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WO2007037555A9 - Ｄｕｓｐ１５遺伝子の治療的又は診断的用途 - Google Patents

Ｄｕｓｐ１５遺伝子の治療的又は診断的用途

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Publication number
WO2007037555A9
WO2007037555A9 PCT/JP2006/320043 JP2006320043W WO2007037555A9 WO 2007037555 A9 WO2007037555 A9 WO 2007037555A9 JP 2006320043 W JP2006320043 W JP 2006320043W WO 2007037555 A9 WO2007037555 A9 WO 2007037555A9
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WO
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cancer
gene
protein
antibody
seq
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PCT/JP2006/320043
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Shinichirou Niwa
Yasutaka Makino
Tomoki Ikuta
Kazuya Arai
Takayuki Shindou
Hiromichi Ogura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Link Genomics Inc
Original Assignee
Link Genomics Inc
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Publication date
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Publication of WO2007037555A1 publication Critical patent/WO2007037555A1/ja
Publication of WO2007037555A9 publication Critical patent/WO2007037555A9/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a D U S P 15 gene which is a gene specifically amplified in cancer, and its therapeutic nucleotide relates to a diagnostic use.
  • Cancer Malignant tumors. (Cancer) are characterized by growth, invasion and metastasis. Local therapies such as surgical resection or radiotherapy cannot adequately deal with metastatic recurrent cancers, and the development of pharmacotherapy, which is a systemic therapy, will improve future cancer treatment results. Expected.
  • Chemotherapy the current center of cancer drug therapy, is a cell killing agent that acts directly on the DNA and / or RNA of cancer cells to kill them.
  • Other than this for example, bone marrow cells, germ cells, hair matrix cells, and gastrointestinal epithelial cells also acted on normal cells with many divisions, causing strong side effects.
  • recent advances in molecular cell biology have elucidated the mechanisms involved in cancer cell invasion, proliferation, and metastasis, and molecular target drugs that act specifically on the specific mechanisms of cancer cells Development is attracting attention.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Yretza genetic name: gefitinib
  • a tyrosine kinase inhibitor WO 9 6 Z3 3 9 80
  • breast cancer Herceptin gene: trastuzumab
  • HE R-2 human epidermal growth factor receptor 2
  • the present inventors have conducted extensive research, and as a result, the gene that is frequently amplified in cancer (especially colorectal cancer) is the DUSP 15 gene. I found out.
  • the present inventors have further found that by inhibiting the expression of DU SP 15 protein in colorectal cancer cell lines and cervical cancer cell lines, the growth of cancer cells can be suppressed,
  • the present invention has been completed. That is, the present invention is directed to a cancer therapeutic agent, a method for screening a candidate substance having a cancer-suppressing action, a cancer diagnostic agent, a kit for cancer diagnosis, and a method for cutting cancer described below. Etc.
  • a therapeutic agent for cancer containing an inhibitor of DU S P 15 gene expression as an active ingredient.
  • the cancer therapeutic agent according to (1) ′ above comprising a substance selected from the group consisting of: (3) D'U S P 1 5.
  • the cancer treatment agent according to (3) above which comprises a substance selected from the group consisting of: .
  • a method for screening a substance that inhibits the expression of DU S P 15 gene comprising:
  • a screening method comprising a step of selecting a compound that reduces the expression level as compared with a case where a test compound is not contacted.
  • a method for screening DU SP 15 protein inhibitory substances ′ (a) a step of contacting p USP 15 protein with a test compound, (b) a step of measuring the binding activity between the DU SP 1 5. protein and the test compound, and
  • a screening method comprising a step of selecting a compound that binds to the U S P 15 protein.
  • a cancer therapeutic agent comprising the antibody according to (9 ') above.
  • a cancer diagnostic agent comprising the antibody according to (9) above.
  • a cancer diagnostic agent comprising a nucleotide sequence that can be hybridized under stringent high-precipitation conditions to a DUSP15 gene or a partial nucleotide sequence thereof.
  • a cancer diagnostic kit comprising a polynucleotide comprising a nucleotide sequence that can be hyper-predated under a stringent hyper-precipitation condition in a D U S P 15 gene or a part of the nucleotide sequence thereof.
  • the biological sample is whole blood, serum, or plasma, (1 9) The method described in 3 ⁇ 4.
  • ⁇ (b) a step of detecting and Z or quantifying the binding between the antibody in the above test and DU S P.1 '5' protein.
  • a method for treating cancer comprising the step of administering to a patient a substance that inhibits the activity of DU S P 15 protein.
  • a cancer depressant containing a DUSP 15 gene expression inhibitor as an active ingredient comprising SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, .. SEQ ID NO: 9, or A therapeutic agent for cancer, comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10; INDUSTRIAL APPLICABILITY
  • novel drugs, needles and methods useful for the treatment and diagnosis or diagnosis of cancer for example, colorectal cancer
  • candidate compounds having cancer suppressive action for example, colorectal cancer
  • a screening method is provided. Brief description of the drawings ''
  • Fig. 1 is a histogram showing the frequency of DU S P 15 gene relative to the degree of gene amplification in 2.00 samples from colon cancer patients.
  • Figure 2 shows an optical micrograph (phase contrast image) showing the results of RNA i analysis when the siRNA of the DUS ⁇ 1.5 gene was transcribed into the colon cancer cell lines Caco 2 and RKO ⁇ 6. It is.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of quantitative evaluation of the R N Ai effect by R T—P C R, when s R N A of the DU S P 15 gene was transferred to the colon cancer cell line C ao 2. .
  • Figure 4 shows the results of evaluating the RNA i effect by measuring the number of viable cells when siRNA of the DU SP 15 gene was transfected into colon cancer cell lines C ac ⁇ 2 and R KO E 6 It is a graph which shows.
  • Figure 5 is a photograph showing the results of verifying the RNA i effect with an optical microscope when siRNA of the DU SP 15 gene is transferred to the cell line C CD 18 CO derived from normal colon tissue. Phase difference image).
  • Figure 6 shows the RNA i effect when siRNA of the DU SP 15 gene is transfected into the cell line C CD 1 8 CO derived from normal colon tissue. It is a graph which shows the result verified by cell number measurement.
  • ⁇ 7 is a photograph showing the results of Northern Hybridization performed using various normal organ tissues.
  • Fig. 8 is an optical micrograph (fluorescence image) of a portion of the tissue (6 cells) of each sample tissue (A to J) derived from a colon cancer patient analyzed by the FISH method.
  • FIG. 9A and FIG. 9B are graphs showing the results of (A) serum derived from a colon cancer patient and (B) serum derived from a healthy subject analyzed by mass spectrometry, respectively.
  • Figures 10A-C are determined by analysis M S / M S,: shows the correspondence between pic and amino acids (or amino acid sequences) shown in Figure 9,.
  • Figure 1 is a graph showing the results of verifying the RNA i effect by measuring the number of viable cells when siRNA of DUSP 1.5 gene was transfected into a cervical cancer cell line.HeLa cell line. . .
  • Figure 12 is a photomicrograph: True (differential interference image) showing the result of observing the movement of the experiment of Figure 11 in time series under a microscope and in detail.
  • the inventors of the present invention conducted verification of amplified genes by an array GH method using a sample derived from a colon cancer patient, and identified a gene amplification region specific to colorectal cancer.
  • Specimen In the region where amplification is occurring at high frequency, the DU DU SP 15 (Dualspe ci ficityphosphatase— 1 i ke 1 5) gene is frequently found in specimens from patients with colorectal cancer. I found it.
  • DUSP 15 belongs to the non-receptor type protein tyrosine phosphatase family, Protein—tyrosinephosphatasef am i 1 y, and includes protein tyrosine phosphatase activity and serine / threonine-specific phosphatase (S erine / threonine—specificphosphatase) with activity '14' Therefore, it is called a bispecific phosphatase (D ua, le secifieityphosphatase (DSP)). .
  • D ua le secifieityphosphatase
  • Protein phosphatase ⁇ f is a serine / threonine specific phosphatase (PP 1; PP 2 etc.) and tyrosine phosphatase (P TP) containing cysteine residues. Divided (T onks
  • P ⁇ P is P T P'I B (C ha r b o n n e au, H. ⁇ e t a 1. (1 9 8 9) P r o c. N at: 1. A c a d. S c i. U
  • DSP DSP
  • M itogen-activate dproteinkinase M itogen-activated protein kinase
  • NA 'phosphatase MA' P kinasephosphat a. Se (MKP)
  • MK P kinase targeting motif In addition to typical D S P like MK P, MK P kinase targeting motif
  • V H 1 derived from ⁇ xinia virus (V a c c i n i a V i r u s) is D S P. (G u a n, K. L., e t a 1.
  • DU SP 15 (VHY) is expressed in testis-specific expression in normal tissues, and in the detailed digit, it is expressed in the pakiten phase (the mitotic stage) spermatocytes, which is the first metaphase of meiosis. It is done.
  • myristate which is required for membrane localization, has a binding site (glycine residue) at the N-terminus, and is localized in the cell membrane and Golgi apparatus. The direct association of DU S P 15 with cancer has not been reported. ⁇
  • the present inventors have also confirmed that cancer cell growth can be suppressed by suppressing the expression of DU S P 15 gene by R.NA i (RNA 1000) ⁇ ). Therefore, by suppressing the expression of the DU S P 15 gene, it becomes possible to treat cancer. It is also possible to diagnose cancer by determining the expression level of DU S P.15 gene.
  • the present invention includes (1) a cancer therapeutic agent containing an OUSP 15 gene expression inhibitor as an active ingredient, and (2) a DU S ⁇ 1 ⁇ protein active or sex inhibitor as an active ingredient.
  • a cancer therapeutic agent is provided. .
  • DUS ⁇ 15 gene refers to NCBI nucleotides on the basis of A ccession No ..: NM_ 8 8 6 1 1 It means the human DU SP 15 gene (SEQ ID NO: 1) consisting of 3 bases (A lonso, A., eta (2 0 0 4) J. B iol. C he m.
  • stringent conditions may be any of f stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, the conditions of 5 XSSC, ⁇ X Denhardt's solution, 0. ⁇ % SDS, 50% holmium, 3 2.
  • Medium stringent conditions are, for example, the conditions: 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0'. ⁇ % SDS ⁇ 50% formamide, 42 t.
  • “High stringency conditions” are; for example, 5 XSSC 5 X Denhardt's solution; 0.5% SDS, 50% formamide, 50 conditions. Under these conditions, it can be expected that DNA with higher compatibility can be obtained efficiently as the temperature is increased.
  • factors affecting the hybridization stringency may include multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration. For example, it is possible to achieve the same triggency by appropriately selecting these elements. , ⁇ ⁇ ⁇ ' ⁇ '
  • hybridizable polynucleotide the base sequence of SEQ ID NO: 1, for example, 70% or more, when calculated using the default parameters by homology search software such as FAS TA and BLAST, 7 5% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 9 1% or more, 9 2% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, Examples include polynucleotides having 9 7% or more, 98% or more, and 99% or more identity.
  • inhibiting expression of a gene from gene to protein production; the sequence of events (e.g., transcription '(generation of mR NA), translation (generation of protein): including) of By inhibiting any event, it means inhibiting the production of protein encoded by the gene.
  • DU SP 15 protein refers to 2 3 5 amino acid residues registered in the NC Br protein database as A ccession No .: N P — 0 5 4 2 1 7 8
  • the activity of human DUSP 1 5 protein (SEQ ID NO: 2) and substantially the same activity as this protein (eg, protein tyrosine phosphatase activity and serine / threonine specific phosphatase activity)
  • SEQ ID NO: 2 protein tyrosine phosphatase activity and serine / threonine specific phosphatase activity
  • a mutant protein consisting of
  • the amino acid mutation site and number in the above mutant protein are not particularly limited as long as the mutant protein retains substantially the same activity as the original protein, but the number of mutations is, for example, 1 to 50, 1 to 40, ⁇ ! ⁇ 30, 1-2,5! ⁇ 2 0 ,! ⁇ 1 5 pieces, 1 ⁇ ; 1 0 pieces, 1 ⁇ 9 pieces,:! ⁇ 8 pcs! ⁇ 7, 1-6 (1 ⁇ several)! ⁇ 5 pcs! ⁇ Four, .:! ⁇ 3, .1 ⁇ 2, 1 In general, the smaller the number of mutations, the better.
  • such a mutant protein has approximately .70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 9% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 2% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more amino acid sequence having identity And proteins having substantially the same activity as the original protein. In general, the larger the homology value, the better.
  • the DU SP 15 protein includes “partial peptides” of the DU SP 15 protein.
  • a partial peptide of DU SP 15 protein a part of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of DU SP 15 protein is linked. Any partial peptide consisting of a sequence of X mific acid followed by any of the above may be used as long as it has an activity similar to that of the DU SP 15 protein described above.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 at least 20, preferably at least .50, more preferably at least 70, more preferably at least 100, most preferably Preferred examples include polypeptides having an “amino acid sequence” consisting of at least 200 amino acid residues.
  • these polypeptides contain an amino acid sequence corresponding to the portion responsible for the activity of the DU SP 15 protein.
  • the partial peptide used in the present invention is the above-mentioned polypeptide! In ⁇ , one or more amino acid residues in the amino acid sequence (for example, about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, and more preferably about 1 to 5 pieces) are deleted.
  • the D U S P; l S protein used in the present invention can be prepared from cells or tissues in which the protein is expressed. These proteins can also be synthesized by known peptide synthesizers, or prepared by recombinant methods using appropriate host cells selected from prokaryotes or eukaryotes. Can do.
  • the DU S P 15 protein used in the present invention may be derived from any species. Preferably, it is derived from human.
  • fermentation rate activity protein tyrosine phosphatase 'activity and serine threonine-specific phosphatase activity, etc.
  • fermentation rate activity protein tyrosine phosphatase 'activity and serine threonine-specific phosphatase activity, etc.
  • L 0 to 0 times preferably about 0.5 to 20 times
  • More preferably about 0.5 to 2 times quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • Enzyme activity was measured using p-nitrophenyl phosphorate dephosphorylation 3 ⁇ 4 (A lonso, A., Eta 1. (2 04 04) J. B iol. m.
  • cancer therapeutic agent means anticancer agent, cancer metastasis inhibitor, cancer cell apoptosis inducer, cancer cell proliferation inhibitor, cancer cell invasion inhibitor, cancer preventive agent, etc. Used to include.
  • cancer and “tumor” are used as square words having the same meaning.
  • the present invention provides a cancer therapeutic agent containing a substance that inhibits the expression of DU S P 15 gene as an active ingredient.
  • the “DU SP 15 gene expression inhibitor” is not limited as long as it inhibits the expression of DU SP 15 gene.
  • DU SP 15 gene to DU A substance that inhibits transcription to SP 15 mRNA; and
  • RNA i activity against D.U S P 1.5 mRNA or a portion thereof eg, siRNA
  • nucleic acid means R N A or DN A.
  • Nucleic acid as used herein may contain not only purine and pyrimidine bases but also those with other heterocyclic bases that have been modified. 'Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleosides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. It may be converted to a functional group.
  • RNA i is a phenomenon in which the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene is inhibited when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene is introduced into the cell.
  • R ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ is, for example, a double-stranded RNA that generates RNA interference with a length of 1.9 to 30 bases, such as ds RNA (doublesrand RNA) ⁇ , si RNA (sma 1 1 interfering RNA) Or sh RNA (shorthairpin RA).
  • ds RNA doublesrand RNA
  • si RNA si RNA
  • sh RNA shorthairpin RA
  • -Delivery of RNA, ribosome, etc . The system can be locally delivered to the desired site, and it can be expressed locally using a single vector so that the above double-stranded RNA can be generated. You can.
  • the methods for preparing and using such double-stranded RNA are known from many literatures (Special Table 2).
  • the length of the double-stranded RNA exhibiting the RNA i effect used in the present invention is usually 19 to 30 bases, preferably 20 to 27 bases, more preferably 21. ⁇ 25 bases, most preferably 2 1-23 bases.
  • the following si RNA (used in Example 3) can be used.
  • antisense nucleic acid or “antisense poly'nucleotide” includes: a polynucleotide that is complementary to at least one PN.A region of interest, and the polynucleotide is A nucleic acid that can hybridize with at least a part of the region.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • the antisense nucleic acid of the present invention is Ri ⁇ A, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and those that are resistant to degradation of oligonucleotides, but are not limited to them. Is not to be done.
  • the antisense nucleic acid to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • the nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal using a known method.
  • the sequence of the antisense nucleic acid is determined by the animal being transformed. It is preferable that the sequence is complementary to the endogenous gene or a part thereof, but it may not be completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed. '
  • Antisense nucleic acid effective for inhibiting gene translation is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably, of the target gene transcript. Has a complementarity of about 95% or more. ''
  • the length of the antisense nucleic acid is at least about 0 bases (for example, about 10 to 40), preferably about 15 bases More preferably, it is about 10 bases or more, more preferably about 500 bases or more.
  • 'Antisense nucleic acids can be referred to by publicly known literature: Design: can be made' (eg, Hira. Shima and Inoue, New Chemistry Laboratory 2 Nucleic acid IV gene replication and expression, 'Japan Biochemical Society, Tokyo, Japan) Chemistry, 1.9 93, p. .3 1 9-3 4 7), J. Kawak am ieta 1., P harm T e Ja Pan. V o 1 .8, p.
  • a nucleic acid having a ribozyme activity that specifically cleaves a transcript of the DU SP 15 gene can be used as an active ingredient.
  • ribozyme activity refers to a nucleic acid that specifically cleaves mRNA, which is a transcription product of a target gene.
  • Some ribozymes have a size of 400 nucleotides or more, such as group I introns and MRNA contained in RNase P. 40 nucleotides called hammerhead or hepin types Some have a sex. Domain (protein nucleic acid enzyme, 1.990, .35, p.
  • a compound other than a nucleic acid that inhibits the transcription activity of the DU S P 15 gene can be used as an active ingredient.
  • a compound is, for example, a compound that binds to a factor involved in transcription of the expression of the DU S P 15 gene.
  • Such a compound may be a natural product or a synthetic compound.
  • Such compounds can be obtained by the screening method described below. 1. Cancer treatment containing 2 DU S P 15 protein activity inhibitor M
  • the present invention also provides a cancer therapeutic agent containing a DU.S P 15 protein activity inhibitor.
  • D U S P 15 protein activity inhibitor includes, for example,
  • the “antibody” means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, so long as it binds to the D1J SP 15 protein of the present invention, in addition to the above polyclonal antibody, monoclonal antibody, and human antibody, a human antibody, a genetically modified hydride Also included are typed antibodies, as well as antibody fragments and antibody modifications.
  • An antibody that binds to DU S P 15 protein can be prepared by methods known to the abandoned person. Details of the anti-D, U.S P I ⁇ antibody will be described later.
  • DUS ⁇ 15; a DUSP 15 protein variant with dominant negative properties for proteins means that by expressing the gene that encodes it.
  • a protein that has the function of eliminating or reducing the activity of the endogenous wild-type DU SP 15 protein Kermanihiro Tsuchida, Gene Activity Inhibition Experiment, edited by Takuma Yoshikazu, Yodosha. (2 0 0 1) 2 (See 6-3 3). .
  • a compound other than the above antibody or mutant that binds to DU S P 15 protein can be used as an active ingredient.
  • Such compounds are, for example, compounds that bind to DUSP 15 protein and inhibit its activity.
  • Such compounds can be natural or synthetic.
  • Such a compound can be obtained by a screening method described later.
  • the above-described substance capable of inhibiting the activity of the DUPSP15 protein of the present invention can be used as a cancer therapeutic agent. .
  • the present invention relates to a screening method for a candidate compound having a cancer suppressing action. Also provide ... .
  • One preferred embodiment is a method using as an index the binding between DU S P1.5 protein and a test compound.
  • a compound that binds to DU S P 15 protein is expected to have an effect of inhibiting the activity of DU S P 15 protein.
  • the compound preferably binds to the active site of DU S P 1 5. protein.
  • DU S P 15 protein protein is contacted with a test compound.
  • DU SP 15 protein depending on the indicator for detecting binding to the test compound, ⁇ for example, a purified form of the DU SP 15 protein, still intracellular; is expressed extracellularly, or It may be in a form bound to an affinity column.
  • the test compound used in this method can be appropriately labeled as necessary. As examples of knowledge, radiolabels, fluorescent labels, and the like can be given.
  • the binding of DU S P.1 protein and test compound is then detected.
  • test compounds and substances used in this method There are no particular limitations on the test compounds and substances used in this method. For example, natural. Compound, organic compound, inorganic compound, protein, peptide, etc., and compound library., Gene library expression product, cell extract, cell culture supernatant, fermenting microorganism product , Marine organism extracts, extracts, plant extracts, etc., but are not limited to these. .
  • the binding between the DU S P 15 protein and the test compound can be detected by, for example, a label attached to the test compound bound to the PU S P 15 protein.
  • a change in the activity of the DU S P 15 protein caused by the binding of the test compound to the DU S P 15 protein expressed intracellularly or extracellularly can also be detected as an indicator.
  • the binding activity between a protein and a test compound can be measured by a known method (for example, the p-nitrophenyl phosphate dephosphorylation method (A 1 onso, A., eta I. (2 0 0 4) J. B iol. C he m. 2 7 9, 3 2 5 8 6— 3 2 5 9 1)).
  • the compound isolated by this method is expected to have a cancer suppressing action and is useful as a cancer therapeutic agent.
  • Another aspect of the screening method of the present invention is a method using the expression of the DUPSP15 gene as an index.
  • a test compound is brought into contact with cells expressing the DUSP 15 gene.
