antibody, anti-CD 40L antibody And anti-IL 2 receptor antibody [Immunology Today, 21, 403 (2000)].
  • Anti-gpl20 antibodies [Structure, 8, 385 (2000)], anti-CD4 antibodies. Rheumatology, 25, 2065 (1998)], anti-CCR4 antibodies , Anti-verotoxin antibodies. Clin. Microbiol., 37, 396 (1999)].
  • Examples of the peptide having physiological activity include peptides that maintain the activity of the glycoprotein among the partial fragments of the glycoprotein.
  • a peptide that regulates the enzyme activity or a peptide that retains the structure of the enzyme is also included.
  • the peptide that regulates the activity of the enzyme for example, a peptide that functions as a glycoprotein agonist or antagonist is preferably used. Any peptide may be used as long as it has an activity that enhances the activity of glycoprotein.
  • somatostatin derivative, somatrobin, atrial natriuretic peptide, glucagon, insulin, insulin-like growth factor, Gonadotropin etc. can be raised.
  • the antagonist may be any peptide as long as it has an activity of suppressing the activity of glycoprotein. Specific examples include pegvisomatone.
  • the animal cell used for producing the above-mentioned peptide having physiological activity may be any animal cell as long as the above-mentioned peptide can be produced, but preferably a vector having a gene encoding the peptide to be produced. A transformant into which is introduced is used.
  • a transformed cell into which a vector having a gene encoding a peptide is introduced can be obtained by introducing a recombinant vector containing a DNA encoding a peptide and a promoter into a host cell.
  • the host cell an animal cell having the ability to produce the above substance is used.
  • Any vector can be used as a vector used for preparing the recombinant vector as long as it functions in animal cells used in the present invention.
  • pcDNA I, pcDM8 manufactured by Funakoshi
  • pAGE107 [JP-A-3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • pAS3-3 JP-A-2-227075
  • pcDM8 [Nature, 3 29, 840 (1987) ]
  • PcDNAl / Amp Invitrogen
  • pREP4 Invitrogen
  • PAGE103 U. Biochem. 101, 1307 (1987)]
  • pAGE210 etc.
  • Any promoter can be used as long as it functions in the animal cells used in the present invention.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 Examples include early promoters, retrovirus promoters, metamouthone promoters, heat shock promoters, SRa promoters, and the like.
  • a human CMV IE gene enhancer or the like may be used together with a promoter.
  • any method for introducing a recombinant vector into a host cell any method can be used as long as it introduces DNA into the cell.
  • the electopore method [Cytot echnology, 3, 133 ( 1990)]
  • calcium phosphate method JP-A-2-227075
  • lipofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987), Virology, 52, 456 (1973)].
  • transformed cells used in the present invention include transformed cells 7-951 (FERM BP-6691) that produce anti-GD3 human chimeric antibodies, and traits that produce anti-CCR4 chimeric antibodies.
  • Transformed cells KM2760 (FERM BP—7054), transformed cells producing anti-CCR4 humanized antibodies KM8759 (FERM BP—8129) and KM8760 (FERM BP—8130), 709 LCA—500D strain (FERM BP—8239), Transformed cells producing anti-IL-5 receptor ⁇ chain chimeric antibody ⁇ 7399 (FERM BP-5649), transformed cells producing anti-IL 5 receptor ⁇ chain human CDR grafted antibody ⁇ 8399 (FERM BP 56 48) And KM9399 (FERM BP—5647), transformed cells producing anti-GM2 human CDR-grafted antibody KM8966 (FERM BP—5105), KM8967 (FERM BP—5106), KM8969 (FERM BP—5527), KM8970
  • any culture method such as batch culture, repeat batch culture, fed-batch culture or perfusion culture may be used, but preferably fed-batch culture is used.
  • the culture volume is usually 10 ⁇ using an Erlenmeyer flask, etc.! Even a small culture volume of OOOmL can be used for commercial production of! ⁇ 200 OOL, usually using a culture tank such as a jar, etc.
  • the culture method used in the present invention may be any method suitable for the animal cells to be used, but usually perfusion culture under conditions of pH 6-8, 30-40 ° C, etc. for 3-20 days. Let's do it for 3-60 days.
  • antibiotics such as streptomycin and penicillin may be added to the medium as needed during the culture.
  • dissolved oxygen concentration control, pH control, temperature control, stirring, etc. can be carried out according to the methods used for normal animal cell culture.
  • animal cells having the ability to produce a substance are cultured in a medium supplemented with a dipeptide, the substance is produced and accumulated in the culture, and the substance is collected from the culture. By doing so, the substance can be produced efficiently.
  • the production method of the present invention includes a direct expression method for producing a peptide in a host cell, a method for secreting and producing a peptide outside a host cell (Molecular Cloning, Second Edition) Etc.
  • Peptides were prepared by the method of Paulson et al. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], the method of Lou et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop. , 4, 1288 (1990)], or JP-A-5-336963 or WO 94/23021 can be used to actively secrete the cells from the host cell.
  • the desired peptide can be actively secreted outside the host cell by expressing it in such a manner that a signal peptide is bound to the N-terminus of the desired peptide using a genetic recombination technique.
  • the desired peptide produced by the method of the present invention can be isolated and purified using, for example, a normal peptide isolation and purification method.
  • the peptide produced by the method of the present invention is expressed in a dissolved state in the cells, after completion of the culture, the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, an ultrasonic disrupter, Disrupt the cells using a French press, Manton Gaurin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • the peptide produced by the method of the present invention is secreted extracellularly, the peptide can be recovered in the culture supernatant. That is, the culture supernatant is obtained by treating the culture by the same method such as centrifugation as described above, and the crude purified sample is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above.
  • a purified preparation can be obtained, and the present invention is characterized by adding a dipeptide to an animal cell having an ability to produce a substance and culturing the animal per cell of the substance produced from the cell. It relates to a method for improving productivity. In the present invention, the improvement in productivity per cell of a substance produced by animal cells can be confirmed by determining the specific production rate (SPR) of the substance.
  • SPR specific production rate
  • the specific production rate of a substance refers to the amount of substance produced per cell that produces the substance. Specifically, the amount of substance produced throughout the culture period is compared to the substance that survived during the culture period. By dividing by the number of cells to be produced, the required power S can be obtained.
  • the present invention also relates to a method for maintaining the survival rate of a cell, which comprises culturing by adding a dipeptide to an animal cell having the ability to produce a substance.
  • Cell viability can be determined by collecting cells in the medium over time, measuring the viable cell density, and multiplying the viable cell density by 100.
  • the density of viable cells is determined by a method such as [Culture of Animal Cells: A Manual oi Basic Technique, R. Ian Freshney, Alan R. Liss, Inc., New York (1983)]. You can ask.
  • the present invention also relates to a method for suppressing an increase in the concentration of ammonium ions in a culture solution of a cell, which comprises culturing an animal cell having the ability to produce a substance by adding a dipeptide. .
  • the concentration of ammonium ions in the culture solution can be measured by collecting the culture solution over time and using a potentiometric method such as BioProfile 400 (registered trademark: Nova Biomedical).
  • the present invention relates to a method for suppressing apoptosis of a cell, which comprises culturing by adding a dipeptide to an animal cell having the ability to produce a substance.
  • apoptosis includes early apoptosis.
  • the percentage of early apoptotic cells such as Guava PCA-96 Nexin Kit (manufactured by GE Healthcare Biosciences), is usually present inside the cell membrane, and phosphatidyl that appears outside when an apoptotic reaction occurs.
  • Ms705 / AT III strain (FERM BP 8472) that produces antithrombin, perform batch culture in a 250 mL Erlenmeyer flask and examine the effects of a medium containing L-glutamine and a medium containing L-alanil-L-glutamine. Compared.
  • EX-CELL TM 302 medium As a basic culture medium, a medium (hereinafter referred to as a modified EX-CELL TM 302 medium) in which glutamine was excluded from EX-CELL TM 302 medium (manufactured by JRH Bioscience) was used.
  • methatotrexate hereinafter referred to as MTX
  • MTX methatotrexate
  • L-glutamine 12 mmol / L Wako Pure Chemical Industries
  • L-alanyl-L glutamine 12 mmol / L Malkin
  • Gln culture the culture in which L-glutamine is added to the medium
  • AlGln culture the culture in which L-alanyl-L-glutamine is added to the medium
  • EX-CELL TM 302 medium manufactured by JR Hbioscience
  • MTX 500 nmol / L manufactured by Sigma Aldrich
  • L-glutamin 0 ⁇ 875 g / L (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Medium
  • Cell suspensions were seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / mL in 125 mL, 250 mL, lOOOOmL Erlenmeyer flasks (manufactured by Cojung) at a culture volume of about 10-30%. Thereafter, the cells were cultured at 35 ° C for 4 days, and subcultured several times until the number of cells necessary for seeding of the main culture was obtained.
  • Viable cell density was measured by a dye exclusion method using 0.4% trypan blue solution (Invitrogen).
  • Cumulative viable cell density is shown as the sum of products of viable cell density and elapsed time. The cumulative viable cell density was calculated based on the method shown in Equation 1. [0066] (Formula 1)
  • the medium for expansion until the main culture is EX-CELL TM 302 medium (manufactured by HR Bioscience), MTX 500 nmol / L (manufactured by Sigma Aldrich), and L glutamine 0 ⁇ 875 g / L.
  • the medium added (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. About 10-30% of the medium was placed in a 125 mL, 250 mL, or lOOOOmL Erlenmeyer flask (manufactured by Cojung), and the cell suspension was seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the cells were cultured at 35 ° C for 4 days, and passaged several times until the number of cells required for seeding of the main culture was obtained.
  • the cells were seeded at 3 X 10 5 cells / mL in a 2 L bioreactor (Able) filled with 600 mL of the basic medium described below.
  • the basic culture medium is EX-CELL TM 302 medium (manufactured by GM Bioscience), modified medium with glutamine removed, MTX 500 nmol / L (Sigma Al A medium supplemented with L. glutamine 1.75 g / L (Wako Pure Chemical Industries) was used.
  • the feed medium contains amino acids [(L-alanine 0 ⁇ 14 g / L, L-arginine monohydrochloride 0 ⁇ 47 g / L, L-parasine monohydrate 0 ⁇ 16 g / L, L-cystine dihydrochloride 0 ⁇ 51 g / L, L— Glutamic acid 0.42 g / L, L Histidine monohydrochloride dihydrate 0.24 g / L, L Iso-Isine 0.
  • Gln-G In culture The culture in which L-glutamine is added to the basic medium and the feed medium is referred to as “Gln-G In culture”, and the culture in which L-alanil-L-glutamine is added to the feed medium in the basic medium and the feed medium is referred to as “Gln-AlaGln culture”. And).
  • the viable cell density was measured by the same method as in Example 1. In this example, the viable cell density was measured every day from the beginning of the culture to the 14th day, and the cumulative viable cell density was calculated from Equation 1 described in Example 1 using the measured viable cell density.
  • the protein concentration was measured by HPLC.
  • PA ID Sensor Cartridge (Applied Systems) was used as the column, and L-7400 (detection wavelength 280 nm, manufactured by Hitachi, Ltd.) was used as the detector.
  • Ammonium ion concentration is BioProfile 400 (registered trademark: Nova Biomedical)
  • SPR which represents the amount of protein produced by a unit cell per unit time, was calculated from the following equation 2 using the measured protein concentration and the calculated cumulative viable cell density.
  • SPR g / 10 6 cells / day protein concentration (mg / L) ⁇ cumulative viable cell density (10 6 cells / mL X days)
  • the survival rate was 90% or more from the start of culture to the ninth day of culture.
  • the cell viability in Gin-Gin culture on the 10th day of culture was 59%, while that in Gin-AlaGln culture was as high as 95%.
  • the maximum reached viable cell density was 1.0 ⁇ 10 7 cells / mL or more in the culture using any of the feed media.
  • the cumulative viable cell density was approximately equal to 9.7 X 10 7 cells / mL X day for Gin-Gin culture and 9.3 X 10 7 cells / mL X day for Gin-AlaGln culture.
  • the ammonium ion concentration decreased to 311111101 / in the 011-8, 1 & 011 culture, compared to about 6 mmol / L in the Gin-Gin culture. It was revealed that the ammonium ion concentration in the medium was reduced when the feed medium supplemented with Ranil L-glutamine was used.
  • the protein concentration increased to 131% in Gln-AlaGln culture, assuming that the value in Gin-Gin culture was 100%.
  • SPR increased to 121% in Gin-AlaGln culture, assuming the value in G1 n-Gin culture as 100%.
  • the culture using the feed medium supplemented with L-alanil-L-glutamine produced antithrombin while maintaining the viability of the production cells as compared with the culture using the feed medium supplemented with glutamine. It became clear that productivity per cell was improved.
  • the medium for expansion until the main culture is EX-CELL TM 302 medium (manufactured by HR Bioscience), MTX 500 nmol / L (manufactured by Sigma Aldrich), L glutamine 1 ⁇ 75 g / L A medium supplemented with (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. About 20% of the medium was placed in a 125 mL, 250 mL, 500 mL or lOOOOmL volume Erlenmeyer flask (manufactured by Cojung), and the cell suspension was seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / mL. The cells were cultured at 35 ° C for 4 days, and subcultured several times until the number of cells required for seeding of the main culture was obtained.
  • the cells were seeded at 3 X 10 5 cells / mL in a 250 mL Erlenmeyer flask (manufactured by Cojung) filled with 40 mL of the following basic medium. Thereafter, the cells were cultured at 35 ° C, 100 rpm, pH 7.1 for 14 days.
  • the modified EX—CELL TM 302 medium used in Example 2 was added to MTX 500 nmol / L (Sigma Aldrich) and L-glutamine 0 ⁇ 87 g / L (Wako Pure Chemical Industries) or A medium supplemented with L-alanil-L-glutamine 1 ⁇ 30 g / L (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) was used.
  • the feed medium contained amino acids [L alanine 0 ⁇ 14 g / L, L arginine monohydrochloride 0 ⁇ 47 g / L, L-rasparagine monohydrate 0 ⁇ 16 g / L, L—cystine dihydrochloride 0 ⁇ 51 g / L, L—glutamic acid 0.42 g / L, L histidine monohydrochloride dihydrate 0.24 g / L, L-Isoguchiine 0.59 g / L, L-leucine 0.59 g / L, L-lysine monohydrochloride 0.82 g /: L, L phenyl lanine 0.37 g / L, L proline 0.22 g / L, L-serine 0.
  • the culture solution is collected on days 1, 3, 4, 7, 10, 12, and 14 and the viable cell density (cells / mL), protein concentration (mg / L), and ammonium ion concentration (mmol / L) are measured. It was measured.
  • the viable cell density was measured by the same method as in Example 1.
  • the protein concentration and the ammonium concentration were measured in the same manner as in Example 2.
  • the cumulative viable cell density (cells / mL X day) and SPR g / 10 6 cells / day were calculated by the following method.
  • the cumulative viable cell density was calculated from Equation 1 described in Example 1 using the measured viable cell density.
  • SPR is the formula described in Example 2 using the measured protein concentration and the calculated cumulative viable cell density.
  • the results are shown in Figs.
  • the survival rate showed a good value of 95% or more from the start of culture to the seventh day of culture in any culture.
  • the maximum viable cell density showed good growth in all cultures exceeding 4.5 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the concentration of ammonium ions at the time of incubation was 12. lmmol / L in Gin-Gin culture, whereas it was 7.4 mmol / L in Gln-AlaGln culture, and 5.2 mmol in AlaGln-AlaGln culture. / L, and the addition of L-alanil-L-glutamine to the medium reduced the ammonia concentration.
  • the cumulative viable cell density for 14 days is 2.6 X 10 7 cells / mL X day for Gin—Gin culture, 3 ⁇ 9 X 10 7 cells / mL X day for Gin—AlaGln culture, 3 ⁇ for AlaGln—Ala Gin culture OX 10 7 cells / mL X day, the highest value was obtained when L-alanil-L-glutamine was added only to the feed medium.
  • the protein concentration increased to 180% in the Gin-AlaGln culture and 194% in the AlaGln-AlaGln culture with the addition of L-alanil-L-glutamine, assuming that the value in the Gin-Gin culture was 100%.
