JP3170595B2

JP3170595B2 - Ｗｘ遺伝子発現の確認方法およびモチコムギの作出方法

Info

Publication number: JP3170595B2
Application number: JP27756292A
Authority: JP
Inventors: 村俊樹中; 守誠山
Original assignee: 農林水産省東北農業試験場長
Priority date: 1992-10-15
Filing date: 1992-10-15
Publication date: 2001-05-28
Anticipated expiration: 2016-05-28
Also published as: JPH06125669A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】〔発明の背景〕

【産業上の利用分野】本発明は、穀物、特にコムギのＷ
ｘ遺伝子発現の確認方法ならびにこの確認方法を利用す
ることができるモチコムギの作出方法およびこの作出方
法によって得られるモチコムギに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】種子にモチ性が認められる作物として
は、イネ、トウモロコシ、オオムギ、ジャガイモ、ア
ワ、ソルガムなどが知られており、普通（ウルチ）系統
のものにおいてはＷｘタンパク質が存在しているのに対
して、モチ性系統ではこのＷｘタンパク質の存在が見ら
れない。Ｗｘタンパク質はＷｘ遺伝子の発現産物であっ
てアミロース合成に関与するデンプン合成酵素(Granule
Bound Starch Synthase : GBSS)としての機能を有す
る。このＷｘ遺伝子は、イネなどの２倍体植物ではには
１種の遺伝子として存在しており、低率（１０^-4）では
あるが突然変異によって欠落し（植物育種学、上巻、基
礎編藤巻ら著、培風館、第８０〜８２頁、１９９２
年）、これによってＷｘタンパク質が産性されず普通系
統のものがモチ性となる。これに対して、コムギでは３
種のＷｘ遺伝子を有する６倍体のもの（普通系統）およ
び２種のＷｘ遺伝子を有する４倍体のもの（マカロニ種
など）が存在していることが知られている。６倍体であ
る普通系コムギ（Triticum aestivum L.、ゲノム構成Ａ
ＡＢＢＤＤ）では、３種のＷｘ遺伝子Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ
−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ１を染色体腕７ＡＳ、４ＡＬおよ
び７ＤＳ上に持つことがサザン法によって確認されてい
る（Chaoら、Theor.Appl.Genet. 、第７８巻、４９５〜
５０４頁、１９８９年）が、Ｗｘ遺伝子の発現産物であ
るＷｘタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による電気泳
動によって単一のバンドとしてしか検出されていない
（山守ら、育種学雑誌、４０巻（別冊１）第４１０〜４
１１頁、１９９０年）。また、６倍体コムギ（普通系
統）および４倍体コムギ（マカロニ系統など）について
は現在のところモチ性のものは知られていない。

【０００３】〔発明の概要〕

【発明が解決しようとする課題】コムギにおける３種の
Ｗｘ遺伝子Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ１の
発現の有無を個々に確認できる分析方法が確立できれ
ば、この分析方法を利用して特定のＷｘ遺伝子の発現を
欠いた変異体を見つけ出し、適当な変異体の組合わせを
選択して交配することにより、コムギにおいてＷｘタン
パク質が産性されない、すなわちＷｘ遺伝子の発現を欠
いたモチ性系統のものを作出することができる。本発明
は穀物、特にコムギにおける３種の遺伝子の発現の有無
を個々に確認できる分析方法および３種のＷｘタンパク
質が産性されないモチコムギを作出する手段を提供する
ことを目的とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
法でＷｘタンパク質が単一のバンドとしてしか検出され
ない原因は、コムギの胚乳中では１種のＷｘ遺伝子しか
発現していないためか、あるいは、複数の遺伝子が発現
しているがその産物の分子量が同一もしくは近接するこ
とによりＳＤＳ−ＰＡＧＥ法では分離できず単一のタン
パク質として検出されるため、の２点が考えられる。そ
こで本発明者等は、コムギのＣｈｉｎｅｓｅＳｐｒｉ
ｎｇ（ＣＳ）およびそのｎｕｌｌｉｓｏｍｉｃ−ｔｅｔ
ｒａｓｏｍｉｃ（ＮＴ）系統のＷｘタンパク質を二次元
電気泳動法を用いて解析することによって、３種遺伝子
由来の産物を検出することに成功した。この知見をもと
に本発明を完成するに至った。すなわち、本発明による
Ｗｘ遺伝子発現の確認方法は、穀物のＷｘ遺伝子の発現
産物である複数のＷｘタンパク質を二次元電気泳動法を
用いて分離することを特徴とするものであり、この好ま
しい態様は、コムギＷｘ遺伝子の発現産物であるＷｘタ
ンパク質Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ１を二
次元電気泳動法を用いて分離することを特徴とするもの
であり、このさらに好ましい態様は、二次元電気泳動法
が等電点電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動との組合わせのものである。また、本発明による
モチコムギの作出方法は、コムギＷｘ遺伝子Ｗｘ−Ａ
１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ１を有しそのうちの２種
の遺伝子の発現を欠いた６倍体コムギ変異体と残りの１
種の遺伝子の発現を欠いた６倍体コムギ変異体（好まし
くは、両変異体のＷｘ遺伝子の発現を上記の確認方法で
確認したもの）を交配し、その後代において上記３種の
遺伝子の発現を欠いた個体を得ることを特徴とするもの
であり、この好ましい態様は、交配がＷｘ遺伝子Ｗｘ−
Ａ１およびＷｘ−Ｂ１の発現を欠いたコムギ変異体とＷ
ｘ遺伝子Ｗｘ−Ｄ１の発現を欠いたコムギ変異体との組
合わせによるものである。本発明によるモチコムギの別
の作出方法は、コムギＷｘ遺伝子Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ
１およびＷｘ−Ｄ１を有しそのうちの２種の遺伝子Ａ１
およびＢ１の発現を欠いた６倍体コムギ変異体と、二粒
系コムギゲノム構成ＡＡＢＢ個体（好ましくは、変異体
のＷｘ遺伝子の発現を上記の確認方法で確認したもの）
とを交配し、その後代において上記２種の遺伝子の発現
を欠いた４倍体個体を得ることを特徴とするものであ
る。本発明はまた、上記作出方法によって得られるモチ
コムギに関するものでもある。

