WO2008062699A1

WO2008062699A1 - Carrier

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Publication number: WO2008062699A1
Application number: PCT/JP2007/072102
Authority: WO
Inventors: Shigeo Koyasu; Shigenori Nagai; Chihiro Sasakawa; Hitomi Mimuro
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2006-11-20
Filing date: 2007-11-14
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2009-05-20
Also published as: JP5145700B2; US20100074921A1; JP2008127324A; US8524250B2; AU2007322846A1; AU2007322846B2

Description

明細書

キャリア

技術分野

[0001] 化合物を腸管関連リンパ組織に運搬するためのキャリアに関する。

背景技術

[0002] 腸管、鼻腔，口腔，呼吸器官などの、動物の体内で外界との境界面を覆う粘膜組織における免疫組織は、脾臓と骨髄を中心とする免疫系、すなわち全身免疫系とは別個の、共通した機構を有する一つの免疫系（粘膜免疫系）を形作っている。

[0003] 中でも腸管は、体外から摂取した食物を消化して吸収する消化器官であることに加えて、体外からの多様な異物に曝される最前線でもあるため、免疫系の組織が発達している。ヒトの場合約 400m²にも及ぶ表面積を有する腸管における粘膜免疫系は、ノイエル板、腸間膜リンパ節、腸管上皮間リンパ球、タリブトパッチなどからなり、全身のリンパ球の 60〜70%が集結する体内最大の免疫組織である腸管関連リンパ組織 (gut-associated lymphoid tissue, GALT)を構成する。

[0004] これらのうち、小腸の粘膜固有層に存在するパイエル板（Peyer's patch, PP)は、腸管上皮から取り込まれた各種の抗原に対して、免疫応答を誘導するか、あるいは逆に免疫寛容を示す力、を制御する司令塔としての役割を有し、その機能には樹状細胞が重要な役割を果たしてレ、る。

[0005] 近年、粘膜における以上のような免疫機構が次々に解明されるにつれて、粘膜免疫を利用する粘膜免疫ワクチンの開発が進められている（特開 2003— 321392号公報)。粘膜免疫ワクチンの場合には、例えば口腔、鼻腔などへ抗原を経粘膜的に投与することにより、唾液などの粘膜系組織中に分泌型 IgA抗体が産生され、他方、歯肉溝浸出液などの全身系組織中には、血清由来の IgG抗体が産生される。このように、抗原を経粘膜投与することにより、粘膜系と全身系の両方で免疫応答を誘導すること力 Sでさる。

[0006] このような粘膜免疫を利用した免疫誘導の実験的な試みとして、 Haemophilus influe nzaeの細胞膜蛋白質を抗原としてマウスに経鼻投与することにより、鼻腔洗浄液中に IgA抗体が、血清中に IgG抗体が産生され、その結果、粘膜系及び全身系の両方で免疫応答が誘導されたことが報告されている（Yamamoto, M. et al.(1998) J. Immunol. 161(8):4115-4121) ₀また、 Streptococcus mutansの外膜蛋白質をマウスに経鼻投与することにより、粘膜系及び全身系の両方で免疫応答が誘導されたことも報告されている（Saito, M. et al. (2001) J. Infect. Dis. 183(5):823_826)。これらのような粘膜免疫ワクチンは、病原性微生物に対して粘膜系及び全身系の両方で免疫応答を誘導できるため、新たなワクチンとして臨床への応用が期待されている。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] しかし、腸管関連リンパ組織に働きかけることを目的として、例えば経口的に投与したとしても、多くの物質は胃酸で分解されたり消化酵素で消化されたりするため、そのまま腸管へ到達させることは困難である。また、たとえ腸にまで到達させられたとしても、その物質は腸管関連リンパ組織に取り込まれるとは限らず、そのまま体外へ排泄されてしまうこともある。

上記課題に鑑み、本発明は、化合物を、分解や消化されることなく腸管関連リンパ組織に効率よく運搬できるキャリアを提供することを目的としてなされた。

課題を解決するための手段

[0008] グラム陰性らせん菌の一種であるピロリ菌（Helicobacter pylori)は、胃粘膜の傷害を引き起こして胃炎や胃潰瘍などの原因となりうることが知られている。ピロリ菌は、通常、胃の粘膜に定着し、鞭毛を有するらせん形の形状をして活動している。しかし、至適条件ではない環境、例えば小腸などの嫌気的な環境下では、球形 (coccoid for m、コッコイド型）の菌体となって生存することができる。このような球形菌体は、「生きているが培養できない（viable but non_culturable、 VNC)」状態の一種であると考えられている。