  • SPR increased to 120% for Gin-AlaGln culture and 167% for AlaGln-AlaGln culture with the addition of L-alanil-L-glutamine, assuming a value of 100% for Gin-Gin culture.
  • the medium for expansion until the main culture includes EX-CELL TM 302 medium (manufactured by HR Bioscience), MTX 500 nmol / L (manufactured by Sigma Aldrich), L-glutamine 1. 75 g / L A medium supplemented with (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. About 20% of the medium was placed in a 125 mL, 250 mL, 500 mL, or lOOOOmL Erlenmeyer flask (manufactured by Cojung), and the cell suspension was seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / mL. The cells were cultured at 35 ° C for 4 days, and subcultured several times until the number of cells required for seeding of the main culture was obtained.
  • the cells were seeded at 3 X 10 5 cells / mL in a 2 L volume bioreactor (Able) filled with 600 mL of the basic medium described below.
  • the modified EX—CELL TM 302 medium used in Example 2 MT X500 nmol / L (Sigma Aldrich) and L-glutamine 0 ⁇ 87 g / L (Wako Pure Chemical Industries) or A medium supplemented with L-alanil-L-glutamine 1 ⁇ 30 g / L (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) was used.
  • the feed medium contains amino acids [L-alanine 0 ⁇ 14 g / L, L-arginine monohydrochloride 0 ⁇ 47 g / L, L-parasine monohydrate 0 ⁇ 16 g / L, L-cystine dihydrochloride 0 ⁇ 51 g / L L, L--Glutamic acid 0.42 g / L, L histidine monohydrochloride dihydrate 0.24 g / L, L iso-icine 0.59 g / L, L leucine 0.59 g / L, L lysine monohydrochloride 0.
  • the culture solution is collected every day, and the viable cell density (cells / mL), protein concentration (mg / U, ammonium ion concentration (mmol / L), L glutamine concentration, and L-alanil-L-glutamine Concentration (mmol / L) was measured.
  • the viable cell density was measured by the same method as in Example 1.
  • the protein concentration and ammonium ion concentration were measured in the same manner as in Example 2.
  • L-glutamine concentration and L-alurul-L-glutamine concentration were measured by inducing the collected culture medium with FMOC-C1 according to the following procedure.
  • 270 ⁇ L of lOOmmol / L borate buffer prepared from boric acid (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) and sodium hydroxide (manufactured by Kokusan Kagaku Co., Ltd., ⁇ 9.0) and acetone (Kokusan Chemical Co., Ltd.)
  • the product was mixed with 300 L of a 1.5 mg / mL FMOC-C1 (manufactured by Tokyo Kasei Co.) solution.
  • the cumulative viable cell density was calculated from Equation 1 described in Example 1 using the measured viable cell density.
  • SPR was calculated from Equation 2 described in Example 2 using the measured protein concentration and the calculated cumulative viable cell density.
  • Guava EasyCyte Plus (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used as a device for measuring the ratio of early apoptotic cells.
  • Guava PCA-96 Nexin Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used as the measurement reagent, and the measurement was performed according to the experimental procedure attached to the measurement reagent.
  • Gin-AlaGln culture decreased to 3.4 mmol / L on the 8th day, indicating that the addition of L-alanyl L-glutamine decreased the ammonium ion concentration.
  • the protein concentration increased to 109% in the Gin-AlaGln culture, assuming that the Gin-Gin culture value was 100%.
  • SPR increased to 10 6% for Gin-AlaGln culture and 115% for AlaGln-AlaGln culture with the addition of L-alanyl-L-glutamine, assuming the value of Gin-Gin culture as 100%.
  • the concentration of L-alanil-L-gnoretamine was OmM force S until the third day of culture, and then the concentration increased each time the feed medium was added until the eighth day of culture. After the 11th day of culture, the concentration of L-farnil and L-glutamine began to decrease and reached approximately OmM on the 14th day.
  • the proportion of cells with early apoptosis was 7.3% in Gin-AlaGln culture and 4.1% in AlaGln-AlaGln culture, compared to 7.3% in Gin-Gin culture on day 8 of culture.
  • the percentage of early apoptotic cells was suppressed by the addition of L-alanil-L-glutamine.
  • the Gin-Gin culture was 11.5%, while the Gln-AlaGln culture was 6.7% and the AlaGln-AlaGln culture was 3.6%.
  • Gin-Gin culture was 14.1%, Gln-AlaGln culture was 14.8%, and AlaGln-AlaGln culture was 8.3%.
  • the medium for expansion until the main culture is EX-CELL TM 302 medium (manufactured by JRH Bioscience), MTX 500 nmol / L (manufactured by Sigma Aldrich), L glutamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1.
  • a medium supplemented with 75 g / L was used.
  • a cell suspension was seeded at 3 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • the cells were cultured at 35 ° C for 4 days, and subcultured several times until the number of cells required for seeding of the main culture was obtained.
  • the feed medium contained amino acids [L-alanine 0 ⁇ 14 g / L, L-arginine monohydrochloride 0 ⁇ 47 g / L, L-parasine monohydrate 0 ⁇ 16 g / L, L-cystine dihydrochloride 0 ⁇ 51 g / L L, L--Glutamic acid 0.42 g / L, L histidine monohydrochloride dihydrate 0.24 g / L, L iso-icine 0.59 g / L, L leucine 0.59 g / L, L lysine monohydrochloride 0.
  • 022g / L Folic acid 0.02 2g /, myo Inosinole 0.040g /, Niacinamide ⁇ . 022g /, Pyrido, xalhydrochloric acid 0.022g / L, Riboflavin 0.0021g / L, Thiamine hydrochloride 0 022g / L, Shianocobalamin 0.073mg / L (sold by Sigma-Aldrich)], Recombinant Human Insulin 0 ⁇ 31g / L (GJ Bioscience), Ethanolamine 0 ⁇ 0 25g / L (manufactured by Sigma-Aldrich), 2 mercaptoethanol 0.009g / L (manufactured by Sigma-Aldrich), soy hydrolyzate HY—SOY8g / L (manufactured by Quest International), sodium selenite 16.
  • the culture solution was collected on days 4, 7, 9, 11, 13, and 14 of the culture, and the viable cell density (cell / mU and protein concentration (mg / L) was measured.
  • the viable cell density was measured by the same method as in Example 1.
  • the protein concentration was measured in the same manner as in Example 2.
  • the cumulative viable cell density (cells / mL X day) and SPR g / 10 6 cells / day were calculated by the following method.
  • the cumulative viable cell density was calculated from Equation 1 described in Example 1 using the measured viable cell density.
  • SPR was calculated from Equation 2 described in Example 2 using the measured protein concentration and the calculated cumulative viable cell density.
  • the medium for expansion until the main culture is EX-CELL TM 302 medium (GLA).
  • GLA EX-CELL TM 302 medium
  • MTX500 nmol / L Sigma-Aldrich
  • L-glutamine 1.75 g / L Wang-OOOmL Erlenmeyer flask (manufactured by Cojung)
  • the cells were cultured at 35 ° C for 4 days, and subcultured several times until the number of cells required for seeding of the main culture was obtained.
  • the feed medium contained amino acids [L-alanine 0 ⁇ 14 g / L, L-arginine monohydrochloride 0 ⁇ 47 g / L, L-parasine monohydrate 0 ⁇ 16 g / L, L-cystine dihydrochloride 0 ⁇ 51 g / L L, L--Glutamic acid 0.42 g / L, L histidine monohydrochloride dihydrate 0.24 g / L, L iso-icine 0.59 g / L, L leucine 0.59 g / L, L lysine monohydrochloride 0.
  • 022g / L Folic acid 0.02 2g /, myo Inosinole 0.040g /, Niacinamide ⁇ . 022g /, Pyrido, xalhydrochloric acid 0.022g / L, Riboflavin 0.0021g / L, Thiamine hydrochloride 0 022g / L, Shianocobalamin 0.073mg / L (sold by Sigma-Aldrich)], Recombinant Human Insulin 0 ⁇ 31g / L (GJ Bioscience), Ethanolamine 0 ⁇ 0 25g / L (manufactured by Sigma-Aldrich), 2 mercaptoethanol 0.009 g / L (Sigma Soy hydrolyzate HY—SOY8g / L (Quwest International), Sodium selenite 16.8 g / L (Sigma—Aldrich), Cholesterol lipid concentrated solution 2mL / L (250 X aqueous solution, manufactured by
  • a feed medium of 6.25% of the initial medium amount was added on the 47th and 9th days from the start of the culture.
  • the viable cell density was measured in the same manner as in Example 1.
  • the specific growth rate (h- 1 ) was calculated from the following formula 3 using the viable cell density on the 4th day of culture /
  • h— (Natural logarithm of viable cell density on day 4)
  • the results of the seeded live cell density are shown in Fig. 9 and Fig. 10.
  • the specific growth rate is 0 in the culture without ammonium chloride. 0187h— 0 for lOmmol / caroculture In culture of 20 mmol / L supplemented carodium, 0.0109 h—in culture of 30 mmol / L supplemented caroten, 0 0072 h—in culture of supplemented 40 mmol / L, 0.4 0041 h—in culture supplemented with 50 mmol / L—0.0025 h— 1 And 60 mMol / L addition, it was 0.0033h- 1 , indicating that the specific growth rate decreased as the concentration of ammonium chloride in the basic medium increased.
  • Anti-CD20 antibody production by 2L bioreactor Effect of ammonium ions in the culture medium in the cultivation of CHO cell line Ms704 / CD20
  • the medium for expansion until the main culture is EX-CELL 1 M 302 medium (manufactured by HR Bioscience), MTX 500 nmol / L (Sigma-Aldrich) and L glutamine 1 ⁇ 75 g A medium supplemented with / L (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • the feed medium contained amino acids [L-alanine 0 ⁇ 14 g / L, L-arginine monohydrochloride 0 ⁇ 47 g / L, L-parasine monohydrate 0 ⁇ 16 g / L, L-cystine dihydrochloride 0 ⁇ 51 g / L L, L--Glutamic acid 0.42 g / L, L histidine monohydrochloride dihydrate 0.24 g / L, L iso-icine 0.59 g / L, L leucine 0.59 g / L, L lysine monohydrochloride 0.
  • 022g / L Folic acid 0.02 2g /, myo Inosinole 0.040g /, Niacinamide ⁇ . 022g /, Pyrido, xalhydrochloric acid 0.022g / L, Riboflavin 0.0021g / L, Thiamine hydrochloride 0 022g / L, Shianocobalamin 0.073mg / L (sold by Sigma-Aldrich)], Recombinant Human Insulin 0 ⁇ 31g / L (GJ Bioscience), Ethanolamine 0 ⁇ 0 25g / L (manufactured by Sigma-Aldrich), 2 mercaptoethanol 0.009 g / L (Sigma Mar Aldrich), soy hydrolyzate HY— SOY8g / L (Quwest International), sodium selenite 16.8 g / L (Sigma Aldrich), cholesterol concentrated solution 2mL / L (250 X aqueous solution, manufactured by Invitrog
  • the culture broth was collected every day, and the viable cell density (cells / mL), protein concentration (mg / L), and ammonium ion concentration (mmol / L) were measured.
  • the viable cell density was measured by the same method as in Example 1.
  • the cumulative viable cell density (cells / mL X day) was calculated by the following method.
  • the cumulative viable cell density was calculated from Equation 1 described in Example 1 using the measured viable cell density.
  • the results are shown in Fig. 11.
  • the survival rate on the 5th day of culture decreased to 92% or less in the culture supplemented with ammonium chloride.
  • the culture without ammonium chloride it was maintained at 98% or more.
  • the maximum reached viable cell density was over 5.0 ⁇ 10 6 cells / mL in the culture supplemented with ammonium chloride.
  • culture without ammonium chloride showed a good growth of 1.1 X 10 7 cells / mL.
  • the protein concentration decreased to 61% in the culture without ammonium chloride, assuming that the value was 100% in the culture without ammonium chloride.
  • a dipeptide is added in the method for culturing animal cells having the ability to produce a substance.
  • a method for improving the per-cell productivity of a substance produced from the cell characterized by culturing, characterized by adding a dipeptide to an animal cell having the ability to produce the substance, and culturing.
  • a method for maintaining the viability of the cells a method for culturing animal cells having the ability to produce substances, and culturing with the addition of a dipeptide. It is possible to provide a method for suppressing an increase in the ON concentration, and a method for suppressing apoptosis of the cell, which comprises culturing by adding a dipeptide to an animal cell having the ability to produce a substance.

