WO2007132760A1

WO2007132760A1 - コムギ内在性ｄｎａの検出・定量法、および被検試料における遺伝子組換えコムギの混入率の決定方法

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Publication number: WO2007132760A1
Application number: PCT/JP2007/059727
Authority: WO
Inventors: Shinjiro Imai; Keiko Tanaka
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 2006-05-15
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2008-11-15
Also published as: JPWO2007132760A1; US20100062432A1; KR101426573B1; KR20090015061A; EP2019136A4; ES2452819T3; EP2019136A1; EP2019136B1; JP5100644B2; US20120208992A1; US20120214161A1; US8173400B2

Abstract

　本発明の目的は、ａ）コムギ品種で普遍的に存在し、ｂ）コムギ品種により存在量（検出量）が偏らず、ｃ）他の穀物が存在しても交差性なくパンコムギのみ検出可能であり、ｄ）ＰＣＲ反応で定量的に増幅される、という条件を満たすコムギ内在性配列を見出し、被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によってより正確に検出又は定量する方法を提供することを目的とする。　本発明は、被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出又は定量する方法であって、前記被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、配列番号：２に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域に含まれる増幅可能なプライマーペアを用いて前記領域の核酸を増幅する工程、及び前記増幅された核酸を検出又は定量する工程を含む方法を提供する。

Description

明細書

コムギ内在性 DNAの検出 ·定量法、および被検試料における遺伝子組換えコムギの混入率の決定方法

技術分野

[0001] 本発明は、被検試料中のコムギ内在性遺伝子を検出、定量する方法に関する。特に食品素材、加工食品中に含まれる遺伝子組換えコムギの混入率を決定する際に用いるコムギ内在性 DNAの検出又は定量方法に関する。

背景技術

[0002] 日本では、現在までにトウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ等について 50種以上の遺伝子組換え農作物（以下「GMO」、う）が安全性審査を経て輸入や販売を認められている。これに伴って、 GMO含有食品は、「遺伝子組換えに関する表示に係る加工食品品質表示基準第 7条第 1項及び生鮮食品品質表示基準第 7条第 1項の規定に基づく農林水産大臣の定める基準」（平成 12年 3月 31日農林水産省告示第 517 号)、及び「食品衛生法施行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について」（平成 13年 3月 15日厚生労働省食発第 79 号）に基づき、その表示が義務化されている。

[0003] しかし、海外では、一度安全性評価が終了すると GMOと非 GMOが混在する形で栽培されることもあり、収穫後の流通の過程でも混入の可能性を否定できない。また、食品メーカ等は、加工食品の製造を製造業者に委託することも多ぐ仮に非 GMO を使用するように指定して委託しても、製造業者の工場で GMOも使用して、る場合は、この GMOが加工食品に微量混入してしまうことがある。従って、表示の義務を遵守するためには、食品メーカ等は、完成したカ卩工食品中にも GMOが混入していないカゝどうか検査分析して確認することが求められる。

[0004] 加工食品及びその原料等の被検試料中の GMO検出方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「PCR」という）によって組換え DNAを検出する方法、 ELISA法によつて組換え蛋白質を検出する方法等がある。加工食品の場合、加熱や加圧によって蛋白質が変性していることが多いため、 ELISA法では正確な検出ができないことも多ぐ PCR法による検出が一般的に行われる。

[0005] 検査分析する方法として、 JAS分析試験ハンドブック遺伝子組換え食品検査 ·分析マニュアル改訂第 2版 (非特許文献 1)に記載される方法や、『組換え DNA技術応用食品の検査方法について (一部改正)』 (平成 15年 6月 18日厚生労働省食発第 0 618002号）に記載される方法がある。これらによれば、 GMOの検査分析においては、被検試料カゝら抽出した DNAで PCR増幅が可能かどうかを確認する目的で、各農産物の内在性 DNAを検知するプライマーペアを用いて PCR法を行い、予想される長さの PCR産物が得られることにより確認する必要があることが記載されて、る。また、被検試料中に含まれる GMOを定量する場合には、その農産物が必ず持っている内在性 DNAに対する組換え DNAの存在比率から、組換え体の混入率を相対的に測定する方法が用いられる。

[0006] 例えばトウモロコシでは、 5系統の承認 GMO品種それぞれに対して特異的な検知プライマーペアのほか、トウモロコシの内在性 DNAとして SSIIB遺伝子の領域を検知するプライマーペアが開発されて、る (非特許文献 1)。

[0007] 『組換え DNA技術応用食品の検査方法について（一部改正)』（平成 15年 11月 1 3日食安発第 1113001号)では、定量 PCR法を行う際、トウモロコシ又はダイズの内在性 DNA及び組換え DNAを標的とした特異的プライマー対により増幅された増幅産物をプラスミド上に連結したものを標準物質として使用している。かかる標準物質を用いて定量 PCR法を行うことにより、被検試料について一定時間定量 PCRを行った場合に組換え DNAのコピー数と内在性 DNAのコピー数との比を正確に求めることができる。

[0008] トウモロコシのように複数の系統の GMO品種が存在する場合には、各系統に特異的な DNAと内在性 DNAとを一つの環状 DNAに組み込んだ標準物質を用いれば、各系統の混入率の測定において共通の標準物質を用いることができ、特に有用である。

[0009] また、一般に、各系統に特異的な遺伝子は入手が困難であるが、一度これらを組み込んで複製可能な DNAを作製すれば、この DNA自体を複製することによって、系統特異的な DNAを安定して供給することも可能となる。 [0010] 一方、パンコムギにつ、て、現在のところ安全性審査を経た遺伝子組換え品はなヽ力近い将来の上巿が予想される。このため、コムギの GMOが流通した場合に備えて、コムギの内在性 DNAを検出及び定量する方法及びこれに用いる PCR用プライマーペアの開発が求められて、る。

[0011] コムギは他の穀物に比べ、遺伝子の存在形態に様々なバリエーションが存在する。

これはコムギ品種により 6倍体、 4倍体、 2倍体の遺伝子型が存在するからである。例えば、一般的なパンコムギの場合 6倍体 (AA、 BB、 DD)であるが、それぞれの遺伝子は類似しているものの、転座などにより部分的な相違が認められている。一方、デュラムコムギは 4倍体であり、ゲノム DDを有して!/ヽな!、。

[0012] また、コムギの場合には、同じ穀物の中にゲノム構造やコードされる遺伝子の塩基配列について相同性の高い麦類、例えばォォムギ、ライムギ、オーツムギなどがある。これら麦類はパンコムギとの相同性が高ぐ誤検出される可能性が高い。

[0013] このような事情から、コムギについては、 a)コムギ品種で普遍的に存在し、 b)コムギ品種により存在量 (検出量)が偏らず、 c)他の穀物が存在しても交差性なくコムギのみ検出可能であり、 d) PCR反応で定量的に増幅される、という条件を満たす DNA配列の発見が困難となっている。

[0014] 国際公開パンフレット WO2005Z097989号 (特許文献 1)は、このような条件を満たすコムギ内在性 DNAとして、 Waxy遺伝子 (非特許文献 2を参照）の部分配列等を用いることができることを開示して！/、る。

