RU2845361C1

RU2845361C1 - Модуляция фермента и пути сульфгидрильными соединениями и их производными

Info

Publication number: RU2845361C1
Application number: RU2022129755A
Authority: RU
Inventors: Чжисинь ШАО
Original assignee: Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2025-08-18

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой антитело к α-синуклеину, имеющее моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, причем антитело к α-синуклеину имеет 17,2-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,1-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан. Изобретение позволяет эффективно использовать такое антитело к α-синуклеину для лечения пациентов с болезнью Паркинсона. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 8 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к белкам, в частности к антителам, таким как биспецифические антитела к CD20/CD3 и антителам к α-синуклеину, имеющим моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны. Более конкретно, настоящее изобретение относится к конструированию с использованием галактозилирования для получения белков с улучшенными терапевтическими свойствами, включая белки с повышенным титром. Кроме того, изобретение относится к среде для культивирования клеток и клетке млекопитающего, а также к способам применения указанной среды для культивирования клеток и указанной клетки млекопитающего для получения указанных белков. Более того, настоящее изобретение относится к применению указанных антител в качестве лекарственного средства, например, для лечения рака, в частности рака, связанного с В-клетками, или болезни Паркинсона.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Многие гликопротеины были основным продуктом биотехнологической промышленности и использовались, в частности, в терапевтических целях. Примеры включают эритропоэтин (ЭПО), терапевтические моноклональные антитела (терапевтические mAb), тканевой активатор плазминогена (ТАП), интерферон-α, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) (dimming et al., Glycobiology 1: 115-130 (1991)). Таким образом, олигосахаридный компонент гликопротеинов может влиять на их свойства, связанные с эффективностью терапевтических гликопротеинов, включая без ограничения физическую стабильность, устойчивость к атаке протеаз, взаимодействие с иммунной системой, фармакокинетику и специфическую биологическую активность. Такие свойства могут зависеть не только от наличия или отсутствия, но и от конкретных структур олигосахаридов.

Как правило, иммуноглобулины или антитела в их нативной форме обычно представляют собой тетрамерные гликопротеины, состоящие из двух легких и двух тяжелых цепей. Такие иммуноглобулины обычно содержат олигосахариды в консервативных положениях константных областей тяжелой цепи, которые могут по-разному влиять на сборку, секрецию или функциональную активность белка (Boyd et al., (1995) Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwer A., and Howard, S.C. (1990) Biochem. 29:4175-4180; Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)).

Например, повышенное галактозилирование антител может быть функционально более противовоспалительным, как, например, описано в отчете Karsten et al. (Nature Medicine 18.9 (2012) 1401-1406), на мышах показано, что высокое галактозилирование иммунных комплексов IgG способствует ассоциации Fcγ RIIB и дектина-1, что блокирует провоспалительные эффекторные функции C5aR и CXCR226. Другие сообщения о влиянии галактозилирования на молекулы IgG включают изменение физико-химических свойств, таких как конформация и доступность поверхности (Krapp et al., J. Mol. Biol. 325 (2003) 979-89; Mimura et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 697-706). Fortunato и Colina (J. Phys. Chem. 118 (2014) 9844-9851) использовали явное моделирование атомистической молекулярной динамики воды для изучения эффектов галактозилирования в Fc-домене иммуноглобулина G1. Они предположили, что гликозилирование можно использовать в качестве пути улучшения устойчивости моноклональных антител к агрегации для терапевтического лечения.

Учитывая влияние разного уровня гликозилирования и/или характера гликозилирования гликопротеинов на их свойства, в частности, связанные с терапевтической эффективностью, важно обеспечить, чтобы характер гликозилирования гликопротеинов, производимых, в частности, для клинического применения, был однородным и, таким образом, по меньшей мере для сохранения благоприятных свойств антител.

Однако обычно экспрессия рекомбинантных гликопротеинов в клетках-хозяевах приводит к вариациям олигосахаридных структур, присоединенных к определенному сайту гликозилирования, так что продуцируемые гликопротеины существуют в виде множественных гликоформ. Таким образом, до сих пор технически было очень сложно точно регулировать и контролировать уровень гликозилирования и/или характер гликозилирования в клетках-продуцентах in vivo в данном процессе продуцирования терапевтического белка.

В течение последних десятилетий были предложены различные способы и исследовано несколько параметров процесса, которые могут изменить характер гликозилирования гликопротеинов в клетках-хозяевах, включая введение или сверхэкспрессию определенных ферментов в клетках-хозяевах, которые участвуют в получении олигосахаридов (патент США №5047355, патент США №5510261), изменения уровня оксигенации, рН, схемы очистки и т.п.(Werner, R. and Noe, W. (1993), Drug Res. 43:1134-1139; Werner, R. and Noe, W. (1993), Drug Res. 43:1242-1249; Hayter et al, (1992) Biotech, and Bioeng. 39:327-335; Borys et al., (1994) Biotech and Bioeng. 43:505-514; Borys et al., (1993) Bio/technology 11:720-724; Hearing et al., (1989) J. Cell Biol. 108:339-353; Goochee et al., in Frontiers in Bioprocessing II, Todd et al., eds (1992) American Chemical Society pp.199-240; патент США №5096816; Chotigeat, W, (1994) Cytotech. 15:217-221).

Как указано выше, продукция гликопротеинов с желаемым уровнем гликозилирования и/или характером гликозилирования важна, по меньшей мере, для сохранения и, необязательно, оптимизации благоприятных свойств указанных антител, в частности свойств, связанных с их терапевтической эффективностью.

Техническая проблема решается путем обеспечения вариантов осуществления, представленных в данном документе ниже и описанных в прилагаемой формуле изобретения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В последние годы было предпринято много усилий для фундаментального понимания и технического контроля процесса галактозилирования белков в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО. До сих пор существует несколько общих стратегий, которые можно использовать для воздействия на степень гликозилирования белков, где эффекты часто зависят от типа клеток и продукта (Hossler et al., Glycobiology 19(9) (2009) 936-949; Hossler, Genomics and Systems Biology of Mammalian Cell Culture 127 (2012) 187-219): 1) улучшение активности гликозилтрансфераз, 2) улучшение доступности и активности транспортеров нуклеотидных Сахаров для переноса нуклеотидных Сахаров, 3) повышение доступности субстратов нуклеотидных Сахаров и 4) снижение гликозидазы при деградации внеклеточного гликана. Crowell и др. (Biotechnol Bioeng 96(3) (2007) 538-549) показали, что добавление к культурам клеток СНО марганца, предпочтительного кофактора как комплекса олигосахарилтрансферазы, так и β1,4-галактозилтрансферазы, увеличивало занятость сайта и β1,4-галактозилирование N-гликанов rhEPO в культуре на поздних стадиях. Gramer и др. (Biotechnol Bioeng. 108(7) (2011) 1591-602)) сообщили, что синергетическая комбинация уридина, MnCl₂ и галактозы значительно количественно увеличивает галактозилирование mAb по отношению к общей концентрации поставляемого UMG. Также сообщалось о некоторых подходах, использующих сверхэкспрессию и/или нокдаун гликозилтрансфераз и транспортеров нуклеотидных сахаров (Jeong et al., J Microbiol Biotechnol 18(12) (2008) 1945 1952; Weikert et al., Nat Biotechnol 17(11) (1999) 1116-1121). Сообщалось, что питание предшественником нуклеотидного сахара является возможной стратегией контроля гликозилирования рекомбинантных белков (Wong et al., Biotechnology and Bioengineering 107.2 (2010) 321-336). В частности, было доказано, что добавление галактозы, глюкозамина и N-ацетилманнозамина в среду для культивирования клеток повышает внутриклеточный уровень нуклеотидного сахара. Однако влияние повышенных внутриклеточных уровней нуклеотидного сахара на экспрессию генов гликозилирования изучено недостаточно. Более того, увеличение внутриклеточных уровней нуклеотидного сахара не обязательно приводило к улучшению гликозилирования рекомбинантных белков. В некоторых исследованиях применялась стратегия подавления клеточных гликозидаз (Ngantung et al., Biotechnol Bioeng. 95(1) (2006) 106-19) с целью улучшения гликозилирования белков. Однако такой подход работал только от случая к случаю. Таким образом, все еще существует потребность в фундаментальных исследованиях для изучения того, как различные внешние факторы влияют на процесс внутриклеточного галактозилирования.

Как описано в настоящем документе, галактозилирование антител зависит от концентрации УДФ-галактозы, присутствующей в клетках, поскольку эти молекулы сахара действуют как субстраты, необходимые для галактозилирования. Таким образом, было обнаружено, что увеличение содержания УДФ-галактозы связано с более высоким галактозилированием и сиалированием антитела, экспрессируемого в клетках СНО. Различные уровни УДФ-галактозы в клетках могут существенно влиять на гетерогенность гликанов.

В этом контексте путь превращения УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы, включающий два идентифицированных фермента, уридиндифосфат α-D-глюкозоэпимеразу (УДФ-Glc-E) и УДФ-α-D-глюкозу: было обнаружено, что α-D-галактоза-1-фосфат уридилтрансфераза (УДФ-Gal-T) играет решающую роль в пути превращения УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО.

В этом отношении УДФ-Gal-T (ЕС 2.7.7.12) представляют собой особый класс ферментов, которые можно регулировать несколькими простыми сульфгидрильными молекулами, такими как L-цистеин, глутатион, 2-меркаптоэтанол и DTT. Еще в 1966 г. Mayes и Hansen (Methods Enzymol. 9 (1966) 708-713) обнаружили, что L-цистеин можно использовать для активации и стимуляции ферментативной активности частично очищенной УДФ-Gal-T из печени теленка. В последующие годы Mayes (Arch. Biochem. Biophys. 172 (1976) 715-720) провел обширные исследования с полностью очищенной УДФ-Gal-T из печени теленка и дополнительно подтвердил эту активационную функцию L-цистеина. Подобные исследования также проводились с УДФ-Gal-T из других организмов. Saito и др. (J. Biol. Chem. 242 (1967) 2362-2368) продемонстрировали, что L-цистеин стимулирует очищенную УДФ-Gal-T Е. coli до достижения ее максимальной активности. Chowdhury (Indian J. Biochem. Biophys. 16 (1979) 273-277) также подтвердил это наблюдение с очищенной УДФ-GAL-T из£. coli.

Таким образом, с помощью настоящего изобретения было обнаружено, что можно регулировать и контролировать внутриклеточное содержание УДФ-галактозы и галактозилирование рекомбинантных белков, таких как антитела, в процессе производства с использованием сульфгидрильных соединений или их производных. Например, с помощью настоящего изобретения было обнаружено, что можно регулировать и контролировать процессинг N-гликанов рекомбинантного моноклонального антитела во время процесса продуцирования с использованием сульфгидрильных соединений или их производных для успешного и специфического управления процессом культивирования клеток для тонкой настройки галактозилирования антитела.

Одной из особенностей настоящего изобретения является использование простых сульфгидрильных молекул или соединений, таких как L-цистеин, для модулирования активности УДФ-Gal-T in vivo в клеточных линиях млекопитающих, таких как СНО K1 и ее производных клеточных линиях, для получения рекомбинантного белка, содержащего моногалактозилированные (G1) или дигалактозилированные (G2) гликаны. Другими словами, в настоящем изобретении предложены новые подходы к регулированию глюко- и галактоконфигурированных УД Ф-Сахаров in vivo, в частности, путем модулирования недавно идентифицированного и указанного пути превращения с помощью двух ферментов УДФ-Gal-T и УДФ-Glc-E в клетках млекопитающих, таких как СНО K1 и ее производные клеточные линии, для получения рекомбинантного белка, имеющего моногалактозилированные (G1) или дигалактозилированные (G2) гликаны. Как показано в приведенных в данном документе примерах, было продемонстрировано, что путем регулирования относительных концентраций определенных сульфгидрильных соединений или их производных в среде можно точно контролировать галактозилирование различных антител в высокопроизводительном, периодическом или периодическом процессе продуцирования с подпиткой, с минимальным влиянием на другие гликоформы, другие характеристики качества продукта или производительность клеточной культуры. Более того, эти данные показывают, что возможно точное регулирование и контроль сложного динамического клеточного процесса в масштабе продуцирования для определения молекулярной гетерогенности и биологической активности продукта рекомбинантного антитела. Это позволяет понять ключевые эффекторные взаимодействия, лежащие в основе основанного на знаниях дизайна среды для культивирования клеток или питательной композиции для достижения заданного уровня галактозилирования антител при максимальной пролиферации и продуктивности клеток.

В частности, настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу к CD20/CD3, содержащему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, биспецифическому антителу к CD20/CD3, содержащему первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, причем первый антигенсвязывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий

(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,(б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и

(в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; и

вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий

(г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25,

(д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и

(е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27;

причем второй антигенсвязывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий

(а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34,

(б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и

(в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и

(г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37,

(д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и

(е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39; и

причем биспецифическое антитело к CD20/CD3 имеет 19,0-29,0% (мас./мас.) G1 и 1,3-2,8% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 20,0-28,0% (мас./мас.) G1 и 1,4-2,7% (мас./мас.) G2 на общий гликан; более предпочтительно 21,0-28,0% (мас./мас.) G1 и 1,5-2,7% (мас./мас.) G2 на общий гликан и наиболее предпочтительно 21,0-27,4% (мас./мас.) G1 и 1,5-2,6% (мас./мас.) G2 на общий гликан.

Предпочтительно биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором

(а) первый антигенсвязывающий домен содержит последовательность VH с SEQ ID NO: 28, а второй антигенсвязывающий домен содержит последовательность VH с SEQ ID NO: 40;

(б) первый антигенсвязывающий домен содержит последовательность VL с SEQ ID NO: 29, а второй антигенсвязывающий домен содержит последовательность VL с SEQ ID NO: 41; или

(в) первый и второй антигенсвязывающий домен содержит последовательность VH, определенную в (а), и последовательность VL, определенную в (б).

Более предпочтительно биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором

(а) последовательность VH первого антигенсвязывающего домена имеет по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 28, а последовательность VH второго антигенсвязывающего домена имеет по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40;

(б) последовательность VL первого антигенсвязывающего домена имеет по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 29, а последовательность VL второго антигенсвязывающего домена имеет по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41; или

(в) биспецифическое антитело к CD20/CD3 содержит последовательность VH первого и второго антигенсвязывающего домена, определенную в (а), и последовательность VL первого и второго антигенсвязывающего домена, определенную в (б).

Еще более предпочтительно биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором биспецифическое антитело к CD20/CD3 содержит

(а) первую тяжелую цепь SEQ ID NO: 46 и вторую тяжелую цепь SEQ ID NO: 45,

(б) первую легкую цепь SEQ ID NO: 33 и вторую легкую цепь SEQ ID NO: 44; или

(в) первую тяжелую цепь и вторую тяжелую цепь, определенные в (а), и первую легкую цепь, и вторую легкую цепь, определенные в (б).

Наиболее предпочтительно биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором биспецифическое антитело к CD20/CD3 содержит

(а) первую тяжелую цепь SEQ ID NO: 47 и вторую тяжелую цепь SEQ ID NO: 45,

(б) первую легкую цепь SEQ ID NO: 33, вторую легкую цепь и третью легкую цепь SEQ ID NO: 44; или

(в) первую тяжелую цепь и вторую тяжелую цепь, определенные в (а), и первую легкую цепь, вторую легкую цепь и третью легкую цепь, определенные в (б).

В равной степени настоящее изобретение относится к антителу к α-синуклеину, имеющему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, причем антитело к α-синуклеину содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий

(а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10,

(б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и

(в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и

(г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13,

(д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и

(е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; и

причем антитело к α-синуклеину имеет 17,2-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,1-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 25,4-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,5-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 27,2-47,0% G1 и 4,4-15,0% G2 на общий гликан; предпочтительно 40,0-46,0% (мас./мас.) G1 и 8,4-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; более предпочтительно 41,0-45,0% (мас./мас.) G1 и 9,5-14,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан и наиболее предпочтительно 42,1-43,9% (мас./мас.) G1 и 10,6-13,3% (мас./мас.) G2 на общий гликан.

Предпочтительно антитело к α-синуклеину содержит

(а) последовательность VH SEQ ID NO: 16;

(б) последовательность VL SEQ ID NO: 17; или

(в) последовательность VH, определенную в (а), и последовательность VL, определенную в (б).

Более предпочтительно антитело к α-синуклеину содержит

(а) последовательность VH, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 16;

(б) последовательность VL, имеющую по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17; или

Еще более предпочтительно антитело к α-синуклеину содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 20 и легкую цепь SEQ ID NO: 21.

Предпочтительно моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны биспецифического антитела к CD20/CD3 или антитела к α-синуклеину, как раскрыто в контексте изобретения, связаны с N-ацетилглюкозамином.

В равной степени настоящее изобретение относится к среде для культивирования клеток с получением антитела, как раскрыто в контексте изобретения, имеющего моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны в клетке млекопитающего, причем среда для культивирования клеток содержит сульфгидрильную(ые) группу(ы) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации от более чем 4,0 мМ и менее чем 10,0 мМ и глюкозу в концентрации по меньшей мере более чем 3,0 г/л.

Предпочтительно среда для культивирования клеток представляет собой среду с определенным химическим составом, предпочтительно среду для культивирования клеток, не содержащую сыворотку, белки и/или олигопептиды, более предпочтительно среду с определенным химическим составом, более предпочтительно среду для культивирования клеток, не содержащую сыворотку, белки и олигопептиды.

В равной степени настоящее изобретение относится к клетке млекопитающего, продуцирующей биспецифическое антитело к CD20/CD3, как раскрыто в контексте изобретения, имеющему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, содержащему полинуклеотид, содержащий последовательность, имеющую 80% идентичности с полинуклеотидом, кодирующим первый антигенсвязывающий домен, содержащий первый и второй вариабельный домен тяжелой цепи (VH), как раскрыто в контексте изобретения, или содержащий последовательность, имеющую 80% идентичности с полинуклеотидом, содержащим последовательность, кодирующую второй антигенсвязывающий домен, содержащий первый и второй вариабельный домен легкой цепи (VL), как раскрыто в контексте изобретения, или

один или более векторов, содержащих такие полинуклеотиды,

причем указанную клетку культивируют в среде для культивирования клеток, как раскрыто в контексте изобретения.

Предпочтительно, клетка млекопитающего дополнительно содержит последовательность, имеющую 80% идентичности с полинуклеотидом, кодирующим первую и вторую тяжелые цепи, как раскрыто в контексте изобретения, или содержащую последовательность, имеющую 80% идентичности с полинуклеотидом, содержащим последовательность, кодирующую первую и вторую легкую цепь, как раскрыто в контексте изобретения, или

В равной степени настоящее изобретение относится к антителу к α-синуклеину, имеющему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, содержащему полинуклеотид, содержащий последовательность, имеющую 80% идентичности с полинуклеотидом, кодирующем вариабельный домен тяжелой цепи (VH), как описано в контексте изобретения, или полинуклеотид, содержащий последовательность, имеющую 80% идентичности с полинуклеотидом, кодирующим вариабельный домен легкой цепи (VL), как раскрыто в контексте изобретения, или

В равной степени настоящее изобретение относится к способу получения биспецифического антитела к CD20/CD3, как раскрыто в контексте изобретения, имеющего моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, причем указанный способ включает:

(а) культивирование клетки млекопитающего, как раскрыто в контексте изобретения, в среде для культивирования клеток, как раскрыто в контексте изобретения, причем концентрацию сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений по меньшей мере более чем 4,0 и менее чем 10,0 мМ и глюкозы по меньшей мере более чем 3,0 г/л в среде для культивирования клеток поддерживают в течение по меньшей мере 3, более предпочтительно в течение по меньшей мере 4 и еще более предпочтительно в течение по меньшей мере 5 дней,

(б) выделение указанного антитела.

Предпочтительно поддержание концентрации эффективно для продуцирования биспецифического антитела к CD20/CD3, имеющего 19,0-29,0% (мас./мас.) G1 и 1,3-2,8% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 20,0-28,0% (мас./мас.) G1 и 1,4-2,7% (мас./мас.) G2 на общий гликан; более предпочтительно 21,0-28,0% (мас./мас.) G1 и 1,5-2,7% (мас./мас.) G2 на общий гликан и наиболее предпочтительно 21,0-27,4% (мас./мас.) G1 и 1,5-2,6% (мас./мас.) G2 на общий гликан.

Предпочтительно культивирование клетки млекопитающего приводит к повышению титра указанного антитела по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 60% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 80%

относительно титра при соответствующем культивировании клетки млекопитающего без поддержания сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере более чем 4,0 и менее чем 10,0 мМ в среде для культивирования клеток. В качестве другого примера, культивирование клетки млекопитающего приводит к увеличению титра указанного антитела между 30 и 75% по отношению к титру при соответствующем культивировании клетки млекопитающего без поддержания сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере более чем 4,0 и менее чем 10,0 мМ в среде для культивирования клеток.

В равной степени настоящее изобретение относится к способу получения антитела к α-синуклеину, как раскрыто в контексте изобретения, имеющему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, причем указанный способ включает:

(б) выделение указанного антитела.

Предпочтительно концентрация эффективна для продуцирования антитела к α-синуклеину, содержащего 17,2-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,1-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; 25,4-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,5-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 27,2-47,0% G1 и 4,4-15,0% G2 на общий гликан; предпочтительно 40,0-46,0% (мас./мас.) G1 и 8,4-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; более предпочтительно 41,0-45,0% (мас./мас.) G1 и 9,5-14,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан и наиболее предпочтительно 42,1-43,9% (мас./мас.) G1 и 10,6-13,3% (мас./мас.) G2 на общий гликан.

Предпочтительно культивирование клетки млекопитающего приводит к повышению титра указанного антитела по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100%

относительно титра при соответствующем культивировании клетки млекопитающего без поддержания сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере более чем 4,0 и менее чем 10,0 мМ в среде для культивирования клеток.

Предпочтительно культивирование клетки млекопитающего приводит к продуцированию антитела к α-синуклеину, имеющему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, характеризующиеся

(i) повышенным связыванием белка-мишени по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 35%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 45% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50%;

(ii) повышенным связыванием неонатального Fc-рецептора (FcRn) по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 33%, более предпочтительно по меньшей мере на 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 45%; и/или

(iii) повышенным связыванием FcyRIIa по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 36%, еще более предпочтительно на 45% и наиболее предпочтительно на 50%,

относительно немоногалактозилированной (G1) и недигалактозилированной (G2) форм антитела к α-синуклеину при соответствующем культивировании клетки млекопитающего без поддержания сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере более чем 4,0 и менее чем 10,0 мМ в среде для культивирования клеток.

Способы, как раскрыто в контексте изобретения, предпочтительно включают культивирование клетки млекопитающего при начальной концентрации по меньшей мере более чем 3,0 и менее чем 10,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений. Предпочтительно способы дополнительно включают шаг предварительного культивирования клетки млекопитающего в среде для культивирования клеток до указанного культивирования. Предпочтительно концентрацию поддерживают в течение по меньшей мере 5 дней, предпочтительно в течение по меньшей мере 7 дней, более предпочтительно в течение по меньшей мере 10 дней, еще более предпочтительно в течение по меньшей мере 12 дней и наиболее предпочтительно в течение по меньшей мере 14 дней.

Предпочтительно, сульфгидрильная(ые) группа(ы) одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования клеток, как раскрыто в контексте изобретения, содержится(атся) в восстановленной и/или окисленной форме, более предпочтительно концентрация восстановленной формы указанного сульфгидрила составляет в диапазоне от более чем 4,0 мМ до менее чем 10,0 мМ и/или концентрация окисленной формы указанного сульфгидрила составляет в диапазоне от более чем 2,0 мМ до менее чем 5,0 мМ.

Предпочтительно способы, как раскрыто в контексте изобретения, дополнительно включают сбор биспецифического антитела к CD20/CD3 или антитела к α-синуклеину.

Предпочтительно способы, как раскрыто в контексте изобретения, дополнительно включают изменение уровня моногалактозилированных (G1) и дигалактозилированных (G2) гликанов биспецифического антитела к CD20/CD3 или антитела к α-синуклеину. Предпочтительно способы дополнительно включают составление биспецифического антитела к CD20/CD3 или антитела к α-синуклеину в лекарственный продукт.

Предпочтительно среда для культивирования клеток, как раскрыто в контексте изобретения, содержит по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равное или менее чем 9,0 мМ, предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равное или менее чем 8,0 мМ, более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равное или менее чем 7,0 мМ и еще более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равное или менее чем 6,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений.

Предпочтительно среда для культивирования клеток, как раскрыто в контексте изобретения, содержит сульфгидрильную(ые) группу(ы) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере 5,0 мМ и менее чем 10,0 мМ, предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равную или менее чем 9,0 мМ, более предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равную или менее чем 8,0 мМ, еще более предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равную или менее чем 7,0 мМ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равную или менее чем 6,0 мМ.

Предпочтительно среда для культивирования клеток, как раскрыто в контексте изобретения, содержит по меньшей мере более чем 2,0 г/л глюкозы, предпочтительно по меньшей мере более чем 3,0 г/л глюкозы и более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 г/л глюкозы.

Предпочтительно среда для культивирования клеток содержит не более 13,0 г/л глюкозы, предпочтительно не более 8,0 г/л, более предпочтительно не более 7,0 г/л, еще более предпочтительно не более 6,0 г/л и наиболее предпочтительно не более 5,0 г/л глюкозы.

Предпочтительно среда для культивирования клеток содержит от более чем 2,0 г/л до не более 13,0 г/л глюкозы, предпочтительно от более чем 2,0 г/л до не более 8,0 г/л глюкозы, более предпочтительно от более чем 2,0 г/л до не более 7,0 г/л глюкозы, еще более предпочтительно от более чем 2,0 г/л до не более 6,0 г/л глюкозы и наиболее предпочтительно от более чем 2,0 г/л до не более 5,0 г/л глюкозы.

Предпочтительно одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) среды для культивирования клеток, как раскрыто в контексте изобретения, выбрано(ы) из группы, состоящей из цистеина, цистина, сукцимера, метимазола, цистеамина, азатиоприна, меркаптопурина, S-метилцистеина, селеноцистеина, S-фосфоцистеина, 4'-фосфопантетеина, бутирилтиохолина, карбоцистеина, N-сульфоцистеина, алетина, ацетилцистеина, димеркапрола, ко фермента М, ауротиомалата натрия, пантетина, буцилламина, метилселеноцистеина, димеркаптоянтарной кислоты, амида ацетилцистеина, тиогликолевой кислоты, 2,3-димеркаптопропанола, О-метилмеркаптоэтанола, меркаптоуксусной кислоты, β-меркаптопропионовой кислоты, метилмеркаптана, S-метилмеркаптоэтанола, глутатиона, производных глутатиона и их комбинации. Более предпочтительно одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) выбрано(ы) из группы, состоящей из цистеина, цистина и их комбинации. Еще более предпочтительно одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) представляет собой цистеин, и причем концентрация цистеина в среде для культивирования клеток составляет более чем 4,0 мМ и менее чем 10,0 мМ, предпочтительно концентрация цистеина составляет по меньшей мере 5,0 мМ и равна или менее чем 6,0 мМ. В равной степени предпочтительно одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) представляет собой цистин, и причем концентрация цистина в среде для культивирования клеток составляет более чем 2,0 мМ и менее чем 5,0 мМ, предпочтительно концентрация цистина составляет по меньшей мере 3,0 мМ и равна или менее чем 4,0 мМ.

Предпочтительно культивирование клетки млекопитающего по способу, как раскрыто в контексте изобретения, проводят в крупномасштабном биореакторе, предпочтительно в биореакторе объемом 10000 л.

В равной степени настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу к CD20/CD3, как раскрыто в контексте изобретения, имеющему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, полученные с помощью способа или клетки млекопитающего, как раскрыто в контексте изобретения.

В равной степени настоящее изобретение относится к антителу к α-синуклеину, как раскрыто в контексте изобретения, имеющему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, полученные с помощью способа или клетки млекопитающего, как раскрыто в контексте изобретения.

Предпочтительно, изобретение относится к биспецифическому антителу к CD20/CD3, как раскрыто в контексте изобретения, имеющему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, для применения в качестве лекарственного средства. Более предпочтительно биспецифическое антитело к CD20/CD3, как раскрыто в контексте изобретения, предназначено для лечения пациентов с типами рака, связанными с В-клетками, предпочтительно для применения в лечении пациентов с хроническим лейкозом и лимфомой.

В равной степени предпочтительно изобретение относится к антителу к α-синуклеину, имеющему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, для применения в качестве лекарственного средства. Более предпочтительно антитело к α-синуклеину, как раскрыто в контексте изобретения, предназначено для лечения пациентов с болезнью Паркинсона.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ФИГУР

Фигура 1. Путь превращения глюкозы при образовании УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в СНО K1M. ЕС 2.7.7.9: УТФ: α-D-глюкозо-1-фосфат уридилилтрансфераза. УДФ-Glc-E: Уридиндифосфатглюкозоэпимераза.

Фигура 2. Комбинированные пути взаимопревращения УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в СНО K1M. ЕС 2.7.7.9: УТФ: α-D-глюкозо-1-фосфат уридилилтрансфераза. УДФ-Glc-E: Уридиндифосфатглюкозоэпимераза. УДФ-Gal-T: УДФ-α-D-глюкоза: α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза.

Фигура 3. Модулирование путей взаимопревращения УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в СНО K1M сульфгидрильными соединениями. УДФ-Glc-E: Уридиндифосфатглюкозоэпимераза. УДФ-Gal-T: УДФ-α-D-глюкоза: α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза.

Фигура 4. Модулирование путей взаимопревращения УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в СНО K1M с L-цистином в среде для культивирования клеток. УДФ-Glc-E: Уридиндифосфатглюкозоэпимераза. УДФ-Gal-T: УДФ-α-D-глюкоза: α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза.

Фигура 5. УДФ-галактоза образуется из УДФ-глюкозы и используется в аппарате Гольджи для галактозилирования белка. УДФ-Glc-E: Уридиндифосфатглюкозоэпимераза. УДФ-Gal-T: УДФ-α-D-глюкоза: α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза. ЕС2.4.1.38: B-N-ацетилглюкозаминилгликопептид бета-1,4-галактозилтрансфераза.