【０００５】〔発明の具体的説明〕普通系コムギ（Trit
icum aestivum L.（遺伝子型：ＡＡＢＢＤＤ））におけ
る３種のＷｘ遺伝子Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ
−Ｄ１は３つの別々の染色体腕７ＡＳ、４ＡＬおよび７
ＤＳ上に存在しており（Chaoら、１９８９年、前記）、
このＷｘ遺伝子の発現によって産生されるＷｘタンパク
質（Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ１）は、デ
ンプン粒に結合したタンパク質でアミロース合成に関与
するデンプン合成酵素（顆粒性澱粉合成酵素(Granule B
ound StarchSynthase : GBSS) ）である。Ｗｘ遺伝子発現の確認方法本発明によるＷｘ遺伝子発現の確認方法は、穀物のＷｘ
遺伝子の発現産物である複数のＷｘタンパク質を二次元
電気泳動法を用いて分離することを特徴とするものであ
り、特に、コムギにおけるＷｘ遺伝子の発現産物である
Ｗｘタンパク質Ａ１、Ｂ１およびＤ１を二次元電気泳動
法を用いて分離することを特徴とするものであることは
前記したところである。従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
電気泳動では、上記３種のＷｘタンパク質が単一のバン
ドとしてしか検出できなかったが、本発明における二次
元電気泳動法により、これら３種のＷｘタンパク質を個
々に分離確認すること、すなわち３種のＷｘ遺伝子の発
現の有無を確認することが可能となった。本発明による
二次元電気泳動は、具体的にはたとえばタンパク質の有
する固有の当電点の差を利用して分離を行う等電点電気
泳動およびタンパク質の分子量の差を利用して分離を行
うＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥともいう）との組合わせによるものであ
る。等電点電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥの組合わせによ
る二次元電気泳動の好ましい方法は、基本的にはＯ´Ｆ
ａｒｒｅｌ１の二次元電気泳動法に従って実施すること
ができる。二次元電気泳動の方法は、基本的には、分析
しようとする試料、すなわちコムギ種子のデンプン（好
ましくは精製されたもの）について一次元目の泳動とし
て等電点電気泳を行った後、泳動方向を９０度変えて二
次元目の電気泳動としてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ビスアクリ
ルアミド濃度を下げたゲルを用いたＳＰＳ−ＰＡＧＥ
（後述））を行って目的のＷｘタンパク質を二次元方向
に分離し、分離試料について染色操作を施した後に染色
パターンを解析することによってＷｘタンパク質の有
無、すなわちＷｘ遺伝子（Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１、Ｗ
ｘ−Ｄ１）の発現の有無を確認することができる。

【０００６】（１）デンプン試料の調製Ｗｘ遺伝子発現の確認のための試料としてのコムギデン
プンの調製は、デンプンを分離精製するための合目的的
な任意の方法を用いることができ、このような方法とし
てはたとえば、EchtおよびSchwartzの方法（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ，９９，２７５〜２８４，１９８１年）があげら
れ、この方法に基づいて粗製デンプンまたは精製デンプ
ンを得ることができる。EchtおよびSchwartzの方法に基
づく調製法の概要は次の通りである。まず、各種系統の
種子（通常は胚を取り除いた完熟種子）を粉砕した後に
ふるい（通常６０μｍ）にかけ、この粉に冷却した緩衝
液または水、好ましくは緩衝液（たとえばドデシル硫酸
ナトリウムを含む緩衝液（ＳＤＳ緩衝液：後記(2) 参
照）を４℃程度に冷却したもの）を加え、ホモジナイズ
した後適当なフィルター（ミラクロスなど）で濾過す
る。瀘液を遠心洗浄（通常１５０００rpm で５分間）
し、上清（後に可溶性タンパク質サンプルとして利用で
きる）を除き、蒸留水およびアセトンなどで同様の洗浄
をした後に乾燥（エバポレーターによる真空乾燥など）
を行う。この方法において乾燥以外の操作は全て低温下
（通常４℃下程度）で行い、乾燥させたデンプンは使用
されるまでは−２０℃程度の低温で保存されることが望
ましい。この方法の詳細は後記実験例に記載されてい
る。調製された粗デンプンまたは精製デンプンは、次に
一次元目の電気泳動に供するための試料に調製する必要
がある。この調製は次のような方法によって行うことが
できる。上記のように調製されたデンプン（好ましくは
精製デンプン）に対してＬｙｓｉｓ緩衝液（たとえば、
尿素（通常８Ｍ）、ノニデット（Nonidet)- Ｐ４０（界
面活性剤を主成分として含む、通常２％）、アンフォリ
ン（Ampholine 、ポリアミノポリカルボン酸を主成分と
して含む、通常２％）、β−メルカプトエタノール（通
常５％）、ポリビニルピロリドン（通常５％）からなる
緩衝液）を一定の割合で（通常デンプン１０ｍｇに対し
て３００μｌ程度）加え、通常、１００℃で２分間熱処
理を加えて氷中などの低温で１０分間程度冷却するかあ
るいは加熱を加えずに室温で１時間程度放置する。これ
を遠心（通常１５０００rpm で１０分間）することによ
り、上清を電気泳動用の試料とすることができる。この
ようにして得られたデンプン溶出液を好ましくは１００
〜３００μ、より好ましくは２００μｌ程度の量で一次
元目の電気泳動、好ましくは等電点電気泳動に供試す
る。試料としての上清の量は通常の泳動の場合には１０
〜２０μｌであり、このような量では最終的にＷｘタン
パク質のスポットの確認が極めて困難であるが、上記の
ような量を使用することによって３種のＷｘタンパク質
のスポットの確認が可能となる。なお、デンプン試料の
濃度の大小に対応してこの使用量を変化させることがで
きる。

【０００７】（２）等電点電気泳動等電点電気泳動の具体的な操作方法は、基本的には前記
O'Farrel1 の方法に従うことができるが、一般的な操作
の概要は以下に示す通りである。まず、泳動用の支持溶
液を作成する。支持溶液は、アクリルアミドを基本とす
るゲル（通常３０％）溶液が好ましい。ゲル用溶液とし
ては、通常この目的に用いられる任意のものが適用でき
るが、下記のような組成配合のものが一般的である。尿素３０％アクリルアミド溶液（高純度品）純水１０％ＮＰ−４０アンフォライン（ｐＨ３．５〜１０）アンフォライン（ｐＨ５〜８）１０％過硫酸アンモニウムＴＥＭＤ（テトラメチルエチレンジアミン）上記の配合およびアンフォラインの組合せは、必要に応
じて支持溶液としての機能を維持する範囲で任意に変化
させることができる。次に、ゲル溶液を垂直に立てた等
電点電気泳動用ガラス管に注入してゲル化させ、上側に
前記Ｌｙｓｉｓ緩衝液を重層する。一方の陽極電極槽に
酸性溶液（たとえば０．０１Ｎリン酸溶液）を入れ、他
方の陰極電極槽に塩基性溶液（たとえば０．０２ＮＮ
ａＯＨ）を入れて適当な条件で予備通電した後、デンプ
ン試料を前記したように１００〜３００μｌ、より好ま
しくは２００μｌ程度ゲル上に重層する。適当な泳動条
件、通常、４００Ｖ（定電圧）で１６〜１８時間、必要
に応じて更に８００Ｖ（定電圧）で１時間程度泳動を行
う。泳動条件は全体で５０００〜１００００Ｖ・時間と
なるようにすることが望ましい。泳動終了後、ガラス管
よりゲルを抜き出して適当な緩衝液（たとえばＳＤＳ緩
衝液：０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２．３％
ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール、１０％グリセ
ロール）で平衡化し、これを二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅのために使用する。

