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WO2008034430A2 - Serumfreies medium zur differenzierung von stammzellen - Google Patents

Serumfreies medium zur differenzierung von stammzellen Download PDF

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WO2008034430A2
WO2008034430A2 PCT/DE2007/001694 DE2007001694W WO2008034430A2 WO 2008034430 A2 WO2008034430 A2 WO 2008034430A2 DE 2007001694 W DE2007001694 W DE 2007001694W WO 2008034430 A2 WO2008034430 A2 WO 2008034430A2
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WO
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cells
polypeptide
cell culture
culture medium
differentiation
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PCT/DE2007/001694
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Andrea Seiler
Katharina Schlechter
Roland Buesen
Horst Spielmann
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Bundesinstitut fur Risikobewertung
Original Assignee
Bundesinstitut fur Risikobewertung
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Publication date
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    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance

Definitions

  • Serum-free medium for differentiation of stem cells Serum-free medium for differentiation of stem cells
  • stem cells summarizes all cells of an organism that have two fundamental properties. On the one hand, stem cells have the capacity for unlimited division and thus are capable of producing identical copies of themselves over a long period of time without differentiation (long-term self-renewal), and on the other hand they have the potential under certain conditions Differentiate conditions into specialized cell types. Depending on their respective differentiation potential, stem cells are differentiated into totipotent, pluripotent and multipotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells to which both embryonic stem cells (ES cells) and embryonic germ cells (EG cells) and embryonic carcinoma cells (EC cells) are counted are no longer able to produce a complete organism.
  • the pluripotent stem cells at this stage of differentiation already lack the ability to produce extraembryonic tissue, such as the placenta and trophoectoderm, required during the development of an organism for its supply.
  • the differentiation potential of the ES cells for example, is sufficient, however, to differentiate to the more than 200 different types of tissue of an organism.
  • ES cells pluripotent embryonic stem cells
  • ES cells have the ability to proliferate almost indefinitely in cell culture (in vitro), and under suitable culture conditions, they can develop into the cell types of all three cotyledons mesoderm, endoderm and ectoderm.
  • the mouse ES cells can be kept in undifferentiated state for a long time in vitro under suitable cultivation and environmental conditions.
  • a differentiation-inhibiting cytokine the murine leukemia inhibitory factor (mLIF)
  • mLIF murine leukemia inhibitory factor
  • FCS fetal calf serum
  • FCS FKS
  • amino acids necessary for the synthesis of proteins attachment factors which allow culturing of adherent cells in cell culture vessels, fats, vitamins, binding and transport proteins (eg albumin), inorganic salts, trace elements as well as hormones and growth factors , which, among other things, promote the growth and proliferation of different cell types.
  • Another important component of the FCS are the neutralization (eg albumin) and buffer systems (NaHCO 3 ), which bind the metabolic products of the cells or keep the pH constant over a certain period of time.
  • TCS can also contain unwanted bacterial toxins and microorganisms, such as viruses, bacteria (including mycoplasma) and fungi be. Also a possible presence of pathogens of transmissible spongiform encephalopathy (TSE or BSE) represents a further danger.
  • TSE transmissible spongiform encephalopathy
  • the FCS can be heat inactivated before use for 30 minutes at 56 0 C.
  • this method is not always applied because it can also lead to a reduction or destruction of important components (eg growth factors, vitamins).
  • the jR-vzYro stem cell technology allows the study of early cellular differentiation processes in culture. So far, it has hardly been possible to differentiate undifferentiated mouse embryonic stem cells efficiently under serum-free conditions into beating cardiomyocytes.
  • Cardiomyocytes differentiated from stem cells are often used for various purposes. Some application examples are:
  • Toxicology / Reproductive Toxicology Use in safety-toxicological in vitro test systems, e.g. for the testing of chemicals and pharmaceutical agents for mutagenicity, cytotoxicity and embryotoxicity, e.g. in the Embryonic Stem Cell Test (EST) (see also Rohwedel et al., 2001. Toxicolog in Vitro 741-753; Davila et al., 2004. Toxicological Sciences 79, 214-223).
  • EST Embryonic Stem Cell Test
  • mouse embryonic stem cells in safety-toxicological / n-vz ⁇ ro test systems is the Embryonic Stem Cell Test (EST), which exploits the differentiation potential of embryonic stem cells in order to test chemicals and active pharmaceutical ingredients for their embryotoxic potential.
  • EST Embryonic Stem Cell Test
  • the EST investigates the influence of embryotoxic test chemicals on the differentiation of embryonic stem cells into contracting cardiomyocytes.
  • Results are evaluated in relation to the cytotoxic effect of the substances on ES cells and on differentiated cells (3T3 mouse fibroblasts). Based on concentration
  • FCS fetal calf serum
  • the VCS consists of a large number of different components (see, for example, Example 1), many of which are not yet analyzed.
  • the composition of these ingredients since it is a product of animal origin, can vary widely from lot to lot. These variations in the composition of the serum may in turn have a positive or negative effect on the growth and differentiation ability of the cells.
  • FCS fetal calf serum
  • FCS In cell culture, the FCS is currently used by default as a component of the medium in the cultivation of many cell lines. The resulting regular and high demand for FCS can only be covered by the husbandry of large cattle herds. Within these flocks the VCS is obtained by ethically questionable cardiac puncture of the still-living fetus during the slaughter of the dam. The fetal killing usually takes place between the seventh and ninth months of gestation. At this time, according to the current state of knowledge, the pain sensation of the fetus is already largely pronounced.
  • the object of the invention was therefore to provide means that make it possible to cultivate stem cells without the addition of fetal calf serum over a longer period of time and to enable differentiation.
  • Fig. 1 shows in a bar chart the result of zeildiffer iststests to replace the FKS.
  • the average values from 7 experiments are shown for each batch. They are the Positive (DMEM 15% FCS) and the negative control (Advanced DMEM 15% SR) 5 and the two approaches using the growth factors BMP-2, BMP-4, activin A and ascorbic acid (batch I) or PDGF (Platelet derived growth factor) and SlP (sphingosine-1-phosphate) (approach II).
  • a cell differentiation test is considered valid if at least 21 of 24 holes in cardiac myocytes can be detected.
  • DMEM stands for "Dulbecco's Modified Eagle Medium”
  • FKS stands for fetal calf serum
  • Advanced stands for Advanced DMEM
  • SR KnockOut TM Serum Replacement
  • d stands for day.
  • Fig. 2 is a graph showing the result of carrying out a cell differentiation test using the highly embryotoxic substance 5-fluorouracil (Test 1, Fig. 2a, and Test 2, Fig. 2b). both diagrams show the concentration-dependent antidegrading effect of the embryotoxic substance 5-fluorouracil on cardiac muscle differentiation.
  • FKS stands for fetal calf serum and stands for SR KnockOut TM Serum Replacement; d stands for day.
  • FIG. 3 shows in a bar chart the result of the simultaneous differentiation into myocardial and neuronal cells. Shown are the results of the simultaneous differentiation of ES cells into neuronal cells and heart muscle cells under serum-free conditions with the aid of the stem cell differentiation medium according to the invention (T approach). The results from flow cytometric studies on days 7, 10, 12 and 14 of the differentiation are shown.
  • T approach the results from flow cytometric studies on days 7, 10, 12 and 14 of the differentiation are shown.
  • MAP2 microtubuli-associated protein-2
  • ce-internexin ce-internexin
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • the antibody anti-sarcomeric myosin heavy chain sarc MHC, clone: MF20
  • synthetic composition refers to a composition that is not of direct animal or human origin, in this context non-animal or human origin means that it is not a composition that as a whole is directly derived from the organism
  • synthetic composition therefore excludes, for example, fetal calf serum as such.
  • synthetic Composition does not mean that the components of the composition itself are also substances that have been synthesized by industrial chemical means, rather, the individual components may well be of natural, ie animal or human origin.
  • basic medium refers to any liquid composition used in the art after the addition of other substances, such as FCS or serum replacement medium, for culturing and / or differentiating cells.
  • cell culture medium refers to any liquid composition used in the art for cultivating and / or differentiating cells, as well as any composition known in the art after the addition of fetal calf serum for cultivation and / or or differentiation of cells is used.
  • stem cell differentiation medium refers to a cell culture medium that can be used to differentiate stem cells.
  • use to supplement cell culture media refers to the use of a substance as an adjunct to a cell culture medium, wherein desired properties (eg differentiation) are achieved only by the addition of the substance be useful if, for example, the long-term stability of a substance in Zelllculturmedium is low, and therefore for storage reasons, the additive is stored separately.
  • differentiation factor refers to substances that initiate and / or control a differentiation process of a cell.
  • differentiate refers to a process of structurally and functionally specializing cells The process is initiated and / or controlled by certain differentiation factors.
  • cultivating refers to maintaining cells under conditions that will ensure their survival.
  • cultivating makes no statement about whether the cells proliferate, differentiate or rest, but includes all these forms of the cell.
  • polypeptide refers to a polypeptide chain having at least 5 amino acid residues
  • polypeptide chain having at least 5 amino acid residues
  • proteins consisting of more than one such polypeptide chain
  • An example of such a polypeptide as used in this application would be, for example also activin A as a homodimer consisting of two / JA subunits each comprising 116 amino acids.
  • BMP-2 refers to a polypeptide comprising the mature form of human BMP-2.