特許文献 1：国際公開ノンフレット WO2005Z097989号

非特許文献 1： AS分析試験ハンドブック遺伝子組換え食品検査'分析マ-ユアル改訂第 2版

非特許文献 2 :Ainsworth C, et al, Plant Mol Biol. 1993 Apr;22(l):67- 82

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0015] し力しながら、 Waxy遺伝子を欠損した変異体であるモチコムギが知られており、モチコムギを含む被検試料にお!、ては、上記特許文献 1に開示された Waxy遺伝子の部分配列を検出しても、コムギ内在性 DNAを正確に測定することができない。また、 Waxy遺伝子はコムギの Dゲノム上に存在すると考えられるため、 Dゲノムを有しないデュラムコムギのゲノム上には存在しない。従って、特許文献 1に開示された方法は、デュラムコムギとパンコムギを識別することを目的としている場合には有用であるが、デュラムコムギとパンコムギとを併せて「コムギ」として検出することが要請される場合も多ぐ力かる状況では別途デュラムコムギの内在性 DNAを見出し、検出'測定しなければならない。

[0016] そこで、本発明は、上記 a)〜d)の条件を満たす、さらなるコムギ内在性配列を見出し、被検試料中のコムギ内在性 DNAを、ポリメラーゼ連鎖反応によってより正確に検出又は定量する方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0017] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、コムギのゲノム DNAにおいて、 Proline rich protein (PRP)遺伝子（C. A. Raines et al., Plant Molec ular Biology 16: 663-670, 1991)の一部の領域はコムギ品種で普遍的に存在し、力つ PCR反応において他の植物との交差性が無ぐ当該領域を増幅することによってコムギ内在性 DNA配列を特異的に検出又は定量できることを見出し、本発明を完成させた。

[0018] 即ち、本発明は、

〔 1〕被検試料中のコムギ内在性 DNAを、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出又は定量する方法であって、前記被検試料中の核酸又は前記被検試料から抽出した核酸を铸型とし、配列番号: 2に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を増幅可能なプライマーペアを用いて該領域の核酸を増幅する工程と、前記増幅された核酸を検出又は定量する工程と、を含む方法；

〔2〕前記配列番号： 2に記載の塩基配列の部分配列力なる領域が、配列番号： 11 力も 18のいずれか 1つに記載の塩基配列力もなる領域である、上記〔1〕に記載の方法；

〔3〕前記プライマーペアが、（0配列番号: 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号: 4に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、 GO配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号: 4に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（m)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号: 6に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、 Gv)配列番号: 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号: 6に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、 ( V)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 7に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（vi)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号: 8に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（vii)配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号: 8に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（viii)配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 7 に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、及び Gx)前記 G)〜(viii)のプライマーペアのそれぞれにおいて、各核酸が有する塩基配列の少なくとも 80%の連続した塩基配列を含む核酸のペア力なるプライマーペア、からなる群から選択されるプライマーペアである上記〔1〕に記載の方法；

〔4〕前記プライマーペアに含まれる各プライマーが 15〜40塩基長の核酸である、上記〔1〕から〔3〕の、ずれか 1項に記載の方法；

〔5〕前記ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された領域を、配列番号： 9又は 10に記載のプローブを用いて検出する、上記〔1〕から〔4〕のいずれか 1項に記載の方法；〔6〕上記〔3〕に記載のプライマーペアのうち少なくとも 1つのプライマーペアを含む、被検試料カゝらポリメラーゼ連鎖反応によってコムギ内在性 DNAを検出又は定量するためのキット；

〔7〕遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性 DNA として、配列番号： 2に記載の塩基配列又はその部分配列力なる DNAと、遺伝子組換えコムギ特異的 DNAとして、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる 1以上の DNAと、を含む複製可能な DNA;

〔8〕遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性 DNA として、配列番号： 2に記載の塩基配列又はその部分配列力なる DNAと少なくとも 80%の相同性を有する塩基配列からなる DNAと、遺伝子組換えコムギ特異的 DN Aとして、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列力なる 1以上の DNAと、を含む複製可能な DNA; 〔9〕前記配列番号： 2に記載の塩基配列の部分配列力なる DNAが、配列番号： 11 力も 18のいずれか 1つに記載の塩基配列力もなる DNAである、上記〔7〕又は〔8〕に記載の方法；

〔10〕遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性 DN Aとして、上記〔3〕に記載のプライマーペアのいずれかを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅可能な配列からなる DNAと、遺伝子組換えコムギ特異的 DNAとして、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる 1以上の DNAと、を含む複製可能な DNA;

〔11〕被検試料における遺伝子組換えコムギの混入率を決定する方法であって、上記〔7〕から〔10〕の、ずれか 1項に記載の複製可能な DNAを含む溶液を用いて 2種類以上の濃度希釈系列を作り、それぞれについて定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行つて、前記コムギ内在性 DNAと、少なくとも一種類の前記遺伝子組換えコムギ特異的 DNAとを増幅し、各部分領域について検量線を求める工程と、前記被検試料について、前記検量線を求める工程と同一の条件で定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記検量線を用いて、被検試料中に存在した、前記コムギ内在性 DNAの分子数と前記遺伝子組換えコムギ特異的 DNAの分子数とを求める工程と、を含む方法；〔12〕前記被検試料中に存在した、前記遺伝子組換えコムギ特異的 DNAの分子数を、前記コムギ内在性 DNAの分子数で除して得られる比 Aと、遺伝子組換えコムギの各系統の標準種子を用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行って求められる、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な DNAの分子数を、コムギ内在性 DNAの分子数で除して得られる比 Bと、を用い、式 100 XAZBを計算して、前記被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を決定する工程、をさらに含む、上記〔11〕に記載の方法;及び、

〔13〕前記コムギ内在性 DNAの増幅を、請求項 3に記載のプライマーペア力選択される少なくとも 1つのプライマーペアを用いて行う、上記〔11〕又は〔12〕に記載の方法、に関するものである。

発明の効果

本発明によれば、 PRP遺伝子の一部領域を PCR法により増幅することによって、食品素材及び加工食品等の被検試料から、他の作物と交差することなくコムギ内在性 DNAを特異的に検出又は定量することができる。

さらに、該方法により提供される遺伝子組換えコムギ（以下「GMコムギ」という場合もある）検知のための標準物質を用いることにより、定量 PCR法で、被検試料中の G Mコムギの混入率を GMO系統別に精度良く求めることが可能となる。

発明を実施するための最良の形態

[0020] 以下に、本明細書において用いる用語の意味等を示し、本発明を詳細に説明する本明細書において、用語「コムギ」は特にことわりがない限りパンコムギ、デュラムコムギ、及びモチコムギを意味する。

[0021] 本発明の方法は、コムギの内在性 DNA配列として、コムギゲノム上の PRP遺伝子（ GeneBank Accession No. X52472,配列番号： 1)の特定部分、即ち、配列番号： 2に記載の塩基配列又はその部分配列力もなる領域を検出するものである。