【０００８】（３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの具体的な操作方法については一般的
な文献もしくは書物、（たとえばLaemmli:Nature, ２２
７；６８０〜６８５，１９７０年）の方法を参照するこ
とができるが、好ましくはLaemmli の変法である低ビス
濃度ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Hiran
o,J.Protein chem.８：１１５〜１３０，１９８９およ
びKagawa and Hirano,Japan J.Breed.３８：３２７〜３
３２，１９８８）を参照することができる。操作の概要
は以下に示す通りである。まず、泳動用の分離ゲル用溶
液を作成する。分離ゲル用溶液としては、下記のような
組成配合のものが一般的である。分離ゲル用緩衝液分離ゲル用アクリルアミド溶液純水１０％過硫酸アンモニウムＴＥＭＤ分離ゲル用アクリルアミド溶液は通常次のような配合で
ある。分離ゲル用アクリルアミドストック液（アクリルアミ
ド：ビス＝３０：０．１３５：アクリルアミド（電気泳動用）メチレンビスアクリルアミド（電気泳動用）純水分離ゲル用緩衝液は通常下記のような配合である。分離ゲル用緩衝液（１Ｍトリス・ＨＣｌｐＨ８．８／
０．２７％ＳＤＳ）：トリス（電気泳動用）ＳＤＳ純水このように調製した分離ゲル溶液を泳動用のガラス板の
間に注入してゲル化させる。濃縮ゲル用溶液を調製す
る。濃縮ゲル用溶液としては、下記のような組成配合の
ものが一般的である。濃縮ゲル用緩衝液３ｍｌ濃縮ゲル用アクリルアミド溶液１ｍｌ純水２ｍｌ１０％過硫酸アンモニウム３０μｌＴＥＭＤ２０μｌ濃縮ゲル用アクリルアミド溶液は通常次のような配合で
ある。濃縮ゲル用アクリルアミドストック液（アクリルアミ
ド：ビス＝３０：０．８）アクリルアミド（電気泳動用）メチレンビスアクリルアミド（電気泳動用）純水濃縮ゲル用緩衝液としては、通常次のような配合が用い
られる。分離ゲル用緩衝液（０．２５Ｍトリス・ＨＣｌｐＨ
６．８／０．２％ＳＤＳ）：トリス（電気泳動用）ＳＤＳ純水このように調製した濃縮ゲル用溶液を分離ゲル上に注入
してゲル化させる。電気泳動用アガロース（高純度のも
のが望ましい）用溶液（通常ＳＤＳ緩衝液中アガロ−ス
１％（Ｗ／Ｖ））を濃縮ゲル上に加えてゲル化させる。
分離ゲル用溶液および濃縮ゲル用溶液の配合割合は、必
要に応じてそれらの機能を維持する範囲で任意に変化さ
せることができる。泳動用緩衝液槽に泳動用緩衝液を加
えて適当な泳動条件、通常ゲル１枚当たり２０ｍＡ（定
電流）で泳動を行う。この時、コントロールとしてブロ
ムフェノールブルー（ＢＰＢ）などの色素を標準物質と
して泳動用緩衝液に加えておくことが望ましい。泳動用
緩衝液は通常次のような配合である。電気泳動用緩衝液：トリスグリシンＳＤＳ純水標準物質を目安として適当な時点で泳動を停止し、分離
ゲルを取り出した後に染色操作を行う。染色方法は、タ
ンパク質を染色するためのものであれば一般的に用いら
れる任意の方法が可能であり、たとえば、クマシーブリ
リアントブルーによる染色などがある。上記したような
二次元電気泳動により得られる結果（Chinese-Spring(C
S)およびそのnullisomic-tetrasomic(NT) 系統を用いた
Ｗｘタンパク質の二次元電気泳動法による解析）は図１
〜２に示される通りであり、３種のＷｘタンパク質の存
在の有無を個々に確認できることがわかる。すなわち、
図１に示される通り、コムギChinese-Spring(CS)系統の
タンパクは高分子量と低分子量の二つのサブユニットグ
ループ（ＳＧ）に分かれること、高分子量のＳＧはＮ７
ＡＴ７Ｂ、Ｎ７ＡＴ７Ｄでは検出されないこと、Ｎ４Ａ
Ｔ４Ｂ、Ｎ４ＡＴ４Ｄでは低分子量ＳＧの酸性側のサブ
ユニットが薄くなるか欠失していること、一方Ｎ７ＤＴ
７Ａ、Ｎ７ＤＴ７Ｂでは逆に塩基性側のサブユニットが
欠失していること、が認められる。これらの結果より、
明らかに高分子量のＳＧは７Ａ染色体上のＷｘ−Ａ１遺
伝子にコードされていることが、また、低分子量のＳＧ
は４Ａ染色体上のＷｘ−Ｂ１遺伝子および７Ｄ染色体上
のＷｘ−Ｄ１遺伝子にコードされており各々の遺伝子由
来のＳＧの等電点は若干異なるため両者のサブユニット
が部分的に重なった形になっていることも明かになっ
た。これらの結果を単純なダイアグラムにすると図２の
ようになる。また、図３は、３種遺伝子のうちＷｘ−Ａ
１だけが発現していない変異個体（ｗｘ^Ａ）、Ｗｘ−Ａ
１およびＷｘ−Ｂ１の両方が発現していない変異個体
（ｗｘ^ＡＢ）、Ｗｘ−Ｄ１だけが発現していない変異個
体（Ｗｘ^Ｄ）における泳動図およびそのダイアグラムを
示すものである。