[0009] このピロリ菌による胃炎や胃潰瘍の発症には、粘膜免疫系における、ピロリ菌に特異的な T細胞が関与していることが最近分かってきた（例えば、 Lundgren, Α·， et al. ( 2005) Infect. Immun. 73:5612-5619を参照）。し力、し、炎症部位である胃そのものには免疫組織がないため、体内のどの部位においてピロリ菌による T細胞の感作が生じるのかは明らかではなかった。そこで、発明者らは鋭意研究を行った結果、（1 )ピロリ菌の球形菌体は、非常に効率よく免疫細胞に貪食され、効果的に樹状細胞の免疫応答を誘導すること、（2)腸管関連リンパ組織の一つである小腸のパイエル板がピロリ菌の球形菌体を効率よく取り込み、パイエル板の樹状細胞が取りこまれた球形菌体を貪食すること、さらに、（3)ピロリ菌の球形菌体が、パイエル板において CD4陽性 T 細胞を感作して免疫応答を誘導し、（4)その結果、胃における特異的な炎症性免疫応答を誘導すること、を明らかにし、本発明の完成に至った。

[0010] すなわち、本発明に係るキャリアは、化合物を腸管関連リンパ組織に運搬するためのキャリアであって、胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体を含有することを特徴とする。腸管関連リンパ組織はパイエル板であってもよぐ胃粘膜傷害性らせん菌はピロリ菌（H. pylori)であってもよい。そして化合物は、医薬組成物であってもよぐさらに、腸管関連リンパ組織に作用する医薬組成物であってもよい。

[0011] 本発明に係る経口剤は、化合物及び胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体を含有する経口剤である。胃粘膜傷害性らせん菌は、ピロリ菌（H. pylori)であってもよい。そして化合物は、医薬組成物であってもよぐさらに、腸管関連リンパ組織に作用する医薬組成物であってもよい。

[0012] 本発明に係る誘導剤は、化合物に対する腸管関連リンパ組織の免疫細胞による免疫応答を誘導する誘導剤であって、前記化合物及び胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体を含有することを特徴とする。腸管関連リンパ組織は、パイエル板であってもよく、免疫細胞は、樹状細胞であってもよい。胃粘膜傷害性らせん菌は、ピロリ菌（H. pyl ori)であってもよい。そして化合物は、蛋白質であってもよく、さらに、らせん菌によつて産生される蛋白質であってもよい。

[0013] 本発明に係る医薬組成物は、胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体をキャリアとして含有する医薬組成物である。球形菌体は、腸管関連リンパ組織への運搬のためのキャリアであってもよい。腸管関連リンパ組織は、パイエル板であってもよぐ胃粘膜傷害性らせん菌は、ピロリ菌（H. pylori)であってもよい。

[0014] 本発明に係る治療薬は、胃粘膜傷害性らせん菌による胃の炎症性疾患の治療薬であって、腸管関連リンパ組織における細胞性免疫を抑制することを特徴とする。胃粘膜傷害性らせん菌はピロリ菌（H. pylori)であってもよい。腸管関連リンパ組織は、ノイエル板であってもよい。さらに本発明に係る治療薬は、胃粘膜傷害性らせん菌の球状菌体を含有してもよい。

[0015] = =関連文献とのクロスリファレンス = =

なお、本出願は、 2006年 11月 20曰出願の曰本国出願番号特願 2006— 31321 7を基礎とする優先権の利益を主張し、これを引用することにより本明細書に含める。図面の簡単な説明

[0016] [図 1]本発明の実施例において、ピロリ菌を培養細胞に感染させた結果を表す図である。 a〜dは、培養プレート上の脾臓細胞（a, b)、またはカバーグラス上の脾臓細胞（c , d)を、ピロリ菌のらせん形菌体（a, c)または球形菌体 (c, d)で感染させて、未染色のまま（a, b)、またはへマトキシリンェォジン染色して (c, d)、顕微鏡観察した写真である。 e, fは、培養した脾臓細胞（e)または BMDC (f)をピロリ菌の球形菌体で感染させ、核染色および抗ピロリ菌抗血清による免疫染色を行い蛍光顕微鏡で観察した写真である。 gは、 BMDCをピロリ菌のらせん形菌体（黒縦棒)または球形菌体（白縦棒 )で 0〜100 MOIにて感染させ、培養上清に含まれる IL-12p70の量を測定し、プロットした棒グラフである。

[図 2]本発明の実施例において、ピロリ菌をマウスの小腸に感染させた結果を表す図である。 aは、左から順に、ピロリ菌接種後 0, 5, 18時間に、小腸のパイエル板をそれぞれ抗ピロリ菌抗血清で免疫染色し、明視野（上段）または喑視野（下段）にて蛍光顕微鏡で観察した写真である。 bは、ピロリ菌接種直後（左）または 20時間後 (右）に、ノイエル板を抗ピロリ菌抗血清及び抗 CD 11c抗体で免疫染色して、蛍光顕微鏡で観察した写真である。右下パネルの挿入図は全体図の一部を拡大した図であり、ピロリ菌の菌体と CD 11c陽性樹状細胞とが共染色されることが示されている。