[0022] 各種のコムギ品種にぉ、て、特許文献 1に開示された Wx012領域と、 PRP遺伝子の複数の部分領域を PCRにより増幅したところ、 Wx012領域の増幅産物と、 PRP遺伝子の各領域の増幅産物との比は、 1 : 1〜1： 3の間で変動することがわ力つた。 1 : 1 以外の比となるのは、 PRP遺伝子上に同一のプライマーで増幅される領域が複数存在すること〖こよるものと考えられるので、カゝかる領域は本発明に用いられるコムギ内在性配列としては適当でない。そこで、本発明者らは、さらに検討を重ねた結果、配列番号: 2に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域 (ただし 80塩基以上の領域）を増幅すれば、当該増幅産物と、 Wx012増幅産物とが、 1 : 1の割合で得られることを見出した。

[0023] また、配列番号： 2に記載の塩基配列又はその部分配列は、デュラムコムギでも検出されることを確認した。このことから、 PRP遺伝子は、コムギゲノムの A又は B上に存在すると推定される。現在市場に流通するコムギにはパンコムギ、デュラムコムギ、モチコムギなどが含まれるので、検出するコムギ内在性遺伝子としては、これらのコムギ品種に共通して存在し、品種により存在量が変化しない遺伝子が好ましいところ、これらのコムギ品種にはゲノム A、 Bが必ず存在するので、この点でも配列番号： 2に記載の塩基配列力なる領域がコムギ内在性遺伝子として好ま、。

[0024] 一方、 PRP遺伝子には非常に類似したシユード遺伝子が存在することが確認されている。このため、加工食品中のコムギゲノムを増幅する際、 PRP遺伝子の全長から無作為に選択した部分配列を増幅するプライマーを使用すると、シユード遺伝子の部分配列も同時に増幅される可能性がある。すなわちコムギ品種によっては単位コムギあたりの DNA増幅量が一定にならない場合が想定される。しかしながら、本発明者らは、配列番号: 2に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を増幅するプライマーを用いて PCRを行えば、シユード遺伝子とも交差することなく PRP遺伝子の当該領域のみを増幅できることを確認した。

[0025] さらに、配列番号： 2に記載された塩基配列からなる領域は、 330bpとゲノム全長に比べ極端に短いため、 DNAが断片化されている可能性のある加工食品等の試料からもコムギ内在性 DNAの検出及び定量が可能である。

[0026] 配列番号 : 2に記載された塩基配列の部分配列は特に限定されないが、 80塩基長以上の配列が好ましぐ特に、配列番号： 11〜18のいずれか 1つに記載の塩基配列が好ましい。これらの配列は、配列番号： 3〜8に記載の塩基配列を含む核酸力なるプライマーを適宜組合せることによって PCRにより増幅することができる。

図 1に、配列番号： 2における、配列番号 3〜8に記載のプライマーの結合領域を示す。

[0027] 尚、配列番号： 3〜8に記載のプライマーの塩基長を変更したり、プライマーが結合する領域をわずかに変更したりすることにより、増幅される配列も、配列番号：11〜1 8に記載の塩基配列からなる領域とわずかにずれた領域となるが、それらの領域も本発明における「配列番号： 2に記載された塩基配列の部分配列」に含まれる。このような領域としては、例えば、配列番号： 3〜8に記載の塩基配列と 80%以上、好ましくは 90%以上共通の領域を有する領域が挙げられる。

[0028] 本発明において PCR法に用いられるプライマーペアは、配列番号： 2に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を増幅できるプライマーペアであれば特に限定されず、増幅しょうとする領域の塩基配列に基づいて、プライマー作成上の基本ルールを遵守して設計することができる。その際、各プライマーの Tm値の統一を図ることに留意する。また、各プライマーの長さは、通常は 15〜40bp、好ましくは 15〜30b Pである。

[0029] 本発明にかかる方法では、使用するプライマーペアがコムギ以外の作物と交差反応すると、コムギ検出の偽陽性の可能性が生じるば力りでなぐ被検試料中のコムギ内在性 DNA配列の正確な定量は困難となる。また、本発明の方法は、食品素材及びカ卩工食品等の被検試料中のコムギの存在及びその量の正確な情報を与えるものである。従って、本発明の方法に用いる PCR用プライマーペアは、コムギを特異的に検出し、コムギ以外の作物、例えばコ入ォォムギ、ライムギ、オーツムギ、ナタネ、トウモロコシ、ァヮ、キビ、ソバ等とは交差反応しないことが必要である。

[0030] このようなプライマーペアとしては、例えば、（0配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 4に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、 GO配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 4に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（iii)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 6に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（iv)配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号: 6に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（V)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 7に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（vi)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 8に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（vii)配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 8に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（viii)配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 7に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、及び、（ix)前記 (i)〜(viii)のプライマーペアのそれぞれにお、て、各核酸が有する塩基配列の少なくとも 80%、好ましくは 90%、さらに好ましくは 85%の連続した塩基配列を含む核酸のペアからなるプライマーペア等が挙げられる。これらのプライマーペアは配列番号： 2に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を、コムギ以外の作物と交差性なぐ特異的に増幅することができる。

[0031] また、本発明に係る方法においては、ポリメラーゼ連鎖反応で増幅された領域を検出するプローブは、増幅産物を定量的に検出できる限り特に限定されないが、配列番号 9又は 10に記載の塩基配列力もなるプローブを用いて検出することが好ましい。これらのプローブは、増幅産物、即ち配列番号： 11〜18のいずれかに記載の塩基配列からなる領域の一部に高い特異性をもって結合するので、増幅産物を定量的に検出することが可能である。図 1には、配列番号： 9又は 10に記載の塩基配列からなるプローブが結合する領域も示されてヽる。

[0032] 本発明で用いられる被検試料は、コムギを含む又は含む可能性のある食品素材及び加工食品であり、例えばコムギの生の種子、乾燥種子、小麦粉やミックス粉などの食品原料やその加工中間原料、パン類ゃ麵類などの加工食品が含まれる。また、食品素材又は食品はヒトの食品のみならず、ペットフードや飼料を含む。さらに、コムギ以外の作物は、食品素材、食品原料として用いられる全ての作物を意味し、例えば上述した作物である。

[0033] このような試料は、例えばそのまま、又は粉砕して核酸抽出に供してもよぐ洗浄して乾燥させてから破砕して核酸抽出に供してもよい。被検試料カゝら抽出して分析に用いる核酸は通常は DNAである。 DNAは公知の任意の方法によって抽出してもよいが、現在は多数の DNA抽出キットが市販されており、これらを用いて抽出することができる。例えば DNeasy Plant Maxiキット（QIAGEN社製）を用いて Kopellらの方法（Kopell, E. et al, Mitt. Gebiete Levensm, Hyg., 88, 164)に従って被検試料から DNAを抽出する。抽出した DNAは、吸光度の測定などにより濃度を求め、 PCRに好適な濃度まで希釈して用いることが好まし、。