  • BMP-2 also includes a polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1 refers to a monomer), i. amino acids 284-396 of the human BMP-2 precursor protein (SEQ ID NO: 2, the sequence refers to a monomer).
  • SEQ ID NO: 1 refers to a monomer
  • SEQ ID NO: 2 amino acids 284-396 of the human BMP-2 precursor protein
  • BMP-2 may be present in particular as a homodimer.
  • bone morphogenetic protein-4" and "BMP-4" as used herein refer to a polypeptide comprising the mature form of human BMP-4.
  • BMP-4 also includes a polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 3 refers to a monomer), in particular amino acids 293-408 of human BMP-4 (SEQ ID NO: 4, the sequence refers to a monomer).
  • SEQ ID NO: 3 refers to a monomer
  • amino acids 293-408 of human BMP-4 SEQ ID NO: 4
  • BMP-4 may be present as a homodimer.
  • activin A refers to a polypeptide comprising the mature form of human activin A.
  • activin A also comprises a polypeptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 5 (SEQ ID NO: 5) one monomer), in particular amino acids 311-426 of human activin A (SEQ ID NO: 6; / 3A monomer), which is a homodimer consisting of two / 3A subunits each comprising 116 amino acids.
  • the present invention in one aspect relates to a synthetic composition
  • a synthetic composition comprising a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO Comprises 5 and comprises ascorbic acid.
  • the present invention relates to a synthetic composition comprising BMP-2 (Bone Morphogenetic Protein-2), BMP-4 (Bone Morphogenetic Protein-4), Activin A and ascorbic acid.
  • BMP-2 Bismethyl Morphogenetic Protein-2
  • BMP-4 Bone Morphogenetic Protein-4
  • Activin A ascorbic acid.
  • the synthetic composition according to the invention does not have to comprise other substances, but may include this.
  • the composition of the invention may be in a dry state or in a liquid form.
  • the composition in the dry state is particularly suitable for long-term storage.
  • the dry composition may comprise lyophilized BMP-2, lyophilized BMP-4 and lyophilized activin A.
  • water or appropriate buffer e.g. PBS, Hepes etc. or suitable solvent such as 4 mM HCl (+ 0.1% bovine serum albumin [BSA]) for BMP-2 and BMP-4; PBS (+ 0.1% BSA) for activin A; PBS for ascorbic acid
  • the composition can be converted in the dry state to a liquid state composition.
  • Such a composition is then less stable for a long time, but can be added to a basal or cell culture medium at the correct concentration without much effort.
  • BMP-2 may be BMP-2 of any species, but is preferably BMP-2 of the species to which the cells to be cultured or differentiated are also assigned. Preferably, it is BMP-2 from human, mouse, rat (as 100% conserved here), or other species, e.g. Beef, sheep, horse or pig, as the BMPs are highly conserved between species. To obtain the effect according to the invention, modified forms of BMP-2 or precursors can also be used as long as the receptor binding site is present.
  • the receptor binding site of BMP-2 comprises the amino acids of positions 284-396 of SEQ ID NO: 2 (corresponding to SEQ ID NO: 1).
  • BMP-2 can be part of the composition according to the invention in dissolved form or as dry substance. BMP-2 may be of recombinant origin.
  • BMP-4 may be BMP-4 of any species, but is preferably BMP-4 of the species to which the cells to be cultured or differentiated are also assigned. Preferably, it is human or mouse BMP-4 (98% to 100% conserved here) or other species such as rat, bovine, ovine, equine or porcine, as the BMPs are highly conserved between species. Modified forms of BMP-4 or precursors may also be used to achieve the effect according to the invention as long as the receptor binding site is present.
  • the receptor binding site of BMP-4 comprises the amino acids of positions 293-408 of SEQ ID NO: 4 (corresponding to SEQ ID NO: 3).
  • BMP-4 may be part of the inventive composition in dissolved form or as dry substance. BMP-4 may be of recombinant origin.
  • Activin A may be activin A of any species but is preferably activin A of the species to which the cells to be cultured or differentiated are to be assigned. Preferably, it is human or mouse activin A (as it is 100% conserved here) or other species, e.g. Rat, cattle, sheep, horse or pig, as activin A is highly conserved between species. To achieve the effect according to the invention, modified forms of activin A or precursors can also be used. Activin A may be of recombinant origin.
  • Ascorbic acid may be present as a dry substance in the form of one of its salts or may be present in a dissolved state.
  • the term ascorbic acid refers in particular to L-ascorbic acid.
  • composition according to the invention comprises substances which have an analogous effect, such as BMP-2, BMP-4, activin A and / or ascorbic acid, e.g. other members of the TGF-ß superfamily that promote cellular proliferation and differentiation.
  • substances which have an analogous effect such as BMP-2, BMP-4, activin A and / or ascorbic acid, e.g. other members of the TGF-ß superfamily that promote cellular proliferation and differentiation.
  • the present invention relates to a cell culture medium or a stem cell differentiation medium which comprises the composition according to the invention.
  • the cell culture medium or stem cell differentiation medium comprises the composition according to the invention, but is free from fetal calf serum.
  • the cell culture medium or stem cell differentiation medium according to the invention comprises Advanced DMEM and / or KnockOut TM DMEM Serum Replacement.
  • the stem cell differentiation medium of the invention comprises BMP-2 at a concentration of about 1 ng / ml to about 10 ng / ml, especially at a concentration of about 5 ng / ml, BMP-4 at a concentration of about 0.06 ng / ml to about 8 ng / ml, especially in one Concentration of about 2 ng / ml, activin A at a concentration of about 1 ng / ml to about 10 ng / ml, especially at a concentration of 2 ng / ml and ascorbic acid in a concentration of 10 -7 to 10 -3 mol / L, in particular with a concentration of about 10- 5 mol / L.
  • the stem cell differentiation medium according to the invention may in particular also comprise sodium selenite, insulin and transferrin.
  • the stem cell differentiation medium according to the invention may also contain color indicators, stabilizers, salts and ions, stabilizing proteins, e.g. BSA, include.
  • the stem cell differentiation medium according to the invention comprises as differentiation factors only BMP-2, BMP-4 and activin A, and ascorbic acid.
  • compositions of numerous basal media as well as cell culture media are known in the art, e.g. for Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI-1640, Han's F12, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), etc., and thus can be used to prepare the stem cell differentiation medium of the present invention.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • RPMI-1640 Han's F12
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium IMDM
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • the present invention relates to BMP-2 for use in combination with BMP-4, activin A and ascorbic acid for the preparation and / or supplementation of a stem cell differentiation medium.
  • the present invention relates to BMP-4 for use in combination with BMP-2, activin A and ascorbic acid for the preparation and / or supplementation of a stem cell differentiation medium.
  • the present invention relates to activin A for use in combination with BMP-2, BMP-4 and ascorbic acid for the preparation and / or supplementation of a stem cell differentiation medium.
  • the present invention relates to ascorbic acid for use in combination with BMP-2, BMP-4 and activin A and for the production and / or supplementation of a stem cell differentiation medium.
  • the present invention relates to the use of the composition according to the invention and / or the stem cell differentiation medium in a cell differentiation assay, in particular as part of an embryonic stem cell test (EST).
  • EST embryonic stem cell test
  • the present invention relates to the use of the composition according to the invention and / or the stem cell differentiation medium in basic research in the field of cell and developmental biology for the investigation of early functional cardiogenic development processes in vitro, in particular in the targeted study of the effect of growth and differentiation factors.
  • the present invention relates to the use of the composition according to the invention and / or of the stem cell differentiation medium in the context of toxicological investigations, in particular in the context of reproductive toxicology, such as, for example, use in safety-toxicological in vitro test systems, e.g. for testing substances such as chemicals and active pharmaceutical ingredients, as well as radiation doses for mutagenicity, cytotoxicity or embryotoxicity, in particular in the context of cell differentiation assays, e.g. Embryo Stem Cell Test (EST).
  • EST Embryo Stem Cell Test
  • the present invention relates to the use of the composition of the invention and / or the stem cell differentiation medium in pharmacological efficacy testing and / or screening techniques, e.g. for the search for antiangiogenic substances, or in the context of electrophysiological analyzes for the investigation of cardioactive substances and / or drugs in vitro.
  • the present invention relates to the use of the composition according to the invention and / or of the stem cell differentiation medium in the context of the establishment of therapy models in which stem cells are used to develop or differentiate certain cell types used for the therapy of corresponding diseases can be.
  • This concerns eg the differentiation in cardiomyocytes for the therapy of heart attacks or eg the production of neuronal stem cells for the therapy of degenerative nerve diseases.
  • composition according to the invention or the stem cell differentiation medium according to the invention can in principle be used in any assay or cultivation method.
  • the composition according to the invention or the stem cell differentiation medium is preferably used for cell differentiation methods in which a standardized cell culture medium which is precisely defined in its composition is desired.
  • EST embryonic stem cell test
  • FCS undefined composition
  • FCS myocardial cell differentiation of ES cells in vitro.
  • the FCS batch determines the success of the differentiation through its partly unknown composition (cytokines). Often, batches are inappropriate and do not allow the cells to differentiate. To perform the differentiation test in the EST, therefore, suitable batches are an absolute prerequisite. However, finding such a batch is very time-consuming, since no information from the manufacturers on the suitability for stem cell differentiation can be made in advance, because there are not yet decisive indications as to which ingredients would be needed for this purpose. An assessment of suitability succeeds only by time-consuming and costly trial and error.