【０００９】モチコムギの作出方法前述のように、普通系コムギ（Triticum aesutivum L.
）には３種のＷｘ遺伝子、すなわちＷｘ−Ａ１、Ｗｘ
−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ１（遺伝子型ＡＡＢＢＤＤ）が存
在しており、このＷｘ遺伝子の発現産物であるＷｘタン
パク質、すなわちＷｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ−
Ｄ１タンパク質は、デンプン粒に結合したタンパク質で
あってアミロース合成に関与するデンプン合成酵素であ
る。従って、コムギにおいてこのタンパク質が欠失する
とアミロースが合成されず、アミロペクチンだけからな
るデンプン、すなわちモチデンプンになる。本発明は、
モチコムギの作出方法にも関するものであり、この作出
方法は基本的に、３種のＷｘ遺伝子のうちの特定のＷｘ
遺伝子の発現を欠いた適当な組み合わせによる６倍体コ
ムギ変異体同士の交配によりすべてのＷｘ遺伝子の発現
を欠いた６倍体個体を作出するもの、および特定のＷｘ
遺伝子の発現を欠いた６倍体個体と４倍体（二粒系）コ
ムギゲノム構成ＡＡＢＢ個体との適当な組み合わせによ
る交配により４倍体個体を作出するものである。これら
の作出方法は、上述してきたような本発明によるＷｘ遺
伝子の確認方法の確立により、コムギにおける３種のＷ
ｘ遺伝子の発現の有無、すなわちＷｘ遺伝子発現産物も
しくはＷｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ１タンパ
ク質の存在の有無が個々に確認できるようになり、これ
によって本発明作出方法が可能になった。なお、本発明
において「個体」とは、植物体および種子の両者を包含
するものである。

【００１０】（１）６倍体モチコムギの作出方法本発明による６倍体モチコムギの作出方法は、コムギＷ
ｘ遺伝子Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ１を有
しそのうちの２種の遺伝子の発現を欠いた６倍体コムギ
変異体と、残りの１種の遺伝子の発現を欠いた６倍体コ
ムギ変異体とを交配し、その後代において上記３種の遺
伝子の発現を欠いた個体を得ることを特徴とするもので
あり、必要となる上記変異体は、代表的には前記したよ
うな本発明によるＷｘ遺伝子発現の確認方法を用いるこ
とによって所望の組合わせのものを選択することができ
る。Ｗｘ遺伝子Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ
１のうちの２種の発現を欠いた６倍体コムギ変異体とし
ては、Ｗｘ−Ａ１とＷｘ−Ｂ１、Ｗｘ−Ｂ１とＷｘ−Ｄ
１、およびＷｘ−Ａ１とＷｘ−Ｄ１の組合わせのものが
ありうるが、その代表例としては、Ｗｘ−Ａ１タンパク
質とＷｘ−Ｂ１タンパク質の発現を同時に欠く変異体で
ある。従って、６倍体モチコムギの作出方法の代表例
は、Ｗｘ−Ａ１タンパク質とＷｘ−Ｂ１タンパク質の発
現を共に欠いているがＷｘ−Ｄ１タンパク質の発現能力
を維持している６倍体変異体と、Ｗｘ−Ａ１タンパク質
とＷｘ−Ｂ１タンパク質の発現能力を共に有しているが
Ｗｘ−Ｄ１タンパク質の発現のみを欠いた６倍体変異体
とを交配することによって全て（３種）のＷｘ遺伝子の
発現を欠いた、すなわち３種のＷｘタンパク質の産性の
ないモチ性の個体を得るものである。この作出方法の具
体的な内容を以下に説明する。Ｗｘ−Ａ１タンパク質と
Ｗｘ−Ｂ１タンパク質の発現を共に欠いているがＷｘ−
Ｄ１タンパク質の発現能力を維持している６倍体コムギ
（たとえば、パンコムギ関東１０７号）の遺伝子型をａ
ａｂｂＤＤと表記すれば、Ｗｘ−Ｄ１タンパク質の発現
のみを欠いたコムギはＡＡＢＢｄｄと表記することがで
きる。この両者を通常の方法によって交配することによ
り、一代雑種個体（Ｆ_１種子）を得ることができる。コ
ムギの交配によるＦ_１種子の生産方法に関しては一般的
な文献あるいは書物（たとえば植物遺伝学実験法、常脇
恒一郎編集、ｐ２７８〜２７９、１９８２年）を参照す
ることができるが、基本的な操作手順は次のようにす
る。片方のコムギが開花する２〜３日前におしべをピン
セットなどで取り去り（除雄）、パーチメント袋（硫酸
紙）をかぶせる。２〜３日後に袋をはずし、このコムギ
のめしべに他方のコムギの花粉を毛筆ふでなどでふりか
ける。他からの花粉の飛来を避けるため再び袋をかぶせ
る。交配が成功していれば３０〜４０日後に種子が得ら
れる。このようにして得られるＦ_１種子は３種の遺伝子
に関してヘテロ（すなわち３性雑種）になるので、その
遺伝子型はＡａＢｂＤｄと表記される。次に、このＦ_１
個体を自家受粉させて雑種第２代（Ｆ_２個体）を得る。
コムギの自家受粉による種子生産方法については一般的
な文献あるいは書物（たとえば上記植物遺伝学実験法、
第２７７頁を参照することができるが、基本的な操作手
順は、他からの花粉の飛来を避けるため開花１〜３日前
にパーチメント（硫酸紙）袋をかぶせるようにする。上
記のようにして得られるＦ_２種子の一粒づつについて、
電気泳動法によりＷｘタンパク質の存在の有無を分析す
る。電気泳動は、本発明によるＷｘ遺伝子の確認方法に
おける二次元電気泳動法を用いればよい。電気泳動分析
の結果Ｗｘタンパク質が検出されないモチ性のコムギ個
体を選抜する。Ｗｘ遺伝子は互いに異なる３つの染色体
上にあるので（Chaoら、Theor.Appl.Genet. 第７８巻、
４９５〜５０４頁、１９８９年、前記）、このＦ_２世代
においてはメンデルの法則（分離および独立の法則）に
従って１／６４（＝１／４×１／４×１／４）の割合で
遺伝子型ａａｂｂｄｄのコムギ個体が得られる。すなわ
ち３性雑種のＦ_２世代においてはメンデルの法則により
遺伝子型Ａ₋Ｂ₋Ｄ、Ａ₋Ｂ₋ｄｄ、Ａ₋ｂｂＤ₋、ａ
ａＢ₋Ｄ₋、Ａ₋ｂｂｄｄ、ａａＢ₋ｄｄ、ａａｂｂｄ
Ｄ、ａａｂｂＤ₋、ａａｂｂｄｄの個体がそれぞれ２
７：９：９：９：３：３：３：１（計６４）の比で分離
し（「育種学」、松尾孝嶺著、養賢堂、９８頁、１９７
８年）（ここで、Ａ₋はＡＡまたはＡａ、Ｂ⁻はＢＢま
たはＢｂ、Ｄ₋はＤＤまたはＤｄを表す）、従って、Ｆ
_２種子において１／６４の割合で遺伝子型ａａｂｂｄｄ
のコムギ個体が得られる。このコムギの表現型は３種の
Ｗｘタンパク質（Ａ１、Ｂ１、Ｄ１）発現が欠失したも
のであり、従って、このコムギ個体はＷｘタンパク質の
発現を欠いたモチコムギとなる。最終的に得られるＷｘ
タンパク質の発現を欠いたコムギ種子（粉）についてア
ミロース含量を測定し、そのモチ性（アミロース０％）
を確認する。アミロース量の測定方法に関しては、一般
的な文献あるいは書物（たとえば黒田ら、育種学雑誌、
第３９巻（別冊２）１４２〜１４３頁、１９８９年）を
参照することができ、通常ヨード・ヨードカリ呈色反応
が用いられる。交配の組合わせとして、Ｗｘ−Ｂ１タン
パク質とＷｘ−Ｄ１タンパク質の発現を欠いた６倍体変
異体とＷｘ−Ａ１タンパク質のみの発現を欠いた６倍体
変異体との組合わせ、およびＷｘ−Ａ１タンパク質とＷ
ｘ−Ｄ１タンパク質の発現を欠いた６倍体変異体とＷｘ
−Ｂ１タンパク質のみの発現を欠いた６倍体変異体との
組合わせの場合においても、上述した方法と同様にして
それぞれＦ_２世代において１／６４の割合でＷｘタンパ
ク質発現を欠いたモチコムギを得ることができる。また
交配の一方の変異体である２種の遺伝子の発現を欠いた
６倍体変異体としては、上記の他に１種づつ遺伝子の発
現を欠いたものの交配によって得られたものを使用する
ことも可能である。このようにして得られるモチ性Ｆ_２
個体およびその後代の個体（Ｆ_３以後の種子または植物
体）はすべてモチコムギとなり、本発明はこれらもすべ
て包含するものである。