Фигура 6А. Влияние различных концентраций L-цистеина на форму G0 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L965 с 6 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Показан процент формы G0 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 6Б. Влияние различных концентраций L-цистеина на форму G1 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L965 с 6 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Показан процент формы G1 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 6В. Влияние различных концентраций L-цистеина на форму G2 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L965 с 6 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Показан процент формы G2 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 6Г. Влияние различных концентраций L-цистеина на титр продукта антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L965 с 6 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Показан процент титра продукта антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 6Д. Влияние различных концентраций L-цистеина на рост клеток (IVCD) культуры клеток СНО L965, продуцирующих антитело к α-синуклеину, с 6 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Процент роста клеток (IVCD) показан в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 7А. Влияние различных концентраций L-цистеина на форму G0 биспецифического антитела к CD20/CD3 в культуре клеток СНО Т104 с 5 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Показан процент формы G0 биспецифического антитела к CD20/CD3 в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 7Б. Влияние различных концентраций L-цистеина на форму G1 биспецифического антитела к CD20/CD3 в культуре клеток СНО Т104 с 5 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Показан процент формы G1 биспецифического антитела к CD20/CD3 в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 7В. Влияние различных концентраций L-цистеина на титр продукта биспецифического антитела к CD20/CD3 в культуре клеток СНО Т104 с 5 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Показан процент титра продукта биспецифического антитела к CD20/CD3 в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 7Г. Влияние различных концентраций L-цистеина на рост клеток (IVCD) культуры клеток СНО Т104, продуцирующих биспецифическое антитело к CD20/CD3, с 5 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Процент роста клеток (IVCD) показан в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 8А. Влияние различных концентраций L-цистеина на форму G0 биспецифического антитела к CD20/CD3 в культуре клеток СНО Т104 с 5 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Показан процент формы G0 биспецифического антитела к CD20/CD3 в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 8Б. Влияние различных концентраций L-цистеина на форму G1 биспецифического антитела к CD20/CD3 в культуре клеток СНО Т104 с 5 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Показан процент формы G1 биспецифического антитела к CD20/CD3 в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 8 В. Влияние различных концентраций L-цистеина на титр продукта биспецифического антитела к CD20/CD3 в культуре клеток СНО Т104 с 5 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Показан процент титра продукта биспецифического антитела к CD20/CD3 в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 8Г. Влияние различных концентраций L-цистеина на рост клеток (IVCD) культуры клеток СНО Т104, продуцирующих биспецифическое антитело к CD20/CD3, с 5 мМ L-цистеина или 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования. Процент роста клеток (IVCD) показан в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 9А. Влияние различных концентраций L-цистина на форму G0 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L967 с 2 мМ L-цистина или 4 мМ L-цистина. Показан процент формы G0 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 9Б. Влияние различных концентраций L-цистина на форму G1 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L967 с 2 мМ L-цистина или 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент формы G1 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 9В. Влияние различных концентраций L-цистина на форму G2 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L967 с 2 мМ L-цистина или 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент формы G2 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 9Г. Влияние различных концентраций L-цистина на титр продукта антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L967 с 2 мМ L-цистина или 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент титра продукта антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 9Д. Влияние различных концентраций L-цистина на рост клеток (IVCD) культуры клеток СНО L967, продуцирующих антитело к α-синуклеину, с 2 мМ L-цистина или 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Процент роста клеток (IVCD) показан в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 10A. Влияние различных концентраций L-цистина на форму G0 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L971 с 2 мМ L-цистина или 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент формы G0 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 10Б. Влияние различных концентраций L-цистина на форму G1 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L971 с 2 мМ L-цистина или 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент формы G1 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 10В. Влияние различных концентраций L-цистина на форму G2 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L971 с 2 мМ L-цистина или 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент формы G2 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 10Г. Влияние различных концентраций L-цистина на титр продукта антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L971 с 2 мМ L-цистина или 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент титра продукта антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 10Д. Влияние различных концентраций L-цистина на рост клеток (IVCD) культуры клеток СНО L971, продуцирующих антитело к α-синуклеину, с 2 мМ L-цистина или 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Процент роста клеток (IVCD) показан в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 11А. Влияние различных концентраций Е-цистина/Е-цистеина на форму G1 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L971 с 6 мМ L-цистеина или 3 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент формы G1 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 11Б. Влияние различных концентраций L-цистина/L-цистеина на форму G2 антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L971 с 6 мМ L-цистеина или 3 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент формы G2 антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 11В. Влияние различных концентраций L-цистина/L-цистеина на относительный уровень связывания FcRn антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L971 с 6 мМ L-цистеина или 3 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент относительного уровня связывания FcRn антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 11Г. Влияние различных концентраций L-цистина/L-цистеина на относительный уровень связывания Fcy-RIIa (Н131) антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L971 с 6 мМ L-цистеина или 3 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент относительного уровня связывания Fcy-RIIa (Н131) антитела к α-синуклеину в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 11Д. Влияние различных концентраций L-цистина/L-цистеина на относительное связывание с мишенью антитела к α-синуклеину в культуре клеток СНО L971 с 6 мМ L-цистеина или 3 мМ L-цистина в среде для продуцирования. Показан процент относительного связывания с мишенью в конце 14-дневного процесса продуцирования.

Фигура 12. Схематическое изображение сайтов гликозилирования в Fc-области (№1 Fc-гликозилирование), сайтов связывания эффекторов FcγIIa и FcRn (№2 связывание FcγIIa и связывание FcRn) сайта связывания антигена в Fab-области (4 Fab-связывание) и модификации С-конца (№5 С-концевое изменение) антитела.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Рекомбинантные белки, имеющие различные паттерны гликозилирования, особенно паттерны галактозилирования, обычно получают с помощью ферментативного процесса продуцирования с использованием экспрессионных систем млекопитающих. Посттрансляционное гликозилирование, в частности галактозилирование, белков необходимо для выполнения важных физико-химических свойств и функций, таких как растворимость белков, стабильность, клиренс, иммуногенность и иммунные эффекторные функции. В связи с этим различия в паттернах гликозилирования, особенно паттернов галактозилирования рекомбинантно продуцируемых белков, в последнее время стали предметом большого внимания в научном сообществе, поскольку рекомбинантные белки, продуцируемые в качестве возможных профилактических и терапевтических средств, приближаются к клинической практике. Олигосахаридные боковые цепи гликопротеинов могут влиять на функцию белка (Wittwer and Howard, Biochem. 29 (1990) 4175-4180) и на внутримолекулярное взаимодействие между частями гликопротеина, приводящее к конформации и представлению трехмерной поверхности белка (Hart, Curr. Op.Cell Biol., 4 (1992) 1017-1023: Goochee, et al., Bio/Technology 9 (1991) 1347-1355; Parekh, Curr, Op. Struct, Biol. 1 (1991) 750-754). Например, статус галактозилирования рекомбинантного белка регулируется различными ферментами, и различия в функции одного или более из этих ферментов могут оказывать существенное влияние на статус галактозилирования рекомбинантного белка. В этом контексте были продемонстрированы множественные эффекты модуляции ферментативного пути УДФ-сахара на рекомбинантных клетках млекопитающих, например, клетках СНО, и включают без ограничения влияние на рост клеток, на продуктивность рекомбинантного белка и/или качество белка, в частности, на уровень галактозилирования. Было продемонстрировано дополнительное влияние на биологические функции рекомбинантных mAb. Поэтому важно поддерживать характер галактозилирования рекомбинантных белков, особенно белков, предназначенных для использования в качестве терапевтических средств.

Известно, что качество рекомбинантных белков, в частности терапевтических белков, таких как антитела, зависит от различных параметров, таких как концентрация различных питательных веществ, присутствующих в среде, поскольку такие питательные вещества, например, молекулы сахара действуют как предшественники пула сахарных нуклеотидов внутри клеток, необходимого для гликозилирования. Различные уровни концентрации сахарных нуклеотидов в клетках могут оказывать существенное влияние на гетерогенность антител, что особенно важно в периодических процессах или процессах с подпиткой, где постоянное качество продукта необходимо для достижения заранее определенного клинического результата.

Таким образом, одной из основных целей данного изобретения является использование сульфгидрильных соединений, таких как цистеин или цистин, для регулирования внутриклеточной концентрации УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в клетках млекопитающих in vivo, таких как СНО K1 и ее производные клеточные линии, тем самым улучшая качество конечного продукта для заранее определенных клинических применений.

В этом контексте настоящее изобретение относится к гликопротеину, в частности к рекомбинантному гликопротеину, имеющему моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, а также к средствам и способам получения указанного гликопротеина. Следовательно, гликопротеин, как описано в данном документе и в контексте изобретения, может быть, например, терапевтическим гликопротеином, таким как рекомбинантный гликопротеин. Таким образом, как раскрыто в данном документе и используется в контексте изобретения, гликопротеин, такой как рекомбинантный белок, представляет собой белок, который может быть связан с одним или более гликанами. Как раскрыто в данном документе и проиллюстрировано в прилагаемых примерах, белок, связанный с одним или более гликанами, относится к белку, имеющему моногалактозилированные (G1) или дигалактозилированные (G2) гликаны. Белок, имеющий один или более гликанов, может иметь несколько сайтов, с которыми может быть связан гликан. Специалисту в данной области техники известны потенциальные сайты, где гликан может быть связан с белком, раскрыто в данном документе и в контексте изобретения. Например, белок может содержать по меньшей мере один, более предпочтительно по меньшей мере два галактозилированных гликана, причем галактозилированные гликаны могут быть связаны с N-ацетилглюкозамином. Такие гликаны могут быть или моногалактозилированные (G1), или дигалактозилированные (G2). Как описано в данном документе, уровень моногалактозилированного (G1) или дигалактозилированного (G2) белка можно измерить средствами и способами, известными специалисту в данной области техники, и как показано в прилагаемых примерах.

Как раскрыто в данном документе и в контексте изобретения, рекомбинантный белок может представлять собой терапевтический белок. Такой терапевтический белок может представлять собой, например, антитело, но не ограничиваться им. Вследствие этого, указанный гликопротеин, например, антитело может использоваться в качестве лекарственного средства. Терапевтические белки могут включать, но не ограничиваться ими, терапевтические белки для применения в лечении В-клеточных пролиферативных нарушений, таких как неходжкинская лимфома и хронический лимфолейкоз, болезнь Паркинсона и родственные нарушения. В одном конкретном варианте осуществления рекомбинантный белок может представлять собой антитело. Например, антитело, которое должно продуцироваться клеткой млекопитающего, представляет собой антитело, предназначенное для использования в терапии, или антитело, используемое в качестве потенциального лекарственного средства для разработки лекарственного средства для применения в терапии. В одном варианте осуществления рекомбинантный белок может представлять собой антитело к α-синуклеину или биспецифическое антитело к CD20/CD3.

Указанный гликопротеин, например, антитело, может продуцироваться клеткой млекопитающего, которая содержит полинуклеотид, кодирующий указанный гликопротеин. Например, клетки млекопитающего, как описано в данном документе и в контексте изобретения, можно культивировать в крупномасштабном биореакторе, таком как биореактор объемом 10000 л. Клетки яичника китайского хомячка (СНО) являются наиболее часто используемыми эукариотическими хозяевами для получения рекомбинантного терапевтического белка.

Как описано в данном документе и в контексте изобретения, гликопротеин может представлять собой антитело, такое как биспецифическое антитело, например, антитело к CD20/CD3. Указанное антитело может быть экспрессировано на векторе, содержащем один или более полинуклеотидов, кодирующих указанное антитело. В качестве другого примера, антитело может представлять собой антитело к α-синуклеину и указанное антитело может быть клонировано в подходящий вектор, такой как без ограничения либо LoxP.SV40.Puro.CMVi.FseI nbe, либо вектор экспрессии Loxfas.puro.CMV.2L.vl. Клетки-хозяева СНО-K1M TI трансфицировали этой полицистронной плазмидой для получения стабильных эукариотических клеточных линий. Используемый в данном документе термин «вектор» относится к любому генетическому элементу, такому как плазмида, фаг, транспозон, космида, хромосома, вирус, вирион и т.д., который способен к репликации при связывании с соответствующими контрольными элементами и который может осуществлять перенос последовательностей генов между клетками. Вследствие этого, термин включает носители для клонирования и экспрессии, а также вирусные векторы. Например, один или более векторов, описанных в настоящем документе, могут быть полицистронными векторами. Используемый в данном документе термин «полицистронный» относится к мРНК, кодирующей более одной полипептидной цепи. В качестве одного конкретного примера можно использовать более одного вектора, где первый вектор может экспрессировать первую легкую цепь и вторую тяжелую цепь, а второй вектор может экспрессировать вторую легкую цепь и первую тяжелую цепь. Специалисту в данной области техники известно, как сконструировать векторы, подходящие для экспрессии антитела, как описано в данном документе и в контексте изобретения. Кроме того, для образования рекомбинантных клеточных линий клетка-хозяин может быть совместно трансфицирована одним или более векторами, причем указанные векторы могут содержать маркер отбора, такой как ген дигидрофолатредуктазы (ДГФР). Например, экспрессия мышиного гена ДГФР управляется ранним промотором вируса обезьян 40 (SV40) и терминируется сигналом полиаденилирования SV40 (SV40 поли А).

Кроме того, среда для культивирования клеток, как описано в данном документе и в контексте изобретения, может использоваться для получения указанного гликопротеина, такого как антитела, причем среда для культивирования клеток содержит сульфгидрильную(ые) группу(ы) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации более чем 4,0 мМ и менее чем 10,0 мМ и глюкозу в концентрации по меньшей мере более чем 3,0 г/л. Среда для культивирования клеток может представлять собой среду с определенным химическим составом, предпочтительно среду для культивирования клеток, не содержащую сыворотку, белки и/или олигопептиды. Например, обычные среды для культивирования клеток с определенным химическим составом могут содержать до 100 компонентов, которые можно сгруппировать по источникам энергии, аминокислотам, витаминам, микроэлементам и неорганическим солям, производным нуклеиновых кислот, жирным кислотам и липидам и некоторым другим.

Как описано в настоящем документе, клетку млекопитающего, продуцирующую гликопротеин, как описано в настоящем документе и проиллюстрировано в прилагаемых примерах, можно культивировать способом, включающим

(а) культивирование клетки млекопитающего в среде для культивирования клеток, как описано в данном документе, причем сульфгидрильное(ые) группу(ы) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере более 4,0 и менее чем 10,0 мМ и по меньшей мере более чем 3,0 г/л глюкозы в среде для культивирования клеток поддерживают по меньшей мере в течение 3, более предпочтительно по меньшей мере в течение 4 и еще более предпочтительно по меньшей мере в течение 5 дней,

(б) выделение указанного гликопротеина.

Указанное культивирование клетки млекопитающего может приводить к увеличению титра указанного гликопротеина по сравнению с титром при соответствующем культивировании клетки млекопитающего без поддержания сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере более чем 4,0 и менее чем 10,0 мМ в среде для культивирования клеток. Указанное культивирование может дополнительно привести образованию гликопротеина, имеющего моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, как описано в данном документе, и характеризующегося повышенным связыванием белка-мишени, повышенным связыванием неонатального Fc-рецептора (FcRn) и/или повышенным связыванием FcyRIIa по сравнению с немоногалактозилированными (G1) и недигалактозилированными (G2) формами гликопротеина при соответствующем культивировании клетки млекопитающего без поддержания сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере более чем 4,0 и менее чем 10,0 мМ в среде для культивирования клеток. В частности, культивирование клетки млекопитающего может включать культивирование при начальной концентрации по меньшей мере более чем 3,0 и менее чем 10,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений. Способ может дополнительно включать шаг предварительного культивирования клетки млекопитающего в среде для культивирования клеток до указанного культивирования.

Процесс культивирования клеток, раскрытый в данном документе и в контексте изобретения, относится к процессу культивирования клеток, начинающемуся с инокуляции клеток в среду для культивирования клеток, и может заканчиваться сбором клеток из среды для культивирования клеток. Упомянутая инокуляция относится к 1-му дню процесса культивирования клеток, а сбор клеток из среды культивирования клеток может быть, например, но не ограничиваясь этим, на 12-й, 13-й или 14-й день культивирования клеток.

Следовательно, специалисту в данной области техники известно, как выбрать подходящую продолжительность процесса культивирования клеток, исходя из общеизвестных сведений. Это также иллюстрируется прилагаемыми примерами. Весь процесс культивирования клеток, раскрытый в данном документе и используемый в контексте изобретения, может включать фазу роста и фазу продуцирования. Как описано в данном документе и используется в контексте изобретения, концентрацию сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений поддерживают в течение по меньшей мере 5 дней, предпочтительно в течение по меньшей мере 7 дней, более предпочтительно в течение по меньшей мере 10 дней, еще более предпочтительно в течение по меньшей мере 12 дней и наиболее предпочтительно в течение по меньшей мере 14 дней в процессе культивирования клеток.

Способ, как раскрыто в данном документе и в контексте изобретения, может дополнительно включать шаг предварительного культивирования клеток млекопитающих в среде для культивирования клеток. Указанный шаг предварительного культивирования может включать культивирование клетки в среде для культивирования клеток, содержащей от 4,0 мМ до 10,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений, как раскрыто в данном документе и в контексте изобретения, или может не содержать сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в указанной концентрации в среде для культивирования клеток. В частности, среда для культивирования клеток на шаге предварительного культивирования может либо включать среду, используемую для инокуляции биореактора клеткой млекопитающего, либо может включать среду, не включающую среду, используемую для инокуляции биореактора клеткой млекопитающего, как раскрыто в данном документе и в контексте изобретения.

Сульфгидрильная(ые) группа(ы) одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования клеток может содержатся в окисленной форме и/или в восстановленной форме. Указанная окисленная форма означает, что сульфгидрильная(ые) группа(ы) одного или более сульфгидрильных соединений содержится(атся) в среде для культивирования клеток в «связанной форме», в то время как восстановленная форма означает, что сульфгидрильная(ые) группа(ы) одного или более сульфгидрильных соединений содержатся в «свободной форме», что означает, что сульфгидрильная(ые) группа(ы) содержит(ат) свободную группу -SH. Среда для культивирования клеток, как раскрыто в данном документе и используется в контексте изобретения, может содержать от 4 мМ до 10 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в их окисленной форме и/или в восстановленной форме. Например, одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) может представлять собой цистеин, цистин, сукцимер, метимазол, цистеамин, азатиоприн, меркаптопурин, S-метилцистеин, селеноцистеин, S-фосфоцистеин, 4'-фосфопантетеин, бутирилтиохолин, карбоцистеин, N-сульфоцистеин, алетин, ацетилцистеин, димеркапрол, кофермент М, ауротиомалат натрия, пантетин, буцилламин, метилселеноцистеин, димеркаптоянтарную кислоту, амид ацетилцистеина, тиогликолевую кислоту, 2,3-димеркаптопропанол, О-метилмеркаптоэтанол, меркаптоуксусную кислоту, β-меркаптопропионовую кислоту, метилмеркаптан, S-метилмеркаптоэтанол, глутатион, производные глутатиона. Например, сульфгидрильная группа одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования клеток, как раскрыто в данном документе и используется в контексте изобретения, может представлять собой цистеин. В качестве другого примера, одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) в среде для культивирования клеток, как раскрыто в данном документе и используется в контексте изобретения, может представлять собой цистин. В качестве еще другого примера, одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) в среде для культивирования клеток, как раскрыто в данном документе и используется в контексте изобретения, может представлять собой цистин и цистеин.

Способ может дополнительно включать измерение уровня моногалактозилированных (G1) и дигалактозилированных (G2) гликанов гликопротеина, такого как антитело, как описано в данном документе.

Специалисту в данной области известны средства и способы измерения и определения указанного содержания сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования клеток. Такая концентрация может быть получена путем определения количества сульфгидрильного(ых) соединения(й) с помощью масс-спектометрии и расчета количества сульфгидрильной(ых) группы (групп), присутствующей в указанном(ых) сульфгидрильном(ых) соединении(ях). Дополнительные средства и способы измерения и определения концентрации сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений находятся в пределах общих знаний специалиста в данной области техники.

Способ или среда для культивирования клеток, как описано в данном документе, может содержать, например, по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равное или менее чем 9,0 мМ, предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равное или менее чем 8,0 мМ, более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равное или менее чем 7,0 мМ и еще более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равное или менее чем 6,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений. В качестве другого примера среда для культивирования клеток содержит сульфгидрильную(ые) группу(ы) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере 5,0 мМ и менее чем 10,0 мМ, предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 9,0 мМ, более предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 8,0 мМ, еще более предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 7,0 мМ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 6,0 мМ.

В качестве конкретного примера, одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) представляет(ют) собой цистеин, и концентрация цистеина в среде для культивирования клеток составляет более чем 4,0 мМ и менее чем 10,0 мМ, предпочтительно концентрация цистеина составляет по меньшей мере 5,0 мМ и равна или менее чем 6,0 мМ. В качестве другого конкретного примера, одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) представляет(ют) собой цистин, и концентрация цистина в среде для культивирования клеток составляет более чем 2,0 мМ и менее чем 5,0 мМ, предпочтительно концентрация цистина составляет по меньшей мере 3,0 мМ и равна или менее чем 4,0 мМ.

В большинстве химически определенных средах для культивирования для культивирования клеток млекопитающих глюкоза является наиболее часто используемым углеводом, поскольку ее можно эффективно транспортировать в клетки (Wright et al., J Exp Biol 196 (1994) 197-212). Глюкоза представляет собой простой моносахарид. Помимо использования в качестве источника энергии, глюкоза также может использоваться в качестве строительных блоков для многих других молекул и структур. Чтобы служить этим целям, данный моносахарид должен быть сначала «активирован». Эта активация включает добавление нуклеозид-дифосфатной группы к сахару, что приводит к образованию нуклеотидного сахара. Например, в клетках СНО подавляющее большинство нуклеотидов-сахаров синтезируется в хорошо охарактеризованных реакциях глюкозы. Как показано на Фигуре 1, D-глюкоза превращается в D-глюкозо-1-фосфат.Активация D-глюкозо-1-фосфата осуществляется с помощью UTP-глюкозо-1-фосфат уридилилтрансферазы (ЕС 2.7.7.9) дает цитоплазматический пул УДФ-глюкозы (Turnquist and Hansen, The Enzymes, 3rd. Ed. (Boyer, P. D., ed.) 8 (1973) 51-71; Chang et al., Eur. J. Biochem. 236 (1996) 723-728).

Вследствие этого, среда для культивирования клеток, как описано в данном документе и используется в контексте изобретения, может, например, содержать по меньшей мере более чем 3,0 г/л глюкозы и более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 г/л глюкозы. Кроме того или в качестве альтернативы, среда для культивирования клеток содержит, например, не более 13,0 г/л глюкозы, предпочтительно не более 8,0 г/л, более предпочтительно не более 7,0 г/л, еще более предпочтительно не более 6,0 г/л и наиболее предпочтительно не более 5,0 г/л глюкозы. В качестве конкретного примера, среда для культивирования клеток содержит от более чем 3,0 г/л до не более 13 г/л глюкозы, предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 8,0 г/л глюкозы, более предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 7,0 г/л глюкозы, еще более предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 6,0 г/л глюкозы и наиболее предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 5,0 г/л глюкозы.

В частности, среда для культивирования клеток для инокуляции и культивирования клеток, как раскрыто в данном документе и в контексте изобретения, может содержать от 3,0 мМ до 10,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений, где сульфгидрильные соединения могут представлять собой цистеин и/или цистин. Например, клетки, продуцирующие рекомбинантный белок, могут представлять собой клетки СНО, продуцирующие антитело к α-синуклеину или биспецифическое антитело к CD20/CD3, и могут культивироваться в среде для культивирования клеток, содержащей 6 мМ цистеина. В качестве другого примера, клетки, продуцирующие рекомбинантный белок, могут представлять собой клетки СНО, продуцирующие антитело к α-синуклеину или биспецифическое антитело к CD20/CD3, и могут культивироваться в среде для культивирования клеток, содержащей 5 мМ цистеина. В качестве еще другого примера, клетки, продуцирующие рекомбинантный белок могут представлять собой клетки СНО, продуцирующие антитело к α-синуклеину или биспецифическое антитело к CD20/CD3, и могут культивироваться в среде для культивирования клеток, содержащей 4 мМ цистина. В качестве еще другого примера, клетки, продуцирующие рекомбинантный белок могут представлять собой клетки СНО, продуцирующие антитело к α-синуклеину или биспецифическое антитело к CD20/CD3, и могут культивироваться в среде для культивирования клеток, содержащей цистин и цистеин, такой как комбинированные цистин и цистеин с концентрацией от 4,0 мМ до 5,0 мМ.

Как раскрыто в данном документе и в контексте изобретения, клетки могут культивироваться в среде для культивирования клеток, содержащей по меньшей мере более чем 3 г/л глюкозы. Указанная глюкоза может присутствовать во время инокуляции клетки средой для культивирования клеток, как описано в данном документе и в контексте изобретения, или может быть добавлена во время процесса культивирования клеток, например, между 4 и 14 днями процесса культивирования клеток. В одном варианте осуществления глюкоза может присутствовать во время фазы продуцирования в процессе культивирования клеток.

Как показано в прилагаемых примерах, клетки могут культивироваться в присутствии 6 мМ цистеина и в присутствии по меньшей мере более чем 3 г/л, а именно равной или более чем 4 г/л глюкозы. Как также показано в прилагаемых примерах, клетки могут культивироваться в присутствии 5 мМ цистеина и в присутствии по меньшей мере более чем 3 г/л, а именно равной или более чем 4 г/л глюкозы.

Как показано в примерах, глюкоза может быть добавлена в среду для культивирования клеток между 4-м и 14-м днем процесса культивирования клеток. Другими словами, как показано в примерах, среда для культивирования клеток может содержать по меньшей мере более чем 3 г/л глюкозы с момента добавления глюкозы в среду для культивирования клеток, например, между 4 и 14 днями. Глюкоза может быть добавлена в среду для культивирования клеток, как описано в настоящем документе, и использована в контексте изобретения в процессе периодической подпитки или перфузии, но процесс, посредством которого глюкоза добавляется в указанную среду для культивирования клеток, не ограничивается этим. Следует понимать, что концентрация глюкозы, присутствующая в среде для культивирования клеток, относится к концентрации, которая не нарушает рост клеток и/или продуцирование рекомбинантного белка клеткой. Другими словами, выбирается концентрация глюкозы, подходящая для поддержания и/или увеличения роста клеток и/или продуцирования рекомбинантного белка клеткой.

Как показано в прилагаемых примерах, указанное антитело к α-синуклеину или биспецифическое антитело к CD20-CD3 может быть получено в клеточной линии СНО, такой как клеточная линия СНО K1M. Следует понимать, что рекомбинантный белок, как раскрыто в данном документе и в контексте изобретения, может продуцироваться в любой клеточной линии млекопитающего, подходящей для продуцирования указанного рекомбинантного белка. В этом контексте специалисту в данной области известны такие подходящие клетки млекопитающих, и он знает, как выбрать такую клетку млекопитающего для получения рекомбинантного белка, как описано в данном документе и в контексте изобретения. Указанные клетки, продуцирующие рекомбинантный белок, такой как антитело к α-синуклеину или биспецифическое антитело к CD20-CD3, могут включать, но не ограничиваться ими, клетки СНО, клетки Vero, клетки ВНК, клетки COS и клетки HEK293/293Т. Клетки млекопитающих можно культивировать в среде для культивирования клеток с определенным химическим составом. Среды для культивирования клеток, используемые в контексте изобретения, раскрыты в данном документе. В этом отношении специалисту в данной области известны подходящие коммерчески доступные среды для культивирования клеток с определенным химическим составом, такие как DMEM, но не ограничивающиеся ими, для использования в контексте изобретения. Как показано в прилагаемых примерах, бессывороточную среду с определенным химическим составом можно использовать для культивирования клеток млекопитающих. В одном варианте осуществления среда для культивирования клеток представляет собой среду с определенным химическим составом, предпочтительно среду для культивирования клеток, не содержащую сыворотку, белки и/или олигопептиды.

Как раскрыто в данном документе и проиллюстрировано приложенными примерами, клетки млекопитающих, такие как клетки СНО, можно культивировать, например, до 14 дней в среде для культивирования, содержащей от 4,0 мМ до 10 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений, таких как цистеин и/или цистин, и по меньшей мере более 3 г/л глюкозы.

Способ может дополнительно включать сбор гликопротеина, такого как антитело, как описано в данном документе. Следует понимать, что клетки можно собирать из среды для культивирования клеток во время или в конце фазы продуцирования. Следовательно, специалист в данной области может выбрать подходящий момент времени для сбора клеток из среды для культивирования клеток, как это также показано в прилагаемых примерах. Способ может дополнительно включат составление гликопротеина, такого как антитело, как описано в данном документе, в лекарственный продукт.

Все аспекты, которые описаны ниже в контексте среды для культивирования клеток, используемой в способе по настоящему изобретению, также относятся к среде для культивирования клеток, используемой в контексте настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным белкам, имеющим желаемое содержание галактозилированных гликанов, причем рекомбинантный белок может содержать по меньшей мере моногалактозилированные, более предпочтительно дигалактозилированные гликаны. Предпочтительно галактозилированные гликаны связаны с N-ацетилглюкозамином. Все аспекты, которые описаны ниже в контексте рекомбинантного белка, полученного с помощью способа по настоящему изобретению, также относятся к рекомбинантному белку, предложенному в контексте настоящего изобретения. Также в настоящем изобретении предложены рекомбинантные белки, полученные с помощью способа по настоящему изобретению, и раскрыты далее.

В этом контексте в настоящем изобретении обнаружено, что сульфгидрильное(ые) соединение(ия) и их производные, например, L-цистеин и/или цистин, могут использоваться для активации УДФ-α-D-глюкозы: α-D-галактоза- 1-фосфат уридилилтрансферазы (ЕС 2.7.7.12). Следовательно, УДФ-α-D-глюкоза: α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза может эффективно активироваться. Кроме того, сульфгидрильное(ые) соединение(ия) могут использоваться для модулирования пути УДФ-сахар, в частности, in vivo. Например, L-цистин, окисленная димерная форма L-цистеина, может быть использована для модулирования пути УДФ-сахар, в частности, in vivo. В частности, путь УДФ-сахар, в частности, in vivo, можно модулировать путем добавления сульфгидрильных соединений и их производных, таких как цистин и/или цистеин, для увеличения роста клеток, продуктивности рекомбинантного белка и/или качества белка в организме, в частности, повышения уровня галактозилирования рекомбинантного белка культурой клеток млекопитающих.

Термин «степень окисления» относится к степени, в которой окисляемая(ые) сульфгидрильная(ые) группа(ы) одного или более сульфгидрильных соединений подвергается(ются) окислению в среде для культивирования клеток. Например, если сульфгидрильное соединение содержит одну сульфгидрильную группу, которая окисляется путем образования дисульфидного мостика с сульфгидрильной группой другого (того же или другого) сульфгидрильного соединения, тогда увеличение массы указанного сульфгидрильного соединения указывает на окисление сульфгидрильной группы. Статус окисления можно измерить с помощью показателей, известных специалистам в области химии белков и пептидов, включая, без ограничения, анализ числа окисленных остатков, интенсивность пика масс-спектра, интегрированную площадь масс-спектра и т.п.В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов, предложенных в данном документе, степень окисления указывается в процентах, где 0% относится к отсутствию окисления, а 100% относится к полному окислению потенциально окисляемой сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в среде. Термин «потенциально окисляемая сульфгидрильная группа» и т.п.относится к общему количеству сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в среде, которые могут подвергаться окислению, например, путем образования дисульфидного мостика.

Термины «неокисленная сульфгидрильная группа» и т.п. относятся к количеству сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в среде, которая не подверглась окислению. Увеличение массы сульфгидрильного соединения по сравнению с массой того же сульфгидрильного соединения, которое не окислено, отражает количество окисленных сульфгидрильной(ых) группы (групп) в сульфгидрильном соединении. Увеличение количества сульфгидрильного(ых) соединения(ий), имеющего(их) окисленную сульфгидрильную(ые) группу(ы), по сравнению с количеством сульфгидрильного(ых) соединения(ий), не имеющего(их) окисленную сульфгидрильную(ые) группу(ы), отражает степень окисления. Затем определяют степень окисления сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений по общему количеству сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений, имеющего(их) одну или более окисленную(ые) сульфгидрильную(ые) группу(ы) и общее количество сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования клеток.

Например, определение степени окисления сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования клеток включает шаги а) определения массы и количества одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования клеток; б) сравнение массы, определенной для одного или более сульфгидрильных соединений, с массой одного или более сульфгидрильных соединений, которые не окислены, причем увеличение массы одного или более сульфгидрильных соединений по сравнению с массой одного или более сульфгидрильных соединений, которые не являются окисленными, отражает количество окисленных сульфгидрильных групп в одном или более сульфгидрильных соединениях; и в) определение степени окисления одного или более сульфгидрильных соединений по общему количеству одного или более сульфгидрильных соединений, содержащих по меньшей мере одну окисленную сульфгидрильную группу, и, таким образом, общему количеству сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений.

