DE60009956T2

DE60009956T2 - Wachstumsfaktoren und l-glutamin enthaltendes zellkulturmedium

Info

Publication number: DE60009956T2
Application number: DE60009956T
Authority: DE
Inventors: Dick Joost DE BRUIJN; Johannes Gerhardus TIBBE; Claudia Sandra DA SILVA MADUREIRA MENDES
Original assignee: Iso Tis NV
Current assignee: OctoPlus Sciences BV
Priority date: 1999-12-28
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2005-04-28
Anticipated expiration: 2020-12-28
Also published as: DK1242578T3; US20030017588A1; DE60009956D1; CA2395271A1; EP1242578A1; US6838284B2; TR200401091T4; WO2001048147A1; JP2003518378A; WO2001048147A9; AU780653B2; ATE264385T1; ES2217031T3; EP1242578B1; AU3246101A

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet des "tissue engineerings" (Zell- und Gewebetechnik). Insbesondere betrifft die Erfindung ein Medium und ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen.
Der Bedarf nach Austauschteilen für den menschlichen Körper in Kombination mit dem Engpass von Donor-Geweben und/oder -Organen hat zur Produktion von Austauschgeweben durch Züchten von Zellen auf oder in einem Gerüst geführt. Irgendwann soll dies zu "tissue engineering"-Produkten führen, die fertig zur Implantation sind, um die Funktion von fehlenden oder verletzten Körperteilen zu übernehmen.
Das Gerüst (scaffold) definiert die Konstruktionsform und die Dimensionen des zu implantierenden Austauschmaterials. Bevorzugt wird es aus einem porösen oder faserartigen, biologisch abbaubaren Material hergestellt, so dass der Abbau des Gerüstes parallel zur Akkumulation der Gewebskomponenten (Wachstum und Synthese der extrazellulären Matrix (ECM)) verläuft. Somit wird die Funktion des Gerüstes, die Bereitstellung von Form und Festigkeit, allmählich von den gebildeten Gewebskomponenten übernommen.
Im Hinblick auf die Tatsache, dass Zellen aus allogenen Quellen im allgemeinen abgestoßen werden, werden bevorzugt autologe Zellen, die aus Gewebsbiopsien des Patienten, der behandelt wird, isoliert werden, verwendet. Um das Ausmaß der erforderlich Biopsie und die Zeit, die für die Zellexpansion erforderlich ist, zu minimieren, müssen die expandierten Zellen zunächst in/auf dem Gerüst in effizienter Weise aufgebracht werden. Zusätzlich sollten die Zellen homogen im gesamten Gewebe verteilt sein, um die kontinuierliche Neugewebsbildung zu erlauben.
Im allgemeinen werden die Zellen, die aus dem Körper des Patienten entnommen wurden, in vitro für einen gewissen Zeitraum kultiviert entweder mit oder ohne vorhandenes Gerüstmaterial. Während dieses Kultivierungszeitraums findet die Proliferation und/oder Differenzierung der Zellen statt, abhängig vom Typ der entnommenen Zellen und dem Zieltyp des Gewebes.
In der Literatur und auf dem Markt sind verschiedene Zellkulturmedien bekannt. Diese enthalten üblicherweise Glukose, anorganische Salze (Mineralien), Aminosäuren und Vitamine. Andere Bestandteile, die manchmal verwendet werden, schließen Ribonukleoside, Desoxyribonukleoside und Antibiotika ein. Gut bekannte, kommerziell erhältliche Kulturmedien sind z.B. Dulbecco's Modified Minimal Eagle's Medium (DMEM) und Alpha Minimal Eagle's Medium (α-MEM).