【００１１】（２）４倍体モチコムギの作出方法本発明による４倍体モチコムギの作出方法は、コムギＷ
ｘ遺伝子Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ１を有
しそのうちの２種の遺伝子Ａ１およびＢ１の発現を欠い
た６倍体コムギ変異体と、二粒系コムギゲノム構成ＡＡ
ＢＢ個体とを交配し、その後代において上記２種の遺伝
子の発現を欠いた４倍体個体を得ることを特徴とするも
のである。必要となる上記６倍体コムギ変異体は、本発
明によるＷｘ遺伝子発現の確認方法を用いることによっ
て所望のものを選択することができ、また４倍体コムギ
は従来知られているものの中から所望のものを選択する
ことができる。この４倍体モチコムギの作出方法は言い
換えれば、Ｗｘ−Ａ１タンパク質とＷｘ−Ｂ１タンパク
質の発現を共に欠いているがＷｘ−Ｄ１タンパク質の発
現能力を維持している６倍体変異体と、二粒系コムギゲ
ノム構成ＡＡＢＢ個体とを交配することによって全ての
遺伝子（２種）の発現を欠いた、すなわちＷｘタンパク
質の産生のないモチ性のコムギ個体を得るものである。
この作出方法の具体的な内容を以下に説明する。６倍体
コムギと４倍体コムギの交雑後代から４倍体コムギが出
現することは古くから知られており（「小麦の合成」、
木原均著、２７４〜２９３頁、講談社、１９７３年）、
いくつかの４倍体コムギが得られている。Ｗｘ−Ａ１タ
ンパク質とＷｘ−Ｂ１タンパク質の発現を同時に欠いた
６倍体コムギ（染色体数２ｎ＝４２）（たとえばパンコ
ムギ関東１０７号）の遺伝子型をａａｂｂＤＤと表記す
れば、Ｗｘ−Ａ１タンパク質とＷｘ−Ｂ１タンパク質の
発現能力を持つ４倍体コムギ（染色体数２ｎ＝２８）
（マカロニ種など）はＷｘ−Ｄ１遺伝子を得たないので
ＡＡＢＢと表記することができる。この両者を通常の方
法によって交配することによりＦ_１個体を得ることがで
きる。コムギの６倍体コムギと４倍体の交配によるＦ_１
種子の生産方法に関しては一般的な文献あるいは書物
（たとえば前記植物遺伝学実験法、２７８〜２７９頁）
を参照することができるが、基本的な操作手順は（１）
の６倍体もチコムギの作出方法において前記した方法の
ようにする。このようにして得られるＦ_１種子の遺伝子
型はＡａＢｂＤとなる。次に、このＦ_１個体を自家受粉
させてＦ_２個体を得る。コムギの自家受粉による種子生
産方法については(1) ６倍体コムギの作出方法の場合と
同様である。上記のようにして得られるＦ_２種子の一粒
づつについて、電気泳動法によりＷｘタンパク質の存在
の有無を分析する。電気泳動は、本発明によるＷｘ遺伝
子の確認方法における二次元電気泳動法を用いればよ
い。また、アミロースの測定（ヨー素・ヨードカリ呈色
反応など）によればより簡単に確認することができる。
実際には、種子を分析用と次世代の植物体栽培のために
胚を含む部分を分けておく必要がある。電気泳動分析あ
るいはアミロース測定の結果Ｗｘタンパク質が検出され
ないモチ性のコムギ個体を選抜する。上記のＦ_１個体の
遺伝子型において、Ａ・ａおよびＢ・ｂに関してのみ注
目すれば、これらは対をなしているので、メンデルの法
則により後代のＦ_２において遺伝子型ａａｂｂの個体が
１／６４（＝１／４×１／４）の割合で得られ、Ｄに関
しては対をなしていないので、この遺伝子（Ｗｘ−Ｄ
１）が座乗している染色体（７Ｄ）はＦ_２世代以降に脱
落するものがある（前記、「小麦の合成」２７４〜２９
３頁、１９７３年、１４頁６行）。従ってａａｂｂの個
体の中にＷｘ−Ｄ１も欠いた個体が出現する。Ｗｘ−Ｄ
１の欠失はこれが座乗する染色体（７Ｄ）の欠落の結果
であるので、６倍体コムギではＷｘ−Ｄ１はなくなら
ず、染色体数の減少した４倍体コムギにおいてすべての
Ｗｘタンパク質（この場合はＷｘ−Ａ１タンパク質とＷ
ｘ−Ｂ１タンパク質の２種）をなくすことが可能とな
る。このように染色体を欠落したものは正常な６倍体コ
ムギに復帰することはなく、減少の方向に進み４倍体と
なる（前記「小麦の合成」２７４〜２９３頁、１９７３
年、１４頁６行）。すなわち、染色体数の減少した４倍
体コムギでのみＷｘタンパクの削除された個体が得られ
る。このコムギ個体はＷｘタンパク質の発現を欠いたモ
チコムギとなる。最終的に得られるＷｘタンパク質の発
現を欠いたコムギ種子について、染色体数（２ｎ＝２
８）およびアミロース含量を測定し（通常ヨウ素・ヨウ
素カリ呈色反応）、そのモチ性（アミロース０％）を確
認する。アミロース量の測定方法に関しては、一般的な
文献あるいは書物（たとえば黒田ら、育種学雑誌、前
出）を参照することができる。また染色体数の測定に関
してはたとえば前記植物遺伝学実験法、２８４〜２８６
頁を参照することができ、その方法は基本的には、発芽
した種子の根を前処理（氷水（０℃）中２４時間程度浸
漬）し、固定液（たとえば、酢酸：エチルアルコール＝
１：３の比からなる液）で固定した後、それを酢酸カー
ミン（カーミンを１％になるように４５％酢酸に溶かし
たもの）に浸して、染色体を染め、顕微鏡でその数を数
えるものである。また交配の一方の変異体である２種の
遺伝子の発現を欠いた６倍変異体としては、上記の他に
１種づつ遺伝子の発現を欠いたものの交配によって得ら
れたものを使用することも可能である。このようにして
得られるモチ性Ｆ_２個体およびその後代の個体（Ｆ_３以
後の種子または植物体）はすべてモチコムギとなり、本
発明はこれらもすべて包含するものである。