Для определения массы целевых фрагментов используется масс-спектрометрия. Термины «масс-спектрометрия», «МС» и т.п. относятся к способам фильтрации, обнаружения и измерения ионов на основе отношения их массы к заряду (т.е. «м/з»). Термины «масса» и «м/з» используются взаимозаменяемо в контексте результатов масс-спектрометрического анализа, и, если не указано иное, все значения м/з предполагают однократно ионизированные частицы. Термины «масса основного изотопа» и «основной изотоп м/з» относятся к массе, сообщаемой для молекулярного иона, с учетом массы наиболее распространенного (т.е. основного) изотопа каждого элемента. Как правило, одну или более интересующих молекул ионизируют, а затем ионы вводят в масс-спектрометр, где благодаря сочетанию магнитных и электрических полей ионы следуют в пространстве по траектории, зависящей от массы («м») и заряда («з»). См., например, патент США №6204500, озаглавленный «Mass Spectrometry From Surfaces», патент США №6107623, озаглавленный «Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry)), 6268144, озаглавленный «DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry)), патент США №6124137, озаглавленный «Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes)), Wright et al., Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2:264-76 (1999); и Merchant and Weinberger, Electrophoresis 21:1164-67 (2000), каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Термины «интегральная интенсивность)), «интегральная площадь масс-спектра», «интегральная интенсивность масс-спектра» и т.п. относятся к площади под масс-спектрометрической кривой, соответствующей количеству молекулярного иона, имеющего конкретный основной изотоп м/з, как хорошо известно в данной области техники.

Например, в приборе «квадруполь» или «квадрупольная ионная ловушка» ионы в осциллирующем радиочастотном поле испытывают силу, пропорциональную потенциалу постоянного тока, приложенному между электродами, амплитуде радиочастотного сигнала и м/з. Напряжение и амплитуда могут быть выбраны таким образом, чтобы только ионы с определенным значением м/з перемещались по длине квадруполя, а все остальные ионы отклонялись. Таким образом, квадрупольные приборы могут действовать как «фильтр масс» и как «детектор масс» для вводимых в прибор ионов.

Уридиндифосфат (УДФ)-сахара в клетках млекопитающих

Установлено, что уридиндифосфат (УДФ) α-D-глюкозоэпимераза (ЕС 5.1.3.2) и УДФ-α-D-глюкоза: α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза (ЕС 2.7.7.12) играют решающую роль в пути превращения УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в клетках млекопитающих, например, в клетках СНО.

Используемый в данном документе термин «уридиндифосфат (УДФ) α-D-глюкозоэпимераза» и «УДФ-Glc-E» используются взаимозаменяемо и относятся к ферменту, который представляет собой гомодимерную эпимеразу, обнаруженную в бактериях, грибах, растениях и клетках млекопитающих, относящихся к классу ЕС 5.1.3.2. Как показано в примере 1, кДНК УДФ-Glc-E в клеточной линии СНО K1M была амплифицирована, секвенирована и дополнительно проанализирована.

Используемые в данном документе термины «УДФ-α-D-глюкоза: α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза», «УДФ-Gal-T» и «ЕС 2.7.7.12» используются взаимозаменяемо и относятся к ферменту, который катализирует обмен нуклеотидов между уридин-5'-дифосфат-глюкозой (УДФ-глюкоза) и галактоза-1-фосфатом (Gal-1-Р) с образованием уридин-5'-дифосфат-галактозы (УДФ-галактоза) и глюкозо-1-фосфата (Glc-1-П) по обратимому механизму. Как показано в примере 2, кДНК УДФ-Gal-T в клеточной линии СНО K1M была амплифицирована, секвенирована и дополнительно проанализирована.

Уридиндифосфат-глюкозоэпимераза

Путь синтеза УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы показан на Фигуре 1. Следовательно, показан путь взаимопревращения УДФ-сахаров при образовании УДФ-глюкозы из α-D-глюкозы и последующее образование УДФ-галактозы из УДФ-глюкозы с помощью УДФ-глюкозоэпимеразы (УДФ-Glc-E: Уридиндифосфатглюкозоэпимераза. ЕС 5.1.3.2).

УДФ-α-D-глюкоза: α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза

Путь УДФ-галактоза и УДФ-глюкоза был дополнительно расширен, как показано на Фигуре 2. Следовательно, показан путь взаимопревращения УДФ-сахаров при образовании УДФ-галактозы из α-D-глюкозы и последующее превращение УДФ-галактозы обратно в УДФ-глюкозу под действием УДФ-α-D-глюкозы: α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансферазы (УДФ-Gal-T: УДФ-α-D-глюкоза: α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансферазы ЕС 2.7.7.12).

Установление пути превращения УДФ-глюкозы/галактозы

Как показано на Фигуре 2, УДФ-Gal-T катализирует обратимое превращение УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы. Однако Wagstaff и др. ((2015) Carbohydrate Research 404: 17-25) обнаружили, что при определенных обстоятельствах (например, в присутствии избытка глюкозы-1-Р) УДФ-Gal-T осуществляет в основном обратное превращение, преобразовывая большинство УДФ-галактозы в УДФ-глюкозу. Этот механизм может привести к внутриклеточному изменению глюко- и галакто-сконфигурированного пула УДФ-сахаров, что приводит к снижению внутриклеточной концентрации УДФ-галактозы и повышению количества внутриклеточной УДФ-глюкозы. На основании этих экспериментальных результатов можно более точно описать этот новый путь УДФ-глюкоза/УДФ-галактоза, например, как показано на Фигуре 2, для данного процесса продуцирования терапевтического белка с использованием химически определенной платформы среды с избытком глюкозы.

Новый подход к регуляции пути УДФ-глюкоза/УДФ-галактоза в клетках млекопитающих с помощью сульфгидрильных соединений

Как показано на Фигуре 3, сульфгидрильные соединения и их производные, такие как L-цистеин и/или L-цистин, могут быть добавлены в среду для культивирования клеток для дальнейшей активации УДФ-Gal-T и дополнительной регуляции глюко- и галактоконфигурации УДФ-сахаров в клетках млекопитающих, таких как СНО K1 и ее производные клеточные линии. Следовательно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что путем добавления одного или более сульфгидрильных соединений можно получить рекомбинантные белки, содержащие моногалактозилированные или дигалактозилированные гликаны. Используемый в данном документе термин «сульфгидрильное(ые) соединение(ия)» относится к неорганическим или органическим соединениям, которые содержат серу как неотъемлемую часть молекулы, предпочтительно к соединениям, содержащим радикал -SH; и/или соединениям, изначально содержащим радикал -SH и ковалентно связанным друг с другом в восстановительных условиях с образованием дисульфидного мостика. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что одно или более сульфгидрильных соединений, которые увеличивают плотность жизнеспособных клеток и/или титр продукта во время получения рекомбинантного белка, продуцируемого культурой клеток млекопитающих, оказывают прямо коррелирующее действие на содержание галактозы в полученном рекомбинантном белке. В этом контексте настоящее изобретение обеспечивает способы контроля степени галактозилирования рекомбинантного белка, продуцируемого культурой клеток млекопитающих. Следуя способам, представленным в данном документе, специалист в данной области может определить точные параметры процесса, обеспечивающие контроль содержания галактозы в рекомбинантном белке, продуцируемом культурой клеток млекопитающих.

В одном аспекте в контексте настоящего изобретения во время получения рекомбинантного белка, продуцируемого культурой клеток млекопитающих, может быть увеличено содержание галактозы в рекомбинантном белке. В еще одном аспекте настоящего изобретения рекомбинантный белок, имеющий моногалактозилированные (G1) или дигалактозилированные (G2) гликаны, представляет собой биспецифическое антитело к CD20/CD3, причем биспецифическое антитело к CD20/CD3 содержит 19,0-29,0% (мас./мас.) G1 и 1,3-2,8% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 20,0-28,0% (мас./мас.) G1 и 1,4-2,7% (мас./мас.) G2 на общий гликан; более предпочтительно 21,0-28,0% (мас./мас.) G1 и 1,5-2,7% (мас./мас.) G2 на общий гликан и наиболее предпочтительно 21,0-27,4% (мас./мас.) G1 и 1,5-2,6% (мас./мас.) G2 на общий гликан.

В частности, биспецифическое антитело к CD20/CD3, имеющее моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывается с CD3, и второй антигенсвязывающий домен, который связывается с CD20. Биспецифическое антитело к CD20/CD3 может содержать первый антигенсвязывающий домен, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), и второй антигенсвязывающий домен, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL).

Более конкретно, биспецифическое антитело к CD20/CD3, имеющее моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, содержит первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, причем первый антигенсвязывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий

(а) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22,

(б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и

Как раскрыто в данном документе и в контексте изобретения, биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором биспецифическое антитело к CD20/CD3 может содержать третий антигенсвязывающий домен. Например, биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором биспецифическое антитело к CD20/CD3 содержит третий антигенсвязывающий домен, который связывается с CD20. В качестве альтернативы, биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором биспецифическое антитело к CD20/CD3 содержит третий антигенсвязывающий домен, который связывается с CD3. В контексте данного документа термины «первый», «второй», «третий» и т.д. в отношении антигенсвязывающих доменов используют для того, чтобы облегчить различение, в случае наличия более чем одного из каждого типа доменов. Использование этих терминов не подразумевает конкретного порядка или ориентации, если явным образом не указано иное.

Например, биспецифическое антитело к CD20/CD3 может содержать второй антигенсвязывающий домен, который связывается с CD3, первый и третий антигенсвязывающие домены, которые связываются с CD20. В качестве более конкретного примера, третий антигенсвязывающий домен может быть идентичен первому антигенсвязывающему домену (т.е. первый и третий антигенсвязывающие домены могут содержать одинаковые аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей). Еще более конкретно, первая и третья молекулы Fab, содержащие первый и третий антигенсвязывающие домены, могут быть идентичными и, более того, могут иметь одинаковое расположение доменов (т.е. обычное или перекрестное).

В качестве другого примера, биспецифическое антитело к CD20/CD3 может содержать первый антигенсвязывающий домен, который связывается с CD3, второй и третий антигенсвязывающие домены, которые связываются с CD20. В качестве более конкретного примера, третий антигенсвязывающий домен может быть идентичен второму антигенсвязывающему домену (т.е. второй и третий антигенсвязывающие домены могут содержать одинаковые аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей). Еще более конкретно, вторая и третья молекулы Fab, содержащие второй и третий антигенсвязывающие домены, могут быть идентичными и, более того, могут иметь одинаковое расположение доменов (т.е. обычное или перекрестное).

В качестве более конкретного примера, описанного в данном документе, биспецифическое антитело к CD20/CD3 может содержать третий антигенсвязывающий домен, причем третий антигенсвязывающий домен содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий

В качестве еще более конкретного примера, биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором третий антигенсвязывающий домен может содержать последовательность VH SEQ ID NO: 40 и последовательность VL SEQ ID NO: 41. Предпочтительно биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором третий антигенсвязывающий домен может содержать последовательность VH третьего антигенсвязывающего домена, которая имеет по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40, а последовательность VL третьего антигенсвязывающего домена имеет по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41.

Первый антигенсвязывающий домен биспецифического антитела к CD20/CD3 может представлять собой кросс-Fab-молекулу, в которой заменены вариабельные домены или константные домены тяжелой и легкой цепи Fab, а второй и третий, если они присутствуют, антигенсвязывающие домены могут представлять собой стандартную молекулу Fab. Например, антигенсвязывающий домен, который связывается с CD3, представляет собой кроссоверную молекулу Fab, в которой заменены (т.е. замещены друг другом) вариабельные домены или константные домены тяжелой и легкой цепи Fab. В качестве другого более конкретного примера, первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссоверную молекулу Fab, а каждый из второго и первого антигенсвязывающего фрагмента представляют собой стандартную молекулу Fab.

«Молекула Fab» относится к белку, состоящему из VH и СН1-домена тяжелой цепи («тяжелая цепь Fab») и VL и CL-домена легкой цепи («легкая цепь Fab») иммуноглобулина. Под «слитым» подразумевается, что компоненты (например, молекула Fab и субъединица Fc-домена) связаны пептидными связями, как напрямую, так и посредством одного или более пептидных линкеров.

Под «кроссоверной» молекулой Fab (также называемой «Crossfab») подразумевается молекула Fab, в которой обменены (т.е. замещены друг другом) вариабельные домены или константные домены тяжелой и легкой цепи Fab, т.е. кроссоверная молекула Fab содержит пептидную цепь, состоящую из вариабельного домена легкой цепи VL и константного домена тяжелой цепи 1 CHI (VL-CH1, в направлении от N- к С-концу), и пептидную цепь, состоящую из вариабельного домена тяжелой цепи VH и константного домена легкой цепи CL (VH-CL, в направлении от N- к С-концу). Для ясности, в кроссоверной молекуле Fab, в которой обменены вариабельные домены легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab, пептидная цепь, содержащая константный домен тяжелой цепи 1 СН1, называется в данном документе «тяжелой цепью» (кроссоверной) молекулы Fab. В то же время, в кроссоверной молекуле Fab, в которой обменены константные домены легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab, пептидная цепь, содержащая вариабельный домен тяжелой цепи VH, называется в данном документе «тяжелой цепью» (кроссоверной) молекулы Fab.

В противоположность этому, под «стандартной» молекулой Fab подразумевается, что молекула Fab имеет свой естественный формат, т.е. содержит тяжелую цепь, состоящую из вариабельных и константных доменов тяжелой цепи (VH-CH1, в направлении от N- к С-концу), и легкую цепь, состоящую из вариабельных и константных доменов легкой цепи (VL-CL, в направлении от N- к С-концу).

Третья молекула Fab может быть слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. Используемый в данном документе термин «субъединица» Fc-домена относится к одному из двух полипептидов, образующих димерный Fc-домен, т.е. полипептид, включающий С-концевые константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, способные к стабильной самоассоциации. Например, субъединица Fc-домена IgG содержит константные домены СН2 IgG и СН3 IgG.

Например, каждая из второй и третьей молекулы Fab слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена, а первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab. Более конкретно антитело состоит преимущественно из первой, второй и третьей молекул Fab, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, а третья молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена (см. также ЕР 3252078 А1, в частности, Фигуры 1Б, 1Д, 1К и 1П в сочетании с абзацем [0338], которые включены в данный документ посредством ссылки).

Другими словами, биспецифическое антитело к CD20/CD3 может содержать третий антигенсвязывающий домен, причем первый антигенсвязывающий домен биспецифического антитела к CD20/CD3 слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего домена, второй антигенсвязывающий домен биспецифического антитела к CD20/CD3 слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, а третий антигенсвязывающий домен биспецифического антитела к CD20/CD3 слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена.

Вторая и третья молекулы Fab могут быть слиты с Fc-доменом напрямую или посредством пептидного линкера. Например, каждая из второй и третьей молекул Fab слита с Fc-доменом посредством шарнирной области иммуноглобулина. В частности, шарнирная область иммуноглобулина представляет собой шарнирную область IgG1 человека, в частности, когда Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG1 человека. Необязательно, легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab могут быть дополнительно слиты друг с другом.

В качестве альтернативы каждая из первой и третьей молекулы Fab слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена, а вторая Fab молекула слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой цепи Fab второй молекулы Fab. Более конкретно антитело состоит преимущественно из первой, второй и третьей молекул Fab, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab, первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, а третья молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена (см. также ЕР 3252078 А1, в частности, Фигуры 1B, 1E, 1Л и 1С в сочетании с абзацем [0339], которые включены в данный документ посредством ссылки).

Другими словами, биспецифическое антитело к CD20/CD3 может содержать третий антигенсвязывающий домен, причем второй антигенсвязывающий домен биспецифического антитела к CD20/CD3 слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего домена, первый антигенсвязывающий домен биспецифического антитела к CD20/CD3 слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, а третий антигенсвязывающий домен биспецифического антитела к CD20/CD3 слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена.

Первая и третья молекулы Fab могут быть слиты с Fc-доменом напрямую или посредством пептидного линкера. Например, каждая из первой и третьей молекул Fab слита с Fc-доменом посредством шарнирной области иммуноглобулина. В частности, шарнирная область иммуноглобулина представляет собой шарнирную область IgG1 человека, в частности, когда Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG1 человека. Необязательно, легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab могут быть дополнительно слиты друг с другом.

В качестве дополнительной альтернативы каждая из первой и второй молекулы Fab слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена, а третья Fab молекула слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой цепи Fab второй молекулы Fab. Более конкретно антитело состоит преимущественно из первой, второй и третьей молекул Fab, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем третья молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab, первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, а вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена. Другими словами, биспецифическое антитело к CD20/CD3 может содержать третий антигенсвязывающий домен, причем третий антигенсвязывающий домен биспецифического антитела к CD20/CD3 слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего домена, первый антигенсвязывающий домен биспецифического антитела к CD20/CD3 слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N- концом первой субъединицы Fc-домена, а второй антигенсвязывающий домен биспецифического антитела к CD20/CD3 слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена.

Первая и вторая молекулы Fab могут быть слиты с Fc-доменом напрямую или посредством пептидного линкера. Например, каждая из первой и второй молекул Fab слита с Fc-доменом посредством шарнирной области иммуноглобулина. В частности, шарнирная область иммуноглобулина представляет собой шарнирную область IgG1 человека, в частности, когда Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG1 человека. Необязательно, легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab третьей молекулы Fab могут быть дополнительно слиты друг с другом.

Дополнительные конфигурации биспецифического антитела к CD20/CD3, используемые в данном документе и в контексте изобретения, можно найти, например, в ЕР 3252078 А1, в частности, на Фигуре 1 и в параграфах с [0335] по [0367], которые включены в данный документ посредством ссылки.

Еще конкретнее, биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором биспецифическое антитело к CD20/CD3 может содержать

(а) первую тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 47, и вторую тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 45;

(б) первую легкую цепь, имеющую по меньшей мере 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 33, и вторую и третью легкую цепь, имеющую по меньшей мере 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 44; или

Еще конкретнее, биспецифическое антитело к CD20/CD3 представляет собой антитело, в котором биспецифическое антитело к CD20/CD3 содержит

(а) первую тяжелую цепь SEQ ID NO: 47 и вторую тяжелую цепь SEQ ID NO: 45;

В другом аспекте настоящего изобретения рекомбинантный белок, имеющий моногалактозилированные (G1) или дигалактозилированные (G2) гликаны, представляет собой антитело к α-синуклеину, причем антитело к α-синуклеину имеет 17,2-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,1-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 25,4-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,5-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 27,2-47,0% G1 и 4,4-15,0% G2 на общий гликан; предпочтительно 40,0-46,0% (мас./мас.) G1 и 8,4-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; более предпочтительно 41,0-45,0% (мас./мас.) G1 и 9,5-14,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан и наиболее предпочтительно 42,1-43,9% (мас./мас.) G1 и 10,6-13,3% (мас./мас.) G2 на общий гликан.

В частности, антитело к α-синуклеину, имеющее моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий

причем антитело к α-синуклеину имеет 17,2-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,1-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 25,4-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,5-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 27,2-47,0% G1 и 4,4-15,0% G2 на общий гликан; предпочтительно 40,0-46,0% (мас./мас.) G1 и 8,4-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; более предпочтительно 41,0-45,0% (мас./мас.) G1 и 9,5-14,0% (мас. /мас.) G2 на общий гликан и наиболее предпочтительно 42,1-43,9% (мас./мас.) G1 и 10,6-13,3% (мас./мас.) G2 на общий гликан.

Более конкретно, антитело к α-синуклеину содержит

(а) последовательность VH SEQ ID NO: 16;

(б) последовательность VL SEQ ID NO: 17; или

Еще более конкретно, антитело к α-синуклеину содержит

Еще более конкретно, антитело к α-синуклеину содержит тяжелую цепь, имеющую по меньшей мере 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20, и легкую цепь, имеющую по меньшей мере 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21.

Еще более конкретно, антитело к α-синуклеину содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 20 и легкую цепь SEQ ID NO: 21.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно эталонной полипептидной последовательности определяется как процентная доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществлять различными способами, которые известны в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. При этом в целях данного документа значения процента (%) идентичности аминокислотных последовательностей получают, используя компьютерную программу для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана компанией Genentech, Inc., а исходный код был подан вместе с пользовательской документацией в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован под номером регистрации авторского права США TXU510087. Программа ALIGN-2 находится в свободном доступе от Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, Калифорния, или может быть скомпилирована из исходного кода. Программу ALIGN-2 следует компилировать для использования в операционной системе UNIX, включая Digital UNIX V4,0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и не варьируются. В тех случаях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей используют ALIGN-2, % идентичности аминокислотной последовательности заданной аминокислотной последовательности А с или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В (что в альтернативном варианте можно сформулировать как заданная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности с или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью В) рассчитывают следующим образом: 100 умножить на отношение X/Y, где X представляет число аминокислотных остатков, оцененных программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 как идентичные совпадения в осуществленном программой выравнивании А и В, a Y представляет общее число аминокислотных остатков в В. Следует понимать, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А с В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В с А. Если специально не указано иное, все значения % идентичности аминокислотных последовательностей, используемые в данном документе, получены, как описано в предыдущем параграфе, с использованием компьютерной программы ALIGN-2.

Под нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом, имеющими нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, например, на 95% «идентичную» эталонной последовательности по настоящему изобретению, подразумевается, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична эталонной последовательности за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной нуклеотидной последовательности. Другими словами, чтобы получить полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, по меньшей мера на 95% идентичную эталонной нуклеотидной последовательности, до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть удалены или замещены другими нуклеотидами или в эталонной последовательность может быть вставлено число нуклеотидов, составляющее до 5% от общего числа нуклеотидов в эталонной последовательности. Эти изменения эталонной последовательности могут находиться в 5' или 3' концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, размещаясь по отдельности между остатками в эталонной последовательности или одной или более непрерывными группами в эталонной последовательности. На практике определение того, что любая конкретная полинуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, можно осуществлять традиционным способом, используя известные компьютерные программы, такие как те, которые обсуждаются выше для полипептидов (например, ALIGN-2).

Используемые в данном документе термины «среда для культивирования клеток» и «культуральная среда» используются взаимозаменяемо и относятся к питательному раствору, используемому для выращивания клеток млекопитающих, который обычно содержит по меньшей мере один компонент одной или более из следующих категорий: 1) источник энергии, обычно в виде углевода, такого как глюкоза; 2) все незаменимые аминокислоты и обычно основной набор из двадцати аминокислот плюс цистеин; 3) витамины и/или другие органические соединения, необходимые в низких концентрациях; 4) свободные жирные кислоты; и 5) микроэлементы, где микроэлементы определяются как неорганические соединения или встречающиеся в природе элементы, которые обычно требуются в очень низких концентрациях, обычно в микромолярном диапазоне. Необходимые компоненты, такие как факторы роста для конкретной клеточной линии, легко определяются эмпирически без ненужных экспериментов, как описано, например, в Mammalian Cell Culture (Mather, J.P. ed., Plenum Press, N.Y. [1984]), и Barnes and Sato. (1980) Cell. 22:649).

Как раскрыто в данном документе и в контексте изобретения, среда для культивирования клеток с получением антитела, имеющего моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, представляет собой среду для культивирования клеток, содержащую концентрацию более чем 4,0 мМ и менее чем 10,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений и концентрацию по меньшей мере более чем 3,0 г/л глюкозы.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения среда для культивирования клеток, как раскрыто в контексте изобретения, содержит по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равно или менее чем 9,0 мМ, предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равно или менее чем 8,0 мМ, более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равно или менее чем 7,0 мМ и еще более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равно или менее чем 6,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений.

В другом предпочтительном аспекте среда для культивирования клеток, как раскрыто в контексте изобретения, содержит концентрацию по меньшей мере 5,0 мМ и менее чем 10,0 мМ, предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 9,0 мМ, более предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 8,0 мМ, еще более предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 7,0 мМ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5.0 мМ и равно или менее чем 6,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений.

В качестве альтернативы (например, в случае цистеина и/или цистина) среда для культивирования клеток содержит от более чем 0,7 г/л до равной или менее чем 1,2 г/л, предпочтительно от более чем 0,7 г/л до равной или менее чем 1.1 г/л, более предпочтительно от более чем 0,7 г/л до равной или менее чем 1,0 г/л, более предпочтительно от более чем 0,7 г/л до равной или менее чем 0,9 г/л, еще более предпочтительно от более чем 0,7 г/л до 0,8 г/л одного или более сульфгидрильных соединений.

Сульфгидрильная(ые) группа(ы) одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования клеток, как раскрыто в контексте изобретения, содержится в восстановленной и/или окисленной форме. Например, концентрация восстановленной формы указанного сульфгидрила находится в диапазоне от более чем 4,0 мМ до менее чем 10,0 мМ, и/или концентрация окисленной формы указанного сульфгидрила находится в диапазоне от более чем 2,0 мМ до менее чем 5,0 мМ.

Как раскрыто в данном документе и в контексте изобретения, одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) может(гут) быть выбрано(ы) из группы, состоящей из цистеина, цистина, сукцимера, метимазола, цистеамина, азатиоприна, меркаптопурина, S-метилцистеина, селеноцистеина, S-фосфоцистеина, 4'-фосфопантетеина, бутирилтиохолина, карбоцистеина, N-сульфоцистеина, алетина, ацетилцистеина, димеркапрола, кофермента М, ауротиомалата натрия, пантетина, буцилламина, метилселеноцистеина, димеркаптоянтарной кислоты, амида ацетилцистеина, тиогликолевой кислоты, 2,3-димеркаптопропанола, О-метилмеркаптоэтанола, меркаптоуксусной кислоты, β-меркаптопропионовой кислоты, метилмеркаптана, S-метилмеркаптоэтанола, глутатиона, производных глутатиона и их комбинации. Предпочтительно одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) выбрано(ы) из группы, состоящей из цистеина, цистина и их комбинации.

В частности, одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) может(гут) быть выбрано(ы) из группы, состоящей из цистеина, цистина и их комбинации. Например, одно или более сульфгидрильное(ых) соединение(ий) представляет(ют) собой цистеин, и концентрация цистеина в среде для культивирования клеток составляет более чем 4,0 мМ и менее чем 10,0 мМ, предпочтительно концентрация цистеина составляет по меньшей мере 5,0 мМ и равна или менее чем 6,0 мМ.

В качестве альтернативы (например, в случае цистеина и/или цистина) среда для культивирования клеток для получения рекомбинантного белка, имеющего моногалактозилированные или дигалактозилированные гликаны, в клетке млекопитающего содержит от 0,5 г/л до 1,2 г/л, предпочтительно от 0,6 г/л до 1,2 г/л одного или более сульфгидрильных соединений.

Как описано в данном документе и в контексте изобретения, среда для культивирования клеток может содержать по меньшей мере более чем 3,0 г/л глюкозы и более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 г/л глюкозы. В качестве альтернативы среда для культивирования клеток может содержать не более 13,0 г/л глюкозы, предпочтительно 8,0 г/л, более предпочтительно не более 7,0 г/л, еще более предпочтительно не более 6,0 г/л и наиболее предпочтительно не более 5,0 г/л глюкозы. В частности, среда для культивирования клеток, как описано в данном документе и в контексте изобретения, может содержать от более чем 3,0 г/л и до 13 г/л глюкозы, предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 8,0 г/л глюкозы, более предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 7,0 г/л глюкозы, еще более предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 6,0 г/л глюкозы и наиболее предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 5,0 г/л глюкозы.

Как будет понятно специалистам в данной области, минимальная и питательная среды, используемые для культивирования клеток для получения рекомбинантного белка, а также другие переменные, такие как график кормления, скорость роста, температура и уровень кислорода, могут влиять на выход и качество экспрессируемого белка. Способы оптимизации этих условий известны специалисту; иллюстративные условия изложены в приведенных в данном документе примерах. Как описано в данном документе и в контексте изобретения, среда для культивирования клеток представляет собой среду с определенным химическим составом, предпочтительно среду для культивирования клеток, не содержащую сыворотку, белки и/или олигопептиды.

Среды определенного химического состава были интенсивно разработаны и опубликованы в последнее время, включая такие среды для культивирования клеток млекопитающих. Все компоненты определенных сред хорошо охарактеризованы, и такие среды не содержат сложных добавок, таких как сыворотка и гидролизаты. Как правило, эти среды включают определенные количества очищенных факторов роста, белков, липопротеинов и других веществ, которые в противном случае могут быть обеспечены добавками сыворотки или экстракта. Такие среды были созданы с единственной целью поддержания высокопродуктивных клеточных культур. Некоторые определенные среды могут называться средами с низким содержанием белка или могут быть безбелковыми, если не включены типичные компоненты сред с низким содержанием белка, инсулина и трансферрина. В противном случае в способах по настоящему изобретению можно использовать бессывороточную среду. Такие среды обычно не содержат сыворотку или белковые фракции, но могут содержать неопределенные компоненты. Примеры коммерчески доступных питательных сред включают Ham's F10 (Sigma), минимальную питательную среду (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM, Sigma), а также среды с определенным химическим составом и кормовые добавки, продаваемые Life Technologies. Любые такие среды могут быть дополнены при необходимости гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат), буферами (такими как ГЭПЭС), нуклеозидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как GENTAMYCIN™) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Необходимые питательные вещества и факторы роста для среды, включая их концентрации, для конкретной клеточной линии определяются эмпирически и без излишнего экспериментирования, как описано, например, в Mammalian Cell Culture, Mather (Plenum Press: NY 1984); Barnes и Sato, Cell 22 (1980) 649 или Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach M. Butler (IRL Press, 1991). Подходящая среда содержит базовый компонент среды, такой как состав на основе DMEM/HA F12 с измененными концентрациями некоторых компонентов, таких как аминокислоты, соли, сахара и витамины, и необязательно содержащий глицин, гипоксантин, тимидин, рекомбинантный человеческий инсулин, гидролизованный пептон, такой как PRIM ATONE HS™ или PRIMATONE RL™ (Шеффилд, Англия) или его эквивалент, агент для защиты клеток, такой как PLURONIC F68™ или эквивалентный плюроник полиол и GENTAMYCIN™.

В другом аспекте настоящего изобретения среда для культивирования клеток представляет собой среду с определенным химическим составом, предпочтительно среду для культивирования клеток, не содержащую сыворотку, белки и/или олигопептиды; и причем среда для культивирования клеток содержит от 4,0 мМ до 10,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений. В другом предпочтительном аспекте среда для культивирования клеток представляет собой среду с определенным химическим составом, предпочтительно среду для культивирования клеток, не содержащую сыворотку, белки и/или олигопептиды; и причем среда для культивирования клеток содержит по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равно или менее чем 9,0 мМ, предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равно или менее чем 8,0 мМ, более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равно или менее чем 7,0 мМ и еще более предпочтительно по меньшей мере более чем 4,0 мМ и равно или менее чем 6,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений. В еще другом предпочтительном аспекте настоящего изобретения среда для культивирования клеток представляет собой среду с определенным химическим составом, предпочтительно среду для культивирования клеток, не содержащую сыворотку, белки и/или олигопептиды; и причем среда для культивирования клеток содержит по меньшей мере 5,0 мМ и менее чем 10,0 мМ, предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 9,0 мМ, более предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 8,0 мМ, еще более предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 7,0 мМ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 6,0 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений.

Концентрация одного или более сульфгидрильных соединений, рассчитанная для коммерческих сред, как указано выше, изменится, если эти среды будут дополнены сложными ингредиентами, такими как сыворотка или пептоны. Когда способ по изобретению включает регулирование концентрации одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования путем добавления этого(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) в среду, любое сульфгидрильное соединение, представленное в данном документе и подходящее для включения в среду для культивирования, можно использовать для получения рекомбинантного белка.

На Фигуре 3 показано модулирование путей взаимопревращения УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в СНО K1 сульфгидрильным(и) соединением(ями). Как показано на Фигуре 3, при добавлении сульфгидрильного(ых) соединения(ий), такого(их) как L-цистеин, для стимуляции УДФ-Gal-T большее количество УДФ-галактозы может быть преобразовано в УДФ-глюкозу, и, следовательно, в цитоплазме остается меньше УДФ-галактозы. Как показано на Фигуре 4, путем добавления L-цистина вместо L-цистеина в среду для культивирования клеток эффект стимуляции ферментативной активности УДФ-Gal-T L-цистеином может быть ослаблен в цитоплазме. С другой стороны, повышенное поглощение L-цистина может обеспечить более эффективную окислительно-восстановительную систему для регулирования выживания клеток и улучшения метаболического процесса УДФ-галактозы.