[0034] 本発明の方法において、 PCRは、使用するプライマーや DN Aポリメラーゼを考慮して常法に従って行うことができる。その際に、 PCR緩衝液、 dNTP, MgC12等の試薬は調製してもよいし、市販の PCRキットを用いてもよい。 PCR〖こは、上記プライマーペアを一組又は二組を以上用いてもよい。また、 PCR条件は、例えば 95°C30秒、 6 3°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 40サイクル行い、最後に終了反応として 72 °C7分間という条件が挙げられる力用いるプライマーの Tmや増幅すべき領域の長さ、铸型 DNAの濃度などを考慮して適宜変更することができる。

[0035] 増幅された核酸 (PCR産物）の検出は、特定の DNA断片を同定しうる任意の方法、具体的にはァガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、キヤピラリー電気泳動、ノ、イブリダィゼーシヨン、免疫学的方法などを用いて実施することができる。一般的には、 PCR産物を電気泳動し、その泳動パターンにより確認するが、例えばェチジゥムブ口ミドを含む 0. 8%のァガロースゲルによる電気泳動を行い、バンドを確認すること〖こよって検出することができる。

[0036] 本発明は、上述の検出又は定量方法で用いるプライマーペア、及びそれらのブライマ一ペアを含むキットを含む。プライマーは常法に従って製造することができる。また、キットはプライマーペアのほ力、、他の試薬、例えば dNTP、 MgCl、 TaqDNAポリ

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メラーゼなどのポリメラーゼ、緩衝液（例えば Tris— HC1)、グリセロール、 DMSO、ポジティブコントロール用 DNA、ネガティブコントロール用 DNA、蒸留水等を包含してもよい。これらの試薬はキットの中で、それぞれ独立に梱包されて提供されてもよいし、 2種以上の試薬が混合された形で提供されてもよい。キット中のそれぞれの試薬濃度に特に制限はなぐ本発明の PCRを実施するについて可能な範囲であればよい。また、キットには、好適な PCR条件等の情報がさらに添付されていてもよいし、プライマー試薬のみであってもよヽ。

[0037] また、本発明は、 GMコムギの混入率を定量 PCR法によって測定する際に有用な、標準物質を提供する。この標準物質は、 Non-GMコムギと GMコムギとが共通して有する内在性 DNAと、 1以上の GMコムギ特異的 DNAとを、 1つの複製可能な DNA 上に連結したものである。尚、上記部分配列としては、配列番号： 11〜18のいずれ力 1つに記載の塩基配列力もなる DNAを用いることができる。

[0038] 本発明に係る標準物質は、例えば、内在性 DNAとして、配列番号： 2に記載の塩基配列またはその部分配列力なる DNAと少なくとも 80%の相同性を有する塩基配列からなる DNAを含む複製可能な DNAであってもよい。

[0039] 標準物質として用いられる複製可能な DNAは、内在性 DNA及び GMコムギの系統特異的 DNAを挿入できるものであれば特に限定されず、例えば、 pBR系ベクター (例； pBR322、 pBR328等）、 pUC系ベクター（pUC19、 pUC18等）、 λファージ系ベクター（ gtlO、 gtl l等）、これらに改変をカ卩えた市販のベクター等を用いることができる。

[0040] GMコムギを検出する場合は、遺伝子組換えにより普通コムギゲノムに挿入された外来 DNA配列のみを増幅して検出するのではなぐ外来 DNA配列の上流及び下流の内在性配列を含む領域を増幅する必要がある。他の作物にも、同一の外来 DN A配列を挿入して GMOを作製する場合があるため、外来 DNA配列のみ検出すると、 GMコムギ由来なの力、他の作物の遺伝子組換え体なのかが判別できないからである。従って、 GMO系統特異的配列を検出するためのプライマーは、各系統の GM コムギに挿入された外来 DNA配列とその上流及び下流の内在性配列を含む領域を増幅できるプライマーである必要がある。かかるプライマーは、例えばダイズについて報告された上記 Kopellらの方法、及び Wurzらの方法（Wurz, A. et al.; 2nd Status rep ort. BgVV, BgW-Heft, 1/199797,118)、又はそれに準じた方法に従って、作製される。上記標準物質に挿入される GMコムギの各系統に特異的な配列は、それらのプライマーで増幅できる DNA配列が選択される。

[0041] 標準物質に挿入するコムギ内在性 DNAと、 GMコムギ特異的 DNAとが決定されたら、普通コムギゲノム又は GMコムギゲノムを铸型とした PCRを行って、内在性 DNA 及び GMコムギ特異的 DNAをクローユングし、クローユングした DNA断片と上記複製可能な DNAのクローユングサイトとを同一の制限酵素で切断することにより、 DN A断片を複製可能な DNAの切断された部位に連結することができる。制限酵素は、自体公知のものを適宜選択して使用することができ、例えば、 EcoRI、 Spel、 EcoRV、 S mal、 Sacl、 NotI、 HindIII、 Xhol等が用いられる。

[0042] こうして作製された標準物質を含む溶液について、 2種以上の希釈系列を作り、それぞれについて定量的 PCRを行うと、コムギ内在性 DNA配列、 GMO特異的 DNA 配列の部分領域のそれぞれについて、検量線を求めることができる。さらに、本発明に係る標準物質は、定性 PCRにおけるコムギ内在性 DNA配列又は GMO特異的 D NA配列のポジティブコントロールとしても利用することができる。

[0043] 本発明は、上述の標準物質を用いたポリメラーゼ連鎖反応により、被検試料中における GMコムギの混入率を決定する方法を包含する。該方法は、上述の標準物質を用いて、特定の配列の検量線を求める工程と、被検試料について、検量線を求めるときと同一の条件で定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行って、コムギ内在性 DNA配列の部分領域及び GMコムギ特異的 DNA配列の部分領域を増幅し、検量線を用いて、被検試料中に存在したコムギ内在性 DNA配列の部分領域、及び GMコムギ特異的 DNA配列の部分領域の分子数を求める工程と、を含む。

[0044] 被検試料における GMコムギの混入率を計算する場合は、まず、被検試料中の G Mコムギ特異的 DNA配列の部分領域の分子数を、コムギ内在性 DNA配列の部分領域の分子数で除して得られる比 Aを求める。また、遺伝子組換えコムギの標準種子を用いた定量的 PCRを行って求められる、 GMコムギの各系統に特異的な DNA 配列の部分領域の分子数を、コムギ内在性 DNA配列の部分領域の分子数で除して得られる比 Bを求める。そして、式 100 XAZBを計算して、被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を決定する工程と、を行うこと〖こよって求めることができる。上記比 Bは、非特許文献 1において「内標比」と呼ばれるものであり、純粋な GM系統毎の種子カゝら抽出した DNA中の (組換え遺伝子) Z (内在性遺伝子）の比率である。内標比は、各組換え系統種子中で一定の比率を示す。

[0045] 本発明に係る GMコムギ混入率の決定方法にぉ、て行われる各 PCR工程は別々に実施することができるが、同時に実施してもよい。なお、各 PCR工程は、検量線を作成するために行った PCRと、略同一の速度で核酸の増幅反応が起こる条件で行うことが好ましい。かかる条件としては、例えば、検量線を作成するために行った PCR と温度及びサイクルを同一とする条件が挙げられる。また、 GMコムギの混入率の算出は、内在性 DNAと組換え DNAの量を別個に測定して、その測定結果から算出してもよいが、非特許文献 1の方法に従ってリアルタイム PCR装置により増幅し、 GMコムギの混入率を算出することが可能である。尚、本発明にお、て「組換え DNA」とは、人為的にコムギに導入した任意の外来性 DNAであり、例えば外来性遺伝子をコードする領域、未転写もしくは未翻訳領域、リンカ一領域、ベクター部分の DNAを意味する。