  • cells expressing the DUSP 15 gene examples include human, mouse, cat, inu, ushi, hidge, and birds, such as cells derived from pets and livestock.
  • Dusp 15 m gene expressing ⁇ “ cell. ”Refers to cells expressing endogenous DUS ⁇ 15 gene, or exogenous DUS; P 15 gene introduced.
  • cells expressing the gene can be used.
  • Cells in which an exogenous DUSP15 gene is expressed can usually be prepared by introducing each into an expression vector into which the DUSP15 gene has been inserted.
  • the expression vector can be prepared by a general genetic engineering technique. ' ⁇
  • test compound used in this method is not particularly limited.
  • a natural compound, an organic compound, an inorganic compound, a single compound such as a protein, a peptide, and the expression product of a compound library or gene library are used.
  • Cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, etc. are used.
  • Contact of a test compound to a cell expressing the DUSP 15 gene is usually performed by adding the test compound to the culture medium of the cell expressing the DUSP 15 gene. Not. When the test compound is a protein or the like, “contact” can be performed by introducing a DNA vector that expresses the protein into the cell.
  • the expression level of the DUSP 15 gene is measured.
  • gene expression includes both transcription and translation. Measurement of gene expression levels should be performed by methods known to those skilled in the art. And can. For example, mRNA is extracted from cells expressing the DU S PI 5 gene according to a conventional method, and the transcription level of the gene is determined by carrying out the Northern hybridization method or RT-PCR method using this mRNA. Measurements can be made.
  • the promoter region of the DU SP 15 gene is isolated according to a conventional method, and a marker gene (for example, luminescence of luciferase, GFP, galactosidase, etc., a gene that can be detected as an indicator such as fluorescence, color development, etc.)
  • the transcription level of the gene can also be measured by observing the activity of the marker gene.
  • by collecting the protein fraction from the cells that express the DU SP 15 gene and detecting the expression of each DU SP 15 protein by electrophoresis such as SDS-PAGE It is also possible to measure the translation level.
  • it is also possible to measure the translation level of the gene by detecting the expression of the protein by performing Western plotting using an antibody against DUS P.15 protein. Is possible.
  • the antibody used for detecting the DU SP 1; 5 protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both monoclonal antibodies, '. Or polyclonal antibodies can be used.
  • a compound that lowers the expression level is then selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control).
  • Compounds selected in this way become candidate compounds for cancer therapeutics. .
  • the present invention also provides an anti-DU SP 15 antibody, a cancer therapeutic agent containing this antibody, and the like.
  • the cancer therapeutic agent is used for cancer targeted therapy or targeted drug delivery.
  • anti-DU S P 15 antibody includes an antibody that specifically binds to DU S P 1.5 protein (including fragments (partial peptides) or salts thereof).
  • the anti-DU SP 15 antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody glass is not particularly well-defined, I g G,. I gM, I gA, I g
  • Antibodies having any isotype such as D or IgE are also included. I g G or I g M is preferable, and ⁇ g G is more preferable in consideration of ease of purification.
  • the term “antibody” is used to mean any antibody fragment or derivative, such as F ab, F ab '. 2 , CD, humanized antibody, multifunctional Antibodies, single chain antibodies (S c F v): etc.
  • the antibody of the present invention can be produced by a known method. Methods for producing such antibodies are well known in the art (eg, Harlow
  • the protein used as a sensitizing antigen is usually DUSP 15 protein or a salt thereof.
  • the DUSP 15 protein includes partial peptides thereof, which are not limited to force, for example, fragments of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 20 or more
  • the partial peptide having a continuous amino acid sequence portion of 4 or more, 60 or more, 80 or more, or 1.00 or more.
  • these fragments for example, amino (N) terminal fragment and carboxy (C) terminal fragment are used.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 6)) amino acid residues in the above amino acid sequence are deleted. , Substitutions, insertions and additions or additions.
  • salts of DU SP 15 protein or partial peptides used herein include inorganic acids (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid) Or a salt with an organic acid (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid).
  • the DU S, P "l 5 protein of the present invention used as a sensitization anti-antibody for antibody acquisition is not limited to the animal species from which it is derived, but is a protein derived from mammals such as mice and humans. Proteins are preferred, and proteins derived from special baboon are preferred.
  • DU SP 15 protein as described above, partial peptide thereof or salt thereof (in the present specification, in the description of the antibody, these are collectively referred to as “DU SP, 15 protein”) as an antigen.
  • Administer to mammals such as rats, mice, and rabbits.
  • the dose per anti-thick animal is 0.1 to 100 mg when no adjuvant is used, and 1 to L.0.00 when the adjuvant is used.
  • adjuvants include bromine complete adjuvant (F..CA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunity 'interval' is not particularly limited, but it may be several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks.
  • antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the final immunization, preferably 1 to 14 days after.
  • Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells. Spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available cell lines of animals such as mice can be used.
  • the cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells.
  • HAT selection medium including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • myeloma cells are X 6 3 A g. 8. 6 5 3, MSI myeloma cell lines such as NSI /.1.—A g 4—1, N S.0 Zo 1, and small myeloma cell lines such as Yg 2 ”0.
  • the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused.
  • the cell fusion, DM EM serum-free, R.PM I - 1 6 40 culture 3 ⁇ 4 for animal cell culture medium such as, 1 XI .0 6 ⁇ : the LX 1 0 7 or Zm 1 of antibody-producing cells 2 X 1.0 5:. ⁇ 2 X 1 0 6 or Zm 1 myeloma were mixed with cells (antibody producing cells with myeloma cells and the cell ratio 2: 1 to 3: 1 is preferred), cells fusion promoter present Perform the fusion reaction under As the cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 100 to 600 daltons can be used. Also, commercially available cell fusion apparatus electrical stimulation (e.g. elect port Poresho emissions) and for ⁇ li: antibody-producing cells and myeloma Y-, and Ma cells can be fused with.
  • the culture supernatant of the growing hybridoma is screened for the presence of antibodies that react with DU S P 15 protein.
  • the screening of pipridoroma may be performed according to a normal method and is not particularly limited. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and screened by enzyme immunoassay, radioimmunoassay or the like. Cloning of fused cells is performed by limiting dilution. Finally, a hybridoma that is a cell producing a monoclonal antibody that reacts with the DUSP 15 protein is established.
  • a normal cell culture method or ascites formation method can be employed.
  • mammalian derived Eroma cells hive Li dormer about 1 X 1 0 7 cells were administered intraperitoneally to same species animals are grown hybridomas in a large amount. And.:!
  • the antigen described above is administered to mammals such as rabbits, mice, and rabbits.
  • the dose of the antigen per animal is 0.:! To 100 mg when adjuvant is not used, and 10 to 100 g when adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), aluminum hydroxide, and juvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Aluminum hydroxide aluminum hydroxide
  • juvant juvant.
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. Further, the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed for several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks, 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times.
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay (ELISA (enz ume—11 nkedi mmu nosorbentassy) or EIA (enzyme immunassay)
  • radioimmunoassay RIA; radioi mm unoassay
  • Etc. blood is collected on the day when the maximum antibody titer is shown to obtain antiserum.
  • polyclonal antibodies in the antiserum Collect antibody that reacts with DU SP 15 protein (column adsorption 0 min) over a fixed affinity column.
  • the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum against the DU SP 15 protein can be measured by the ELIS A. method or the like. .:
  • F ab or F ab ' 2 fragments can be prepared by digestion with a protease (eg,' pepsin yet papain) by conventional methods.
  • a protease eg,' pepsin yet papain
  • Humanized antibodies are described, for example, by Riechmann et al. (Riechmann JM o 1 B iol. Oct 5; 2 0 3; (3): 8 2 5-8, 1 9 8 8), 'and J ones et al. (J H. nes et al., Nature .3 2 1: 5 2.2—5 2.5, 1 9 8 6). .
  • the antibody that binds to the DU S P 1,5 protein of the present invention can be used for the purpose of, for example, suppressing the proliferation or metastasis of cancer cells.
  • a human antibody or a human antibody is preferred in order to reduce immunogenicity.
  • the antibody When the antibody is used as a diagnostic agent, it may be labeled with a labeling substance for monitoring (eg, radioisotopes, fluorescent substances, etc.). If necessary, it is labeled with radioactive substances, fluorescent compounds, etc. can do.
  • a labeling substance for monitoring eg, radioisotopes, fluorescent substances, etc.
  • radioactive substances, fluorescent compounds, etc. can do.
  • fluorescent labeling compounds fluorescein isothiocyanate
  • the antibody DU SP 15 antibody can be labeled with a bioluminescent compound. The presence of a bioluminescent protein is measured by detecting the presence of fluorescence.
  • bioluminescent compounds for this purpose are luciferin, luciferase and aequorin.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting DU S P 15 protein in a subject such as body fluid or tissue.
  • the anti-DU SP 15 antibody used in the present invention itself is an agent having a neutralizing activity that attenuates the activity of the antigen in the therapeutic agent or diagnostic agent of the present invention. However, if necessary, it can be used in combination with other drugs for producing a therapeutic effect. Therefore, in another aspect, the present invention provides an anti-DUP 15 antibody for use in targeted therapy or targeted imaging of cancer (eg, colorectal cancer) and other drugs. And a composition containing such a complex is also provided. According to such an embodiment, the anti-DU SP 15 antibody used in the present invention is used to express other drugs having a therapeutic effect or a labeling agent for diagnosis, etc., and highly express the DU SP 15 protein. Can be delivered to the target site.
  • cancer eg, colorectal cancer
  • Examples of the “other drug” used in the present invention include a viral vector or a non-viral vector for introducing a gene into a target, such as a radioisotope, a therapeutic protein, or a small molecule drug. .
  • examples of the “radioisotope” include fluorine 1 18, Examples include radioactive halogen elements such as iodine—1 2 5 ( 1 2 )) and iodine—1 3 1. Like these radioactive halogen element also radioactive metallic element described above: a labeled antibody or peptide may be wide immediately utilized as radioactive Osamu therapeutic agent or a radioactive diagnostic agent. For example, it can be bound to an antibody or antibody fragment by a known method such as odorization with 1 2 5 I. or 1 3 1 I, or chloramine sputum method.
  • technetium 99 m for diagnosis, indium—11 1 1 and gallium 6 7 ( 6 7 Ga), etc., and for treatment, yttrium 1 90 ( 9 0 Y), rhenium—1 8 6 ( -1 8 6 Re) or rhenium 1 8 8. ( 1 88 Re) can be used.
  • a metal chelator is usually used.
  • EDTA, DTPA, diaminodithio compounds, cyclam, and DOT A are known as gold genus chelating agents. These chelating agents can be pre-bound to the antibody and then labeled with a radioactive metal, or they can be labeled after binding to the antibody after forming a radioactive metal gilt. ;
  • a cytokine that activates cells responsible for immunity is suitable, for example, a hydrointerleukin 2, a human granulocyte, a macrophage, and a colony stimulating factor Examples include human macrophage colony-stimulating factor, human interleukin 12 and the like.
  • toxins such as ricin and diphtheria toxin can be used to directly kill colon cancer cells.
  • the cDNA encoding the therapeutic protein is linked to the cDNA encoding the antibody or antibody fragment, and the DN A encoding the fusion antibody is constructed.
  • a fusion antibody can be produced by inserting the expression vector into a eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • “Small molecule drug” is used herein to mean a diagnostic or therapeutic compound other than “radioisotope” or “therapeutic protein”.
  • small molecule drugs include Nitrogen 'Mustard, Alkylating agents such as cyclophosphamide, antimetabolites such as 5-fluorouracil and mesotrexate, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, antibiotics such as daunorubicin and doxorubicin, vincristine, vinblastine, vindesine
  • Anti-cancer agents such as hormonal agents such as plant algiroids, evening moxifen, dexamethasone (clinical oncology (Japan Clinical Oncology Society 1 9 9 6 Cancer and Chemotherapy)), or Hyde mouth Cortisone, Steroids such as prednisone, non-sterolides such as 7spirin, Indomethacin, immunoregulators such as gold zomarate and penicillamine, immunosuppressants such as cycl
  • clemacytin ' Antihistamines such as anti-inflammatory agents (inflammation and anti-inflammatory therapy in 1982 years Biomedical drug Publishing Co., Ltd.) and the like and the like.
  • daunomycin and antibody can be bound by binding between daunomycin and the amino group of the antibody via dartal aldehyde, or the amino group of daunomycin and the carboxyl group of the antibody via water-soluble carpositimide. And the like.
  • virus vector a virus vector modified so as to bind to the anti-DU SP 15 antibody of the present invention can be used (for example, adenovirus vector (W ang, P., Eta (1 9 9 5) S oma tie C e 1 1 and Mol e'c. G enet. '2 1, 4 2 9-44 1), retroviral vectors (N aviaux RK, et. A 1. (1 9 9 6) J. Virol 7 0, 5 7 0 1-5 7 0 5), Lentiviral vector (N aldini, L. (1 9 9 8) C urr. O pin. B iotechno 1 9, 4 5 7-4 6 3)).
  • adenovirus vector W ang, P., Eta (1 9 9 5) S oma tie C e 1 1 and Mol e'c. G enet. '2 1, 4 2 9-44
  • retroviral vectors N aviaux RK, et. A 1. (1 9 9 6) J. Virol 7
  • virus vectors for example, induce apoptosis of cancer cells at target sites (eg, colon cancer) such as cell proliferation-related genes, apoptosis-related genes, and immune regulatory genes.
  • a gene (therapeutic gene) that produces a therapeutic effect such as Viral vectors that bind to anti-DUSP 15 antibodies are When administered to a patient in need of gene therapy with an anti-DUSP 15 antibody, it can be targeted to a site where an antigen recognized by the anti-DUSP 15 antibody (ie, DUSP 1.5) is present.
  • the anti-D U S P 15 antibody and the other drug can be combined chemically or genetically.
  • “chemical bond” includes, for example, ison bond, hydrogen bond, covalent bond, bond by intermolecular force, bond by hydrophobic interaction, etc.
  • ⁇ nativity binding '' includes the mode of binding between the antibody and therapeutic protein when a fusion protein consisting of the antibody and therapeutic protein is produced using a technique such as genetic recombination. To do.
  • Cancer treatment agent containing IS harmful substance Cancer treatment agent containing DUSP 15 protein activity inhibitor
  • anti-D SP15 antibody used in the present invention carries a radioisotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, and a therapeutic gene.
  • a therapeutic agent chemically or genetically engineered with any one or any combination of these can be formulated based on a known acupuncture method.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be added as necessary according to a conventional method.
  • surfactants for example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, taste masking
  • the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be appropriately used.
  • the types of dosage forms of the therapeutic agent of the present invention include, for example, oral tablets,. Powders, pills, powders, granules, fine granules, soft, hard capsules, film coating agents , Pellets, sublinguals, pastes, etc.
  • the optimal dosage form can be selected according to the target.
  • Inhibitors of DU S P 1.5 protein activity (or expression of DU S P 15 gene) as an active ingredient may be included in the preparation in an amount of 0.1 to 99.9% by weight.
  • the dose of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc.
  • the daily dose is about 0.1 mg to l, 100 mg, preferably about 1.0 to: I 00 mg, more preferably about 1.0 to 50 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, administration method, etc.
  • patients 60 kg About 0.1 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to: about 1 O mg is conveniently administered by intravenous injection. It is.
  • the type of dosage form, method of administration, age and weight of the patient, patient symptoms, etc. can be taken into account, and can be determined as appropriate by the physician or veterinarian.
  • the preparation thus obtained can be administered, for example, to humans or other mammals (eg, rabbits, magpies, hidges, buyu, ushi, cats, nu, monkeys, etc.). it can. In the case of animals other than humans, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • mammals eg, rabbits, magpies, hidges, buyu, ushi, cats, nu, monkeys, etc.
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the therapeutic agent of the present invention is cancer (for example, colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, Prevention of bladder cancer,.
  • Uterine cancer eg cervical cancer, endometrial cancer
  • testicular cancer thyroid cancer
  • knee cancer ovarian cancer
  • brain tumor blood tumor, etc.
  • blood tumor used for treatment, preferably 'prophylaxis of colorectal cancer' treatment.
  • the drug of the present invention contains DUSP 15 protein activity inhibitor IV or DU.
  • S 15 gene expression inhibitor as an active ingredient, anti-cancer agent, cancer.metastasis inhibitor, cancer cell apoptosis It can be used as an inducer or the like.
  • the target cell, tissue, organ, or cancer type is not limited to a specific type.
  • the agent of the present invention may contain both a D U S P 15 protein poor activity inhibitor and a D y S P 15 gene expression inhibitor.
  • an antisense nucleic acid is used in the therapeutic agent of the present invention, the antisense nucleic acid is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associate virus vector, etc. Thereafter, it can be administered according to known means.
  • Antisense nucleic acids can be formulated alone or with a physiologically acceptable carrier and administered via a catheter such as a gene gun or a hide-mouth gel catheter.
  • a virus vector such as a recombinant adenovirus particle and an anti-DUSP 1 ⁇ antibody
  • these may be used alone, but in general, pharmaceuticals are used.
  • a commercially acceptable carrier used with a commercially acceptable carrier.
  • the above-described carrier and aqueous isotonic solutions such as water, physiological saline, glucose, and human albumin are preferable.
  • additives, preservatives, preservatives, balance, etc. that are usually used in pharmaceutics can also be added.
  • the pharmaceutical composition thus prepared can be administered by an appropriate administration form and administration route depending on the disease to be treated.
  • dosage forms include emulsions, syrups, capsules, tablets, granules, injections, ointments and the like.
  • administering usually from 10 3 to 10 15 virus particles at a time per adult.
  • the administration frequency may be once to several times a day.
  • the administration period may be from 1 day to several months or more, with 1 to several doses as one set. May be administered.
  • the virus vector particles or virus vector nucleic acid molecules used in the present invention can be used for detection of specific cells and Z or tissues, or diagnosis of disease states.
  • a viral vector particle obtained by incorporating a detectable marker gene into a nucleic acid molecule of a virus vector and transfection into an appropriate host cell is anti-D 'USP 1 It can be used to detect and diagnose tumor cells in combination with 5 antibodies.
  • a detectable label can be bound to the anti-DU SP 15 antibody and used to excise and diagnose tumor cells.
  • the cancer diagnostic agent of the present invention comprises: (a) an antibody against DU SP 15 protein; or (b) a DUS P 15 gene or a partial nucleotide sequence thereof.
  • ⁇ ⁇ Contains a polynucleotide consisting of a base sequence that can be hybridized under high hybridization conditions.
  • the diagnostic method using the anti-DU SP 15 antibody of the present invention includes, for example, (a) a step of bringing a subject-derived biological sample into contact with an antibody against DU SP 15 protein, and (b) A step of detecting and Z or quantifying the binding between the antibody in the sample and the DU SP 15 protein or a partial peptide or a salt thereof.
  • a step of bringing a subject-derived biological sample into contact with an antibody against DU SP 15 protein includes, for example, (a) a step of bringing a subject-derived biological sample into contact with an antibody against DU SP 15 protein, and (b) A step of detecting and Z or quantifying the binding between the antibody in the sample and the DU SP 15 protein or a partial peptide or a salt thereof.
  • the detection and / or quantification step using the labeled anti-DU SP 15 antibody, DU SP 15 protein or The binding of the fragment to the anti-DUSP 1 ⁇ antibody is detected and / or quantified. : '"
  • biological sample derived from a test refers to a tissue, cell, or body fluid derived from a subject (eg, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), urine, lymph, saliva, sweat, semen Etc.)
  • a “subject” is a human subject who usually receives or desires to undergo a cancer screening, and is a human subject who has or is suspected of having cancer. Etc. are included. Examples of such cancers are colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer. , Uterine cancer (eg cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer., Ovarian cancer, brain tumor, blood. Colorectal cancer is preferred.
  • Immunoassays to detect the expression of DUS ⁇ 15 in a biological sample from a subject as described above may be suspected of having cancer (eg, colorectal cancer) or risk of cancer. Including contacting a biological sample taken from a subject with anti-DUS ⁇ 15 antibody under conditions that produce specific anti-antigen-antibody binding, and then measuring the amount of immunospecific binding by the antibody. To do. Such antibody binding is used to detect the presence and increased expression of the DUS 15 protein. In this case, detection of increased D U S 15 protein expression is an indicator of disease state. If necessary, the level of DUS 15 protein in a biological sample may be compared with the level of a healthy person who does not have cancer. ..
  • a biological sample such as a serum sample is contacted with a solid support or carrier such as nitrocellulose for the purpose of immobilizing all proteins present in the sample.
  • the support is then washed with buffer and subsequently treated with detectably labeled anti-DUSP 15 antibody.
  • the solid support is then washed twice with buffer to remove unbound antibody.
  • the amount of bound antibody on the solid support is measured according to well-known methods. Detection conditions suitable for each measurement are determined using conventional test methods. It can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the antibody is conjugated to an enzyme; for example the enzyme used in the enzyme immunoassay (EIA): [V oi 1 er, A. “The enzyme-labeled immunosorbent assay” (ELISA)., 1 9 7 8 ,; Diagnostic Horizons, 2: 1-7 , Microbiological A ssociates Quarterly Pub 1 ication, W a 1 kersvi 1 1 'e .. MD; V oi 1 er, A. by J' ⁇ CI in. Pathol., 3 1: 5 0 7-5 2 0: 1 9 7 8: B tier, J. E. by M eth.
  • EIA enzyme immunoassay
  • the photometric reaction produces a chemical molecule that can be detected by fluorescence measurement with visible means, and is reacted with an appropriate substrate, preferably a chromogenic substrate. Used for Enzymes which can and Turkey, it encompasses Peruokishidaze and alkaline phosphatase, and the like.