Другим аспектом настоящего изобретения является применение простых сульфгидрильных молекул, таких как L-цистеин и/или цистин, для регулирования in vivo внутриклеточной концентрации УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в клетках млекопитающих, таких как СНО K1 и ее производные клеточные линии. Например, L-цистин может быть добавлен в среду для культивирования для регулирования in vivo внутриклеточной концентрации УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в СНО K1. Таким образом, количество и качество конечного продукта можно контролировать и улучшать для заранее определенных клинических применений.

Модулирование пути УДФ-глюкозы/УДФ-галактозы для контроля гликозилирования продукта и процесса культивирования клеток

Как показано на Фигуре 5, УДФ-галактоза действует как донор галактозила в различных реакциях галактозилирования, катализируемых гликозилтрансферазами. Например, УДФ-α-D-галактоза: N-ацетил-β-D-глюкозаминилгликопептид 4-β-галактозилтрансфераза (ЕС 2.4.1.38) катализирует образование связей Galpl-4GlcNAc путем переноса галактозильной группы с УДФ-галактозы на GlcNAc (Qasba et al., Curr. Drug. Targets. 9 (2008) 292-309).

Повышенный уровень L-цистеина в цитоплазме может стимулировать фермент УДФ-Gal-T к превращению большего количества УДФ-галактозы в УДф-глюкозу, что приводит к уменьшению цитоплазматического пула УДФ-галактозы для последующей реакции галактозилирования. С другой стороны, в присутствии L-цистина вместо L-цистеина в среде для культивирования клеток L-цистин транспортируется через систему х_с ^- в клетки. При повышенном поглощении L-цистина стимуляция фермента УДФ-Gal-T может быть ослаблена, что приводит к сбалансированному цитоплазматическому пулу УДФ-галактозы для последующей реакции галактозилирования.

В соответствии с настоящим изобретением концентрацию одного или более сульфгидрильных соединений регулируют для воздействия на характер галактозилирования рекомбинантного белка, продуцируемого клеткой млекопитающего. Концентрации одного или более сульфгидрильных соединений с сульфгидрильной(ыми) группой(ами) в диапазоне от приблизительно 4 мМ до 10 мМ могут быть использованы и модифицированы в соответствии с конкретной культивируемой клеткой-хозяином и желаемым паттерном галактозилирования полученного рекомбинантного белка. Для получения белка с желаемым профилем галактозилирования выбирают концентрацию одного или более сульфгидрильных соединений, которая обеспечивает постоянный гомогенный профиль галактозилирования рекомбинантного белка. Для повышения степени галактозилирования рекомбинантного белка, как правило, более низкая концентрация обеспечивает повышенную степень галактозилирования при сохранении жизнеспособности культуры клеток-хозяев млекопитающих. Как правило, используют концентрации одного или более сульфгидрильных соединений, таких как цистеин и/или цистин, с сульфгидрильной(ыми) группой(ами) в диапазоне от приблизительно 4 мМ до 10 мМ, предпочтительно от приблизительно 5 мМ до 10 мМ. Более предпочтительно используются концентрации от приблизительно по меньшей мере 5,0 мМ до равной или менее чем 9,0 мМ, более предпочтительно от приблизительно по меньшей мере 5,0 мМ до равной или менее чем 8,0 мМ, еще более предпочтительно от приблизительно по меньшей мере 5,0 мМ до равной или менее чем 7,0 мМ и наиболее предпочтительно от приблизительно по меньшей мере 5,0 мМ до равной или менее чем 6,0 мМ. В качестве альтернативы (например, в случае цистеина и/или цистина) используются концентрации от приблизительно по меньшей мере 0,6 г/л до равной или менее чем 1,1 г/л, более предпочтительно от приблизительно по меньшей мере 0,6 г/л до равной или менее чем 1,0 г/л, более предпочтительно от приблизительно по меньшей мере 0,6 г/л до равной или менее чем 0,9 г/л, еще более предпочтительно от приблизительно по меньшей мере 0,6 г/л до равной или менее чем 0,8 г/л и наиболее предпочтительно от приблизительно по меньшей мере 0,6 г/л до равной или менее чем 0,7.

Используемый в данном документе термин «концентрация» по отношению к одному или более сульфгидрильному(ым) соединению(иям) относится к общей концентрации всех сульфгидрильных соединений, содержащихся в среде для культивирования. Используемый в данном документе термин «концентрация» по отношению к сульфгидрильной группе относится к общей концентрации всех сульфгидрильных соединений, содержащихся в среде для культивирования. В этом контексте сульфгидрильная группа относится к -SH (в данном документе также обозначается как «[-SH]») и может также относиться к сульфгидрильной группе, которая подверглась реакции, в которой водород диссоциирует от атома серы сульфгидрильной группы и указанный атом серы образует связь S-S с другой сульфгидрильной группой, которая подверглась указанной реакции. Другими словами, термин «сульфгидрильная группа» также включает сульфгидрильные группы, которые были связаны, например, дисульфидным мостиком. Концентрация может быть измеренной или измеряемой, либо рассчитанной или рассчитываемой фактической концентрацией сульфгидрильного(ых) соединения(ий) в среде, окружающей клетки, в данный момент времени. Способы измерения концентрации этого(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) в среде известны в данной области техники. Примеры таких способов включают PCI-MS (Agilent, Боблинген, Германия). Таким образом, концентрация также относится к количеству сульфгидрильного(ых) соединения(ий), содержащегося(ихся) в среде для культивирования, окружающей клетки во время культивирования, и, таким образом, является фактической концентрацией соответствующего(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) в данный момент времени. Эта концентрация может быть определена аналитически и является результатом, например, введения сульфгидрильного(ых) соединения(й) в культуру (взвешиванием, переносом клеток и среды из прекультуры, введением примесей, выщелачиванием и т.д.), высвобождением клетками (например, путем гибели клеток или путем активной секреции), от поглощения клетками и других факторов.

Как используется в контексте настоящего изобретения, среда для культивирования клеток содержит повышенный уровень одного или более сульфгидрильных соединений по сравнению со средой для культивирования клеток, не содержащей повышенный уровень одного или более сульфгидрильных соединений.

В частности, изобретение относится к способу получения гликопротеина, такого как рекомбинантный белок или антитело, в частности, биспецифическое антитело к CD20/CD3 или антитело к α-синуклеину, причем указанный способ включает

(а) культивирование клетки млекопитающего, как описано в данном документе, в среде для культивирования клеток, как описано в данном документе, причем концентрацию сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений по меньшей мере более чем 4,0 и менее 10,0 мМ и глюкозы по меньшей мере более чем 3,0 г/л в среде для культивирования клеток поддерживают в течение по меньшей мере 3, более предпочтительно в течение по меньшей мере 4 и еще более предпочтительно в течение по меньшей мере 5 дней,

(б) выделение указанного антитела.

В контексте способа по настоящему изобретению рекомбинантный белок имеет повышенный уровень моногалактозилированных или

дигалактозилированных гликанов по сравнению с соответствующим уровнем рекомбинантного белка, полученного с использованием среды, не содержащей повышенный уровень одного или более сульфгидрильных соединений, как используется в контексте способа по настоящему изобретению рекомбинантный белок имеет повышенный уровень моногалактозилированных или дигалактозилированных гликанов по меньшей мере на 3%, более предпочтительно по меньшей мере на 5%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 10%. Как используется в контексте способа по настоящему изобретению, титр продуцированного рекомбинантного белка увеличивается по сравнению с титром соответствующего рекомбинантного белка, полученного с использованием среды, не содержащей повышенный уровень одного или более сульфгидрильных соединений. Предпочтительно титр полученного рекомбинантного белка составляет по меньшей мере 2000 мг/л.

Как используется в контексте способа по настоящему изобретению, плотность жизнеспособных клеток в среде для культивирования клеток увеличивается по сравнению с соответствующей плотностью жизнеспособных клеток в среде, не содержащей повышенный уровень одного или более сульфгидрильных соединений. Предпочтительно максимальная плотность жизнеспособных клеток в среде для культивирования клеток составляет по меньшей мере приблизительно 120×10⁵ клеток/мл.

Например, рекомбинантный белок может представлять собой биспецифическое антитело к CD20/CD3, имеющее 19,0-29,0% (мас./мас.) G1 и 1,3-2,8% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 20,0-28,0% (мас./мас.) G1 и 1,4-2,7% (мас./мас.) G2 на общий гликан; более предпочтительно 21,0-28,0% (мас./мас.) G1 и 1,5-2,7% (мас./мас.) G2 на общий гликан и наиболее предпочтительно 21,0-27,4% (мас./мас.) G1 и 1,5-2,6% (мас./мас.) G2 на общий гликан. Указанное культивирование клетки млекопитающего может приводить к увеличению титра указанного антитела по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 60% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 80% по отношению к титру при соответствующем культивировании клетки млекопитающего без поддержания сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере более чем 4,0 и менее чем 10,0 мМ в среде для культивирования клеток.

В качестве другого примера рекомбинантный белок может представлять собой антитело к α-синуклеину, имеющее 17,2-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,1-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; 25,4-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,5-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 27,2-47,0% G1 и 4,4-15,0% G2 на общий гликан; предпочтительно 40,0-46,0% (мас./мас.) G1 и 8,4-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; более предпочтительно 41,0-45,0% (мас./мас.) G1 и 9,5-14,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан и наиболее предпочтительно 42,1-43,9% (мас./мас.) G1 и 10,6-13,3% (мас./мас.) G2 на общий гликан. Указанное культивирование клетки млекопитающего может приводить к увеличению титра указанного антитела по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, более предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100% по отношению к титру при соответствующем культивировании клетки млекопитающего без поддержания сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере более чем 4,0 и менее чем 10,0 мМ в среде для культивирования клеток. В качестве другого примера, указанное культивирование клетки млекопитающего может приводить к увеличению титра указанного антитела между 9,0 и 75% по отношению к титру при соответствующем культивировании клетки млекопитающего без поддержания сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере более чем 4,0 и менее чем 10,0 мМ в среде для культивирования клеток.

Кроме того, указанное культивирование клетки млекопитающего приводит к получению антитела к α-синуклеину, имеющего моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, характеризующиеся

«Рекомбинантный белок» или «рекомбинантно экспрессированный белок», используемый в данном документе, относится к белку, экспрессируемому из клетки-хозяина, которую подвергали воздействию для целей такой экспрессии. Воздействие включает одну или более генетических модификаций, таких как введение одного или более гетерологичных генов, кодирующих экспрессируемый белок. Гетерологичный ген может кодировать белок, который обычно экспрессируется в этой клетке или является чужеродным для клетки-хозяина. В качестве альтернативы воздействие может заключаться в повышении или понижении уровня одного или более эндогенных генов. Как используется в контексте настоящего изобретения, рекомбинантный белок имеет моногалактозилированные или дигалактозилированные гликаны. Используемый в данном документе термин «гликан» рекомбинантного белка относится к гликопротеину. Используемый в данном документе термин «гликопротеин» обычно относится к пептидам и белкам, имеющим более чем приблизительно десять аминокислот и по меньшей мере одну олигосахаридную боковую цепь. Гликопротеины могут быть гомологичны клетке-хозяину или, предпочтительно, они гетерологичны, т.е. чужеродны для используемой клетки-хозяина, такой как белок человека, продуцируемый клеткой яичника китайского хомяка (СНО). Предпочтительно используют гликопротеины млекопитающих (гликопротеины, которые первоначально были получены из организма млекопитающих), более предпочтительно те, которые непосредственно секретируются в среду. Примеры гликопротеинов млекопитающих включают такие молекулы, как цитокины и их рецепторы, а также химерные белки, содержащие цитокины или их рецепторы, включая, например, фактор некроза опухоли альфа и бета, их рецепторы и их производные; гормон роста, включая гормон роста человека и гормон роста крупного рогатого скота; фактор высвобождения гормона роста; паратиреоидный гормон: тиреотропный гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор ткани IX и фактор фон Виллебранда; факторы, препятствующие свертыванию крови, такие как белок С; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа или моча человека или активатор плазминогена тканевого типа (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; энкефалиназа; RANTES (регулируется активацией обычно экспрессируемых и секретируемых Т-клеток); воспалительный белок макрофагов человека (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека; мюллер-ингибирующее вещество; А-цепь релаксина; В-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста: интегрин; белок А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как костный нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервов, такой как NGF-β; фактор роста тромбоцитов (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); des(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; белки CD, такие как CD-3, CD-4, CD-8 и CD-19; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (ИЛ), например, от ИЛ-1 до ИЛ-10; супероксиддисмутаза; Т-клеточные рецепторы; белки поверхностных мембран; фактор ускорения распада; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки СПИДа; транспортные белки; рецепторы самонаведения; адрессины; регуляторные белки; антитела; химерные белки, такие как иммуноадгезины, и фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов. «Галактозилированный», используемый в данном документе в отношении гликопротеинов, относится к гликопротеину, содержащему один или более остатков галактозы, что приводит к образованию гликоструктур G1 и G2. Например, галактозилированные рекомбинантные белки, имеющие моногалактозилированные или дигалактозилированные гликаны, которые содержат один или более остатков сиаловой кислоты, такие как GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂Gal, GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂Gal₂, GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂GalSiai, GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂Gal₂Siai и GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂Gal₂Siai₂.

В одном аспекте, используемом в контексте настоящего изобретения, рекомбинантный белок представляет собой антитело. Используемый в данном документе термин «антитело» (АЬ) относится к молекуле иммуноглобулина или иммунологически активной части молекулы иммуноглобулина, то есть к молекуле, которая содержит сайт связывания антигена, такой как фрагмент Fab или F(ab')₂, независимо от того, являются ли они натуральными или частично или полностью синтетическими. Термин «антитело» используется в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая без ограничения моноклональные антитела (включая полноразмерные антитела, которые имеют Fc-область иммуноглобулина или интактные моноклональные антитела), композиции антител с полиэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, поливалентные антитела (обычно сконструированные таким образом, что они имеют три или более антигенсвязывающих сайта), мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образованные как минимум из двух интактных антител, диател и одноцепочечных молекул, таких как молекулы scFv, а также фрагменты антител (например, Fab, F (ab')2 и Fv), если они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность. «Мультиспецифические антитела» представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух разных сайтов, т.е. разных эпитопов на разных антигенах или разных эпитопов на одном антигене. Мультиспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

Методики для создания мультиспецифических антител включают, но не ограничиваются этим, рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелая цепь -легкая цепь иммуноглобулина, имеющих разную специфичность (см. Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), и конструирование по типу «выступ во впадину» (смотрите, например, патент США №5731168 и Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)). Мультиспецифические антитела также можно создавать путем конструирования с использованием эффекта электростатического взаимодействия для создания Fc-гетеродимерных молекул антител (смотрите, например, WO 2009/089004); перекрестного сшивания двух или более антител или фрагментов (смотрите, например, патент США №4676980 и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); применения лейциновых молний для получения биспецифических антител (смотрите, например, Kostelny et al., J. Immunol, 148(5): 1547-1553 (1992) и WO 2011/034605); применения технологии общей легкой цепи для преодоления проблемы неправильного спаривания легкой цепи (смотрите, например, WO 98/50431); применения технологии «диател» для получения биспецифических фрагментов антител (смотрите, например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); и применения одноцепочечных димеров Fv (sFv) (смотрите, например, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); и получения триспецифических антител, как описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

В определение антитела включены конъюгаты антител, такие как конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) или антитела, конъюгированные, например, с элементами маркировки. Кроме того, в определение антитела включены антитела, связывающиеся с достаточной аффинностью к конкретному белку-мишени, так что антитело можно использовать в качестве диагностического и/или терапевтического средства для нацеливания на конкретный белок. Например, антитело может представлять собой антитело к α-синуклеину, способное связывать α-синуклеин с достаточной аффинностью, так что это антитело можно использовать в качестве диагностического и/или терапевтического средства для нацеливания на α-синуклеин.

В качестве другого примера, антитело может представлять собой антитело к CD20/CD3, способное связывать CD20-CD3 с достаточной аффинностью, так что антитело можно использовать в качестве диагностического и/или терапевтического средства для нацеливания на CD20-CD3. В одном аспекте степень связывания антитела с неродственным, отличным от целевого белком составляет менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с мишенью, измеренной, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР). В определенных аспектах антитело, которое связывается с мишенью, имеет константу диссоциации (K_Д) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М). Говорят, что антитело «специфически связывается» с мишенью, когда антитело имеет Кд 1 мкМ или менее. В определенных аспектах антитело связывается с эпитопом мишени, который является консервативным для мишени от разных видов. В некоторых аспектах, как используется в контексте настоящего изобретения, рекомбинантный белок представляет собой терапевтический белок. Например, когда рекомбинантный белок представляет собой антитело, это антитело может быть терапевтически эффективным антителом и может связываться с любым белком, включая члена семейства ангиопоэтинов, такого как Ang1, Ang2, Ang3 и Ang4, и биспецифические антитела в отношении члена семейства ангиопоэтинов и, например, VEGF, такой как Ang2/VEGF; член семейства рецепторов HER, такой как HER1 (EGFR), HER2, HER3 и HER4; белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD33, CD34, CD38, CD40, CD44 и CD52; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, VLA04, ICAM-1, VCAM и интегрин, включая их α- или β-субъединицы (например, антитела к CD11 α, к CD18 или к CD11 β); факторы роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы цитокинов, такие как рецептор стромального лимфопоэтина тимуса (TSLP-R); IgE; антигены группы крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (ОВ) и белок С. Другие иллюстративные белки включают гормон роста (GH), включая гормон роста человека (hGH) и гормон роста крупного рогатого скота (bGH); фактор высвобождения гормона роста; паратиреоидный гормон, тиреотропный гормон; липопротеины; А-цепь инсулина; В-цепь инсулина; проинсулин, фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC; тканевой фактор (TF); фактор фон Виллебранда; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа или активатор плазминогена тканевого типа (t-PA), бомбазин, тромбин, фактор некроза опухоли-α и -β; энкефалиназа; RANTES (регулируется активацией обычно экспрессируемых и секретируемых Т-клеток); воспалительный белок макрофагов человека (MIP-1-α); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин (HSA); мюллеров ингибирующий фактор; А-цепь релаксина, В-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; ДНКаза; ингибин; активин; рецепторы для гормонов или факторов роста; белок А или D; белок активации фибробластов (FAP); карциноэмбриональный антиген (СЕА); ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как костный нейротрофический фактор (BDNF); нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервов, такой как NGF-β; фактор роста тромбоцитов (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF) и рецептор эпидермального фактора роста (EGFR); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-α и TGF-β, включая TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 или TGF-βδ; инсулиноподобный фактор роста-1 и -II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-1 (мозговой IGF-I); белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста (IGFBP); эритропоэтин (ЭПО); тромбопоэтин (ТПО); остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон (интерферон-α, -β или -γ); колониестимулирующие факторы (CSF), напр. M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (ИЛ), т.е. от ИЛ-1 до ИЛ-10 и ИЛ-17; супероксиддисмутаза; Т-клеточные рецепторы; рецептор BlyS (Br3); иммуноадгезин Br3-Fc; рецептор Аро-2; Fc-рецептор; белки поверхностных мембран; фактор ускорения распада (DAF); вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки СПИДа; транспортные белки; рецепторы самонаведения; адрессины; регуляторные белки; иммуноадгезины; и биологически активные фрагменты или варианты любого из вышеперечисленных. В качестве альтернативы, антитело может быть антителом, направленным против эпителиальных клеток молочной железы или связывающимся с клетками карциномы толстой кишки, антителами к ЕрСАМ, антителами к Gp11b/IIIa, антителами к RSV, антителами к CMV, антителами к ВИЧ, антителами к гепатиту, антителами к СА 125, антитела к почечно-клеточной карциноме человека, антителами к колоректальной опухоли человека, антителами R24 к меланоме человека, направленными против ганглиозида GD3, антителами к плоскоклеточному раку человека, антителами к антигену лейкоцитов человека (HLA), антителами к HLA DR.

Используемые в данном документе термины «антиген» и «эпитоп» используются взаимозаменяемо и относятся к сайту (например, непрерывному участку аминокислот или конформационной конфигурации, состоящей из различных областей из не являющихся непрерывными аминокислот) на антигене, либо белковые или небелковые, с которыми связывается фрагмент связывания антитела, образуя комплекс связывающий фрагмент антитела-антиген. Таким образом, эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается антителом. Эпитопы могут образовываться из непрерывных участков аминокислот (линейный эпитоп) или содержать прерывистые аминокислоты (конформационный эпитоп), например, приводимые в пространственную близость вследствие сворачивания антигена, т.е. за счет третичного сворачивания белкового антигена. Линейные эпитопы обычно остаются связанными с антителом после воздействия на белковый антиген денатурирующих агентов, тогда как конформационные эпитопы обычно разрушаются при обработке денатурирующими агентами. Эпитоп содержит по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

В некоторых вариантах осуществления детерминанта-эпитоп включает химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи Сахаров, фосфорил или сульфонил, а в некоторых вариантах реализации может иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические зарядные характеристики. Подходящие антигенные детерминанты могут находиться, например, на поверхности опухолевых клеток, на поверхностях инфицированных вирусом клеток, на поверхностях других пораженных заболеванием клеток, на поверхности иммунных клеток, в свободном виде в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (ВКМ). Белки, применимые в контексте данного документа, могут представлять собой любую нативную форму белков из любого источника, относящегося к позвоночным, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Отбор антител, связывающихся с конкретным эпитопом (т.е. тех, которые связываются с одним и тем же эпитопом), можно проводить с помощью способов, обычных в данной области техники, таких как, например, без ограничения, аланиновое сканирование, пептидные блоты (смотрите Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463), анализ расщепления пептидов, вырезание эпитопа, экстракция эпитопа, химическая модификация антигенов (см. Prot. Sci. 9 (2000) 487-496) и перекрестный конкурентный анализ (смотрите «Antibodies», Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY).

В конкретном варианте осуществления антиген представляет собой человеческий белок. Когда в данном документе упоминается конкретный белок, этот термин включает «полноразмерный» непроцессированный белок, а также любую форму белка, которая является результатом процессинга в клетке. Этот термин также охватывает варианты белка природного происхождения, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Другими словами, этот термин также охватывает антитело, имеющее структуру, по существу, аналогичную структуре нативного антитела, или имеющее тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, как определено в настоящем документе.

Под «антигенсвязывающий» подразумевается, что антигенсвязывающий сайт части антитела специфически связывается с антигеном. Другими словами, термин «антигенсвязывающий сайт» относится к части антитела, которая содержит участок, специфически связывающийся и комплементарный с частью антигена или со всем антигеном. Под выражением «специфическое связывание» подразумевается, что связывание является избирательным в отношении антигена и может быть отделено от нежелательных или неспецифических взаимодействий. Способность антигенсвязывающей молекулы связываться с конкретным антигеном можно определить с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ИФА) или других методик, известных специалисту в данной области техники, например, метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (с анализом на приборе BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)).

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей молекулы иммуноглобулина содержат связывающий домен, взаимодействующий с антигеном. Константные области антител (Ab) могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (такие как эффекторные клетки) и компоненты системы комплемента, такие как C1q, первый компонент в классическом пути активации комплемента. «Вариабельный домен» (вариабельный домен легкой цепи (VL), вариабельный домен тяжелой цепи (VH)) при использовании в настоящем документе означает каждую из пар легких и тяжелых цепей, которые вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены легких и тяжелых цепей человека имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасные области (FR), последовательности которых являются в значительной степени консервативными, соединенные тремя «гипервариабельными областями» (или определяющими комплементарность областями, CDR). (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., стр. 91 (2007)). Одного домена VH или VL может быть достаточно для придания антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связывают конкретный антиген, можно выделять, используя домен VH или VL из антитела, которое связывает антиген, для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. Смотрите, например, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991). В контексте данного документа термин «гипервариабельная область» или «HVR» относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными по последовательности и которые определяют антигенсвязывающую специфичность, например, к «определяющим комплементарность областям» («CDR»). Если не указано иное, CDR определены в соответствии с Kabat et al., выше. Специалисту в данной области техники известно, что отнесение CDR также можно определять в соответствии с Чотия, выше, МакКаллумом, выше, или любой другой научно принятой системой номенклатуры.

Каркасные области принимают β-складчатую конформацию, a CDR могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи удерживаются в своей трехмерной структуре при помощи каркасных областей и образуют вместе с CDR из другой цепи антигенсвязывающий сайт. Области CDR3 тяжелой и легкой цепей антитела играют особенно важную роль в специфичности/аффинности связывания антител согласно изобретению и, следовательно, представляют собой дополнительный объект изобретения. Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в вариабельной области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, описанной в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. «Каркасная область» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно находятся в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. За исключением CDR1 в VH, CDR в целом содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. CDR также содержат «определяющие специфичность остатки» или «SDR», которые представляют собой остатки, контактирующие с антигеном. SDR содержатся в областях CDR, называемых сокращенными-CDR или a-CDR. Примеры a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-H3) встречаются на аминокислотных остатках 31-34 L1, 50-55 L2, 89-96 L3, 31-35В H1, 50-58 H2 и 95-102 Н3. (См. Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)).

Как указано выше, термин «антитело» в данном документе, если не указано иное или явно не противоречит контексту, включает полноразмерное антитело и фрагменты антитела, которые являются антигенсвязывающими фрагментами, т.е. сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Другими словами, термин «фрагмент», используемый в данном документе, относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антигены, с которыми связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, (i) Fab'- или Fab-фрагмент; диатела, линейные антитела; молекулы одноцепочечного антитела (например, scFv и scFab), мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов L, VH, CL и Сн1, или моновалентное антитело, как описано в WO 2007059782 (Genmab); (ii) фрагменты F(ab')2, бивалентные фрагменты, содержащие два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий по существу из доменов V_H и С_Н1; (iv) фрагмент Fv, состоящий в основном из доменов V_L и V_H одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), который состоит в основном из домена V_H, также называемый доменом антител (Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov; 21(11):484-90); (vi) верблюжьи антитела или нанотела (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5(1): 111-24) и (vii) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Обработка пепсином приводит к получению Е(ab')2-фрагмента, который имеет два антигенсвязывающих сайта (два Fab-фрагмента) и часть Fc-области. Обсуждение фрагментов Fab и F(ab')2, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и имеющих увеличенное время полужизни in vivo, смотрите в патенте США №5869046. «Диатела» представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими. Смотрите, например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Более того, хотя два домена Fv-фрагмента, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с применением рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, что позволяет сделать их единой белковой цепью, в которой V_L и участки V_H образуют пары с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные антитела или одноцепочечные Fv (scFv), см., например, Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) и Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Таким образом, «одноцепочечный вариабельный фрагмент» или «scFv» представляет собой слитый белок из вариабельных доменов тяжелой (VH) и легкой цепей (VL) антитела, соединенных линкером. В частности, линкер представляет собой короткий полипептид из 10-25 аминокислот и обычно обогащен глицином для гибкости, а также серином или треонином для растворимости, и может соединять N-конец VH с С-концом VL или наоборот. Этот белок сохраняет специфичность оригинального антитела несмотря на удаление константных областей и внесение линкера. Обзор scFv-фрагментов см., например, в Pluckthun, в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994); также см. WO 93/16185; и патенты США №№5571894 и 5587458. «Однодоменные антитела» представляют собой фрагменты антител, содержащие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В определенных аспектах однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (Domantis, Inc., Waltham, MA; смотрите, например, патент США №6248516 В1). Фрагменты антител можно получать различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также рекомбинантное продуцирование рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli), как описано в данном документе.

Такие одноцепочечные антитела охватываются термином «антитело», если не указано иное или явно не указано в контексте. Хотя такие фрагменты обычно включаются в определение антитела, они вместе и каждый независимо являются уникальными признаками настоящего изобретения, проявляя различные биологические свойства и полезность. Эти и другие полезные фрагменты антител в контексте настоящего изобретения, а также биспецифические форматы таких фрагментов обсуждаются далее в данном документе. Обзор некоторых фрагментов антител смотрите в Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005).

Термин «полноразмерное антитело» означает антитело, состоящее из двух «тяжелых цепей полноразмерного антитела» и двух «легких цепей полноразмерного антитела». «Тяжелая цепь полноразмерного антитела» представляет собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца до С-конца из вариабельного домена (VH) тяжелой цепи антитела, константного домена 1 (СН1) тяжелой цепи антитела, шарнирной области (HR) антитела, константного домена 2 (СН2) тяжелой цепи антитела и константного домена 3 (СН3) тяжелой цепи антитела, который сокращенно называется VH-CH1-HR-СН2-СН3; и необязательно константного домена 4 (СН4) тяжелой цепи антитела в случае антитела подкласса IgE. Предпочтительно «тяжелая цепь полноразмерного антитела» представляет собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца до С-конца из VH, CH1, HR, СН2 и СН3. «Легкая цепь полноразмерного антитела» представляет собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца до С-конца из вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела и константного домена легкой цепи (CL) антитела, что сокращенно называется VL-CL. Константный домен легкой цепи (CL) антитела может быть к (каппа) или % (лямбда). Две цепи полноразмерного антитела связаны вместе посредством дисульфидных связей между полипептидами между доменом CL и доменом СН1 и между шарнирными областями тяжелых цепей полноразмерного антитела. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. В определенных аспектах антитело относится к изотипу IgG₁. «Класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, которые содержит его тяжелая цепь. В определенных аспектах антитело относится к изотипу IgG₁ с мутациями P329G, L234A и L235A для уменьшения эффекторной функции Fc-области. В других аспектах антитело относится к изотипу IgG₂. В определенных аспектах антитело относится к изотипу IgG₄ с мутацией S228P в шарнирной области для улучшения стабильности антитела IgG₄. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности ее константного домена.

Также следует понимать, что термин антитело, если не указано иное, также включает поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAb), антителоподобные полипептиды, такие как химерные антитела и гуманизированные антитела, и фрагменты антител, сохраняющие способность специфически связываться с антигеном (антигенсвязывающими фрагментами), полученные с помощью любой известной методики, такой как ферментативное расщепление, синтез пептидов и рекомбинантные методики. Полученное антитело может иметь любой изотип. Термин «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из определенного источника или вида, тогда как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или вида.

Например, антитело может быть моноклональным антителом. В контексте данного документа термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих мутации природного происхождения или возникающие во время получения препарата моноклональных антител, причем такие варианты в целом присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение «моноклональный» указывает на характеристику антитела, как полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и его не следует интерпретировать как требование получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела можно получать различными методиками, включая, но не ограничиваясь этим, метод гибридомы, методы рекомбинантных ДНК, методы фагового дисплея и методы с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, причем такие методы и другие типовые методы получения моноклональных антител описаны в данном документе.

В качестве другого примера антитело может представлять собой гуманизированное антитело. Термин «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасные области или «определяющие комплементарность области» (CDR) были модифицированы так, чтобы содержать CDR иммуноглобулина с отличной специфичностью по сравнению с исходным иммуноглобулином. Другими словами, этот термин охватывает химерное антитело, содержащее аминокислотные остатки из нечеловеческих CDR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В определенных аспектах гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все CDR соответствуют таковым из нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют таковым из человеческого антитела. Гуманизированное антитело, необязательно, может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, полученную из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, подвергшемуся гуманизации. Способы получения гуманизированных антител включают обычные технологии рекомбинантной ДНК и генной трансфекции и хорошо известны в данной области. См., например, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; и Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270.