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Description

明 細 書
物質の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法において、ジぺプチ ドを添加して培養することを特徴とする物質を生産する能力を有する動物細胞の培 養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法に おいて、ジペプチドを添加して培養し、該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培 養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、物質を生産する能力 を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養することを特徴とする、該細胞より生 産される物質の細胞当たりの生産性を向上させる方法、物質を生産する能力を有す る動物細胞にジペプチドを添加して培養することを特徴とする、該細胞の生存率を維 持させる方法、物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養 することを特徴とする、該細胞の培養液中におけるアンモニゥムイオン濃度の上昇を 抑制させる方法、及び物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加し て培養することを特徴とする、該細胞のアポトーシスを抑制する方法に関する。 背景技術
[0002] 糖蛋白質の中でも抗体は、特に近年、種々の医薬品として認可され、更には多くの 抗体が開発中である（非特許文献 1)。今後、動物細胞における抗体などの有用物質 の生産が盛んになることが予測されている力 S、動物細胞による有用物質の生産性が 充分に高くなレ、ことが問題点としてあげられて!/、る。
抗体をはじめとする糖蛋白質の物質を生産する宿主細胞として、チャイニーズハム スター卵巣組織由来細胞（以下、 CHO細胞と称す）あるいはハイプリドーマなどの動 物細胞を選択するのは、当該細胞から生産された糖蛋白質に結合している糖鎖が相 対的にヒトに近!/、ためである（特許文献 1、 2)。
[0003] 細胞は、エネルギー源としてグルコース、グルタミンを用いる。細胞培養に用いる培 地にグルコースまたはグルタミンを添加して細胞を培養した場合、培地中には細胞に よりグルタミンが代謝されて発生したアンモニアが蓄積する。また培地中のグルタミン が自然分解して発生したアンモニアも培地中に蓄積する。アンモニアは動物細胞の 増殖や動物細胞が生産する物質に影響を及ぼすことが知られている（非特許文献 2 、 3)。細胞の代謝による培地のアンモニアの蓄積を低減する方法として、グルタミン を基質として必要としない細胞を造成することが知られている（特許文献 3)。また、培 地の加熱滅菌によるグルタミンの分解を防止することを目的として、 L—アミノ酸 L —グルタミンを添加した基礎培地が知られて!/、る (特許文献 4)。
[0004] L ァラニルー L—グルタミンは L—グルタミンと比較して熱安定性が高いことが知ら れており、輸液製剤などに利用されている（非特許文献 4、 5)。 L ァラニルー Lーグ ルタミンが添加された基礎培地を用いた Hela細胞などの培養方法（特許文献 5)、ヒ ト細胞培養用として 300mg/Lの L ァラニルー L—グルタミンが含有された基礎培 地が知られている（特許文献 6)。 L ァラニルー L グルタミンが含有された培地は、 細胞凍結用培地としても知られている（非特許文献 6)。また、 L ァラニルー Lーグ ルタミンはインビトロジェン社ゃジエーアールエイチバイオサイエンス社からサプリメン トとして販売されており、該サプリメントを基本培地に添加することによりアンモニアの 発生を抑えることが知られている（非特許文献 7)。しかし、 L ァラニルー L ダルタミ ンを含有した培地では必ずしもすべての細胞が生育しないため、細胞の馴化が必要 であることが知られて!/、る (非特許文献 8)。
[0005] Lーチロシンを含むジペプチドとしては、血圧効果作用を持つとされる L バリルー Lーチロシンが知られている（非特許文献 9)。
特許文献 1： W096/39488
特許文献 2 : US4724206
特許文献 3： WO87/04462
特許文献 4：特開昭 61— 271985
特許文献 5 : EP0220379
特許文献 6 : US 5328844
非特許文献 1 : Nature Rev. Drug. Discov. , 3, 383 (2004)
非特許文献 2 : Gastroenterology, 107, 429 (1994)
非特許文献 3 : Biotechnology Prog, 18, 3129 (2002) 非特許文献 4 : Biotechnology Bioeng, 68, 370 (2000)
非特許文献 5 : Infusionsther Transfusioned, 22, 317 (1995)
非特許文献 6 : Biotechnology Prog. , 20, 1113 (2004)
非特許文献 7 : Quest, 1 , 7 (2004)
非特許文献 8 : Biotechnology Bioeng, 64, 298 (1999)
非特許文献 9： Hypertension Research, 28, 545 (2005)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 動物細胞を培養し、該細胞から物質を生産させる方法にお!/、て、該細胞の生存率 の維持させる方法、生産される物質の生産性を向上するための方法、及びアポトー シスを抑制する方法が求められている。
課題を解決するための手段
[0007] すなわち、本発明は、以下の（1)〜（90)を提供するものである。
(1) 物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法において、ジペプチドを添 カロして培養することを特徴とする動物細胞の培養方法。
(2) ジペプチドが L—グルタミンを含むジペプチドである、（1)に記載の方法。
(3) L—グルタミンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーグノレタミンである、（2)に 記載の方法。
(4) ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、（1)に記載の方法。
(5) Lーチロシンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーチロシンである、（4)に記 載の方法。
(6) 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、（1)〜（5)のいずれか 1項に記載 の方法。
(7) 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、（6)に記載の方法。
(8) 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来する 細胞である、（1)〜（7)の!/、ずれか 1項に記載の方法。
(9) 物質がペプチドである、（1)〜（8)のいずれか 1項に記載の方法。
(10) 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形 質転換細胞である、 (9)に記載の方法。
(11) ペプチドが糖蛋白質である、（9)または（10)に記載の方法。
(12) 糖蛋白質が抗体である、（11)に記載の方法。
(13) ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、（1)〜（； 12)のい ずれか 1項に記載の方法。
(14) ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、（1)〜（； 13)のいずれか 1項 に記載の方法。
(15) 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、（1)〜（； 14)のいずれか 1項に 記載の方法。
(16) 物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法にお いて、ジペプチドを添加して培養し、該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養 物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法。
(17) ジペプチドが L—グルタミンを含むジペプチドである、（16)に記載の方法。
(18) L—グルタミンを含むジペプチドが L—ァラニルー L—グルタミンである、（17) に記載の方法。
(19) ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、（18)に記載の方法。
(20) Lーチロシンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーチロシンである、（19)に 記載の方法。
(21) 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、（16)〜（20)のいずれ力、 1項に 記載の方法。
(22) 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、（21)に記載の方法。
(23) 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来す る細胞である、（16)〜（22)の!/、ずれか 1項に記載の方法。
(24) 物質がペプチドである、（16)〜（23)のいずれか 1項に記載の方法。
(25) 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形 質転換細胞である、 (24)に記載の方法。
(26) ペプチドが糖蛋白質である、（24)または（25)に記載の方法。
(27) 糖蛋白質が抗体である、（26)に記載の方法。 (28) ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、（16)〜（27)の いずれか 1項に記載の方法。
(29) ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、（16)〜（28)のいずれか 1 項に記載の方法。
(30) 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、（16)〜（29)のいずれか 1項に 記載の方法。
(31) 物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養すること を特徴とする、該細胞より生産される物質の細胞当たりの生産性を向上させる方法。
(32) ジペプチドが L グルタミンを含むジペプチドである、（31)に記載の方法。
(33) L—グルタミンを含むジペプチドが L ァラニルー L—グルタミンである、（32) に記載の方法。
(34) ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、（31)に記載の方法。
(35) Lーチロシンを含むジペプチドが L ァラニルー Lーチロシンである、（34)に 記載の方法。
(36) 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、（3；！)〜（35)のいずれ力、 1項に 記載の方法。
(37) 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、（36)に記載の方法。
(38) 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来す る細胞である、（3；！)〜（37)の!/、ずれか 1項に記載の方法。
(39) 物質がペプチドである、（3；！)〜（38)のいずれか 1項に記載の方法。
(40) 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形 質転換細胞である、 (39)に記載の方法。
(41) ペプチドが糖蛋白質である、（39)または (40)に記載の方法。
(42) 糖蛋白質が抗体である、（41)に記載の方法。
(43) ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、（31)〜（42)の いずれか 1項に記載の方法。
(44) ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、（3；！)〜（43)のいずれか 1 項に記載の方法。 (45) 培養方法が培養槽を用いた培養法である、（31)〜（44)のいずれ力、 1項に記 載の方法。
(46) 物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養すること を特徴とする、該細胞の生存率を維持させる方法。
(47) ジペプチドが L—グルタミンを含むジペプチドである、（46)に記載の方法。
(48) L—グルタミンを含むジペプチドが L—ァラニルー L—グルタミンである、（47) に記載の方法。
(49) ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、（46)に記載の方法。
(50) Lーチロシンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーチロシンである、（49)に 記載の方法。
(51) 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、（46)〜（50)のいずれ力、 1項に 記載の方法。
(52) 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、（51)に記載の方法。
(53) 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来す る細胞である、（46)〜（52)の!/、ずれか 1項に記載の方法。
(54) 物質がペプチドである、（46)〜（53)のいずれか 1項に記載の方法。
(55) 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形 質転換細胞である、 (54)に記載の方法。
(56) ペプチドが糖蛋白質である、（54)または（55)に記載の方法。
(57) 糖蛋白質が抗体である、（56)に記載の方法。
(58) ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、（46)〜（57)の いずれか 1項に記載の方法。
(59) ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、（46)〜（58)のいずれか 1 項に記載の方法。
(60) 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、（46)〜（59)のいずれか 1項に 記載の方法。
(61) 物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養すること を特徴とする、該細胞の培養液中におけるアンモニゥムイオン濃度の上昇を抑制さ せる方法。
(62) ジペプチドが L グルタミンを含むジペプチドである、（61)に記載の方法。
(63) L—グルタミンを含むジペプチドが L ァラニルー L—グルタミンである、（62) に記載の方法。
(64) ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、（61)に記載の方法。
(65) Lーチロシンを含むジペプチドが L ァラニルー Lーチロシンである、（64)に 記載の方法。
(66) 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、（6；！)〜（65)のいずれか 1項に 記載の方法。
(67) 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、 ½6)に記載の方法。
(68) 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来す る細胞である、（6；！)〜（67)の!/、ずれか 1項に記載の方法。
(69) 物質がペプチドである、（6；！)〜（68)のいずれか 1項に記載の方法。
(70) 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形 質転換細胞である、 (69)に記載の方法。
(71) ペプチドが糖蛋白質である、（69)または（70)に記載の方法。
(72) 糖蛋白質が抗体である、（71)に記載の方法。
(73) ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、（61)〜（72)の いずれか 1項に記載の方法。
(74) ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、（6；！)〜（73)のいずれか 1 項に記載の方法。
(75) 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、（61)〜（74)のいずれ力、 1項に 記載の方法。
(76) 物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養すること を特徴とする、該細胞の初期アポトーシスを抑制する方法。
(77) ジペプチドが L グルタミンを含むジペプチドである、（76)に記載の方法。
(78) L—グルタミンを含むジペプチドが L ァラニルー L—グルタミンである、（77) に記載の方法。 (79) ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、（76)に記載の方法。
(80) Lーチロシンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーチロシンである、（79)に 記載の方法。
(81) 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、（76)〜（80)のいずれ力、 1項に 記載の方法。
(82) 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、（81)に記載の方法。
(83) 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来す る細胞である、（76)〜（82)の!/、ずれか 1項に記載の方法。
(84) 物質がペプチドである、（76)〜（83)のいずれか 1項に記載の方法。
(85) 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形 質転換細胞である、 (84)に記載の方法。
(86) ペプチドが糖蛋白質である、（84)または（85)に記載の方法。
(87) 糖蛋白質が抗体である、（86)に記載の方法。
(88) ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、（76)〜（87)の いずれか 1項に記載の方法。
(89) ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、（76)〜（88)のいずれか 1 項に記載の方法。
(90) 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、（76)〜（89)のいずれか 1項に 記載の方法。
発明の効果
本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法において、ジぺプチ ドを添加して培養することを特徴とする物質を生産する能力を有する動物細胞の培 養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法に おいて、ジペプチドを添加して培養し、該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培 養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、物質を生産する能力 を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養することを特徴とする、該細胞より生 産される物質の細胞当たりの生産性を向上させる方法、物質を生産する能力を有す る動物細胞にジペプチドを添加して培養することを特徴とする、該細胞の生存率を維 持させる方法、物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養 することを特徴とする、該細胞の培養液中におけるアンモニゥムイオン濃度の上昇を 抑制させる方法、及び物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加し て培養することを特徴とする、該細胞のアポトーシスを抑制する方法を提供する。 図面の簡単な説明