  • the 'Detection may also be accomplished by colorimetric methods using a chromogenic substrate for the enzyme.
  • Radioimsoatase RIA
  • sandwich immunoassay immunometric method
  • FIA fluorescence immunoassay
  • TRFIA 'time-resolved fluorescence immunoassay
  • EIA Enzyme immunoassay
  • ⁇ IA luminescence immunoassay
  • ELIA electrochemiluminescence immunoassay
  • latex agglutination method immunoprecipitation atse
  • precipitin reaction method gel diffusion precipitin reaction method
  • an immunoassay selected from the group consisting of an assay, an agglutination assay, a complement binding assay, an immunoradiometric assay, a fluorescence immunoassay, and a protein A immunoassay (WO 0).
  • each of the species associated with DU SP ⁇ 5 protein dysfunction Diagnosis of disease can be made. For example, if an increase in the concentration of DU SP 1.5 protein is detected, it may be caused by, for example, a disease caused by overexpression of DU SP 15 'protein (eg, cancer (eg, colon cancer)). Can be diagnosed as being high or likely to be affected in the future. .
  • DU SP 15 'protein eg, cancer (eg, colon cancer
  • the anti-DU SP 15 antibody of the present invention can also be used for diagnosis with i n v i V o.
  • Antibody preparations, product preparations and methods of use that can be used here are well known in the art.
  • antibody-chelating agents are described in Nuc1, Med. Biol. 1 990 017: 24 7-254.
  • an antibody having a label and a paramagnetic ion used in magnetic resonance imaging is described in, for example, M agne tic 'Re e n a c e e N e c i c e e 1 9 9 1 2 2: 3 3 9 ⁇ 34 2.
  • a probe or primer designed based on the nucleotide sequence of DUSP 15 gene can be used.
  • a diagnostic method includes, for example, (a) a biological sample derived from a subject, and a hybridization process that is based on the nucleotide sequence of the DU S 15 gene or a fragment thereof. And (b) contacting the polynucleotide in the sample with the DU SP 15 gene or a fragment thereof. Includes the process of detecting and Z or quantifying the session.
  • DNA of the DUSP 15 gene (or gene fragment thereof) in a biological sample derived from a subject is detected using the probe. And / or quantify.
  • the length of the base sequence used as a probe is, for example, 12 bases or more, 15 bases or more, .18 bases or more, 21 bases or more, 24 bases or more, 27 bases or more, 30 bases or more, or It may be a longer length polynucleotide fragment.
  • the low, high or high stringency conditions described above may be used.
  • a nucleotide sequence that can be hybridized under hybridization conditions that are stringent to the sequence” includes “DU SP 15 gene or fragment thereof”.
  • ⁇ a base sequence complementary to the base sequence (antisense polynucleotide): ⁇ .
  • Methods of hybridization of probes and nucleic acids are known to those skilled in the art. For example, International Publication No. 8 9/0 6 6 9 8, ⁇ ⁇ — A 0 2 0 0 3 6 2, US Pat. No. 2 9 1 5, 0 8 2, EP—A 0 0 6 3 8 7 9, E P.—A
  • the target sequence can be detected or quantified by using a known polynucleotide probe or primer for the DUPSP15 gene;
  • known methods for example, Southern hyperpla- dization, 'Northern hybridization, RT-PCR method, PCR ⁇ SSCP method (Genomics, Sections 5, IV, 8) 7 4-8 7 9 (1 9 8 9)), Proceedingsofthe Natio ⁇ a 1 A cademyof Sc
  • the array C GH method is a method that applies the chromosomal C GH method (K allioniemi, A. eta 1. (1 9 9 2) Science 2 5 8, 8 1 8-8 2 1). Genome D covering the region Using DNA chips with highly densely spotted NA fragments (BAC, PAC, YAC, etc.), cancer-derived DNA and normal DNA labeled with different dyes are converted into 'genomic DA fragments on the slide. In this method, DNA and copy number abnormalities in cancer are detected with high resolution by simultaneously performing hybridization and detecting the binding state (P nkel, D. et a. 9 9 8) N at. G enet. 2 0, 2 0 7-2 1 1).
  • the mR 1ST A level of DU SP 15 in the cell is expressed as a standard gene '(' housekeeping gene.
  • a standard gene ' housekeeping gene.
  • rnRNA levels can also be compared, preferably by RT-PCR.
  • the target sequence (DNA, mRNA, etc.) is detected and quantified by the method described above and overexpression of the DU SP 15 gene is confirmed, for example, it is caused by overexpression of DUS P 15 It can be diagnosed that the disease is likely (eg, cancer (eg, colorectal cancer)) or is likely to be affected in the future.
  • cancer eg, colorectal cancer
  • the presence of a target protein or a fragment thereof in a test sample can be identified using a mass spectrometer (MS). That is, by using a mass spectrometer, it is possible to determine the amino acid sequence of a target protein or a fragment thereof, and determine whether DU SP 15 protein is present in a biological sample derived from a subject. be able to.
  • Mass spectrometry uses MS to ionize samples such as proteins and peptides, and separates them according to the resulting mass charge (mZ z) It is a method to determine the mass of a sample by measuring its intensity. From the results of mass spectrometry, individual amiso acids' constituting the amino acid sequences of proteins and peptides can be identified.
  • MAL DI matrix assisted laser deposition
  • EI electrospray ionization
  • EI gas phase
  • FD field desorption
  • ion separation an ion separation method that is compatible with the ionization method is used.
  • TI me off 1 ight: TOF time-of-flight mass spectrometer
  • QM S quadrupole type
  • ion trap type ion trap type
  • magnetic field type ion trap type
  • Mass spectrometers are sometimes used in evening and in demem.
  • Other amino acid sequencing methods may be used, for example, sequencing using a sequencer (eg, gas phase sequencer);
  • the present invention also provides a kit for detecting and Z or determinating and quantifying a DU SP 15 protein or fragment thereof in a body fluid sample of a subject containing an anti-DU SP 15 antibody as a cancer marker.
  • the DU SP 15 gene or a part of its nucleotide sequence contains a stringent high-prididase nucleotide sequence that can be hybridized under the conditions of the DU SP 15 gene in a biological sample derived from a subject.
  • It also provides a kit for detecting and determining or quantifying the fragment as a cancer marker. These kits are used to detect a cancer marker by the above-mentioned immunological technique or hybridization method.
  • cancers examples include colon cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, and uterus.
  • cervical cancer, endometrial cancer testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, Ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc. are included, but colorectal cancer is particularly preferable.
  • the term “'cancer marker” refers to a subject's body fluid (eg, blood, urine, lymph fluid, saliva, sweat, semen, etc.) or cells or tissues that are not derived from normal tissue. Or a molecule that is selectively up-regulated in cancer cells or tissues, and the presence of the molecule in the body fluid or cell or tissue of the subject indicates or suggests the presence of cancer. Say things.
  • the kit according to the first aspect includes a component for detecting and / or quantifying a D U S P 15 antigen (including D U 'S P .15 protein and its partial peptide) in a body fluid sample from a subject.
  • a D U S P 15 antigen including D U 'S P .15 protein and its partial peptide
  • a D U S P 15 antigen including D U 'S P .15 protein and its partial peptide
  • a D U S P 15 antigen including D U 'S P .15 protein and its partial peptide
  • a body fluid sample from a subject.
  • a component for detecting and / or quantifying a D U S P 15 antigen including D U 'S P .15 protein and its partial peptide
  • a body fluid sample from a subject.
  • DUSP 15 protein is detected and / or quantified by ELISA
  • Such components can be expressed in, for example, tissue sections or levels of D 'USP 15 in body fluid samples such
  • the kit according to the second embodiment contains a polynucleotide having a base sequence that can be hyper-precipitated under a high-pridition condition stringent to the base sequence of the DUPSP 15 'gene or a part thereof.
  • the kit of the present invention may contain the above-mentioned polynucleotide immobilized on a DNA chip.
  • the kit of the present invention can be used for a high-pridition condition under high-precipitation conditions.
  • Containers and labels may be included.
  • the label on or associated with the container may indicate that the drug is used to detect a colorectal cancer marker.
  • other items such as instructions for use may be further included.
  • Example 1 Identification of colon cancer specific amplified gene by array 'C GH method
  • sample preparation of 200 colorectal cancer specimens and verification based on the array CGH method were performed.
  • the gene information in the public DB (NCBI: http: ZZwww. Ncbi. N 1 m. Nih. Gov /) is used in the region where amplification occurs frequently in colorectal cancer specimens.
  • the used B AC C 1 one.
  • the gene was found to be frequently and highly elevated in colorectal cancer patients (Fig. 1, Table 2).
  • Figure 1 shows a histogram showing the frequency of amplification of DU S P 15 gene in 200 colorectal cancer patients.
  • Table 2 shows the degree of amplification (GZR value) and frequency of 200 samples of DUSP 15 gene in colorectal cancer patients.
  • the average value shows the average value for samples with a .'GZR value of 1.2 or more.
  • the 'DUSP 15 gene was amplified in 56.0% of 20 0 colon cancer patients, with an average amplification of 1.7. .
  • the maximum value was 2.4, and remarkable amplification occurred very frequently. ..
  • Example 2 Verification of gene amplification in a colon cell culture
  • the degree of amplification in a colon cancer-derived cultured cell line was examined for a high-frequency and high-value gene region in colorectal cancer patients.
  • the cultured cell lines used were C a c o 2 and R KO. E 6 which are cell lines derived from colorectal cancer. Genomic DNA was extracted from the cultured cells using B 1 ood & CellCu1ture D.NA Kit (Q I AGEN) according to the protocol attached to the kit.
  • Table 3 shows the degree of amplification (G / R value) of DU.
  • S ⁇ 15 gene in a cell line derived from colorectal cancer. As shown, in the colon cancer-derived cell line, it was demonstrated that amplification occurred in the DUSP I 5 gene located in B AC Clone RP 1 1 — 2 4 3 J 16. -
  • Quantitative PCR was performed to confirm the amplification of the DU SP 15 gene region. Quantitative PCR is performed using S YB RG reen RT—PCRR eagents, Applied B iosys te rn s) according to the attached protocol. iosystems) did. Primers were synthesized using the following sequences (commissioned to OPE RON).
  • Table 4 shows the degree of amplification of the DU.SP15 gene in a colon cancer-derived cell line. Values are relative to control DNA (normal). As shown, it was found that amplification occurred in the DU S P 15 gene region also in the colon cancer-derived cell line. (Table 4)
  • DU SP 15 gene was also amplified in a colon cancer-derived cell line (C aco 2, RKOE 6). Therefore, cultured cells that could be used for functional analysis of DUSP 1'5 gene in cancer were selected.
  • Example 3 Functional analysis by RNA 1 analysis using colorectal cancer cell lines
  • the DU SP 15 gene which was frequently amplified in 20 colorectal cancer patients, was a colon cancer-derived cell line, and gene amplification was observed at the genomic level.
  • Cell line (C aco 2, R Using KOE 6), RNAi analysis was performed and the phenotype was observed.
  • RNA i analysis was performed and the phenotype was observed.
  • s i RN A was selected as a specific 21 m er within the gene and s i RN A was synthesized with the sequence as the target (commissioned to Q I AGEN).
  • siRNA When siRNA was introduced into Caco 2 cells, O 1 I gofeet amine (Invitrogen) was used, and si and RNA of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ were introduced into the cells according to the attached protocol.
  • siRNA was introduced into kKO E 6 cells using R NA i FECT (QIAGEN), and 1 0 0 111 ⁇ 3 i RN A was introduced into the cells according to the attached pro-collet.
  • N e g. Ativ e. Controlsi RNA (QI AG EN) was used. The cells were observed under an inverted microscope for 4 days after introduction into the cells.
  • siRNA was verified at the mRNA level using a quantitative RT-PCR method. From the cells 24 hours after siRNA introduction, total RNA was extracted according to the attached protocol using Micro-to-Midi Total RNA Purification System (Invitrogen). Then S superer S cript III CDNA was synthesized according to the attached protocol using FIrst—Strand Synthesis Systemfr; RT-PCR (Invitrogen).
  • the standard gene for calculating the relative ratio is G: lycer a.1 dehyde— 3-phosphatedehydrogenase (GAP DH) Control Reagents (A plied B iosyst em s). The ratio was calculated. Measurement of living cell count>
  • Fig. 2 A and Fig. 2 B show that after transfeetion, siRNA of DU SP 15 gene was transferred to Caco 2 cells and RKOE 6 cells, respectively.
  • the observation images on the 4th day are shown (in each figure, the upper row: ⁇ ⁇ 40; the lower row: ⁇ 2 0 0).
  • a, b, and c are 3 types of siRNA of DU SP 15 gene, and N C ′ represents a negative control.
  • N C ′ represents a negative control.
  • the number of cells was significantly reduced for both a, b, and c siRNAs compared to negative control (NC) (Fig. 2A,. B).
  • Fig. 3 shows the results of quantitative RT-PCCR after cells were harvested 24 hours after siRNA of DU S P15 gene was transformed into C. a o 2 cells.
  • the relative amount of N C was shown using the contrast of GAPDH.
  • the effect at the RNA level was confirmed by quantitative RT-PCR.
  • the amount of all three siRNAs was significantly reduced (Fig. 3).
  • Figures 4A and B show that after transfeetion of DUSP 15 gene iRNA to Caco 2 cells and RK0 E 6 cells, respectively, the number of viable cells was measured with the measurement reagent using the cells on day 4. The measurement results are shown. The graph shows the relative amount to N C. As shown, the number of viable cells was measured. As a result, for Caco 2 cells, one of the DU SP 15 gene siRNAs (c), for R KO E 6 cells, DUSP 1 In all three types of siRNA of 5 genes (a, b, c), the number of cells was significantly decreased compared to Negatube contfo 1 (NC), similar to the phenotype (Fig. 4 ⁇ ). , ⁇ ). All siRNAs of the above DU S ⁇ 15 genes in which a small number of cells were observed were significant in the t test ( ⁇ 0. 0 1).
  • Example 4 Functional analysis by RN A 1 analysis using a colon-derived normal cell line
  • RNA 1 analysis was performed using a cell line derived from normal tissue of the large intestine. By conducting this, we verified that the suppressive effect of the target gene is cancer-specific.
  • Example 3 For cell lines, use C CD 1 8 Co purchased from AT C. The culture conditions were in accordance with the attached protocol. As the siRNA used, the c sequence of Example 3 was used. For introduction of siRNA into the cells, .'Lipofect am ine 2200 (Invitrogen) was used, and 25 nM of siRNA was introduced into the cells according to the attached protocol. As a control, N e ga tiv e C o n t r o l. S i R N A (Q ⁇ A G EN) was used. The cells were observed under an inverted microscope for 5 days after introduction.
  • FIG. 5 shows the observation image obtained on the 5th day after Transfection of siRNA of DU SP 15 gene on CCD 18 Co cells (upper: X 40; lower); X 2,0 0 ) D U S P 15 c represents one of the S i shakuhachi of the D U S P 15 gene (c sequence of Example 3), and N C represents a negative control. As shown, phenotypic observations were similar to NC and no effect was observed (Figure 5).
  • FIG. 6 shows the results of measuring the number of viable cells with the measurement reagent using the cells on the 5th day after transfection of siRNA of the DUPSP15 gene into CCD18CO cells by Transfectioion.
  • the graph shows the relative amount to N C.
  • N C NegativyCorntrol
  • the organ-specific expression of the DU S P 15 gene in normal tissues was evaluated by the Northern hybridization method known in the art.
  • RNA levels in normal organ tissues 23 organs (Heart, Brain, Placenta: (Pl'acenta), Lung, Liver) (Liver)., Skeletal muscle (S'keleta ⁇ Muscle), kidney (Kidney), spleen (Pancreas), spleen (Spleen), thymus (Thymus), prostatic gland (Prostate), testis, ovary ( Ovary, 'Small Intestine, Colon, Peripheral Blood, Peripheral Blood Leukocyte, Stomach, Thyroid, Spinal Cord, Lymph Node, Trachea (Trachea), Adrenal Gland, and Bone Marrow were analyzed by the Northern hybridization method.
  • DU SP 15 gene ⁇ ⁇ ⁇ 1 J is the NCBI (http://www.ncbi.nliii.nih.gov), Accession No.NM_080611, and the 1,383 bp sequence is mRNA. It is registered as.
  • Figure 7 shows the results. As shown, Alonso A. et al. (Alonso A. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279 (31), 32586- 3259.1) As in the report, a band around 1.5 kb was observed in the testis, confirming significant testis-specific expression. . In this analysis, a new band was observed around 1.3 kb in the heart and skeletal muscle, suggesting the appearance of alternative splicing variants. For other organs, the expression level was confirmed to be low. The specific expression in the testis and the limited expression of organs in the testis are likely to be limited to normal tissues due to the effects of drugs targeting this gene. Example 6 Evaluation of gene amplification
  • the gene amplification degree (G / R) was 1.2 by the P- array CGH method, which was evaluated by the FISH method known in the art that gene amplification occurred in the DUSP 15 gene region in cancer cells in the specimen tissue.
  • Hybridization was carried out using the BAC Clone RP11-243J16 DNA Probe in which the DUSP 15 gene is located using the specimen tissue (derived from a colon cancer patient).
  • Figure 8 shows optical micrographs (fluorescence images) of some of the specimen tissues (A ⁇ : a portion of cancer cells (6 cells) observed with sputum. As shown, there are signals in the cancer cells. .3 Spots or more were found It was confirmed that the DU SP 15 gene region was amplified in 10 specimens with a gene amplification level of 1.2 or more by the array CGH method. It was shown that gene amplification occurred during the latter period of time, indicating that the DU SP 15 gene region is not only used as a molecular target for cancer therapeutics, but also for cancer diagnosis by FISH.
  • Example 7 Detection of DU SP 15 protein in blood by mass spectrometry
  • Serum specimens from colorectal cancer patients and healthy specimens 10 / zL Dilute with 500 L of a solution (10 mM Tris HC1 ph 7.4 + 150 mM NaCl), and then use a ProteomeLab IgY-12 SC proteome partitioning kit (BECKMAN COULTER: A24618) to obtain a large amount of protein in serum such as albumin and globulin. Was removed. Dithiothreitol (Wako: 049-08972) was added to the obtained fraction to a final concentration of 10 mM, and the reduction reaction was performed at 60 for 30 minutes.
  • a solution 10 mM Tris HC1 ph 7.4 + 150 mM NaCl
  • odoacetate and amide (SIGMA: 144-48-9) were added to a final concentration of 10 mM, and the alkylation reaction was carried out at room temperature for 30 minutes in the dark. After completion of the reaction, add 4 times the amount of cold acetone (with Wako: 014-08681, —20) to the reaction solution, let stand at 80 for 1 hour, and then centrifuge at 15,000 xg for 30 minutes to precipitate the protein. It was collected. The recovered protein was dissolved in 80 L of 2 M urea + lOOmM ammonium bicarbonate solution. After dissolution, a portion was subjected to protein concentration measurement by the BCA method. ⁇ Lipsin (Promega: V511C) was added to the sample protein to 1/50 (w / w), and digestion was performed at 37 for 16 hours.
  • Nano-column (C18 PepMap 3 m, 100 A, 75 m) directly bound to 0.7 g of peptide fragment with X-Precoluinn cartridge (C18 PepMap300, 5 m, 300A, 300 M m id x 5 mm LC PACKINGS: 163589) It was separated by id ⁇ ⁇ 150 mm LC PACKINGS: 160321). As the HPLC apparatus, Ultimate Plus (LC PACKINGS) was used.
  • the flow rate is 200nL / min, and the concentration gradient of 0.formic acid (Wako: 062-02901) -containing ⁇ acetonitril (MERCK: 1287229) and 0.formic acid-containing 90% acetonitrile is 0.573 ⁇ 4 / min.
  • 0.formic acid Wako: 062-02901
  • MERCK ⁇ acetonitril
  • 0.formic acid-containing 90% acetonitrile is 0.573 ⁇ 4 / min.
  • the sample was ionized under the conditions of a capillary voltage of 1500 V, an end plate offset value of 500 V, a dry gas flow rate of 12 L / min, and a dry gas temperature of 250.
  • the ion trap is set to capture 1 Da before and after the target m / z.
  • MS / MS analysis was performed on a mobile phone.
  • Fig. 9A and Fig. 9B show the results of analyzing the above methods for (A) serum derived from colorectal cancer patients and (B) serum derived from healthy subjects, respectively.
  • FIGS. 10A to C show the correspondence between the peaks shown in FIG. 9 and amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis.
  • si RN A was introduced into cells using O 1 igofec .t am ine (Invitr Q gen, and 100 nM si RN A was introduced into the cells according to the attached protocol.
  • egative Controlsi RNA Q. I AGE N was used ...
  • 01 1 shows the results of measuring the number of viable cells (MTT assay) with the measurement reagent using the cells on the 4th day after transfection of siRNA of DU S P 15 gene into HeLa cells.
  • the graph shows the relative amount with respect to N C (Negative control siRNA (Qiagen)).
  • N C Negative control siRNA (Qiagen)
  • 3 types of siRNA of DUSP 15 gene (a, b, c). Among them, 26% growth inhibitory effect was observed in siRNA a (p ⁇ 0.01 in t-test).
  • differential interference images were taken under a microscope, and the dynamics were observed in detail, specifically, after siRNA (a, b, c) was transferred to HeLa cells, 1,,, A differential interference image of the same visual field was observed after 2, 3, and 4 days, and the results are shown in Fig. 12.