В качестве другого примера антитело может представлять собой антитело человека. Термин «антитело человека» при использовании в настоящем документе предназначен включать антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевых линий человека. Другими словами, термин охватывает аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, продуцируемого человеком или клеткой человека, или полученного из источника, отличного от человека, в котором используются репертуары антител человека или другие последовательности, кодирующие антитела человека. Это определение человеческого антитела явным образом исключает гуманизированное антитело, содержащее отличные от человеческих антигенсвязывающие остатки. Антитела человека хорошо известны в данной области техники (van Dijk, М.А., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Человеческие антитела можно получать, используя различные методики, известные в данной области техники. Человеческие антитела в целом описаны в van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008). Человеческие антитела можно получать путем введения иммуногена трансгенному животному, модифицированному для продуцирования интактных человеческих антител или интактных антител с человеческими вариабельными областями в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные, как правило, содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, которые замещают эндогенные локусы иммуноглобулина или которые находятся вне хромосом или случайным образом интегрированы в хромосомы животного. Как правило, у таких трансгенных мышей инактивированы эндогенные локусы иммуноглобулина. Обзор способов получения человеческих антител от трансгенных животных смотрите в Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Также смотрите, например, патенты США №№6075181 и 6150584, в которых описана технология XENOMOUSE™; патент США №5770429, в котором описана технология HuMab®; патент №7041870, в котором описана технология К-М MOUSE®, и публикацию заявки на патент США №US 2007/0061900, в которой описана технология VelociMouse®). Человеческие вариабельные области из интактных антител, продуцируемых такими животными, можно дополнительно модифицировать, например, путем объединения с отличной человеческой константной областью.

Человеческие антитела можно получать способами на основе гибридом. Были описаны линии клеток человеческой миеломы и мышино-человеческой гетеромиеломы для продуцирования человеческих моноклональных антител. (См., например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Человеческие антитела, полученные посредством технологии человеческой В-клеточной гибридомы, также описаны в Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают способы, описанные, например, в патенте США №7189826 (в котором описано получение моноклональных человеческих антител IgM из линий клеток гибридомы) и Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (в котором описаны человек-человеческие гибридомы). Технология человеческой гибридомы (технология триомы) описана в Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

Человеческие антитела также можно получать путем выделения последовательностей вариабельного домена из библиотек фагового дисплея человеческого происхождения. Такие последовательности вариабельного домена затем можно объединять с необходимым человеческим константным доменом. Способы отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.

В одном аспекте, используемом в контексте настоящего изобретения, рекомбинантный белок представляет собой антитело к α-синуклеину или биспецифическое антитело, направленное против CD3 и CD20, также обозначаемое как биспецифическое антитело к CD20/CD3. Термин «биспецифическое антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, имеющему две разные антигенсвязывающие области, определяемые разными последовательностями антител. Примеры форматов биспецифических антител, которые можно применять в этих целях, включают, но не ограничиваются этим, так называемые молекулы «BiTE» (привлекающий Т-клетки биспецифический активатор), в которых две молекулы scFv сшиты гибким линкером (смотрите, например, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261 и WO 2008/119567, Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); диатела (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) и их производные, такие как тандемные диатела («TandAb»; Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)); молекулы «DART» (перенацеливание с двойной аффинностью), которые основаны на формате диатела, но имеют С-концевой дисульфидный мостик для дополнительной стабилизации (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)), и так называемые triomab, которые представляют собой полностью гибридные молекулы IgG мыши/крысы (обзор в Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). Конкретные включенные в данный документ форматы Т-клеточных биспецифических антител описаны в WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) е1203498.

Термины «антитело к α-синуклеину», «антитело анти-α-синуклеин» и «антитело, которое связывается с α-синуклеином» относятся к антителу, которое способно связывать альфа-синуклеин человека с достаточной аффинностью, так что антитело полезно в качестве диагностического и/или терапевтического средства для нацеливания на α-синуклеин. α-синуклеин представляет собой белок, который в головном мозге играет центральную роль в контроле дофаминергических функций нейронов и, как полагают, играет решающую роль в патофизиологии болезни Паркинсона (БП). Например, синуклеинопатии, также известные как болезни с тельцами Леви (LBD), характеризуются дегенерацией дофаминергической системы, двигательными нарушениями, когнитивными нарушениями и образованием телец Леви (LB) и/или нейритов Леви (McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24), и их можно лечить антителами к α-синуклеину. Такие синуклеинопатии включают болезнь Паркинсона (включая идиопатическую болезнь Паркинсона), диффузную болезнь с тельцами Леви (DLBD), также известную как деменция с тельцами Леви (DLB), вариант болезни Альцгеймера с тельцами Леви (LBV), комбинированную болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, истинную вегетативную недостаточность и множественную системную атрофию (МСА; например, оливопонтоцеребеллярную атрофию, стриатонигральную дегенерацию и синдром Шай-Дрейджера).

Альфа-синуклеин является частью большого семейства белков, включая бета- и гамма-синуклеин, и синоретин. Природный человеческий альфа-синуклеин дикого типа представляет собой пептид из 140 аминокислот, имеющий следующую аминокислотную последовательность:

MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (SEQ ID NO: 9)

(Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:11282-6).; номер доступа GenBank: P37840). Белок имеет три распознаваемых домена: повторяющийся домен KTKE, охватывающий аминокислоты 1-61, домен NAC (неамилоидный компонент), простирающийся приблизительно от аминокислот 60-95, и С-концевой кислотный домен, простирающийся приблизительно от аминокислоты 98 до 140. Ссылка на альфа-синуклеин или его фрагменты включает природные аминокислотные последовательности дикого типа человека, указанные выше, и их аллельные варианты человека, особенно связанные с болезнью с тельцами Леви (например, E46K, А30Р и А53Т, где первая буква обозначает аминокислоту в SEQ ID NO: 9, номер представляет собой положение кодона в SEQ ID NO: 9, а вторая буква представляет собой аминокислоту в аллельном варианте).

Альфа-синуклеин экспрессируется в нормальном состоянии, связанном с синапсами, и считается, что он играет роль в нервной пластичности, обучении и памяти. Несколько исследований показали, что альфа-синуклеин играет центральную роль в патогенезе БП. Белок может агрегировать с образованием нерастворимых фибрилл при патологических состояниях. Например, синуклеин накапливается в LB (Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8). Мутации в гене альфа-синуклеина косегрегируют с редкими семейными формами паркинсонизма (Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276:2045-7). Сверхэкспрессия альфа-синуклеина у трансгенных мышей (Masliah et al., Science (2000) 287:1265-9) и дрозофилы (Feany et al., Nature (2000) 404:394-8) имитирует некоторые патологические аспекты болезни с тельцами Леви. Кроме того, предполагалось, что растворимые олигомеры синуклеина могут быть нейротоксичными (Conway KA, et al., Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:571-576; VollesMJ, Lansbury PT, Jr Biochemistry (2003) 42:7871-7878). Накопление альфа-синуклеина со сходными морфологическими и неврологическими изменениями у видов и моделей животных, таких разных, как люди, мыши и мухи, предполагает, что эта молекула способствует развитию болезни с тельцами Леви.

Например, антитело к α-синуклеину может представлять собой антитело, обозначаемое как 9Е4 (прасинезумаб), BIIB054, 1Н7, 5С1, 6Н7, 8А5 и N1-202.21D11, и родственные им антитела. Прасинезумаб или 9Е4 также известен как PRX002 и RG7935. Как показано в прилагаемых примерах, клетки СНО L965 (Пример 3), клетки СНО L967 (Пример 6) и клетки СНО L971 (Примеры 7 и 8) продуцируют прасинезумаб. Ссылки на такие антитела можно найти в данной области техники, например, 9Е4 (прасинезумаб) и родственные ему антитела можно найти в патентах США 8609820; США 9556259; США 9884906; США 8697082; США 8506959; США 9034337; США 7919088; США 8092801; США 8147833; США 8673593; США 7910333 и США 7674599. Ссылки на BIIB054, также известный как N1-202.12F4, и родственные ему антитела можно найти, например, в патентах США 10301381; США 9975947; США 8896504; США 9580493 и США 8940276. Ссылки на 1Н7 и родственные ему антитела можно найти, например, в патентах США 7910333; США 8790644; США 9234031; 9217030 США; 9670273 США и 10118960 США. Ссылки на 5С1, и родственные ему антитела можно найти, например, в патентах США 9605056; США 10081674 и США 10301382. Ссылки на 6Н7 и родственные ему антитела можно найти, например, в патентах США 8673593 и США 7910333. Ссылки на 8А5 и родственные ему антитела можно найти, например, в патентах США 8673593 и США 7910333. Ссылки на N1-202.21D11, и родственные ему антитела можно найти, например, в патенте США 9580493.

В частности, пациентов с болезнью Паркинсона и родственными нарушениями можно лечить антителом к α-синуклеину. Действительно, помимо того, что α-синуклеин является основным белковым компонентом телец Леви (ТЛ), генетические исследования показали, что определенные точечные мутации и мультипликации гена α-синуклеина вызывают семейные формы БП. Большой объем данных указывает на то, что патология α-синуклеина в дофаминергических синапсах может лежать в основе возникновения дисфункции и дегенерации нейронов в головном мозге при БП (Bellucci, A., et al., Brain Res. 1432 (2012) 95-113).

Термин «CD20» относится к CD20 человека (UniProtKB/Swiss-№ прот. Р11836) и включает любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD20, которые естественным образом экспрессируются клетками, включая опухолевые клетки, или экспрессируются клетками, трансфицированными геном CD20 или кДНК. Молекула CD20 (также называемая антиген ограниченной дифференцировки человеческих В-лимфоцитов или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой приблизительно 35 кДа, локализованный на пре-В- и зрелых В-лимфоцитах (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(19): 11282- 11287; и Einfield et al., (1988) EMBO J. 7(3): 711-717). CD20 обнаруживается на поверхности более чем 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов и экспрессируется во время раннего развития пре-В-клеток и остается до дифференцировки плазматических клеток. CD20 присутствует как на нормальных В-клетках, так и на злокачественных В-клетках. В частности, CD20 экспрессируется более чем в 90% В-клеточных неходжкинских лимфом (НХЛ) (Anderson et al. (1984) Blood 63(6): 1424-1433), но не обнаруживается в гемопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или других нормальных тканях (Tedder et al. (1985) J. Immunol. 135(2):973-979).

Термин «CD3», используемый в данном документе, относится к белку кластера дифференцировки 3, который является частью белкового комплекса корецептора Т-клеток и состоит из четырех отдельных цепей. CD3 также обнаружен у человека, а также у других видов, и, таким образом, термин «CD3» может быть использован в данном документе и не ограничивается CD3 человека, если это не противоречит контексту. У млекопитающих комплекс содержит CD3y (гамма) цепь (человеческая CD3y цепь UniProtKB/Swiss-Prot № Р09693 или CD3y яванского макака UniProtKB/Swiss-Prot № Q95LI7), CD36 (дельта) цепь (человеческий CD36 UniProtKB/Swiss-Prot № Р04234 или CD36 UniProtKB/Swiss-Prot № Q95LI8 у яванского макака), две цепи CD3s (эпсилон) (CD3s человека UniProtKB/Swiss-Prot № Р07766; CD3s у яванского макака UniProtKB/Swiss-Prot № Q95LI5; или CD3s у макака-резуса UniProtKB/Swiss-Prot № G7NCB9) и дзета-цепь (CD3C человека UniProtKB/Swiss-Prot № Р20963, CD3ζ UniProtKB/Swiss-Prot № Q09TK0 яванского макака). Эти цепи связываются с молекулой, известной как Т-клеточный рецептор (TCR), и генерируют сигнал активации в Т-лимфоцитах. Молекулы TCR и CD3 вместе составляют комплекс TCR.

В соответствии с настоящим изобретением клетки млекопитающих культивируют для получения рекомбинантного белка, имеющего моногалактозилированные или дигалактозилированные гликаны. При выборе клетки-хозяина для продукции рекомбинантного белка в контексте настоящего изобретения специалист в данной области техники понимает, что разные клетки-хозяева обладают разными свойствами и/или специфическими механизмами для трансляционного и посттрансляционного процессинга и модификации экспрессированного белка, такими как без ограничения гликозилирование и расщепление. В этом контексте специалисту известно, как выбрать подходящую клетку в контексте настоящего изобретения. Другими словами, специалист в данной области знает, какую клеточную линию следует выбрать, чтобы обеспечить возможность посттрансляционных модификаций. В качестве альтернативы клетка-хозяин может быть модифицирована средствами, необходимыми для специфической посттрансляционной модификации для экспрессии рекомбинантного белка, имеющего моногалактозилированные или дигалактозилированные гликаны. Рекомбинантные способы для получения рекомбинантных белков, таких как антитела, которые могут представлять собой полученные, например, как описано в патенте США 4816567. Для этих способов предложены одна или более выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих антитело. В случае нативного антитела или нативного фрагмента антитела необходимы две нуклеиновые кислоты, одна для легкой цепи или ее фрагмента и одна для тяжелой цепи или ее фрагмента. Такая(ие) нуклеиновая(ые) кислота(ы) кодирует (кодируют) аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). Эти нуклеиновые кислоты могут находиться в одном экспрессионном векторе или в разных экспрессионных векторах.

В случае биспецифического антитела с гетеродимерными тяжелыми цепями необходимы четыре нуклеиновые кислоты, одна для первой легкой цепи, одна для первой тяжелой цепи, содержащей полипептид первой гетеромономерной Fc-области, одна для второй легкой цепи и одна для второй тяжелой цепи, содержащей полипептид второй гетеромономерной Fc-области. Четыре нуклеиновые кислоты могут содержаться в одной или более молекулах нуклеиновых кислот или одном или более экспрессионных векторах. Такие нуклеиновые кислоты кодируют аминокислотную последовательность, содержащую первую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую первую VH, содержащую первую гетеромономерную Fc-область, и/или аминокислотную последовательность, содержащую вторую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую вторую VH, содержащую вторую гетеромономерную Fc-область антитела (например, первую и/или вторую легкие и/или первую и/или вторую тяжелые цепи антитела). Эти нуклеиновые кислоты могут находиться в одном экспресс ионном векторе или в разных экспрессионных векторах, обычно эти нуклеиновые кислоты расположены в двух или трех экспрессионных векторах, т.е. один вектор может содержать более одной из этих нуклеиновых кислот. Примерами этих биспецифических антител являются CrossMab (смотрите, например, Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191). Например, одна из гетеромономерных тяжелых цепей содержит так называемые «мутации выступа» (T366W и необязательно одну из S354C или Y349C), а другая содержит так называемые «мутации впадины» (T366S, L368A и Y407V и необязательно Y349C или S354C) (смотрите, например, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73) в соответствии с нумерацией по индексу EU.

Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была внесена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированные клетки и полученное от них потомство вне зависимости от числа пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновой кислоты и может содержать мутации. Сюда включено мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, в отношении которой проводят скрининг или отбор изначально трансформированных клеток. Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии кодирующих антитела векторов включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в данном документе. Информацию по экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях смотрите, например, в US 5648237, US 5789199 и US 5840523. (Смотрите также Charlton, К.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol.248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp.245-254, где описана экспрессия фрагментов антитела в Е. coli.) После экспрессии антитело можно выделять из бактериальной клеточной пасты в растворимую фракцию и дополнительно очищать.

Термины «клетка-хозяин млекопитающего», «линия клетки-хозяина млекопитающего» и «культура клетки-хозяина млекопитающего» используются взаимозаменяемо и относятся к клеточным линиям, полученным от млекопитающих, которые способны к росту и выживанию при помещении либо в монослойную культуру, либо в суспензионную культуру в среде, содержащей соответствующие питательные вещества и факторы роста. Необходимые факторы роста для конкретной клеточной линии, легко определяются эмпирически без ненужных экспериментов, как описано, например, в Mammalian Cell Culture (Mather, J.P. ed., Plenum Press, N.Y. [1984]), и Barnes and Sato. ((1980) Cell. 22:649). Как правило, клетки способны экспрессировать и секретировать большие количества конкретного интересующего гликопротеина в среду для культивирования. Примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих в контексте настоящего изобретения могут включать клетки яичника китайского хомяка/-ДГФР (СНО. Urlaub and Chasm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216 [1980]); клетки dp12.CHO (EP 307.247 опубликован 15 марта 1989); линию почки обезьяны CV1, трансформированную SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); линию почки эмбриона человека (293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 [1977]); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки Сертоли мышей (ТМ4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 [1980]); клетки почки обезьяны (CVI АТСС CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, АТСС CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени серой крысы (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клетки легкого человека (W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоль молочной железы мышей (ММТ 060562. АТСС CCL51); клетки TRI (Mather et al, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 [1982]); клетки MRC 5; клетки FS4; и линия гепатомы человека (Hep G2). В предпочтительном аспекте настоящего изобретения клетки млекопитающего выбраны из группы, состоящей из клеток СНО, клеток Vero, клеток ВНК, клеток COS и клеток HEK293/293Т, более предпочтительно клетки млекопитающего представляют собой клетки СНО.

Более предпочтительно клетка-хозяин млекопитающих представляет собой клетку СНО, еще более предпочтительно клетку СНО с недостаточной активностью дигидрофолатредуктазы (ДГФР). Клетка млекопитающего, используемая в настоящем изобретении, может быть отобрана или подвергнута воздействию для получения рекомбинантного белка. Воздействие включает одну или более генетических модификаций, таких как введение одного или более гетерологичных генов, кодирующих экспрессируемый белок. Гетерологичный ген может кодировать белок, который обычно экспрессируется в этой клетке или является чужеродным для клетки-хозяина. Дополнительно или в качестве альтернативы воздействие может заключаться в повышении или понижении уровня одного или более эндогенных генов. Часто клетки подвергают воздействию для получения рекомбинантного белка, например, путем введения гена, кодирующего белок, и/или путем введения контрольных элементов, которые регулируют экспрессию гена, кодирующего интересующий белок. Гены, кодирующие рекомбинантные белки и/или элементы управления, могут быть введены в клетку-хозяина с помощью векторов, таких как плазмиды, фаги или вирусные векторы. В контексте данного документа термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной увеличивать число копий другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Этот термин включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую его внесли. Некоторые векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе «экспрессионными векторами».

Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены, в то время как другие векторы могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Различные векторы общедоступны, и точная природа векторов не является существенной для настоящего изобретения. Обычно компоненты вектора включают одну или более из сигнальных последовательностей, точку начала репликации, один или более маркерных генов, промотор и последовательность терминации транскрипции. Такие компоненты описаны в WO 97/25428.

«Фаза роста» клеточной культуры относится к периоду экспоненциального роста клеток (логарифмическая фаза), когда клетки обычно быстро делятся. Во время этой фазы клетки культивируют в течение определенного периода времени, обычно от 1 до 4 дней, и в таких условиях, чтобы рост клеток был максимальным. Определение цикла роста клетки-хозяина может быть определено для конкретной предполагаемой клетки-хозяина без ненужных экспериментов. «Период времени и при таких условиях, при которых рост клеток максимизируется» и т.п., относятся к тем условиям культивирования, которые для конкретной клеточной линии определены как оптимальные для роста и деления клеток. В фазе роста клетки культивируют в питательной среде, содержащей необходимые добавки. Кроме того, условия культивирования, такие как температура, рН, растворенный кислород (dO₂) и т.п., используются для конкретного хозяина и будут очевидны специалисту в данной области техники. Обычно рН регулируют либо кислотой (например, CO₂), либо основанием (например, Na₂CO или NaOH). Подходящий диапазон температур для культивирования клеток млекопитающих, таких как клетки СНО, составляет приблизительно от 30 до 38°С, а подходящее значение dO₂ составляет от 5 до 90% от насыщения воздухом во влажной контролируемой атмосфере, так что достигается оптимальный рост для конкретного вида клеточной линии. Например, можно использовать условия периодического культивирования клеток с подпиткой, поскольку условия периодического культивирования с подпиткой разработаны для усиления роста клеток млекопитающих в фазе роста клеточной культуры. «Периодическая культура с подпиткой», используемая в данном документе, относится к способу культивирования клеток, при котором дополнительные компоненты добавляются в культуру во время или после начала процесса культивирования. Периодическую культуру с подпиткой обычно останавливают в какой-то момент, а клетки и/или компоненты среды собирают и, необязательно, очищают. Кроме того, на определенной стадии клетки могут использоваться для инокуляции на фазе или шаге получения клеточной культуры. В качестве альтернативы фаза или шаг получения может быть непрерывным с фазой или шагом инокуляции или роста.

«Переходная фаза» клеточной культуры относится к периоду времени, в течение которого действуют условия культивирования на фазе получения. Во время переходной фазы факторы окружающей среды, такие как температура клеточной культуры, осмоляльность среды и т.п., смещаются из условий роста в условия получения.

«Фаза получения» клеточной культуры относится к периоду времени, в течение которого рост клеток стабилизировался. Во время фазы получения логарифмический рост клеток закончился, и получение белка является первичным. В течение этого периода среда обычно дополняется для поддержки непрерывного получения белка и получения желаемого продукта гликопротеина. Например, под контролем находится среда культивирования клеток во время фазы получения клеточной культуры. В соответствии со способом по настоящему изобретению один или более факторов, влияющих на плотность жизнеспособных клеток и/или титр продукта культуры клеток-хозяев млекопитающих, подвергают воздействию таким образом, чтобы достичь определенного содержания галактозила в экспрессированном рекомбинантном белке. «Титр» в данном контексте относится к общему количеству рекомбинантно экспрессированного гликопротеина, продуцируемого культурой клеток млекопитающих в заданном количестве объема среды. Титр обычно выражается в миллиграммах гликопротеина на миллилитр среды. В частности, факторы, повышающие содержание галактозила в рекомбинантном белке, контролируются в фазе получения в процессе культивирования клеток таким образом, чтобы полученный рекомбинантный белок содержал конкретное количество галактозила. Как используется в данном документе, фазе получения в процессе культивирования клеток предшествует переходная фаза клеточной культуры, в которую вовлечены параметры для фазы получения клеточной культуры.

В способе по настоящему изобретению концентрацию одного или более сульфгидрильных соединений и/или концентрацию глюкозы регулируют на любой или всех фазах роста или получения в процессе ферментации. Например, концентрацию одного или более сульфгидрильных соединений и/или глюкозы можно регулировать в начале или во время фазы роста и/или в начале или во время фазы получения. В частности, концентрацию одного или более сульфгидрильных соединений и/или глюкозы можно регулировать в начале роста и в начале фазы получения или в любой, или во всех фазах начала роста во время фазы роста, в начале фазы получения и во время фазы получения. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения одно или более сульфгидрильные соединения и/или глюкозу добавляют в среду в начале или во время фазы получения для создания концентрации одного или более сульфгидрильных соединений приблизительно от 4 мМ до 10 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) в среде и/или по меньшей мере более 3,0 г/л глюкозы. В другом предпочтительном аспекте настоящего изобретения способ дополнительно включает начальный шаг культивирования клеток млекопитающих в той же среде без указанного одного или более сульфгидрильных соединений, содержащих от 4 мМ до 10 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) и/или по меньшей мере более 3,0 г/л глюкозы. В еще одном аспекте настоящего изобретения способ дополнительно включает начальный шаг культивирования клеток млекопитающих в той же среде без указанного одного или более сульфгидрильных соединений, содержащих от 4 мМ до 10 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) и/или по меньшей мере более 3,0 г/л глюкозы, и одно или более сульфгидрильные соединения и/или глюкозу добавляют в среду в начале или во время фазы получения для создания концентрации одного или более сульфгидрильных соединений с приблизительно от 4 мМ до 10 мМ сульфгидрильной(ых) группы (групп) в среде и/или по меньшей мере более 3,0 г/л глюкозы.

Концентрацию одного или более сульфгидрильных соединений можно регулировать путем увеличения или уменьшения концентрации этого(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) в среде для культивирования. В настоящем изобретении, когда концентрация этого(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) увеличивается или уменьшается, это увеличение или уменьшение концентрации связано с концентрацией этого(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) в среде в фазе культивирования, непосредственно предшествующей увеличению. Таким образом, если наблюдается увеличение концентрации, например, цистина и/или цистеина в среде в начале фазы получения, это приводит к увеличению концентрации этого(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) по сравнению с концентрацией этого(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) в среде непосредственно предшествующей фазы роста. Аналогичным образом, если концентрация, например, цистина и/или цистеина в среде во время фазы получения должна увеличиться, то это означает увеличение концентрации этого(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) по сравнению с концентрацией этого(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) в среде непосредственно предшествующей части фазы получения. Аналогичным образом, если должно наблюдаться снижение концентрации, например, цистина и/или цистеина в среде в начале или во время любой из фаз роста или получения, то это снижение концентрации этого(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий) в среде непосредственно предшествующей фазы культивирования.

Как правило, предпочтительно, если концентрации любого из одного или более сульфгидрильных соединений регулируются в среде для культивирования клеток, причем концентрации всех этих одного или более сульфгидрильных соединений регулируются одновременно. Однако способ по настоящему изобретению также включает корректировку одного или более сульфгидрильных соединений путем одновременной корректировки первого сульфгидрильного(ых) соединения(ий), а затем второго или наоборот. В частности, если концентрация одного или более сульфгидрильных соединений должна увеличиваться, а концентрация одного или более сульфгидрильных соединений должна уменьшаться, корректировка в сторону увеличения и уменьшения может происходить одновременно или в разные периоды времени. В этом случае предпочтительно, чтобы регулирование для увеличения концентрации одного или более сульфгидрильных соединений и для уменьшения концентрации одного или более сульфгидрильных соединений происходило в один и тот же момент времени или в одной и той же среде.

В способе по настоящему изобретению регулирование концентрации одного или более сульфгидрильных соединений может быть достигнуто любым способом, подходящим для используемых условий ферментации. Способ, с помощью которого регулируется концентрация одного или более сульфгидрильных соединений, не является существенным для настоящего изобретения, а соответствующие способы известны в данной области техники. Таким образом, регулирование концентрации одного или более сульфгидрильных соединений может происходить либо путем добавления в среду (в случае увеличения концентрации одного или более сульфгидрильных соединений), в которой культивируются клетки, либо путем переноса всех или части клеток (например, путем расщепления) в свежую среду, содержащую желаемую концентрацию одного или более сульфгидрильных соединений. При необходимости можно использовать комбинацию этих способов.

Таким образом, корректировка концентрации одного или более сульфгидрильных соединений может быть непрерывной в течение всего или части периода культивирования или может быть прерывистой, например, как реакция на предполагаемую, рассчитанную или измеренную концентрацию одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования. Изобретение определяет регулирование концентрации одного или более сульфгидрильных соединений в определенных диапазонах. Если фактическое измерение или расчет концентрации каждого или всех одного или более сульфгидрильных соединений в течение определенного периода культивирования, например, во время фазы роста или продукции, указывает на то, что концентрация каждого или всех из одного или более сульфгидрильных соединений попадает в диапазоны, указанные в настоящем документе, тем не менее может иметь место корректировка этой концентрации при условии, что результирующая концентрация одного или более сульфгидрильных соединений остается в пределах указанного диапазона. При необходимости можно использовать известные методики для измерения фактических концентраций одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования до внесения корректировок.

Таким образом, если используются условия периодической ферментации, повышение концентрации одного или более сульфгидрильных соединений может быть достигнуто, например, путем посева в свежую среду, содержащую или дополненную концентрациями одного или более сульфгидрильных соединений, которые увеличены по сравнению с существующей средой для культивирования, или путем разделения клеток в среде, содержащей или дополненной повышенными концентрациями соответствующего(их) одного или более сульфгидрильных соединений по сравнению с существующей средой. Если используются условия периодической ферментации с подпиткой, повышение концентрации одного или более сульфгидрильных соединений может быть достигнуто, например, за счет посева в свежую среду, содержащую или дополненную повышенными концентрациями соответствующего одного или более из соответствующего(их) сульфгидрильного(ых) соединения(ий), дающего одну или более болюсных или непрерывных подач соответствующего одного или более сульфгидрильных соединений в среду для культивирования; путем определения скорости питания на основе количества клеток или рассчитанной в соответствии с известными метаболическими моделями, метаболическими суррогатными маркерами и т.д., или путем разделения культуры на среду, которая содержит или была дополнена повышенными концентрациями соответствующего(их) одного или более сульфгидрильных соединений. Если добавляется болюс или непрерывная подача, он может содержать другие питательные вещества/компоненты, необходимые для культуры, в дополнение к одному или более сульфгидрильному(ым) соединению(иям). Если используются условия перфузионной ферментации, достижение увеличения концентрации одного или более сульфгидрильных соединений может быть достигнуто, например, путем непрерывного или периодического добавления одного или более сульфгидрильных соединений в реактор либо одновременно, либо отдельно с другими питательными веществами/компонентами, добавляемыми в перфузионную культуру.

Если требуется снижение концентрации одного или более сульфгидрильных соединений, это может быть достигнуто путем посева клеток в свежую среду, в которой концентрация одного или более сульфгидрильных соединений снижена по сравнению с концентрацией одного или более сульфгидрильных соединений в среде непосредственно предшествующей фазы культивирования.

Конкретные значения сниженных или повышенных концентраций одного или более сульфгидрильных соединений основаны либо на фактических измерениях одного или более сульфгидрильных соединений в среде для культивирования, либо на теоретических концентрациях, либо на расчетах концентрации одного или более сульфгидрильных соединений в растворе для культивирования, окружающем клетки. Практик понимает, что может присутствовать некоторая концентрация одного или более сульфгидрильных соединений, введенных, например, с помощью примесей и выщелачивания, и будет учитывать это при расчете пониженной или повышенной концентрации одного или более сульфгидрильных соединений в соответствии с изобретением.

В одном аспекте в контексте настоящего изобретения концентрация одного или более сульфгидрильных соединений может быть отрегулирована в среде для культивирования для увеличения галактозилирования гликанов рекомбинантного белка. В другом аспекте настоящего изобретения концентрация одного или более сульфгидрильных соединений может быть отрегулирована в среде для культивирования для повышения плотности жизнеспособных клеток, для повышения титра продукта рекомбинантного белка и/или затем снова для увеличения галактозилирования гликанов рекомбинантного белка. Например, концентрация одного или более сульфгидрильных соединений может быть отрегулирована в среде для культивирования сначала для усиления роста, а затем снова для увеличения галактозилирования гликанов рекомбинантного белка. В качестве другого примера, концентрация одного или более сульфгидрильных соединений может быть отрегулирована в среде для культивирования для повышения плотности жизнеспособных клеток и затем для увеличения галактозилирования гликанов рекомбинантного белка. В качестве другого примера, концентрация одного или более сульфгидрильных соединений может быть отрегулирована в среде для культивирования для увеличения титра продукта рекомбинантного белка, а затем снова для увеличения галактозилирования гликанов рекомбинантного белка. В другом аспекте настоящего изобретения концентрация одного или более сульфгидрильных соединений может быть отрегулирована в среде для культивирования для повышения плотности жизнеспособных клеток, для повышения титра продукта рекомбинантного белка и затем снова для увеличения галактозилирования гликанов рекомбинантного белка.

Используемый в данном документе термин «биореактор» относится к любому сосуду, используемому для выращивания культуры прокариотических или эукариотических клеток, например, культуры клеток животных (такой как культура клеток млекопитающих). Биореактор может быть любого размера, если он подходит для культивирования клеток, например, клеток млекопитающих. Как правило, биореактор имеет объем не менее 30 мл и может иметь объем 1, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 литров или более или любой промежуточный объем. Внутренние условия биореактора, включая без ограничения рН и температуру, обычно контролируют в течение периода культивирования. Биореактор может состоять из любого материала, подходящего для хранения культур клеток млекопитающих, суспендированных в среде в условиях культивирования по настоящему изобретению, включая стекло, пластик или металл. Используемый в данном документе термин «биореактор для продуцирования» относится к конечному биореактору, используемому для получения интересующего полипептида или белка. Объем крупномасштабного биореактора для продуцирования клеточных культур обычно превышает приблизительно 100 мл, обычно по меньшей мере приблизительно 10 литров, и может составлять 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 литров или более или любой промежуточный объем. Например, культивирование клеток млекопитающих осуществляется в крупномасштабном биореакторе, предпочтительно в биореакторе объемом 10000 л.