  • the present invention also relates to the use of the composition of the invention as a supplement to Zelll ⁇ ilturmedien.
  • the present invention relates to the use of this composition as an additive for cell culture media suitable for stem cell differentiation.
  • the concentration of the individual components before addition to the medium can be more concentrated than stated above.
  • the composition is present as a solid prior to addition to the basal or cell culture medium.
  • the composition according to the invention is used in processes which serve to differentiate stem cells, in particular the differentiation to heart muscle cells and / or nerve cells.
  • composition according to the invention is used to prepare a stem cell differentiation medium and added to commercially available basal or cell culture media.
  • commercially available media are DMEM, Advanced DMEM, KnockOut DMEM or IMDM (Invitrogen, Düsseldorf).
  • composition of the invention is added to the cell culture medium along with fetal calf serum.
  • inventive composition of the present invention is used in conjunction with KnockOut TM Serum Replacement (Invitrogen) instead of FCS, Newborn CaIf Serum or other natural sera.
  • KnockOut TM Serum Replacement Invitrogen
  • the use of the stem cell differentiation medium of the present invention primarily results in differentiation into cardiomyocytes and neural cells. Myocardial cells can easily be detected with the microscope because they rhythmically contract.
  • Cells which can be cultured or differentiated in the stem cell differentiation medium according to the invention-containing the composition according to the invention are e.g. embryonic stem cells (ES cells), postembryonic stem cells and / or adult stem cells.
  • the stem cells to be differentiated may be obtained, in particular, from mice or rats, or from other species, e.g. Monkey, human, cattle, sheep, horse or pig.
  • Non-limiting examples of mouse embryonic stem cells may be e.g. ABl, AB2, Bl 17, BK4, BLC6, CCE, D1, D3, E14, Fl, HMl, Rl or W3-1-A. Most of these cell lines originate from the blastocysts of the mouse strain 129 or from crossover variants with it.
  • Assays that make use of the stem cell differentiation medium of the present invention can thus obtain standardized conditions without fluctuations due to Ensure composition of the culture medium. Further tests and differentiation methods that benefit from such conditions are basically all assays, since a test system can be better standardized by using defined components.
  • the differentiation of, for example, undifferentiated mouse ES cells into functional, beating cardiac muscle cells can now be carried out under chemically defined, serum-free conditions. A standardizability and a high reproducibility is thus given.
  • the present invention relates to a kit comprising BMP-2, BMP-4, activin A and ascorbic acid as defined herein.
  • Example 1 Composition of fetal calf sera
  • Table I illustrates the composition of fetal calf sera according to T. Lindl (ZeIl and tissue culture, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin, 5th edition, 2002)
  • Example 3 Replacement of the fetal calf serum in the differentiation test:
  • FCS For the replacement of the FCS in differentiation tests was for the cultivation of undifferentiated stem cells with DMEM and 15% FCS by two alternative media, the Advanced-DMEM and the KnockOut TM -DMEM (Invitrogen, Düsseldorf) in combination with a serum replacement
  • KnockOut TM Serum Replacement (SR) (Invitrogen, Düsseldorf), supplemented.
  • the KnockOut TM -SR is used to culture and differentiate the cells at the same concentration (15%) used to apply the FCS.
  • the cultivation of the cells was otherwise carried out according to standard methods known in the art.
  • the cells were first gradually adapted to the new media (Advanced-DMEM and KnockOut TM -DMEM) and the serum replacement (KnockOut TM -SR).
  • the FCS concentration was slowly reduced from passage to passage, and the serum replacement level was increased gradually.
  • the stepwise adaptation was performed during the routine passage of the cells (e.g., Monday, Wednesday, and Friday) in the presence of 1000 U / ml mouse lymphocyte inhibitory factor (LEF), so that it was completed within five passages.
  • the cells were cultured for a further three passages in the respective medium in gelatin-coated cell culture petri dishes (0 6 cm) before being used in the differentiation assay using specific growth factors to replace the FCS.
  • the adapted cells can be used until the 21st passage in the differentiation test.
  • the applicability of the selected components with respect to the differentiation of the cells to contracting cardiomyocytes in the differentiation test had to be determined using various growth factors.
  • the trials used the serum replacement RnockOut TM -SR in combination with the advanced DMEM.
  • this stem cell differentiation medium two batches with different combinations of growth factors, ie BMP-2, BMP-4, activin A and ascorbic acid in batch I, and PDGF and SlP in batch ⁇ were prepared.
  • a negative control ie an approach with the appropriate medium without the addition of growth factors (Advanced-DMEM + 15% KnockOut TM -SR) was included in each batch. On the basis of the negative controls can It can be checked whether a differentiation can be achieved even without the factors.
  • the positive control used was an approach with DMEM + 15% FCS (see FIG. 1).
  • the concentrations of the four growth factors selected for use in the differentiation test and thus for the differentiation of embryonic stem cells into contracting cardiomyocytes were respectively 5 ng / ml (BMP -2), 2 ng / ml (BMP-4), 2 ng / ml (activin A ), respectively, 10 "5 mol / L (ascorbic acid).
  • the growth factors are added to the medium for the first time on day 3 of the assay in the transfer of the cells into the suspension culture and was repeated on day 5 of the test when transferring the "embryoid bodies” (EBs) into the 24-well plate but also earlier, eg on day 0.
  • EBs embryonic stem cells
  • the EBs that had formed in the hanging drops were rinsed with the appropriate medium from the lid of the Petri dish.
  • the EBs were pipetted into a 15 ml centrifuge tube. After the EBs had sunk to the bottom of the tube, the media supernatant was aspirated. Subsequently, the EBs were taken up in 5 ml of medium, which was supplemented with the corresponding concentrations of the respective growth factors (see above), or for the positive and negative controls contained no growth factors.
  • each EB was individually transferred by means of a pipette into a hole in a 24-well plate.
  • the 24-well plates were previously coated with a 0.1% gelatin solution to allow the EBs to attach and spread in the plate.
  • the appropriate amounts of the respective growth factors were added to the medium as indicated above.
  • the light microscopic evaluation of the batches was carried out on days 7, 10, 12 and in some cases also on day 14 after the beginning of the experiment. For each approach, at least three independent experiments were performed.
  • FIG. 1 shows the results from the experiments for replacing the FCS.
  • the results are shown as bar graphs, showing individual values.
  • the arithmetic mean was used.
  • the standard error (SEM) from the approaches is listed.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine synthetische Zusammensetzung, die ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst, und Ascorbinsäure umfasst. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine synthetische Zusammensetzung, die BMP-2 (Bone Morphogenetic Protein-2), BMP-4 (Bone Morphogenetic Protein-4), Aktivin A und Ascorbinsäure umfasst. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Zellkulturmedium bzw. ein Stammzelldifferenzierungsmedium, das die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst.

Description

Serumfreies Medium zur Differenzierung von Stammzellen
Unter dem Begriff Stammzellen werden alle Zellen eines Organismus zusammengefasst, die über zwei fundamentale Eigenschaften verfügen. Einerseits besitzen Stammzellen die Fähigkeit zur unbegrenzten Teilung und sind damit in der Lage, über einen langen Zeitraum identische Kopien von sich selbst zu erstellen, ohne dabei zu differenzieren (long-term self-renewal), und andererseits verfügen sie über das Potential, unter bestimmten Bedingungen in spezialisierte Zelltypen zu differenzieren. Entsprechend ihres jeweiligen Differenzierungspotentials werden Stammzellen in totipotente, pluripotente und multipotente Stammzellen unterschieden.
Die pluripotenten Stammzellen, zu welchen sowohl die embryonalen Stammzellen (embryonic stem cells, ES-Zellen) als auch die embryonalen Keimzellen (embryonic germ cells, EG-Zellen) und die embryonalen Karzinomzellen (embryonic Carcinoma cells, EC-Zellen) gezählt werden, sind nicht mehr in der Lage, einen kompletten Organismus hervorzubringen. Zur Bildung eines kompletten Organismus fehlt den pluripotenten Stammzellen in diesem Stadium der Differenzierung bereits die Fähigkeit zur Bildung von extraembryonalem Gewebe, wie beispielsweise der Plazenta und des Trophoektoderms, die während der Entwicklung eines Organismus für dessen Versorgung erforderlich sind. Das Differenzierungspotential der ES- Zellen beispielsweise reicht jedoch aus, um zu den mehr als 200 verschiedenen Gewebearten eines Organismus zu differenzieren.
Die pluripotenten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) besitzen die Fähigkeit, sich in der Zellkultur (in vitro) nahezu unbegrenzt zu vermehren, und unter geeigneten Kultivierungsbedingungen können sie sich in die Zelltypen aller drei Keimblätter Mesoderm, Endoderm und Ektoderm entwickeln.
Verschiedenen Arbeitsgruppen ist es bereits gelungen, aus ES-Zellen der Maus mit einem entsprechenden Differenzierungsprotokoll Insulin-produzierende /3-Inselzellen zu gewinnen, die nach dem Einsetzen in eine Mausmutante ihre biologische Funktion, die Ausschüttung von Insulin, aufgenommen haben. Es wurde auch bereits gezeigt, dass in vitro hergestellte neuronale Vorläuferzellen fähig sind, auf Signale aus der Umwelt zu reagieren, Zellwanderungen und Differenzierungen zu lenken und das Potential haben, neuronale Zellen sowie Gliazellen im Zentralnervensystem wieder herzustellen. Außerdem konnten mit einem weiteren Differenzierungsprotokoll auch Dopamin und Serotonin produzierende Zellen mit neuronalen Eigenschaften generiert werden.