  • Negative control siRNA Qiagen was used for NC. Suppression and induction of cell death (partially indicated by arrows) were confirmed, where a, b, and c correspond to si RNA a, si RNAb, and si RNA c in Figure 11 respectively. Induction of cell death was observed in a in which growth suppression was observed.
  • the present invention provides cancer therapeutic agents, diagnostic agents, diagnostic methods, therapeutic methods, kits used therefor, and the like. Therefore, the present invention is useful in fields such as cancer diagnosis or targeted therapy.

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Abstract

本発明は、ＤＵＳＰ１５タンパク質の発現阻害物質または活性阻害物質を含有するがん治療剤；そのような治療剤の有効成分として使用し得る化合物のスクリーニング方法；ＤＵＳＰ１５タンパク質に対する抗体；その抗体などを用いるがん診断剤・がん診断方法などを提供する。

Description

明細書
DU S P .l 5.遺伝子の治療的又は診断的用途 技術分野
本発明は、. がんにおいて特異的に増幅している遺伝子である D U S P 1 5遺伝子、 その治療的ヌは診断的用途などに関する。 背景技術
悪性腫瘍.'（がん） の特徴として、 増殖 ' 浸潤 · 転移を経て.全身化する こどによる致死があげられる。 外科的な切除または放射線治療のような 局所療法では、 転移性再発がんに対して十分な対処.はできず、 全身療¾ 'である薬物療法の発展が、 今後のがん治療成績の向上に期待されている。
がん薬物療法の現在の中心である化学療法は、 直接がん細胞の DNA および/または RN Aに作用し、 細胞を死に至らせる殺細胞薬剤を)^い. 場合が多いが、 がん細胞以外の、 例えば、 骨髄細胞、 生殖細胞、 毛母 細胞、 消化管上皮細胞など分裂がさかんな正常細胞に対しても作用し、 .強い副作用をもたらしていた。 一方、 近年の分子細胞生物学の進歩によ り、 がん.細胞の浸潤 ·増殖 · 転移などにかかわるメカニズムが解明され、 そのがん細胞の特定メカニズムに特異的に,作用する分子標的薬の開発が ' 注目されている。 代表例として、 非小細胞肺がんの治療に効果のある E G F R (上皮成長因子受容体） 、 'チロシンキナーゼ阻害剤であるィレツ サ （一般名 ： ゲフイチニブ） （WO 9 6 Z3 3 9 8 0 ) 、 乳がんの治療 に効果のある HE R— 2 (ヒ ト上皮成長因子受容体 2 ) のヒ ト化モノク ローナル抗体のハーセプチン （一般名 ： トラスッズマブ） （W094Z 0 0 1 3 6 ) などがあげられる。 しかしながら、 現状では未だ有効な分 子標的薬は少なく、 今後更なる各がん種に対する有効な分子標的薬の開 発が望まれている。
日本人の大腸がんは年々増加の傾向にあり、 死亡数は、 肺がん、 胃が んに次い .3位になっている。 .年齢別では 6 0歳代が一番多く 次いで 5 0.歳代、 7 0歳代の順で ¾る。 大腸がんの増加の原因には、 遺伝的要 因、 環境的要因などが考,えられるが、 食生活の西欧化、 特に動物性脂肪 の取りすぎが原因ではないかと指摘されている。 大腸がんの有効な分子 標的薬の開発が待たれている。. また、 診断に用いられている腫瘍マーカ 一 (C E.A, C A 1 9 - 9 ) は、 進行大腸がんであっても約半数が'陽性 を示すのみで、 臓器特異性も無く、 より高性能な診断薬の開発が望まれ ている。 - ' 発明の開示 '.
上 己のような状祝下で、 がんを治療および または診断するた.めの たな薬剤または方法が求められている。
' 特に、 がんに対して特異性の高い治療薬および または診断薬が求め られている。 . '
上記のような状況に鑑み、 本発明者.らは、 鋭意研究を重ねた結果、' が ん （特に、 大腸がん） において高頻度に増幅が起きている遺伝子が、 D U S P 1 5遺伝子であることを見出した。 本'発明者らはさらに、 大腸が ん細胞株なら.びに子宮頸がん細胞株において DU S P 1 5タンパク質の 発現を阻.害することによって、 癌細胞の増殖を抑制し得るととを見出し、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本,発明は、 以下に記載するがん 治療剤、 がん抑制作用を有する候補物質のスクリ一二ング方法、. がん診 断剤、 がん診断用キッ ト、 がんの 断方法などを提供する。
( 1 ) DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するが ん治療剤。
( 2 ) 上記 DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質が、
( a ) DU S P 1 5遺伝子の発現を RN A i効果により阻害する作用 を有する核酸、
( b ) D U S P 1 5遺伝子もしくはその一部、 またはその転写産物に 対するアンチセンス核酸、 ( c ) P U S P 1 5遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、
.( d ), D U S P 1 5遺伝子まだほその一部 対してドミナントネガテ イブに作用する DU S P 1.5遺伝子変異体
(e ) DU S P 1 5遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザィム. 活性を有する.核酸、
および ■ ' —— ' ■■" ,
. ( f ) D U S I3 1 5遺伝子の転写または DU S P 1 5 mRNAの翻 訳を阻害す.る化合物 （上記核酸を除く）
からなる群から選択される物質を含む、 上記 （ 1 ) 'に記載のがん治療剤。 (3) D'U S P 1 5.タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有す ' るがん治療剤。 ， . ： .
(4) 上記 DU S P 1 5タンパク質の活性阻害物質が、
( a) 該 DU S P 1 5タンパク質に対する抗体、
( b ) 該 DU S P 1 5夕ンパク質に対してドミナンドネガティブの性 質を有する DU S P 1 5タンパク質変異体、 ：および、'
., (c ) 該 DU S P 1 5タンパグ質に結合する.化合物 （上記抗体および 変異体を除く）
からなる群から.選択される物質を含む、.上記 （ 3 ) に記載のがん治療.剤。.
( 5 ) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 .上記 （ 1 ) 〜 ( 4 ) のいずれ.かに記載のがん治療剤。 ，
(6 ) DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質をスクリ一ニングする方法で あって、 '
( a) DU S P l 5遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物を接触させ る工程、
(b) 該 DU S P 1 5遺伝子の発現レベルを測定する工程、 および
(c ) 被検化合物を接触させない場合と比較して、 該発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程を包含する、 スクリーニング方法。
( 7 ) DU S P 1 5夕ンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする方 法であって、 ' ( a〉 p U S P 1 5タンパク質と被検化合物どを接触させる工程、 .(b).該 DU S P 1 5.タンパク質と被.検化合物との結合活性を測定す る工程、 および
( c ) 該 U S P 1 5タンパク質と.結合する化合物.を選択する工程を 包含する、 スクリーニング方法。
( 8) 上記がんが、 大腸がん孝たは子宮頸がんである、 上記 （6 )' また は （ 7 ) に記載の方法。
( 9) DU S P 1 5タンパク質に対する抗体。
( 1 0 ) 上記 （ 9') に記載の抗体を含有するがん治療剤。
( 1 1 ) 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬剤、 または治療 遺伝子を担持した.ベクターをさらに:含有する、 上記 (.1 0 ) に記載のが ん治療剤。 '
( 1 2 ) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 上記 （ 1 0) または （ 1 1 ) に記載のがん治療剤。
( 1 3) 上記 （ 9 ) に記載の抗体を含有するがん診断剤。 ■ ' '
( 1 4 ) D U S P 1 5遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリ ン i ン卜なハイプリダイゼーシヨン条件下でハイブリダィズ可能な塩基配列 .を含有するがん診断剤。
( 1 5 ) ·上記がんが大腸がんで る、 上記 （ 1 3 ) または'（ 1 4 ) に記 載のがん診断剤.。
( 1 6 ) 上記 （ 9 ) に記載の抗体を含有するがん診断用キッ ト。.
( 1 7 ) D U S P 1 5遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリンジェ ン卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列 からなるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キッ 卜。
( 1 8 ) 上記がんが大腸がんである、 上記 （ 1 6) または （ 1 7 ) に記 載のがん診断用キッ ト。
( 1 9) 被験者由来の生体試料中の D U S P 1 5タンパク質または DU S P 1 5遺伝子をがんマ一カーとして検出および または定量する方法。 ( 2 0 ) 前記生体試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 上記 （ 1 9) に記 ¾の方法。
( 2 1 ). 質量分析装置を用いて、 bu S. P 1 5夕ンパク質を検出および /または定量する、 上記 （.1 9 ) または （ 2 0 ) に記載の方法。
( 2 2 ) 抗 D U S P 1 5抗体を用いて、 D U S P 1. 5.タンパク質を検出 および/または定量する、 上記.（ 1 9) 〜 （ 2 1 ) のいずれかに記載の 方法。 . ' ■ '■
( 2 3 ) ( a) 被験者由来の生体試料と、 DU S P 1 5タンパク質に対 する抗体とを接触させる工程、 および
■ (b) 上記試 中での上記抗体と、 DU S P.1 '5 'タン.パク覃との結合 ：を検出および Zまたは定量する工程、
を包含する、 上記 （ 2 2 ) に記載の方法。
(24) ( a) 被験者由来の生体.試料と、 DU S P.1 5遺伝子またはそ の断片の塩基配列にス トリンジェン卜なハイブリダィゼ一ション条件下
.でハイプリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触さ せる工程、 および : ：
. ( b ) 上記試料中での上記ポリ'ヌクレオチドと、 DU S, P 1 5遺伝子 またはその断片とのハイプリダイゼーショジを検出および/または定量 する工程、 '
を包含する、 上記 （ 1 9 )' または (2 0 ) に記載の方法。.
(2.5 ) がんの.診断に用いるための上記 （.1 9 ) 〜 （'2 4) のいずれか に記載の方法。 ，
( 2 6 ) 前記がんが、 大腸がんである、 上記 （ 2 5 ) に記載の方法。 ( 2 7 ) DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質を患者に投与する工程を包 含する、 がん治療方法。
( 2 8 ) DU S P 1 5タンパク質の活性阻害物質を患者に投与する工程 を包含する、 がん治療方法。
• (2 9 ) がんを治療するための医薬の製造のための、 DUS P 1 5遺伝 子の発現阻害物質の使用。
(3 0 ) がんを治療するための医薬の製造のための、 DU S P 1 5タン パク質の.活性阻害物質の使用。： . ：
( 3, 1 ) 配列番号 5、 配列番号 6、 '配列番号 7、 Ϊ&列番号.8、 配列番号 9、 または配冽番'号 1 0の塩基配列を有する、 ポリヌクレオチド。
( 3 2 ) D U S P 1 5遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含.有する がん 瘴剤であって、 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 配列番号 8、 ..配列番号 9、 または配列番号 1 0の塩基配列を有するポリヌクレオ , チドを含有する.、 がん治療剤。 本発明により、 がん （例えば、 .大腸がん) の治療およびノまたは診断 · .に有用な新規な.薬剤、 ヰッ トおよび方法、. ならびにがん抑制作用を有す る候補イ 合物のスクリーニング方法が提供される。 図面の簡単な説明 '
図 1は、 D U S P 1 5遺伝子の大腸がん患者由来の 2.0 0検体におけ る遺伝子増幅度に対する頻度を示すヒス トグラムで,ある。
図 2は、 大腸がん細胞株 C a c o 2および R K O Ε 6に、 D U S Ρ 1 . 5遺伝子の' s i RNAをトラシススェク 卜した場合の、 RNA i解析の 結果を示す光学顕微鏡写真 (位相差像）である。
図 3は、 大腸がん細胞株 C a o 2に DU S P 1 5遺伝子の s R N Aをトランスフエク .卜した場合の、 R N A i効果を定量的 R T— P C R 、 により評価した結果を示すグラフである。 .
図 4,は、 大腸がん細胞株 C a c ό 2および R KO E 6に DU S P 1 5 遺伝子の s i RNAをトランスフエク トした場合の、 生細胞数測定によ る R N A i効果を評価した結果を示すグラフである。
図 5は、 大腸正常組織由来の細胞株 C CD 1 8 C Oに DU S P 1 5遺 伝子の s i RNAを トランスフエタ トした場合の、 RNA i効果を光学 顕微鏡により検証した結果を示す写真（位相差像）である。
図 6は、 大腸正常組織由来の細胞株 C CD 1 8 C Oに DU S P 1 5遺 伝子の s i RNAをトランスフエク トした場合の、 RNA i効果を生細 胞数測定により検証した結果を示すグラフである。
囱 7は、 正常な種々の臓器組織を用いて行ったノーザンハイブリダィ ゼーシヨンの結果を示す写真である。
図 8は、 FISH 法で解析した大腸癌患者由来の各検体組織（A〜J)のが ん細 の一部 （6細胞分） の光学顕微鏡写真（蛍光像）である。
図 9 Aおよび図 9 Bは、 質量分析により解析した （A) 大腸がん患者 由来の血清および （B) 健常者由来の血清についての結果をそれぞれ示 すグラフである。
図 1 0 A〜Cは、 M S /M S,解析によって決定された:、 図, 9に示すピ クとアミノ酸 （またはアミノ酸配列） との対応関係を示す。
図 1 1.は、 子宮頸癌細胞株. HeLa.細胞株に D U S P 1.5遺伝子の s i RNAを卜ランスフエク トしだ.場合の、 RNA i効果を生細胞数測定 より検証した結果を示すグラフである。. .
図 1 2は、 図 1 1の実験を時系列に従い、 顕微鏡下で撮影し、 その動 態を詳細に観察した結果を示す光 顕微鏡写:真（微分干渉像)である'。 発明'を実施するための最良の形態 .
本発明者らは、 大腸がん患者由来の検体を用いてアレイ C GH法によ る増幅遺伝子の検証を行 、 大腸がん特異的な遺伝子増幅^域を特定し た。 検体におい:て高蘋度に増幅が起きている領域のう'ち、 ヒ 卜 DU S P 1 5 (D u a l s p e c.i f i c i t y p h o s p h a t a s e— 1 i k.e 1 5 ) 遺伝子が大腸がん患者由来の検体において高頻度であ ることを見出した。
D U S P 1 5は、 非受容体型のプロティンチロシンホスファターゼフ アミリー 、 P r o t e i n— t y r o s i n e p h o s p h a t a s e f am i 1 y ) に属し、 プロテインチロシンホスファターゼ （P r o t e i n— t y r o s i n e p h o s p h a t a s e) 活性および セリン/スレオニン特異的ホスファタ一ゼ （S e r i n e / t h r e o n i n e— s p e c i f i c p h o s p h a t a s e ) 活 '14を有する' そのため、 二重特異性ホスファ.ダーゼ .（D u a ,レ · s e c i f i e i t y p h o s p h a t a s e (D S P ) ) と呼ばれる。 .
プロティンホスファタ ~~ f ( P r o t e i n p h o s p h a t a s e ) は 、 セリン/スレオニン特異的ホスファタ一ゼ (P P 1；, P P 2な ど ), システィン残基を含むチロシンホスファターゼ （T y r o s i n e P h o s p h a t a s e ) . (P T P) とに分けられる （T o n k s
N . K . & N e e 1 , B · G. ( 1 9 9 6 ) C e l l 8 7， 3 6 5 -
3 6 8 ； M u s t e
Figure imgf000009_0001
, Ύ . , e t a 1. ( 2 0 0 2 ) F r o n t . B i o s c i . 7 , 8 5 - 1 4 2 ; Mu S t . e l i n, T. ， e t
. a 】 . ( 2 0 ひ 3 ) Γ mm u n ό 1 , R e v . 1 9 2 , 1 3 9 - 1 4
7 最近ではさ.らに、 ァスパラギン酸を含む金属イオン依存性,の P. T
P (Tひ o t '1 e，■ T . L . , e t a 1. ( 2 0.0 3 ) N a t u r e
4 2 6 , 2 9 9 - 3 ひ 2 ; R a y a p u r e d i , J . ， e t :. a 1
( 2 0 0 3 ) N a t u r e .4 2 6 , 2 9 5 - 2 9 8 ; L i , X . , e t a に ( 2 0 0 3 ) N a t u r e. 4 2 6 , 2 4 7 - 2 54 ) が見 かつている。 P τ Pは、 P T P'I B ( C h a r b o n n e a u , H. · e t a 1. ( 1 9 8 9 ) P r o c . N a t: 1 . A c a d. S c i . U
■ ,S . A . 8 6 , 5 2 5 2— 5 2 5 6 ) に代表される非受容体犁と C D 4 o 「 (H e r m i s t ο η ,' Μ. L . e t a 1. ( 2 0 0 '3 ) A n n u
R e. v . I mm.u n o 1 . 2 1， i 0 7— 1 3' 7 ) に代表され ¾受容体 型に加え、 プロティンチロシンホスファ夕ーゼ活性およびセリン /ズレ ォニン特異的ホスファ夕ーゼ活性の両方を有する非受容体型の D S P (Yu v a n i y ama , J . ， e t a 1. ( 1 9 9 6 ) S c i e n c e 2 7 2 , 1 3 2 8 - 1 3 3 1 ; D e n u, J . M. ， e t a 1. ( 1 9 9 5 ) J . B i o l . C h e m. 2 7 0 , 3 7 9 6— 3 8 0 3 ; K e y s e , S. M. ( 1 9 9 8 ) S e m i n. C e l l D e v. B i o l . 9 , 1 4 3 - 1 5 2 ; C amp s , . , e t a 1. ( 1 9 9 9 ) F AS E B J . 1 4， 6— 1 6 ; K e y s e， S . M. ( 2 0 0 0 ) C u r r . O p i n. C e l l B i o l . 1 2 , 1 8 6 - 1 9.2 ； M y e r s , M.. P . , e t a 1. ( 1 9 9 7 ) P r o. c . N a t 1 . A c a d. S c i, .. U . S . A . 9 4 , 9 0 5 2— 9 0 5 7 ) に分類される。 ヒ トゲノム上の P T Pは 9 6種の遺伝子が存 在し、 その内,、 非受容体型は 2 6種、. 受容体型は 2.9種、 ^り D S Pに ついては 4 1種類あるとの報告がある （B h a d u. r i ， A. & S o w d h a m i n i , R . ( 2 0 0 3 ) P r o t e i n E n g. 1 6 '， 8 8 1 - 8 8 8 )
D S Pの代表例として、 マイ 卜ジェン活性化プロテインキナーゼ （M i t o g e n— a c t i v a t e. d p r o t e i n k i n a s e ) である E r'k、 J n k：'、 p 3 8より.脱リ ン酸化し不活性させる MA Pキ ナ一ゼホスファタ一ゼ （ M A' P k i n a s e p h o s p h a t a. s e ( M K P ) ) が知られている .（S a x e n a , M. &M u s t e 1 i n， T . ( 2 0 0 0 ) S e m i n . I mmu n o 1 . 1 2， 3 8 7 - 3 9 6 ; A 1 o n s o , に :, e. t a 1. ( 2 0 0 3 ) T o . C u r. r . G e n e t . 5， 3 3 3— 3 5 8 ) 。 ： ；
. MK Pの様な典型的な D S Pの他に、 MK Pキナーゼ標的化モチーフ
(MK P k i n a s e - t a r g、e t i n ' mo t i f ) を欠くグ ル—プが存在する。 ヮクシニアウィルス （V a c c i n i a V i r u s ) 由来の V H 1が D S Pである.. ( G u a n , K . L. , e t a 1.
( 1 .9 9 1 ) N;a t u r e 3 5 0 , 3 5 9 - 3 6 2 ) と報告されて以 来、 D U S P 3 ( V H R ) ( I s h i b a s h i , T. , e t a .
( 1 9 9 2 ) P r o c - a t 1 '. 'A c a d . S c i . U . S A. 8
9， 1 2 1 7 0 - 1 2 1 7 4) 、 D U S P 2 2 ( VHX) (A 1 o n s o， A. , e t a 1 ( 2 0 0 2 ) J . B i o 1 . C h e m 2 7 7
「 「
o o 2 4 - 5 5 2 8 ) 、 D U S P 1 δ (VHY) (A 1 o n s o ， A. e t a 1. ( 2 0 0 4 ) J . B i o l . C h e m. 2 7 9， 3 2 5 8
6一 3 2 5 9 1 ) 、 D U S P 1 4、 D U S P 1 9 、 D U S P 2 0 、 D U
S P 2 1、 D U S P 2 3 ( VH Z ) (A 1 o n s o , A . , e t a ゾ
( 2 0 0 4 ) J . B i o 1 . C h e m. 2 7 9 ， 3 5 7 6 8 - 7 4) な ど見つか ている。
DU S P 1 5 (VHY) は、 正 ½組織において精巣特異的な発現がみ られ、 詳細な解桁では 減数分裂の第一分裂中期であるパキテン期 （太 糸期） 精母細胞に発現が見られる。 また、 膜への局在に必要なミ リスチ ン酸が結合部位 （グリシン残基） が N末端にあり、 細胞膜やゴルジ体に 局在する。 DU S P 1 5のがんとの直接的な関連については.、 報^きれ ていない。 ■
本発明者らは、 DU S P 1 5遺伝子の発現を R.NA i (RNA千涉） によつて抑制す^)ことによってがん細胞の増殖を抑制できることも確認 した。 したがって、 DU S P 1 5遺伝子の発現を抑制す ¾こ.とによって、' がん 治療することが可能となる。 また、 DU S P.1 5遺伝子の発現量 を惻定することによってがんの診断を行うことも可能となる。
以下、 本発明のがん治療剤、 スクリ ニング方法、 診断剤などについ て詳細に説明する。 . ，
.■' ； .
1. かん抑制作用を有する薬剤
まず、 本発明は、 （ 1 ) O U S P 1 5遺伝子の発現阻害物質を有効成 分として含有するがん治療剤、 及び （ 2 ) DU S Ρ 1 δタンパク質の.活 、 性阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。 .