Специалисту в данной области техники будет известно, и он сможет выбрать подходящие биореакторы для использования в практике настоящего изобретения.

Как используется в предпочтительном аспекте в контексте настоящего изобретения, способ дополнительно включает сбор рекомбинантного белка, продуцируемого клеткой млекопитающего. Сбор экспрессированного белка либо во время, либо в конце периода культивирования, предпочтительно фазы получения, может быть достигнут с использованием способов, известных в данной области техники. Белок может быть получен из среды для культивирования в виде секретируемого белка, хотя он может быть получен из лизатов клеток-хозяев при непосредственном продуцировании без секреторного сигнала. Если белок связан с мембраной, его можно высвободить из мембраны с помощью подходящего раствора детергента (например, Triton-X 100) или его внеклеточную область можно высвободить путем ферментативного расщепления. Экспрессированный белок может быть выделен и/или очищен при необходимости с использованием способов, известных в данной области техники. «Выделенный» белок, такой как антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонента его природного окружения. В некоторых аспектах белок, например, антитело является очищенным до более чем 95% или 99% чистоты, по определению, например, электрофоретическими (например, ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографическими (например, ионообменная или обращенно-фазовая ВЭЖХ) методами. Обзор методов оценки чистоты антител смотрите, например, в Flatman et al., J. Chromatogr. В 848:79-87 (2007).

Используемый в данном документе термин «экспрессия» или «экспрессирует» используются взаимозаменяемо и относятся к транскрипции и трансляции в клетке-хозяине. Уровень экспрессии рекомбинантного белка в клетке-хозяине можно определить на основании либо количества соответствующей мРНК, присутствующей в клетке, либо количества белка, кодируемого соответствующим геном. Например, мРНК, транскрибируемую с гена-продукта, желательно количественно оценить с помощью нозерн-гибридизации (Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)). Белок, кодируемый геном-продуктом, может быть количественно определен либо путем анализа биологической активности белка, либо с помощью анализов, которые не зависят от такой активности, таких как вестерн-блоттинг или радиоиммуноанализ с использованием антител, которые способны реагировать с белком (Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual, pp 18 1- 18 88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)).

В частности, клетки млекопитающих, которые экспрессируют рекомбинантный белок, содержащий моногалактозилированные или дигалактозилированные гликаны, должны экспрессировать или подвергаться воздействию для экспрессии конкретных ферментов таким образом, чтобы при соответствующих условиях, как описано в настоящем документе, in vivo происходила соответствующая посттрансляционная модификация. Ферменты включают те ферменты, которые необходимы для добавления и восполнения N-и О-связанных углеводов, таких как ферменты, описанные у Hubbard и Ivan выше для N-связанных олигосахаридов. Ферменты необязательно включают олигосахарилтрансферазу, альфа-глюкозидазу I, альфа-глюкозидазу II, ER альфа (1,2) маннозидазу, альфа-маннодазу Гольджи I, N-ацетилглюкозаминилтрансферазу I, альфа-маннодазу Гольджи II, N-ацетилглюкозаминилтрансферазу II, альфа (1,6) фукозилтрансферазу и β (1.4) галактозилтрансферазу. Кроме того, клетка-хозяин экспрессирует соответствующий(ие) фермент(ы), которые, как можно ожидать, присоединяют галактозу в определенном положении и связываются как часть генома клетки-хозяина. Необязательно, клетка-хозяин может экспрессировать соответствующий(ие) фермент(ы), например, путем трансфекции ДНК клетки-хозяина, кодирующей фермент(ы). Ожидается, что фермент(ы), такие как описанные выше, будут добавлять галактозу к соответствующей олигосахаридной структуре, такой как GlcNAc. Подходящий(ие) фермент(ы) в контексте настоящего изобретения включает(ют) без ограниченич тот(те) фермент(ы), которые катализируют галактозилирование и разветвление N- и О-связанных олигосахаридов.

Для культивирования клеток млекопитающих, экспрессирующих желаемый белок и способных добавлять желаемые углеводы в определенном положении и связи, можно использовать многочисленные условия культивирования, уделяя особое внимание культивируемой клетке-хозяину. Подходящие условия культивирования клеток млекопитающих хорошо известны в данной области техники (J. Immunol. Methods (1983) 56:221-234) или могут быть легко определены специалистом в данной области техники (см., например, Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood. D. and Hames. B.D., eds. Oxford University Press. New York (1992)) и различаются в соответствии с выбранной конкретной клеткой-хозяина.

Культуру клеток млекопитающих по настоящему изобретению готовят в среде, подходящей для конкретной культивируемой клетки. «Среда», «среда для культивирования клеток» и «культуральная среда» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к раствору, содержащему питательные вещества, поддерживающие рост клеток млекопитающих. Как правило, такие растворы обеспечивают незаменимые и заменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды и микроэлементы, необходимые клетке для минимального роста и/или выживания. Такой раствор может также содержать дополнительные компоненты, которые усиливают рост и/или выживаемость выше минимальной скорости, включая без ограничения гормоны и/или другие факторы роста, определенные ионы, такие как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат, буферы, витамины, нуклеозиды или нуклеотиды, микроэлементы, аминокислоты, липиды и/или глюкозу или другой источник энергии. Среда предпочтительно составлена с рН и концентрацией соли, оптимальными для выживания и пролиферации клеток.

Коммерчески доступные среды, такие как среда Хэма F10 (Sigma), минимальная питательная среда ([MEM], (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и среда Игла в модификации Дульбекко ([DMEM], Sigma) представляют собой типовые питательные растворы. Кроме того, любая из сред, описанных в Ham and Wallace (1979) Meth. Enz., 58:44; Barnes and Sato (1980) Anal. Biochem., 102:255; патентах США №4767704; 4657866; 4927762; 5122469 или 4560655; международных публикациях №WO 90/03430; и WO 87/00195; раскрытия всех из которых включены в данный документ посредством ссылки, могут быть использованы в качестве питательных сред. Любые из этих сред могут быть дополнены при необходимости гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат), буферами (такими как ГЭПЭС), нуклеозидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как препарат Gentamycin™), следовыми элементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне), липидами (такими как линолевая или другие жирные кислоты) и их подходящими носителями, и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые необходимые добавки также могут быть включены в соответствующих концентрациях, как известно специалистам в данной области техники.

Используемый в данном документе термин «в условиях, при которых клетка экспрессирует рекомбинантный белок» обозначает условия, которые используются для культивирования клетки, экспрессирующей полипептид, и которые известны или могут быть определены специалистом в данной области техники. Специалисту в данной области техники известно, что эти условия могут варьироваться в зависимости от типа культивируемых клеток и типа экспрессируемого рекомбинантного белка. Как правило, клетку культивируют при температуре, например, от 20°С до 40°С и в течение периода времени, достаточного для эффективного получения конъюгата, например, на срок от 4 до 28 дней, в объеме от 0,01 до 10' л.

Предпочтительно клетка-хозяин млекопитающего представляет собой клетку СНО, предпочтительно клетку СНО, лишенную активности дигидрофолатредуктазы (ДГФР), а подходящая среда содержит базовый компонент среды, такой как состав на основе DMEM/HAMF-12 (для состава сред DMEM и НАМ F12, см. составы питательных сред в Каталоге клеточных линий и гибридом Американской коллекции типовых культур. Шестое издание. 1988. стр. 346-349) с измененными концентрациями некоторых компонентов, таких как аминокислоты, соли, сахара и витамины, и необязательно содержащая глицин, гипоксантин, тимидин, рекомбинантный человеческий инсулин, гидролизованный пептон, агент защиты клеток, такой как Pluronic F68, или эквивалентный плюроновый полиол, гентамицин и микроэлементы.

В соответствии с настоящим изобретением клетки-хозяева млекопитающих культивируют для получения восстанавливаемого рекомбинантного белка, имеющего моногалактозилированные или дигалактозилированные гликаны. Общее содержание галактозы в рекомбинантном белке регулируют, контролируя параметры клеточной культуры, которые влияют на плотность жизнеспособных клеток, титр продукта и/или содержание галактозы в клетке млекопитающего. Факторы, влияющие на плотность жизнеспособных клеток и/или титр продукта, хорошо известны в данной области и включают без ограничения факторы, влияющие на число копий ДНК, РНК, факторы, влияющие на РНК, такие как факторы, стабилизирующие РНК, питательные вещества среды и другие добавки, концентрацию усилителей транскрипции, осмоляльность среды для культивирования, температуру и рН клеточной культуры и т.п.В соответствии с настоящим изобретением корректировка этих факторов по отдельности или в комбинации для увеличения плотности жизнеспособных клеток и/или титра продукта дает рекомбинантный белок, содержащий моногалактозилированные или дигалактозилированные гликаны. Корректировка этих факторов по отдельности или в комбинации для увеличения плотности жизнеспособных клеток и/или титра продукта приводит к получению рекомбинантного белка с повышенным содержанием галактозы.

Термины «плотность клеток», «концентрация клеток» и т.п., используемые в данном документе, относятся к количеству, весу, массе и т.д. клеток, присутствующих в данном объеме среды. «Пиковая плотность клеток» и т.п.относится к максимальному количеству клеток, которое может быть достигнуто в заданном объеме среды, а «желаемая пиковая плотность клеток» и т.п. относится к максимальному количеству клеток, которое практикующий врач желает получить (например, мишени) в заданном объеме клетки. Варианты такого целевого значения (значений) будут понятны специалистам в данной области техники, например, специалист в данной области может выражать целевое(ые) значение(ия) в терминах желаемой клеточной массы, и такое целевое(ые) значение(ия) может(гут) быть выражено(ы) в одной или более подходящих единицах измерения (например, желаемых пиковых единицах клеточной массы).

Используемый в данном документе термин «жизнеспособность клеток» относится к способности клеток в культуре выживать при заданном наборе условий культивирования или экспериментальных вариациях. Используемый в данном документе термин также относится к той части клеток, которые являются живыми в определенное время по отношению к общему количеству клеток, живых и мертвых, в культуре в это время.

Используемые в данном документе термины «культура» и «культура клеток» относятся к клеточной популяции, которая суспендирована в среде для культивирования клеток в условиях, подходящих для выживания и/или роста клеточной популяции. Используемые в данном документе термины могут относиться к комбинации, включающей клеточную популяцию (например, культуру клеток животных) и среду, в которой суспендирована популяция.

В одном аспекте способ дополнительно включает шаг предварительного культивирования клеток млекопитающих в среде для культивирования клеток. Как предложено в данном документе, клетки можно предварительно культивировать до экспоненциальной фазы роста в подходящей среде для культивирования клеток с сульфгидрильной(ыми) группой(ами) или без них из одного или более сульфгидрильных соединений. Используемый в данном документе термин «предварительное культивирование» или «осуществление предварительного культивирования» используется взаимозаменяемо и относится к шагу культивирования, предшествующему культивированию клеток на втором шаге культивирования. Например, клетки могут быть выращены в первой культуре клеток в качестве шага предварительного культивирования, а затем инокулированы во вторую культуру клеток, например, в биореакторе, таком как биореактор для продуцирования. Специалисту в данной области известны шаги предварительного культивирования, и известно, как выполнять такие шаги предварительного культивирования.

Термин «общая плотность жизнеспособных клеток» или «IVCD», используемый в данном документе, относится к средней плотности жизнеспособных клеток в ходе культивирования, умноженной на количество времени, в течение которого культивирование проводилось. Предполагая, что количество продуцируемого полипептида и/или белка пропорционально количеству жизнеспособных клеток, присутствующих в ходе культивирования, интегрированная плотность жизнеспособных клеток является полезным инструментом для оценки количества полипептида и/или белка, продуцируемого в ходе культивирования.

Рекомбинантный белок по настоящему изобретению может быть получен путем культивирования клеток, которые экспрессируют рекомбинантный белок, в различных условиях культивирования клеток. Другими словами, образование биомассы и экспрессия белка из клеток млекопитающих достигаются в соответствии со способом по изобретению путем культивирования клеток с помощью любого ферментационного способа или системы культивирования клеток, которые пригодны для выращивания клеток, для образования биомассы и экспрессии белков, которые могут использоваться в настоящем изобретении. Например, клетки можно выращивать в периодических культурах, культурах с подпиткой, перфузионных или раздельных культурах, где культуру прекращают после того, как происходит достаточная экспрессия белков, после чего белки собирают и, при необходимости, очищают.

Например, в клеточной культуре по настоящему изобретению можно использовать процедуру периодического культивирования с подпиткой. В периодической культуре с подпиткой клетки млекопитающих могут изначально подаваться в сосуд для культивирования, а дополнительные клеточные питательные вещества подаются, непрерывно или постепенно, в культуру во время культивирования, с периодическим сбором клеток и/или продукта или без него перед прекращением культивирования. Периодическая культура с подпиткой может включать, например, полунепрерывную периодическую культуру с подпиткой, в которой периодически вся культура (включая клетки и среду) удаляется и заменяется свежей средой. Периодическая культура с подпиткой отличается от простой периодической культуры, в которой все компоненты для культивирования клеток (включая клетки и все питательные вещества для культуры) подаются в сосуд для культивирования в начале процесса культивирования. Периодическая культура с подпиткой может дополнительно отличаться от перфузионного культивирования, поскольку надосадочная жидкость не удаляется из сосуда для культивирования во время процесса (при перфузионном культивировании клетки калибруются в культуре, например, при последовательной фильтрации, инкапсуляции, присоединении к микроносителям и т.д., а среду для культивирования непрерывно или периодически вводят и удаляют из сосуда для культивирования). В качестве альтернативы, клетки могут быть выращены в перфузионных культурах, где культура не исчезает, и новые питательные вещества и компоненты периодически или постоянно добавляются к культуре, а экспрессированный гликопротеин удаляют либо периодически, либо непрерывно.

Кроме того, клеточные культуры можно размножать в соответствии с любой схемой или процедурой, которая может быть подходящей для конкретной клетки-хозяина и предполагаемого выбора плана получения. Например, в данной области техники известны реакторы, температуры и другие условия для ферментации культуры клеток для образования биомассы и получения белков, такие как концентрация кислорода и рН. Любые условия, подходящие для культивирования выбранной клетки млекопитающего, могут быть выбраны с использованием информации, доступной в данной области техники. Условия для культивирования, такие как температура, рН и т.п., соответствуют обычным используемым ранее с выбранной для экспрессии клеткой-хозяином и являются очевидными для специалиста в данной области техники. При желании температуру, и/или рН, и/или СО₂ можно изменить в ходе культивирования, чтобы увеличить выход и/или увеличить относительное количество белка желаемого качества.

Кроме того, в этом контексте в настоящем изобретении рассматривают одношаговую или многошаговую процедуру культивирования. При одношаговом культивировании клетки-хозяева инокулируют в среду культивирования, а способы по настоящему изобретению применяют в течение одной фазы продуцирования клеточной культуры. В качестве альтернативы предполагается многостадийная культура. В многошаговой культуре клетки можно культивировать в несколько шагов или фаз. Например, клетки можно выращивать на первом шаге или в фазе роста культуры, где клетки, возможно, изъятые из хранилища, инокулируют в среду, подходящую для стимуляции роста и высокой жизнеспособности. Используемый в данном документе термин «жизнеспособность клеток» относится к способности клеток в культуре выживать при заданном наборе условий культивирования или экспериментальных вариациях. Используемый в данном документе термин также относится к той части клеток, которые являются живыми в определенное время по отношению к общему количеству клеток, живых или мертвых, в культуре в это время. Клетки можно поддерживать в фазе роста в течение подходящего периода времени путем добавления свежей среды к культуре клеток-хозяев.

Например, процедуры культивирования клеток для крупномасштабного или мелкомасштабного получения белков потенциально применимы в контексте настоящего изобретения. Процедуры, включающие без ограничения биореактор с псевдоожиженным слоем, биореактор с полыми волокнами, культивирование в роллер-бутылке или биореактор с мешалкой, можно использовать и эксплуатировать альтернативно в периодическом режиме, периодическом режиме с подпиткой и/или перфузионном режиме. «Перфузионная культура», используемая в данном документе, относится к способу культивирования клеток, включающему выращивание клеток на базовой среде для инокуляции и, когда клетки достигают желаемой плотности клеток, замену отработанной среды свежей средой. Перфузия может включать либо непрерывную, либо прерывистую перфузию и может включать доставку по меньшей мере одного болюса в культуру клеток. За перфузионной культурой может следовать периодическая культура с подпиткой. Используемый в данном документе термин «биореактор» относится к любому сосуду, используемому для выращивания культуры клеток млекопитающих. Как правило, биореактор имеет объем не менее 1 литра и может иметь объем 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 литров или более или любой промежуточный объем. Внутренние условия биореактора, включая без ограничения рН, растворенный кислород и температуру, обычно контролируют в течение периода культивирования. Биореактор может состоять из любого материала, подходящего для хранения культур клеток млекопитающих, суспендированных в среде в условиях культивирования по настоящему изобретению, включая стекло, пластик или металл. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения культивирование клеток млекопитающих проводят в биореакторе, более предпочтительно в крупномасштабном биореакторе. В более предпочтительном аспекте настоящего изобретения культивирование клетки млекопитающего осуществляется по меньшей мере в биореакторе объемом 10000 л.

Важность Fc-галактозилирования антител

Как показано на Фигуре 5, Asn297-связанная углеводная цепь состоит из общей биантеннарной гликановой структуры из четырех остатков N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) и трех остатков маннозы с различными добавками остатков фукозы, галактозы и сиаловой кислоты. Эти гликаны часто называют в соответствии с количеством биантеннарных терминальных остатков галактозы, т.е. G0 (без галактозы), G1 (одна галактоза), G2 (две галактозы) и в соответствии с наличием основного остатка фукозы, т.е. G0 (без галактозы), G1 (одна галактоза), G2 (две галактозы).

В предпочтительном аспекте, используемом в контексте настоящее изобретения, рекомбинантный белок используется в качестве лекарственного средства. Об изменении галактозилирования IgG впервые сообщили при ревматоидном артрите (Parekh et al., Nature. 316 (1985) 452-457), а позднее и при других аутоиммунных заболеваниях, таких как псориатический артрит и анкилозирующий спондилоартрит (Martin et al., J Rheumatol 28 (2001) 1531-1536). Повышенное галактозилирование наблюдалось во время беременности и у пациентов с ревматоидным артритом, у которых наблюдалась вызванная беременностью ремиссия (Bondt et al., J. Proteome. Res. 12 (2013) 4522-4531). Это предполагает, что повышенное галактозилирование антител может быть функционально более противовоспалительным (Zauner et al., Mol. Cell Proteomics. 12 (2013) 856-865). Karsten и др. (Nature Medicine 18.9 (2012) 1401-1406) подтвердили это противовоспалительное свойство, показав на мышах, что высокое галактозилирование иммунных комплексов IgG способствует ассоциации Fcγ RIIB и дектина-1, что блокирует провоспалительные эффекторные функции C5aR и CXCR226. В другом предпочтительном аспекте, используемом в контексте настоящего изобретения, рекомбинантный белок предназначен для лечения пациентов с В-клеточными пролиферативными нарушениями, такими как неходжкинская лимфома и хронический лимфолейкоз, или пациентов с болезнью Паркинсона и родственными нарушениями.

Другим важным аспектом, который следует учитывать при рассмотрении функционального влияния концевой галактозы, является то, что она обеспечивает основу для добавления сиаловой кислоты, наиболее удаленной сахарной части гликана IgG-Fc. Анализ олигосахаридов показал, что отсутствие галактозилирования белка было потенциальной причиной снижения содержания сиаловой кислоты.

Известно, что концевые галактозные структуры оказывают существенное влияние на аффинность к комплексу Clq, и их удаление приводит к снижению активности лизиса комплемента (Hodoniczky, J. et al., Biotechnol. Progr. 21 (2005) 1644-1652). В частности, Wright and Morrison (1998) (J Immunol. 1998; 160:3393 3402) и Hodoniczky et al. (2005) обнаружили, что отсутствие галактозы на олигосахаридах mAb Fc снижает аффинность между Fc и компонентом C1q комплемента, тем самым снижая активность CDC.

Ритуксимаб (Rituxan® анти-CD20), впервые одобренный в 1997 г., представляет собой химерное моноклональное антитело, продуцируемое в клетках СНО, для лечения неходжкинской лимфомы и других заболеваний, связанных с В-клетками. Ритуксимаб гликозилирован в Fc, а гликаны Fc сильно гетерогенны, в основном из-за вариабельного присутствия концевых остатков галактозы. Влияние концевых остатков галактозы ритуксимаба на активность CDC связано с участием таких остатков в связывании ритуксимаба с комплементом C1lq (Hodoniczky et al. 2005).

Наличие или отсутствие галактозы на гликанах IgG коррелирует с эффекторной функцией модифицированного Fc в некоторых, но не во всех (Boyd et al., Mol Immunol. 32 (1995) 1311-1318; Wright and Morrison, J Immunol. 160 (1998) 3393 3402) моноклональных антителах IgG, что позволяет предположить, что наблюдаемые эффекты могут быть частично специфичными для антител. Tsuchiya и др. (1989) обнаружили, что агалакто IgG снижает связывание с рецепторами C1q и Fc, a Boyd и др. обнаружили, что агалакто Campathl (моноклональное антитело к CD52) обладает сниженным клеточно-опосредованным лизисом (CML), но сохраняет способность запускать ADCC. Таким образом, используемый в данном документе термин «эффекторные функции» относится к видам биологической активности, обеспечиваемым Fc-областью антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ); связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; понижающую регуляцию клеточных поверхностных рецепторов (например, В-клеточного рецептора) и активацию В-клеток; см. также, например, Thomann et al, PLoS One. 2015 Aug 12;10(8):e0134949. doi: 10.1371/journal.pone, 0134949. eCollection 2015.

В контексте данного документа термин «Fc-область» используют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Этот термин включает Fc-области с нативной последовательностью и вариантные Fc-области. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи IgG могут немного варьироваться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека по определению обычно простирается от Cys226 или от Pro230, до его карбокси-конца тяжелой цепи. Однако антитела, продуцируемые клетками-хозяевами, могут подвергаться посттрансляционному отщеплению одной или более, в частности одной или двух, аминокислот от С-конца тяжелой цепи. Следовательно, антитело, продуцируемое клеткой-хозяином посредством экспрессии конкретной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную тяжелую цепь, может содержать полноразмерную тяжелую цепь или может содержать расщепленный вариант полноразмерной тяжелой цепи (что также называется в данном документе «тяжелой цепью с расщепленным вариантом»). Такое может происходить, когда двумя последними С-концевыми аминокислотами тяжелой цепи являются глицин (G446) и лизин (K447, нумерация в соответствии с индексом EU по Кабату). Следовательно, С-концевой лизин (Lys447) или С-концевые глицин (Gly446) и лизин (К447) Fc-области могут присутствовать или нет. Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

В некоторых аспектах, если рекомбинантный белок представляет собой антитело, Fc-домен антитела может содержать одно или более изменений по сравнению с Fc-доменом дикого типа. Эти Fc-домены, тем не менее, будут сохранять, по существу, те же характеристики, необходимые для терапевтического применения, по сравнению с их аналогами дикого типа. Например, в Fc-области могут быть сделаны определенные изменения, которые могут привести к изменению (т.е. улучшению или уменьшению) связывания C1q и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в WO 99/51642. См. также Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США №5648260; патент США №5624821; и WO 94/29351 в отношении других примеров вариантов Fc-области. В WO 00/42072 (Presta) и WO 2004/056312 (Lowman) описаны варианты антител с повышенным или сниженным связыванием с FcR. Содержание патентных публикаций специально включено в данный документ посредством ссылки. См. также Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001). Антитела с повышенным временем полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным Fc -рецептором (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG в плод (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Время полужизни антитела может зависеть от структуры Fc-области антитела, что, в свою очередь, влияет на эффективность связывания указанной Fc-области с FcRn неонатального рецептора. Таким образом, время полужизни увеличивается за счет сохранения связывания Fc-области с FcRn. В частности, при рН приблизительно 6,0 это связывание приводит к эндосомальному перемещению антитела, связанного с FcRn, на пути лизосомной деградации, рециклируя его вместо этого на плазматическую мембрану, где IgG повторно высвобождается в кровоток при рН 7,4. Таким образом, этим путем достигается увеличенный период полужизни IgG в крови, что необходимо для длительного воздействия антитела на его мишень и повышения потенциальной терапевтической эффективности; см. Saxena, Abhishek; Bai, Bingxin; Hou, Shin-Chen; Jiang, Lianlian; Ying, Tianlei; et al. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1827: 399-417. (2018); Spearman, Maureen; Dionne, Ben; Butler, Michael. Cell Engineering, Vol 7: Antibody Expression and Production 7: 251-292. SPRINGER. (2011), которые специально включены в данный документ посредством ссылки. Эти антитела содержат Fc-домен с одной или более заменами, которые улучшают связывание Fc-области с FcRn. Варианты полипептидов с измененными аминокислотными последовательностями Fc-области и повышенной или пониженной способностью связывания C1q описаны в патенте США №6194551 и международной публикации WO 99/51642. См. также Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). Содержание таковых специально включено в данный документ посредством ссылки.

Другие сообщения о влиянии галактозилирования на молекулы IgG включают изменение физико-химических свойств, таких как конформация и доступность поверхности (Krapp et al., J. Mol. Biol. 325 (2003) 979-89; Mimura et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 697-706). Fortunato и Colina (J. Phys. Chem. 118 (2014) 9844-9851) использовали явное моделирование атомистической молекулярной динамики воды для изучения эффектов галактозилирования в Fc-домене иммуноглобулина G1. Они предположили, что гликозилирование можно использовать в качестве пути улучшения устойчивости моноклональных антител к агрегации для терапевтического лечения. В настоящем документе термин «лечение» (и его грамматические варианты, такие как «лечить» или «осуществление лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения заболевания у индивидуума, которого подвергают лечению, и может проводиться как для профилактики, так и при течении клинической патологии. Необходимые эффекты лечения включают, но не ограничиваются этим, предотвращение появления или повторного появления заболевания, смягчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению используют для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

Из имеющихся в настоящее время данных следует, что остатки галактозы в антителах влияют на определенные функции IgG и могут быть необходимы для эффективного мониторинга и контроля во время галактозирования этих молекул.

Как указывалось ранее, известно, что галактозилирование антител зависит от концентрации УДФ-галактозы, присутствующей в клетках, поскольку эти молекулы сахара действуют как субстраты, необходимые для галактозилирования. Увеличение содержания УДФ-галактозы связано с более высоким галактозилированием и сиалированием антитела, экспресс ируемого в клетках СНО. Различные уровни УДФ-галактозы в клетках, возможно, также могут иметь существенное влияние на другие типы гликозилирования в других терапевтических белках.

Модулирование концентрации УДФ-галактозы для О-связанного гликозилирования

В общем, в используемых в данном документе рекомбинантных белках сахара могут быть присоединены либо к амидному атому азота в боковой цепи аспарагина через N-связь, либо к атому кислорода в боковой цепи серина или треонина через О-связь. О-связанное гликозилирование происходит путем добавления N-ацетилгалактозамина к остаткам серина или треонина ферментом УДФ-N-ацетил-D-галактозамин:полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансферазой (ЕС2.4.1.41), за которым следуют другие углеводы, такие как УДФ-галактоза. Следовательно, внутриклеточная концентрация УДФ-галактозы может влиять на О-связанное гликозилирование. Следовательно, новый подход, описанный в данном изобретении, может быть полезен для модулирования внутриклеточного уровня УДФ-галактозы и для дополнительного контроля уровня галактозилирования в конечном белковом продукте.

Модулирование концентрации УДФ-галактозы для гликозилирования антитела Fab

Существование гликанов IgG Fab известно уже довольно давно. Гликаны Fab предположительно более доступны для гликозилтрансфераз, что приводит к большему процессингу по сравнению с Fc гликанами, которые пространственно локализованы на внутренней стороне доменов СН2. Соответственно, внутриклеточная концентрация УДФ-галактозы также может влиять на процесс галактозилирования Fab IgG. Следовательно, новый подход, описанный в данном изобретении, может использоваться для модулирования внутриклеточного уровня УДФ-галактозы и для дополнительного контроля уровня галактозилирования в конечном белковом продукте.

Как используется в контексте настоящего изобретения, уровень N-связанных галактозилированных гликанов рекомбинантного белка увеличивается. Таким образом, способ по настоящему изобретению увеличивает продуцирование N-связанных галактозилированных гликанов рекомбинантного белка. В одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения рекомбинантный белок содержит по меньшей мере моноглактозилированные, более предпочтительно дигалактозилированные гликаны, причем галактозилированные гликаны связаны с N-ацетилглюкозамином. Связи галактозы с их соответствующей мишенью в рекомбинантном белке и их влияние на функцию рекомбинантного белка дополнительно описаны в следующем примере.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный белок. Термины «композиция» и «фармацевтическая композиция» используются взаимозаменяемо и должны пониматься как определяющие фармацевтические композиции, отдельные компоненты или ингредиенты которых сами по себе являются фармацевтически приемлемыми, т.е. если предусматривается пероральное введение, приемлемо пероральное применение, а, если предусматривается местное введение, приемлемо местное применение, а также включает их комбинации, т.е. если предусматривается пероральное и местное введение, приемлемо пероральное и местное применения. Термин также относится к препарату, который находится в форме, обеспечивающей эффективность биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительные компоненты, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет введена фармацевтическая композиция. «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции или фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается этим, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.

Фармацевтическая композиция будет составлена и дозирована в соответствии с надлежащей медицинской практикой, принимая во внимание клиническое состояние отдельного пациента, место доставки фармацевтической композиции, способ введения, график введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Таким образом, «эффективное количество» фармацевтической композиции для целей данного изобретения определяется в соответствии с такими соображениями. Специалисту в данной области техники известно, что эффективное количество фармацевтической композиции, вводимой индивидууму, будет, среди прочего, зависеть от природы соединения. В этом контексте «эффективное количество» средства, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желательного терапевтического или профилактического результата.

Терапевтический белок, такой как антитело по изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, если это необходимо для местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение дозы можно проводить любым удобным путем, например, посредством инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или постоянным. В данном документе предусмотрены различные схемы введения доз, включая, но не ограничиваясь этим, однократное или многократное введение в различные моменты времени, болюсное введение и импульсную инфузию.

Антитела по изобретению составляют, дозируют и вводят способом, соответствующим надлежащей медицинской практике. Факторы, которые необходимо учитывать в этом контексте, включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место доставки агента, способ введения, график введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело необязательно составляют с одним или более агентами, применяемыми в настоящее время для предотвращения или лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в фармацевтической композиции, типа нарушения или лечения и других факторов, которые обсуждались выше. Другие агенты обычно применяют в таких же дозировках и вводят путями, описанными в данном документе, или в дозировках, составляющих от приблизительно 1 до 99% от дозировок, описанных в данном документе, или в любой дозировке и любым путем, которые эмпирически/клинически определены как подходящие.

Для предупреждения или лечения заболевания соответствующая доза антитела по изобретению (применяемого отдельно или в комбинации с одним или более другими дополнительными терапевтическими агентами) зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, того, вводится ли антитело с с целью предупреждения или терапевтической целью, предыдущей терапии, истории болезни пациента и его ответа на антитело, а также решения лечащего врача.

Используемый в данном документе термин «и/или» следует понимать как конкретное раскрытие каждого из двух указанных признаков или компонентов вместе или без другого. Например, «А и/или В» следует понимать как конкретное раскрытие каждого из (i) A, (ii) В и (iii) А и В, точно так же, как если бы каждый из них был изложен в настоящем документе отдельно.

Различные аспекты и признаки изобретения, описанные в данном документе, дополнительно описаны в качестве примера ниже. Хотя вышеизложенное изобретение было подробно описано посредством иллюстрации и примеров в целях ясности понимания, описания и примеры не следует воспринимать как ограничивающие объем данного изобретения.