[図 3]本発明の実施例において、ピロリ菌の球形菌体によって感作させた CD4陽性 T 細胞を、免疫不全マウスに養子移入した結果を表す図である。 a、 bは、ピロリ菌感作 T細胞を移入して 2ヶ月後の胃の切片を、へマトキシリンェォジン染色（a)またはクロ口酢酸エステラーゼ染色 (b)して顕微鏡観察した写真である。 bの右下の挿入図は、全体図中の枠内を拡大して表した図であり、好中球やマスト細胞が多数の斑点状に示されている。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。実施の形態並びに実施例に特に説明がない場合には、 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), "Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition)， Coia Spring Harbor Press,し old ¾pnn g Harbor, New York (2001)や、 F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Mo ore, J.G. Seidman, J. A. Smith, . Struhl (Ed.), "Current Protocols in Molecular Bio logy", John Wiley & Sons Ltd.などの、当該技術分野における標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれらを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや装置を用いるときには、特に説明がない場合は、それらに添付のプロトコールゃ取扱説明書に従って用いる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びアイデアは、本明細書の記載により当業者には明らかであり、本明細書の記載に基づき、当業者が本発明を再現することは容易である。以下に記載された具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すための例示又は説明として示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

[0018] = = =キャリアによる化合物の運搬 = = =

本発明は、化合物を、腸管関連リンパ組織まで効率よく運搬するための媒体、すなわちキャリアを提供するものである。

[0019] 本発明のキャリアによって運搬される化合物は、低分子であってもよぐあるいは核酸や蛋白質などの生体高分子であってもよい。また、細菌などの微生物やウィルス、またはそれらの一部であっても力、まわないが、腸管関連リンパ組織で効果を発揮する化合物であることが好ましい。

[0020] 本発明のキャリアによって化合物を運搬させる部位は、小腸のパイエル板（Peyer's patch)を含む、腸管関連リンパ組織（gut-associated lymphoid tissue, GALT)である。本発明のキャリアとして用いられるらせん菌の球形菌体は、経口投与されるとパイエル板にまで到達し、パイエル板の樹状細胞の食作用によって、効率よく取り込まれる。従って、本発明のキャリアを使用すれば、化合物を、パイエル板及びその近傍の腸管関連リンパ組織にまで効率よく運搬することができるので、化合物を、腸管関連リンパ組織に対する局所剤の有効成分として、本発明に用いることができる。従って、本発明のキャリアによって運搬される化合物は、腸管関連リンパ組織に到達することで効果を発揮する化合物であることが望ましレ、が、腸管関連リンパ組織自体で機能しなくても構わない。

[0021] 例えば、化合物が局所的に作用してその効果を発揮するものである場合は、化合物が腸管関連リンパ組織に効率よく運搬されることから、その効果の及ぶ範囲も腸管関連リンパ組織及び/またはその近傍に限定される。一例として、化合物が免疫原性を有していれば、本発明のキャリアによって運搬されると、腸管関連リンパ組織におけるパイエル板中の樹状細胞に取り込まれて、 CD4陽性 T細胞に提示される。他方、例えば化合物が、免疫抑制作用を有していれば、本発明のキャリアを用いて腸管関連リンパ組織まで運搬されると、腸管関連リンパ組織に作用して、粘膜免疫応答を抑制できる。さらに、化合物は、腸管関連リンパ組織に対して有効な、上記以外の機能を有してもよい。例えば抗菌作用を有する化合物であれは、腸管関連リンパ組織に対する抗菌剤の有効成分として、本発明のキャリアによって運搬できる。

[0022] 一方、運搬された化合物によってもたらされる効果の及ぶ部位は、その化合物の作用に応じて異なってもよい。例えば、運搬された化合物の有する作用が、免疫応答を特異的に調節する作用、すなわち免疫応答を誘導または抑制する作用である場合は、その効果が及ぶ範囲は、腸管関連リンパ組織に限られない。すなわち、胃におけるピロリ菌の炎症反応誘導作用の例に見られるように、免疫原となる化合物が、ひとたび樹状細胞に取り込まれて CD4陽性 T細胞に提示されると、感作された T細胞は循環系を通じて全身に運ばれる。従って、運搬された化合物によって生じる特異的な免疫応答反応は、粘膜免疫，全身免疫のいずれを問わず、免疫原となる物質の存在する、全身の任意の部位において惹起され得る。

[0023] 本発明に用いうる胃粘膜傷害性らせん菌としては、ヒトの胃炎や胃潰瘍の原因菌である、へリコパクター（Helicobacter)属のピロリ菌（Η· pylori)がその代表的なものとして挙げられる。また、 Helicobacter属に含まれるその他のらせん菌のうち、例えば H. f elis, H. mu stelae, H. rodentium, H. hepaticusなども、胃米占膜に定着して炎 ¾Eを惹起しうること、及び球状菌体の状態を取り得ることが知られており、それぞれィヌゃネコなどの哺乳動物への感染が認められているほ力、、マウスやフェレットなどを用いた動物実験にも使用されている。従ってこれらの菌についても、感染性を有する適切な哺乳動物を対象とすることで、ピロリ菌と同様にして、本発明に使用することが可能である