. 本明細書中、 . 「D U S Ρ 1 5遺伝子」 と.いう場合、 N C B I ヌクレオ チドデ—夕ベースにおいて、 A c c e s s i o n N o .. ： NM_ひ 8 0 6 1 1で登録されている 1 3 8 3塩基からなるヒ ト DU S P 1 5遺伝 子 （配列番号 1 ) を意味するが （A l o n s o , A. ， e t a し ( 2 0 0 4 ) J . B i o l . C h e m. 2 7 9 , 3 2 5 8 6 - 3 2 5 9 1 ) 、 これに限定されず、 例えば、 当該遺伝子の塩基配列において 1つ 以上の塩基の置換、 欠失、 付加、 または挿入などを有することによって 変化している変異体のような、 当該遺伝子の塩基配列またはその相補配 列にス トリンジェントなハイプリダイゼーシヨン条件下でハイブリダイ ズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子も本明細書 中で使甩する 「DU S P 1 5遺伝子」 .に含まれる'ものとする。 · ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の.方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ' クローニング （Mo 1 e c u 卜 a r C I o n i. n g T h i r d E d i t i o n , J . S a m b r o o k e t a 1.. , C o l d S p r in g H a r b o r L a b. P r e s s . .2.0 0 1 ) に記載の方法などに従って行うことができる。 また、 • 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に 従って行うことができる。 ここで、 「ス トリンジェントな条件」 は、 fま' ス 卜リ ンジェン卜な条件、 中ストリ ンジェン卜な条件及び高ス ドリンジ .ェントな条 '件のいずれでもよい。 「低ス トリンジェン卜な条件」 は、 例 えば、 5 X S S C， δ Xデンハルト溶液、 0. δ % S D S , 5 0 %ホ,ル ムアミ ド、 3 2 の条件である。 また、 「中ス トリ ンジェン卜な条件」 は、 例えば、： 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0' . δ % S D S\ 5 0 %ホルムアミ ド、 4 2 tの条件である。 「高ス トリ ンジェン 卜な条., 件」 は； 例えば、 5 X S S C 5 Xデ .ンハルト溶液、； 0. 5 % S D S、 5 0 %ホルムアミ'ド、 5 0での条件である。 .これらの条件において、 温 度を上げるほど高い相向性を有する D N Aが効率的に得られることが期 待できる。 ただし、 ハイブリダィゼ一シヨンのス トリンジエンシーに影 響する要素としては温度、 'プローブ濃度、 プロ ブの長さ、 イオン強度、 時間.、 塩濃度など複数の要素が考えられ、. 当業者であればこれら要素を 適宜選択することで同様の トリンジエンシーを実現することが可能で . ある。 ， ■ · ■ '■ '
ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとしては、 FAS TA、 B L A S Tなどの相同性検索ソフ トウェアにより、 デフォルトのパラメ一夕 一を用いて計算したときに、 配列番号 1の塩基配列と、 例えば、 7 0 % 以上、 7 5 %以上、 8 0 %以上、 8 5 %以上、 9 0 %以上、 9 1 %以上、 9 2 %以上、 9 3 %以上、 9 4 %以上、 9 5 %以上、 9 6 %以上、 9 7 %以上、 9 8 %以上、 9 9 %以上の同一性を有するポリヌクレオチド をあげることができる。 本明細書中、 「遺伝子の発現阻害」 とは、 遺伝子からタンパク質生成 まで ;の一連の事象 （例えば、 転写 '（mR NAの生成） 、 翻訳 （タンパク 質の生成）：を含む） のうちのいずれかの事象を阻害することによってそ の遺伝子によってコードされる夕ンパ.ク質の生成を阻害することを意味 す ¾ものとする。
本明細書中、 「DU S P 1 5タンパク質」 という場合、 NC B rタン パク質データベースにおいて、 A c c e s s i o n N o . ： N P_ 0 5 4 2 1 7 8で登録されている 2 3 5アミノ酸残基からなるヒ ト D U S P 1 5夕ンパク質 （配列番号 2 ) およびこの夕.ンパク質と実質的に同質 ,の活性 （例えば、 プロテインチロシンホス.ファタ一ゼ活性およびセリン /スレオニン特異的ホスファタ一ゼ活性から選択される一種以上の活 性) を保持し、 このタンパク質のアミノ酸配列に対して 1〜複数個のァ ミノ酸残基め欠失、 置換、 挿入、 及び/または付加が生じたアミノ酸配 列からなる変異タンパク をいう。
上記変異タンパク質における、 アミノ酸の変異部位および個数は、' 变 異タンパク質が元のタンパク質と実質的に同質の活性を保持している限 り特に制限'はないが、 変異個数は、 例えば、 ■' 1〜 5 0個、 1〜 4 0個、 ^！〜 3 0個、 1〜 2 5個、 ：！〜 2 0個、 ：！〜 1 5個、 1〜； 1 0、個、 1〜 9.個、 ：！〜 8個、 ：！〜 7個、 1〜 6個 （ 1〜数個） 、 ：！〜 5個、 ：！〜 4 個、 .：！〜 3個、 .1〜 2個、 1個である。 変異個数は一般的に少ない程好 ましい。 また、 このような変異タンパク質は、 配列番号 2のアミノ酸配 列と約.7 0 %以上、 7 5 %以上、 8 0 %以上、 8 5 %以上、 9 0 %以上、 9 1 %以上、 9 2 %以上、 9 3 %以上、 9 4 %以上、 9 5 %以上、 9 6 %以上、 9 7 %以上、 9 8 %以上、 9 9 %以上の同一性を有するアミ ノ酸配列を有し、 かつ元のタンパク質と実質的に同質の活性を有する夕 ンパク質を含む。 上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
上記 DU S P 1 5タンパク質には、 DU S P 1 5タンパク質の 「部分 ペプチド」 も含まれる。 DU S P 1 5タンパク質の部分ペプチドとして は、 DU S P 1 5タンパク質のァミノ酸配列 （配列番号 2 ) の一部の連 続する Xミフ酸の配列からなる部分ペプチドであって、 好ましくは、 前 述 DU S P 1 5タンパク質の活性と同様の活性を有するものであれば . いずれのものでも'良い。.例えば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列に おいて、 少なく とも 2 0個、 好ましくは少なくとも.5 0翻、 'さらに好ま しぐ 少なくとも 7 0個、 より好ましくは少なくとも 1 0 0個、 最も好 ましぐは少なく とも 2 0 0個のアミノ酸残基からなる'ァミノ酸配列'を有 するボリペプチドなどが挙げられる。 '好ましくは、 これらのポリべプチ ドは、 DU S P 1 5タンパク質の活性に関与する部分に対応するアミノ 酸配列を含有する。 また、 本発明で使用される部分ペプチドは、 上記の ポリべプチ！^において、 そのアミノ酸配列中の 1または複数個 （例えば、 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに り好ましく は 1〜 5個程度） のアミソ酸残基が欠失、 付加、 置換、 または挿入によ
'り変吏さ ているものでもよい。 . . .
本発明で用いる. D U S P;l Sタンパク質は、 そのタンパク質を発現レ, ている細胞や組織から調製することが.できる。 また.、, これらめタンパク 質は、 公知のペプチド合成機によっても合成できるし、： 原核生物あるい は真核生物から選択される適当な宿主細胞を'用いた組換え方法によって も調製することができる。 本発明で用いる DU S P 1 5タンパク質は、. いずれの種由来のものでもよい力 好ましぐはヒ ト由来である。
「実質的に同質の活性」 とは、 それらの活性が性質的に同等であるこ とを示す。 したがって、 酵率活性 （プロテインチロシンホスファタ一ゼ '活性およびセリン スレオニン特異的ホスファターゼ活性など） が同等 (例えば、 約 0. 0 1〜： L 0 0倍、 好ましくは約 0. 5〜 2 0倍、 より 好ましくは約 0. 5〜 2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の 程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 酵素 活性の測定は、 p—二ト口フエニルホスフエ一トデホスホリ レ一ション (p— N i t r o p h e n y l P h o s p h a t e D e p h o s p h o r y l a t i o n ) ¾ (A l o n s o , A . , e t a 1. ( 2 0 04 ) J . B i o l . C h e m. 2 7 9 , 3 2 5 8 6 - 3 2 5 9 1 ) などの文献に記載の公知の方法に準じて行うことができるが、 例え ば、. 後に記載するスグリー二ング方法に従つて制定することができる。 なお、 アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 カーリンおよびアルチュ ールによるァルゴリズム B L A S T . (P r o c . N a t 1. A c a d. S c i.. U S A 8 7 2 2 64 - 2 2 6 8 , 1 9 9 0 ; p r o c . N a t 1.. A c a d . S c i U S A 9 0 ： 5 8 7 3 , 1 9 9 3 ) を用いて決定できる。 B L A S Tのアルゴリズムに基づいた B L A S T Nや B LA S T Xと呼ばれるプログラムが開発されている （A 1 t s c h u S F， e t a 1 : J M o 1 B i -o 1： 2ュ 5 ： 4 0 3 , 1 9 9 0 ) 。 B'L A S T Νを用いて塩基配列を解析する場合は、 ノ ラメ一.夕一は、 .例えば. s c o r e;= 1 0 0、 w o r d 1 e n g. t h = 1 2とする。 また、 B L A S TX.を用いてアミノ酸配列を解析する場合 は、 ノ ラメ一夕一は、 例えば s c o r e. = 5 0、 wo r d l e n g t h = 3とする。 B LA S T i a p p e d B L A S Tプログラムを用い る場合は、 各プログラムのデフォルト.パラメーターを用いる。
本明細書中、 「がん治療剤」 という用語は、 抗癌剤、 癌転移阻害剤、 癌細胞のアポトーシス誘導剤、 .癌細胞の增殖抑制剤、 癌細胞の浸潤抑制 剤、 がん予防剤等を含む意味で使用される。 なお、 本願明細書中、 用語 「癌 （ .たは、 がん） 」 と 「腫瘍」 とは同じ意味を有する角語として使 用される。
1. 1 . DUS P 1 5遺伝子の 阻害物質を含有するがん治療剤
本発明は、 1つの実施形態において、 DU S P 1 5遺伝子の発現阻害 物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、 「DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質」 には、 DU S P 1 5遺伝子の発現を阻害するものであれば制限はないが、 例えば、 ( i ) DU S P 1 5遺伝子から DU S P 1 5 mRNAへの転写を阻害 する物質、 および （ i i ) DU S P 1 5 mRNAから DU S P 1 5夕 ンパク質への翻訳を阻害する物質が含まれる。 . D U S. P I.5遺伝子から D U S p 1 5 mR N Aへの転写を阻害する. 物質の例としては、
( a) DU S P Γ 5遺伝子またはその一部に対するアンヂセンス核酸、
(b) DU S Ρ 1 5遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、
( ς ) DU S Ρ 1 5遺伝子またはその一部に対してドミナントネガティ ブに作用する DU S P 1 5·遺伝子変異体、 あるいは ノ (d) そめ他の転写阻害化合物
などが含まれる。
また、 ' DU S P '1 5 mR.NAから DU S Ρ,ί .5:タンパク への翻訳 ,を阻害する^質の例としては、
. (e ) D.U S P 1.5 mRNAまたはその一部に対レて RNA i作甩を 有するポリヌクレオチド （例えば、 s i R N A) ；
( f ) DU S P.1 δ mRNAまたはその一部に対するアンチセンスポ リヌクレオチド、 ' ( g ) D U S P 1 δ mR Ν Αまたは.その一部に対レてリボザィム活性 を有するポリヌクレオチド、 あるいは '
(h) その他の翻訳阻害化合物
などが含まれる。：
本明細書中、 「核酸」 とは R N Aまたは DN Aを意味する。 ここでい う 「核酸」. は、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修 飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。 'こうした修飾物は、 メチル化されだプリンおよびピリミジン、 ァシル化 されたプリ ンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジ ン、 あるいはその他の複素環を含むものであって良い。 修飾されたヌク レオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、 糖部分が修飾されてい て良く、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置 換されているか、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されて いてよい。
本発明のがん治療剤においては、 DU S P 1 5遺伝子の発現を RN A i,効桌により阻害する作用を有する核酸を有効成分として用いることが できる。 R N A i とは、 .標的遺伝子配列と同一もしくは類似した.配列を 有する二重鎖 R N.A.を細胞内に導入すると、 導入した外来遺伝子および 標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のこと いう。 ここ で用いられる R Ν Αとしては、 例えば、 1.9〜 3 0塩基長の RN A干渉. を生ずる二重鎖 RNA、 例えば、 d s RNA (d o u b l e s r a n d R N.A )■ 、 s i R N A ( s m a 1 1 i n t e r f e r i n g R N A) 又は s h R N A ( s h o r t h a i r p i n R A) が挙 げられる。 このような R N A 、 リボソームなどの-送達:システムにより 所望の部位に局所送達させることも可能であり、 また上記二重鎖 RN A が生成きれるよう,なベクタ一を用いてこれを局所発現させることができ る。 このような二重鎖 RNA (d s RNA、 s i R N Aまた s■ h R N Ά) の調製方法、 使用方法などは、 多くの文献から公知である （特表 2
0 0 2 - 5 1 6 0 6 2号：； 米国公開許第 2 0 0 2 / 0 8 6 3 5 6 A 号 ； N a t u r e G e n e t i c. s， ：2 4 ( 2) , F e b! , .
1 8 0 - 1 8 3 ; G e n e s i s , 2 6 ( 4 ) ， . A p r i 1 ，'
2 4ひ一 2 44 ; N a t u r. e , S p e . 2 1 , 4 0 7 : 6 8 0 2 ,
3 1 9 - 2 0 ； G e n e s &. D e v. ， V o l . 1 6. , ( 8 ) , A p r . 1 6 , 9 4 8 - 9 5 8 ； . P r o c . N a t 1.. A c a d. S c. i . U S A, , . 9 9 ( 8 ) , 1 6 A p r 「 「
o o 1 「 「 「 p — o o
2 0 ; S c i e n c e , 2 9 6 ( 5 5 6 7 ) 9 A r . ,
'5 5 0— 5 5 3 ; P r o c N a t l . A c S c に U
S A, A r . 3 0， 9 9 : 9， 6 04 7 - 2 ； N a t u r e B i o t e c h n o l o g y, V o l . ( 5 ) ， M a y, 4 9 7 - 5 0 0 ; N a t u r e B ι o t n o 1 o g y，
V o l . 2 0 ( 5) ， M a y, 5 0 0 - 5 0 N u c l e i c
A c i d s R e s . , M a y 1 5など） 。
本発明で用いられる R N A i効果を奏する二重鎖 R N Aの長さは、 通 常、 1 9〜 3 0塩基、 好ましくは 2 0〜 2 7塩基、 より好ましくは 2 1 〜 2 5塩基、 最も好ましくは 2 1〜 2 3塩基である。 本発明においては、 具体的には、 下記 s i R N A (実施例 3で使用） を用いることができる。
(表 1 ) , . s i R N A配列 ：
Figure imgf000018_0001
本明細書中、 「アンチセンス核酸」 、 または 「アンチセンスポリ'ヌク レオチド」 と:は、 ある対象となる PN.A領域 少なくとも一^に相補的 な,ポリヌクレオチドを有し、 そのポリヌクレオチドが当該領域の少なぐ とも一部とハイブリダィズすることができる核酸のことをいう。 本発明 のアンチセンス核酸は、 RNA、 DNA、 あるいは修飾された.核酸 （R NA、 DN A) である。 本発明のアンチセンス核酸は、 Ri^A、 DNA、 あるいは修飾された核酸 （RNA、 DN A) である。 'それらは；本鎖 D . NA、 一本鎖 DNA、 二本鎖 RNA、 一本鎖 RNA、 さらに DNA :.R N Aハイブリッ ドであってもよい。'修飾された核酸の具体例とレては、 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 さらにはポリヌクレオチ ドアミ ドゃオリゴヌクレオチドアミ ドの分解に抵抗性を有するものなど が挙げられるが、 それらに限定されるものではない。
使用されるアンチセンス核酸は、 適当なプロモーターの下流に連結さ れ、 好ましくは 3 ' 側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 こ のようにして調製された核酸は、 公知の方法を用いることで、 所望の動 物へ形質転換できる。 アンチセンス核酸の配列は、 形質転換される動物 が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好まし いが、 遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、 完全に相補的で なくてもよい。 '
例えば、 DU S P 1 5遺伝子の mRN Aの 5， 端近.傍の非翻訳領域に 相補 なアンチセンス配列を設計すれば、 遺伝子の翻訳阻害に効果的で ある。 コード領域もしくは 3 ' 側の非翻訳領域に相補的な配列も使用す ることができる。 遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核酸は、 標 的遺伝子の転写産物に対して約 7 0 %以上、 好ましぐは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好まじくは約 9 5 %以上の相補性を 有する。 ' '
アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、 アンチセンス核酸の長さは少なぐとも約 0塩基以上 （例えば、 1 0〜 40個程度） 、 好ましくは約 1 5塩基以上であり、 より好ましくは約 1 0 ひ塩基以上であり、 さらヒ好ましくは約 5 0 0塩基以上である。 'アン チセンス核酸は公知の文献を参照レて:設計す:ることができる'（例えば、 平.島および井上、 新生化学実験講座 2 核酸 I V遺伝子の複製と発現、' 日本生化学会編、 東京化学同人、 1.9 9 3、 p . .3 1 9— 3 4 7 ) 、 J . K a w a k am i e t a 1 . , P h a r m T e c h J a p a n . V o 1 . .8 , p . 2 47 ,； 1 9 9 2.; V o 1. 8 , p . 3.9 5 , 1 9 9 2 ; . S . T . ； C r o o k e e t a 1. ， e d . ■， A n t i s e n . s e R e s e a r c h a n d Ap p l i c a t i o n s , C R C P r e s s , 1 9 9 3など参照） '。
また、 本発明のがん治療剤においては、 DU S P 1 5遺伝子の転写産 物を特異的に切断するリボザィム活性を有する核酸を有効成分として用 いることができる。 ここでいう 「リボザィム活性」 とは、 ターゲッ トと する遺伝子の転写産物である mRN Aを部位特異的に切断する核酸のこ とをいう。 リボザィムには、 グループ Iイントロン型や R N a s e Pに 含まれる M l RNAのように 40 0ヌクレオチド以上の大きさのもの もある力 ハンマ一ヘッ ド型やへァピン型と呼ばれる 4 0ヌクレオチド 程度の 性.ドメインを有するものもある （タンパク質核酸酵素、 1.9 9 0、 .3 5、 p . 2 1 9 1 )： 。 ハンマーへッ ド型リボザィム.については、 例えば、 F E B S： L e t t , 1 9 8 8 , 2 2 8， p . 2 2 8 ； F E Β· S: L e t t , 1 9 8 8 , 2 3 9 , p. 2 8 5 ； 夕ンパク質核酸酵素， 1 9 9 0 , 3 5， p . 2 1 9 l ; N u c l A c i d s R e s , 1 9 8 9 , 1 7 , p . 7 0 5 9などを参照することが.でぎる。 また、 ヘアピ ン型リボザィム.については、.例えば、 N a t u. r e , 1.9 8.6， 3 2 3， p . 3 49 ； N u c 1 A c i d s R e s , 1 9 9 1 , 1 9 , p. 6 7 5 1 ； 菊池洋， 化学と生物， 1 9 9.2， 3 0 , 1 1 2などを参照 することが' きる。 このようなリボ.ザィムを用いて本発明における DU S P 1 5遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、 該遺伝子の発現 を阻害ずることができる。
さらに、 本発明は、 DU S P 1 5遺伝子の転写活性を阻害する核酸以 外の化合物を有効成分とじて用いることができる。 そのような化合物は、 例えば、 DU S P 1 5遺伝子の発現 ' 転写に関与する因子に結合する化 合物である。 このような化合物は、 天然物でも合成化合物でもよい。 こ : のような化合物は、 後述のスクリーニング方法によって、 取得すること が可能である。 1. 2 DU S P 1 5タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療 M
' 本発明はまた、 別の実施形態において、 DU.S P 1 5タンパグ質の活 性阻害物質を含有するがん治療剤を提供する。
本明細書中、 「D U S P 1 5タンパク質の活性阻害物質」 には、 例え ば、
(a) D U S P 1 5タンパク質に結合する抗体、
(b) DUS P 1 5タンパク質に対してドミナントネガティブの性質 を有する DU S P 1 5タンパク質変異体、 あるいは
( c ) DU S P 1 5タンパク質に結合する化合物 （上記抗体および変 異体を除ぐ） .
などが含まれる。 、 本明細書における 「抗体」 とはタンパク質の全長又は断片に反応する 抗体を意味する。 本発明の抗体の形態には、 特に制限はなく、 本発明の D1J S P 1 5タンパク質に結合する限り、 上記ポリクローナル抗体、 モ ノクロ.一ナル抗体のほかに、 ヒ ト抗体、 遺伝子組み換えによるヒ ド型化 抗体、 さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。 DU S P 1 5タン パク質に結合する抗体 （抗 DU S P 1 5抗体） は、 当棄者に公知の方法 により調製することが可能である。 なお、 抗 D,U.S P I δ抗体の詳細 ，ついては後^する。
本明被書におけ.る 「D U S Ρ 1 5;タンパク質に対してドミナントネガ ティブの性質を有する D U S P 1 5タンパク質変異体」.とは、. それをコ 一ドする遺伝子を発現させることによって、 内在性の野生型 DU S P 1 5タンパク質の活性を消 もしくは低下させる機能を有するタンパク質 を指す （土田邦博著、 遺伝子の活 阻害実験法 多比良和誠編、 羊土社. ( 2 0 0 1 ) 2 6— 3 2など参照） 。 .