[図 l]CHO細胞
Figure imgf000011_0001
BP— 8472)を用いた三角フラスコ でのバッチ培養を実施した時の、生細胞密度（細胞/ mL)の経時変化を図 1に示す 。図中の口は Gin培養を示し、國は AlaGln培養を示す。
[図 2]CHO細胞
Figure imgf000011_0002
BP— 8472)を用いた 2Lバイオリ アクターでのフエドバッチ培養を実施した時の、アンモニゥムイオン濃度（mmol/L) 、生存率（％)、生細胞密度（細胞/ mL)の経時変化を図 2に示す。図中の口は Gin Gin培養を示し、國は Gin— AlaGln培養を示す。
[図 3]CHO細胞 Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いた三角フラスコ でのフエドバツチ培養を実施した時の、生細胞密度（細胞/ mUの経時変化を図 3 に示す。図中の口は Gin— Gin培養を示し、♦は Gin— AlaGln培養を示し、國は A1 aGln— AlaGln培養を示す。
[図 4]CHO細胞 Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いた三角フラスコ でのフエドバツチ培養を実施した時の、蛋白濃度（mg/mL)、 SPR g/106細胞 /日）を図 4に示す。図中の口は Gin— Gin培養を示し、斜線は Gin— AlaGln培養 を示し、國は AlaGln— AlaGln培養を示す。
[図 5]CHO細胞 Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いた 2Lバイオリア クタ一でのフエドバッチ培養を実施した時の、生細胞密度（細胞 /mL)、アンモニゥ ムイオン濃度（mmol/L)の経時変化を図 5に示す。図中の口は Gin— Gin培養を示 し、♦は Gin— AlaGln培養を示し、國は AlaGln— AlaGln培養を示す。
[図 6]CHO細胞 Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いた 2Lバイオリア クタ一でのフエドバツチ培養を実施した時の、蛋白濃度（mg/L)、 SPR g/106 細胞/日）、初期アポトーシスの細胞の割合（％)を図 6に示す。図中の口は Gin— G In培養を示し、斜線は Gin— AlaGln培養を示し、國は AlaGln— AlaGln培養を示 す。
[図 7]CHO細胞 Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いた 2Lバイオリア クタ一でのフヱドバッチ培養を実施した時の、培養液中の L グルタミン濃度（mmol /L)、 L ァラニルー L グルタミン濃度（mmol/L)の経時変化を図 7に示す。図 中の♦は Gin— AlaGln培養を示し、國は AlaGln— AlaGln培養をそれぞれ示す。 また、図中の点線は L グルタミン濃度を示し、実線は L ァラニル一 L グルタミン 濃度をそれぞれ示す。
[図 8]CHO細胞 Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いた三角フラスコ でのフエドバツチ培養を実施した時の、 SPR g/106細胞/日）を図 8に示す。図 中の口は Tyr培養を示し、國は AlaTyr培養を示す。
[図 9]CHO細胞 Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いた三角フラスコ でのフエドバツチ培養を実施した時の、生細胞密度（細胞/ mUの経時変化を図 9 に示す。図中の♦は塩化アンモニゥム非添加の培養を示し、口は塩化アンモニゥム 1 Ommol/L添加の培養を示し、△は塩化アンモニゥム 20mmol/L添加の培養を示 し、 Xは塩化アンモニゥム 30mmol/L添加の培養を示し、 *は塩化アンモニゥム 40 mmol/L添加の培養を示し、〇は塩化アンモニゥム 50mmol/L添加の培養を示し 、 +は塩化アンモニゥム 60mmol/L添加の培養を示す。
[図 10]CHO細胞 Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いた三角フラス コでのフヱドバッチ培養を実施した時の、培養 4日目の比増殖速度 QT1)を図 10に 示す。図中の國は塩化アンモニゥム非添加の培養を示し、口は塩化アンモニゥム 10 mol/L、 20mol/L、 30mol/L、 40mol/L、 50mol/L、 60mol/L添カロの培 養をそれぞれ示す。
[図 l l]CHO細胞 Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いた 2Lバイオリ アクターでのフエドバツチ培養を実施した時の、生細胞密度（細胞/ mU、蛋白濃度 (mg/L)の経時変化を図 11に示す。図中の國は塩化アンモニゥム非添加の培養を 示し、□は塩化アンモニゥム 24mmol/L添加の培養を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法において、ジぺプチ ドを添加して培養することを特徴とする動物細胞の培養方法に関する。 本発明に用いるジペプチドとしては特に制限はないが、 L グルタミンを含むジぺ プチド、 Lーチロシンを含むジペプチド等が挙げられ、 L グルタミンを含むジぺプチ ドとしては、ァラニルグルタミンが好ましぐ L ァラニルー L—グルタミンが特に好まし い。また、 Lーチロシンを含むジペプチドとしては、ァラニルチロシンが好ましぐ L- ァラニル— L チロシンが特に好ましい。
[0011] L グルタミンを含むジペプチドは公知の合成法、酵素法または発酵法により製造 することが出来る。例えば、 L ァラニル一 L グルタミンを製造する方法としては、合 成法 [Organic Process Research & Development 5, 132 (2001)、特 開平 6— 234715]及び発酵法（WO2004/058960、 WO2006/001379)等力 S 挙げられる。
[0012] Lーチロシンを含むジペプチドも公知の合成法、酵素法、または発酵法により製造 することが出来る。例えば、 L ァラニル一 L チロシンを製造する方法としては、合 成法及び発酵法（WO2004/058960、 WO2006/001379)等力 S挙げられる。 ジペプチドを培地に添加する方法は特に制限はな!/、が、基本培地及び/またはフ イード培地に添加して、動物細胞を培養して!/、る培地に用いることが好まし!/、。
[0013] フィード培地として添加する場合は、ジペプチドを単独でフィード培地として培地へ 添加しても良!/、し、またジペプチドと他の培地成分とを予め混合されたフィード培地と して培地へ添加しても良い。また、フィード培地を分割して不連続に培地に添加して も良いし、フィード培地を連続して培地に添加しても良い。
培地中へ添加されるジペプチドの濃度は、培養に用いる動物細胞の種類、生産す る物質の種類、ジペプチドの種類、ジペプチドの添加時期などにより適宜選択すれ ば良いが、好ましくは終濃度 0. 01〜； 1000mmol/L、さらに好ましくは 0. 1 -500 mmol/L、特に好ましくは l〜100mmol/Lである。ジペプチドの終濃度とは培地 に添加した直後の培地中のジペプチドの濃度をいう。
[0014] ジペプチドの添加する時期については特に制限はないが、好ましくは対数増殖期、 特に好ましくは対数増殖期の前半に培地へ添加する。対数増殖期は培養する細胞 株、培養の制御方法によって異なる力 培養される細胞数が上昇した時点から培養 される細胞数が一定になる時点までの期間を指す。
フィード培地の保存方法としては、培地が無菌状態を保持する方法であれば特に 制限されないが、ステンレスタンク、デイスポーサブルバッグを用いる方法などが挙げ られる。
[0015] 本発明に用いられる培地としては、動物細胞の培養に用いることが出来ればいかな るものでも良く、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地が用いられる。予めグ ルタミン及び/またはチロシンを培地成分として含有していても良いし、また不含でも 良い。
例えば、血清含有培地、血清含有培地中に血清アルブミンや血清分画物等の動 物由来物を含まない培地、無血清培地、無蛋白質培地等、いずれの培地も用いられ る力 好ましくは無血清培地または無蛋白質培地を用いることが好ましい。
[0016] 本発明の方法において用いられる、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地 としては、例えば、 RPMI1640培地 [The Journal of the American Medical
Association, 199. 519 (1967) ]、 Eagleの MEM培地 [Science, 122. 5 01 (1952) ]、ダルベッコ改変 MEM (DMEM)培地 [Virology, 8, 396 (195 9) ]、 199培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine , 73, 1 (1950) ]、 F12培地（LTI社製） [Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 53, 288 (1965) ]、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM培地） ϋ· Experime ntal Medicine, 147. 923 (1978) ]、 EX— CELL™ 302培地（ジエーア一 ルェイチバイオサイエンス社製）またはこれらの改変培地や混合培地等が挙げられ、 好ましくは RPMI1640培地、 DMEM培地、 F12培地、 IMDM培地及び EX— CEL
L™ 302培地等が用いられる。
[0017] 無血清培地としては、基礎培地に、血清の代わりに生理活性物質、栄養因子、動 物細胞が資化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な栄養因子、生理活性物 質等を添加する。これらの添加物は、培養前にあらかじめ培地に含有させることが好 ましい。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等が挙げられる。 [0018] アミノ酸としては、 L ァラニン、 L アルギニン、 L ァスパラギン、 L ァスパラギ ン酸、 L—シスチン、 L—グルタミン酸、 L—グルタミン、グリシン、 L—ヒスチジン、 L - イソロイシン、 L一口イシン、 L—リジン、 L メチォニン、 L—フエニノレアラニン、 Lープ 口リン、 Lーセリン、 Lースレオニン、 L—トリプトファン、 Lーチロシン、 Lーバリン等があ げられ、 1種または 2種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩及び/または 水和物等の溶媒和物を用いても良!/、。
[0019] ビタミンとしては、 D ビォチン、 D パントテン酸、コリン、葉酸、 myo イノシトー ル、ナイァシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シァノコバラミン、 DL— a トコフエロール等が挙げられ、 1種または 2種以上組み合わせて用いられる。また 、これらの塩及び/または水和物等の溶媒和物を用いても良!/、。
生理活性物質としては、インシュリン、トランスフェリン、血清アルブミン、増殖因子を 含む血清分画物等が挙げられる。
[0020] 動物由来物を含まない培地において、動物由来物の代わりに添加される物質とし ては、遺伝子組換え法で製造された生理活性物質や、加水分解物または動物由来 物を含まなレ、脂質等が挙げられる。
加水分解物としては、大豆、小麦、米、えんどう豆、綿実または酵母抽出物等の加 水分解物等が挙げられる。
[0021] 動物由来物を含まない脂質としては、コレステロール、リノール酸、リノレイン酸等が 挙げられる。また、これらの塩及び/または水和物等の溶媒和物も含まれる。
無蛋白培地としては、 ADPF培地（Animal derived protein free medium ; ハイクローン社製）、 CD— Hybridoma培地（インビトロジェン社製）、 CD— CHO培 地 (インビトロジェン社製）、 IS— CD— CHO培地（アイエス社製）等があげられる。
[0022] 長期間または高密度で培養する場合は、アミノ酸及びビタミン等を高濃度に含有し た培地、例えば RPMI1640培地、 DMEM培地および F 12培地を 1： 1： 1の比率で 混合した培地、 DMEM培地および F12培地を 1： 1の比率で混合した培地、ハイブリ ドーマ SFM培地 (インビトロジェン社製）等が好適に用いられる。
本発明に用いられる物質を生産する能力を有する動物細胞としては、哺乳類、鳥 類、は虫類、両生類、魚類及び昆虫類のいずれかに属する細胞等、いずれを用いて も良いが、好ましくは哺乳類に属する動物細胞が用いられ、より好ましくはヒトまたは サル等の霊長類に由来する動物細胞またはマウス、ラットまたはハムスター等の齧歯 類に由来する動物細胞が用いられる。
[0023] 哺乳類に属する細胞としては、ミエローマ細胞またはミエローマ細胞に由来する細 胞、卵巣細胞、腎臓細胞、血球細胞、子宮細胞結合組織細胞、乳腺細胞または胚 性網膜芽細胞等が挙げられるが、特にミエローマ細胞またはミエローマ細胞に由来 する細胞及び卵巣細胞から選ばれる細胞が好ましい。また、生産される物質が抗体 である場合は、ハイプリドーマ等の抗体産生細胞であることが好ましい。
[0024] 哺乳類に属する細胞としては、例えば、ヒト細胞株である HL— 60 (ATCC CCL — 240)、 HT— 1080 (ATCC CCL— 121)、 HeLa (ATCC CCL— 2)、 293 (E CACC 85120602)、 Namalwa (ATCC CRL— 1432)、 Namalwa KJM— 1 ( Cytotechnology, 1, 151 (1988)、 NM— F9細胞（DSM ACC2605, WO05 /17130)および PER. C6細胞（ECACC No. 96022940、 US6855544)、サ ル細胞株である VERO (ATCC CCL— 1651)及び COS— 7 (ATCC CRL- 16 51)、マウス細胞株である C127I (ATCC CRL— 1616)、 Sp2/0— Agl4 (ATC C CRL— 1581)、 NIH3T3 (ATCC CRL— 1658)、 NS0 (ATCC CRL— 182 7)、ラット細胞株である Y3 Agl . 2. 3. (ATCC CRL 1631)、 YO (ECACC N o： 85110501)及び YB2/0 (ATCC CRL— 1662)、ハムスター細胞株である C HO— Kl (ATCC CCL— 61)、 CHO/dhfr— (ATCC CRL— 9096)、 CHO/ DG44 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) ]及び BHK 21 (ATCC CRL— 10)、ィヌ細胞である MDCK (ATCC CCL— 34)等が挙げら れる。鳥類に属する細胞としては、例えばニヮトリ細胞株 SL— 29 (ATCC CRL - 2 9)等、魚類に属する細胞としては、例えばゼブラフィッシュ細胞株 ZF4 (ATCC CR L 2050)等、昆虫穎に属する細胞 しては、例えば蛾（Spodoptera frugiperda )細胞株 Sf9 (ATCC CRL— 1711)等がそれぞれ挙げられる。また、ワクチン製造 に使用される初代培養細胞として、初代サル腎細胞、初代ゥサギ腎細胞、初代ニヮト リ胎児細胞、初代ゥズラ胎児細胞等が挙げられる。
[0025] ミエローマ細胞またはミエローマ細胞に由来する細胞としては、 Sp2/0— Agl4、 NS0、 Y3 Agl . 2. 3.、 YOまたは YB2/0等が挙げられる。卵巣細胞または卵巣 細胞に由来する細胞としては、 CHO— Kl、 CHO/dhfr_または CHO/DG44等 力 S挙げられる。また、腎臓細胞としては、 293、 VERO、 COS— 7、 BHK21または M DCK等が、血球細胞としては HL— 60、 Namalwa, Namalwa KJM— 1または N M— F9等が、子宮細胞としては HeLa等力 S、結合組織細胞としては HT— 1080また は NIH3T3等力 乳腺細胞としては C1271I等力 胚性網膜芽細胞としては PER. C6等が、それぞれ挙げられる。
[0026] 本発明に用いられる物質を生産する能力を有する動物細胞としては、物質の生産 に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された動物細胞、変異処理 を施して物質を産生するようになった細胞、または B細胞等の抗体産生細胞とミエ口 一マ細胞との融合細胞であるハイプリドーマ等が挙げられる。また、物質の発現量を 上昇させるような変異処理を施した動物細胞等も本発明の動物細胞に包含される。
[0027] 変異処理を施して物質を産生するようになった細胞としては、所望の物質を生産で きるようにするために蛋白質の修飾酵素などに変異が導入された細胞などが挙げら れ、例えば、所望の物質が糖蛋白質である場合には、蛋白質に結合する糖鎖の構 造を変化させるために、種々の糖鎖修飾酵素に変異が導入された細胞等が用いら れても良い。
物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された細胞は、 物質の生産に関与する DNAとプロモーターを含む組換え体ベクターを、上記の本 発明に用いられる動物細胞に導入することによって得られる。
[0028] 物質の生産に関与する DNAとしては、例えば、ペプチドなどの物質をコードする D NA、物質の生合成に関わる酵素または蛋白質をコードする DNA等を用いることが 出来る。
本発明の方法により製造される物質としては、動物細胞が生産できる物質であれば いずれでも良いが、哺乳類に属する動物細胞が生産出来る物質であることが好ましく 、例えば、ペプチド等が挙げられる。
[0029] ペプチド以外にも、本発明の方法により製造される物質としては、リボザィム等の生 体触媒分子、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、レシリン及びフイブ口イン等の構造の 形成/保持分子、痘瘡ワクチン、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、おた ふく風邪ワクチン、狂犬病ワクチン、水痘ワクチン、ゥシ流行熱ワクチン、イバラキ病ヮ クチン及びゥシ伝染性気管炎ワクチン等のワクチン、またはアデノウイルス、バキュ口 ウィルス等のウィルスが挙げられる。
[0030] 本発明の方法により製造されるペプチドとしては、真核細胞由来のペプチドが挙げ られ、好ましくは哺乳動物細胞由来のペプチドが挙げられる。また、生理活性を有す るペプチドが好ましい。本発明においてペプチドとしては、所望のペプチドが含まれ ていれば、いかなる形態でも良ぐ例えば、他のペプチドと融合させた融合ペプチド 等の人工的に改変されたペプチドであっても良いし、その部分断片であって良い。
[0031] また、本発明の方法により製造されるペプチドは、糖蛋白質を包含する。
糖蛋白質としては、具体的には、抗体、エリスロポイエチン（EPO) . Biol. Ch em. , 252. 5558 (1977) ]、トロンボポイエチン（ΤΡΟ) [Nature, 369. 533
(1994) ]組織型プラスミノーゲンァクチベータ（t— PA)、プロウ口キナーゼ、トロン ボモジュリン、アンチトロンビン、プロテインお血液凝固因子 VII、血液凝固因子 VIII 、血液凝固因子 IX、血液凝固因子 X、血液凝固因子 XI、血液凝固因子 XII、プロトロ ンビン複合体、フイブリノゲン、アルブミン、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン 、上皮増殖因子（EGF)、肝細胞増殖因子（HGF)、ケラチノサイト増殖因子、ァクチ ビン、骨形成因子、顆粒球コロニー刺激因子（G— CSF) U. Biol. Chem. , 25 8, 9017 (1983) ]、マクロファージコロニー刺激因子（M— CSF) . Exp. M ed. , 173, 269 (1992) ]などの幹細胞因子（SCF)、顆粒球 マクロファージ コロニー刺激因子（GM— CSF) . Biol. Chem. , 252, 1998 (1977) ] 、顆粒球—マクロファージコロニー刺激因子（GM— CSF) . Biol. Chem. , 25 2 1998 (1977) ]、インターフェロン α、インターフェロン /3、インターフェロン γ、 インターロイキン一 2 (IL— 2) [Science, 193, 1007 (1976) ]、インターロイキ ン 6、インターロイキン 10、インターロイキン 11、インターロイキン 12 (IL— 12) [J. Leuc. Biol. , 55, 280 (1994) ]、可溶性インターロイキン 4受容体、腫瘍壊 死因子 α、 Dnasel,ガラクトシダーゼ、 αダルコシダーゼ、ダルコセレブロシダーゼ、 ヘモグロビン、トランスフェリン、ハプトグロビン、卵胞刺激ホルモン、プロテイン S等、 及びこれらの糖蛋白質の部分断片が挙げられる。