In dem US-Patent 5 197 985 wird ein Verfahren offenbart zur Verbesserung der Implantation und Differenzierung der aus dem Knochenmark abgeleiteten Mesenchymal-Zellen. Es wird berichtet, dass das Verfahren insbesondere als Mittel zur Behandlung von Skelett- und anderen Bindegewebsstörungen in Menschen dienen soll. Für die Kultivierung der Mesenchymal-Zellen wurde ein Medium verwendet, das kommerziell erhältliches BGJ_b-Medium (Fitton-Jackson-Modifizierung) und ausgewählte Anteile von fötalem Rinderserum umfasst. Weiterhin wurde das Medium F-12 Nährstoffmischung (Ham) für die selektive Trennung der Knochenmarks-abgeleiteten Mesenchymal-Zellen verwendet.
Die Herstellung von Gewebstechnik-Produkten wird im allgemeinen erst dann begonnen, wenn der Typ der Verletzung oder der Störung bekannt ist, und über eine spezifische Behandlungsweise entschieden wurde. Während das "tissue engineering" durchgeführt wird, leidet der Patient in der Zwischenzeit unter seinen Verletzungen oder Störungen. Um daher die Unannehmlichkeiten des Patienten zu minimieren ist es von großer Bedeutung, dass die Herstellung der gezüchteten Gewebe so schnell wie möglich verläuft. Ein Nachteil der am meisten bekannten Kulturmedien besteht darin, dass sie keine ausreichend schnelle Proliferation und/oder Differenzierung der Zellen, die darin kultiviert werden, erlauben. Dieser Nachteil ist besonders deutlich, wenn Humanzellen kultiviert werden.
Die vorliegende Erfindung versucht ein Kulturmedium bereitzustellen, worin die Zellen sehr schnell proliferieren und/oder differenzieren. Das gewünschte Kulturmedium erlaubt eine Verringerung des Zeitraums, der – verglichen mit konventionellen Kulturmedien – für das Kultivieren der Zellen in der Behandlung von Patienten erforderlich ist, mittels des Gewebstechnikansatzes.
Es wurde überraschend gefunden, dass die Geschwindigkeit der Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen signifikant verbessert werden kann durch Kultivieren davon in einem Medium, das einen Wachstumsfaktor und eine erhöhte Konzentration von L-Glutamin enthält. Die Erfindung betrifft daher ein Kulturmedium, das Glukose, Mineralien, Vitamine, Wachstumsfaktoren und L-Glutamin umfasst, worin das L-Glutamin in einer Konzentration von mindestens 300 mg/L vorhanden ist.
Es wurde gefunden, dass Humanzellen viel schneller in dem Kulturmedium gemäß der Erfindung proliferieren als in konventionellen Kulturmedien. Außerdem wurde gefunden, dass die Differenzierung von Zellen, die fähig zur Differenzierung sind, ebenfalls sehr viel schneller verläuft als in konventionellen Kulturmedien. Diese gesteigerte Kultivierungsgeschwindigkeit ist vorteilhaft, wenn das Kulturmedium für die Herstellung von Gewebstechnikprodukten für die Behandlung eines Patienten verwendet wird.
Das Kulturmedium umfasst verschiedene Komponenten, die in einer geeigneten Flüssigkeit, bevorzugt destilliertes Wasser, gelöst oder suspendiert sind. Da in dem Medium Zellen kultiviert werden, ist es klar, dass es von Vorteil ist, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, um eine mikrobielle Kontaminierung der Kulturen zu verhindern.
Um die Zellen zu kultivieren, ist es notwendig, dass ausreichend Nährstoffe in dem Kulturmedium vorhanden sind. Zu diesem Zweck umfasst das vorliegende Kulturmedium Glukose, Mineralien und Vitamine.
Glukose ist ein bedeutender Bestandteil in einem Kulturmedium. Gemäß der Erfindung ist es bevorzugt, dass die Konzentration der Glukose mindestens 750 mg/L, bevorzugter zwischen 900 und 2000 mg/L beträgt.