さらに、 本発明においては、 DU.S P 1 5タンパク質の活性を阻害し 得る物質として、 D U S P 1 5タンパク質に結合する、 上記抗体または 変異体以外の化合物を有効成分として用いることができる。 そのような 化合物は、.例えば、 DU S P 1 5タンパク質に結合し、 その活性を阻害 する化合物である。 ごのような化合物は、 天然物でも合成化合物でもよ レ 。 このような化合物は、 後述のズクリーニング方法によって、 取得す ることが可能である。
上記した本発明の D U S P 1 5タンパク質の活性を阻害し得る物質は、 がん治療剤として使用することができる。 .
2. DU S P 1 5タンパク質の活性もしくは発現を阻害する物質のス クリ一二ング方法
本発明は、 がん抑制作用を有する候補化合物のスクリーニング方法を も提供する.。 .
一つの好ましい態様は、 DU S P 1. 5タンパク質と被検化合物との結 合を指標とする方法である。 通常、 DU S P 1 5夕ンパク質と結合する 化合物は、 DU S P 1 5タンパク質の活性を阻害する効果 有すること が期待.される。 ここで、 該化合物は、 DU S P 1 5.タンパク質の活性部 位に結合することが好ましい。 本方法においては、 まず、 DU S P 1 5 タンパク賁と被検化合物とを接触させる。 DU S P 1 5タンパク質は、 被検化合物との結合を検出するための指標に応じて、 ^えば、 DU S P 1 5タンパク質の精製された形態、 細胞内まだ；は細胞外に発現した形 、 あるいはァフィ二ティーカラムに結合した形態であり得る。 この方法に 用いる 検化合物.は必要に応じて適宜標識して用いることができる。，檩 識としては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識等を挙げることができる。， 本方法においては、 次いで、 DU S P.1 5夕ンパク質と被検化合物と の結合を検出する。
本方法に甩いる被検化合物とレ は:、 特に 限はない。 例えば、 天然. 化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチドなどの単一化 合物、 並びに、 化合物ライブラリー.、 遺伝子ライブラリーの発現産物、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出、物、 植物 抽出物等が挙げられるが、' これらに限定されない。 . '
DU S P 1 5タンパク質と被検化合物との結合は、 '例えば、 PU S P 1 5タンパク質に結合した被検化合物に付された標識によって検出する ことができる。 また、 細胞内または細胞外に発現している DU S P 1 5 夕ンパク質への被検化合物の結合により生じる DU S P 1 5タンパク質 の活性の変化を指標として検出することもできる。 タンパク質と被検化 合物との結合活性は、 公知の手法によって測定することができる （例え ば、 p—二トロフエニルホスフエ一トデホスホリ レ一ション法 （A 1 o n s o， A. ， e t a I . ( 2 0 0 4 ) J . B i o l . C h e m. 2 7 9， 3 2 5 8 6— 3 2 5 9 1 ) ) 。
本方法においては、 次いで、 DU S P 1 5タンパク質と結合し、 その 活性を阻害する被検化合物を選択する。
本方法により単離されるィ匕合物は、 .· がん抑制作用を有することが期待 され、 がん治療剤とし 有用である。
本発明のスクリーニング方法の他の.態様は、 D U S P 1 5遺伝子の発 現を指標とする方法である。
本方法においては、 まず、 D U S P 1 5遺伝子を発現する細胞に、 被 検化合物を接触させる。 用いられる 「細胞」 の由来としては、 ヒ ト、 マ ウス、 ネコ、 ィヌ、 ゥシ、 ヒッジ、 トリなど、 ペッ ト、 家畜等に由来す る細胞が挙げられ'る力 これら由来に制限され い'。 「： D u s p 1 5 m ,伝子を発現 ί "る.細胞」 としては、 内因性の D U S Ρ 1 5遺伝子を発現し ている細胞、 また,は外因性の D U S ; P 1 5遺伝子が導入され、 該遺伝子 が発現している細胞を利用することができる。 外因性の D U S P 1 5遺. 伝子が発現した細胞は、 通常、 それぞれ D U S P 1 5遺伝子が挿入され た発現ベクター ¾宿主細^へ導入することにより作製することができる。 該発現べクダ一は、 般的な遺伝子ェ.学技術によって作製するこ.とがで. きる。' ■ ■■ ■
本方法に用いる被検化合物としては、 特に'制限はないが、 例えば、 天 然化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチドなどの単一 化合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遺伝子ライブラリーの発現産物、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物 抽出物等が用いられる。
D U S P 1 5遺伝子を発現する細胞への被検化合物の 「接触」 は、 通 常、 それぞれ D U S P 1 5遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物 を添加することによって行うが、 この方法に限定されない。 被検化合物 がタンパク質等の場合には、 該タンパク質を発現する D N Aベクタ一を、 該細胞へ導入することにより、 「接触」 を行うことができる。
本方法においては、 次いで、 該 D U S P 1 5遺伝子の発現レベルを測 定する。 ここで 「遺伝子の発現」 には、 転写および翻訳の双方が含まれ る。 遺伝子の発現レベルの測定は、 当業者に公知の方法によって行うこ とができ .。 例えば、 DU S P.I 5遺伝子を発現する細胞から mRNA を常法に従って抽出し、 この mRNA.を铸型としたノーザンハイブリダ ィゼーシヨ ン法または R T— P C R法を実施することによって該遺伝子 の転写レベルの測定を行うことができる。 あるいは、 DU S P 1 5遺伝 子のプロモーター領域を常法に従って単離し、 その下流に標識遺伝子 (例えば、 ルシフェラ一ゼ、 G F P、 ガラク トシダ ゼ等の発光、 .蛍光、 発色など 指標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、 これらに限定され ない） をつなげ、 その標識遺伝子の活性を見ることによつても該遺伝子 の転写レベルの測定を行うことができる。 また,、 DU S P 1 5遺伝子を ,発現する細 からタンパク質画分を回収し、 それぞれ DU S P 1 5タン パク質の発現を S.D S— P AG E等の電気泳動法で検出することにより、 遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。 さらに、 DUS P.1 5 タンパク寳に対する抗体を用いて、 ウエスタンプロッティ ング法を実施 することにより該夕ンパク,:質の発現を検出することにより、 遺伝子の翻. 訳レベルの測定を行うことも可能である。 DU S P 1; 5タンパク質の検 出に用いる抗体としては、 検出可能な抗体であれば、 特に制限はない力 例えばモノクローナル抗体、'.またはポリクローナル抗体の両方を利用す ることができる。
本方法においては、 次いで、 被検化合物を接触させない場合 （コント ロール） と比較:して、 該発現レベルを低下させる化合物を選択する。 こ のようにして選択された化合物は、 がん治療剤のための候補化合物とな る。 .
3. 抗 D U S P 1 5抗体及びこの抗体を含有する治療剤、 複合体およ び組成物
本発明はまた、 抗 DU S P 1 5抗体、 この抗体を含有するがん治療剤 などを提供する。 本発明の 1つの好ましい態様では、 上記がん治療剤は、 がんの標的化療法または標的化薬物送達のために使用される。 3. 1 抗 D U S P 1 5抗体
本明細書中、 「抗 DU S P 1 5抗体.」 には、 DU S P 1.5タンパク質 (その断片 （部分ペプチド） もしぐはその塩を含む） に特異的に結合す る抗体が含まれる。 本発明において使用する抗 DU S P 1 5抗体は、 ポ リクローナル抗体であってもよいし、 モノクローナル抗体であってもよ レ、。 抗体のグラスは、 特に 15良定されず、 I g G、 . I gM、 I gA、 I g
D、 または I g.E等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。 好ましくは、 . I g Gまたは I g Mであり、 精製の容易性等を考慮すると、 より好ましくは Γ g Gである。 また、 ここでい.う 「抗体」 という用語は、 .任意の抗体断片.または誘導体を含む意味で用いられ、 例えば、 F a b、 ノ F a b ' .2、 CD 、 ヒ 卜化抗体、 多機能抗体、 単鎖抗体 （S c F v): などを含む。 本発明の抗体は、 公知の方法で製造することができる。 こ のような抗体の製造法は当該分野で周知である （例えば H a r l o w
E . & L a n e D . . , An t i b o d y, C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8
8) を参照） 。 ■ . '·
( 1 ) 抗原の調製
： . 本発明において、 感作抗原として使用されるタンパク質は、 通常、 D U S P 1 5夕ンパク質またはその塩である。 上記 D U S P 1 5夕ンパク 質には、 その部分ペプチドも含まれ、 ごれは、 限定されることはない力 、、 例えば、 配列番号 2のアミノ酸配列の断片であって、 例えば、 2 0個以 上、 4 個以上、 6 0個以上、 8 0個以上、 1.0 0個以上の、 連続する アミノ酸配列部分を有する部分ペプチドである。 これらの断片として、 例えば、 ァミノ （N) 末端断片やカルボキシ （C) 末端断片が用いられ る。 本発明で用いられる部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1また は 2個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1 〜 6個） ） のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入及びノ又は付加されたも のであってもよい。 ここで用いられる DU S P 1 5タンパク質またはそ の部分ペプチドの塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、.酢酸、 ギ酸、. プロピオン酸) との塩. などが用いられる。 抗体取得の感作抗 0として使甩される本発明の DU S, P"l 5タンパグ質は、.その由来となる動物種に制限されないが哺乳動 物、 例えばマウス、 ヒ ト由来のタン Λ°ク質が好ましく、 特【こヒ 卜由来の タンパク質が好ましい。
( 2 ) D.U S Ρ 1 5夕ンパク質に対するモノクローナル抗体の作製 ( i ) 抗体産生細胞の採取
上記のような DU S P 1 5夕ンパク質、 その部分べプチド又はその塩 (本明細書中、 抗体に関する説明では、 これら まとめて、 「DU S P ,1 5タンパ 質」 という。 ） を抗原.として、 哺乳動物、 例えばラッ ト、 マウス、 ゥサギな.どに投与する。 抗厚の動物 1匹当たりの投与量は、 、ァ ジュバン卜を用いないときは 0. 1〜 1 0 0 m gであり、 ァジュバン卜 を用いるときは 1〜： L .0 0 gである。 アジュバン卜としては、 ブロイ ンド完全アジュバント （F..CA) 、 フロイント不完全アジュバント （F I A) 、 水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。.免疫は、' 主 レて静脈内、 皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。 また、 免疫の'間隔 'は特に限定されず、 数日から数週間間隔、 .好ましくは 2〜 5 週間間隔で、 ：！〜 1 0回、 ：好ましくは 2〜 5回免疫を行う。 そして、 最 終の免疫.日から 1〜 6 0 日後、. 好ましくは 1〜 1 4日後に抗体産生細胞 を採集する。 抗体産生細胞としては、.脾臓細胞、 リンパ節細胞、. 末梢血 細胞等が挙げられるが、 脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
( i i ) 細胞融合
ハイプリ ドーマを得るため、 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞 融合を行う。 抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、 マウス などの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。 使用 する細胞株としては、 薬剤選択性を有し、 未融合の状態では HAT選択 培地 （ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジンを含む） で生存でき ず、 抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが 好ましい。 ミエローマ細胞としては、 例えば X 6 3 A g. 8. 6 5 3、 N S I /.1.— A g 4— 1、 N S.0ゾ 1などのマウ ミエローマ細胞株、. Yg 2ズ 0などのラッ小ミエロ マ細胞株が挙げられる。
に、 上 :記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。 細胞 融合は、 血清を含まない DM EM、 R.PM I — 1 6 40培 ¾などの動物 細胞培養用培地中で、 1 X I .06〜： L X 1 07個 Z.m 1 の抗体産生細胞 と 2 X 1.05：〜 2 X 1 06個 Zm 1 のミエローマ.細胞とを混合し （抗体 産生細胞とミエローマ細胞との細胞比 2 ： 1〜 3 ： 1が好ましい） 、 細 胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。 細胞融合ィ定進剤として、 平 均分子量 1 0 0 0〜 6 0 0 0ダルトンのポリエチレングリコール等を偉 用することができる。 また、 電気刺激 （例えばエレク ト口ポレーショ ン） を禾 li用した市販の細胞融合装置 :を用いて抗体産生細胞とミエ ΰ—,マ 細胞とを融合させることもできる。
( i i i ) ハイプリ ドーマの選別及びクロ一ニング
細胞融合処理後の細胞力）ら.目的とするハイプリ ドーマを選別する。 そ の方法として； 細胞懸濁液を例え【まゥシ胎児 ώ清含有 R ΡΜ I —.1 64 , 0培地などで適当に希釈後、 マイクロ夕イタ一プレート上に 3 X I り 個/ w e l l程度まき、 各ゥエルに.選択培地を加え、 以後適当に選択培 地を交換して培養を行う。 その結果、 選択培地で培養開始後、 1 4曰前 後から生育してくる細胞をハイプリ ドーマとして得ることがでぎる。
次に、 増殖してきたハイプリ ドーマの培養上清中に、 DU S P 1 5夕 . ンパク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。 パイ プリ ドーマのスクリーニングは、 .'通常の方法に従えばよく、 特に限定さ れるものではない。 例えば、 ハイプリ ドーマとして生育したゥエルに含 まれる培養上清の一部を採集し、 酵素免疫測定法、 放射性免疫測定法等 によってスクリーニングすることができる。 融合細胞のクローニングは、 限界希釈法等により行う。 そして、 最終的に、 DU S P 1 5タンパク質 と反応するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリ ドーマを 樹立する。
( i V ) モノクローナル抗体の採取 上記のようにして得たハイブリ ドーマからモノクローナル抗体を採取 する方法として、 通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用する.ことが できる。 細胞培養法においては、 ハイプリ ドーマを 1 0 %ゥシ胎児血清 含有 R PM I — 1 6 40培地、 M E V [培地又は無血清培地等の動物細胞 培養培地中で、 通常の培養条件 （例えば 3.7で、 5 % C〇2濃度） で . 7〜； 1 4日間培養し、 その培養上清から抗体を取得する。 腹水形成法の 場合は、 エローマ細胞由来の哺乳動物ど同種系動物の腹腔内にハイブ リ ドーマを約 1 X 1 07個投与し、 ハイブリ ドーマを大量に増殖させる。 そして、 .:！〜 2週間後に腹水を採取する。. 上記,抗体の採取方去において 抗体の精製が必要とざれる場合は、 硫安塩析法、 イオン交換クロマトグ ラフィ一.、 ゲル濾.過、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどの公知の 方法を適宜選択して、 又はこれらを組み合わせることにより精製するこ 'とができる。：
( 3) DU S P 1 5タンパケ貲に対するポリクローナル抗体の作製 まず、 上記した抗原を哺乳動物、 例えばラッ 卜、 マウス、 ゥサギなど に投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量は、 アジュバントを用いな . いときは 0. ：!〜 1 0 0 m gであり.、 アジュ'バントを用いるときは 1 0 〜 1 0 0 0 gである。 'アジュバントとしては、 フロイン卜完全アジュ ノ ン ト （F C A) 、 フロイ ン ト不完全アジュバン ト ( F I A ) 、 水酸化 アルミニウムァ,ジュバント等が挙げられる。 免疫は、 '主として静脈内、 皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。 また、 免疫の間隔は '特に限定されず、 数日から数週間間隔、 好ましくは 2〜 5週間間隔で、 1〜1 0回、 好ましくは 2〜 5回免疫を行う。 そして、 最終の免疫日か ら 6〜 6 0 日後に、 酵素免疫測定法 （E L I S A ( e n z ume— 1 1 n k e d i mmu n o s o r b e n t a s s y) 又は E I A ( e n z y m e i mm u n o a s s a y ) ) 、 放射性免疫測定法 （R I A ； r a d i o i mm u n o a s s a y) 等で抗体価を測定し、 最大 の抗体価を示した日に採血し、 抗血清を得る。
次いで、 例えば、 抗血清中のポリクローナル抗体を、 DU S P 1 5夕 ンパク貧で.固定されたァフィ二ティ一カラムにかけて DU S P 1 5タン パク.賁と反応する抗体 （カラム吸着 0分） を採取する。 DU S P 1 5夕 ンパク質に対する'抗血清中のポリクローナル抗体の反^性は、 E L I S A.法などで測定することができる。. . ：
(4) 抗体の断片など
F a bまたは F a b ' 2断片は、 従来の方法に,よるプロテアーゼ' （例 えば、' ペプシンまだはパパイン） を用いだ消化により作製することがで きる。 ヒ ト化抗体は、 例えば R i e c h m a n nら （ R i e c h m a n n J M o 1 B i o l . O c t 5 ; 2 0 3 ;( 3 ) ： 8 2 5— 8 , 1 9 8 8 ) 、' および J o n e s ら ( J ひ n e s ら N a t u r e .3 2 1 : 5 2.2— 5 2.5， 1 9 8 6 ) に記載のような方法の 1うにより調製 することができる。. .
' また、 キメラ抗体は、 例えば、 「実験医学 （臨時増刊号） 、 V o し 1. 6 , N o. 1 0 , 1 9: 8.8」 、 特公平 3— 7 3 2 8 0号公報等を、 ヒ ト化抗体は、 例えば、 「N a t u r e G e n e, t i c s； V o l .
1 5 , ." p , 1 4 6 - 1 5 6 , 1 9 9 7」 ■、 「 N a t u r e G e n e t ..