[0024] = = =らせん菌のキャリアとしての利用 = = =

本発明は、上記のような化合物を、らせん菌の球形菌体が腸管関連リンパ組織に効率よく取り込まれる現象を利用して、管関連リンパ組織にまで運搬するためのキヤリァを提供する。従って、本発明のキャリアとしては、これら球形菌体そのもの、または球形菌体を加工したものを使用する。らせん菌は、らせん状の状態で至適条件で培養して増殖させた後に、培養条件を菌の生育に適さない条件、例えば嫌気的条件に変えることによって、容易に球形菌体に変化させることができる。らせん菌は、ひとたび球形菌体になれば、菌としての増殖性がなくなり（VNC状態）、安定性も増すので、球形菌体をキャリアとして使用することは、その安全性や取り扱い上の容易さの点力、らも好適である。

[0025] 球形菌体は、 VNC状態であれば、そのまま使用してもよいし、腸管関連リンパ組織運搬される性質を維持できれば、加工してから用いてもよい。例えば、らせん菌自体の生死は問わないので、球形菌体になった後の生菌を弱毒化もしくは不活性化させた菌体ゃ死菌などの、球形菌体加工物を用いてもよい。そのような弱毒化'不活性化のためには、紫外線や電子線の照射、乾燥、加熱などの一般的な方法を用いればよい。さらに、菌体表面の抗原を不活性化する処理、例えば酵素分解処理を行つて、らせん菌としての抗原性を低減させた球形菌体加工物を用いてもよい。こうすると、球形菌体そのものをキャリアとして投与した時に生じ得る、らせん菌に対する免疫反応を引き起こしてしまうという副作用を回避できるので好ましい。

[0026] 本発明のキャリアを用いて化合物を投与するための方法としては、非侵襲的に行える経口投与法が好適である。らせん菌の球形菌体は、安定性が高ぐ例えば胃酸などの酸による分解や消化酵素による消化に対する耐性を有している。従ってキャリアとして球形菌体を用いれば、化合物を経口投与するだけで、分解や消化されてしまうことなく、し力、も非侵襲的な方法で、腸にまで運搬することができる。しかし、化合物を腸管関連リンパ組織に到達させられるような方法であれば、他の投与方法を使用してもよぐ、例えば注射やカテーテルによって、胃や腸に直接投与してもよい。

[0027] 本発明のキャリアを用いて化合物を投与するための剤形としては、上記の球形菌体又は球形菌体加工物を含有できる剤形であればよいが、経口的に投与する場合はさらに、経口投与に適した剤形であることが好ましぐ例えば、錠剤，カプセル，顆粒 ,粉末，シロップなどでもよい。また、投与の回数や間隔はとくに制限されず、予想される作用の程度や、実際の効果の増減に応じて、適宜加減することができる。また、これら剤形は、単独で投与してもよいし、必要であれば他の薬剤と同時に投与してもよい。

[0028] 本発明のキャリアによって投与される化合物は、上記の剤形の中に、腸管関連リンパ組織まで運搬されるのに適した形で含有される。そのためには、化合物が剤形中に安定して保持されるように、化合物をキャリアの表面に結合させる力、、あるいはその内部に含有させることが好ましい。このように結合又は含有させる操作は、前記の球形菌体の形成並びに球形菌体の加工の操作の前に行ってもよいし、後に行ってもよい。例えば、表面に結合させる場合、化合物を、らせん菌，球形菌体又は球形菌体加工物に添加して、その表面に結合させてもよい。化合物は、球形菌体または球形菌体加工物の表面に直接結合させてもよいし、あるいは、架橋剤を介して結合させてあよい。

[0029] 一方、化合物をキャリアの内部に含有させる場合、化合物が浸透性を有するものであれば、らせん菌，らせん菌の球形菌体若しくは球形菌体加工物に添加し、表面から内部へ浸透させて、内部に保持させるようにしてもよいし、あるいは、らせん菌の取り込み作用を利用して内部に取り込ませてもよい。これら化合物を内部に含有させることは、表面に結合させた場合に起こりうる、化合物の胃酸による分解や消化酵素による消化を回避できるため好ましい。さらに、化合物が、腸管関連リンパ組織にまで運搬される途中で、望ましくない効果、たとえば食道や胃に対する傷害などを及ぼすことを回避できるので好ましレ、。

[0030] さらに、化合物が核酸，蛋白質，ペプチドなどの生体分子の場合、化合物は、上記のように、キャリアに対して後から加えてもよいが、あるいは、らせん菌自体に産生させることもできる。例えば、らせん菌を培養中に、らせん菌の遺伝子発現系を利用して、菌体の中で生体分子を発現させてから、培養条件を変えて球形菌体に変化させることで、そのまま、これら生体分子を含有したキャリアとして本発明に使用することができる。