【００１２】

【実施例】以下は、実施例によって本発明を更に詳細に
説明するものであるが、本発明はこれによって限定され
るものではない。例１：コムギＷｘ遺伝子発現（Ｗｘタンパク質）の確認（１）デンプンの精製デンプン精製は、ＥｃｈｔとＳｃｈｗａｒｔｚの方法に
もとづいて行われた。まず、各品種系統の完熟種子から
胚を取り除き、粉砕した後に６０μｍのふるいを通して
粉を準備した。粉２００ｍｇ当り１ｍｌの割合で冷却し
たドデシル硫酸ナトリウムを含むバッファー（ＳＤＳ−
ｂｕｆｆｅｒ：０．１ｍＴｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ６．
８，２．３％，ＳＤＳ，５％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅ
ｔｈａｎｏｌ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、２分
間ホモジェンイザーをかけた後ミラクロスを用いて濾過
した。次に濾液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心して、
上清を捨て、再びＳＤＳ−ｂｕｈｈｅｒを加えて懸濁
し、再び遠心をかけた。この操作を３回繰り返した後、
蒸留水を加えて同様な操作を２回、さらに蒸留水をアセ
トンに変えて３回行い、最後にロタリーエバポレーター
により真空乾燥を行った。乾燥以外の操作は全て４℃下
で行い、乾燥させたデンプンは、−２０℃で使用まで保
存された。上述の様に、精製されたテンプン１０ｍｇに
３００ｍｌのＬｙｓｉｓ−ｂｕｆｆｅｒ（８ＭＵｒｅ
ａ，２％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０，２％Ａｍｐｈｏｌｉ
ｎｅｐＨ３．５〜１０，５％ β−ｍｅｒｃａｐｔｏ
ｅｔｈａｎｏｌ，５％ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌ
ｉｄｏｎｅ）を加え、１００℃で２分間熱処理を加えて
氷中で１０分間冷却する（あるいは加熱を加えず、室温
で１時間放置する）。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心
し、上清２００μｌを１次元目であるＩＥＦ（等電点電
気泳動）に供試する。（２）二次元電気泳動二次元電気泳動を次の操作方法に従って実施した。一次
元目の等電点電気泳動用ガラス管を用意し、底部をバラ
フィルムでシールする。紙タオルを底に敷いたガラス管
立てに、垂直に立てる。１００ｍｌビーカー中に試薬を
以下の順に混合し、一次元目のゲル溶液を調製する。（１００数本分）尿素４．８ｇ３０％アクリルアミド溶液（高純度品）１．１６ｍｌ純水２．８４ｍｌ１０％ＮＰ−４０２．０ｍｌアイフォライン（ｐＨ３．５〜１０）０．２５ｍｌアイフォライン（ｐＨ５〜８）０．２５ｍｌ１０％過硫酸アンモニウム１５μｌＴＥＭＥＤ１０μｌ１０ｍｌの注射器を用いて、ガラス管の上部より１ｃｍ
の高さまで、ゲル溶液を注入する。このとき、ガラス管
中に気泡が入らないように注意し、気泡が入ってしまっ
たら、ガラス管を軽く振って気泡を除く。ゲルの上部に
純水を重層する。２〜３時間放置して、ゲル化する。ゲ
ルに重層した水を注射器で除き、１０μｌのＬｙｓｉｓ
緩衝液をゲルに重層する。陽極側電極層（下側）に０．
０１Ｎリン酸を入れ、ガラス管のＬｙｓｉｓ緩衝液の上
に０．０２ＮＮａＯＨを静かに重層し、陰極側電極層
（上側）も０．０２ＮＮａＯＨで満たす。２００Ｖ（定
電圧）で１５分間、３００Ｖ（定電圧）で１５分間、４
００Ｖ（定電圧）で３０分間、予備通電する。予備通電
終了後、一旦、陰極側電極槽（上側）の溶液を除き、ガ
ラス管中の溶液を注射器で抜き取る。エッペンドルフ・
チューブにサンプルを準備する。調製した試料の２００
μｌに重層する。残存するＮａＯＨと試料が反応して沈
澱が生じることもあるので注意する。その上に、３倍に
希釈したＬｙｓｉｓ緩衝液を１０μｌ重層し、更に、
０．０２ＮＮａＯＨを重層する。４００Ｖ（定電圧）で
１６〜１８時間、泳動する。８００Ｖ（定電圧）で１時
間、泳動する。（全体で５０００〜１００００Ｖ・時間
となるようにする。）純水を満たした注射器で、ゲルと
ガラスの間に水を注入しながら、静かにゲルを抜き出