Die Mineralien können zweckmäßig aus der Gruppe von Calcium, Kalium, Lithium, Magnesium, Natrium, Sulfat, Chlorid, Bicarbonat, Dihydrogenphosphat-Ionen und Kombinationen davon ausgewählt werden. Besonders geeignete Mineralien sind Calciumchlorid, bevorzugt in einer Menge von 100–400 mg/L, Kaliumchlorid, bevorzugt in einer Menge von 200–600 mg/L, Natriumchlorid, bevorzugt in einer Menge von 5500–8000 mg/L, Magnesiumsulfat, bevorzugt in einer Menge von 100–300 mg/L, Natriumbicarbonat, bevorzugt in einer Menge von 1500–3000 mg/L, und Natriumdihydrogenphosphat, bevorzugt in einer Menge von 100–200 mg/L. Die Konzentrationen dieser Mineralien können in weiten Bereichen variiert werden. Typischerweise wird die kombinierte Menge der Mineralien in dem Kulturmedium gemäß der Erfindung so ausgewählt, dass nahezu physiologische Bedingungen resultieren (ungefähr 0,9%).
Die Vitamine werden geeignet ausgewählt aus der Gruppe von L-Ascorbinsäure, Biotin, D-Calciumpantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, i-Inositol, Nikotinamid, Pyridoxal, Riboflavin, Thiamin, Vitamin B₁₂, Vitamin A (Retinsäure) und Kombinationen davon. Diese können in folgenden bevorzugten Konzentrationen vorliegen:
Es ist weiterhin bevorzugt, dass das vorliegende Kulturmedium Aminosäuren umfasst. Zweckmäßig werden diese Aminosäuren aus der folgenden Gruppe in den angegebenen Konzentrationen ausgewählt:
Die vereinigten Konzentrationen der Aminosäuren liegen bevorzugt zwischen 800 und 5000 mg/L. Es ist darauf hinzuweisen, dass dieser Konzentrationsbereich L-Glutamin nicht einschließt.
L-Glutamin ist eine bedeutende Komponente des Kulturmediums gemäß der Erfindung. Es wurde gefunden, dass eine Konzentration von L-Glutamin von mindestens 300 mg/L, bevorzugt zwischen 400 und 800 mg/L zu einer besonders hohen Proliferation und/oder Differenzierungsgeschwindigkeit der Zellen, die in dem vorliegenden Kulturmedium kultiviert werden, führt.
Eine weitere Komponente des Kulturmediums gemäß der Erfindung ist der Wachstumsfaktor. Die Natur des Wachstumsfaktors kann geeignet von dem Typ von Zellen, die kultiviert werden, ausgewählt werden. Beispiele bevorzugter Wachstumsfaktoren sind das morphogenetische Knochenprotein (Bone Morphogenetic Protein (BMP)), der epidermale Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor (EGF)), der basische Fibroblast-Wachstumsfaktor (basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)), der Nervenwachstumsfaktor (Nerve Growth Factor (NGF)), der Knochenwachstumsfaktor (Bone Derived Growth Factor (BDGF)), der transformierende Wachstumsfaktor-β1 (Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1)) und das Humanwachstumshormon (human Growth Hormone (hGH)). In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Kulturmedium verwendet, um Zellen zu kultivieren, die für die Gewebskonstruktion von Knochen verwendet werden. Gemäß dieser Ausführungsform ist der Wachstumsfaktor bevorzugt bFGF. Der Wachstumsfaktor ist bevorzugt in einer Menge zwischen 0,1 μg/L und 10 μg/L vorhanden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das vorliegende Kulturmedium weiterhin Antibiotika oder eine Kombination von Antibiotika.
Beispiele der geeigneten Antibiotika schließen Penicillin G, Gentamicin, Fungizon, Streptomycin ein. Es wurde überraschend gefunden, dass die Natur des Antibiotikums die Kultivierungsgeschwindigkeit der Zellen in dem vorliegenden Kulturmedium beeinflusst. Eine sehr bevorzugte Kombination von Antibiotika ist Penicillin G und Streptomycin. Diese Antibiotika werden bevorzugt jeweils in einer Menge von 50–150 μg/mL, noch bevorzugter werden sie beide in einer Menge von 100 μg/mL verwendet. Die Gesamtmenge der Antibiotika in dem Kulturmedium gemäß der Erfindung liegt bevorzugt zwischen 75 und 300 mg/ml.