[0031] = =キャリアの利用方法 = =

本発明のキャリアは、化合物を腸管関連リンパ組織に効率よく取り込ませることが可能である。この現象を利用して、以下のようなキャリアの利用が可能である。

[0032] まず、化合物に対する腸管関連リンパ組織の免疫細胞による免疫応答を誘導する誘導剤として利用できる。そもそも、ピロリ菌がパイエル板に取り込まれると、樹状細胞を活性化し、 CD4陽性 T細胞を感作する結果、胃における特異的な炎症性免疫応答を誘導する。また、上記のように、抗原を経粘膜投与することにより、粘膜系での免疫応答を誘導することができる。従って、このキャリアを用いて、対象となる化合物を腸管関連リンパ組織に投与することにより、腸管関連リンパ組織の免疫細胞による免疫応答を誘導することができる。

[0033] 同様に、抗原を経粘膜投与することにより、全身系での免疫応答を誘導することができるため、胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体をキャリアとして、粘膜免疫ワクチンを提供すること力できる。この場合、ワクチンの対象物は、化合物に限らず、微生物やウィルス、またはそれらの一部であることが好ましい。また、癌ワクチンなどに利用される癌特異的抗原などでも構わなレ、。

[0034] また、胃粘膜における胃粘膜傷害性らせん菌による炎症は、胃粘膜傷害性らせん菌がパイエル板において免疫誘導することによって生じる。従って、本発明のキャリアに、腸管関連リンパ組織において免疫抑制作用を有する化合物を含有させることにより、胃粘膜傷害性らせん菌による炎症性免疫を抑制することができ、胃粘膜傷害性らせん菌による胃の炎症性疾患の治療薬となる医薬組成物を提供することができる。

[0035] = =胃粘膜傷害性らせん菌による胃の炎症性疾患の治療薬 = = 実施例に示すように、胃粘膜における胃粘膜傷害性らせん菌による炎症は、菌の球形菌体がパイエル板に取り込まれ、免疫誘導することによって生じる。従って、この過程のいずれかの段階を抑制することによって、胃粘膜傷害性らせん菌による胃の炎症性疾患を治療することができるようになる。これは、小腸を標的とした、胃粘膜傷害性らせん菌による炎症の初めての治療方法である。

[0036] まず、パイエル板に取り込まれるのは、球形菌体であることから、胃粘膜傷害性らせん菌がらせん状菌体から球形菌体になるのを阻害することにより、当該らせん菌による胃の炎症を治療 ·予防することができる。また、この球形菌体がパイエル板に取り込まれることを阻害することによつても、当該らせん菌による胃の炎症を治療 '予防すること力 Sできる。さらに、この球形菌体がパイエル板に取り込まれても、炎症性の細胞性免疫が誘導されなければよぐ従って、パイエル板における免疫応答を抑制することにより、当該らせん菌による胃の炎症を治療 ·予防することができる。

[0037] 例えば、パイエル板を含む腸管関連リンパ組織における細胞性免疫を抑制するために、腸管関連リンパ組織に免疫抑制剤を投与することが考えられる。この免疫抑制剤は、球形菌体が腸管関連リンパ組織で引き起こす免疫応答を抑制する作用があればよぐ例えば、イムレク（ァザチォプリン製剤）、シクロスポリン八、タクロリムス（FK5 06)などを使用できる。

[0038] 投与方法は特に限定されないが、非浸襲性の点から、経口投与であることが好ましい。

実施例

[0039] 以下に、実施例及び図表を用いて本発明の実施の態様をより詳細に説明する。

[0040] = = =ピロリ菌の免疫細胞による貪食 = = =

まず、ピロリ菌のらせん形または球形の菌体に対する、脾臓細胞及び骨髄由来樹状細胞（Bone Marrow-derived dendritic cell, BMDC)の食食能を調べた。また、 B

MDCにピロリ菌のらせん形菌体または球形菌体を貪食させた場合の免疫応答を、 I

L 12の分泌量を測定することにより調べた。

[0041] 〔ピロリ菌の菌体の調製〕ヒトより単離された Helicobacter pyloriのマウス適応型 SS 朱を、 5%ヒッジ血液寒天培地上で 2日間培養し、次いで 5%ゥシ胎児血清含有ブルセラ培地中で、 37°Cの微好気環境下にて一晩振盪培養して、らせん形菌体を得た。球形菌体を調製する場合は、 5%ヒッジ血液寒天培地上で、まず 3日間 37°Cの微好気環境下にて培養した後、さらに 7日間、 37°Cの嫌気条件下で培養した。

〔脾臓細胞の調製〕 C57BL/6系統の野生型マウスの脾臓を取り出し、潰して脾臓細胞を押し出した。回収 '遠心した後、 Ack溶液にて赤血球を溶血し、リン酸緩衝液で洗浄し培地に懸濁して、これを脾臓細胞調製液とした。