す。このとき、陽極側に銅線等を入れると、後で酸性側
／塩基性側の確認が容易にできる。小型サンプル管に泳
動後のゲルを入れ、ＳＤＳサンプル緩衝液を５ｍｌを加
えて３０分間、振とうしてゲルを平衡化する。液を交換
して、更に、３０分間振とうして平衡化する。二次元目分離ゲル（１５％）を下記の配合で調製する（１枚分）分離ゲル用緩衝液６．３ｍｌ分離ゲル用アクリルアミド溶液８．５ｍｌ純水２．０ｍｌ１０％過硫酸アンモニウム１２０μｌＴＥＭＥＤ２０μｌ分離ゲル用アクリルアミド溶液および分離ゲル用緩衝液
は次のように作成する。分離ゲル用アクリルアミドストック液（アクリルアミド：ビス＝３０：０．１３５）アクリルアミド（電気泳動用）３０ｇメチレンビスアクリルアミド（電気泳動用）０．１３５ｇ純水に溶かして１００ｍｌとし、遮光して保存。分離ゲル用緩衝液（１Ｍトリス・ＨＣｌｐＨ８．８／０．２７％ＳＤＳ）トリス（電気泳動用）１２．１１ｇＳＤＳ０．２７ｇ約８０ｍｌの純水に溶かし、塩酸によりｐＨを８．８に
調整する。最終容量を１０ｍｌとする。二次元目用のガ
ラス板の間に、上から約３ｃｍの高さまで注入する。約
１ｍｌの純水が静から重層して、３０分間放置する。二次元目濃縮ゲルを下記の配合で調製する（１枚分）濃縮ゲル用緩衝液３ｍｌ濃縮ゲル用アクリルアミド溶液１ｍｌ純水２ｍｌ１０％過硫酸アンモニウム３０μｌＴＥＭＥＤ２０μｌ濃縮ゲル用緩衝液および濃縮ゲル用アクリルアミド溶液
は次のように作成する。濃縮ゲル用アクリルアミドストック液（アクリルアミド：ビス＝３０：０．８）アクリルアミド（電気泳動用）３０ｇメチレンビスアクリルアミド（電気泳動用）０．８ｇ純水に溶かして１００ｍｌとし、遮光して保存。分離ゲル用緩衝液（０．２５Ｍトリス・ＨＣｌｐＨ６．８／０．２％ＳＤＳ）トリス（電気泳動用）３．０３ｇＳＤＳ０．２ｇ約８０ｍｌの純水に溶かし、塩酸によりｐＨを６．８に
調整する。最終容量を１０ｍｌとする。これを分離ゲル
の上に注入する。高純度の電気泳動用アガロースをＳＤ
Ｓサンプル緩衝液に１％（Ｗ／Ｖ）になるように加え
て、湯浴中で加熱して溶解する。濃縮ゲルの上に、アガ
ロース溶液を加えて、そこに平衡化した一次元目のゲル
を静かに、気泡を入れないようにして乗せる。このと
き、ゲルを乗せるための適当なアクリル板を作成してお
くと便利である。泳動用緩衝液槽に泳動用緩衝液を加え
て、ゲル１枚辺り２０ｍＡ（定電流）で泳動する。電気
泳動用緩衝液は次のように作成する。電気泳動用緩衝液トリス３．０ｇグリシン１４．４ｇＳＤＳ１．０ｇ純水に溶かして１０００ｍｌとする。上部緩衝液槽にＢＰＢを少量加えておく。ＢＰＢがゲル
の下部から５ｍｍのところまで移動したら（約４時間
後）、泳動を停止する。分離ゲルを取り出し、クマシー
ブリリアントブルーＲ２５０あるいは銀染法で染色す
る。上述の二次元電気泳動の結果は図１〜２に示されて
いる。図１〜２は、コムギＣｈｉｎｅｓｅＳｐｒｉｎ
ｇ（ＣＳ）およびそのｎｕｌｌｉｓｏｍｉｃ−ｔｅｔｒ
ａｓｏｍｉｃ（ＮＴ）系統を用いたＷｘタンパク質の二
次元電気泳動による解析結果を示すものである。図１に
示される通り、（ｉ）コムギＣｈｉｎｅｓｅ−Ｓｐｒｉ
ｎｇ（ＣＳ）系統のタンパクは高分子量と低分子量の二
つのサブユニットグループ（ＳＧ）に分かれた。（ｉ
ｉ）高分子量のＳＧはＮ７ＡＴ７Ｂ、Ｎ７ＡＴ７Ｄでは
検出されなかった。（ｉｉｉ）Ｎ４ＡＴ４Ｂ、Ｎ４ＡＴ
４Ｄでは低分子量ＳＧの酸性側のサブユニットが薄くな
るか欠失していた。一方（ｉｖ）Ｎ７ＤＴ７Ａ、Ｎ７Ｄ
Ｔ７Ｂでは逆に塩基性側のサブユニットが欠失してい
た。これらの結果より、明らかに高分子量のＳＧは７Ａ
染色体上のＷｘ−Ａ１遺伝子にコードされていること
が、また低分子量のＳＧは４Ａ染色体上のＷｘ−Ｂ１遺
伝子および７Ｄ染色体上のＷｘ−Ｄ１遺伝子にコードさ
れており、各々の遺伝子由来のＳＧの等電点は若干異な
るため両者のサブユニットが部分的に重なった形になっ
ていることも明かになった。これらの結果を単純なダイ
アグラムにして図２に表した。国内品種、系統のＷｘタ
ンンパクをこのダイアグラムに当てはめてみたところ、
３遺伝子のうちＷｘ−Ａ１だけが発現していない変異個
体、Ｗｘ−Ａ１およびＷｘ−Ｂ１の両方が発現していな
い変異個体が存在することが確認された（図３）。図３
中のＡ３−Ｂ３は、Ｗｘ−Ｄ１遺伝子のみが発現してい
ない変異個体における泳動図およびそのダイアグラムを
示す。