実施例

[0046] 以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されず、様々な実施形態が可能であり、本発明は本明細書及び図面に開示の思想に従ったものであるかぎり、すべての実施形態を包含することは理解されるべきである。 [0047] なお、以下の実施例においては、次に示す試料、試薬及び装置を使用した。

(1)試料

コムギ（Triticum aestivum)は、次の品種の乾燥種子を用いた： Hank、 Scarlet, Tara 、 YearaRojo、 Finch ^ Lewjain、 Rod、 W eatherford、 Estica、 Buchanan ^ Finley、 uarlan d、 TAM107、 Declo、 Hattonゝ Morgan^ Neely、 Ramp、 Amidon、 Ernest、 Mcneal、 AC— B arrie、 AC- Splender、 CDC- Teal、 Laura, -シカゼ、 -シホナミ、チタゴィズミ、ッガル H DC、シロガネ、シラサギ、ビホロ HDN、ホクシン、バンドゥヮ、キタ HDI、農林 61号、はつもち、もち乙女、関東 107、白火。

デュラムコムギ（Triticum durum)は、次の品種の乾燥種子を用いた： AC Navigator 種。

トウモロコシ (Zea mays)は、次の品種の乾燥種子を用いた：デントコーン。ダイズ（Glycine max)は、次の乾燥種子を用いた：遺伝子組換えダイズ Roundup Re ady Soy系統後代品種。

コメ（Oryza sativa)は、次の品種の乾燥種子を用いた：コシヒカリ種。

ォォムギ（Hordeum vulgare)は、次の品種の乾燥種子を用いた：ベンケィ種。

オーツムギ (Avena sativa)は、次の品種の乾燥種子を用いた：巿販品種。ライムギ（Secale cereale)は、次の品種の乾燥種子を用いた：巿販品種。ナタネ（Brassica napus)は、次の品種の乾燥種子を用いた： canola種。

ァヮ（Setaria italica Beauvois)は、次の品種の乾燥種子を用いた：モチアヮ種。キビ（Panicum miliaceum Panicum)は、次の品種の乾燥種子を用いた：モチキビ種。マイ口（Sorghum subglabrescens)は、次の品種の乾燥種子を用いた：市販品。

ソバ（Fagopyrum esculentum)は、次の品種の乾燥種子を用いた：在来品種。

[0048] (2)試薬

(2—1)試料力もの DNA抽出には以下の試薬を使用した。

ラウリル硫酸ナトリウム（SDS) (試薬特級） (Sigma Chemical Co.)

QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit (QIAGEN GmbH)

QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN GmbH)

DNAの電気泳動には以下の試薬を使用した。酢酸（試薬特級）（和光純薬： Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) トリス [ヒドロキシメチル]ァミノメタン (Tris) (試薬特級） (Sigma Chemical Co.) エチレンジァミン四酢酸（EDT A) (試薬特級） (Sigma Chemical Co.) ァガロース粉末"し03「丁&1 &1½」"（丁&1¾1½ Shuzo Co.,Ltd.)

ェチジゥムブロミド (Sigma Chemical Co.)

ブロムフエノーノレブノレ一 (Sigma Chemical Co.)

キシレンシァノール（Sigma Chemical Co.)

DNAマーカー" lkbラタ、、一"（New England Biolabs Inc.)

DNAマーカー，， lOObpラダー，， (New England Biolabs Inc.)

[0049] (2 - 2)定性的 PCRには以下の試薬を使用した。

DNAポリメラーゼ" AmpliTaq Gold" (Applied Biosystems)

X 10 PCRバッファー II (Applied Biosystems)

[0050] (2— 3)プラスミド作製'精製には以下の試薬を使用した。

DNAポリメラーゼ，， AmpliTaq Gold" (Applied Biosystems)

X 10 PCRバッファー II (Applied Biosystems)

DNAポリメラーゼ，， KOD" (TOYOBO Co., Ltd.)

X 10 PCR /くッファー II (TOYOBO Co.'Ltd.)

TOPO TA Cloning Kit with TOP10F' Cells (Invitrogen Co.)

酵母エキストラタト（Difco Laboratories)

トリプトンペプトン（Difco Laboratories)

NaCl (試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

ァガー粉末（TAKARA BIO)

D[-]- a -Aminobenzylpenicillin(Ampicilin)Sodium Salt(Sigma Chemicalし o.)

QIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN GmbH)

エタノール（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

2—プロパノール（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) トリス [ヒドロキシメチル]ァミノメタン (Tris) (試薬特級） (Sigma Chemical Co.) エチレンジァミン四酢酸（EDTA) (試薬特級） (Sigma Chemical Co.) 制限酵素" EcoRI" (TaKaRa Shuzo Co., Ltd.)

制限酵素" Sacl" (New England Biolabs Inc.)

制限酵素" XbaI" (New England Biolabs Inc.)

Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (Invitrogen)

フエノール（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

クロ口ホルム（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)

イソアミルアルコール（試薬特級）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) [0051] (2— 4)定量的 PCRには、以下の試薬を使用した。

TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems)

[0052] (3)装置

(3— 1)試料力もの DNA抽出には以下の装置を使用した。

粉砕器，， Multi Beads Shocker MB301" (Yasui Kikai Co.)

[0053] (3— 2) DNAの電気泳動には以下の装置を使用した。

電気泳動装置" Mupid 2" (Advance Co.,Ltd.)

[0054] (3— 3)定性的 PCRには以下の装置を使用した。

サーマルサイクラ一" PTC- 200" (MJ Research Inc.)

[0055] (3— 4)定量的 PCRには以下の装置を使用した。

定量的 PCR装置，， ABI PRISM 7700 Sequence Detector System" (Applied Biosyste ms)

尚、プライマー、及びプローブの合成は Operon社に委託した。

[0056] [実施例 1]プラスミドの構築

Ernest品種コムギ種子より Genomic DNAを抽出し、この DNAを铸型に PCRを行った。増幅対象は表 1に示すとおり、コムギ内在性遺伝子候補 2種類 (PRP遺伝子及び Wa xy遺伝子）と、仮想 GMコムギ遺伝子として RRS遺伝子について実施した。使用した Pr imerを表 2に示す。尚、 RRS遺伝子とは、後述するように、ラウンドアップ耐性遺伝子である。

[0057] [表 1] 遺伝子名 -般名サイズ（bp)

PRP Proline rich protein 259

Waxy WaxyDl 529

RRS Enolpyrnylshiicimate phosphate synthase 1886

[0058] [表 2]

次に、得られた増幅 DNAを铸型に制限酵素付加 Primerを用い再度 PCRを行った。そして、得られた増幅 DNAは制限酵素消化後、精製断片を pUC19ベクターにライゲーシヨンし、これを大腸菌に形質転