〔BMDCの調製〕 C57BL/6系統の野生型マウス（クレアジャパン社）の骨髄から単離した細胞を、 10%ゥシ胎児血清及び 10ng/mlGM— CSF含有 RPMI培地を用いて 6穴培養プレート上で培養した。一日おきに培地を交換して顆粒細胞を除去し、培養 6日目に、プレート表面に弱く付着した細胞を穏やかなピペッティングで回収した。抗 CD 1 lc抗体結合 N418マイクロビーズと AutoMACS自動細胞分離装置（Miltenyi Biotech 社)を使用して、 CDl lc陽性の樹状細胞を分離し、 BMDCとした。

[in vitro感染実験〕培養した未感作の脾臓細胞に、らせん形及び球形菌体の H. pylo ri SSIを、それぞれ 20 MOI (multiplicity of infection)で添加し、培養プレート上またはカバーグラス上で、 3日間、 37°Cで共培養して感染させた。また、 BMDCには、球形菌体の H. pylori SSIを 100MOIで添加し、 1時間、 37°Cで共培養した。得られた細胞をスライドガラス上に塗抹し、 10%中性ホルマリンで固定し、 0.1% Triton X-100で透過処理をした後、へマトキシリンェォジン染色、または、 DAPI染色及びファロイジン染色と抗 H. pylori抗体（Biomeda社）を用いた免疫染色との組み合わせにより染色し、顕微鏡下で観察した。

〔IL— 12産生能の測定〕 5xl0⁵個の BMDCを 24穴培養プレート上で 1時間培養した後に、 Η· pylori SSIに 0〜100 MOIで感染させた。 1時間後に 50 ^ g/mlゲンタマイシンを添加して細胞外の菌を除菌し、さらに 20時間培養を続けた。抗 IL-12p70抗体を含む ELISAキット（Invitrogen社）を使用して、培養上清中の IL_12p70の分泌量を測定した。

〔結果〕ピロリ菌のらせん形または球形菌体を、脾臓細胞に添加すると、球形菌体を用いた場合は、直径 30〜50 nmの単核の巨細胞が生じた力 S (図 lb, d)、らせん菌の場合は生じな力、つた（図 la, c)。球形菌体の添加によって生じた巨細胞の内部や近傍には、多数の菌体が認められた（図 lb, d、多数の小班点で示されている）。また、球形菌体を添加した BMDCは多数の菌体を食食した（図 le, fの小光点で示されている）。

一方、らせん形菌体または球形菌体を 0〜100 MOIで添加した BMDCによる IL 1 2の産生は、らせん形菌体よりも球形菌体を添加した場合に、より効果的に誘導された（図 lg)。

このように、ピロリ菌の球形菌体は、らせん形菌体より、より効率よく免疫細胞に貪食され、より効果的に樹状細胞の免疫応答を誘導した。

[0043] = = =小腸のパイエル板へのピロリ菌球形菌体の取り込み = = =

さらに、マウス小腸へピロリ菌球形菌体を接種し、パイエル板へのピロリ菌球形菌体の取り込みを調べた。

[0044] 〔マウス小腸ループの in situ接種実験〕 C57BL/6系統の野生型マウス（6週齢、メス）を麻酔して、小腸の、 1ないし 2個のパイエル板を含むように約 4cmの間隔を隔てた 2 箇所において縫合糸を用いて結紮し、小腸のループを形成した。ループ内に、 0.2ml の生理的食塩水に懸濁した H. pylori SS1 (1 x 10⁹cfo)を接種した。所定時間の経過後にパイエル板を摘出して、リン酸緩衝液で充分に洗浄した後、 ₄%パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝液で固定した。ノラフィン包埋切片を作製し、パイエル板の sub印 i thelial dome (SED)を、抗ピロリ抗体（Biomeda社）または抗 CD 11cモノクローナル抗体（Becton Dickinson社）で免疫染色して、蛍光顕微鏡下で観察した。

[0045] 〔結果〕ピロリ菌の球形菌体を接種したマウス小腸のループでは、接種から 18時間以内に、時間依存的に、パイエル板の sub印 ithelial dome (SED)領域内へのピロリ菌の取り込みが進んだ（図 2a)。また、接種後 20時間では、抗ピロリ菌抗血清及び抗 CD1 lcモノクローナル抗体を用いた二重染色により、ピロリ菌と CD11陽性樹状細胞の共染色が認められた（図 2b)。

このように、ピロリ菌の球形菌体は、腸管のパイエル板に取りこまれ、パイエル板の樹状細胞が、取り込まれたピロリ菌球形菌体を効率よく貪食した。このことは、ピロリ菌の球形菌体が、パイエル板へ化合物を運搬するためのキャリアとして有用であること、そしてこのキャリアによって運搬された化合物力樹状細胞による免疫応答を誘導することを示す。