Die ES -Zellen der Maus können in vitro unter geeigneten Kultivierungs- und Umgebungsbedingungen über einen langen Zeitraum im undifferenzierten Zustand gehalten werden. Zur Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustandes muss dem Kulturmedium ein differenzierungshemmendes Zytokin, der murine Leukemia Inhibitory Factor (mLIF), zugegeben werden. In Abwesenheit dieses Faktors beginnen die ES-Zellen mit der Differenzierung in die verschiedenen Zelltypen aller drei Keimblätter, nämlich Mesoderm, Ektoderm und Endoderm.
Für eine erfolgreiche /72-vzYrσ-Kultivierung von ES-Zellen über einen längeren Zeitraum ist es wichtig, die Umgebungsbedingungen der Zellen so weit wie möglich den /n-vzvo-Bedingungen dieses Zelltyps anzupassen. Dies gilt insbesondere für die Versorgung der Zellen mit einem geeigneten Medium und den entsprechenden Zusätzen, wobei eukaryotische Zellen tierischen und humanen Ursprungs zur optimalen Kultivierung in vitro, d.h. für Wachstum, Proliferation und zellspezifische Differenzierung, den Zusatz von Serum benötigen, da die im Serum enthaltenen Stoffe für den geregelten Ablauf dieser Prozesse von Bedeutung sind. Als Serum wird fetales Kälberserum (FKS) eingesetzt, das aus einer Vielzahl unterschiedlicher Komponenten besteht, die für das Wachstum und die Differenzierung der ES-Zellen essentiell sind. Die genaue Zusammensetzung ist allerdings bis heute noch nicht bekannt, da einige der enthaltenen Komponenten noch nicht identifiziert sind. Bekannt ist jedoch, dass im FKS Aminosäuren, die zur Synthese von Proteinen notwendig sind, Anheftungsfaktoren, die eine Kultivierung von adhärenten Zellen in Zellkulturgefäßen ermöglichen, Fette, Vitamine, Bindungs- und Transportproteine (z.B. Albumin), anorganische Salze, Spurenelemente sowie Hormone und Wachstumsfaktoren, die unter anderem das Wachstum und die Proliferation unterschiedlicher Zellarten fördern, enthalten sind. Ein weiterer wichtiger Bestandteil des FKS sind die Neutralisations- (z.B. Albumin) und Puffersysteme (NaHCO3), die Stoffwechselprodukte der Zellen binden bzw. den pH- Wert über einen bestimmten Zeitraum konstant halten.
Neben den genannten Inhaltsstoffen können im FKS aber auch unerwünschte bakterielle Toxine und Mikroorganismen, wie Viren, Bakterien (einschließlich Mycoplasmen) und Pilze, enthalten sein. Auch ein etwaiges Vorhandensein von Erregern der übertragbaren spongiformen Enzephalopathie (TSE bzw. BSE) stellt eine weitere Gefahr dar.
Um das Kontaminierungsrisiko zu senken und Komplementfaktoren im Serum zu inaktivieren, kann das FKS vor Gebrauch für 30 Minuten bei 560C hitzeinaktiviert werden. Allerdings wird diese Methode nicht immer angewandt, da es hierbei auch zu einer Verminderung bzw. Zerstörung wichtiger Komponenten (z.B. Wachstumsfaktoren, Vitamine) kommen kann.
Die jR-vzYro-Stammzelltechnologie erlaubt die Untersuchung von frühen zellulären Differenzierungsprozessen in Kultur. Bisher ist es kaum gelungen, undifferenzierte embryonale Stammzellen der Maus effizient unter serumfreien Bedingungen in schlagende Kardiomyozyten zu differenzieren.
Aus Stammzellen differenzierte Kardiomyozyten werden vielfach zu verschiedenen Zwecken eingesetzt. Einige Anwendungsbeispiele sind:
1. Einsatz in der Grundlagenforschung auf dem Gebiet der Zell- und Entwicklungsbiologie zur Untersuchung von frühen funktionellen, cardiogenen Entwicklungsprozessen in vitro, z.B. gezielte Untersuchung zur Wirkung von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren
2. Toxikologie/Reproduktionstoxikologie: Einsatz in sicherheitstoxikologischen In-vitro- Testsystemen z.B. zur Prüfung von Chemikalien und Arzneimittelwirkstoffen auf Mutagenität, Zytotoxizität und Embryotoxizität, z.B. im Embryonalen Stammzelltest (EST) (siehe auch Rohwedel et al., 2001. Toxicolog in Vitro 741-753; Davila et al., 2004. Toxicological Sciences 79, 214-223).
3. Pharmakologische Wirksamkeitsprüfungen und Screeningsysteme, z.B.
• Screening von antiangiogenen Substanzen (siehe Wartenberg et al., 1998, Laboratory Investigation 78, 1301-1314).
• Elektophysiologische Analysen zur Untersuchung cardioactiver Arzneimittel in vitro
4. Etablierung von Zelltherapie- und Transplantationsmodellen 5. Entdeckung und Entwicklung neuer Wirkstoffe (Mc Neish, Nature Reviews, 2004, 3, p709).
Traditionell erfolgt die /«-vzYro-Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus unter dem Einsatz von fetalem Kälberserum. Da es sich hier um ein Undefiniertes tierisches Naturprodukt handelt, können diese Untersuchungen nur unter größerem Aufwand zu halbwegs standardisierten Bedingungen durchgeführt werden.
Ein Beispiel für den Einsatz embryonaler Stammzellen der Maus in sicherheitstoxikologischen /n-vzϊro-Prüfsystemen ist der Embryonale Stammzelltest (EST), der das Differenzierungspotential embryonaler Stammzellen ausnutzt, um Chemikalien und Arzneimittelwirkstoffe auf ihr embryotoxisches Potential hin zu überprüfen.
Mit dem EST wird der Einfiuss von embryotoxischen Testchemikalien auf die Differenzierung von embryonalen Stammzellen in kontrahierende Herzmuskelzellen untersucht. Diese
Ergebnisse werden in Relation zum zytotoxischen Effekt der Substanzen auf ES-Zellen und auf differenzierte Zellen (3T3 Maus-Fibroblasten) bewertet. Anhand von Konzentrations-
Wirkungskurven werden Halbhernmkonzentrationen (ID50, IC50) bestimmt, die die
Klassifizierung der Testsubstanzen in drei Embryotoxizitätsklassen „nicht, schwach oder stark" embryotoxisch gestatten. Die Klassifizierung erfolgt mit einem biostatistischen
Prädiktionsmodell.
Im Differenzierungstest des EST muss zum Erhalt und für das Wachstum der undifferenzierten ES-Zellen sowie für eine effiziente Differenzierung der embryonalen Stammzellen, z.B. in schlagende Kardiomyozyten, dem Medium 15% fetales Kälberserum (FKS) zugesetzt werden. Das FKS besteht aus einer Vielzahl verschiedener Komponenten (siehe z.B. Beispiel 1), wobei viele der enthaltenen Bestandteile noch nicht analysiert sind. Die Zusammensetzung dieser Inhaltsstoffe kann, da es sich um ein Produkt tierischer Herkunft handelt, von Charge zu Charge stark variieren. Diese Variationen in der Zusammensetzung des Serums können sich wiederum positiv oder negativ auf das Wachstum und die Differenzierungsfähigkeit der Zellen auswirken. Des Weiteren kann bei dem Einsatz von FKS in einem Testsystem kein vollständig standardisierter Arbeitsablauf erreicht werden, da die genaue Zusammensetzung dieses Testsystems nicht definiert werden kann. Dies trägt außerdem zur Erschwerung einer Etablierung derartiger /ra-vzYro-Testsysteme in andere Laboratorien bei. In der Zellkultur wird das FKS derzeit standardmäßig als Bestandteil des Mediums bei der Kultivierung vieler Zelllinien eingesetzt. Der daraus resultierende regelmäßige und hohe Bedarf an FKS kann nur durch die Haltung entsprechend großer Rinderherden seitens der Hersteller abgedeckt werden. Innerhalb dieser Herden erfolgt die Gewinnung des FKS durch die ethisch bedenkliche Herzpunktion des noch lebenden Fetus während der Schlachtung des Muttertieres. Die Tötung des Fetus erfolgt in der Regel zwischen dem siebten und neunten Monat der Tragezeit. Zu diesem Zeitpunkt ist nach dem heutigen Wissensstand die Schmerzempfindung des Fetus bereits weitestgehend ausgeprägt.
Allerdings sollte eine Reduzierung bzw. ein Ersatz des FKS in der Zellkultur nicht nur aus ethischen, sondern auch aus ökonomischen und vor allem wissenschaftlichen Gründen angestrebt werden. Die Integration einer neuen Serumcharge in den laufenden Testbetrieb ist in hohem Maße personal- und zeitintensiv und daher kostenintensiv. Aus wissenschaftlicher Sicht trägt die Verwendung einer chemisch definierten Formulierung auch wesentlich zur Standardisierbarkeit des Testsystems bei.