換した。ある、はベクター pCR4に TAクローユングした。

得られたクローンは制限酵素マッピングにより挿入断片を確認後、シーケンシングにより全配列の確認を行った。

[0059] TAクローユングした各クローンを制限酵素消化後、精製断片を pUC19ベクターにラィゲーシヨンし、これを大腸菌に形質転換した。

形質転換体よりプラスミドを抽出精製し、配列の確認を行った。

[0060] 以上の流れによりプラスミドを構築した。具体的には制限酵素付加プライマーを用 V、増幅した WaxyDl領域を Xbalで消化後、これを同じく Xbalで消化後脱リン酸ィ匕した p UC 19にライゲーシヨンし、 pWIGOlを構築した。

[0061] PCR増幅した RRS遺伝子をー且 TA Cloningし、得られたプラスミド pRRSを EcoRI、 Sa clで消化し、 RRS断片を精製した。同じく pWIGOlを EcoRI、 Sadで消化し、プラスミドを精製後、ここに RRS断片をライゲーシヨンし、 pWIG02を構築した。 [0062] PCRにより増幅した PRP領域をー且 TA Cloningし、得られたプラスミド pPRPを EcoRI で消化し、 PRP断片を精製した。同じく PWIG02を EcoRI、で消化し、脱リン酸化後、ここに PRP断片をライゲーシヨンし、 pWIG03を構築した。

[0063] 構築したプラスミドはシーケンシングを行ヽ、挿入配列の確認を行った。確認された配列は全て目的配列と一致した。

[0064] 尚、実施例 1〜3において用いた各手法を、以下に具体的に示す。

(1) 制限酵素消化

各制限酵素マニュアルに従い実施した。すなわち、各 DNA溶液と酵素に添付の X I 0バッファー、蒸留水、制限酵素を混合し、通常 37°C2時間反応した。

(2) 消化後の DNA断片精製

Agaroseゲル電気泳動で分離した。ゲルからの精製は QIAGEN社製キットを使用した。すなわち、目的 DNAを含んだゲルを加熱融解し、 DNAをシリカ膜に結合させた。シリカ膜を、エタノールを含む溶液等で洗浄した後、蒸留水で溶出した。

(3) 制限酵素消化プラスミドの脱リン酸ィ匕

制限酵素消化後脱塩処理したプラスミドを CIAP (GIBCO社製）と専用バッファーを混合

し 37°C30分間反応した。反応後フエノール処理により CIAPを失活せしめ、エタノール沈殿で脱リン酸ィ匕プラスミドを回収した。

(4) DNAライゲーシヨン

TAKARA社製 DNA ligationキット Ver.2を使用した。すなわち、目的 DNAを混合し、キットの反応混合液 (soln I)を等量カ卩え、 16°Cで 30分間静置することにより DNAをライゲーシヨンした。

(5) 形質転換

TOYOBO社製 Competent Cell E. coli DH5 aを使用した。融解した 10〜50 μ 1コンピテントセルを氷上で DNAと 30分間混合静置し、 42°Cで 50秒間ヒートショック後、氷上に戻し、 2分後 37°Cに暖めておいた SOC培地を 450 1添加、 37°Cで 1時間インキュべートした。この溶液をサークルグロ一培地 +プレートに 100 1/plate展開し、 37°Cで 1 6時間培養した。 (6) 培養

プラスミド精製の目的での培養は培地サークルグロを用いて実施した。プラスミド産生の選択圧には Amp耐性を利用し、終濃度 100 g/mlのアンピシリンを用いた。培養は試験管振盪器で、 37°C 14から 16時間行った。

(7) PCR

アプライドバイオシステムズ社製 AmpliTaq Gold polymeraseを使用した。反応組成としては表 3の組成を用いた。反応条件は表 4のように実施した。

[0065] [表 3]

10 X Buffer 2.5

25m MgCI2 1.5

2.5mM dNTP 2.0

Primer pair 2.5

5u/ U I Taq 0.25

MQ H20 15.75

50ng/ l DNA 0.5

total 25.0

[0066] [表 4]

(8) TAクローニング

TAクローユングは、インビトロジェン社製 TOPO ΤΑクロー-ングシステムを用い、同社マニュアルに従!、実施した。

(9) DNAシーケンシング

DNAのシーケンシングは、ベックマンコールター社製 CEQ8000を用い、同社マ-ュアルに従い実施した。キットとして同社 DTCS Quick Start Master Mixを用いた。

(10) Real-Time PCR SYBR法

TAKARA社製キット（TAKARA SYBR Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time) Code No. : RR041A)を用いて行った。

1) Template DNA (Plasmid)を表 5に従って希釈した（希釈には ColEl 5ng/ μ 1溶液を用た)。

2) Unknown DNAは、 10倍力 2倍の希釈列で各 4点調製した（希釈には ColEl 5ng/ 1溶液を用いた)。

3) MasterMixは、表 5に従って、 Primer毎に調製した。

4) MasterMixと TemplateDNAを混合した。

5)表 6に示す条件で反応を開始した。

[0067] [表 5]

[0068] [表 6]

(11) Real-Time PCR TaqMan法

TAKARA社製キット（TAKARA Premix Ex Taq™ (Perfect Real Time) Code No.： R R039

A)を用いて行った。

1)各種 Genomic DNA濃度を希釈せずに Templateとした。

2) Master Mixは、表 7に従って Premix、 ROX、 Primer, Probeを混合して調製した。

3) Master Mix 16 μ 1/wellと Template DNA 4 μ 1/wellを混合した。

4)表 8に示す条件で反応を開始した。 [0069] [表 7]

[0070] [表 8]

Template DNA (Plasmid)は表 9に従って希釈した（希釈には ColEl 5ng/ 1溶液を用い

た)。

[0071] [表 9]

(12) 種子の粉砕少量の場合

上述した粉砕器 Multi Beads Shocker MB301を使用した。

1) 2mlチューブに種子を 1粒入れ、金属コーンを入れふたをした。

2) 2000rpmで 10秒間の粉砕を 2回行った。

3)粉砕された粉末カゝら直接 DNAを抽出した。

(13) 種子の粉砕大量の場合

ミルを用いて行った。

1)ミルに種子を 30g入れ、ふたをした。 2) 30秒間の粉砕を 2回行った。

3)粉砕された粉末を保管した。

(14) ゲノム DNAの調製

QIAGEN社製キット（QIAGEN Plant Mini Kit)を用いて行った。操作はキットマ-ュアルに従い実施した。

1)粉砕種子に 400 1の API溶液、 4 1の RNaseAを添カ卩し、攪拌した。

2) 65°Cで 10分間インキュベートし、インキュベート中 2、 3回ミックスした。

3) 130 1の AP2を添カ卩し、攪拌後 10分間氷上で放置した。

4)遠心分離（15000rpm=20000g、 5min、 RT)を行った。

5)上清を QIAshredderに全量アプライし、遠心分離（15000rpm、 2min、 RT)を行った。

6)デカントでノススルー上清を別容器に移し 1.5容積 (675 μ 1)の ΑΡ3/Ε添加攪拌した。

7)半量を Spinカラムにアプライし、遠心分離（10000rpm、 lmin、 RT)を行った。

8)フロースルーを捨て、残量を同処理した。

9)新しいチューブにカラムをおき、 500 1の AWを添カ卩し、遠心分離（10000rpm、 lmi n、 RT)を行った。

10)同処理後、フロースルーを捨て遠心分離（15000rpm,2min、 RT)