[0046] = = =ピロリ菌で感作した T細胞による粘膜免疫の誘導 = = =

次に、ピロリ菌に未感染のマウスまたはピロリ菌感染マウスから分離した CD4陽性 T 細胞を、ピロリ菌を感染させたパイエル板/免疫細胞欠損マウスに養子移入し、移入マウスにおける、移入 T細胞のピロリ菌排除効果を調べた。

[0047] 〔T細胞のピロリ菌抗原による感作〕ピロリ菌に未感染の野生型マウス（C57BL/6系統 )から脾臓，腸管膜リンパ節，及びパイエル板を摘出し、 CD4マイクロビーズと AutoM ACS自動細胞分離装置 (Miltenyi Biotech社)を用いて CD4陽性 T細胞を分離し、未感作 T細胞とした。一方、対数増殖期の H. pylori SSI培養液 0.15ml ( 1〜2 x 10⁸cfo) を、野生型マウスにゾンデにて胃内投与して、 8週間飼育してピロリ菌を感染させた。このピロリ菌感染マウスから、脾臓，腸管膜リンパ節，及びパイエル板を摘出し、同様の方法によって CD4陽性 T細胞を分離し、ピロリ菌感作 T細胞とした。

〔T細胞の養子移入実験〕 C57BL/6系統の野生型マウス、または C57BL/6系統に由来する _Ί c_Rag2二重欠損型免疫不全マウス（Taconic社、 Germantown, NY)を、 H. p ylori SSIをゾンデにて胃内投与することにより感染させた。感染マウスをさらに 8週間飼育して、宿主マウスとした。上記の未感作 T細胞または感作 T細胞を、宿主マウスに静脈注射 (脾臓及び腸間膜リンパ節由来の T細胞の場合は 5 X 10⁶個/マウス、パイエル板由来の T細胞の場合は 5 X 10⁵個/マウス）することにより養子移入し、さらに飼育を継続した。

〔ピロリ菌排除効果の測定〕上記の各細胞を養子移入したそれぞれのマウスから、 8 週間目に胃を摘出し、小彎から小彎にかけて二等分した。一方をホモジェナイズし、プレート希釈法によってコロニー数を計数して、胃の単位組織重量当たりの感染菌数を測定した。

[0048] 〔結果〕 γ c_Rag2二重欠損型免疫不全マウスは、 B細胞及び T細胞の分化能を欠失しており、なおかつパイエル板も欠失している。従って、あらかじめピロリ菌に感染させた _Ί c_Rag2二重欠損型免疫不全マウスに、未感作の T細胞を移入しても炎症を誘発できず、胃におけるピロリ菌の排除は生じな力、つた (表 1)。ところ力ピロリ菌に感染したマウスの脾臓，腸間膜リンパ節 (mLN) , ノィエル板 (PP)のそれぞれに由来する CD4陽性 T細胞を養子移入すると、いずれの場合も、 γ c_Rag2二重欠損型免疫不全マウスの胃のピロリ菌が排除された。特にパイエル板由来の T細胞は、脾臓や腸間膜リンパ節由来の T細胞よりも少ない細胞数を用いたにもかかわらず非常に強い排除効果を示した。

〔表 1〕T細胞の養子移入によるピロリ菌の排除

[0050] このように、全身免疫系及び粘膜免疫系の T細胞は、ピロリ菌抗原で感作されることによって、ピロリ菌に対する免疫反応を誘導した。なかでも、腸管関連リンパ組織であるパイエル板に由来する感作 τ細胞力ピロリ菌に対して強い免疫応答を誘導した。このことは、パイエル板に抗原を与えることにより、局所免疫を誘導するだけでなぐ全身免疫を誘導することを示しており、パイエル板へピロリ菌を用いて抗原を導入することが、粘膜免疫ワクチンとして有効であることが確かめられた。

[0051] = = =ピロリ菌で感作した T細胞による胃炎の誘導 = = =

ここでは、ピロリ菌の球形菌体で感作された CD4陽性 T細胞を、ピロリ菌を感染させたパイエル板 ·免疫細胞欠損マウスに移植し、移植マウスにおける胃の炎症を調べた

[0052] 〔養子移入実験〕 γ c_Rag2二重欠損型免疫不全マウスを、 H. pylori SSIのらせん形菌体をゾンデにて胃内投与して感染させ、 2ヶ月間飼育して宿主マウスとした。一方、野生型マウスに H. pylori SSIの球形菌体を同様に胃内投与し、 8週間後に、前節の実施例と同様の方法で、ピロリ菌抗原に感作した CD4陽性 T細胞を脾臓から単離した。このピロリ菌感作 T細胞を、前節の実施例と同様にして、上記の宿主マウスに養子移入した。移入後 2ヶ月目のマウスから胃を摘出し、横断面にて薄切して凍結及びノラフィン切片を作製した。切片をへマトキシリンェォジン染色又はクロ口酢酸エステラーゼ染色して、顕微鏡下で観察した。