[0032] 抗体としては、いかなる抗原結合性を有する抗体でもよいが、腫瘍関連抗原に結合 する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原に結合する抗体、循環器疾患に 関連する抗原に結合する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原に結合する抗体、ま たはウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原に結合する抗体であることが好ましく 、抗体のクラスは IgGであることが好ましい。
[0033] 本発明の方法により製造される抗体としては、抗体の一部分を含む断片などが包 含され、例えば、 Fab (Fragment of antigen bindingの略）、 Fab，、 F (ab，） 、
2 一本鎖抗体（single chain Fv ;以下、 scFvと称す）及びジスルフイド安定化抗体（ disulfide stabilized Fv;以下、 dsFvと称す）や、抗体の Fc領域を含む融合蛋白 質等が挙げられる。
[0034] また、抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイ プリドーマ細胞が分泌する抗体の他、遺伝子組換え技術により作製された抗体、す なわち、抗体遺伝子を揷入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより 取得された抗体等が挙げられる。具体的には、ハイプリドーマが生産する抗体、ヒト型 キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体等を挙げることが出来る。
[0035] ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域 (以下、重鎖は H鎖として 、可変領域は V領域として HVまたは VHともいう）及び抗体軽鎖可変領域 (以下、軽 鎖は L鎖として LVまたは VLともいう）とヒト抗体の重鎖定常領域 (以下、定常領域は C 領域として CHとも!/、う）及びヒト抗体の軽鎖定常領域 (以下、 CLとも!/、う）とからなる 抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ノ、ムスター、ラビットなど、ハ イブリドーマを作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることが出来る。
[0036] ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより VH及び VLを コードする cDNAを取得し、ヒト抗体 CH及びヒト抗体 CLをコードする遺伝子を有する 宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ揷入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し 、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することが出来る。
ヒト型キメラ抗体の CHとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、 hlgという）に属すればい かなるものでも良いが、 MgGクラスのものが好適であり、更に MgGクラスに属する hlg Gl、 MgG2、 MgG3、 MgG4といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また 、ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよぐ κクラスある いはえクラスのものを用いることが出来る。
[0037] ヒト化抗体としては、ヒト以外の動物の抗体の VH及び VLのヒト型相同性決定領域（ complementarity determining region:以下、 CDRという)のアミノ酸酉己歹 IJをヒト 抗体の VH及び VLの適切な位置に移植して作製された CDR移植抗体等が挙げら れる。
CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VH及び VLの CDR配列を任意のヒト 抗体の VH及び VLの CDR配列に移植した V領域をコードする cDNAを構築し、ヒト 抗体の CH及びヒト抗体の CLをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクター にそれぞれ揷入して CDR移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主 細胞へ導入することにより CDR移植抗体を発現させ、製造することが出来る。
[0038] CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すれば!/、かなるものでもよ!/、が、 hlgGクラ スのものが好適であり、さらに hlgGクラスに属する MgGl、 MgG2、 MgG3、 MgG4と いったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、 CDR移植抗体の CLとしては 、 hlgに属すればいかなるものでも良ぐ κクラスまたはえクラスのものを用いることが 出来る。
[0039] 本発明の方法により製造される抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられる 。腫瘍関連抗原に結合する抗体としては、抗 GD2抗体 [Anticancer Res. , 13, d31 (1993) ]、 JTLGD3JTL体 [Cancer Immunol. Immunother. , dり, 26 0 (1993)]、抗 GM2抗体 [Cancer Res. , 54, 1511 (1994) ]、抗 HER2抗 体 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 (1992) ]、抗 CD52抗体 [Nat ure, 332, 323 (1988) ]、抗 MAGE抗体（British J. Cancer, 83, 493
(2000)]、抗 HM1. 24抗体 [Molecular Immunol. , 36, 387 (1999)]、 抗副甲状腺ホルモン関連蛋白 PTHrP抗体 [Cancer, 88, 2909 (2000)]、抗 FGF8抗体 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911 (1989)]抗塩 基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗 FGF8受容体抗体 Biol. Chem. , 265 , 16455 (1990)]、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様 増殖因子抗体、抗インスリン様増殖因子受容体抗体 Neurosci. Res. ， 40 , 647 (1995)]、抗 PMSA抗体 Urology, 160, 2396 (1998)]、抗 血管内皮細胞増殖因子抗体 [Cancer Res. , 57, 4593 (1997)]、抗血管内 皮細胞増殖因子受容体抗体 [Oncogene, 19, 2138 (2000) ]、抗 CA125抗 体、抗 17— 1A抗体、抗インテグリン 3抗体、抗 CD33抗体、抗 CD22抗体、抗 HLA抗体、抗 HLA— DR抗体、抗 CD20抗体、抗 CD19抗体、抗 EGF受容体抗体 [Immunology Today, 21, 40ό (2000) ]、 i CDlOi 体 [American Jour nal of Clinical Pathology, 113, 374 (2000) ]、抗 PERP抗体、抗 HB— EGF抗体等が挙げられる。
[0040] アレルギーあるいは炎症に関連する抗原に結合する抗体としては、抗インターロイ キン 6抗体 [Immunol. Rev. , 127. 5 (1992) ]、抗インターロイキン 6受容体抗体 [ Molecular Immunol. , 31, 371 (1994) ]、抗インターロイキン 5抗体 [Immunol . Rev. , 127. 5(1992)]、抗インターロイキン 5受容体抗体、抗インターロイキン 4 抗体 [Cytokine, 3, 562 (1991) ]、抗インターロイキン 4受容体抗体 Qj. Immunol • Meth. , 2Γ7, 41(1998)]、抗腫瘍壊死因子抗体 [Hybridoma, 13, 183(199 4)]、抗腫瘍壊死因子受容体抗体 [Molecular Pharmacol. , 58, 237(2000)] 、抗 CCR4抗体 [Nature, 400. 776 (1999) ]、抗ケモカイン抗体 Immunol. M eth. , 174. 249(1994)]、抗ケモカイン受容体抗体 Exp. Med. , 186. 1373 (1997)]、抗 IgE抗体、抗 CD23抗体、抗 CDlla抗体 [Immunology Today, 2 1, 403 (2000)]、抗 CRTH2抗体 Immunol. , 162, 1278 (1999)] 、抗 CCR8抗体（W〇99/25734)、抗 CCR3抗体（US6207155)等力 S挙げられる
〇
[0041] 循環器疾患に関連する抗原に結合する抗体としては、抗 GpIIb/lIIa抗体 Im munol. , 152, 2968 (1994) ]、抗血小板由来増殖因子抗体 [Science, 25 3, 1129 (1991)]、抗血小板由来増殖因子受容体抗体 Biol. Chem. , 272, 17400 (1997)]または抗血液凝固因子抗体 [Circulation, 101, 115 8 (2000)]等が挙げられる。
[0042] 自己免疫疾患に関連する抗原に結合する抗体としては、抗自己 DNA抗体 [Immu nol. Letters, 72, 61 (2000) ]、抗 CD1 la抗体、抗 ICAM3抗体、抗 CD80 抗体、抗 CD2抗体、抗 CD3抗体、抗 CD4抗体、抗インテグリン α 4 /3 7抗体、抗 CD 40L抗体、抗 IL 2受容体抗体 [Immunology Today, 21 , 403 (2000) ]な どが挙げられる。
[0043] ウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原に結合する抗体としては、抗 gpl20抗 体 [Structure, 8, 385 (2000) ]、抗 CD4抗体 . Rheumatology, 25, 2065 (1998) ]、抗 CCR4抗体、抗ベロ毒素抗体 . Clin. Microbiol. , 37 ， 396 (1999) ]等が挙げられる。
[0044] 生理活性を有するペプチドとしては、例えば、上記の糖蛋白質の部分断片のうち、 該糖蛋白質の活性を維持しているペプチド等が挙げられる。また、糖蛋白質が酵素 である場合には、酵素活性を調節するペプチドまたは酵素の構造を保持するぺプチ ド等も包含される。酵素の活性を調節するペプチドとしては、例えば、糖蛋白質のァ ゴニストまたはアンタゴニストとして機能するペプチド等が好ましく用いられる。ァゴニ ストとしては、糖蛋白質の活性を亢進する活性を有するペプチドであればいかなるも のでも良ぐ具体的には、ソマトスタチン誘導体、ソマトロビン、心房性ナトリウム利尿 ペプチド、グルカゴン、インスリン、インスリン様成長因子、性腺刺激ホルモン等があ げられる。アンタゴニストとしては、糖蛋白質の活性を抑制する活性を有するペプチド であればいかなるものでも良ぐ具体的には、ぺグビソマトン等があげられる。
[0045] 上記の生理活性を有するペプチドを産生する場合に用いられる動物細胞としては 、上記のペプチドが産生出来ればいずれの動物細胞でも良いが、好ましくは産生す るペプチドをコードする遺伝子を有するベクターが導入された形質転換体が用いら れる。
ペプチドをコードする遺伝子を有するベクターが導入された形質転換された細胞は 、ペプチドをコードする DNAとプロモーターを含む組換え体ベクターを、宿主細胞に 導人することによって得られる。
[0046] 宿主細胞としては、上記の物質を生産する能力を有する動物細胞が用いられる。
該組換え体ベクターを調製するために用いられるベクターとしては、本発明で用い る動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが出来、例えば、 pcDNA I、 pcDM8 (フナコシ社製）、 pAGE107 [特開平 3— 22979号、 Cytotechnology, 3, 133 (1990) ]、 pAS3— 3 (特開平 2— 227075号）、 pcDM8 [Nature, 3 29, 840 (1987) ]、 pcDNAl/Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen 社製）、 PAGE103 U. Biochem. , 101 , 1307 (1987) ]、 pAGE210等力 S挙 げられる。
[0047] プロモーターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいず れも用いることが出来、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate earl y)遺伝子のプロモーター、 SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター 、メタ口チォネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等が 挙げられる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサ一等をプロモーターと共に用い ても良い。
[0048] 宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、当該細胞に DNAを導入す る方法であればいずれも用いることが出来、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytot echnology, 3, 133 (1990) ]、リン酸カルシウム法（特開平 2— 227075)、リポ フエクシヨン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)、Vir ology, 52, 456 (1973) ]等が挙げられる。
[0049] 本発明に用いられる形質転換細胞としては、具体的には、抗 GD3ヒト型キメラ抗体 を生産する形質転換細胞 7— 9 51 (FERM BP— 6691)、抗 CCR4キメラ抗体を 生産する形質転換細胞 KM2760 (FERM BP— 7054)、抗 CCR4ヒト化抗体を生 産する形質転換細胞 KM8759 (FERM BP— 8129)および KM8760 (FERM B P— 8130)、 709 LCA— 500D株（FERM BP— 8239)、抗 IL— 5受容体 α鎖キ メラ抗体を生産する形質転換細胞 ΚΜ7399 (FERM BP— 5649)、抗 IL 5受容 体 α鎖ヒト型 CDR移植抗体を生産する形質転換細胞 ΚΜ8399 (FERM BP 56 48)及び KM9399 (FERM BP— 5647)、抗 GM2ヒト型 CDR移植抗体を生産す る形質転換細胞 KM8966 (FERM BP— 5105)、 KM8967 (FERM BP— 5106 )、 KM8969 (FERM BP— 5527)、 KM8970 (FERM BP— 5528)、抗 CD20 抗体を生産する形質転換株 Ms704— CD20 (FERM BP— 10092)及びアンチト ロンビンを生産する形質転換細胞Ms705 pKAN—ATΠI (FERM BP— 8472) 等が挙げられる。
[0050] 動物細胞を培養する方法としては、バッチ培養、リピートバッチ培養、フエドバッチ 培養またはパーフュージョン培養等、いかなる培養方法を用いても良いが、好ましく はフエドバッチ培養が用いられる。また、培養量としては、三角フラスコ等を用いた通 常 10〜； !OOOmLの少量の培養量でも、ジャー等の培養槽等を用いた通常;!〜 200 OOLの商用生産に用いることが出来る大量の培養量でも、いかなる培養量でも良い 1S ジャーを用いた培養量が好ましい。
[0051] 本発明において用いられる培養方法は、用いる動物細胞に適した方法であればい ずれでも良いが、通常 pH6〜8、 30〜40°Cなどの条件下で 3〜20日間、パーフュー ジョン培養では 3〜60日間行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシン、ぺニ シリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。なお、溶存酸素濃度制御、 pH制御、 温度制御、攪拌等は通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことが出 来る。
[0052] 上記のようにして、ジペプチドを添加した培地中で、物質を生産する能力を有する 動物細胞を培養し、培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採 取することにより、該物質を効率的に製造することが出来る。
物質がペプチドである場合、本発明の製造方法としては、宿主細胞内にペプチドを 生産させる直接発現方法、ある!/、は宿主細胞外にペプチドを分泌生産させる方法（ モレキュラー ·クローニング第 2版）等が挙げられる。
[0053] ペプチドは、ポールソンらの方法 . Biol. Chem. , 264, 17619 (1989) ]、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、 G enes Develop. , 4, 1288 (1990) ]、または特開平 5— 336963あるいは WO 94/23021等に記載の方法を利用することにより、宿主細胞外へ積極的に分泌さ せることが出来る。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、所望のペプチドの N末 端にシグナルペプチドを結合させた形で発現させることにより、所望のペプチドを宿 主細胞外に積極的に分泌させることが出来る。
[0054] また、特開平 2— 227075に記載されている、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用 いた遺伝子増幅系を利用することにより、所望のペプチドの生産量を上昇させること も出来る。
本発明の方法により製造される所望のペプチドは、例えば、通常のペプチドの単離 精製法等を用いて単離精製することが出来る。
[0055] 本発明の方法により製造されるペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には 、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕 機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等を用いて細胞を破 砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清 から、通常のペプチドの単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱 塩法、有機溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル (DEAE)—セファロースあるい は DIAION HPA- 75 (三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマト グラフィ一法、 S—セファロース FF (フアルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン 交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロースあるいはフエ二ルセファロース等のレジ ンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、プロテイン Aを 用いたァフィ二ティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法または等電点電 気泳動等の電気泳動法、等を、単独あるいは組み合わせて用いることにより、粗精製 標品または精製標品を得ることが出来る。