【００１３】例２：６倍体モチコムギの製造例１の二次元電気泳動法によって確認された、Ｗｘ−Ａ
１タンパクとＷｘ−Ｂ１タンパクを同時に欠きＷｘ−Ｄ
１タンパクはある６倍体パン小麦（例えば関東１０７
号、遺伝子型：ａａｂｂＤＤ）と、Ｗｘ−Ｄ１のみを欠
いたコムギ（遺伝子型：ＡＡＢＢｄｄ）の両者を一般的
な方法に従い、次のようにして交配してＦ_２個体を得
る。片方のコムギが開花する２〜３日前におしべをピン
セットで取り去り（除雄）、パーチメント袋（硫酸紙）
をかぶせる。２〜３日後に、袋をはずし、このコムギの
めしべに他方のコムギの花粉を毛筆ふででふりかける。
他からの花粉の飛来を避けるために再び袋をかぶせる。
３０〜４０日後に３性雑種個体（Ｆ₁）（遺伝子型：Ａ
ａＢｂＤｄ）を得る。得られる３性雑種個体（Ｆ₁）を
一般的な方法に従い他からの花粉の飛来を避けるための
開花２〜３日前にパーチメント（硫酸紙）袋をかぶせる
ようにして自家受粉させてＦ₂種子を得る。得られるＦ
₂種子についてＷｘタンパク質の存在の有無を一粒づつ
電気泳動法または後記アミロース測定法で分析する。電
気泳動法による分析は前記例１に記載の方法に従って行
う。最終的に得られるＷｘタンパク質が検出されないコ
ムギを選抜し、このＦ₂種子（粉）についてアミロース
含量を測定してそのモチ性（アミロース０％）を確認す
る。アミロース含量の測定は、一般的な方法に従い（黒
田ら、育種学雑誌、前出）ヨード・ヨードカリ呈色反応
を用いて行う。このような方法により、Ｆ₁種子に対し
て１／６４の割合でＷｘタンパクおよびアミロースを欠
いたモチコムギ（遺伝子型：ａａｂｂｄｄ）が得られ
る。

【００１４】例３：４倍体モチコムギの製造例１の二次元電気泳動法によって確認された、６倍体パ
ンコムギ（染色体数２ｎ＝４２）のＷｘ−Ａ１とＷｘ−
Ｂ１を同時に欠いたコムギ（例えば関東１０７号）（遺
伝子型：ａａｂｂＤＤ）と４倍体マカロニコムギ（２ｎ
＝２８）（遺伝子型：ＡＡＢＢ）の両者を一般的な方法
に従い、次のようにして交配してＦ_２の個体を得る。片
方のコムギが開花する２〜３日前におしべをピンセット
で取り去り（除雄）、パーチメント袋（硫酸紙）をかぶ
せる。２〜３日後に袋をはずし、このコムギのめしべに
他方のコムギの花粉を毛筆ふででふりかける。他からの
花粉の飛来を避けるため再び袋をかぶせる。３０〜４０
日後Ｆ_１雑種個体（遺伝子型：ＡａＢｂＤ）を得る。得
られるＦ_１雑種個体を一般的な方法に従い他からの花粉
の飛来を避けるために開花１〜３日前にパーチメント袋
をかぶせるようにして自家受粉させてＦ_２種子を得る。
得られるＦ_２種子についてＷｘタンパク質の存在の有無
を一粒づつ電気泳動法または後記アミロース測定法で分
析する。電気泳動法による分析は前記例１に記載の方法
に従って行う。最終的に得られるＷｘタンパク質が検出
されないコムギを選抜し、このＦ_２種子（粉）について
染色体数（２ｎ＝２８）およびアミロース含量を測定し
てそのモチ性（アミロース０％）を確認する。アミロー
ス含量の測定は例２と同様の方法で行い、染色体数の確
認は一般的な方法に従い次のようにして行う。発芽した
種子の根が２〜３ｃｍに伸びた時、先端から１〜２ｃｍ
を切ってこれを水を満たした管ビンへ入れる。管ビンご
と氷水（０℃）に２４時間つける。根を固定液（酢酸：
エチルアルコール＝１：３）の比からなる）を入れた管
ビンに浸す。３〜７日後に根を取り出し、酢酸カーミン
（カーミンを１％になるように４５％酢酸に煮沸して溶
かしたもの）に３０分〜１時間ひたす。この管ビンごと
あぶり、つづいて根をとり出し、先端１〜２ｍｍをスラ
イドガラスの上へ切り取り、４５％酢酸を一滴たらす。
カバーガラスをかけ、上からつまようじなどで軽くたた
き、根を散らばらせ、カバーガラスの上から指で押しつ
ぶす。これを顕微鏡で観察し染色体を数える。このよう
な方法により、Ｗｘタンパクおよびアミロースを欠く染
色体数の減少した４倍体モチコムギ（遺伝子型：ａａｂ
ｂ）が得られる。

【００１５】

【発明の効果】本発明により、穀物、特にコムギにおけ
る３種のＷｘ遺伝子（Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１、Ｗｘ−
Ｄ１）の発現の有無を確認する二次元電気泳動法を用い
た方法が確立された。このＷｘ遺伝子発現の確認方法を
利用して、３種のＷｘ遺伝子のうちの特定のＷｘ遺伝子
の発現を欠いた適当な組合わせによる６倍体コムギ変異
体同士の交配によりすべてのＷｘ遺伝子の発現を欠く６
倍体個体を、また、特定のＷｘ遺伝子の発現を欠いた６
倍体コムギと特定のＷｘ遺伝子を有する４倍体コムギの
適当な組合わせによる交配によりＷｘ遺伝子の発現を欠
く４倍体個体を、すなわちＷｘタンパク質が産性されな
いモチコムギを製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】チャイニーズ・スプリング（Chinese Spring）
品種およびそのnullisomic-tetrasomic(NT) 系（６種）
におけるＷｘタンパク質の二次元泳動パターンを示す説
明図。矢印は同じ位置を示す。

【図２】図１の泳動パターンを単純化したダイアグラム
を示す説明図。

【図３】Ｗｘ−Ａ１遺伝子の発現を欠く変異個体、Ｗｘ
−Ａ１およびＷｘ−Ｂ１遺伝子の両者の発現を欠く変異
個体、およびＷｘ−Ｄ１遺伝子の発現を欠く変異個体の
それぞれのＷｘタンパク質の電気泳動パターンおよびそ
れを単純化したダイアグラムを示す説明図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献育種学雑誌、第41巻別冊１号（1991），Ｐ．240−241 Ｔｂｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．78（1989），Ｐ．495− 504 ＢｉｏｃｈｏｍｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．31，Ｎｏ５．１／２, 1993

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】コムギＷｘ遺伝子Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１
およびＷｘ−Ｄ１を有しそのうちの２種の遺伝子Ｗｘ−
Ａ１およびＷｘ−Ｂ１の発現を欠いた６倍体コムギ変異
体と、二粒系コムギゲノム構成ＡＡＢＢ個体とを交配
し、その後代において上記２種の遺伝子の発現を欠いた
４倍体個体を得ることを特徴とする、４倍体モチコムギ
の作出方法。
【請求項２】上記変異体のＷｘ遺伝子発現の有無を、Ｗ
ｘタンパク質Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１およびＷｘ−Ｄ１
を二次元電気泳動法を用いて分離することによって確認
する、請求項１記載の作出方法。
【請求項３】二次元電気泳動法が等電点電気泳動とＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動との組合わせであ
る、請求項２記載の作出方法。