Das Kulturmedium umfasst weiterhin beliebige Bestandteile, die konventionelle in Kulturmedien verwendet werden. Beispiele solcher Bestandteile schließen ein: Seren, wie fötales Rinderserum, autologes Serum oder synthetisches Serum (z.B. Ultrocer^®), Thioctansäure, Phenol-Rot, Natriumpyruvat, Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside. Ribonukleosid oder Desoxyribonukleosid sind bevorzugt in einer Konzentration von zwischen 5 und 15 mg/L vorhanden. Es ist darauf hinzuweisen, dass, wenn ein Serum verwendet wird, es zugegeben wird, nach der Formulierung des Kulturmediums. Mit anderen Worten verdünnt die Menge des zugegebenen Serums die Konzentrationen, die hier erwähnt sind. Fötales Rinderserum kann in einer solchen Menge zugegeben werden, dass die Zusammensetzung des Serums und des Kulturmediums zwischen 5 und 15 Vol.-% des Serums umfasst. Ultrocer^® kann in einer solchen Menge zugegeben werden, dass die Zusammensetzung von Serum und Kulturmedium zwischen 1 und 10 Vol.-% des Serums umfasst.
Wie oben erwähnt wurde, ist das vorliegende Kulturmedium besonders nützlich für die Kultivierung humaner Zellen, z.B. in einem Verfahren zur Herstellung von Gewebskonstruktionsprodukten, wie Hautimplantaten, Knochenimplantaten. Es wurde gefunden, dass das vorliegende Kulturmedium besonders vorteilhaft für die in vitro-Herstellung von Knochengewebe ist. Mehr osteogene Zellen werden gebildet, was zu einem höheren Erfolg der Knochenbildung nach der Implantation führt, wenn die Zellen in dem Kulturmedium gemäß der Erfindung kultiviert werden, verglichen mit konventionellen Kulturmedien.
Im Prinzip können die Zellen eines beliebigen Typs in dem Kulturmedium gemäß der Erfindung kultiviert werden. Bevorzugte Zelltypen schließen ein: Stammzellen, Progenitor-Zellen, Mesenchymal-Zellen, Epithelial-Zellen, Knorpel-Zellen, Knochen-Zellen, Muskel-Zellen, Drüsen-Zellen, Fett-Zellen, Pericyten, Satelliten-Zellen und Haut-Zellen. Hochbevorzugte Zellen, die in dem vorliegenden Kulturmedium kultiviert werden, sind Progenitor-Zellen, die in Knochen differenzieren können. Die Differenzierung der Zellen kann erleichtert werden durch die Anwesenheit von Wachstumsfaktoren, wie das Knochen-morphogenetische Protein, oder Dexamethason, das bevorzugt in einer Menge von zwischen 1 × 10^–9 und 1 × 10^–7 μg/L verwendet wird. Die Zellen können in Gegenwart eines Gerüstes oder ohne ein Gerüst kultiviert werden. Wenn die Zellen in Gegenwart eines Gerüstes kultiviert werden, können sie zunächst zweckmäßig auf oder in das Gerüst in jeder bekannten Weise geimpft werden.
Die Erfindung wird nun im Hinblick auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele erläutert.