[0056] 本発明の方法により製造されるペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上 清に該ペプチドを回収することが出来る。すなわち、該培養物を上記と同様の遠心 分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と 同様の単離精製法を用いることにより、粗精製標品または精製標品を得ることが出来 また本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞に、ジペプチドを添加して、 培養することを特徴とする、該細胞より生産される物質の細胞当たりの生産性を向上 させる方法に関する。本発明において、動物細胞により生産される物質の細胞当たり の生産性が向上していることは、物質の比生産速度（SPR)を求めることにより確認す ること力 S出来る。
[0057] 物質の比生産速度は、物質を生産する細胞あたりの生産される物質量をいう。具体 的には、培養期間を通して生産された物質量を、培養期間中に生存していた物質を 生産する細胞数で除することにより、求めること力 Sできる。
また本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞に、ジペプチドを添加して、 培養することを特徴とする、該細胞の生存率を維持する方法に関する。細胞の生存 率は、経時的に培地中の細胞を採取し、生細胞密度を測定し、生細胞密度に 100を 乗じることにより求めること力 S出来る。生細胞密度はトリパンブルー溶液等を用いた色 素お除法 [Culture of Animal Cells ： A Manual oi Basic Technique, R. Ian Freshney, Alan R. Liss, Inc. , New York (1983) ]等によ り求めることが出来る。
[0058] また本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培 養することを特徴とする、該細胞の培養液中におけるアンモニゥムイオン濃度の上昇 を抑制させる方法に関する。培養液中のアンモユウムイオン濃度は、経時的に培養 液を採取し、 BioProfile 400 (登録商標：ノバ'バイオメディカル社製）等の電位差 測定法を用いて測定することが出来る。
[0059] さらに本発明は、物質を生産する能力を有する動物細胞に、ジペプチドを添加して 、培養することを特徴とする、該細胞のアポトーシスを抑制する方法に関する。本発 明において、アポトーシスとしては初期アポトーシスも含む。初期アポトーシスの細胞 の割合は、 Guava PCA— 96 Nexin Kit (GEヘルスケアバイオサイエンス社製） 等の、通常は細胞膜の内側に存在し、アポトーシス反応が起こると外側に表出するフ ォスファチジルセリンを検出するァネキシン Vと膜の透過性により死細胞を検出する 7 -ァミノ一ァクチノマイシン（7—ADD)を含む試薬キット等を用レ、て、採取した培養 液中の細胞を染色した後、 Guava EasyCyte Plus (GEヘルスケアバイオサイェン ス社製）等のキヤビラリーサイトメーター等で初期アポトーシスの細胞を検出し、求め ること力 S出来る。
[0060] 以下の実施例により本発明をより具体的に説明する力 実施例は本発明の単なる 例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例 1
[0061] 250mL三角フラスコでのアンチトロンビン産生 CHO細胞 Ms705/AT— III株の 培養における L グルタミン添加培地と L ァラニルー L グルタミン添加培地との比 較
アンチトロンビンを生産する Ms705/AT III株（FERM BP 8472)株を用い て、 250mL三角フラスコでのバッチ培養を行い、 L—グルタミンを含有する培地と L ァラニルー L グルタミンを含有する培地との効果を比較した。
[0062] 培養の基礎培地としては、 EX— CELL™ 302培地（ジエーアールエイチバイオサ ィエンス社製)からグルタミンを排除した培地（以下、改変 EX—CELL™302培地と 称す）を用いた。初期培地としては、基礎培地に Methotrexate (以下、 MTXと称す ) 500nmol/L (シグマ アルドリッチ社製）及び L—グルタミン 12mmol/L (和光純 薬社製）または L ァラニル— L グルタミン 12mmol/L (マルキンバイオ社製）を添 カロした培地を用いた。以下、本実施例において、 L グルタミンを培地に添加した培 養を「Gln培養」、また L ァラニル— L グルタミンを培地に添加した培養を「AlaGl n培養」と称することとする。
[0063] 拡大培養を行う培地としては、 EX— CELL™ 302培地（ジエーアールエイチバイ ォサイエンス社製）に MTX500nmol/L (シグマアルドリッチ社製）及び Lーグルタミ ン 0· 875g/L (和光純薬社製）を添加した培地を用いた。
125mL、 250mL、 lOOOmL容量三角フラスコ（コーユング社製）に約 10〜30%培 地量で、 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞懸濁液を播種した。その後、 35°Cで 4日 間培養し、本培養の播種に必要な細胞数が獲得されるまで複数回継代した。
[0064] 拡大培養により充分な細胞数を獲得したところで、下記の培地 30mLを満たした 25 OmL三角フラスコ（コーユング社製）に 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞を播種した 。実測値は Gin培養においては 2. 5 X 105細胞/ mL、 AlaGln培養においては 2. 6 X 105細胞/ mLであった。
その後 37°C、 100rpm、 5% COを吹き込んで培養を開始した。
2
[0065] 培養開始時、培養 1日目に試料を採取し、生細胞密度（細胞/ mUを測定した。
生細胞密度は 0. 4%トリパンブルー溶液 (インビトロジェン社製）を用いた色素排除 法で測定した。
生細胞密度と経過時間の積の総和で累積生細胞密度を示した。累積生細胞密度 は式 1に示す方法に基づき算出した。 [0066] (式 1)
累積生細胞密度（細胞/ mL X日） =経過時間の初めと終わりの生細胞密度の和（ 細胞/ mL) ÷ 2 X経過時間（日 )の総和
その結果を図 1に示す。培養 1日目の到達生細胞密度は、 Gin培養においては 5. O X 105細胞/ mLに対して、 AlaGln培養においては 3. 3 X 105細胞/ mLであった 。累積生細胞密度は Gin培養を 100%とした場合、 AlaGln培養は 78. 7%であった
〇
[0067] 以上の結果より、 Ms705/AT— III細胞の培養開始時において、 L グルタミンを 培地に添加した培養に比べて、 L ァラニルー L—グルタミンを培地に添加した培養 の細胞生存率および累積生細胞密度は低下することが判明した。
実施例 2
[0068] 2Lバイオリアクターによるアンチトロンビン産生 CHO細胞 Ms705/AT III株の 培養における L -グルタミン添加培地と L -ァラニル L グルタミン添加培地の比 較
アンチトロンビンを生産する Ms705/AT III株（FERM BP 8472)株を用い て、 2Lバイオリアクターでのフエドバッチ培養を行い、 L—グルタミンを含有する培地 と L ァラニルー L グルタミンを含有する培地との効果を比較した。
[0069] 本培養までの拡大培養用培地には、 EX— CELL™ 302培地（ジエーアールエイ チバイオサイエンス社製）培地に、 MTX500nmol/L (シグマ アルドリッチ社製） 及び L グルタミン 0· 875g/L (和光純薬社製）添加した培地を用いた。 125mL、 2 50mLまたは lOOOmL容量の三角フラスコ（コーユング社製）に約 10〜30%量の培 地を入れ、 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞懸濁液を播種した。 35°Cで 4日間培 養し、本培養の播種に必要な細胞数が獲得されるまで複数回継代を行った。
[0070] 拡大培養により充分な細胞数を獲得したところで、下記の基本培地 600mLを満た した 2L容量バイオリアクター（エイブル社製）に 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞を 播種した。
培養の基本培地には、 EX-CELL™ 302培地（ジエーアールエイチバイオサイ エンス社製）からグルタミンを除いた改変培地に、 MTX500nmol/L (シグマ アル ドリツチ社製)及び L—グルタミン 1. 75g/L (和光純薬社製）を添加した培地を用い た。
[0071] フィード培地には、アミノ酸 [ (L ァラニン 0· 14g/L、 L アルギニン一塩酸 0· 47 g/L、 Lーァスパラギン一水和物 0· 16g/L、 L—シスチン二塩酸 0· 51g/L、L— グルタミン酸 0. 42g/L、 L ヒスチジン一塩酸二水和物 0. 24g/L、 L イソ口イシ ン 0. 59g/L、 L ロイシン 0. 59g/L、 L リジン一塩酸 0. 82g/:L、： L フエニル ラニン 0. 37g /し、 L プロリン 0. 22g /し、 Lーセリン 0. 24g /し、 L スレ才ニン 0. 53g/L、： L トリプトファン 0. 7g/L、 L チロシンニナトリウム二水和物 0. 58g /L、 L バリン 0· 53g/L (以上、シグマ-アルドリッチ社製）、 L ァスパラギン酸 0· 17g/L、グリシン 0· 17g/L (以上、和光純薬工業社製）、 L メチォニン 0· 17g/ L (純正化学社製)及び L グルタミン 7. 3g/L (和光純薬工業社製）または L ァラ ニル一 L グルタミン 10. 9g/L (協和発酵工業社製）]、ビタミン [D ビォチン 0. 0 73mg/L、 D パントテン酸カルシウム 0. 022g/L、塩化コリン 0· 022g/L、葉酸 0. 022g/L、 myo イノシトーノレ 0. 040g/L、ナイァシンアミド 0. 022g/L、ピリド キサール塩酸 0. 022g/L、リボフラビン 0. 0022g/L、チアミン塩酸 0. 022g/L、 シァノコバラミン 0· 073mg/L (以上、シグマ一アルドリッチ社製）]、リコンビナントヒ トインスリン 0· 31g/L (ジエーアールエイチバイオサイエンス社製）、エタノールアミ ン 0· 025g/L (シグマーァノレドリツチ社製）、 2 メノレカプトエタノーノレ 0· 0098g/:L (シグマ—アルドリッチ社製）、大豆加水分解物 HY— SOY8g/L (クウェストインター ナショナル社製）、亜セレン酸ナトリウム 16· 8 g/L (シグマ アルドリッチ社製）、コ レステロール脂質濃縮溶液 2mL/L (250 X水溶液、インビトロジェン社製）、ェチレ ンジァミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩 0· 05g/L (シグマ—アルドリッチ社製）及びグ ルコース 45g/L (和光純薬工業社製)からなる培地をそれぞれ用いた (以下、実施 例にお!/、て、基本培地及びフィード培地に L グルタミンを添加した培養を「Gln— G In培養」、また基本培地及びフィード培地に L ァラニルー L グルタミンをフィード 培地に添加した培養を「Gln— AlaGln培養」と称することとする）。
[0072] 培養開始から対数増殖期間内である培養開始後 3、 5、 6、 7、 8及び 9日目にそれ ぞれ初発培地量の 6· 3%量のフィード培地をそれぞれ添加した。 培養開始後 1日目の到達細胞密度は Gin— Gin培養で 3. 0 X 105細胞/ mL、 G1 n—AlaGln培養で 3. 4 X 105細胞/ mLであった。その後、それぞれグルタミンまた は L—ァラニルー L—グルタミンを含むフィード培地を添加して 35°C、 85rpm、 pH7 . 1で 14日間培養した。
[0073] 培養開始から培養終了まで、培養液を毎日採取し、生細胞密度（細胞/ mL)、蛋 白濃度 (mg/L)およびアンモニゥムイオン濃度 (mmol/L)を測定した。
生細胞密度は実施例 1と同様の方法で測定した。本実施例においては生細胞密 度を培養開始から 14日目まで毎日測定し、累積生細胞密度は測定した生細胞密度 を使用して実施例 1記載の式 1より算出した。
[0074] 蛋白濃度は HPLCによって測定した。カラムとして、 PA ID Sensor Cartridge ( アプライドバイォシステムズ社製）、また、検出器として L— 7400 (検出波長 280nm、 日立製作所製)をそれぞれ用いた。
アンモニゥムイオン濃度は BioProfile 400 (登録商標：ノバ'バイオメディカル社製
)によって測定した。
[0075] 単位時間当たりに単位細胞が生産する蛋白量を表す SPRは測定した蛋白濃度と 算出した累積生細胞密度を使用して以下の式 2より算出した。
(式 2)
SPR g/106細胞/日） =蛋白濃度 (mg/L) ÷累積生細胞密度（106細胞/ mL X日）
その結果を図 2に示す。いずれのフィード培地を用いた培養においても生存率は 培養開始から培養 9日目まで共に 90%以上であった。培養 10日目の Gin— Gin培 養では細胞の生存率が 59%であったのに対し、 Gin— AlaGln培養では細胞の生存 率が 95%と高かった。
[0076] 最大の到達生細胞密度は、いずれのフィード培地を用いた培養においても 1. 0 X 107細胞/ mL以上であった。累積生細胞密度は、 Gin— Gin培養では 9. 7 X 107細 胞/ mL X日、 Gin— AlaGln培養では 9. 3 X 107細胞/ mL X日とほぼ同等であつ た。培養 4日目力、ら 12日目において、アンモニゥムイオン濃度は、 Gin— Gin培養で はほぼ 6mmol/Lに対して、 011—八1&011培養では311111101/しまで低下し、 Lーァ ラニルー L—グルタミンが添加されたフィード培地を用いた場合には培地中のアンモ ニゥムイオン濃度が低減されることが明らかとなった。また、蛋白濃度は、 Gin -Gin 培養での値を 100%とすると、 Gln—AlaGln培養では 131 %と増大した。 SPRは G1 n - Gin培養での値を 100%とすると、 Gin— AlaGln培養では 121 %と増大した。
[0077] 以上から、 L ァラニルー L—グルタミンを添加したフィード培地を用いた培養は、 グルタミンを添加したフィード培地を用いた培養に比べて、生産細胞の生存率を維持 したまま、アンチトロンビンの生産細胞当たりの生産性が向上することが明らかとなつ た。
実施例 3
[0078] 250mL三角フラスコによる抗 CD20抗体産生 CHO細胞 Ms704/CD20株の培 養における L グルタミン添加培地と L -ァラニル L グルタミン添加培地との比較 抗 CD20抗体を生産する Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いて、 2 50mL三角フラスコでのフエドバッチ培養を行い、 L—グルタミンを含有する培地と L ァラニルー L グルタミンを含有する培地との効果を比較した。
[0079] 本培養までの拡大培養用培地には、 EX— CELL™ 302培地（ジエーアールエイ チバイオサイエンス社製）培地に、 MTX500nmol/L (シグマ アルドリッチ社製）、 L グルタミン 1 · 75g/L (和光純薬社製）を添加した培地を用いた。 125mL、 250 mL、 500mLまたは lOOOmL容量の三角フラスコ（コーユング社製）に約 20%量の 培地を入れ、 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞懸濁液を播種した。 35°Cで 4日間 培養し、本培養の播種に必要な細胞数が獲得されるまで複数回継代した。
[0080] 拡大培養により充分な細胞数を獲得したところで、下記の基本培地 40mLを満たし た 250mL三角フラスコ（コーユング社製）に 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞を播 種した。その後 35°C、 100rpm、 pH7. 1で 14日間培養した。
培養の基本培地には、実施例 2で用いた改変 EX— CELL™ 302培地に、 MTX 500 nmol/L (シグマ アルドリッチ社製）及び L—グルタミン 0· 87g/L (和光純 薬社製）または L ァラニルー L グルタミン 1 · 30g/L (協和発酵工業社製）を添加 した培地を用いた。
[0081] フィード培地には、アミノ酸 [L ァラニン 0· 14g/L、 L アルギニン一塩酸 0· 47 g/L、 Lーァスパラギン一水和物 0· 16g/L、 L—シスチン二塩酸 0· 51g/L、L— グルタミン酸 0. 42g/L、 L ヒスチジン一塩酸二水和物 0. 24g/L、 L イソ口イシ ン 0. 59g/L、 L ロイシン 0. 59g/L、 L リジン一塩酸 0. 82g/:L、： L フエニル ラニン 0. 37g /し、 L プロリン 0. 22g /し、 Lーセリン 0. 24g /し、 L スレ才ニン 0. 53g/L、： L トリプトファン 0. 19g/:L、 L チロシンニナトリウム二水和物 0. 58g /L、 L バリン 0· 53g/L (以上、シグマ-アルドリッチ社製）、 L ァスパラギン酸 0· 17g/L、グリシン 0· 17g/L (以上、和光純薬工業社製）、 L メチォニン 0· 17g/ L (純正化学社製)及び L グルタミン 7. 3g/L (和光純薬工業社製）または L ァラ ニル一 L グルタミン 10. 9g/L (協和発酵工業社製）]、ビタミン [D ビォチン 0. 0 73mg/L、 D パントテン酸カルシウム 0. 022g/L、塩化コリン 0· 022g/L、葉酸 0. 022g/L、 myo イノシトーノレ 0. 040g/L、ナイァシンアミド 0. 022g/L、ピリド キサール塩酸 0. 022g/L、リボフラビン 0. 0022g/L、チアミン塩酸 0. 022g/L、 シァノコバラミン 0· 073mg/L (以上、シグマ一アルドリッチ社製）]、リコンビナントヒ トインスリン 0· 31g/L (ジエーアールエイチバイオサイエンス社製）、エタノールアミ ン 0· 025g/L (シグマーァノレドリツチ社製）、 2 メノレカプトエタノーノレ 0· 0098g/:L (シグマ—アルドリッチ社製）、大豆加水分解物 HY— SOY8g/L (クウェストインター ナショナル社製）、亜セレン酸ナトリウム 16· 8 g/L (シグマ アルドリッチ社製）、コ レステロール脂質濃縮溶液 2mL/L (250 X水溶液、インビトロジェン社製）、ェチレ ンジァミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩 0· 05g/L (シグマ—アルドリッチ社製）及びグ ルコース 4g/L (和光純薬工業社製)からなる培地をそれぞれ用いた (以下、実施例 において、基本培地及びフィード培地に L ァラニルー L グルタミンを添加した培 養を「AlaGln—AlaGln培養」と称することとする）。
[0082] 培養開始から対数増殖期間内である培養 4、 6、 9及び 11日目にそれぞれ基本培 地量の 6. 25%量のフィード培地を添加した。
培養液を培養 1、 3、 4、 7、 10、 12及び 14日目に採取し、生細胞密度（細胞/ mL )、蛋白濃度 (mg/L)及びアンモニゥムイオン濃度 (mmol/L)を測定した。
[0083] 生細胞密度は実施例 1と同様の方法で測定した。
蛋白濃度及びアンモユウム濃度は実施例 2と同様の方法でそれぞれ測定した。 また、累積生細胞密度（細胞/ mL X日）と SPR g/106細胞/日）を以下の方 法で算出した。
累積生細胞密度は測定した生細胞密度を使用して実施例 1記載の式 1より算出し た。
[0084] SPRは測定した蛋白濃度と算出した累積生細胞密度を使用して実施例 2記載の式
2より算出した。
その結果を図 3及び図 4に示す。生存率はいずれの培養にいても、培養開始から 培養 7日目まで 95%以上の良好な値を示した。最大の到達生細胞密度は、いずれ の培養においても、 4. 5 X 106細胞/ mLを越える良好な増殖を示した。一方、培止 時のアンモニゥムイオン濃度は、 Gin— Gin培養では 12. lmmol/Lであったのに 対して、 Gln—AlaGln培養では 7· 4mmol/L、 AlaGln—AlaGln培養では 5· 2m mol/Lであり、 L ァラニルー L—グルタミンの培地への添加により、アンモニゥムィ オン濃度が低減した。 14日間の累積生細胞密度は Gin— Gin培養では 2. 6 X 107 細胞/ mL X日、 Gin— AlaGln培養では 3· 9 X 107細胞/ mL X日、 AlaGln— Ala Gin培養では 3· O X 107細胞/ mL X日となり、フィード培地にのみ L ァラニルー L グルタミンの添加を行った際に最も高い値を示した。蛋白濃度は Gin— Gin培養で の値を 100%とすると、 Gin— AlaGln培養では 180%、 AlaGln— AlaGln培養では 194%と、 L ァラニルー L グルタミンの添加により増大した。 SPRは Gin— Gin培 養での値を 100%とすると、 Gin— AlaGln培養では 120%、 AlaGln— AlaGln培養 では 167%と、 L ァラニルー L—グルタミンの添加により増大した。