1.5mlの新しいチューブにカラムをおき 50 1の AEを添カ卩し、室温放置 5分間後、遠心分離（10000rpm、 lmin、 RT)を行った。

[0072] 以下、上述した工程を繰り返した。

(15) DNAの定量

機器は GeneSpecを使用し、マニュアルに従って実施した。

[0073] セルは 5mm、希釈率 1倍、対照は Kit溶出液 (AE)とした。

[実施例 2] PCR増幅効率の確認

PRP、 Waxyの各遺伝子のそれぞれ増幅領域につ!、て標準プラスミド pWIG03を铸型に SYBR

法により ReaKTime PCRを実施した。その結果全ての遺伝子、全ての PCR領域で同一条件下において、铸型濃度依存的な増幅が確認された。増幅産物の融解曲線を確認したところ、ずれの産物も高融点のメインピークを持ち、プライマーダイマーの形成も観察されな力つた。増幅曲線と融解曲線を図 2に示す。また、実施例 2以降において使用したプライマー配列の一覧を表 10に示す。

[0074] [表 10]

[実施例 3]PRP遺伝子中の増幅領域の検索

PRP遺伝子の内、コムギ品種により検出量の変動が無い領域の検索を行った。陽性対照

として Waxy遺伝子を用い、 Wx012増幅領域の検出量に比較して同等の検出が得られる領域を検索した。プライマーペアとして、表 10に示される PRP(U-Fと PRP(U-R P RP03- Fと PRP03- R PRP03- Fと PRP07-Rそれぞれを用い、コムギ種子より抽出した D NAを铸型に SYBR法により ReaKTime PCRを実施した。

[0075] 結果、図 3に示す。 PRP03- Fと PRP03- R PRP03- Fと PRP07- Rのプライマーペアを用いた場合は、 Wx012とほぼ同程度の検出量が確認された。しかし、 PRP(U-Fと PRP 01-Rをプライマーに用いた場合は、 Wx012のおおよそ 3倍量検出された。

[0076] この事から PRP遺伝子の上流領域 (翻訳後のタンパク配列としてアミノ末端側）に相同な遺伝子がコムギ DNAに存在し、当該上流領域は内在性 DNAとして好ましくなヽことが確認された。

[実施例 4]プローブの検索実施例 1から 3までの検討により内在性遺伝子の PCR増幅領域として PRP04-Fから

PRP06-Rまでの領域が好ましい事が確認された。そこで、この領域に対して各種プライマ一ペアに適合するプローブを設計した。プローブの設計はプライマー設計支援ソフト、 Primer Express、もしく ίま Primer3 (The development of Primer «3 and the Primer 3 web site was funded by Howard Hughes Medical Institute and by the National Insti tutes of Health, National Human Genome Research Institute, under grants ROl— HG 00257 (to David C. Page) and P50— HG00098 (to Eric S. Lander). : http://frodo.wi.mi t.edu/cgi- bin/primer3/primer3— www.cgi)を使用した。設計したプローブ配歹 [Jから蛍光標識プローブを合成した。蛍光標識は 5 '末端に FAMを、 3 '末端に TAMRAを標識した。このプローブを用い、標準プラスミドを铸型に TaqMan法による ReaKTime PCR の条件設定を行った。最適な条件を見出した後、各種プライマー (表 10参照）、各種プローブの組合せによる比較を行った。その結果、ずれの組合せにぉヽても良好な増幅が得られ、各同程度の検出効率であった。

[0077] 設計したプローブ配列を表 11に示す。また、各種プライマーを用い得られた結果を図 4に示す。

[0078] [表 11]

[実施例 5」 ReaKTimePCRの条件設定

実施例 1における ReaKTimePCR法に従い、実施例 4記載のプローブを用い、プライマー濃度、プローブ濃度、 PCR反応温度、時間についての各パラメーターを可変させ、最適条件を見出した。選択された条件を表 12及び 13に示す。

[表 12]

[0080] [表 13]

[実施例 6]コムギ品種における普遍性の確認

コムギ品種 40種について、 TaqMan法による ReaKTime PCRにより、その検出量の比較を行った。比較対照はプライマー Wx012-F及び Wx012-Rの増幅産物 Wx012 (配列番号： 31)とした。用いたプライマーは PRP03-Fと PRP03-R、プローブは PRPTaq-1を用いた。 40種類全てでプライマー PRP03-Fと PRP03-Rによる増幅産物 PRP03 (配列番号： 15)は検出された。 Wx012はデュラム種、もちコムギ種を除く全てで検出された。 Wx012の検出された品種で PRP03と比較した結果、全ての品種にお!、てほぼ Wx012 ： PRP03=1: 1の比率であった。

[0081] PRP03が検出された 40種類のうち 20種類のコムギ品種における検出例を図 5に示す。図 5中、はつもち、もち乙女はもちコムギ品種を示し、 AC- Naviはデュラムコムギ品種 AC Navigatorを示す。これらはいずれも検出された。

[実施例 7]仮想 GMコムギによる混入率推定試験

現時点において GMコムギは Monsanto社などにより作出されている力いずれも入手困難である。そこで GMコムギの混入率推定力本発明により見出されたコムギ内在性遺伝子定量により可能である力確認する目的で、仮想 GMコムギを用いて実験を行った。

[0082] Monsanto社が作出した GMコムギはラウンドアップ耐性遺伝子を付与したものであること力ゝら、同じくラウンドアップ耐性遺伝子を付与した GMOである GMダイズを使用することとした。すなわち、 GMダイズ種子を粉砕し、これと AC Barrie品種コムギ種子を粉砕したものを混合し、これを仮想 GMコムギとした。両者の混合率は予備試験により内標比カ^に近づくように検討し、 GMダイズ:コムギ =6 : 94で混合した。この仮想 GM コムギより抽出した DNAを铸型に実施例 5に示した条件の下、 TaqManプローブによる Real-Time PCR法（プローブとして PRP-Taq2、プライマーとして表 14に記載のものを用いた。表中、 RRSはラウンドアップ耐性遺伝子を示す。）でラウンドアップ耐性遺伝子及び内在性遺伝子 (PRP領域)の定量を行った。このとき増幅される配列を、配列番号： 32に示す。得られた RRS定量値をコムギ内在性遺伝子定量値で割った数値を内標比（1.0)とした。

[表 14]

この仮想 GMコムギと別に粉砕したコムギ (YearaRojo品種)を任意に混合した標品力も DNAを抽出し、この DNAを铸型に、本発明の方法に従って、コムギ内在性遺伝子とラウンドアップ耐性遺伝子の定量を行った。その結果を利用して、仮想 GMコムギの混入率を求めた結果を図 6に示す。現実の配合率と、本発明の方法に従って計算により求めた混入率が高い相関性を示すことが確認された。即ち、得られた铸型液量あたりの GMコムギ検出量 (Copy数濃度： Copy/ μ 1)をコムギ内在性遺伝子の铸型液量あたりの検出量 (Copy数濃度: Copy/ 1)で除し、その商を内標比 1.0で除した商を 100倍した値を GM混入率とした。