Beispiel I
Ein Kulturmedium wurde hergestellt durch Mischen der folgenden Bestandteile in spezifischen Konzentrationen in Wasser:
Beispiel II
Einführung
Um humane Knochenmarkszellen (HBMC's) effektiv zu kultivieren, ist es notwendig, ein geeignetes Zellkulturmedium zu entwickeln. Wir verglichen zwei verschiedene Medien, um den Typ zu untersuchen, der am meisten geeignet ist für das Kultivieren der HBMC's und um zu sehen, ob es einen Unterschied gibt in der in vivo Knochenbildung nach der Kultivierung dieser Zellen auf einem CaP-Gerüst. Wir unternahmen verschiedene Studien an HBMC, die von vielen verschiedenen Patienten stammten, unter Verwendung von entweder α-MEM, enthaltend 10%iges fötales Rinderserum (FBS), 0,2 mM L-Ascorbinsäure-2-phosphat (AsAP), 0,1 mg/mL Penicillin G, 50 μg/mL Gentamicin und 0,3 μg/mL Fungizon (AB) oder einem α-MEM, enthaltend 10%iges FBS, 0,2 mM L-Ascorbinsäure-2-phosphat (AsAP), 1 ng/mL basischer Fibroblast-Wachstumsfaktor (bFGF), 2 mM L-Glutamin (L-Glu), 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin (pen/strep) und 1% (50 U/mL) Heparin (nur in Primärkulturen zugegeben) und verglichen die Morphologie, die Wachstumsgeschwindigkeit und die Knochenbildung. Es wurde gefunden, dass die Kombination von L-Ascorbinsäure, Heparin, bFGF, L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin in unserem Kulturmedium das Zellwachstum verbesserte und ein höheres Ausmaß der Knochenbildung zeigte.
Material und Methoden
Humane Knochenmarkszellisolierung und Kultur
Methode A
Knochenmarkaspirat wurde erhalten vom Beckenkamm eines Patienten. Kurz wurden 5 mL des Aspirates erneut suspendiert in 20 mL α-MEM, enthaltend 50 U/mL Heparin und 10%iges fötales Rinderserum. Die Zellsuspension wurde dann erneut suspendiert unter Verwendung einer 20G-Nadel und für 10 Minuten bei 300 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde verworfen und das Zellpellet erneut suspendiert in α-MEM, enthaltend 10% FBS, 0,2 mM L-Ascorbinsäure-2-phosphat (AsAP), 0,1 mg/mL Penicillin G, 50 μg/mL Gentamicin und 0,3 μg/mL Fungizon (AB). Die erhaltenen mononukleierten Zellen wurden anschließend mit einer Dichte von ± 500000 Zellen/cm² in Gewebskulturkolben plattiert. Die Zellen wurden bei 37°C mit 5% CO₂ unter einer feuchten Atmosphäre gezüchtet. Das Kulturmedium wurde zweimal je Woche erneuert und bei naher Konfluenz der anhaftenden Zellen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und enzymatisch durch Inkubieren der Zellen mit 0,25%iger Trypsin-EDTA-Lösung bei 37°C für mindestens 10 Minuten freigesetzt. Die freigesetzten Zellen wurden dann sorgfältig resuspendiert und erneut plattiert bei einer Dichte von 5000–10000 Zellen/cm², nachfolgende Passagen (bis zur fünften Passage) wurden durchgeführt, wenn die Zellen nahe Konfluenz erreichten, und die Zellmorphologie wurde mit einem Lichtmikroskop überwacht.
Methode B
Knochenmarkaspirat wurde erhalten vom Beckenkamm eines Patienten. Kurz wurden 5 mL des Aspirates erneut suspendiert in 20 mL α-MEM, enthaltend 50 U/mL Heparin und 10%iges fötales Rinderserum. Die Zellsuspension wurde dann erneut suspendiert unter Verwendung einer 20G-Nadel und für 10 Minuten bei 300 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde verworfen und der Zellpellet wurde erneut suspendiert in α-MEM, enthaltend 10% FBS, 0,2 mM AsAP, 1 ng/mL bFGF, 2 mM L-Glutamin (L-Glu), 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin (pen/strep) und 1% (50 U/mL) Heparin (nur bei den Primärkulturen zugegeben). Die erhaltenen mononukleierten Zellen wurden anschließend mit einer Dichte von ± 500000 Zellen/cm² in Gewebskulturkolben plattiert. Die Zellen wurden bei 37°C mit 5% CO₂ unter einer feuchten Atmosphäre gezüchtet. Das Kulturmedium wurde zweimal je Woche erneuert und bei naher Konfluenz der anhaftenden Zellen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und enzymatisch durch Inkubierung der Zellen mit 0,25%iger Trypsin-EDTA-Lösung bei 37°C für mindestens 10 Minuten freigesetzt. Die freigesetzten Zellen wurden dann sorgfältig resuspendiert und erneut plattiert bei einer Dichte von 5000–10000 Zellen/cm², nachfolgende Passagen (bis zur fünften Passage) wurden durchgeführt, wenn die Zellen die nahe Konfluenz erreichten, und die Zellmorphologie wurde mit einem Lichtmikroskop überwacht.