Es befinden sich zurzeit verschiedene Produkte zum Ersatz von FKS auf dem Markt. Es muss jedoch festgestellt werden, dass viele Produkte insbesondere für embryonale Stammzellen, insbesondere der Maus, nicht geeignet sind oder optimiert werden müssen. Eine weitere Einschränkung ist, dass die käuflichen serumfreien Medien nicht direkt für die verschiedenen Differenzierungswege eingesetzt werden können, sondern immer dafür entwickelt oder optimiert werden müssen.
Die Aufgabe der Erfindung war es daher, Mittel zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, Stammzellen auch ohne Zusatz von fetalem Kälberserum über einen längeren Zeitraum zu kultivieren und die Differenzierung zu ermöglichen.
Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
Die nachfolgenden Figuren erläutern die Erfindung.
Fig. 1. zeigt in einem Balkendiagramm das Ergebnis aus Zeildifferenzierungstests zum Ersatz des FKS. Dargestellt sind für jeden Ansatz jeweils die Mittelwerte aus 7 Versuchen. Es sind die Positiv- (DMEM 15% FKS) und die Negativkontrolle (Advanced-DMEM 15% SR)5 sowie die 2 Ansätze unter dem Einsatz der Wachstunisfaktoren BMP-2, BMP-4, Aktivin A und Ascorbinsäure (Ansatz I) bzw. PDGF (Platelet derived Growth Factor) und SlP (Sphingosin-1- Phosphat) (Ansatz II) gegenübergestellt. Die Auswertung des Versuches erfolgte an den Tagen 7, 10, 12 und 14 (n=7 am Tag 12; n=3 am Tag 14). Ein Zeildifferenzierungstest gilt als valide, wenn in mindestens 21 von 24 Löchern schlagende Herzmuskelzellen detektiert werden können. DMEM steht für „Dulbecco's Modified Eagle Medium"; FKS steht für fetales Kälberserum, Advanced steht für Advanced DMEM, SR steht für KnockOut™ Serum Replacement; d steht für Tag.
Fig. 2 zeigt in einer Graphik das Ergebnis der Durchführung eines Zelldifferenzierungstests unter Verwendung der stark embryotoxischen Substanz 5-Fluorouracil (Test 1, Fig. 2a; und Test 2, Fig. 2b). hi beiden Diagrammen ist die konzentrationsabhängige differenzierungshemmende Wirkung der embryotoxischen Substanz 5-Fluorouracil auf die Herzmuskeldifferenzierung dargestellt. In beiden Teilabbildungen steht FKS für fetales Kälberserum und steht SR für KnockOut™ Serum Replacement; d steht für Tag.
Fig. 3. zeigt in einem Balkendiagramm das Ergebnis der zeitgleichen Differenzierung in Herzmuskel- und neuronale Zellen. Gezeigt sind die Ergebnisse der zeitgleichen Differenzierung von ES-Zellen in neuronale Zellen und Herzmuskelzellen unter serumfreien Bedingungen mit Hilfe des erfmdungsgemäßen Stammzelldifferenzierungsmediums (Ansatz T). Dargestellt sind die Ergebnisse aus durchflusszytometrischen Untersuchungen an den Tagen 7, 10, 12 und 14 der Differenzierung. Zur Erfassung der neuralen Differenzierung wurden die Antikörper gegen die Strukturproteine Microtubuli-associated Protein-2 (MAP2), ce-Internexin, ß-ffl-Tubulin und Glial fibrillary acidic Protein (GFAP) eingesetzt. Zur Erfassung der herzmuskelzellspezifischen Differenzierung wurde der Antikörper Anti-sarcomeric Myosin Heavy Chain (sarc. MHC; Klon: MF20) eingesetzt; d steht für Tag.
Der Begriff „Synthetische Zusammensetzung", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Zusammensetzung, die nicht unmittelbar tierischen oder menschlichen Ursprungs ist. Nicht tierischen oder menschlichen Ursprungs bedeutet in diesem Zusammenhang, dass es sich nicht um eine Zusammensetzung handelt, die als Ganzes unmittelbar aus dem Organismus eines Tieres oder Menschen entnommen worden ist. Vom Begriff „synthetische Zusammensetzung" ist daher zum Beispiel fetales Kälberserum als solches ausgenommen. Der Begriff „synthetische Zusammensetzung", wie hier verwendet, bedeutet aber nicht, dass es sich auch bei den Komponenten der Zusammensetzung selbst um Stoffe handelt, die über industriell-chemischem Wege synthetisiert worden sind. Vielmehr können die Einzelkomponenten durchaus natürlichen, d.h. tierischen oder menschlichen Ursprungs sein.
Der Begriff „Basalmedium", wie hierin verwendet, bezeichnet jede flüssige Zusammensetzung, die im Stand der Technik nach Zusatz weiterer Stoffe, wie z.B. FKS oder Serumersatzmedium, zur Kultivierung und/oder Differenzierung von Zellen benutzt wird.
Der Begriff „Zelllculturmedium", wie hierin verwendet, bezeichnet jede flüssige Zusammensetzung, die im Stand der Technik zur Kultivierung und/oder Differenzierung von Zellen benutzt wird, sowie jede Zusammensetzung, die im Stand der Technik erst nach Zusatz von fetalem Kälberserum zur Kultivierung und/oder Differenzierung von Zellen benutzt wird.
Der Begriff „Stammzelldifferenzierungsmedium", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Zellkulturmedium, das zur Differenzierung von Stammzellen verwendet werden kann.
Der Begriff „Verwendung zur Ergänzung von Zellkulturmedien", wie hierin verwendet, bezeichnet die Verwendung eines Stoffes als Zusatz zu einem Zellkulturmedium, wobei erst durch den Zusatz des Stoffes gewünschte Eigenschaften (z.B. Differenzierung) erzielt werden. Der nachträgliche Zusatz bestimmter Stoffe zu einem Zellkulturmedium kann sinnvoll sein, wenn z.B. die Langzeitstabilität eines Stoffes im Zelllculturmedium gering ist, und daher aus Lagerungsgründen der Zusatzstoff separat aufbewahrt wird.
Der Begriff „Differenzierungsfaktor", wie hierin verwendet, bezeichnet Substanzen, die einen Differenzierungsprozess einer Zelle einleiten und/oder steuern.
Der Begriff „Differenzieren", wie hierin verwendet, bezeichnet einen Prozess der strukturellen und funktionellen Spezialisierung von Zellen. Der Prozess wird durch bestimmte Differenzierungsfaktoren eingeleitet und/oder gesteuert.
Der Begriff „Kultivieren", wie hierin verwendet, bezeichnet das Halten von Zellen unter Bedingungen, die Ihr Überleben gewährleisten. Der Begriff Kultivieren, wie liier verwendet, macht keine Aussage darüber, ob die Zellen proliferieren, differenzieren oder ruhen, sondern umfasst alle diese Zustandsformen der Zelle.
Der Begriff „Polypeptid", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Polypeptidkette mit mindestens 5 Aminosäureresten. Der Ausdruck erstreckt sich auch auf Proteine, die aus mehr als einer solchen Polypeptidkette bestehen. Ein Beispiel für solch ein Polypeptid, wie in dieser Anmeldung verwendet, wäre z.B. auch Aktivin A als Homodimer bestehend aus zwei jeweils 116 Aminosäuren umfassenden /JA-Untereinheiten.
Die Begriffe „Bone Morphogenetic Protein-2" bzw. „BMP-2", wie hierin verwendet, bezeichnen ein Polypeptid, das die reife Form von humanem BMP -2 umfasst. Insbesondere umfasst BMP-2 auch ein Polypeptid, dass die Sequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst (SEQ ID NO: 1 bezieht sich auf ein Monomer), d.h. die Aminosäuren 284-396 des humanen BMP-2-Vorläufer-Proteins (SEQ ID NO: 2, die Sequenz bezieht sich auf ein Monomer). BMP-2 kann insbesondere als Homodimer vorliegen.
Die Begriffe „Bone Morphogenetic Protein-4" bzw. „BMP-4", wie hierin verwendet, bezeichnen ein Polypeptid, das die reife Form des humanen BMP-4 umfasst. Insbesondere umfasst BMP -4 auch ein Polypeptid, dass die Sequenz von SEQ ID NO: 3 umfasst (SEQ ID NO: 3 bezieht sich auf ein Monomer), insbesondere die Aminosäuren 293-408 von humanem BMP-4 (SEQ ID NO: 4, die Sequenz bezieht sich auf ein Monomer). BMP -4 kann insbesondere als Homodimer vorliegen.