[0053] 〔結果〕ピロリ菌に感染させた γ c_Rag2二重欠損型免疫不全マウスは、パイエル板及び免疫細胞を欠損しているため、胃炎は発症しないが、ピロリ菌球形菌体で感作された T細胞を移植すると、移植 T細胞が強い胃炎を引き起こした（図 3)。

これらの結果は、ピロリ菌の球形菌体が、腸管関連リンパ組織において、パイエル板に取り込まれ、樹状細胞に貪食されて T細胞を感作することで、粘膜免疫系の応答を誘導し、ピロリ菌による胃炎を激化させることを示している。従って、この過程のいずれかの段階を抑制することによって、胃粘膜傷害性らせん菌による胃の炎症性疾患を治療することができるようになる。例えば、腸管関連リンパ組織における細胞性免疫を抑制する薬物は、胃粘膜傷害性らせん菌による胃の炎症性疾患の治療薬として有用である。

産業上の利用可能性

[0054] 本発明によって、腸管関連リンパ組織へ効率よく化合物を運搬するキャリアを提供すること力 Sでさる。

Claims

請求の範囲

[I] 化合物を腸管関連リンパ組織に運搬するためのキャリアであって、

胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体を含有することを特徴とするキャリア。

[2] 前記腸管関連リンパ組織力 Sパイエル板であることを特徴とする請求項 1に記載のキャリア。

[3] 前記胃粘膜傷害性らせん菌がピロリ菌 (H. pylori)であることを特徴とする請求項 1 または 2に記載のキャリア。

[4] 前記化合物が、医薬組成物であることを特徴とする請求項;!〜 3のいずれかに記載のキャリア。

[5] 前記医薬組成物が、腸管関連リンパ組織に作用することを特徴とする請求項 4に記載のキャリア。

[6] 化合物及び胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体を含有する経口剤。

[7] 前記胃粘膜傷害性らせん菌がピロリ菌 (H. pylori)であることを特徴とする請求項 6 に記載の経口剤。

[8] 前記化合物が、医薬組成物であることを特徴とする請求項 6または 7に記載の経口剤。

[9] 前記医薬組成物が、腸管関連リンパ組織に作用することを特徴とする請求項 8に記載の経口剤。

[10] 化合物に対する腸管関連リンパ組織の免疫細胞による免疫応答を誘導する誘導剤であって、

前記化合物及び胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体を含有することを特徴とする誘導剤。

[I I] 前記腸管関連リンパ組織が、ノイエル板であることを特徴とする、請求項 10に記載の誘導剤。

[12] 前記免疫細胞が、樹状細胞であることを特徴とする、請求項 10または 11に記載の誘導剤。

[13] 前記胃粘膜傷害性らせん菌が、ピロリ菌 (H. pylori)であることを特徴とする、請求項 10〜； 12のいずれかに記載の誘導剤。

[14] 前記化合物が蛋白質であることを特徴とする、請求項 10〜； 13のいずれかに記載の誘導剤。

[15] 前記蛋白質が、前記らせん菌によって産生されることを特徴とする、請求項 14に記載の誘導剤。

[16] 胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体をキャリアとして含有する医薬組成物。

[17] 前記球形菌体が、腸管関連リンパ組織への運搬のためのキャリアであることを特徴とする請求項 16に記載の医薬組成物。

[18] 前記腸管関連リンパ組織が、ノイエル板であることを特徴とする、請求項 17に記載の医薬組成物。

[19] 前記胃粘膜傷害性らせん菌が、ピロリ菌 (H. pylori)であることを特徴とする、請求項 16〜； 18の!/ヽずれかに記載の医薬組成物。

[20] 胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体をキャリアとして含有する粘膜免疫ワクチン。

[21] 前記球形菌体が、腸管関連リンパ組織への運搬のためのキャリアであることを特徴とする請求項 20に記載の粘膜免疫ワクチン。

[22] 前記腸管関連リンパ組織が、ノイエル板であることを特徴とする、請求項 21に記載の粘膜免疫ワクチン。

[23] 前記胃粘膜傷害性らせん菌が、ピロリ菌 (H. pylori)であることを特徴とする、請求項 20〜22の!/、ずれかに記載の粘膜免疫ワクチン。

[24] 胃粘膜傷害性らせん菌による胃の炎症性疾患の治療薬であって、腸管関連リンパ組織における細胞性免疫を抑制することを特徴とする治療薬。

[25] 前記胃粘膜傷害性らせん菌が、ピロリ菌 (H. pylori)であることを特徴とする、請求項 24の!/、ずれかに記載の治療薬。

[26] 前記腸管関連リンパ組織が、ノイエル板であることを特徴とする、請求項 24または

25に記載の治療薬。

[27] 胃粘膜傷害性らせん菌の球形菌体を含有することを特徴とする、請求項 24〜26の V、ずれかに記載の治療薬。