1 c s , V o l . 7， p . 1 3— 2 1 , 1 9' 9 4」 、 .特表平 4— 5 04 .3 6 5号公報、 国際出願公開 WO 9 4 · 2 5 5 8 δ号公報等、 「'日経サ ィエンス、 6月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年」 、 「N a t u r e， V o l . 3 6 8 , ρ · 8 5 6— 8 5 9 , 1 9 9 4」 、 ·特表平 6— 5 0 0 、
2 3 3号公報等を参考にそれぞれ製^することができる。 本発明の DU S P 1 ,5タンパク質に結合する抗体は、 例えば、 癌細胞の増殖もしくは 転移の抑制等を目的とした使用が考えられる。 得られた抗体を人体に投 与する目的 （抗体治療） で使用する場合には、 免疫原性を低下させるた め、 ヒ ト抗体やヒ ト型抗体が好ましい。
抗体は、 診断剤として用いる場合は、 モニタリング等のための標識物 質 （例えば、 放射性同位元素、 蛍光物質など） で標識されていてもょレ 必要に応じて、 放射性物質、 蛍光化合物などにより標識することができ る。 最も慣用の蛍光標識化合物の中には、 フルォレセインイソチオシァ ネー卜'、 ローダミン、 フィコエリ小リンおよびフルォレス力ミンがある。 同様に、 生体発光性化合物を用いて、...抗体 DU S P 1 5抗体を標識する こともできる。 生体発光性タンパク質の存在は、 蛍光の存在を検出する ことによって測定される。 この標識目的に重要な生体発光性化合物は、 ルシフェリ ン、 ルシフェラーゼおよびイエクオリンである。
なお.、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する DU S P 1 5夕シパク質等を特異的に検出するために使用することができる。 また、 DU S P 1 5夕ンパク質等を精製するために使用する抗体カラム の作製、 精製時の各分画中の DU S P 1 5タンパク質等の検出、 被検細 胞内における DU S P 1 5夕ンパグ質の挙動の分析などのために使用す ■ることができる。 ，
3. 2 DUS P 1 5抗体を含有する複合体など
また、 本発明において使用する抗 DU S P 1 5抗体は、 本発明の治療 剤または診断剤において、 それ自体が.、 抗原の活性を減弱させるような. 中和活性を有する薬剤 （ a g e n t ) であり得るが、 必要に応じて、 治 療効果を奏するための他の薬剤と組み合わせて用いることができる。 し たがって、 本発明は、 もう一つの態様において、 がん （例えば:、 大腸が ん） の標的化療法または標的化イメージング等に使用するための、 抗 D U P 1 5抗体:と他の薬剤との複合体、 そのような複合体を含有する組 ' 成物などをも提供する。 このような態様によれば、 本発明において使用 'する抗 DU S P 1 5抗体を用いて、 治療効果を奏する他の薬剤または診 断のための標識剤などを、 DU S P 1 5タンパク質を高発現する標的部 位へ送達することができる。
本発明において用いられる 「その他の薬剤」 としては、 例えば、 放射 性同位元素、 治療タンパク質、 または低分子の薬剤など、 標的への遺伝 子導入のためのウィルスベクターもしくは非ウィルスベクターなどが例 示される。
本発明において、 「放射性同位元素」 の例としては、 フッ素一 1 8、 ヨウ素— 1 2 5 (1 2 Ι ) 、 およびヨウ素— 1 3 1などの放射性ハロゲ ン元素が挙げられる。 これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属 元素と同様 :に抗体やペプチドに標識して、 放射性治治療剤あるいは放射 性診断剤として広ぐ利用し得る。 例えば、 1 2 5 I.または1 3 1 Iでのョー ド化ま、 クロラミン Τ法等の公知の方法により、 抗体または抗体断片に 結合させることができる。 さらに、 診断用としてはテクネチウム 9 9 m、 インジウム— 1 1 1およびガリウム一 6 7 ( 6 7 G a) など、 また 治療用としてはイッ トリウム一 9 0 ( 9 0 Y) 、 レニウム— 1 8 6 (- 1 8 6 R e ) またはレニウム一 1 8 8. ( 1 88 R e ) どが使用され得る。 放 射性同位元 を用いて'抗体に標識する場合には、 通常、 金属キレート剤 が用いられる。 金.属キレート剤としては、 E D T A、 D T P A、 ジアミ ノジチォ化合物、 サイクラム、 および DOT Aなどが知られている.。. こ れらのキレ一ト剤は抗体に予め結合しておき、 その後放射性金属で標識 する場合と、 放射性金属ギレ一卜を形成後、 抗体に結合して標識する方 法がある。 . ；
本発明において、 「治療タンパク質」 の例としては、 免疫を担う細胞 を活性化するサイ トカインが好適であり、 例えば、 ヒ ドインターロイキ ン 2、 ヒ ト頼粒球一マクロファージ一コロニー刺激因子、 ヒ トマクロフ ァージコロニー刺激因子、 ヒトインターロイキン 1 2等が挙げられる。 また、 大腸がん細胞を直接殺傷するため、 リシンやジフテリア毒素など の毒素を用いることができる。 例えば、 治療タンパク質との融合抗体に ついては、 抗体または抗体断片をコードする c DNAに治療タンパク質 をコードする c DN Aを連結させ、 融合抗体をコードする DN Aを構築 し、 この DN Aを原核生物または真核生物用の発現べクタ一に挿入し、 この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現 させ、 融合抗体を製造することができる。
「低分子の薬剤」 は、 本明細書中で 「放射性同位元素」 や 「治療タン パク質」 等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いら れる。 「低分子の薬剤」 の例としては、 ナイ トロジェン ' マスタード、 サイクロフ.ァスフアミ ドなどの.アルキル化剤、 5—フルォロウラシル、 メソ トレキセートなどの代謝拮抗剤、...ダウノマイシン、 ブレオマイシン、 マイ トマイシン C，. ダウノルビシン、 ドキソルビシンなどの抗生物質、 ビンクリスチン、 ビンブラスチン、 ビンデシンのような植物アル力ロイ ド、. 夕モキシフェン、 デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤 （臨 . 床腫瘍学 （日本臨床腫瘍研究会編 1 9 9 6年 癌と化学療法社）.） 、 またはハイ ド口コーチゾン、. プレドニゾンなどのステロイ ド剤、 7スピ リン、 インドメ夕シンなどの非ステロイ ド剤、 金チォマレート、 ぺニシ ラミンなどの免疫調節剤、 サイクロフォスフア .ド、 ァザチォプリンな どの免疫抑制剤.、 マレイン酸クロルフエ二ラミン、 クレマシチンのよう ' な抗ヒスタミン剤,等の抗炎症剤 （炎症と抗炎症療法 昭和 5 7年 医歯 薬出版株式会社） などがあげられる。 例えば、 ダウ マイシンと抗体を 結合させる方法としては、 ダルタールアルデヒ ドを介してダウノマイシ ンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、 水溶性カルポジイミ ドを介し てダウノマイシンのアミノ基と抗体の.カルボキシル基を結合させる方法 等があげられる。 . -
「ウィルスベクタ一」 の例として.は、 本発明の抗 D.U S P 1 5抗体に 結合し得るように改変されたウィルスベクタ一が使用し得る （例えば、 アデノウィルスベクタ一 （W a n g , P . ， e t a 1 . ( 1 9 9 5 ) S oma t i e C e 1 1 a n d M o l e'c . G e n e t . ' 2 1， 4 2 9— 44 1 ) 、 レトロウィルスベクター （N a v i a u x R. K. , e t . a 1 . .( 1 9 9 6 ) J . V i r o l 7 0， 5 7 0 1 - 5 7 0 5 ) 、 レンチウィルスベクタ一 （N a l d i n i , L . ( 1 9 9 8 ) C u r r . O p i n . B i o t e c h n o 1 . 9， 4 5 7 - 4 6 3 ) などが挙げられる） 。 このようなウィルスべク 夕一には、 細胞増殖関連遺伝子、 アポトーシス関連遺伝子、 免疫制御遺 伝子等の、 標的部位 （例えば、 大腸がん） において、 例えば、 癌細胞の アポ卜一シスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子 （治療遺伝子） が組み込まれる。 抗 D U S P 1 5抗体に結合するウィルスベクターは、 抗 D U S P 1 5抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場 合、.抗 D U S P 1 5抗体が認識する抗原 （すなわち、 D U S P 1 .5 ) が 存在する部位に標的化することができる。
抗 D U S P 1 5抗体と上記他の薬剤とは、 化学的または遺伝子工学的. に結合され得る。 ここで、 「化学的な結合」 には、 .ィすン結合、 水素結 . 合、 共有結合、 分子間力による結合、 疎水性相互作用による結合などが , 含まれるものとし、 「遺伝子工学的な結合」 には、 例えば、.抗体と治療 タンパク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用い て作製した場合の、 抗体と洽療タンパク質とめ.間の結合様式などが含ま れるものとする。
4 . 製剤化および製剤の投与方法
本発明の S P 1 5遺伝子の発現 IS害物質を含有するがん治療剤、 D U S P 1 5夕ンパク質 活性阻害物質を含有するがん治療剤、 本発明, の抗 D U S P 1 5抗体を含有する治療剤、 または本発明において使用す . る抗 Dひ S P 1 5抗体が、 放射性同位元素、.治療タンパク質、 低分子の 薬剤、 および治療遺伝子を担持した.ウィルス 'ベクターもしくは非ウィル スベクターのうちのいずれか、 またはこれらの任意の組み合わ,せと化学 的または遺伝子工学的に結合されている治療剤は、 公知の芋法に基づい て製剤化するこ.とができる。
本発明の治^剤の製剤化にあたっては、 常法に従い、.必要に応じて.薬 学的に許容される担体を添加することができる。 例えば、 界面活性剤、 賦形剤、 着色料、 着香料、 保存料、 安定剤、 緩衝剤、 懸濁剤、 等張化剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 流動性促進剤、 矯味剤等が挙げられるが、 こ れらに制限されず、 その他常用の担体を適宜使用することができる。 具 体的には、 軽質無水ケィ酸、 乳糖、 結晶セルロース、 マンニトール、 デ ンプン、 カルメロ一スカルシウム、 カルメロースナトリウム、 ヒ ドロキ シプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルメチルセルロース、 ポリ ビ 二ルァセ夕一ルジェチルァミノアセテー ト、 ポリビニルピロリ ドン、 ゼ ラチン： 中鎖脂肪酸トリグリセ.ライ ド、 ポリォキシエチレン硬化ヒマシ 油 6 0、 白糖、 カルボキシメチルセルロース、 コーンスターチ、 無機塩 類等を挙げ :ることができる。
本発明の治療剤の剤型の種類としては、 例えば、 経口剤どして錠剤、 . 粉末剤、 丸剤、 散剤、 顆粒剤、 細粒剤、 軟 ，硬カプセル剤、 フィルムコ —ティ ング剤、 ペレツ 卜剤、 舌下剤、 ペース ト剤等、 '非経口剤として注 射剤、 坐剤、 経皮剤、 軟膏剤、 硬膏剤、 外用液剤等が挙げられ、 当業者 においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができ る。 有効成分としての D U S P 1.5タンパク質の活性 （または DU S P 1 5遺伝子の発現） 阻害物質は、 製剤中 0. 1から 9 9. 9重量％含有 することができる,。
本発明の薬剤の有効成分の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、. 投 与方法などにより差はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 患者 (6 0 k gとして） に対し,て一日につき約 0. l mg〜 l , 0 0 0 mg、 好ましくは約 1. 0〜： I 0 0 m g、 より好ましくは約 1. 0〜 5 0mg である。 非経口的に投与する場合は、 その一回投与量は投与対象、 対象 臓器、 症状、 投与方法などによって.も異なる.が、 えば、 注射剤の形で は通常例えば、 患者 （6 0 k gに対して） 、 一日につき約 0. 0 1から 3 0mg程度、 好ましくは約 0. 1から 2 0mg程度、 より好ましくは 約 0. 1〜： 1 O mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 しかしながら、 最終的には、 剤型の種類、 投与方法、 患者の年齢や体重、 患者の症状等を考慮.レて、 医師まだは獣医師の判断により適宜決定する ことができる。
このようにして得られる製剤は、 例えば、 ヒ トやその他の哺乳動物 (例えば、 ラッ 卜、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。 ヒ ト以外の動物の場合も、 上記の 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
本発明の治療剤は、 がん （例えば、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳が ん、 前立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱がん、 .子宮がん （例 ： 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状 腺がん、 膝臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、. 血液腫瘍など） の予防 ' 治療、 好ましくは'、 大腸がんの予防 ' 治療に用いられる。
本発明の薬剤は、 D U S P 1 5タンパク質の活性阻害物寳または D U . S 1 5遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有しているため、 抗 癌剤、 癌.転移阻害剤、 癌細胞のアポトーシス誘導剤等として使用し得る。 対象となる細胞、 組織、 臓器、 または癌の種類は特定のものに限定され ない。 また、 本発明の薬剤は、 D U S P 1 5タンパク貧の活性阻害物質 および D y S P 1 5遺伝子の発現阻害物質の両方を含んでいても良い。 本発明の治療.剤において、 アンチセンス核酸を用いる場合、 該アンチ センス核酸を単独あるいはレトロウィルスベクター、 アデノウイルスべ クタ一、 アデノウイルスァソシエーテツ ドウィルスベクタ一などの適当 'なベクターに挿入した後、 公知の手段に従って投与することができる。 アンチセンス核酸は、 単 で、 あるいは生理学的に認められる担体とと もに製剤化し、 遺伝子銃やハイ ド口ゲルカテーテル.のようなカテーテル によって投与することができる。
また、 本発明において組換えアデノウイルス粒子のようなウィルスべ クタ一と抗 D U S P 1 δ抗体との組み合わせを癌治療のために使用する 場合は、 これら単独で使用してもよいが、 一般には製薬的に許容できる 担体.と共に使用される。 そのような担体としては、 既に上記レたような 担体、 ならびに水、 生理食塩水、 グルコース、 ヒ トアルブミン等の水性 等張溶液が好ましい。 更に、 製薬的に通常使用される添加剤、 保存剤、 防腐剤、 衡量等を添加することもできる。 そのように調製した医薬組成 物は、 治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、 投与経路によって投 与することができる。 投与形態としては、 例えば、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル、 錠剤、 顆粒剤、 注射剤、 軟膏等が挙げられる。 本発明の抗 D U S Ρ 1 5抗体一ウィルスベクタ一粒子またはこれを含む医薬組成物を 治療のために投与する場合は、 通常成人一人当たり 1回に 1 0 3〜 1 0 1 5個のウィルス粒子を投与するのが好ましいが、 疾病の状態や標的細 胞 ， 組^の性質によって変更してよい。 投与回数は、 1 日 1回〜数回で よく.、 投与期間は 1 日〜数ケ月以上にわたってもよく、 1〜数回の投入 を 1セッ 卜として、. 長期にわたって断続的に多数セッ トを投与してもよ い.。 また、 本発明において使用されるウィルスベクター粒子またはウイ ルスベクター核酸分子は、 特定の細胞および Zまたは組織の検出、 また は疾病状態の診断に使用することができる。 例えば、 .ウィルスべグ夕ー , の核酸分子に検.出可能なマーカー遺伝子を組込み、 これを適切な宿主細 胞にトランスフエクシヨ ンして得られたウィルスベクター粒子は、 抗 D ' U S P 1 5抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用する ことができる。 あるいは、 抗 DU S.P 1 5抗体に検出可能な標識を結合 させて腫瘍細胞を揆出診断するために使用することができる。
5. がんの診断剤及び診断方法
本発明はまた、 がんの診,断剤を提供する。 1つの好ましい態様におレ^ て、 本発明のがんの診断剤は、 （ a ) DU S P 1 5タンパク質に対する 抗体、 :又は (b) DUS P 1 5遺伝子またはその一部の塩基配列にス卜 リンジェン卜なハイブリダイゼーション条件下でハイ,ブリダイズ可能な 塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。 5. 1 抗 DUS P 1 5抗体を用いる診断剤及び診断方法
DU S P 1 5タンパク質に対する抗体は、. DU S P 1 5タンパク質等 特異的に認識することができる.ので、 被検液中の DU S P 1 5タンパ ク質を定量することができる。 具体的には、 本発明の抗 DU S P 1 5抗 体を用いる診断方法は、 例えば、 （ a) 被験者由来の生体試料と、 DU S P 1 5タンパク質に対する抗体とを接触させる工程、 および （b) 前 記試料中での前記抗体と、 DU S P 1 5タンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩との結合を検出および Zまたは定量する工程を包含 する。 好ましくは、 上記検出および または定量する工程において、 標 識された抗 DU S P 1 5抗体を用いて、 DU S P 1 5タンパク質または その断片と抗 D U S P 1 δ抗体との結合が検出および/または定量され る。:' "
本明細書中、. 「被験 由来の生体試料」 は、 被験者由来の組織、 細胞、 または体液 （例えば、 血液 （全血、 血漿、 血清等を含む） 、 尿、 リンパ 液、 唾液、 汗、 精液等） を含む。 また、 「被験者」 .は、 通常、 がん検診 を受ける.、 または受けることが望まれるヒ ト被験体であり、 がんに罹患 しているか、 または罹患していると疑われるヒ ト被験体等が含まれる。 このようながんの例としては、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳がん、 前 立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 .胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱が ん、 子宮がん （例 ： 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状腺がん、 膝臓がん.、 卵巣が.ん、 脳腫瘍、 血液.腫瘍などが含まれるが、 とりわけ、 大腸がんが好ましい。
上記のような被験者由来の生体試料における D U S Ρ 1 5の発現を検 出するための免疫測定は、 ：がん （例えば、 大腸がん） を有すると疑われ るか、 がんの危険性を有する被験体から採取した生体試料を、 特異的抗 . 原-抗体結合を生じさせる条件下で抗 D U S Ρ 1 5抗体と接触させ、 次 いで、 抗体による免疫特異的結合量を測定することを包含する。 このよ うな抗体の結合を使用して、 D U S Ρ 1 5タンパク質の存在および ま たは増大した発現が検出される。 この場合、 増大した D U S Ρ 1 5タン パク質発現の検出が疾病状態の指標となる。 必要に応じて、 生体試料中 . の D U S Ρ 1 5タンパク質のレベルを、 がんを有しない健常者のレベル と比較してもよい。 . . '
上記免疫測定法の 1つの態様では、 例えば、 血清試料などの生体試料 を、 試料中に存在する全部のタンパク質を固定する目的で、 ニトロセル ロースなどの固相支持体または担体と接触させる。 次いで、 この支持体 を緩衝液で洗浄し、 続いて検出可能に標識した抗 D U S P 1 5抗体によ り処理する。 次いで、 この固相支持体を緩衝液で 2回洗浄し、 未結合抗 体を除去する。 固相支持体上の結合した抗体の量を、 周知の方法に従つ て測定する。 各測定に適する検出条件は、 慣用的な試験方法を使用して 当業者〖こよ り適宜決定され得る。
抗, DU S P 1 5抗体を検出可能に 識する方法め 1つにおいて、 当該 抗体を、 酵素； 例えば、 酵素ィムノアッセィ （E I A) に使用されるも の：のような酵素に結合させる [V o i 1 e r , A. による 「酵素標識し た免疫吸着ァッセィ」 （ "T h e E n z yme L i n k e d I m m u n o s o r b e n t A s s a y) (E L I S A). , 1 9 7 8,; D i a g n o s t i c H o r i z o n s , 2 :.1〜 7， M i c r o b i o l o g i c a l A s s o c i a t e s Q u a r t e r l y P u b 1 i c a t i o n , W a 1 k e r s v i 1 1 ' e .. M D ; V o i 1 e r , A. による J '· C I i n . P a t h o l . , 3 1 ： 5 0 7〜 5 2 0 : 1 9 7 8 : B u t i e r , J . E . による M e t h . E n z y m o 1 . ; 7 3 : 48 2〜 5 2 3 , 1 9 8 1〗 。 抗体に結合する酵素を、 例えば分 光光度測定により、 可視手段による蛍光測定により検出することができ る化学分子が生成されるような方法で、 適当な基質、 好ましくは色素原 性基質と反応させる。 抗体に検出可能な標識を付けるために使用するこ とができる酵素は、 ペルォキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼ を包含するが、 これらに限定されない。 この'検出はまた、 酵素に対する 色素原性基質を用いる比色法により達成することができる。
その他の本発明において使用し得る方法としては.、 ラジオィムソアツ セィ （R I A) 、 サンドイッチ免疫測定法、 ィムノメ トリック法、 ネフ ロメ トリー、 蛍光免疫測定法 （F I A) 、 '時間分解蛍光免疫測定法 （T R F I A) 、 酵素免疫測定法 （E I A) 、 発光免疫測定法 （丄 I A) 、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A) 、 ラテックス凝集法、 免疫沈降 アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝 集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロティン A免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法な どが挙げられる （WO 0 0 / 1 42 2 7号公報第 3 9頁第 2 5行〜第 4 2頁第 8行、 E P 1 1 1 1 0 4 7 A 2号公報段落 [ 0 1 1 5 ] 第 1 9頁 第 3 5行〜第 2 0頁第 4 7行など参照） 。 以上のように、 本発明の抗体.を用いる、 生体内での D U S P 1 5タン パク質の定量法を利用することにより..、 DU S P Γ 5夕ンパク質の機能 不全に関連する各'種疾患の診断をすることができる。 例えぱ、 DU S P 1.5タンパク質の濃度増加が検出された場合は、 例えば、 DU S P 1 5 ' タンパク質の過剰発現に起因する疾患 （例えば、 がん （例 ： 大腸が ん） ） である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断する ことができる。 .