Der Begriff „Aktivin A", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Polypeptid, das die reife Form von humanem Aktivin A umfasst. Insbesondere umfasst Aktivin A auch ein Polypeptid, dass die Sequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst (SEQ ID NO: 5 bezieht sich auf ein Monomer), insbesondere die Aminosäuren 311-426 von humanem Aktivin A (SEQ ED NO: 6; /3A- Monomer). Es handelt sich dabei um ein Homodimer bestehend aus zwei jeweils 116 Aminosäuren umfassenden /3A-Untereinheiten.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem Aspekt eine synthetische Zusammensetzung, die ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, ein Polypeptid, das die Ammosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst, und Ascorbinsäure umfasst. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine synthetische Zusammensetzung, die BMP-2 (Bone Morphogenetic Protein-2), BMP-4 (Bone Morphogenetic Protein-4), Aktivin A und Ascorbinsäure umfasst. Neben den erwähnten Substanzen muss die erfindungsgemäße synthetische Zusammensetzung keine weiteren Substanzen umfassen, kann dies aber umfassen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in trockenem Zustand oder in flüssiger Form vorliegen. Die Zusammensetzung im trockenen Zustand eignet sich vor allem zur Langzeitlagerung. Insbesondere kann die Zusammensetzung im trockenen Zustand lyophilisiertes BMP-2, lyphilisiertes BMP-4 und lyophilisertes Aktivin A umfassen. Durch Zugabe von Wasser bzw. entsprechendem Puffer, z.B. PBS, Hepes etc. bzw. geeignetem Lösungsmittel wie 4 mM HCl (+ 0,1% Bovines Serumalbumin [BSA]) für BMP-2 und BMP-4; PBS (+ 0,1% BSA) für Aktivin A; PBS für Ascorbinsäure kann die Zusammensetzung im trockenen Zustand in eine Zusammensetzung im flüssigen Zustand überführt werden. Eine derartige Zusammensetzung ist dann weniger lange stabil, kann aber ohne großen Aufwand in der richtigen Konzentration einem Basal- bzw. Zellkulturmedium zugesetzt werden.
BMP -2 kann BMP-2 jeder Spezies sein, ist aber bevorzugt BMP -2 der Spezies, der auch die zu kultivierenden bzw. zu differenzierenden Zellen zuzuordnen sind. Vorzugsweise ist es BMP -2 aus Mensch, Maus, Ratte (da hier zu 100% konserviert) oder auch aus anderen Spezies, wie z.B. Rind, Schaf, Pferd oder Schwein, da die BMPs zwischen den Spezies hochkonserviert sind. Zur Erzielung der erfindungsgemäßen Wirkung können auch modifizierte Formen von BMP-2 bzw. Vorstufen verwendet werden, solange die Rezeptorbindungsstelle vorhanden ist. Die Rezeptorbindungsstelle von BMP-2 umfasst die Aminosäuren der Positionen 284-396 von SEQ ED NO: 2 (entspricht SEQ ID NO: 1). BMP-2 kann in gelöster Form oder als Trockensubstanz Teil der erfindungsgemäßen Zusammensetzung sein. BMP-2 kann rekombinanten Ursprungs sein.
BMP-4 kann BMP-4 jeder Spezies sein, ist aber bevorzugt BMP-4 der Spezies, der auch die zu kultivierenden bzw. zu differenzierenden Zellen zuzuordnen sind. Vorzugsweise ist es BMP-4 aus Mensch oder Maus (da hier zu 98 bis 100% konserviert), oder auch aus anderen Spezies, wie z.B. Ratte, Rind, Schaf, Pferd oder Schwein, da die BMPs zwischen den Spezies hochkonserviert sind. Zur Erzielung der erfindungsgemäßen Wirkung können auch modifizierte Formen von BMP-4 bzw. Vorstufen verwendet werden, solange die Rezeptorbindungsstelle vorhanden ist. Die Rezeptorbindungsstelle von BMP-4 umfasst die Aminosäuren der Positionen 293-408 von SEQ ID NO: 4 (entspricht SEQ DD NO: 3) BMP-4 kann in gelöster Form oder als Trockensubstanz Teil der erfmdungsgemäßen Zusammensetzung sein. BMP-4 kann rekombinanten Ursprungs sein.
Aktivin A kann Aktivin A jeder Spezies sein, ist aber bevorzugt Aktivin A der Spezies, der auch die zu kultivierenden bzw. zu differenzierenden Zellen zuzuordnen sind. Vorzugsweise ist es Aktivin A aus Mensch oder Maus (da hier zu 100% konserviert), oder auch aus anderen Spezies, wie z.B. Ratte, Rind, Schaf, Pferd oder Schwein, da Aktivin A zwischen den Spezies hochkonserviert ist. Zur Erzielung der erfindungs gemäßen Wirkung können auch modifizierte Foπnen von Aktivin A bzw. Vorstufen verwendet werden. Aktivin A kann rekombinanten Ursprungs sein.
Ascorbinsäure kann als Trockensubstanz in Form einer ihrer Salze vorliegen oder aber in gelöstem Zustand vorliegen. Der Begriff Ascorbinsäure bezeichnet insbesondere L- Ascorbinsäure.
hi einer weiteren Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung Stoffe, die eine analoge Wirkung wie BMP-2, BMP-4, Aktivin A und/oder Ascorbinsäure haben, z.B. weitere Mitglieder der TGF-ß-Superfamilie, die die zelluläre Proliferation und die Differenzierung fördern.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Zellkulturmedium bzw. ein Stammzelldifferenzierungsmedium, das die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst. Insbesondere umfasst das Zellkulturmedium bzw. Stammzelldifferenzierungsmedium die erfϊndungsgemäße Zusammensetzung, ist aber frei von fetalem Kälberserum. In einer besonderen Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Zellkulturmedium bzw. Stammzelldifferenzierungsmedium Advandced-DMEM und/oder KnockOut™-DMEM Serum Replacement.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfmdungsgemäße Stammzelldifferenzierungsmedium BMP-2 in einer Konzentration von ungefähr 1 ng/ml bis ungefähr 10 ng/ml, insbesondere in einer Konzentration von ungefähr 5 ng/ml, BMP-4 in einer Konzentration von ungefähr 0,06 ng/ml bis ungefähr 8 ng/ml, insbesondere in einer Konzentration von ungefähr 2 ng/ml, Aktivin A in einer Konzentration von ungefähr 1 ng/ml bis ungefähr 10 ng/ml, insbesondere mit einer Konzentration von 2 ng/ml und Ascorbinsäure in einer Konzentration von 10"7 bis 10"3 mol/L, insbesondere mit einer Konzentration von ungefähr 10-5 mol/L.
Das erfindungsgemäße Stammzelldifferenzierungsmedium kann in einer besonderen Ausfuhrungsform insbesondere noch Natriumselenit, Insulin und Transferrin umfassen.
Das erfindungsgemäße Stammzelldifferenzierungsmedium kann neben der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, einem Basalmedium, FKS und/oder Serumersatzmedium, auch noch Farbindikatoren, Stabilisatoren, Salze und Ionen, stabilisierende Proteine, z.B. BSA, umfassen. In einer besonderen Ausfuhrungsform umfasst die erfindungsgemäße Stammzelldifferenzierungsmedium als Differenzierungsfaktoren nur BMP-2, BMP-4 und Aktivin A, und Ascorbinsäure.
Die Zusammensetzungen zahlreicher Basalmedien sowie Zellkulturmedien sind im Stand der Technik bekannt, z.B. für Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI- 1640, Hanϊs F12, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) etc., und können somit zur Herstellung des erfindungsgemäßen Stammzelldifferenzierungsmediums verwendet werden. Bevorzugt wird zur Herstellung des erfindungsgemäßen Stammzelldifferenzierungsmediums Advanced-DMEM (tαvitrogen) in Kombination mit KnockOut™ Serum Replacement (SR; Invitrogen) verwendet.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung BMP -2 zur Verwendung in Kombination mit BMP-4, Aktivin A und Ascorbinsäure zur Herstellung und/oder Ergänzung eines Stammzelldifferenzierungsmediums.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung BMP-4 zur Verwendung in Kombination mit BMP -2, Aktivin A und Ascorbinsäure zur Herstellung und/oder Ergänzung eines Stammzelldifferenzierungsmediums.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Aktivin A zur Verwendung in Kombination mit BMP -2, BMP-4 und Ascorbinsäure zur Herstellung und/oder Ergänzung eines Stammzelldifferenzierungsmediums . In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Ascorbinsäure zur Verwendung in Kombination mit BMP-2, BMP-4 und Aktivin A und zur Herstellung und/oder Ergänzung eines Stammzelldifferenzierungsmediums .
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und/oder des Stammzelldifferenzierungsmediums im Rahmen eines Zelldifferenzierungsassays, insbesondere im Rahmen eines Embryonalen Stammzelltests (EST).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und/oder des Stammzelldifferenzierungsmediums im Rahmen der Grundlagenforschung auf dem Gebiet der Zell- und Entwicklungsbiologie zur Untersuchung von frühen funktionellen, kardiogenen Entwicklungsprozessen in vitro, insbesondere bei der gezielten Untersuchung zur Wirkung von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und/oder des Stammzelldifferenzierungsmediums im Rahmen von toxikologischen Untersuchungen, insbesondere im Rahmen der Reproduktionstoxikologie, wie zum Beispiel dem Einsatz in sicherheitstoxikologischen In-vitro- Testsystemen, z.B. zur Prüfung von Substanzen wie Chemikalien und Arzneimittelwirkstoffen, sowie von Strahlendosen auf Mutagenität, Zytotoxizität oder Embryotoxizität, insbesondere im Rahmen von Zelldifferenzierungsassays, z.B. des Embryonalen Stamzelltests (EST).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und/oder des Stammzelldifferenzierungsmediums im Rahmen von pharmakologischen Wirksamkeitsprüfungen und/oder Durchmusterungsverfahren, z.B. für die Suche nach antiangiogenen Substanzen, oder im Rahmen von elektrophysiologischen Analysen zur Untersuchung kardioaktiver Substanzen und/oder Arzneimittel in vitro.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und/oder des Stammzelldifferenzierungsmediums im Rahmen der Etablierung von Therapiemodellen, bei denen aus Stammzellen bestimmte Zelltypen entwickelt bzw. differenziert werden, die zur Therapie entsprechender Krankheiten eingesetzt werden können. Das betrifft z.B. die Differenzierung in Kardiomyozyten zur Therapie von Herzinfarkten oder z.B. die Herstellung neuronaler Stamnizellen zur Therapie von degenerativen Nervenerkrankungen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung bzw. das erfindungsgemäße Stammzelldifferenzierungsmedium kann im Prinzip in jedem Assay bzw. Kultivierungsverfahren eingesetzt werden. Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung bzw. das Stammzelldifferenzierungsmedium für Zeildifferenzierungsverfahren verwendet, in denen ein standardisiertes und exakt in seiner Zusammensetzung definiertes Zellkulturmedium erwünscht ist. So ist es zum Beispiel für den Differenzierungstest des embryonalen Stammzelltest (EST) wichtig, den Einfluss von toxischen Substanzen auf die Differenzierung embryonaler Stammzellen klar von den Einflüssen einer so Undefinierten Zusammensetzung wie FKS trennen zu können.