In vivo Experimente und Histologie
Poröse CaP-Partikel der Größe 2 bis 3 mm wurden für die Kultivierung der freigesetzten HBMC's darauf verwendet. Kurz wurden die geernteten HBMC's der verschiedenen Passagen mit einer Dichte von 100000–200000 Zellen/Partikel gesät. Die Zellen wurden während einer Woche unter Verwendung von α-MEM, enthaltend 10% FBS, 0,2 mM AsAP, 10 nM Dexamethason (Dex) und 10 mM β-Glycerophosphat (βGP) vor der Implantation kultiviert.
Kurz vor der Implantation wurden die Proben in α-MEM aufgesaugt, in PBS gewaschen und subkutan in eine Nacktmaus implantiert und in vivo für 4–6 Wochen gehalten. Kontrollbeispiele inkubiert in beiden Medien, ohne Zellen, wurden auch implantiert. Am Ende der in vivo Periode wurden die implantierten Proben entfernt und sofort fixiert in 1,5%igem Glutaraldehyd in 0,14 M Cacodylsäurepuffer, pH 7,2–7,4.
Nach Dehydration in einer Alkoholreihe und Einbetten in Methylmethacrylat wurden die Proben auf einer histologischen Diamanten-Innenschlosssäge (Leyden Microtom-Schneidsystem) geschnitten. Die Schnitte von ungefähr 10 μm wurden mit basischem Fuchsin und Methylenblau gefärbt, um die Knochenbildung zu untersuchen. Die Schnitte wurden dann je Patient hinsichtlich der Knochenbildung bewertet.
Ergebnisse
Morphologie
Medium mit AB (Methode A): 1 zeigt, dass häufig eine größere flachere Zellmorphologie beobachtet wurde. Das Zellwachstum war beschränkt, und es gab nur gelegentlich Knochenbildung, die nach subkutaner Implantation beobachtet wurde.
Verbessertes Medium (Methode B): 2 zeigt, dass Zellen mit Spindelform und Fibroblasten-Morphologie erhalten wurden. Eine rasche Zellproliferation wurde beobachtet. Auch die De Novo-Knochenbildung nach subkutaner Implantation war weit verbreitet (siehe 3).
4 zeigt einen Vergleich der Wachstumskurven der mit den Methoden A und B kultivierten Zellen.
5 zeigt einen Vergleich von 22 Patienten, die mit Methode A kultiviert wurden 15 Patienten, die mit Methode B kultiviert wurden in Bezug auf die Knochenbildung.
Diskussion
HBMC kultiviert gemäß der Methode B zeigte eine lineare Kulturexpansion verglichen mit dem HBMC kultiviert gemäß Methode A. Die Wachstumsgeschwindigkeit der beiden Methoden die beobachtet wurde, zeigte, dass das Kultivieren von HBMC gemäß Methode B in einer höheren Wachstumsgeschwindigkeit resultiere, als für die Methode A beobachtet.
Rechtzeitiges Kultivieren von HBMC mit α-MEM, enthaltend 10% FBS, 0,2 mM AsAP, 0,1 mg/mL Penicillin G, 50 μg/mL Gentamicin und 0,3 μg/mL Fungizon (Methode A) zeigte eine Abnahme im Zellwachstum. Die Verwendung eines Kulturmediums, das bFGF, L-Glu, pen/strep, AsAP umfasste, mit der Zugabe von 50 U/mL Heparin in die Primärkulturen, zeigte eine verbesserte Morphologie, Wachstumsgeschwindigkeit und in vivo den osteogenen Charakter der Zellen, nachdem sie zur Osteoprogenitor-Differenzierung mit Dexamethason angeregt worden waren.