[0085] 以上から、 Lーグノレタミンよりも L ァラニルー Lーグノレタミンの方力 培地に添加す ることで、培養液中のアンモニゥムイオン濃度を低減し、また、生細胞密度、蛋白濃 度及び SPRがより向上することが明ら力、となった。
実施例 4
[0086] 2Lバイオリアクターによる抗 CD20抗体産生 CHO細胞 Ms704/CD20株の培 養における L グルタミン添加培地と L -ァラニル L グルタミン添加培地との比較 抗 CD20抗体を生産する Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いて、 2 Lバイオリアクターでのフエドバッチ培養を行い、 L—グルタミンを含有する培地と L— ァラニルー L グルタミンを含有する培地との効果を比較した。
[0087] 本培養までの拡大培養用培地には、 EX— CELL™ 302培地（ジエーアールエイ チバイオサイエンス社製）培地に MTX500nmol/L (シグマ アルドリッチ社製）、 L —グルタミン 1. 75g/L (和光純薬社製）を添加した培地を用いた。 125mL、 250m L、 500mLまたは lOOOmL容量の三角フラスコ（コーユング社製）に約 20%量の培 地を入れ、 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞懸濁液を播種した。 35°Cで 4日間培 養し、本培養の播種に必要な細胞数が獲得されるまで複数回継代した。
[0088] 拡大培養により充分な細胞数を獲得したところで、下記の基本培地 600mLを満た した 2L容量バイオリアクター（エイブル社製）に 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞を 播種した。
培養の基本培地には、実施例 2で用いた、改変 EX— CELL™ 302培地に、 MT X500nmol/L (シグマ アルドリッチ社製）及び L—グルタミン 0· 87g/L (和光純 薬社製）または L ァラニルー L グルタミン 1 · 30g/L (協和発酵工業社製）を添加 した培地を用いた。
[0089] フィード培地には、アミノ酸 [L ァラニン 0· 14g/L、 L アルギニン一塩酸 0· 47 g/L、 Lーァスパラギン一水和物 0· 16g/L、 L—シスチン二塩酸 0· 51g/L、L— グルタミン酸 0. 42g/L、 L ヒスチジン一塩酸二水和物 0. 24g/L、 L イソ口イシ ン 0. 59g/L、 L ロイシン 0. 59g/L、 L リジン一塩酸 0. 82g/:L、： L フエニル ラニン 0. 37g /し、 L プロリン 0. 22g /し、 Lーセリン 0. 24g /し、 L スレ才ニン 0. 53g/L、： L トリプトファン 0. 19g/:L、 L チロシンニナトリウム二水和物 0. 58g /L、 L バリン 0· 53g/L (以上、シグマ-アルドリッチ社製）、 L ァスパラギン酸 0· 17g/L、グリシン 0· 17g/L (以上、和光純薬工業社製）、 L メチォニン 0· 17g/ L (純正化学社製)及び L グルタミン 7. 3g/L (和光純薬工業社製）または L ァラ ニル一 L グルタミン 10. 9g/L (協和発酵工業社製）]、ビタミン [D ビォチン 0. 0 73mg/L、 D パントテン酸カルシウム 0. 022g/L、塩化コリン 0· 022g/L、葉酸 0. 022g/L、 myo イノシトーノレ 0. 040g/L、ナイァシンアミド 0. 022g/L、ピリド キサール塩酸 0. 022g/L、リボフラビン 0. 0022g/L、チアミン塩酸 0. 022g/L、 シァノコバラミン 0· 073mg/L (以上、シグマ一アルドリッチ社製）]、リコンビナントヒ トインスリン 0 · 31g/L (ジエーアールエイチバイオサイエンス社製）、エタノールアミ ン 0· 025g/L (シグマーァノレドリツチ社製）、 2 メノレカプトエタノーノレ 0· 0098g/:L (シグマ—アルドリッチ社製）、大豆加水分解物 HY— SOY8g/L (クウェストインター ナショナル社製）、亜セレン酸ナトリウム 16 · 8 g/L (シグマ アルドリッチ社製）、コ レステロール脂質濃縮溶液 2mL/L (250 X水溶液、インビトロジェン社製）、ェチレ ンジァミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩 0· 05g/L (シグマ—アルドリッチ社製）及びグ ルコース 4g/L (和光純薬工業社製)からなる培地をそれぞれ用レ、た。
[0090] 培養開始から対数増殖期間内である培養 3、 5、 7、 9及び 1 1日目にそれぞれ初発 培地量の 8 %量のフィード培地を添加した。
それぞれ 35°C、 85rpm、 pH7. 1で 14日間培養した。
培養開始から培養終了まで、培養液を毎日採取し、生細胞密度（細胞/ mL)、蛋 白濃度 (mg/U、アンモニゥムイオン濃度 (mmol/L)、 L グルタミン濃度及び L ァラニルー L—グルタミン濃度（mmol/L)を測定した。
[0091] 生細胞密度は実施例 1と同様の方法で測定した。
蛋白濃度及びアンモニゥムイオン濃度は実施例 2と同様の方法でそれぞれ測定し た。
L グルタミン濃度及び L ァラュル— L グルタミン濃度は、採取した培養液を以 下の手順に従い FMOC— C1により誘導化し、測定した。培養液 30 H Lを 270 μ Lの l OOmmol/Lホウ酸緩衝液 [ホウ酸（関東化学社製)及び水酸化ナトリウム（国産化 学社製）より調製、 ρΗ9· 0]及びアセトン（国産化学社製）に溶解した 1. 5mg/mL の FMOC— C1 (東京化成社製)溶液 300 Lと混合した。混合した溶液を室温にて 4 0分間保持した後、ァセトニトリル (和光純薬社製)及び 0. 25mol/Lホウ酸緩衝液（ 上記と同様に調製、 pH5. 5)を 1対 3の割合で混合した液体 600 ^ Lを反応液に加 えた。この溶液を、 LC - 10A HPLC (島津製作所社製）を用いて分析し、 L ァラ 二ルー L—グルタミン濃度を検量線より求めた。 HPLCのカラムには Develosil™ O DS - HG - 5 4. 6 X 250mm (野村化学社製）を用いた。検出は蛍光検出器を用 い、励起 254nm、測定 606nmの条件で行った。
[0092] また、累積生細胞密度（細胞/ mL X日）と SPR g/106細胞/日）を以下の方 法で算出した。
累積生細胞密度は測定した生細胞密度を使用して実施例 1記載の式 1より算出し た。
SPRは測定した蛋白濃度と算出した累積生細胞密度を使用して実施例 2記載の式 2より算出した。
[0093] また、培養 8、 9、 10、 11及び 14日目の培養液を採取し、初期アポトーシス細胞の 割合を測定した。
初期アポトーシス細胞の割合の測定装置には Guava EasyCyte Plus (GEヘル スケアバイオサイエンス社製）を用いた。測定試薬は Guava PCA—96 Nexin Ki t (GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、測定試薬に添付の実験手順に従つ て測定を行った。
[0094] その結果を図 5、図 6及び図 7に示す。いずれの培養においても生存率は培養開始 力も培養 9日目まで 90%以上の良好な値を示した。到達最大密度は、いずれの培養 においても 1. 0 X 107細胞/ mLを越える良好な増殖を示した。 14日間の累積生細 胞密度は、 Gin— Gin培養では 7. 5 X 107細胞/ mL X日、 Gln—AlaGln培養では 7. 8 X 107細胞/ mL X日とほぼ同等であった。増殖中期となる培養 6日目力、ら 11日 目のアンモニゥムイオン濃度は、 011 —011培養では711111101/しから1011111101/しに 上昇した。一方、 Gin— AlaGln培養では 8日目に 3. 4mmol/Lまで低下し、 L—ァ ラニル L—グルタミンの添加によるアンモニゥムイオン濃度の低減が示された。また、 蛋白濃度は Gin— Gin培養の値を 100%とすると、 Gin— AlaGln培養では 109%と 増大した。 SPRは Gin— Gin培養の値を 100%とすると、 Gin— AlaGln培養では 10 6%、 AlaGln— AlaGln培養では 115%と、 L—ァラニルー L—グルタミンの添加によ り増大した。
[0095] L—グノレタミン濃度および L—ァラニルー L—グノレタミン濃度については、以下の結 果が得られた。 Gin— Gin培養では、グルタミンの濃度が培養 3日目まで低下した。そ の後はフィード培地を添加した翌日の 4、 6、 8、 10及び 11日目で濃度が上昇するも のの、それ以外の日において濃度は減少した。 Gin— AlaGln培養では、グルタミン 濃度は経時的に減少し、培養 8日目でほぼ OmMに近い数 を示した。培養 9日目 以降 14日目まではグノレタミン濃度は上昇し続けた。一方、 L ァラニルー Lーグノレタ ミンの濃度は培養 3日目まで OmMである力 S、その後、培養 8日目までフィード培地を 添加する度に濃度は上昇していった。培養 11日目以降は L ァラニル一 L グルタ ミン濃度は減少し始め 14日目にほぼ OmMとなった。
[0096] 初期アポトーシスの細胞の割合は、培養 8日目において、 Gin— Gin培養では 7. 3 %であるのに対し、 Gln—AlaGln培養では 5. 1 %、 AlaGln—AlaGln培養では 4· 1 %を示し、 L ァラニルー L—グルタミンの添加によって初期アポトーシスの細胞の割 合は抑制された。培養 9日目において、 Gin— Gin培養では 11. 5%であるのに対し 、 Gln—AlaGln培養では 6. 7%、 AlaGln—AlaGln培養では 3. 6%であった。培養 10日目において、 Gin— Gin培養では 14· 1 %、 Gln—AlaGln培養では 14· 8%で あつたが、 AlaGln— AlaGln培養では 8. 3%であった。
[0097] 以上から、 L ァラニルー L—グルタミンをフィード培地に添加することで、 Lーァラ 二ルー L グルタミンを基本培地に添加することに伴う初期の増殖阻害を受けずに、 グルタミンを培地に添加した培養よりも高い SPRで蛋白生産を行うことが出来、その 結果、高い蛋白生産性を示すことが明らかとなった。また、 L ァラニルー L グルタ ミンを培地に添加することで、アポトーシスが抑制され、加えて基本培地にも Lーァラ 二ルー L グルタミンを添加することでアポトーシスの抑制効果が延長されることが示 された。
実施例 5
[0098] 250mL三角フラスコによる抗 CD20抗体産生 CHO細胞 Ms704/CD20株の培 養における L ァラニルー Lーチロシンの培地への添加の効果
抗 CD20抗体を生産する Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いて、 2 50mL三角フラスコでのフエドバッチ培養を行い、 L ァラニノレ一 L チロシンを添カロ した培地の効果を検討した。
[0099] 本培養までの拡大培養用培地には、 EX— CELL™ 302培地（ジエーアールエイ チバイオサイエンス社製）培地に MTX500nmol/L (シグマ アルドリッチ社製）、 L グルタミン（和光純薬社製） 1. 75g/Lを添加した培地を用いた。 125mL、 250m L、 500mLまたは lOOOmL容量の三角フラスコ（コーユング社製）に約 20%量の培 地を入れ、 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞懸濁液を播種した。 35°Cで 4日間培 養し、本培養の播種に必要な細胞数が獲得されるまで複数回継代した。
[0100] 拡大培養により充分な細胞数を獲得したところで、下記の基本培地 40mLを満たし た 250mL容量三角フラスコ（コーユング社製）に 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞 を播種した。
培養の基本培地には、実施例 2で用いた、改変 EX— CELL™ 302培地に、 MT X500nmmol/L (シグマ アルドリッチ社製）、 L—グルタミン 1 · 75g/L (和光純薬 社製）を添加した培地を用いた。
[0101] フィード培地には、アミノ酸 [L ァラニン 0· 14g/L、 L アルギニン一塩酸 0· 47 g/L、 Lーァスパラギン一水和物 0· 16g/L、 L—シスチン二塩酸 0· 51g/L、L— グルタミン酸 0. 42g/L、 L ヒスチジン一塩酸二水和物 0. 24g/L、 L イソ口イシ ン 0. 59g/L、 L ロイシン 0. 59g/L、 L リジン一塩酸 0. 82g/:L、： L フエニル ラニン 0. 37g /し、 L プロリン 0. 22g /し、 Lーセリン 0. 24g /し、 L スレ才ニン 0. 53g/L、： L トリプトファン 0. 19g/:L、 L チロシンニナトリウム二水和物 0. 58g /L、 L バリン 0· 53g/L (以上、シグマ-アルドリッチ社製）、 L ァスパラギン酸 0· 17g/L、グリシン 0· 17g/L、L—グルタミン 7· 3g/L (以上、和光純薬工業社製） 及び L メチォニン 0· 17g/L (純正化学社製）]、ビタミン [D ビォチン 0· 073mg /L、 D ノ ントテン酸カノレシゥム 0. 022g/L、塩ィ匕コリン 0. 022g/L、葉酸 0. 02 2g /し、 myo イノシ卜ーノレ 0. 040g /し、ナイァシンアミド Ό. 022g /し、ピリド、キサ ール塩酸 0. 022g/L、リボフラビン 0. 0022g/L、チアミン塩酸 0. 022g/L、シァ ノコバラミン 0. 073mg/L (以上、シグマ一アルドリッチ社製）]、リコンビナントヒトイン スリン 0· 31g/L (ジエーアールエイチバイオサイエンス社製）、エタノールァミン 0· 0 25g/L (シグマ一アルドリッチ社製）、 2 メルカプトエタノール 0. 0098g/L (シグ マ—アルドリッチ社製）、大豆加水分解物 HY— SOY8g/L (クウェストインターナショ ナル社製）、亜セレン酸ナトリウム 16. 8 g/L (シグマ—アルドリッチ社製）、コレステ ロール脂質濃縮溶液 2mL/L (250 X水溶液、インビトロジェン社製）、エチレンジァ ミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩 0· 05g/L (シグマ—アルドリッチ社製）及びダルコ一 ス 4g/L (和光純薬工業社製)からなる培地に、更に L ァラニル— L チロシン 10· 17g/L (WO2006/001379)を添カロあるいは非添カロし、それぞれ用いた。以後、 L ァラニノレ一 L チロシンを添加して!/、な!/、フィード培地を用いた培養を「Try培養 」、また L ァラニルー Lーチロシンを添加したフィード培地を用いた培養を「AlaTyr 培養」と称することとする。
[0102] 培養開始から対数増殖期間内である培養 4、 7、 9及び 11日目にそれぞれ初発培 地量の 6. 25%量のフィード培地を添加した。
それぞれ、 35°C、 100rpm、 pH7. 1で 14日間培養した。
培養液を培養 4、 7、 9、 11、 13及び 14日目に採取し、生細胞密度（細胞/ mU及 び蛋白濃度 (mg/L)を測定した。
[0103] 生細胞密度は実施例 1と同様の方法で測定した。
蛋白濃度は実施例 2と同様の方法でそれぞれ測定した。
また、累積生細胞密度（細胞/ mL X日）と SPR g/106細胞/日）を以下の方 法で算出した。
累積生細胞密度は、測定した生細胞密度を使用して実施例 1記載の式 1より算出し た。
[0104] SPRは、測定した蛋白濃度と算出した累積生細胞密度を使用して実施例 2記載の 式 2より算出した。
その結果を図 8に示す。 SPRは、 Tyr培養での値を 100%とすると、 AlaTyr培養で は 117%と増大した。
以上から、 L ァラニルー Lーチロシンを培地に添加することで、蛋白生産性が向 上することが明らかとなった。
参考例 1
[0105] 250mL三角フラスコによる抗 CD20抗体産生 CHO細胞 Ms704/CD20株の培 養における培地中のアンモニゥムイオンによる影響
抗 CD20抗体を生産する Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いて、 2 50mL三角フラスコでのフエドバッチ培養を行い、培地中のアンモニゥムイオンによる 影響を評価した。
[0106] 本培養までの拡大培養用培地には、 EX— CELL™ 302培地（ジエーアールエイ チバイオサイエンス社製）培地に MTX500nmol/L (シグマ—アルドリッチ社製）及 び L—グルタミン 1. 75g/L (和光純薬社製）を追添加して用いた。 125mL、 250m L、 500mLまたは lOOOmL容量の三角フラスコ（コーユング社製）に約 20%量の培 地を入れ、 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞懸濁液を播種した。 35°Cで 4日間培 養し、本培養の播種に必要な細胞数が獲得されるまで複数回継代した。
[0107] 拡大培養により充分な細胞数を獲得したところで、下記の基本培地 40mLを満たし た 250mL三角フラスコ（コーユング社製）に 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞を播 種した。
培養の基本培地には、実施例 2で用いた、改変 EX— CELL™ 302培地に、 MT X500nmol/L (シグマ アルドリッチ社製）及び L—グルタミン 1. 75g/L (和光純 薬社製）を添加した培地に、更に塩化アンモニゥム（ナカライテスタ株式会社製）を 0 mmol L (非添カロ)、 10mmol/L, 20mmol L、 30mmol L、 40mmol L、 5 Ommol/Lまたは 60mmol/Lとなるように添加し、それぞれ用いた。
[0108] フィード培地には、アミノ酸 [L ァラニン 0· 14g/L、 L アルギニン一塩酸 0· 47 g/L、 Lーァスパラギン一水和物 0· 16g/L、 L—シスチン二塩酸 0· 51g/L、L— グルタミン酸 0. 42g/L、 L ヒスチジン一塩酸二水和物 0. 24g/L、 L イソ口イシ ン 0. 59g/L、 L ロイシン 0. 59g/L、 L リジン一塩酸 0. 82g/:L、： L フエニル ラニン 0. 37g /し、 L プロリン 0. 22g /し、 Lーセリン 0. 24g /し、 L スレ才ニン 0. 53g/L、： L トリプトファン 0. 19g/:L、 L チロシンニナトリウム二水和物 0. 58g /L、 L バリン 0· 53g/L (以上、シグマ-アルドリッチ社製）、 L ァスパラギン酸 0· 17g/L、グリシン 0· 17g/L、L—グルタミン 7· 3g/L (以上、和光純薬工業社製） 及び L メチォニン 0· 17g/L (純正化学社製）]、ビタミン [D ビォチン 0· 073mg /L、 D ノ ントテン酸カノレシゥム 0. 022g/L、塩ィ匕コリン 0. 022g/L、葉酸 0. 02 2g /し、 myo イノシ卜ーノレ 0. 040g /し、ナイァシンアミド Ό. 022g /し、ピリド、キサ ール塩酸 0. 022g/L、リボフラビン 0. 0022g/L、チアミン塩酸 0. 022g/L、シァ ノコバラミン 0. 073mg/L (以上、シグマ一アルドリッチ社製）]、リコンビナントヒトイン スリン 0· 31g/L (ジエーアールエイチバイオサイエンス社製）、エタノールァミン 0· 0 25g/L (シグマ一アルドリッチ社製）、 2 メルカプトエタノール 0. 0098g/L (シグ アルドリッチ社製） 大豆加水分解物 HY— SOY8g/L (クウェストインターナショ ナル社製）、亜セレン酸ナトリウム 16. 8 g/L (シグマ—アルドリッチ社製）、コレステ ロール脂質濃縮溶液 2mL/L (250 X水溶液、インビトロジェン社製）、エチレンジァ ミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩 0· 05g/L (シグマ—アルドリッチ社製）及びダルコ ス 4g/L (和光純薬工業社製)力もなる培地をそれぞれ用いた。
[0109] 培養開始から培養 4 7及び 9日目にそれぞれ初発培地量の 6. 25%量のフィード 培地を添加した。
それぞれ 35°C 100rpm pH7. 1で 10日間培養した。
培養液を培養 4 7 9及び 10日目に採取し、生細胞密度（細胞/ mUを測定した
[0110] 生細胞密度は実施例 1と同様の方法で測定した。
また、比増殖速度 (h—1)を、培養 4日目の生細胞密度を用いて、以下の式 3より算 し/
(式 3)
比増殖速度 (h— = (4日目の生細胞密度の自然対数） （播種した生細胞密度の その結果を図 9及び図 10に示す。比増殖速度は塩化アンモニゥム非添加の培養 では 0. 0187h— lOmmol/ 添カロの培養では 0.