FKS war bisher ein notwendiger Bestandteil für die Herzmuskelzelldifferenzierung von ES- Zellen in vitro gewesen. Die FKS-Charge bestimmt durch ihre teils unbekannte Zusammensetzung (Zytokine) den Erfolg der Differenzierung. Oft sind Chargen ungeeignet und lassen die Zellen nicht differenzieren. Für die Durchführung des Differenzierungstests im EST sind deshalb gut geeignete Chargen absolute Voraussetzung. Eine solche Charge zu finden, ist allerdings sehr aufwendig, da im Vorfeld keine Angaben der Hersteller zur Eignung für die Stammzelldifferenzierung gemacht werden können, denn es gibt noch nicht die entscheidenden Hinweise, nach welchen Inhaltsstoffen für diesen Zweck zu suchen wäre. Eine Beurteilung zur Eignung gelingt also nur durch zeit- und kostenaufwendiges Ausprobieren.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung als Ergänzungsstoff zu Zelllαilturmedien. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Zusammensetzung als Zusatzmittel für Zellkulturmedien, die für die Differenzierung von Stammzellen geeignet sind bzw. verwendet werden. Wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung als Ergänzungsstoff zu Zellkulturmedien verwendet, so kann die Konzentration der einzelnen Komponenten vor Zusatz zum Medium konzentrierter sein als oben angegeben. Man spricht in so einem Fall von einer Vorrats- bzw. Stammlösung. In einer Ausführungsform liegt die Zusammensetzung vor Zusatz zum Basal- oder Zellkulturmedium als Feststoff vor. In einer besonderen Ausfuhrungsform wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung verwendet in Verfahren, die der Differenzierung von Stammzellen dienen, insbesondere der Differenzierung zu Herzmuskelzellen und/oder Nervenzellen.
In einer weiteren besonderen Ausfuhrungsform wird die erfmdungsgemäße Zusammensetzung zur Herstellung eines Stammzelldifferenzierungsmediums verwendet und kommerziell erhältlichen Basal- oder Zellkulturmedien zugesetzt. Beispiele für kommerzielle erhältliche Medien sind DMEM, Advanced-DMEM, KnockOut DMEM oder IMDM (Invitrogen, Karlsruhe).
In einer Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung zusammen mit fetalem Kälberserum dem Zellkulturmedium zugesetzt.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zusammen mit KnockOut™ Serum Replacement (Invitrogen) anstelle von FKS, Newborn CaIf Serum oder anderen natürlichen Seren verwendet.
Die Verwendung des Stammzelldifferenzierungsmediums der vorliegenden Erfindung führt primär zur Differenzierung in Herzmuskelzellen und neurale Zellen. Herzmuskelzellen können mit dem Mikroskop leicht nachgewiesen werden, da sie rhythmisch kontrahieren.
Zellen, die im erfindungsgemäßen Stammzelldifferenzierungsmedium - enthaltend die erfmdungsgemäße Zusammensetzung - kultiviert bzw. differenziert werden können, sind z.B. embryonale Stammzellen (ES-Zellen), postembryonale Stammzellen und/oder adulte Stammzellen. Die zu differenzierenden Stammzellen können insbesondere aus Maus oder Ratte, oder auch aus anderen Spezies z.B. Affe, Mensch, Rind, Schaf, Pferd oder Schwein stammen.
Nicht limitierende Beispiele für embryonale Stammzellen der Maus können z.B. ABl, AB2, Bl 17, BK4, BLC6, CCE, Dl, D3, E14, Fl, HMl, Rl oder W3-1-A sein. Die meisten dieser Zelllinien stammen aus den Blastozysten des Mausstammes 129 bzw. aus Kreuzungsvarianten mit diesem.
Assays, die Nutzen vom erfindungsgemäßen Stammzelldifferenzierungsmedium machen, können auf diese Weise standardisierte Bedingungen ohne Schwankungen aufgrund der Zusammensetzung des Kulturmediums gewährleisten. Weitere Tests und Differenzierungsverfahren, die von derartigen Bedingungen profitieren, sind grundsätzlich alle Assays, da ein Testsystem durch den Einsatz definierter Komponenten besser standardisierbar ist.
Mit Hilfe der erfϊndungsgemäßen Zusammensetzung bzw. des erfindungsgemäßen Stammzelldifferenzierungsmediums kann die Differenzierung von beispielsweise undifferenzierter ES-Zellen der Maus in funktionale, schlagende Herzmuskelzellen nun unter chemisch definierten, serumfreien Bedingungen erfolgen. Eine Standardisierbarkeit und eine hohe Reproduzierbarkeit ist damit gegeben.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit umfassend BMP-2, BMP- 4, Aktivin A und Ascorbinsäure wie hierin definiert.
Beispiele:
Beispiel 1 : Zusammensetzung fetaler Kälberseren
Die folgende Tabelle I illustriert die Zusammensetzung fetaler Kälberseren nach T. Lindl (ZeIl- und Gewebekultur, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin, 5. Auflage, 2002)
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
Beispiel 2: Vergleich von Medieninhaltsstoffen
Die folgende Tabelle illustriert den Vergleich der Medieninhaltsstoffe (mg/L) zwischen Advanced-DMEM und DMEM (nach Herstellerangaben).
Figure imgf000018_0001
Beispiel 3: Ersatz des fetalen Kälberserums im Differenzierungstest:
Zum Ersatz des FKS in Differenzierungstests wurde für die Kultivierung der undifferenzierten Stammzellen mit DMEM und 15% FKS durch zwei alternative Medien, dem Advanced-DMEM und dem KnockOut™-DMEM (Invitrogen, Karlsruhe) in Kombination mit einem Serumersatz
KnockOut™ Serum Replacement (SR) (Invitrogen, Karlsruhe), ergänzt. Das KnockOut™-SR wird für die Kultivierung und Differenzierung der Zellen mit der gleichen Konzentration (15%) eingesetzt, mit der auch das FKS verwendet wird. Die Kultivierung der Zellen erfolgte ansonsten nach im Stand der Technik bekannten Standardverfahren.
Die Zellen wurden nach dem Auftauen zunächst schrittweise an die neuen Medien (Advanced- DMEM und KnockOut™-DMEM) und den Serumersatz (KnockOut™-SR) adaptiert. Dabei wurde die FKS-Konzentration langsam von Passage zu Passage verringert und die Konzentration des Serumersatzes wurde schrittweise erhöht. Die schrittweise Adaption wurde während des routinemäßigen Passagierens der Zellen (z.B. Montag, Mittwoch und Freitag) in Anwesenheit von 1000 U/ml mLIF (Leukemia inhibitory factor) der Maus durchgeführt, so dass sie innerhalb von fünf Passagen abgeschlossen war. Im Anschluss an die Adaption wurden die Zellen noch für weitere drei Passagen in dem jeweiligen Medium in mit Gelatine beschichteten Zellkulturpetrischalen (0 6 cm) kultiviert, bevor sie unter dem Einsatz von spezifischen Wachstumsfaktoren zum Ersatz des FKS im Differenzierungstest verwendet worden sind. Die adaptierten Zellen können bis zur 21. Passage im Differenzierungstest eingesetzt werden.
Nach der Adaption der Zellen an die neuen Medien sowie den Serumersatz musste schließlich die Einsetzbarkeit der gewählten Komponenten in Bezug auf die Differenzierung der Zellen zu kontrahierenden Herzmuskelzellen im Differenzierungstest (siehe Figur 1) unter Verwendung verschiedener Wachstumsfaktoren ermittelt werden. In den Ansätzen wurde der Serumersatz RnockOut™-SR in Kombination mit dem Advanced-DMEM eingesetzt. Mit diesem Stammzelldifferenzierungsmedium wurden 2 Ansätze mit unterschiedlichen Kombinationen an Wachstumsfaktoren, d. h. BMP-2, BMP-4, Aktivin A und Ascorbinsäure im Ansatz I, und PDGF und SlP im Ansatz π hergestellt. Zusätzlich wurde zu jedem Ansatz eine Negativkontrolle, d.h. ein Ansatz mit dem entsprechenden Medium ohne die Zugabe von Wachstumsfaktoren (Advanced-DMEM + 15% KnockOut™-SR), mitgeführt. Anhand der Negativkontrollen kann überprüft werden, ob auch ohne die Faktoren eine Differenzierung erreicht werden kann. Als Positivkontrolle wurde ein Ansatz mit DMEM + 15% FKS eingesetzt (siehe Figur 1).