Все патенты и ссылки, не относящиеся к патентам, цитируемые в настоящем документе, в полном объеме включены в настоящий документ посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

кДНК уридиндифосфата (УДФ) α-D-глюкозоэпимеразы (УДФ_Clc-Е, ЕС 5.1.3.2) и УДФ-α-D-глюкоза:α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансферазы клеточной линии СНО K1M были клонированы и секвенированы, соответственно. Было обнаружено, что эти два фермента играют решающую роль в пути превращения УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы в клетках СНО.

Пример 1. Амплификация кДНК уридиндифосфатглюкозоэпимеразы (УДФ-Glc-E) и анализ последовательности клеточной линии СНО K1M

Фермент уридиндифосфат (УДФ)-глюкозо-4-эпимераза (УДФ_Clc-Е, ЕС 5.1.3.2), также известный как УДФ-галактозо-4-эпимераза, представляет собой гомодимерную эпимеразу, обнаруженную в клетках бактерий, грибов, растений и млекопитающих. Этот фермент катализирует обратимое превращение УДФ-глюкозы в УДФ-галактозу.

Экстракцию общей клеточной РНК из клеточной линии СНО K1M (WO 2009047007) проводили с использованием набора для выделения РНК MagNA Pure LC RNA Isolation Kit - High Performance от Roche (№ продукта 03542394001), работающего на приборе Roche MagNA Pure LC 2.0 (№ продукта 05197686001, Roche Diagnostics). Концентрацию очищенной РНК измеряли с помощью NanoVue (GE Healthcare Bio-Science АВ) и хранили при 70°С.

Эту очищенную клеточную РНК использовали для синтеза кДНК УДФ Glc-E и целенаправленной амплификации. Синтез и амплификацию кДНК проводили с использованием набора Roche Transcriptor One-Step RT-PCR Kit (№ продукта 04655877001, Roche Diagnopstics GmbH) с двумя специфическими праймерами УДФ Glc-E, гомологично сконструированными в соответствии с базой данных NCBI GenBank.

В данном документе используется два праймера:

прямой праймер УДФ_ClcE-Е2-21 (SEQ ID NO.: 5):

5' ATGGCCGAGAAGGTGCTGGTC 3', и

обратный праймер УДФ_GlcE-R21 (SEQ ID NO.: 6):

5' TTAGGCCTGTGCTCCAAAGCC 3'.

Условия ОТ-ПЦР:

Обратная транскрипция: 50°С 30 мин.

Начальная денатурация: 94°С 7 мин.

Амплификация ПЦР:

Денатурация: 94°С 10 с

Отжиг: 56°С 30 с

Элонгация: 68°С 60 с (60 с/т.п.н.)

Цикл: 10

Денатурация: 94°С 10 с

Отжиг: 56°С 30 с

Элонгация: 68°С 1:30 + 5 с (+5 с/т.п.н.)

Цикл: 25

Финальная элонгация: 68°С 7 мин.

Амплифицированный продукт ПЦР сначала очищали с помощью набора Roche High Pure PCR Product Purification Kit (№ продукта 11732668001, Roche Diagnopstics GmbH), а затем подвергали прямому секвенированию. Последовательность кДНК УДФ_Clc-Е показана в ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ-1 (SEQ ID NO.: 1). Эта кДНК кодирует предсказанный белок из 348 аминокислот. Производное аминокислотной последовательности УДФ-глюкозо-4-эпимеразы в СНО K1M показано в ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ-2 (SEQ ID NO.: 2).

Белковая последовательность, кодируемая УДФ-Glc-E СНО K1M, на 94,5% идентична и на 96,6% подобна УДФ-глюкозо-4-эпимеразе человека и тесно связана с другими УДФ-глюкозо-4-эпимеразами крупного рогатого скота и мыши.

Пример 2. УДФ-α-D-глюкоза: α-β-галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза (УДФ-Gal-T) Амплификация кДНК и анализ последовательности в клеточной линии СНО K1M

УДФ-α-D-глюкоза:α-D-галактозо-1-фосфат уридилилтрансфераза (УДФ-Gal-T, ЕС2.7.7.12) катализирует нуклеотидный обмен между уридин-5'-дифосфат-глюкозой (УДФ-глюкоза) и галактозо-1-фосфатом (Gal-1-Р) с образованием уридин-5'-дифосфат-галактозы (УДФ-галактоза) и глюкозо-1-фосфата (Glc-1-Р) по обратимому механизму.

Экстракцию общей клеточной РНК из клеточной линии СНО K1M проводили с использованием набора для выделения РНК MagNA Pure LC - High Performance от Roche (№ продукта 03542394001), работающего на приборе Roche MagNA Pure LC 2.0 (№ продукта 05197686001, Roche Diagnostics). Концентрацию очищенной РНК измеряли с помощью NanoVue (GE Healthcare Bio-Science АВ) и хранили при -70°С.

Эту очищенную клеточную РНК использовали для синтеза кДНК УДФ-Gal-T и целенаправленной амплификации. Синтез и амплификацию кДНК проводили с использованием набора Roche Transcriptor One-Step RT-PCR Kit (№продукта 04655877001, Roche Diagnopstics GmbH) с двумя специфическими праймерами УДФ-Gal-T, гомологично сконструированными в соответствии с базой данных NCBI GenBank.

прямой праймер УДФ-Gal-Т-Е2-21 (SEQ ID NO.: 7):

5' ATGTCGCAAAACGGAGATGAT 3' и

обратный праймер УДФ-Gal-T-R18 (SEQ ID NO.: 8):

5' TCAAGCAACAGCTGCTGT 3'. Условия ОТ-ПЦР:

Обратная транскрипция: 50°С 30 мин.

Начальная денатурация: 94°С 7 мин.

Амплификация ПЦР:

Денатурация: 94°С 10 с

Отжиг: 56°С 30 с

Элонгация: 68°С 60 с (60 с/т.п.н.)

Цикл: 10

Денатурация: 94°С 10 с

Отжиг: 56°С 30 с

Элонгация: 68°С 1:30 + 5 с (+5 с/т.п.н.)

Цикл: 25

Финальная элонгация: 68°С 7 мин.

Амплифицированный продукт ПЦР сначала очищали с помощью набора Roche High Pure PCR Product Purification Kit (№ продукта 11732668001, Roche Diagnopstics GmbH), а затем подвергали прямому секвенированию. Последовательность кДНК УДФ-Gal-T показана в ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ-3 (SEQ ID NO.: 3). Эта кДНК кодирует предсказанный белок из 379 аминокислот. Производное аминокислотной последовательности УДФ-α-D-глюкоза:α-D-галактоза-1-фосфат уридилилтрансфераза в СНО K1M показано в ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ-4 (SEQ ID NO.: 4).

Белковая последовательность, кодируемая УДФ-Gal-T СНО K1M, на 89,4% идентична и на 94,7% подобна последовательности УДФ-α-D-глюкозы:α-D-галактозо-1-фосфат уридилилтрансферазы человека и тесно связана с другими УДФ-α-D-глюкоза:α-D-галактозо-1-фосфат уридилилтрансфераза мыши и крупного рогатого скота.

Пример 3. Модуляция фермента и пути с помощью L-цистеина в клеточной линии СНО L965 для получения рекомбинантного антитела к α-синуклеину человека

В этом примере СНО K1M, клеточную линию, полученную из клеток яичника китайского хомячка (СНО), использовали в качестве линии клеток-хозяев (WO 2009047007).

Клетки СНО K1M были сконструированы для экспрессии моноклонального антитела к α-синуклеину человека (описанного в патенте США 9670274 В2 и патенте США 9890209 В9), которое связывается с мономерным или олигомерным α-синуклеином человека, и обозначены в данном документе как клеточная линия СНО L965.

α-синуклеин человека может образовывать фибриллярные агрегаты, и эти агрегаты являются основным компонентом телец Леви и нейритов Леви. Недавняя научная работа предполагает, что префибриллярные олигомеры альфа-синуклеина могут играть ключевую роль в прогрессировании болезни Паркинсона (Luk et al., 2012).

Специфическое антитело L965 может специфически связываться с внеклеточным α-синуклеином и может быть использовано для предотвращения передачи агрегатов от клетки к клетке и прогрессирования болезни Паркинсона.

Для процесса культивирования клеток в качестве базовой среды для культивирования клеток L965 использовали изготовленную по индивидуальному заказу версию среды без сыворотки с определенным химическим составом. После оттаивания клетки пассировали в этой среде в присутствии 3 мкг/мл бластицидина (Blasticidin, InvivoGen S.A.S., Франция) и 10 мкг/мл пуромицина (Puromycin-Solution, InvivoGen S.A.S., Франция, № кат. ANT-PR) во встряхиваемых колбах по графику 3-4 дня. Условия пассажа: 36,5°С, 7% CO₂ и 160 об/мин для колб объемом 125 мл и 500 мл с использованием платформы Kuhner Shaker X (Adolf Kuhner AG, Бирсфельден, Базель, Швейцария).

Для процесса инокуляции и процесса продуцирования в качестве базовой среды для размножения клеток L965 использовалась другая заказная версия бессывороточной среды с определенным химическим составом.

Во время получения этой среды для продуцирования также дополнительно добавляли глюкозу, глутамин, аминокислоты, микроэлементы (раствор RTE1.2, Gibco, Великобритания; № по кат. 043-90585Н) и соли. В этом случае конечную концентрацию L-цистеина (Merck Chemicals GmbH, № по кат.: 1.02735.1000) в среде доводили до 6 мМ и 10 мМ, соответственно.

Предварительно культивированные клетки использовали для инокуляции на шаге N-2 приблизительно при 3,0×10⁵ клеток/мл и на шаге N-1 приблизительно при 5,0×10⁵ клеток/мл параллельно с полученными средами для продуцирования, содержащими 6 мМ или 10 мМ L-цистеина, соответственно, все без бластицидина и пуромицина. Биореакторы для продуцирования инокулировали приблизительно при 10,0×10⁵ клеток/мл в среде, содержащей 6 мМ или 10 мМ L-цистеина, соответственно. Клетки культивировали в биореакторах для продуцирования в условиях периодического культивирования с подпиткой с предварительно определенными рН, растворенным кислородом, температурой и стратегией питания питательными веществами. Обычно использовали биореакторы объемом 2 л с начальным объемом культуры 1,2 л, если не указано иное.

Температуру в биореакторах поддерживали на уровне 36,5°С, а скорость мешалки устанавливали равной приблизительно 223 об/мин. Подавалась газовая смесь, содержащая воздух, CO₂ и O₂. Концентрация растворенного диоксида углерода (dCO₂) измерялась в автономном режиме один раз в день. Концентрацию растворенного кислорода (РК) контролировали в режиме реального времени и доводили до 35% путем изменения парциального давления кислорода в газовой смеси. рН поддерживали при заданном значении рН 7,00 с мертвой зоной ±0,03 единиц рН путем добавления CO₂ или 1,0 М NaHCO₃, если не указано иное.

Питательная среда включала комбинацию внутренней среды с глюкозой, глутамином, аминокислотами и солями. Эту питательную среду получали в растворе и добавляли к культуре на 3-й, 6-й и 9-й день, каждый в количестве приблизительно 10 об. % от объема рабочей культуры.

Готовили дополнительный питательный раствор глюкозы и добавляли его к культуре в течение 4-14 дней для поддержания концентрации глюкозы на уровне приблизительно ≥4 г/л.

Образцы клеточной культуры для продуцирования отбирали ежедневно с помощью шприца для автономного анализа. Продолжительность получения обычно длилась приблизительно 14 дней. Концентрацию и жизнеспособность клеток измеряли способом исключения трипанового синего на приборе CEDEX (Roche Diagnostics GmbH, Германия). Автономные измерения проводились с помощью COBAS INTEGRA® 400 plus (Roche Diagnostics GmbH, Германия) для измерения концентрации глюкозы, глутамина, глутамата, лактата, аммония и продукта. Растворенный диоксид углерода анализировали на анализаторе Cobas b221 (Roche Diagnostics Ltd. СН-6343 Rotkreuz, Швейцария). Осмоляльность измеряли по понижению точки замерзания на автоосмометре Osmomat (Gonotec GmbH, Берлин, Германия).

В конце процесса продуцирования основной культуры культуральную жидкость для культивирования клеток собирали центрифугированием. Супернатанты далее подвергали мелкомасштабной очистке mAb белком-А. Характер гликозилирования очищенного mAb анализировали с помощью 2АВ.

На Фигурах 6А-6Д показано влияние различных концентраций L-цистеина на форму G0 антитела к α-синуклеину L965, форму G1 антитела к α-синуклеину L965, форму G2 антитела к α-синуклеину L965, титр продукта и рост клеток (IVCD).

На фигуре 6А показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G0 антитела к α-синуклеину L965 в процессе с 6 мМ L-цистеина в среде для продуцирования было приблизительно на 10,4% ниже, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 6Б показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G1 антитела к α-синуклеину L965 в процессе с 6 мМ L-цистеина в среде для продуцирования было приблизительно на 13% выше, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 6В показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G2 антитела к α-синуклеину L965 в процессе с 6 мМ L-цистеина в среде для продуцирования было приблизительно на 5% выше, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 6Г показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования титр продукта в процессе с 6 мМ L-цистеина в среде для продуцирования был приблизительно на 73% выше, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 6Д показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования рост клеток в процессе с 6 мМ L-цистеина в среде для продуцирования был выше, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

Пример 4. Модуляция фермента и пути с помощью L-цистеина в клеточной линии СНО Т104 для получения рекомбинантных биспецифических антител к CD20/CD3

В этом примере СНО K1M, клеточную линию, полученную из клеток яичника китайского хомячка (СНО), использовали в качестве линии клеток-хозяев (WO 2009047007). Клетки СНО K1M были сконструированы для экспрессии биспецифического моноклонального антитела к CD20-CD3, нацеленного на Т-клетки, bsAB к CD20/CD3 (описанного в ЕР3252078А1), и обозначены в данном документе как клеточная линия СНО Т104.

BsAB к CD20/K-CD3 представляет собой Т-клеточное биспецифическое (ТСВ) антитело, нацеленное на CD20, экспрессируемый на В-клетках, и CD3-эпсилон-цепь присутствующую на Т-клетках. Механизм действия bsAB к CD20/CD3 включает одновременное связывание с CD20+ В-клетками и CD3+ Т-клетками, что приводит к активации Т-клеток и опосредованному Т-клетками уничтожению В-клеток. В присутствии В-клеток CD20+, циркулирующих или находящихся в тканях, фармакологически активные дозы вызывают активацию Т-клеток и связанное с этим высвобождение цитокинов. BsAB к CD20/CD3 можно использовать для лечения заболевания, в частности, пролиферативного нарушения В-клеток, и для уменьшения неблагоприятных эффектов в ответ на введение терапевтического агента, активирующего Т-клетки. Например, пациентов с хроническим лимфолейкозом можно лечить биспецифическим антителом к CD20/CD3.

Для процесса культивирования клеток в качестве базовой среды для культивирования клеток Т104 использовали изготовленную по индивидуальному заказу версию среды без сыворотки с определенным химическим составом. После оттаивания клетки пассировали в этой среде в присутствии 250 нМ метотрексата (МТХ; Pfizer, кат. №13999031) во встряхиваемых колбах в течение 3-4 дней. Условия пассажа: 36,5°С, 7% CO₂ и 160 об/мин для колб объемом 125 мл и 500 мл с использованием платформы Kuhner Shaker X (Adolf Kuhner AG, Бирсфельден, Базель, Швейцария).

Для процесса инокуляции и процесса продуцирования в качестве базовой среды для размножения клеток Т104 использовалась другая заказная версия бессывороточной среды с определенным химическим составом. Во время получения этой среды для продуцирования также дополнительно добавляли глюкозу, глутамин, аминокислоты, микроэлементы (раствор RTE1.0, SAFC, № по кат. CR40054-1000M SLBR5143V) и соли. В этом случае конечную концентрацию L-цистеина (Merck Chemicals GmbH, № по кат.: 1.02735.1000) в среде доводили до 5 мМ и 10 мМ, соответственно.

Предварительно культивированные клетки использовали для инокуляции на шаге N-2 приблизительно при 3,0×10⁵ клеток/мл и на шаге N-1 приблизительно при 5,0×10⁵ клеток/мл параллельно с полученными средами для продуцирования, содержащими 5 мМ или 10 мМ L-цистеина, соответственно, все без МТХ. Биореакторы для продуцирования инокулировали приблизительно при 10,0×10⁵ клеток/мл в среде, содержащей 5 мМ или 10 мМ L-цистеина, соответственно. Клетки культивировали в биореакторах для продуцирования в условиях периодического культивирования с подпиткой с предварительно определенными рН, растворенным кислородом, температурой и стратегией питания питательными веществами. Обычно использовали биореакторы объемом 2 л с начальным объемом культуры 1,2 л, если не указано иное. Использовали биореакторы Ambr-250 с начальным объемом культуры 200 мл.

Температуру в биореакторах поддерживали на уровне 36,5°С, а скорость мешалки устанавливали равной приблизительно 223 об/мин. Подавалась газовая смесь, содержащая воздух, СО₂ и O₂. Концентрация растворенного диоксида углерода (dCO₂) измерялась в автономном режиме один раз в день. Концентрацию растворенного кислорода (РК) контролировали в режиме реального времени и доводили до 35% путем изменения парциального давления кислорода в газовой смеси. рН поддерживали при заданном значении рН 7,00 с мертвой зоной ±0,03 единиц рН путем добавления CO₂ или 1,0 М NaHCO₃, если не указано иное.

Готовили дополнительный питательный раствор глюкозы и добавляли его к культуре в течение 4-14 дней для поддержания концентрации глюкозы на уровне приблизительно ≥ 3 г/л.

На фигурах 7А-7Г показано влияние различных концентраций L-цистеина на форму G0 bsAB к CD20/CD3, форму G1 bsAB к CD20/CD3, рост клеток (IVCD) и титр продукта.

На фигуре 7А показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G0 bsAB к CD20/CD3 в процессе с 5 мМ L-цистеина в среде для продуцирования было приблизительно на 5,5% ниже, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 7Б показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G1 bsAB к CD20/CD3 в процессе с 5 мМ L цистеина в среде для продуцирования было приблизительно на 3,4% выше, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 7В показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования титр продукта в процессе с 5 мМ L-цистеина в среде для продуцирования был приблизительно на 66% выше, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 7Г показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования рост клеток в процессе с 5 мМ L-цистеина в среде для продуцирования был выше, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

Пример 5. Модуляция фермента и пути с помощью L-цистеина в клеточной линии СНО Т104, продуцирующей рекомбинантное биспецифическое антитело к CD20/CD3, для улучшения процесса продуцирования

В этом примере СНО K1M, клеточную линию, полученную из клеток яичника китайского хомячка (СНО), использовали в качестве линии клеток-хозяев (WO 2009047007). Клетки СНО K1M были сконструированы для экспрессии биспецифического моноклонального антитела к CD20/CD3, нацеленного на Т-клетки, bsAB к CD20/CD3 (описанного в ЕР 3252078 А1), и обозначены в данном документе как клеточная линия Т104.

BsAB к CD20/K-CD3 представляет собой Т-клеточное биспецифическое (ТСВ) антитело, нацеленное на CD20, экспрессируемый на В-клетках, и CD3-эпсилон-цепь (CD3I I), присутствующую на Т-клетках. Механизм действия bsAB к CD20/CD3 включает одновременное связывание с CD20+ В-клетками и CD3+ Т-клетками, что приводит к активации Т-клеток и опосредованному Т-клетками уничтожению В-клеток. В присутствии В-клеток CD20+, циркулирующих или находящихся в тканях, фармакологически активные дозы вызывают активацию Т-клеток и связанное с этим высвобождение цитокинов. BsAB к CD20/CD3 можно использовать для лечения заболевания, в частности, пролиферативного нарушения В-клеток, и для уменьшения неблагоприятных эффектов в ответ на введение терапевтического агента, активирующего Т-клетки.

Для процесса культивирования клеток в качестве базовой среды для культивирования клеток Т104 использовали изготовленную по индивидуальному заказу версию среды без сыворотки с определенным химическим составом. После оттаивания клетки пассировали в этой среде в присутствии 250 нМ метотрексата (МТХ; Pfizer, кат. №13999031) во встряхиваемых колбах в течение 3-4 дней. Условия пассажа: 36,5°С, 7% СО₂ и 160 об/мин для колб объемом 125 мл и 500 мл с использованием платформы Kuhner Shaker X (Adolf Kuhner AG, Бирсфельден, Базель, Швейцария).

Для процесса инокуляции и процесса продуцирования в качестве базовой среды для размножения клеток Т104 использовалась другая заказная версия бессывороточной среды с определенным химическим составом. Во время получения этой среды для продуцирования также дополнительно добавляли глюкозу, глютамин, аминокислоты, микроэлементы (разбавленный раствор RTE1.2, Gibco, Великобритания; № по кат. 043-90585Н) и соли. В этом случае конечную концентрацию L-цистеина (Merck Chemicals GmbH, № по кат.: 1.02735.1000) в среде доводили до 5 мМ и 10 мМ, соответственно.

Предварительно культивированные клетки использовали для инокуляции на шаге N-2 приблизительно при 3,0×10⁵ клеток/мл и на шаге N-1 приблизительно при 5,0×10⁵ клеток/мл параллельно с полученными средами для продуцирования, содержащими 5 мМ или 10 мМ L-цистеина, соответственно, все без МТХ. Биореакторы для продуцирования инокулировали приблизительно при 10,0×10⁵ клеток/мл в среде, содержащей 5 мМ или 10 мМ L-цистеина, соответственно. Клетки культивировали в биореакторах для продуцирования в условиях периодического культивирования с подпиткой с предварительно определенными рН, растворенным кислородом, температурой и стратегией питания питательными веществами. Использовали 2-литровые биореакторы с начальным объемом культуры 1,2 л, если не указано иное. Если не указано иное, использовали биореакторы Ambr-250 с начальным объемом культуры 200 мл.

Температуру в биореакторах поддерживали на уровне 36,5°С, а скорость мешалки устанавливали равной приблизительно 223 об/мин Подавалась газовая смесь, содержащая воздух, СО₂ и О₂. Концентрация растворенного диоксида углерода (dCO₂) измерялась в автономном режиме один раз в день. Концентрацию растворенного кислорода (РК) контролировали в режиме реального времени и доводили до 35% путем изменения парциального давления кислорода в газовой смеси. рН поддерживали при заданном значении рН 7,00 с мертвой зоной ±0,03 единиц рН путем добавления СО₂ или 1,0 М NaHCO₃, если не указано иное.

Питательная среда включала комбинацию порошка RF1.0 (SAFC, № по кат. CR60112), глюкозы, глутамина, аминокислот и солей. Эту питательную среду получали в растворе и добавляли к культуре на 3-й, 6-й и 9-й день, каждый в количестве приблизительно 10 об. % от объема рабочей культуры.

На фигурах 8А-8Г показано влияние различных концентраций L-цистеина на форму G0 bsAB к CD20/CD3, форму G1 bsAB к CD20/CD3, рост клеток (IVCD) и титр продукта.

На фигуре 8А показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G0 bsAB к CD20/CD3 в процессе с 5 мМ L-цистеина в среде для продуцирования было приблизительно на 3,8% ниже, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 8Б показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G1 bsAB к CD20/CD3 в процессе с 5 мМ L-цистеина в среде для продуцирования было приблизительно на 2,5% выше, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 8В показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования титр продукта в процессе с 5 мМ L-цистеина в среде для продуцирования был приблизительно на 67% выше, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 8Г показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования рост клеток в процессе с 5 мМ L-цистеина в среде для продуцирования был выше, чем в процессе с 10 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

Пример 6. Модуляция пути с помощью L-цистина в клеточной линии СНО L967 для получения рекомбинантного антитела к α-синуклеину человека

В этом примере СНО K1M, клеточную линию, полученную из клеток яичника китайского хомячка (СНО), использовали в качестве линии клеток-хозяев (WO 2009047007). Клетки СНО K1M были сконструированы для экспрессии моноклонального антитела к α-синуклеину человека (описанного в патенте США 9670274 В2 и патенте США 9890209 В9), которое связывается с мономерным или олигомерным α-синуклеином человека, и обозначены в данном документе как клеточная линия L967.

α-Синуклеин человека может образовывать фибриллярные агрегаты, и эти агрегаты являются основным компонентом телец Леви и нейритов Леви. Недавняя научная работа предполагает, что префибриллярные олигомеры альфа-синуклеина могут играть ключевую роль в прогрессировании болезни Паркинсона (Luk et al., 2012). Специфическое антитело L967 может специфически связываться с внеклеточным α-синуклеином и может быть использовано для предотвращения передачи агрегатов от клетки к клетке и прогрессирования болезни Паркинсона.

Для процесса культивирования клеток в качестве базовой среды для культивирования клеток L967 использовали изготовленную по индивидуальному заказу версию среды без сыворотки с определенным химическим составом. После оттаивания клетки пассировали в этой среде в присутствии 5 мкг/мл пуромицина (Puromycin-Solution, InvivoGen S.A.S., Франция, кат. № ANT-PR) во встряхиваемых колбах по 3-4-дневному графику. Условия пассажа: 36,5°С, 7% CO₂ и 160 об/мин для колб объемом 125 мл и 500 мл с использованием платформы Kuhner Shaker X (Adolf Kuhner AG, Бирсфельден, Базель, Швейцария).

Для процесса инокуляции и процесса продуцирования в качестве базовой среды для размножения клеток L967 использовалась другая заказная версия бессывороточной среды с определенным химическим составом. Во время получения этой среды для продуцирования также дополнительно добавляли глюкозу, глютамин, аминокислоты, микроэлементы (разбавленный раствор RTE1.2, Gibco, Великобритания; №по кат.043-90585Н) и соли. Перед использованием конечную концентрацию L-цистина (моногидрат динатриевой соли L-цистина; SAFC, №поставщика RES1523C-A154X) в среде доводили до 2 мМ и 4 мМ соответственно.

Предварительно культивированные клетки использовали для инокуляции на шаге N-2 приблизительно при 3,0×10⁵ клеток/мл и на шаге N-1 приблизительно при 5,0×10⁵ клеток/мл параллельно с полученными средами для продуцирования, содержащими 2 мМ или 4 мМ L-цистина, соответственно. Биореакторы для продуцирования инокулировали приблизительно при 10,0×10⁵ клеток/мл в среде, содержащей 2 мМ или 4 мМ L-цистина, соответственно. Клетки культивировали в биореакторах для продуцирования в условиях периодического культивирования с подпиткой с предварительно определенными рН, растворенным кислородом, температурой и стратегией питания питательными веществами. Обычно использовали биореакторы объемом 2 л с начальным объемом культуры 1,2 л, если не указано иное. Использовали биореакторы Ambr-250 с начальным объемом культуры 200 мл.

Температуру в биореакторах поддерживали на уровне 36,5°С, а скорость мешалки устанавливали равной приблизительно 223 об/мин. Подавалась газовая смесь, содержащая воздух, СО₂ и О₂. Концентрация растворенного диоксида углерода (dCO₂) измерялась в автономном режиме один раз в день. Концентрацию растворенного кислорода (РК) контролировали в режиме реального времени и доводили до 35% путем изменения парциального давления кислорода в газовой смеси. рН поддерживали при заданном значении рН 7,00 с мертвой зоной ±0,03 единиц рН путем добавления СО₂ или 1,0 М NaHCO₃, если не указано иное.

Питательная среда включала комбинацию порошка RF1.0 (SAFC, №по кат.CR60112), глюкозы, глутамина, аминокислот и солей. Эту питательную среду получали в растворе и добавляли к культуре на 3-й, 6-й и 9-й день, каждый в количестве приблизительно 10 об. % от объема рабочей культуры.

Готовили дополнительный питательный раствор глюкозы и добавляли его к культуре в течение 4-14 дней для поддержания концентрации глюкозы на уровне приблизительно ≥ 4 г/л.

На фигурах 9А-9Д показано влияние различных концентраций L-цистина на форму G0 антитела к α-синуклеину L967, форму G1 антитела к α-синуклеину L967, форму G2 антитела к α-синуклеину L967, титр продукта и рост клеток (IVCD).

На фигуре 9А показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G0 антитела к α-синуклеину L967 в процессе с 2 мМ L-цистина в среде для продуцирования было приблизительно на 6,6% выше, чем в процессе с 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

На фигуре 9Б показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G1 антитела к α-синуклеину L967 в процессе с 2 мМ L-цистина в среде для продуцирования было приблизительно на 5,9% ниже, чем в процессе с 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

На фигуре 9 В показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G2 антитела к α-синуклеину L967 в процессе с 2 мМ L-цистина в среде для продуцирования было приблизительно на 1,6% ниже, чем в процессе с 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

На фигуре 9Г показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования титр продукта в процессе с 2 мМ L-цистина в среде для продуцирования был приблизительно на 9% ниже, чем в процессе с 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

На фигуре 9Д показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования рост клеток в процессе с 2 мМ L-цистина в среде для продуцирования был приблизительно на 3,7% ниже, чем в процессе с 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

Пример 7. Модуляция пути с помощью L-цистина в клеточной линии СНО L971 для получения рекомбинантного антитела к α-синуклеину человека

В этом примере СНО K1M, клеточную линию, полученную из клеток яичника китайского хомячка (СНО), использовали в качестве линии клеток-хозяев (WO 2009047007). Клетки СНО K1M были сконструированы для экспрессии моноклонального антитела к α-синуклеину человека (описанного в патенте США 9670274 В2 и патенте США 9890209 В9), которое связывается с мономерным или олигомерным α-синуклеином человека, и обозначены в данном документе как клеточная линия СНО L971.

α-синуклеин человека может образовывать фибриллярные агрегаты, и эти агрегаты являются основным компонентом телец Леви и нейритов Леви. Недавняя научная работа предполагает, что префибриллярные олигомеры альфа-синуклеина могут играть ключевую роль в прогрессировании болезни Паркинсона (Luk et al., 2012). Специфическое антитело L971 может специфически связываться с внеклеточным α-синуклеином и может быть использовано для предотвращения передачи агрегатов от клетки к клетке и прогрессирования болезни Паркинсона.

Для процесса культивирования клеток в качестве базовой среды для культивирования клеток L971 использовали изготовленную по индивидуальному заказу версию химической среды без сыворотки. После оттаивания клетки пассировали в этой среде в присутствии 5 мкг/мл пуромицина (Puromycin-Solution, InvivoGen S.A.S., Франция, кат. № ANT-PR) во встряхиваемых колбах по 3-4-дневному графику. Условия пассажа: 36,5°С, 7% CO₂ и 160 об/мин для колб объемом 125 мл и 500 мл с использованием платформы Kuhner Shaker X (Adolf Kuhner AG, Бирсфельден, Базель, Швейцария).

Для процесса инокуляции и процесса продуцирования в качестве базовой среды для размножения клеток L971 использовалась другая заказная версия бессывороточной среды с определенным химическим составом. Во время получения этой среды для продуцирования также дополнительно добавляли глюкозу, глютамин, аминокислоты, микроэлементы (разбавленный раствор RTE1.2, Gibco, Великобритания; № по кат. 043-90585Н) и соли. Перед использованием конечную концентрацию L-цистина (моногидрат динатриевой соли L-цистина; SAFC, № поставщика RES1523C-A154X) в среде доводили до 2 мМ и 4 мМ соответственно.

На фигурах 10А - 10Д показано влияние различных концентраций L-цистина на форму G0 антитела к α-синуклеину L971, форму G1 антитела к α-синуклеину L971, форму G2 антитела к α-синуклеину L971, титр продукта и рост клеток (IVCD).