[実施例 8]特異性の確認試験

本発明による方法が、他の作物と交差性を有しないことを確認する目的で、特性試験を実施した。他の作物としてはォォムギ、オーツムギ、ライムギ、コメ、マイ口、ナタネ、トウモロコシ、ソバ、ァヮ、キビを用いた。これらの作物力も DNAを抽出し、実施例 5に示す方法により確定した条件でこれら DNAを铸型に ReaKTime PCRを行った。

[0084] プライマーペアとしては PRP03- Fと PRP03- R、 PRP03- Fと PRP07- Rの 2種類を、プローブは PRP- Taq2を用いた。

[0085] 結果を図 7に示す。 PRP03-Fと PRP07-Rをプライマーペアに用いた場合、コムギでは DNA1 μ gあたり 140Copy検出されるのに対し、これら作物では 0.2Copy以下であつた。すなわち、これら作物の非特異的検出率は 0.05%以下であり、コムギ検出における標準誤差をはるかに下回ることから、これらの作物がコムギ内在性遺伝子の定量に影響を及ぼさな、ことが確認された。 PRP04-Fと PRP06-Rをプライマーペアに用いた場合はォォムギでコムギに対し 0.3%の検出が見られたものの、その他の作物は 0.05% 以下であった。従って、このプライマーペアを用いた場合も、コムギ検出における標準誤差をはるかに下回り、これらの作物がコムギ内在性遺伝子の定量に影響を及ぼさないことが確認された。

図面の簡単な説明

[図 1]配列番号： 2における、配列番号 3〜8に記載のプライマーの結合領域を示す。

[図 2]PRP、 Waxyの各遺伝子のそれぞれ増幅領域につ!、て標準プラスミド pWIG03を铸型に SYBR法により ReaKTime PCRを実施した際の増幅曲線と融解曲線を示す。

[図 3]表 10に示される PRP01— Fと PRP01— R、 PRP03— Fと PRP03— R、 PRP03— Fと PRP07— Rそれぞれを用い、コムギ種子より抽出した DNAを铸型に SYBR法により ReaKTime P CRを実施した結果を示す。

[図 4]表 11に示す各種プライマーの組合せを用いた ReaKTime PCRの検出効率を示す。

[図 5]PRP03が検出された 40種類のうち 20種類のコムギ品種における検出例を示す。

[図 6]この仮想 GMコムギと別に粉砕したコムギ (YearaRojo品種)を任意に混合した標品から DNAを抽出し、この DNAを铸型に、本発明の方法に従って、コムギ内在性遺伝子とラウンドアップ耐性遺伝子の定量を行った結果を利用して、仮想 GMコムギの混入率を求めた結果を示す。

[図 7]プライマーペアとしては PRP03- Fと PRP03- R、 PRP03- Fと PRP07- Rの 2種類を、プローブは PRP-Taq2を用いて行った、他の作物との交差性の確認試験の結果を示す。

Claims

請求の範囲

[1] 被検試料中のコムギ内在性 DNAを、ポリメラーゼ連鎖反応によって検出又は定量する方法であって、

前記被検試料中の核酸又は前記被検試料カゝら抽出した核酸を铸型とし、配列番号: 2に記載の塩基配列又はその部分配列からなる領域を増幅可能なプライマーべァを用いて該領域の核酸を増幅する工程と、

前記増幅された核酸を検出又は定量する工程と、を含む方法。

[2] 前記配列番号: 2に記載の塩基配列の部分配列力なる領域が、配列番号：11力ゝら 18のいずれか 1つに記載の塩基配列からなる領域である、請求項 1に記載の方法

[3] 前記プライマーペアが、

(0配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 4に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、

GO配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 4に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、

Gii)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 6に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、

Gv)配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 6に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、

(V)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 7に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、

(vi)配列番号： 3に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 8に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、

(vii)配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 8に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、

(viii)配列番号： 5に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号： 7に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、及び

Gx)前記 G)〜(viii)のプライマーペアのそれぞれにお、て、各核酸が有する塩基配列の少なくとも 80%の連続した塩基配列を含む核酸のペア力もなるプライマーペア、からなる群力も選択されるプライマーペアである、請求項 1に記載の方法。

[4] 前記プライマーペアに含まれる各プライマーが 15〜40塩基長の核酸である、請求項 1から 3のいずれか 1項に記載の方法。

[5] 前記ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された領域を、配列番号： 9又は 10に記載のプローブを用いて検出する、請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の方法。

[6] 請求項 3に記載のプライマーペアのうち少なくとも 1つのプライマーペアを含む、被検試料力ポリメラーゼ連鎖反応によってコムギ内在性 DNAを検出又は定量するためのキット。

[7] 遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性 DNAとして、配列番号： 2に記載の塩基配列又はその部分配列力なる DNAと、

遺伝子組換えコムギ特異的 DNAとして、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる 1以上の DNAと、を含む複製可能な DNA。

[8] 遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性 DNAとして、配列番号： 2に記載の塩基配列又はその部分配列力なる DNAと少なくとも 80

%の相同性を有する塩基配列からなる DNAと、

[9] 前記配列番号： 2に記載の塩基配列の部分配列力なる DNAが、配列番号： 11から 18のいずれか 1つに記載の塩基配列からなる DNAである、請求項 7又は 8に記載の方法。

[10] 遺伝子組換えコムギ及び非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性 DNAとして、請求項 3に記載のプライマーペアのいずれかを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅可能な配列力なる DNAと、

[11] 被検試料における遺伝子組換えコムギの混入率を決定する方法であって、

請求項 7から 10のいずれ力 1項に記載の複製可能な DNAを含む溶液を用いて 2 種類以上の濃度希釈系列を作り、それぞれについて定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行って、前記コムギ内在性 DNAと、少なくとも一種類の前記遺伝子組換えコムギ特異的 DNAとを増幅し、各部分領域につ!、て検量線を求める工程と、

前記被検試料について、前記検量線を求める工程と同一の条件で定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記検量線を用いて、被検試料中に存在した、前記コムギ内在性 DNAの分子数と前記遺伝子組換えコムギ特異的 DNAの分子数とを求めるェ程と、を含む方法。

[12] 前記被検試料中に存在した、前記遺伝子組換えコムギ特異的 DNAの分子数を、前記コムギ内在性 DNAの分子数で除して得られる比 Aと、

遺伝子組換えコムギの各系統の標準種子を用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行って求められる、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な DNAの分子数を、コムギ内在性 DNAの分子数で除して得られる比 Bと、を用い、

式 100 X AZBを計算して、前記被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を決定する工程、をさらに含む、請求項 11に記載の方法。

[13] 前記コムギ内在性 DNAの増幅を、請求項 3に記載のプライマーペア力選択される少なくとも 1つのプライマーペアを用、て行う、請求項 11又は 12に記載の方法。