Die für den Einsatz im Differenzierungstest und damit zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen in kontrahierende Herzmuskelzellen ausgewählten Konzentrationen der vier Wachstumsfaktoren betrugen jeweils 5 ng/ml (BMP -2), 2 ng/ml (BMP-4), 2 ng/ml (Aktivin A), bzw, 10"5 mol/L (Ascorbinsäure).
Die Konzentrationen von PDGF und SlP in Ansatz 2 betrugen im Stammzelldifferenzierungsmedium: PDGF = 50 ng/ml, SlP = 5 μg/ml.
Die Zugabe der Wachstumsfaktoren zum Medium erfolgt erstmals am Tag 3 des Tests bei der Überführung der Zellen in die Suspensionskultur und wurde am Tag 5 des Tests beim Überführen der „embryoid bodies" (EBs) in die 24-Lochplatte wiederholt. Die Zugabe der Wachstumsfaktoren kann aber auch früher erfolgen, z.B. am Tag 0.
Am Tag 0 des Differenzierungstests wurden nach dem Passagieren der entsprechend kultivierten Zellen jeweils 3 Petrischalen mit 50 hängenden Tropfen pro Petrischale hergestellt. Zusätzlich wurde pro Mediumansatz eine Petrischale mit 50 Tropfen für die Negativkontrolle angelegt. Eine weitere Petrischale mit 50 Tropfen für die Positivkontrolle wurde mit den Zellen, die im DMEM mit 15% FKS kultiviert wurden, angesetzt.
Am Tag 3 des Tests wurden die EBs, die sich in den hängenden Tropfen gebildet hatten, mit dem entsprechenden Medium vom Deckel der Petrischale abgespült. Die EBs wurden in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen pipettiert. Nachdem die EBs auf den Boden des Röhrchens gesunken waren, wurde der Medienüberstand abgesaugt. Anschließend wurden die EBs in 5 ml Medium aufgenommen, das mit den entsprechenden Konzentrationen der jeweiligen Wachstumsfaktoren (siehe oben) ergänzt wurde, beziehungsweise für die Positiv- und Negativkontrollen keine Wachstumsfaktoren enthielt.
Am Tag 5 wurde jeder EB einzeln mit Hilfe einer Pipette in ein Loch einer 24-Lochplatte überführt. Die 24-Loch-Platten wurden zuvor mit einer 0,1%-igen Gelatine-Lösung beschichtet, um den EBs das Anheften und Ausbreiten in der Platte zu ermöglichen. Für die Ansätze I und II wurden dem Medium die entsprechenden Mengen der jeweiligen Wachstumsfaktoren wie oben angegeben zugefügt.
Die lichtmikroskopische Auswertung der Ansätze erfolgte an den Tagen 7, 10, 12 und in einigen Fällen auch am Tag 14 nach Beginn des Experiments. Für jeden Ansatz wurden mindestens drei voneinander unabhängige Versuche durchgeführt.
Beispiel 4: Statistik
In Figur 1 sind die Ergebnisse aus den Experimenten zum Ersatz des FKS dargestellt. Die Ergebnisse sind als Balkendiagramme aufgeführt, wobei jeweils Einzelwerte gezeigt werden. Für die Gesamtdarstellung wurde das arithmetische Mittel verwendet. Bei den Versuchen zum Ersatz des FKS wird der Standardfehler (SEM, Standard error of the mean) aus den Ansätzen aufgeführt.
Zur Überprüfung der Mittelwerte auf Signifikanz wurde die Varianzanalyse mit anschließendem Mittelwertvergleich (nach Tukey) angewendet. Eine Überprüfung der Testvoraussetzungen in Bezug auf eine Normalverteilung und Varianzhomogenität der einzelnen Versuchswerte erfolgte mit dem Levene-Test. Alle Analysen wurden mit dem Statistikprogramm SPSS Version 11.5 durchgeführt.
Beispiel 5: Durchführung eines Differenzierungstests unter Verwendung der stark embrvotoxischen Substanz 5-Fluorouracil
Es wurde jeweils ein Ansatz mit dem Standardmedium DMEM + 15% FKS parallel zu einem Ansatz mit Advanced-DMEM + 15% Serumersatz und spezifischen Faktoren angesetzt. Die Versuche wurden an den Tagen 10 und 12 der Differenzierung lichtmikroskopisch ausgewertet. Beim Einsatz von 15% FKS wurden am Tag 10 und beim Einsatz des serumfreien Mediums am Tag 12 valide Versuchsergebnisse mit mindestens 21 von 24 Löchern mit kontrahierenden Herzmuskelzellen in den Kontrollen erhalten. Die Darstellung der Ergebnisse aus diesen Versuchen erfolgte in Konzentrations-Wirkungskurven. Anhand der aus den Kurven abzulesenden IDso-Werte, d.h. die Konzentrationen der Testsubstanzen, bei denen die Differenzierung der ES-Zellen zu Herzmuskelzellen zu 50% gehemmt wird, wird deutlich, dass die aus beiden Versuchen erhaltenen Werte miteinander vergleichbare Ergebnisse erzielen. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen sind in Figuren 2a und 2b dargestellt.

Claims

Patentansprüche
1. Synthetische Zusammensetzung, die folgendes umfasst: a) ein Polypeptid, dass die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, b) ein Polypeptid, dass die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 umfasst, c) ein Polypeptid, dass die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst, d) Ascorbinsäure
2. Synthetische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid aus a) BMP-2 ist, das Polypeptid aus b) BMP-4 ist, und/oder das Polypeptid aus c) Aktivin A ist.
3. Synthetische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung nur die genannten Substanzen enthält.
4. Zellkulturmedium, das die synthetische Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3 umfasst.
5. Zelllculturmedium nach Anspruch 4, wobei das Zellkulturmedium frei von fetalem Kälberserum ist.
6. Zellkulturmedium nach einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei das Zellkulturmedium folgendes umfasst:
a) das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst, in einer Konzentration von ungefähr 1 ng/ml bis ungefähr 10 ng/ml, insbesondere in einer
Konzentration von ungefähr 5 ng/ml, b) das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:3 umfasst, in einer Konzentration von ungefähr 0,06 ng/ml bis ungefähr 8 ng/ml, insbesondere in einer Konzentration von ungefähr 2 ng/ml, c) das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst, in einer
Konzentration von ungefähr 1 ng/ml bis ungefähr 10 ng/ml, insbesondere mit einer Konzentration von 2 ng/ml, und/oder d) Ascorbinsäure in einer Konzentration von 10"7 bis 10"3 mol/L, insbesondere mit einer Konzentration von ungefähr 10"5 mol/L.
7. Zellkulturmedium nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Zellkulturmedium Ascorbinsäure und als Differenzierungsfaktoren nur die genannten drei Polypeptide umfasst.
8. Zellkulturmedium nach einem der Ansprüche 4-7, wobei das Zelllculturmedium zur Differenzierung von Stammzellen verwendet werden kann.
9 Verwendung einer der Substanzen wie in Anspruch 1 definiert zur Herstellung eines
Zellkulturmedium wie in Anspruch 4 definiert.
10. Verwendung der synthetischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder des Zellkulturmediums nach einem der Ansprüche 4 bis 8 bei der Untersuchung von frühen funktionellen, kardiogenen Entwicklungsprozessen in vitro, bei toxikologischen Untersuchungen, bei pharmakologischen Wirksamkeitsprüfungen, bei Durchmusterungsverfahren zur Identifizierung neuer Wirkstoffe, bei elektrophysiologischen
Untersuchungen zur Wirksamkeit kardioaktiver Wirkstoffe und/oder bei der Etablierung von Zelltherapie- und Transplantationsmodellen.
11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die toxikologischen Untersuchungen reproduktionstoxikologische Untersuchungen sind, insbesondere zur Prüfung von Substanzen und Strahlendosen auf Mutagenität, Zytotoxizität und/oder Embryotoxizität.
12. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Durchmusterungsverfaliren der Identifizierung antiangiogener Substanzen dient.
13. Verwendung des Zelllculturmediums nach einem der Ansprüche 4-8 zur Differenzierung von Stammzellen, insbesondere von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen), postembryonalen Stammzellen und/oder adulten Stammzellen.
14. Verwendung des Zellkulturmediums nach Anspruch 13, wobei die Zellen, embryonalen Stammzellen (ES-Zellen), postembryonalen Stammzellen und/oder adulten Stammzellen zu Herzzellen und/oder Nervenzellen differenziert werden.
15. Kit umfassend: a) ein Polypeptid, dass die Anαinosäuresequenz von SEQ TD NO: 1 umfasst, b) ein Polypeptid, dass die Arninosäuresequenz von SEQ DD NO: 3 umfasst, c) ein Polypeptid, dass die Aminosäuresequenz von SEQ HD NO: 5 umfasst, und d) Ascorbinsäure.
16. Verwendung des Kits nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Zellkulturmediums, insbesondere zur Herstellung eines Stammzelldifferenzierungsmediums.
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