Figure imgf000041_0001
20mmol/:L添カロの 培養では 0. 0109h— 30mmol/L添カロの培養では 0. 0072h— 40mmol/L添 加の培養では 0. 0041h— 50mmol/L添加の培養では—0. 0025h— 1及び 60m mol/L添加の培養では 0. 0034h— 1であり、基本培地中の塩化アンモニゥム濃度 の向上に伴って比増殖速度が低下することが明らかとなった。
参考例 2
[0111] 2Lバイオリアクターによる抗 CD20抗体産生 CHO細胞 Ms704/CD20株の培 養における培地中のアンモニゥムイオンによる影響
抗 CD20抗体を生産する Ms704/CD20株（FERM BP— 10092)を用いて、 2 Lバイオリアクターでのフエドバッチ培養を行い、培地中のアンモニゥムイオンによる 影響を評価した。 [0112] 本培養までの拡大培養用培地には、 EX— CELL1 M 302培地（ジエーアールエイ チバイオサイエンス社製）培地に MTX500nmol/L (シグマ—アルドリッチ社製）及 び L グルタミン 1 · 75g/L (和光純薬社製）を添加した培地を用いた。 125mL、 25 OmL、 500mLまたは lOOOmL容量の三角フラスコ（コーユング社製）に約 20%量の 培地を入れ、 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞懸濁液を播種した。 35°Cで 4日間 培養し、本培養の播種に必要な細胞数が獲得されるまで複数回継代した。
[0113] 拡大培養により充分な細胞数を獲得したところで、下記の基本培地 600mLを満た した 2L容量バイオリアクター（エイブル社製）に 3 X 105細胞/ mLとなるように細胞を 播種した。
培養の基本培地には、実施例 2で用いた、改変 EX— CELL™ 302培地に、 MT X500nmol/L (シグマ アルドリッチ社製）及び L—グルタミン 0· 87g/L (和光純 薬社製）を添加した培地に、更に塩化アンモニゥム 24mmol/L (ナカライテスタ株式 会社製）を添加あるいは非添加し、それぞれ用いた。
[0114] フィード培地には、アミノ酸 [L ァラニン 0· 14g/L、 L アルギニン一塩酸 0· 47 g/L、 Lーァスパラギン一水和物 0· 16g/L、 L—シスチン二塩酸 0· 51g/L、L— グルタミン酸 0. 42g/L、 L ヒスチジン一塩酸二水和物 0. 24g/L、 L イソ口イシ ン 0. 59g/L、 L ロイシン 0. 59g/L、 L リジン一塩酸 0. 82g/:L、： L フエニル ラニン 0. 37g /し、 L プロリン 0. 22g /し、 Lーセリン 0. 24g /し、 L スレ才ニン 0. 53g/L、： L トリプトファン 0. 19g/:L、 L チロシンニナトリウム二水和物 0. 58g /L、 L バリン 0· 53g/L (以上、シグマ-アルドリッチ社製）、 L ァスパラギン酸 0· 17g/L、グリシン 0· 17g/L、L—グルタミン 7· 3g/L (以上、和光純薬工業社製） 及び L メチォニン 0· 17g/L (純正化学社製）]、ビタミン [D ビォチン 0· 073mg /L、 D ノ ントテン酸カノレシゥム 0. 022g/L、塩ィ匕コリン 0. 022g/L、葉酸 0. 02 2g /し、 myo イノシ卜ーノレ 0. 040g /し、ナイァシンアミド Ό. 022g /し、ピリド、キサ ール塩酸 0. 022g/L、リボフラビン 0. 0022g/L、チアミン塩酸 0. 022g/L、シァ ノコバラミン 0. 073mg/L (以上、シグマ一アルドリッチ社製）]、リコンビナントヒトイン スリン 0· 31g/L (ジエーアールエイチバイオサイエンス社製）、エタノールァミン 0· 0 25g/L (シグマ一アルドリッチ社製）、 2 メルカプトエタノール 0. 0098g/L (シグ マ—アルドリッチ社製）、大豆加水分解物 HY— SOY8g/L (クウェストインターナショ ナル社製）、亜セレン酸ナトリウム 16. 8 g/L (シグマ—アルドリッチ社製）、コレステ ロール脂質濃縮溶液 2mL/L (250 X水溶液、インビトロジェン社製）、エチレンジァ ミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩 0· 05g/L (シグマ—アルドリッチ社製）及びダルコ一 ス 4g/L (和光純薬工業社製)力もなる培地を用いた。
[0115] 培養開始力 対数増殖期間内である培養 3、 5、 7、 9及び 11日目にそれぞれ初発 培地量の 8 %量のフィード培地を添加した。
それぞれ 35°C、 85rpm、 pH7. 1で 14日間培養した。
培養開始から培養終了まで、培養液を毎日採取し、生細胞密度（細胞/ mL)、蛋 白濃度 (mg/L)及びアンモニゥムイオン濃度 (mmol/L)を測定した。
生細胞密度は実施例 1と同様の方法で測定した。
[0116] 蛋白濃度及びアンモユウム濃度は実施例 2と同様の方法でそれぞれ測定した。
また、累積生細胞密度（細胞/ mL X日）を以下の方法で算出した。
累積生細胞密度は、測定した生細胞密度を使用して実施例 1記載の式 1より算出し た。
その結果を図 11に示す。培養 5日目の生存率は塩化アンモニゥム添加の培養では 、 92%以下に低下した。これに対し、塩化アンモニゥム非添加の培養では、 98%以 上で維持されていた。最大の到達生細胞密度は、塩化アンモニゥム添加の培養では 5. 0 X 106細胞/ mLを越える程度であった。これに対し、塩化アンモニゥム非添加 の培養では 1. 1 X 107細胞/ mLの良好な増殖を示した。 14日間の累積生細胞密 度は、塩化アンモニゥム添加の培養では 3. 1 X 107細胞/ mL X日、塩化アンモニゥ ム非添加では 6. 4 X 107細胞/ mL X日であった。蛋白濃度は塩化アンモニゥム非 添加の培養での値を 100%とすると、塩化アンモニゥム添加の培養では 61 %と低下 した。
[0117] 以上から、基本培地中の塩化アンモニゥムの添加により、細胞増殖性及び蛋白生 産性が低下することが明ら力、となった。
産業上の利用可能性
[0118] 本発明により、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法において、ジぺ プチドを添加して培養することを特徴とする物質を生産する能力を有する動物細胞 の培養方法、物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方 法において、ジペプチドを添加して培養し、該培養物中に該物質を生成蓄積させ、 該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造方法、物質を生産する 能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養することを特徴とする、該細胞よ り生産される物質の細胞当たりの生産性を向上させる方法、物質を生産する能力を 有する動物細胞にジペプチドを添加して培養することを特徴とする、該細胞の生存 率を維持させる方法、物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法にお!/、て、 ジペプチドを添加して培養することを特徴とする培養液中のアンモニゥムイオン濃度 の上昇を抑制する方法、及び物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを 添加して培養することを特徴とする、該細胞のアポトーシスを抑制する方法を提供す ること力 S出来る。

Claims

請求の範囲
[I] 物質を生産する能力を有する動物細胞の培養方法において、ジペプチドを添加して 培養することを特徴とする動物細胞の培養方法。
[2] ジペプチドが L—グルタミンを含むジペプチドである、請求項 1に記載の方法。
[3] L—グノレタミンを含むジペプチドが L—ァラニル一 L—グノレタミンである、請求項 2に 記載の方法。
[4] ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、請求項 1に記載の方法。
[5] Lーチロシンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーチロシンである、請求項 4に記載 の方法。
[6] 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、請求項;!〜 5のいずれか 1項に記載の 方法。
[7] 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、請求項 6に記載の方法。
[8] 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来する細胞 である、請求項;!〜 7のいずれか 1項に記載の方法。
[9] 物質がペプチドである、請求項 1〜8のいずれ力、 1項に記載の方法。
[10] 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換 細胞である、請求項 9に記載の方法。
[I I] ペプチドが糖蛋白質である、請求項 9または 10に記載の方法。
[12] 糖蛋白質が抗体である、請求項 11に記載の方法。
[13] ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、請求項;!〜 12のいずれ 力、 1項に記載の方法。
[14] ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、請求項 1〜； 13のいずれか 1項に記 載の方法。
[15] 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、請求項;!〜 14のいずれか 1項に記載 の方法。
[16] 物質を生産する能力を有する動物細胞を培養して物質を製造する方法において、ジ ペプチドを添加して培養し、該培養物中に該物質を生成蓄積させ、該培養物から該 物質を採取することを特徴とする物質の製造方法。
[17] ジペプチドが L—グルタミンを含むジペプチドである、請求項 16に記載の方法。
[18] L—グルタミンを含むジペプチドが L—ァラニルー L—グルタミンである、請求項 17に 記載の方法。
[19] ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、請求項 18に記載の方法。
[20] Lーチロシンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーチロシンである、請求項 19に記 載の方法。
[21] 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、請求項 16〜20のいずれか 1項に記載 の方法。
[22] 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、請求項 21に記載の方法。
[23] 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来する細胞 である、請求項 16〜22のいずれか 1項に記載の方法。
[24] 物質がペプチドである、請求項 16〜23のいずれ力、 1項に記載の方法。
[25] 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換 細胞である、請求項 24に記載の方法。
[26] ペプチドが糖蛋白質である、請求項 24または 25に記載の方法。
[27] 糖蛋白質が抗体である、請求項 26に記載の方法。
[28] ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、請求項 16〜27のいず れか 1項に記載の方法。
[29] ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、請求項 16〜28のいずれか 1項に 記載の方法。
[30] 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、請求項 16〜29のいずれか 1項に記載 の方法。
[31] 物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養することを特徴 とする、該細胞より生産される物質の細胞当たりの生産性を向上させる方法。
[32] ジペプチドが L—グルタミンを含むジペプチドである、請求項 31に記載の方法。
[33] L—グノレタミンを含むジペプチドが L—ァラニルー L—グノレタミンである、請求項 32に 記載の方法。
[34] ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、請求項 31に記載の方法。
[35] Lーチロシンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーチロシンである、請求項 34に記 載の方法。
[36] 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、請求項 3；!〜 35のいずれか 1項に記載 の方法。
[37] 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、請求項 36に記載の方法。
[38] 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来する細胞 である、請求項 3；!〜 37のいずれか 1項に記載の方法。
[39] 物質がペプチドである、請求項 3；!〜 38のいずれ力、 1項に記載の方法。
[40] 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換 細胞である、請求項 39に記載の方法。
[41] ペプチドが糖蛋白質である、請求項 39または 40に記載の方法。
[42] 糖蛋白質が抗体である、請求項 41に記載の方法。
[43] ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、請求項 3；!〜 42のいず れか 1項に記載の方法。
[44] ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、請求項 3；!〜 43のいずれか 1項に 記載の方法。
[45] 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、請求項 31〜44のいずれか 1項に記載 の方法。
[46] 物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養することを特徴 とする、該細胞の生存率を維持させる方法。
[47] ジペプチドが L—グルタミンを含むジペプチドである、請求項 46に記載の方法。
[48] L—グノレタミンを含むジペプチドが L—ァラニルー L—グノレタミンである、請求項 47に 記載の方法。
[49] ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、請求項 46に記載の方法。
[50] Lーチロシンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーチロシンである、請求項 49に記 載の方法。
[51] 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、請求項 46〜50のいずれか 1項に記載 の方法。
[52] 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、請求項 51に記載の方法。
[53] 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来する細胞 である、請求項 46〜52のいずれ力、 1項に記載の方法。
[54] 物質がペプチドである、請求項 46〜53のいずれ力、 1項に記載の方法。
[55] 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換 細胞である、請求項 54に記載の方法。
[56] ペプチドが糖蛋白質である、請求項 54または 55に記載の方法。
[57] 糖蛋白質が抗体である、請求項 56に記載の方法。
[58] ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、請求項 46〜57のいず れか 1項に記載の方法。
[59] ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、請求項 46〜58のいずれか 1項に 記載の方法。
[60] 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、請求項 46〜59のいずれか 1項に記載 の方法。
[61] 物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養することを特徴 とする、該細胞の培養液中におけるアンモニゥムイオン濃度の上昇を抑制させる方法
〇
[62] ジペプチドが L—グルタミンを含むジペプチドである、請求項 61に記載の方法。
[63] L—グノレタミンを含むジペプチドが L—ァラニルー L—グノレタミンである、請求項 62に 記載の方法。
[64] ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、請求項 61に記載の方法。
[65] Lーチロシンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーチロシンである、請求項 64に記 載の方法。
[66] 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、請求項 6；!〜 65のいずれか 1項に記載 の方法。
[67] 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、請求項 66に記載の方法。
[68] 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来する細胞 である、請求項 6；!〜 67のいずれか 1項に記載の方法。
[69] 物質がペプチドである、請求項 6；!〜 68のいずれ力、 1項に記載の方法。
[70] 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換 細胞である、請求項 69に記載の方法。
[71] ペプチドが糖蛋白質である、請求項 69または 70に記載の方法。
[72] 糖蛋白質が抗体である、請求項 71に記載の方法。
[73] ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、請求項 61〜72のいず れか 1項に記載の方法。
[74] ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、請求項 6；!〜 73のいずれか 1項に 記載の方法。
[75] 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、請求項 61〜74のいずれか 1項に記載 の方法。
[76] 物質を生産する能力を有する動物細胞にジペプチドを添加して培養することを特徴 とする、該細胞のアポトーシスを抑制する方法。
[77] ジペプチドが L—グルタミンを含むジペプチドである、請求項 76に記載の方法。
[78] L—グルタミンを含むジペプチドが L—ァラニルー L—グルタミンである、請求項 77に 記載の方法。
[79] ジペプチドが Lーチロシンを含むジペプチドである、請求項 76に記載の方法。
[80] Lーチロシンを含むジペプチドが L—ァラニルー Lーチロシンである、請求項 79に記 載の方法。
[81] 動物細胞が哺乳類に属する動物細胞である、請求項 76〜80のいずれか 1項に記載 の方法。
[82] 哺乳類に属する動物が霊長類または齧歯類である、請求項 81に記載の方法。
[83] 動物細胞がミエローマ細胞または卵巣細胞、あるいはこれらの細胞に由来する細胞 である、請求項 76〜82のいずれ力、 1項に記載の方法。
[84] 物質がペプチドである、請求項 76〜83のいずれ力、 1項に記載の方法。
[85] 動物細胞がペプチドをコードする遺伝子を含有するベクターが導入された形質転換 細胞である、請求項 84に記載の方法。
[86] ペプチドが糖蛋白質である、請求項 84または 85に記載の方法。
[87] 糖蛋白質が抗体である、請求項 86に記載の方法。
[88] ジペプチドを添加する期間が、該細胞の対数増殖期である、請求項 76〜87のいず れか 1項に記載の方法。
[89] ジペプチドを添加する培地がフィード培地である、請求項 76〜88のいずれか 1項に 記載の方法。
[90] 培養方法が培養槽を用いた培養方法である、請求項 76〜89のいずれか 1項に記載 の方法。
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