Claims

Kulturmedium, umfassend Glukose, ein Mineral, ein Vitamin, ein Wachstumsfaktor und L-Glutamin, worin das L-Glutamin in einer Konzentration von mindestens 300 mg/l vorhanden ist und worin das Vitamin L-Askorbinsäure in einer Menge zwischen 75 und 1500 mg/l ist.
Kulturmedium gemäß Anspruch 1, worin das L-Glutamin in einer Konzentration zwischen 400 und 800 mg/l vorhanden ist.
Kulturmedium gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die L-Askorbinsäure in Form von L-Askorbinsäure-2-phosphat zugesetzt wird.
Kulturmedium gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe des knochenmorphogenetischen Proteins (BMP = Bone Morphogenetic Protein), des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF = Epidermal Growth Factor), des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF = basic Fibroblast Growth Factor), des Nervenwachstumsfaktors (NGF = Nerve Growth Factor) des von knochenabgeleiteten Wachstumsfaktors (BDGF = Bone Derived Growth Factor), des transformierenden Wachstumsfaktors-β1 (TGF-β1 = Transforming Growth Factor-β1) und des menschlichen Wachstumshormons (hGH = human Growth Hormone).
Kulturmedium gemäß Anspruch 4, worin der Wachstumsfaktor bFGF ist.
Kulturmedium gemäß Anspruch 5, worin der bFGF in einer Konzentration zwischen 0,1 und 10 μg/l vorhanden ist.
Kulturmedium gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Mineral eines oder mehrere Ionen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe von Calcium, Kalium, Lithium, Magnesium, Natrium, Sulfat, Chlorid, Bicarbonat und Dihydrogenphosphat als Ionen.
Kulturmedium gemäß Anspruch 7, worin das Mineral in einer Konzentration zwischen 5 und 15 g/l vorhanden ist.
Kulturmedium gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Vitamin ausgewählt ist aus der Gruppe von Biotin, D-Calciumpantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, i-Inositol, Nicotinamid, Pyridoxal, Riboflavin, Thiamin, Vitamin B₁₂, Vitamin A und Kombinationen derselben.
Kulturmedium gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend eine oder mehrere Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe von L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystin, L-Cystein, L-Glutaminsäure, L-Alanyl-L-glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin.
Kulturmedium gemäß Anspruch 10, worin die Aminosäuren in einer Konzentration zwischen 0,8 und 5 g/l vorhanden sind.
Kulturmedium gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend ein Antibiotikum.
Kulturmedium gemäß Anspruch 12, worin das Antibiotikum ausgewählt ist aus der Gruppe von Penicillin G, Gentamycin, Fungizon und Streptomycin.
Kulturmedium gemäß Anspruch 13, umfassend als Antibiotikum eine Kombination von Penicillin G und Streptomycin, worin sowohl Penicillin G als auch Streptomycin in einer Menge von 50–150 μg/ml vorhanden sind.
Kulturmedium gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend Dexamethason.
Kulturmedium gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend destilliertes Wasser.
Kulturmedium gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend eine Ribonucleosid und/oder ein Desoxyribonucleosid.
Kulturmedium gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, zu dem Serum zugesetzt ist.
Verwendung eines Kulturmediums gemäß einem der vorstehenden Ansprüchen zur Kultivierung von menschlichen Zellen.
Verwendung gemäß Anspruch 19, worin die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe von Stammzellen, Vorläuferzellen, mesenchymalen Zellen, Epithelzellen, Knorpelzellen, Knochenzellen, Muskelzellen, Drüsenzellen, Fettzellen, Pericyten, Satellitenzellen und Hautzellen.
Verwendung gemäß Anspruch 20, worin die Zellen Vorläuferzellen sind.