На фигуре 10А показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G0 антитела к α-синуклеину L971 в процессе с 2 мМ L-цистина в среде для продуцирования было приблизительно на 3% выше, чем в процессе с 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

На фигуре 10Б показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G1 антитела к α-синуклеину L971 в процессе с 2 мМ L-цистина в среде для продуцирования было приблизительно на 2% ниже, чем в процессе с 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

На фигуре 10В показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G2 антитела к α-синуклеину L971 в процессе с 2 мМ L-цистина в среде для продуцирования было сравнимым с таковым в процессе с 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

На фигуре 10Г показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования титр продукта в процессе с 2 мМ L-цистина в среде для продуцирования был приблизительно на 30% ниже, чем в процессе с 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

На фигуре 10Д показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования рост клеток в процессе с 2 мМ L-цистеина в среде для продуцирования был незначительно сравним с процессом с 4 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

Пример 8. Функциональное сравнение рекомбинантного антитела к α-синуклеину человека L971. полученного посредством процессов с использованием L-цистеина или L-цистина

Для процесса культивирования клеток в качестве базовой среды для культивирования клеток L965 использовали изготовленную по индивидуальному заказу версию химической среды без сыворотки. После оттаивания клетки пассировали в этой среде в присутствии 5 мкг/мл пуромицина (Puromycin-Solution, InvivoGen S.A.S., Франция, кат. № ANT-PR) во встряхиваемых колбах по 3-4-дневному графику. Условия пассажа: 36,5°С, 7% CO₂ и 160 об/мин для колб объемом 125 мл и 500 мл с использованием платформы Kuhner Shaker X (Adolf Kuhner AG, Бирсфельден, Базель, Швейцария).

Для процесса инокуляции и процесса продуцирования в качестве базовой среды для размножения клеток L971 использовалась другая заказная версия бессывороточной среды с определенным химическим составом.

Во время получения этой среды для продуцирования также дополнительно добавляли глюкозу, глютамин, аминокислоты, микроэлементы (разбавленный раствор RTE1.2, Gibco, Великобритания; № по кат. 043-90585Н) и соли. Перед использованием конечную концентрацию L-цистина (моногидрат динатриевой соли L-цистина; SAFC, № по кат. RES1523C-A154X) в среде доводили до 3 мМ в одной части среды. Для прямого сравнения конечную концентрацию L-цистеина (Merck Chemicals GmbH, №по кат.: 1.02735.1000) в среде доводили до 6 мМ в другой части среды.

Предварительно культивированные клетки использовали для инокуляции на шаге N-2 приблизительно при 3,0×10⁵ клеток/мл и на шаге N-1 приблизительно при 5,0×10⁵ клеток/мл параллельно с полученными средами для продуцирования, содержащими заранее определенное количество L-цистина или L-цистеина, соответственно. Биореакторы для продуцирования инокулировали приблизительно при 10,0×10⁵ клеток/мл в среде, содержащей заранее определенное количество L-цистина (3 мМ) или L-цистеина (6 мМ), соответственно. Клетки культивировали в биореакторах для продуцирования в условиях периодического культивирования с подпиткой с предварительно определенными рН, растворенным кислородом, температурой и стратегией питания питательными веществами. Обычно использовали биореакторы объемом 2 л с начальным объемом культуры 1,2 л, если не указано иное. Использовали биореакторы Ambr-250 с начальным объемом культуры 200 мл.

Температуру в биореакторах поддерживали на уровне 36,5°С, а скорость мешалки устанавливали равной приблизительно 223 об/мин. Подавалась газовая смесь, содержащая воздух, СО₂ и О₂. Концентрация растворенного диоксида углерода (cdO₂) измерялась в автономном режиме один раз в день. Концентрацию растворенного кислорода (РК) контролировали в режиме реального времени и доводили до 35% путем изменения парциального давления кислорода в газовой смеси. рН поддерживали при заданном значении рН 7,00 с мертвой зоной ±0,03 единиц рН путем добавления СО₂ или 1,0 М NaHCO₃, если не указано иное.

Неонатальный рецептор Fe (FcRn) влияет на фармакокинетический (ФК) профиль антител IgG-типа за счет своей способности извлекать антитела из ранней эндосомы и возвращать их обратно в кровоток. Взаимодействие с FcRn считается наиболее важным фактором в определении фармакокинетики терапевтических антител типа IgG и считается заменителем клиренса (см. обзор Nimmerjahn and Ravetch 2008).

Fcγ-рецепторы являются медиаторами эффекторных функций на иммунных эффекторных клетках. Среди различных Fcγ-рецепторов человека Fcγ-RIIa считается доминирующим фактором в опосредовании антителозависимого фагоцитоза (ADCP). Из двух наиболее распространенных аллотипов Fcγ-RIIa форма с гистидином в положении аминокислоты 131 (Н131) часто описывается как аллотип с более высокой аффинностью. (Nimmerjahn and Ravetch 2008, Yamada et al. 2013)

В данном документе было определено относительное связывание небольших образцов очищенных aSyn-L971-mAb с FcRn и Fcγlla (His 131) с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Относительное связывание небольших образцов очищенного aSyn-L971-mAb с мишенью определяли с помощью ИФА.

На фигурах 11А-НЕ показано прямое сравнение антитела aSyn-L971, полученного в процессе культивирования клеток, с 3 мМ L-цистина или 6 мМ L-цистеина в среде для культивирования клеток, соответственно.

На фигуре 11А показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G1 антитела к α-синуклеину L971 в процессе с 6 мМ L-цистина в среде для продуцирования было лишь незначительно выше, чем в процессе с 3 мМ L-цистеина в среде для продуцирования.

На фигуре 11Б показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования количество формы G2 антитела к α-синуклеину L971 в процессе с 6 мМ L-цистеина в среде для продуцирования было сравнимо с таковым в процессе с 3 мМ L-цистина в среде для продуцирования.

На фигуре 11В показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования для антитела L971 к α-синуклеину наблюдался приблизительно на 33% более высокий относительный уровень связывания FcRn в процессе с 6 мМ L-цистеина в среде для продуцирования (относительный уровень приблизительно 118%), по сравнению с антителом L971 к α-синуклеину в процессе с 3 мМ L-цистина в среде для продуцирования (относительный уровень приблизительно 85%).

На фигуре 11Г показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования для антитела L971 к α-синуклеину наблюдался приблизительно на 36% более высокий относительный уровень связывания Fcγ-RIIa (Н131) в процессе с 6 мМ L-цистеина в среде для продуцирования (относительный уровень приблизительно 113%), по сравнению с антителом L971 к α-синуклеину в процессе с 3 мМ L-цистина в среде для продуцирования (относительный уровень приблизительно 77%).

На фигуре 11Д показано, что в конце 14-дневного процесса продуцирования для антитела L971 к α-синуклеину наблюдался приблизительно на 35% более высокий относительный уровень связывания с мишенью в процессе с 6 мМ L-цистеина в среде для продуцирования (относительный уровень приблизительно 118%), по сравнению с антителом L971 к α-синуклеину в процессе с 3 мМ L-цистина в среде для продуцирования (относительный уровень приблизительно 83%).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

Hoffmann-La Roche Inc.

<120> МОДУЛЯЦИЯ ФЕРМЕНТА И ПУТИ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ И ИХ

ПРОИЗВОДНЫМИ

<130> AC1883 PCT S3

<150> EP20 17 1356.7

<151> 2020-04-24

<160> 47

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1047

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность кДНК УДФ-глюкоза-4-эпимеразы в CHO K1M

<220>

<221> CDS

<222> 1..1047

<223> /трансл_таблица=1

<400> 1

atg gcc gag aag gtg ctg gtc aca ggc gga gct ggc tac att ggc agc 48

Met Ala Glu Lys Val Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser

1 5 10 15

cac acg gta ctg gag ctg ctg gag gca ggc tac gcc cct gtg gtc atc 96

His Thr Val Leu Glu Leu Leu Glu Ala Gly Tyr Ala Pro Val Val Ile

20 25 30

gac aac ttc cat aat gcc att cgt gga ggg gat tcc atg cct gag agc 144

Asp Asn Phe His Asn Ala Ile Arg Gly Gly Asp Ser Met Pro Glu Ser

35 40 45

ctg cgg cgg gtc cag gaa ctg aca ggc cgc tct gtg gag ttt gag gag 192

Leu Arg Arg Val Gln Glu Leu Thr Gly Arg Ser Val Glu Phe Glu Glu

50 55 60

atg gac atc ttg gac cag gca gcg cta cag cac ctc ttt aag aag cac 240

Met Asp Ile Leu Asp Gln Ala Ala Leu Gln His Leu Phe Lys Lys His

65 70 75 80

agc ttt aag gct gtc atc cac ttt gct ggg ctc aag gct gtg ggc gag 288

Ser Phe Lys Ala Val Ile His Phe Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu

85 90 95

tcg gtg cag aag cct ctg gat tat tat aga gtt aac cta aca ggg acc 336

Ser Val Gln Lys Pro Leu Asp Tyr Tyr Arg Val Asn Leu Thr Gly Thr

100 105 110

atc cag ctt ctg gag atc atg agg gcc cac ggg gtg aag aat ctc gtg 384

Ile Gln Leu Leu Glu Ile Met Arg Ala His Gly Val Lys Asn Leu Val

115 120 125

ttc agc agc tca gcc acc gtg tat ggg aat ccc cag tac ctg cct ctg 432

Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr Gly Asn Pro Gln Tyr Leu Pro Leu

130 135 140

gat gag gcc cac ccc acc ggg ggt tgt acc aac ccc tat gga aag tcc 480

Asp Glu Ala His Pro Thr Gly Gly Cys Thr Asn Pro Tyr Gly Lys Ser

145 150 155 160

aag ttc ttc atc gag gag atg gtc cgg gac ctg tgc cgg gca gat tcg 528

Lys Phe Phe Ile Glu Glu Met Val Arg Asp Leu Cys Arg Ala Asp Ser

165 170 175

gcc tgg aac gca gtg ctg cta cgc tac ttc aat ccc acg ggt gcc cac 576

Ala Trp Asn Ala Val Leu Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Thr Gly Ala His

180 185 190

gcc tct ggc cgc atc ggc gag gat ccc cag ggc gtc ccc aac aac ctc 624

Ala Ser Gly Arg Ile Gly Glu Asp Pro Gln Gly Val Pro Asn Asn Leu

195 200 205

atg ccc tat gtc tcc cag gtg gca att ggg cga cga gag gcc ctg aat 672

Met Pro Tyr Val Ser Gln Val Ala Ile Gly Arg Arg Glu Ala Leu Asn

210 215 220

gtc ttt ggt ggt gac tat gat aca gag gat ggc aca ggt gta agg gat 720

Val Phe Gly Gly Asp Tyr Asp Thr Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp

225 230 235 240

tac att cat gtg gtg gat ctg gcg aag ggc cac atc gca gcc ttg aag 768

Tyr Ile His Val Val Asp Leu Ala Lys Gly His Ile Ala Ala Leu Lys

245 250 255

aag ctg aag gag caa tgt ggt tgc cgg atc tac aac ctg ggc aca ggc 816

Lys Leu Lys Glu Gln Cys Gly Cys Arg Ile Tyr Asn Leu Gly Thr Gly

260 265 270

aca ggc tac tct gtc ctg cag atg gtc caa gca atg gag aag gct tca 864

Thr Gly Tyr Ser Val Leu Gln Met Val Gln Ala Met Glu Lys Ala Ser

275 280 285

ggg aag aag atc cca tac aag gtg gtg gca cgg cgg gaa ggt gac gtg 912

Gly Lys Lys Ile Pro Tyr Lys Val Val Ala Arg Arg Glu Gly Asp Val

290 295 300

gca gcc tgt tat gcc aac ccc agc ctg gcc cat gag gag ctg ggc tgg 960

Ala Ala Cys Tyr Ala Asn Pro Ser Leu Ala His Glu Glu Leu Gly Trp

305 310 315 320

aca gca gcc ttg ggg ctg gac agg atg tgt gaa gat cta tgg cgc tgg 1008

Thr Ala Ala Leu Gly Leu Asp Arg Met Cys Glu Asp Leu Trp Arg Trp

325 330 335

cag aag cag aac cct tca ggc ttt gga gca cag gcc taa 1047

Gln Lys Gln Asn Pro Ser Gly Phe Gly Ala Gln Ala

340 345

<210> 2

<211> 348

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> [CDS]:1..1047 от SEQ ID NO 1

<400> 2

Met Ala Glu Lys Val Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ser

1 5 10 15

His Thr Val Leu Glu Leu Leu Glu Ala Gly Tyr Ala Pro Val Val Ile

20 25 30

Asp Asn Phe His Asn Ala Ile Arg Gly Gly Asp Ser Met Pro Glu Ser

35 40 45

Leu Arg Arg Val Gln Glu Leu Thr Gly Arg Ser Val Glu Phe Glu Glu

50 55 60

Met Asp Ile Leu Asp Gln Ala Ala Leu Gln His Leu Phe Lys Lys His

65 70 75 80

Ser Phe Lys Ala Val Ile His Phe Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu

85 90 95

Ser Val Gln Lys Pro Leu Asp Tyr Tyr Arg Val Asn Leu Thr Gly Thr

100 105 110

Ile Gln Leu Leu Glu Ile Met Arg Ala His Gly Val Lys Asn Leu Val

115 120 125

Phe Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr Gly Asn Pro Gln Tyr Leu Pro Leu

130 135 140

Asp Glu Ala His Pro Thr Gly Gly Cys Thr Asn Pro Tyr Gly Lys Ser

145 150 155 160

Lys Phe Phe Ile Glu Glu Met Val Arg Asp Leu Cys Arg Ala Asp Ser

165 170 175

Ala Trp Asn Ala Val Leu Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Thr Gly Ala His

180 185 190

Ala Ser Gly Arg Ile Gly Glu Asp Pro Gln Gly Val Pro Asn Asn Leu

195 200 205

Met Pro Tyr Val Ser Gln Val Ala Ile Gly Arg Arg Glu Ala Leu Asn

210 215 220

Val Phe Gly Gly Asp Tyr Asp Thr Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp

225 230 235 240

Tyr Ile His Val Val Asp Leu Ala Lys Gly His Ile Ala Ala Leu Lys

245 250 255

Lys Leu Lys Glu Gln Cys Gly Cys Arg Ile Tyr Asn Leu Gly Thr Gly

260 265 270

Thr Gly Tyr Ser Val Leu Gln Met Val Gln Ala Met Glu Lys Ala Ser

275 280 285

Gly Lys Lys Ile Pro Tyr Lys Val Val Ala Arg Arg Glu Gly Asp Val

290 295 300

Ala Ala Cys Tyr Ala Asn Pro Ser Leu Ala His Glu Glu Leu Gly Trp

305 310 315 320

Thr Ala Ala Leu Gly Leu Asp Arg Met Cys Glu Asp Leu Trp Arg Trp

325 330 335

Gln Lys Gln Asn Pro Ser Gly Phe Gly Ala Gln Ala

340 345

<210> 3

<211> 1140

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность кДНК УДФ-α-D-глюкозы: α-D-галактоза-1-фосфата

уридилилтрансферазы в CHO K1M

<220>

<221> CDS

<222> 1..1140

<223> /трансл_таблица=1

<400> 3

atg tcg caa aac gga gat gat cct gag cag cgc cag cag gcg tca gag 48

Met Ser Gln Asn Gly Asp Asp Pro Glu Gln Arg Gln Gln Ala Ser Glu

1 5 10 15

gcg gac gcc atg gca gcg acc ttc cgg gcg agc gaa cac cag cat att 96

Ala Asp Ala Met Ala Ala Thr Phe Arg Ala Ser Glu His Gln His Ile

20 25 30

cgc tac aat ccg ctc cag gat gag tgg gtg tta gtg tcg gcc cat cgc 144

Arg Tyr Asn Pro Leu Gln Asp Glu Trp Val Leu Val Ser Ala His Arg

35 40 45

atg aag cgg ccc tgg caa gga caa gtg gag ccc cag ctt ctg aag aca 192

Met Lys Arg Pro Trp Gln Gly Gln Val Glu Pro Gln Leu Leu Lys Thr

50 55 60

gtg ccc cgc tat gac cca ctc aac cct ctg tgt ccc ggg gcc aca cga 240

Val Pro Arg Tyr Asp Pro Leu Asn Pro Leu Cys Pro Gly Ala Thr Arg

65 70 75 80

gcc aat ggg gag gtg aat cca cac tat gac agc acc ttc ctg ttt gac 288

Ala Asn Gly Glu Val Asn Pro His Tyr Asp Ser Thr Phe Leu Phe Asp

85 90 95

aat gac ttc cca gct ctg cag ccc gat gct ccg gat cca gga ccc agt 336

Asn Asp Phe Pro Ala Leu Gln Pro Asp Ala Pro Asp Pro Gly Pro Ser

100 105 110

gac cat cct ctt ttt cga gca gag gcg gcc aga gga gtt tgt aag gtc 384

Asp His Pro Leu Phe Arg Ala Glu Ala Ala Arg Gly Val Cys Lys Val

115 120 125

atg tgc ttc cat ccc tgg tcg gat gtg aca ctg cca ctc atg tca gtc 432

Met Cys Phe His Pro Trp Ser Asp Val Thr Leu Pro Leu Met Ser Val

130 135 140

cct gag atc cga gct gtc atc gat gcc tgg gct tca gtc acc gag gat 480

Pro Glu Ile Arg Ala Val Ile Asp Ala Trp Ala Ser Val Thr Glu Asp

145 150 155 160

ctg ggt gcc cag tat cct tgg gtg cag atc ttt gaa aac aaa gga gcc 528

Leu Gly Ala Gln Tyr Pro Trp Val Gln Ile Phe Glu Asn Lys Gly Ala

165 170 175

atg atg ggc tgt tct aac ccc cac ccc cac tgc cag gtt tgg gcc agc 576

Met Met Gly Cys Ser Asn Pro His Pro His Cys Gln Val Trp Ala Ser

180 185 190

agt ttc ctg cca gat att gcc cag cgt gaa gtg cga tcc cag cag aac 624

Ser Phe Leu Pro Asp Ile Ala Gln Arg Glu Val Arg Ser Gln Gln Asn

195 200 205

tat cac agc cag cat gga gaa cct ctg tta ctg gaa tat ggc cgc caa 672

Tyr His Ser Gln His Gly Glu Pro Leu Leu Leu Glu Tyr Gly Arg Gln

210 215 220

gaa ctc ctc agg aag gaa cgt ctg gtc tta tct agt gag cac tgg cta 720

Glu Leu Leu Arg Lys Glu Arg Leu Val Leu Ser Ser Glu His Trp Leu

225 230 235 240

gtc ctg gtt ccc ttc tgg gca gtg tgg gct ttc cag aca cta ctg ctg 768

Val Leu Val Pro Phe Trp Ala Val Trp Ala Phe Gln Thr Leu Leu Leu

245 250 255

ccc cgc cgg cat gta cgt cgg cta cct gag ctg acc cct gct gaa cgt 816

Pro Arg Arg His Val Arg Arg Leu Pro Glu Leu Thr Pro Ala Glu Arg

260 265 270

gat gat cta gcc tcc atc atg aag aag cta ttg acc aag tat gac aac 864

Asp Asp Leu Ala Ser Ile Met Lys Lys Leu Leu Thr Lys Tyr Asp Asn

275 280 285

cta ttt gag aca tct ttt ccc tac tcc atg ggc tgg cat ggg gct ccc 912

Leu Phe Glu Thr Ser Phe Pro Tyr Ser Met Gly Trp His Gly Ala Pro

290 295 300

acg gga tta aag act gga gcc gcc tat gac cac tgg cag cta cat gct 960

Thr Gly Leu Lys Thr Gly Ala Ala Tyr Asp His Trp Gln Leu His Ala

305 310 315 320

cat tac tat ccc cca ctc ctg cgc tct gct act gtc cgg aaa ttc atg 1008

His Tyr Tyr Pro Pro Leu Leu Arg Ser Ala Thr Val Arg Lys Phe Met

325 330 335

gtt ggc tat gaa atg ctt gcc cat ggg cac cgg gac ctc act cct gaa 1056

Val Gly Tyr Glu Met Leu Ala His Gly His Arg Asp Leu Thr Pro Glu

340 345 350

cag gct gca gag aga cta agg gcg ctt cct gag gta cat tat tgc ctg 1104

Gln Ala Ala Glu Arg Leu Arg Ala Leu Pro Glu Val His Tyr Cys Leu

355 360 365

gca aag aaa gac aag gaa aca gca gct gtt gct tga 1140

Ala Lys Lys Asp Lys Glu Thr Ala Ala Val Ala

370 375

<210> 4

<211> 379

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> [CDS]:1..1140 от SEQ ID NO 3

<400> 4

Met Ser Gln Asn Gly Asp Asp Pro Glu Gln Arg Gln Gln Ala Ser Glu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Met Ala Ala Thr Phe Arg Ala Ser Glu His Gln His Ile

20 25 30

Arg Tyr Asn Pro Leu Gln Asp Glu Trp Val Leu Val Ser Ala His Arg

35 40 45

Met Lys Arg Pro Trp Gln Gly Gln Val Glu Pro Gln Leu Leu Lys Thr

50 55 60

Val Pro Arg Tyr Asp Pro Leu Asn Pro Leu Cys Pro Gly Ala Thr Arg

65 70 75 80

Ala Asn Gly Glu Val Asn Pro His Tyr Asp Ser Thr Phe Leu Phe Asp

85 90 95

Asn Asp Phe Pro Ala Leu Gln Pro Asp Ala Pro Asp Pro Gly Pro Ser

100 105 110

Asp His Pro Leu Phe Arg Ala Glu Ala Ala Arg Gly Val Cys Lys Val

115 120 125

Met Cys Phe His Pro Trp Ser Asp Val Thr Leu Pro Leu Met Ser Val

130 135 140

Pro Glu Ile Arg Ala Val Ile Asp Ala Trp Ala Ser Val Thr Glu Asp

145 150 155 160

Leu Gly Ala Gln Tyr Pro Trp Val Gln Ile Phe Glu Asn Lys Gly Ala

165 170 175

Met Met Gly Cys Ser Asn Pro His Pro His Cys Gln Val Trp Ala Ser

180 185 190

Ser Phe Leu Pro Asp Ile Ala Gln Arg Glu Val Arg Ser Gln Gln Asn

195 200 205

Tyr His Ser Gln His Gly Glu Pro Leu Leu Leu Glu Tyr Gly Arg Gln

210 215 220

Glu Leu Leu Arg Lys Glu Arg Leu Val Leu Ser Ser Glu His Trp Leu

225 230 235 240

Val Leu Val Pro Phe Trp Ala Val Trp Ala Phe Gln Thr Leu Leu Leu

245 250 255

Pro Arg Arg His Val Arg Arg Leu Pro Glu Leu Thr Pro Ala Glu Arg

260 265 270

Asp Asp Leu Ala Ser Ile Met Lys Lys Leu Leu Thr Lys Tyr Asp Asn

275 280 285

Leu Phe Glu Thr Ser Phe Pro Tyr Ser Met Gly Trp His Gly Ala Pro

290 295 300

Thr Gly Leu Lys Thr Gly Ala Ala Tyr Asp His Trp Gln Leu His Ala

305 310 315 320

His Tyr Tyr Pro Pro Leu Leu Arg Ser Ala Thr Val Arg Lys Phe Met

325 330 335

Val Gly Tyr Glu Met Leu Ala His Gly His Arg Asp Leu Thr Pro Glu

340 345 350

Gln Ala Ala Glu Arg Leu Arg Ala Leu Pro Glu Val His Tyr Cys Leu

355 360 365

Ala Lys Lys Asp Lys Glu Thr Ala Ala Val Ala

370 375

<210> 5

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер УДФ_GlcE-F2-21

<400> 5

atggccgaga aggtgctggt c 21

<210> 6

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер УДФ_GlcE-R21

<400> 6

ttaggcctgt gctccaaagc c 21

<210> 7

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> прямой праймер УДФ-Gal-T-F2-21

<400> 7

atgtcgcaaa acggagatga t 21

<210> 8

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> обратный праймер УДФ-Gal-T-R18

<400> 8

tcaagcaaca gctgctgt 18

<210> 9

<211> 140

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтезированный

<400> 9

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 10

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; CDR1 тяжелой цепи (CDR-H1)

<400> 10

Asn Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; CDR2 тяжелой цепи (CDR-H2)

<400> 11

Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; CDR3 тяжелой цепи (CDR-H3)

<400> 12

Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr

1 5

<210> 13

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; CDR1 легкой цепи (CDR-L1)

<400> 13

Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 14

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; CDR2 легкой цепи (CDR-L2)

<400> 14

Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; CDR3 легкой цепи (CDR-L3)

<400> 15

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 16

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; вариабельный домен тяжелой цепи (VH)

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; вариабельный домен легкой цепи (VL)

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 18

<211> 328

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; константный домен тяжелой цепи (CH)

<400> 18

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 19

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; константный домен легкой цепи (CL)

<400> 19

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 20

<211> 444

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; тяжелая цепь (H)

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440

<210> 21

<211> 220

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> α-синуклеина; легкая цепь (L)

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ile Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Lys Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 22

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; CDR1 тяжелой цепи (CDR-H1)

<400> 22

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 23

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; CDR2 тяжелой цепи (CDR-H2)

<400> 23

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 24

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; CDR3 тяжелой цепи (CDR-H3)

<400> 24

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 25

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; CDR1 легкой цепи (CDR-L1)

<400> 25

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 26

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; CDR2 легкой цепи (CDR-L2)

<400> 26

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; CDR3 легкой цепи (CDR-L3)

<400> 27

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 28

<211> 125

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; вариабельный домен тяжелой цепи (VH)

<400> 28

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 29

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; вариабельный домен легкой цепи (VL)

<400> 29

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 30

<211> 101

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; константный домен тяжелой цепи (CH)

<400> 30

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 31

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; константный домен легкой цепи (CL)

<400> 31

Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 32

<211> 101

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3 константный домен тяжелой цепи (CD3 CH)

<400> 32

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 33

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD3; легкая цепь (L)

<400> 33

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 34

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20; CDR1 тяжелой цепи (CDR-H1)

<400> 34

Tyr Ser Trp Ile Asn

1 5

<210> 35

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20; CDR2 тяжелой цепи (CDR-H2)

<400> 35

Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 36

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20; CDR3 тяжелой цепи (CDR-H3)

<400> 36

Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr

1 5 10

<210> 37

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20; CDR1 легкой цепи (CDR-L1)

<400> 37

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 38

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20; CDR2 легкой цепи (CDR-L2)

<400> 38

Gln Met Ser Asn Leu Val Ser

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20; CDR3 легкой цепи (CDR-L3)

<400> 39

Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 40

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20; вариабельный домен тяжелой цепи (VH)

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 41

<211> 115

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20; вариабельный домен легкой цепи (VL)

<400> 41

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val

115

<210> 42

<211> 101

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20; константный домен тяжелой цепи (CH)

<400> 42

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys

100

<210> 43

<211> 104

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20; константный домен легкой цепи (CL)

<400> 43

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys

1 5 10 15

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

20 25 30

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

35 40 45

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

65 70 75 80

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

85 90 95

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100

<210> 44

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20 легкая цепь (CD20 VL-CL)

<400> 44

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 45

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20 тяжелая цепь [CD20 VH-CHl(EE)-Fc (впадина, P329G LALA)]

<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

355 360 365

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

<210> 46

<211> 439

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20-CD3 тяжелая цепь [CD3 VL-CH1-Fc (выступ, P329G LALA)]

<400> 46

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala

100 105 110

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

145 150 155 160

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

180 185 190

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

195 200 205

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

245 250 255

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

260 265 270

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

275 280 285

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

290 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

305 310 315 320

Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

325 330 335

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu

340 345 350

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

355 360 365

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

370 375 380

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

405 410 415

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

420 425 430

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435

<210> 47

<211> 673

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD20 тяжелая цепь [CD20 VH-CHl(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (выступ, P329G

LALA)]

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln

225 230 235 240

Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys

245 250 255

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val

260 265 270

Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn

275 280 285

Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly

290 295 300

Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala

305 310 315 320

Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly

325 330 335

Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

340 345 350

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

355 360 365

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

370 375 380

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

385 390 395 400

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

405 410 415

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

420 425 430

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

435 440 445

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

450 455 460

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

465 470 475 480

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

485 490 495

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

500 505 510

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

515 520 525

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

530 535 540

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

545 550 555 560

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

565 570 575

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

580 585 590

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

595 600 605

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

610 615 620

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

625 630 635 640

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

645 650 655

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

660 665 670

Pro

<---

Claims

1. Антитело к α-синуклеину, имеющее моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, причем антитело к α-синуклеину содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий

(a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10,

(б) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, и

(в) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12; и

(г) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13,

(д) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и

(е) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15; и

причем антитело к α-синуклеину имеет 17,2-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,1-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 25,4-48,0% (мас./мас.) G1 и 3,5-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; предпочтительно 27,2-47,0% G1 и 4,4-15,0% G2 на общий гликан; предпочтительно 40,0-46,0% (мас./мас.) G1 и 8,4-15,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан; более предпочтительно 41,0-45,0% (мас./мас.) G1 и 9,5-14,0% (мас./мас.) G2 на общий гликан и наиболее предпочтительно 42,1 -43,9% (мас./мас.) G1 и 10,6-13,3% (мас./мас.) G2 на общий гликан.

2. Антитело к α-синуклеину по п. 1, причем антитело к α-синуклеину содержит

(a) последовательность VH SEQ ID NO:16;

(б) последовательность VL SEQ ID NO:17; или

3. Антитело к α-синуклеину по п. 1 или 2, причем антитело к α-синуклеину содержит тяжелую цепь SEQ ID NO:20 и легкую цепь SEQ ID NO:21.

4. Способ получения антитела к α-синуклеину по любому из пп. 1-3, имеющего моногалактозилированные (G1) и дигалактозилированные (G2) гликаны, причем указанный способ включает:

(a) культивирование клетки млекопитающего в среде для культивирования клеток, причем концентрацию сульфгидрильной(ых) группы (групп) одного или более сульфгидрильных соединений по меньшей мере более 4,0 и менее 10,0 мМ и глюкозы по меньшей мере более 3,0 г/л в среде для культивирования клеток поддерживают по меньшей мере в течение 3, более предпочтительно по меньшей мере в течение 4 и еще более предпочтительно по меньшей мере в течение 5 дней,

(б) выделение указанного антитела.

5. Способ по п. 4, в котором концентрацию поддерживают в течение по меньшей мере 5 дней, предпочтительно в течение по меньшей мере 7 дней, более предпочтительно в течение по меньшей мере 10 дней, еще более предпочтительно в течение по меньшей мере 12 дней и наиболее предпочтительно в течение по меньшей мере 14 дней.

6. Способ по любому из пп. 4 или 5, в котором среда для культивирования клеток содержит сульфгидрильную(ые) группу(ы) одного или более сульфгидрильных соединений в концентрации по меньшей мере 5,0 мМ и менее чем 10,0 мМ, предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 9,0 мМ, более предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 8,0 мМ, еще более предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 7,0 мМ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5,0 мМ и равно или менее чем 6,0 мМ.

7. Способ по любому из пп. 4-6, в котором среда для культивирования клеток содержит от более чем 3,0 г/л до не более 13 г/л глюкозы, предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 8,0 г/л глюкозы, более предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 7,0 г/л глюкозы, еще более предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 6,0 г/л глюкозы и наиболее предпочтительно от более чем 3,0 г/л до не более 5,0 г/л глюкозы.

8. Способ по любому из пп. 4-7, в котором одно или более сульфгидрильных соединений выбраны из группы, состоящей из цистеина, цистина и их комбинации.

9. Способ по любому из пп. 4-8, в котором среда для культивирования клеток представляет собой среду с определенным химическим составом, предпочтительно среду для культивирования клеток, не содержащую сыворотку, белки и/или олигопептиды.

10. Применение антитела к α-синуклеину по любому из пп. 1-3 для лечения пациентов с болезнью Паркинсона.