なお、 本発明の抗 DU S P 1 5抗体は、 i n v i V oでの診断に用 いることもできる。 ここで使用し得る抗体調製,物の調製および使用方法 は当該分野でよく知られている。 例えば、 抗体—キレート剤について、 N u c 1 , M e d . B i o l . 1 9 9 0 1 7 ： 24 7 - 2 54 に記載されている。 また、 磁気共鳴イメージングで用いる標識とレての 常磁性イオンを有する抗体については、 例えば、 M a g n e t i c' R e s o n a n c e i n M e d i c i n e 1 9 9 1 2 2 ： 3 3 9 — 34 2に記載されている。
5. 2 ポリヌクレオチド (例えば、 DNA) プローブを用いる診 断剤及び診断方法
本発明の診断方法にお ては、 DU S P 1 5遺伝子の塩基配列に基づ いて設計されるプローブ又はプライマーを用いるこどができる。 具体的 には、 そのような診断方法は、 例えば、 （a) 被験者由来の生体試料と、 DU S尸 1 5遺伝子またはその断片の塩基配列にス十リンジ工ン卜なハ ィプリダイゼーシヨ ン条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列からなる ポリヌクレオチド （プローブ） とを接触させる工程、 および （b) 前記 試料中での前記ポリヌクレオチドと、 DU S P 1 5遺伝子またはその断 片とのハイプリダイゼーシヨンを検出および Zまたは定量する工程を包 含する。
上記本発明の方法では、 被験者由来の生体試料中の D U S P 1 5遺伝 子の DNA (またはその遺伝子断片） を、 上記プローブを使用して検出 および/または定量する。 プローブとして用いる塩基配列の長さは、 例 えば、 1 2塩基以上、 1 5塩基以上、 .1 8塩基以上、 2 1塩基以上、 2 4塩基以上、 2 7塩基以上、 3 0塩基以上、 またはさらに長い長さのポ. リヌクレオチド断片であり得る。 ハイプリダイゼーションには、 上記し た低、 屮又は高ス トリンジェン卜な条件を使用し得る。 なお、 本明細書 中、 「DU S P 1 5遺伝子またはその断片め塩基.配列にス トリンジエン 卜なハイブリダィゼーション条件下でハイブリダィズ可能な塩基配列」 には、 DU S P 1 5遺伝子またはその断片の塩基配列に相補的な塩基配 列 （アンチセンスポリヌクレオチド） も含まれ： δものとする。 プローブ および核酸.のハイブリダィゼーショ,ンの方法は当業者に知られており、 例えば国際公開公 第 8 9 / 0 6 6 9 8号、 Ε Ρ— A 0 2 0 0 3 6 2、 米国特許第 2 9 1 5， 0 8 2号、 E P— A 0 0 6 3 8 7 9、. E P.— A
0 1 7 3 2 5 1、 E P— A 0 1 2 8 0 1 8に記載されている。
本発明の診断方法においては、 D U S P 1 5遺伝子に対する特異的ポ リヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて、；公知の手法を用い て標的配列を検出または定量することができる。 そのような公知の手法 として、 例えば、 サザンハイプリダィゼーシ.'ヨ ン、 ノ一ザンハイブリダ ィゼ一ション、 RT— P C R法、 P C R ^ S S C P法 （G e n om i c s , 第 5.卷， 8 7 4〜 8 7 9頁 （ 1 9 8 9年） ）.、 P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o ή a 1 A c a d e m y o f S c
1 e n c e s ό f t h e Un i t e d S t a t e s o f A m e r i c a， 第 8.6巻， 2 7 6, &〜 2 7 7 0頁 （ 1 9 8 9年） ） 、 F I S H法、 DNAチップあるいはアレイ C GH (C o m p a r a t i v e G e n om i c Hy b r i d i z a t i o n ) 法などを用レ るこ とができる。 定量的な検出は、 定量 RT— P C Rによって実施可能であ る。
アレイ C GH法は、 染色体 C GH法 （K a l l i o n i e m i , A. e t a 1 . ( 1 9 9 2 ) S c i e n c e 2 5 8 , 8 1 8 - 8 2 1 ) を応用した方法で、 スライ ド上に染色体領域をカバーするゲノム D NA断片 （BAC， PAC, YACなど） を高密虔にスポッ トした D N Aチ,ップを用いて、 別々の色素で標識したがん由来 DNAと正常 DNA を、 スライ ド上の'ゲノム D A断片に対して同時にハイブリダイゼーシ ヨンを行い、 その結合状態を検出することにより、 がんにおける DNA . コピー数異常を高解像度に検出する方法である （P n k e l ， D . e t. a に （ 1 9 9 8 ) N a t . G e n e t . 2 0 , 2 0 7 - 2 1 1 ) 。
なお、 本発明においては、 DU S P 1 5遺伝子の発^が上方制御され るか否かを検出するために、 胞の DU S P 1 5の mR 1ST Aレベルを標 準遺伝子 '（'ハウスキーピング遺伝子 (例えば、 S h a p e r , N. L . ら、 J . M a mm a r y 1 a n d B i o.l . N e o 1 a s i a 3 ( 1 9 9 8 ) 3 1 δ - 3 2 4 ; Wu , Y. Y. および R e e s , J . L . , A c t a D e r m.. V e n e r e o 1 . ' 8 0 ( 2 0 0 0 ) 2— 3 ) の rnRNAレベルと、 好ましくは RT— P C Rに よって比較することもできる。 . ； ' 上記のような手法によって標的配列 （DNA、 mR NAなど） を検 出 - 定量し、 DU S P 1 5遺伝子の発現過多が確認された場合は、 例え ば、 DUS P 1 5の過剰発現に起因する疾患 （例えば、 がん （、例 ： 大腸 がん） ） である可能性が高い、 あるいは将来罹患する可能性が高いと診 断することができる。'
5. 3 質量分析装置を用いる診断方法
本発明の診断方法の別の実施形態では、 被検試料中の標的タンパク質 またはその断片の存在を、 質量分析装置 （MS) を用いて同定すること ができる。 すなわち、 質量分析装置を用いることによって、 標的タンパ ク質またはその断片のアミノ酸配列の決定を行うことができ、 被験者由 来の生体試料中に DU S P 1 5タンパク質が存在するか否かを判定する ことができる。 質量分析法は、 M Sを用いてタンパク質やペプチドのよ うな試料をイオン化し、 得られた質量ノ電荷 （mZ z ) に従って分離し、 その強度を測定することにより.、 試料の質量を決定する方法である。 そ の質量分析の結果から、 タンパク質やべプチドのァミノ酸配列を構成す る個々のアミソ酸'を同定することができる。
イオン化には、 マトリクスアシステッ ドレーザーデソ一プシヨンィォ ン化法 （MAL D I ) 、 エレク トロスプレーイオン化法 （E S I ) 、 気 相法 （E I， C I ) 、 電界脱離 （F D) 法など種々の方法が使用され得 る。 ィォジ分離には、 イオン化法と相性のよいイオン分離法が用いられ、 例えば、 MAL D I の場合には、 飛行時間型 （ t i me o f f 1 i g h t : T O F ) 質量分析計.、 E. S Iの場合には.、： 四重極型 （QM S ) 、 イオントラップ型、 磁場型などの質量分析計がそれぞれ用いられる。 質 量分析装置は、 夕,ンデムで用いられることもある。 例えば、 L C一 E S I M S/MS、 Q - T O F MS、 MALD I — TO F M S等が挙 げられる。 なお、 その他のアミノ酸配列決定法、 例えば、 シークェンサ 一 （例 ： 気相シークェンサ一） によるアミノ酸配列決定法が利用されて もよレ ■；
5. 4 診断用キッ卜
, 本発明はまた、 抗 DU S P 1 5抗体を含有する、 被験者の体液試料中 の DU S P 1 5タンパク質またはその断片をがんマーカーとして検出お よび Zまたは定,量するためのキッ トを提供する。 さらに、 DU S P 1 5 遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリンジェン卜なハイプリダイゼ ——ンョン条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列を.含有する、 被験者由 来の生体試料中の DU S P 1 δ遺伝子またはその断片をがんマーカーと して検出およびノまたは定量するためのキッ トをも提供する。 これらの キッ トは、 上述の免疫学的手法またはハイブリダィゼ一シヨン法等によ り、 がんマーカ一を検出するために用いられる。 このようながんとして は、 例えば、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳がん、 前立腺がん、 食道が ん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱がん、 子宮がん (例 ： 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状腺がん、 陴臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍な.どが含まれるが、 とりわけ、 大腸がんが 好ましい。
本明細書中、 「'がんマーカー」 とは、 被験者の体液 （例えば、 血液、 尿、 リンパ液、 唾液、 汗、 精液等） または細胞もしくは組織中における、 正常羝織に由来していないか、 あるいはがん細胞または組織において選 択的に発現の亢進している分子のこどをいい、 被験者の体液または細胞 もしくは組織中.における当該分子の存在ががんの存在を示すかまたは示 唆するものをいう。
上記第一の態様のキッ トは、 被験者からの体液試料中の D U S P 1 5 抗原 （D U' S P .1 5タンパク質およ.びその部分ペプチドを含む） を検出 および または定量する成分を含有する。 例えば、 D U S P 1 5タンパ ク質が E L I S Aで検出および または定量される 合、 このような成 分は、 例えば、 .組織切片、 または血液や尿のような体液試料中の D' U S P 1 5のレベルを.検出および/または定量するために使用され得る。 こ のよう.な抗体は放射能、 蛍光、 比色、 または酵素標識で標識されていて . もよい。 本発明のキッ トは、 標識された二次抗体を含有していてもよレ 。 上記第二の態様のキッ 卜は、 D U S P 1 5 '遺伝子またはその一部の塩 基配列にス トリンジェン卜なハイプリダイゼーショ ン条件下でハイプリ ダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。 例えば、 本発明のキッ ト.は、 D N Aチップ上に固定された上記ポリヌクレオチド を含有し得る。
本発明のキッ トは、. 抗 D U S P' 1 5抗体、 D U S P 1 5遺伝子または その一部の塩基配列にス トリンジェン卜なハイプリダイゼーショ ン条件 下でハイプリダイズ可能な塩基配列等の他に、 容器およびラベルを含ん でいてもよい。 容器上のまたは容器に伴うラベルには、 薬剤が大腸がん マーカ一の検出に使用されることが示されていてもよい。 また、 他のァ ィテム、 例えば、 使用説明書等がさらに含まれていてもよい。
以下、 本発明を実施例を用いてより具体的に説明するが、 本発明の範 囲は、 これらの実施例によって限定されない。 実施例
実施例 1 ： アレイ' C GH法による大腸がん特異的増幅遺伝子の同定
本実施例では、 大腸がん特異的な遺 {云子増幅領域を特定するために、 大腸がん検体 2 0 0症例のサンプル調製およびァレイ C GH法に基づく 検証を実施した。
その結果、. 大腸がん検体において高頻度に増幅が起きている領域の内、 公共 D Bでの遺伝子情報 （N C B I ： h t t p ： ZZwww. n c b i . n 1 m. n i h . g o v/) を利用し、 精査し 結果、 使用した B AC C 1 o n e . R. P 1 1— 2 4 3 J 1 6に位置している、 D U S P 1 5 (D u a l s p e c i f i c i t y ' p h o s p li a 1; a 's e l i. k e 1 5 ) (N C B I A c c e s s i o n N o. ..: NM_ 0.8 0 '6 1 1 ) '遺伝子が大腸がん患者において高頻度で高値であることを見出 した （図 1 , 表 2 ) 。 図 1.は、 DU S P 1 5遺伝子の大腸がん患者 2 0 0検体での増幅度に対する頻度を示すヒス トグラム ある。 また、 下記 の表 2.は、 D U S P 1 5遺伝子の大腸がん患者 2 0 0検体での増幅度 (GZR値） および頻度を示す。 平均値は、 .'GZR値が 1. 2以上の検 体での平均値を示している。
表 2に示されるように、' D U S P 1 5遺伝子は、 2 0 0検体の大腸が ん患者の 5 6. 0 %において増幅が認められ、 その増幅度の平均値は、 1. 7であった。 最大値は 2. 4であり、 非常に高頻度で顕著な増幅が 起こつていた。 ..
(表 2 )
Figure imgf000044_0001
実施例 2 ： 大腸由来培養細胞株での遺伝子増幅度 検証 本実^例では、 大腸がん患者において高頻度で高値な遺伝子領域につ いて、 大腸がん由来培養細胞株での増幅度を検証した。
,くサンプル調製〉
培養細胞株は、 大腸がん由来の細胞株である C a c o 2および R KO. E 6を使用した。 培養細胞より B 1 o o d & C e l l C u 1 t u r e D.NA K i t (Q I AGEN) を使用して、 キッ ト添付のプロ トコ一ル 従い、 ゲノム DN Aを抽出した。
くアレイ C GH〉
遺伝子領域の増幅を確認するために、 アレイ, 0 GHを実施した。 方法 の詳細は実施例.1 と同様に実施した。 結果
表 3に、 DU. S Ρ 1 5遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度 （G /R値） を示した。 示されるように、 大腸がん由来細胞株においても、 B AC C l o n e R P 1 1 _ 2 4 3 J 1 6に位置している、 D U S P I 5遺伝子で増幅が起きていることを鬼出した。 -
(表 3 )
Figure imgf000045_0001
<定量的 P C R>
DU S P 1 5遺伝子領域の増幅を確認するために、 定量的 P C Rを実 施した。 定量的 P C Rは、 S YB R G r e e n RT— P C R R e a g e n t s 、A p p l i e d B i o s y s t e rn s ) を使用して、 添付のプロ トコ一ルに従い、 7 5 0 0 R e a l — T i me P C R S y s t e m (A p p l i e d B i o s y s t e m s ) を用いて実施 した。 プライマーは、 以下の配列を合成し （O P E RONに合成委託） 使用,した。
プライマー配列 ：
5， - C C GC AC TGATC TAAAGGC AT T C - 3 ' (配列番. 号 3):.
5 ' — G G T C T C A A A C T C A T G G C C T.T T G— 3， （配列番
■ . 号4) · 結果 .
. 表 4に、 DU.S P 1 5遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度を示 ， した。 値は対照 DNA (正常） との相対値を示している。 示されるよう に、 大腸がん由来細胞株においても、 DU S P 1 5遺伝子領域に増幅が 起きていることを見出した。 、 (表 4 )
Figure imgf000046_0001
これらの結果により、 大腸がん由来の細胞株 （C a c o 2 , RKOE 6 ) においても、 DU S P 1 5遺伝子が増幅していることが確認された。 よって、 がんにおける D U S P 1' 5遺伝子の機能解析に使用可能な培養 細胞が選択された。 実施例 3 ： 大腸がん細胞株を用いた RNA 1解析による機能解析
本実施例では、 大腸がん患者 2 0 0検体において高頻度に増幅が認め られた DU S P 1 5遺伝子について、 大腸がん由来の細胞株であり、 且 つ、 ゲノムレベルで遺伝子の増幅が認められた細胞株 （C a c o 2 , R KOE 6 ) を用いて、 RNA.i.解析を行い、 その表現型を観察した。 く RNA i解析〉
細胞株は AT ょり購入し、 添付のプロ トコールに従い培養.を行つ た。 s i R N Aは遺伝子内の特異的な 2 1 m e r を選択しその配列を標 的とする s i RN Aを合成した （Q I AGENに合成委託） 。
(表 5 )
s i R N A配列 ：
Figure imgf000047_0001
s i RNAの C a c o 2細胞内への導入ば、 O 1 I g o f e e t am i n e ( I n v i t r o g e n ) を使用し、 Ι Ο Ο η Μの s i、RNAを 添付のプロ トコールに従 細胞に導入した。 s i R NAの kKO E 6細 胞内への導入は.、 R NA i F E C T ( Q I A G E N ) を使用し、. 1 0 0 111^の 3 i RN Aを添付のプロ小コールに従い細胞に導入した。 対照に は N e g. a t i v e. C o n t r o l s i R NA (Q I AG E N) を 使用した。 細胞に導入後 4 日間、 倒立顕微鏡下で観察した。
<定量的 RT— P C R解析 >
定量的 R T— P C R法を用いて、 s i R N Aの効果を mR N Aレベル で検証した。 s i R N A導入後 2 4時間の細胞から、 M i c r o— t o 一 M i d i T o t a l R NA P u r i f i c a t i o n S y s t e rn ( I n v i t r o g e n) を使用して、 添付のプロ トコールに従 レ 全 R NAを抽出した。 その後、 S u p e r S c r i p t I I I F i r s t — S t r a n d S y n t h e s i s S y s t e m f r ； R T - P C R ( I n v i t r o g e n ) を使用して、 添付のプロ ト コールに従い、 c DNAを.合成した。
この c DNAを铸型にして、 定量的 R T P C Rを実施した。 定量的 は、 S Y B R G r e e n R T - P C R R e a g e n t s
(A p l i e d B i o s y s t ern s ) を使用して、 添付のプロ 卜 コールに従い、 7 5 0 0 R e a l -T i me P C R S y s t e m (A p p 1 i e d B i o s y s t e m s ) を甩いて実施した。 プライ マーは、 以下の配列を合成し ，（O P E R ONに合成委託.） 使用した。 プライマー配列 ：
5 ' - A C C A C G A TTGTGACAGC GTATG- 3 ' (配列番 号 1 1 )
5 ' - AAC T C TTCAAGC TGC TGC C TAAAG— 3， （配 列番号 1 2 )
相対比を算出するための標準遺伝子には G:l y c e r a.1 d e h y d e— 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e (GAP D H) C o n t r o l R e a g e n t s (A p l i e d B i o s y s t em s ) を用いて G A P D Hの発現量を求め、 相対比を算出した。 く生細胞数の測定〉
s. i R N A導入後の生細胞数を A 1 a m.a r B l u e (B i o s o u r c e ) を用いて、 添付のプロ トコールに従い、 Wa l l a c 1 4 2 0 u l t i l a b e l / l um i n e s c e n c e C o u n t e r A R V O (P e r k i n E l me r ) により測定した。 .
大腸がん由来の細胞株である C a c o 2および R KOE 6を用いて、 DU S P 1 5遺伝子の R N A i解析を実施した。
図 2 Aおよび図 2 Bに、 それぞれ、 C a c o 2細胞および R K O E 6 細胞に DU S P 1 5遺伝子の s i RNAを T r a n s f e e t i o n後、 4日 目の観察像を示す （各図において、 上段 ： Χ·4 0 ； 下段 ： Χ 2 0 0) 。 a , b, および cは、 それぞれ DU S P 1 5遺伝子の s i RNA 3種であり、 N C'はネガティブコントロールを示す。 示されるように、 表現型の観察では、 a、 b、 および c 3種類の s i RN A共に N.e g a t i v e C o n t r o l (N C) と比較して顕著に細胞数が減少して いた （図 2 A，. B ) 。
図 3には、. C. a o 2細胞に DU S P 1 5遺伝子の s i RNAを T r a n s f e e t i o nして 2 4時間後に細胞を回収し、 定量的 R T - P C Rを行った結果を示す。 内在性コントロールとして、 GAPDHの相 .対比を用い,て、 N Cに対する相対量を示した。 示されるように、 RNA レベルでの効果を定量的 R T— P C Rで確認した結果、 三種類の s i R NA共に顕著に発 量が減少していた （図 3 ) 。
図 4 Aおよび Bには、 それぞれ、 C a c o 2細胞および R K〇 E 6細 胞に D U S P 1 5遺伝子の i RNAを T r a n s f e e t i o n後、 ' 4日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測 した結果を示す。 グラフば N Cに対する相対量を示した。 示されるように、 生細胞数の測 定を行つた結果、. C a c o 2細胞については、 D U S.P 1 5遺伝子の s i R N Aの 1種 （ c ) において、 R KO E 6細胞については、 D U S P 1 5遺伝子の s i RNAの 3種 （ a , b， c ) 全てにおいて、 表現型同 様、 N e g a ti v e C o n t f o 1 (NC) と比較して顕著に細胞 数が減少していた （図 4 Α, Β) 。 細胞数の 少が観察された上記 DU S Ρ 1 5遺伝子の s i RNA全てについて、 t検定において有意 ( < 0. 0 1 ) であった。
よって、 RN A i効果により DU S P 1 5遺伝子の発現が抑制された 結果、 C a c o 2細胞および R KO E 6細胞の両方において、 顕著にが ん細胞の増殖が抑制されることが見出された。 実施例 4 ： 大腸由来正常細胞株を用いた RN A 1解析による機能解析
本実施例では、 大腸の正常組織由来の細胞株を用いて R N A 1解析を 実施することにより、 標的遺伝子の抑制効果ががん特異的であることを 検証した。
<RNA i解析〉 . · ■
細胞株は AT C より購入した C CD 1 8 C oを使用し こ。 培養条件 は、 添付のプロ トコールに従った。 使用した s i RNAは、 実施例 3の c配列を使用した。 s i R N Aの細胞内への導入は、.' L i p o f e c t am i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n ) を使用し, 2 5 nMの s i RNAを添付のプロ トコールに従い細胞に導入レた。 対照には N e g a t i v e C o n t r o l . s i R N A ( Q Ί A G EN) を使用し た。 導入後 5日間、 倒立顕微鏡下で観察した。
く定量的 R T— P C R解析〉
実施例 3の記載方法と同様に実施した。
く生細胞数の測定〉
実施例 3の記載方法と同様に実施した。
¾. ：
DU S P 1 5遺伝子の、 大腸正常組織由来の細胞株 C CD 1 8 C oで の R N A i の効果は以下の通りである。
, 図 5に、 C C D 1 8 C o細胞に DU S P 1 5遺伝子の s i RNAを T r a n s f e c t i o n後、 5 日目に得た観察像を示す （上段 ： X 4 0 ；.下段 ； X 2,0 0 ) 。 D U S P 1 5 cは、 D U S P 1 5遺伝子の s i 尺 八の 1種 （実施例 3の c配列） を示し、 N Cはネガティブコント口 ールを示す。 示されるように、 表現型の観察では、 NCとほぼ同様で、 効果は認められなかった （図 5 ) 。
図 6に、 C C D 1 8 C O細胞に D U S P 1 5遺伝子の s i R N Aを T r a n s f e c t i o n後、 5 日目の細胞を用いて測定試薬により生細 胞数を測定した結果を示す。 グラフは N Cに対する相対量を示す。 その 結果、 表現型同様、 N e g a t i v e C o n t r o l (NC) とほぼ 同様で、 効果は認められなかった （図 6 ) 。
このことにより、 大腸がん由来の細胞株である C a c o 2および RK 〇.E 6では、 . R NA i効果により DU S P 1 5遺伝子の発現が抑制され た結果、 顕著にがん細胞の増殖が抑制されたが、 大腸正常組織由来の細 胞株 C C D Γ 8 C oでは影響が無いことが見出きれた。 よって、 DU S P 1 5遺伝子が、 正常細胞には影響が少ないことより.、 がん特異的な創 薬標的遺伝子となりうることを見出した。 実施例 5 臓器特異性の評価
DU S P 1 5遺伝子が正常組織でどのような臓器特異的な発現がされ ているのか、 当該技術分野で公知のノーザンハイブリダィゼ一ション法 により評価した。
MTN Multiple Tissue Northern Blots (Clontech)を用いて、 .添付の プ.ロ トコール.に従.い、 25mer (5 ' -cagacaccgggggaggcaagaga'aa-3， ■ (酉己 列番号 1 3 ) )の Oligo DNA Probe でハイブリダイゼーションを実施し た。
具体的には、 正常な各臓器組織での RNA レ^ルの発現分布について、 23 種の臓器（心臓 (Heart) 、 脳 (Brain) 、 胎盤： （ Pl'acenta ) 、 肺 ( Lung) 、 肝臓 （ Liver). 、 骨格筋 （ S'keleta卜 Muscle ) 、 腎臓 . (Kidney) 、 脾臓 （Pancreas) 、 脾臓 （Spleen) 、 胸腺 （Thymus) 、 前 立腺 (Prostate) 、 睾丸 (Testis) 、 卵巣 (Ovary) 、 '小腸 (Small Intestine) 、 結腸 （ Colon) 、 末梢血,白血球 （Peripheral Blood Leukocyte) 、 胃 ( Stomach) 、 甲状腺 ( Thyroid ) 、 脊髄 ( Spinal Cord) 、 リ ンパ節 （Lymph Node) 、 気管 （Trachea) 、 副腎 （Adrenal Gland) 、 骨髄 （Bone Marrow) )についてノーザンハイブリダィゼーシ ヨン法により、 解析した。 なお、 前述のとおり、 DU S P 1 5の遺伝子 酉己歹1 J は 、 NCBI (http://www. ncbi. nliii. nih. gov) に 、 Accession No. NM_080611 で 1, 383 bpの配列が mRNAとして登録されている。
結果
図 7は、 その結果を示す。 示されるように、 Alonso A. ら （Alonso A. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279 (31), 32586- 3259.1) の報告と同様 に、 精巣において約 1.5kb付近にバンドが認められ、 精巣特異的に顕著 な発現が確認された。 また、 今回の解析で新たに、 心臓、 骨格筋におい て約 1.3kb付近にバンドが認められ、 オル夕ナティブスプライシングバ リアントの 現が示唆された。 他の臓器については、 発現量が少ないこ とが確認された。 精巣での特異な発現及び、 発現する臓器が一部に限定 されるこどは、 この遺伝子を標的にした薬剤の影響が正常組織に対して 限定的である可能性が高いと考えられる。 実施例 6 遺伝子増幅の評価
検体組織内のがん細胞において D U S P 1 5遺伝子領域で遺伝子増幅 が起きていることを、 当該技術分野で公知の FISH法により評価した P アレイ CGH 法により、 遺伝子増幅度（G/R)が 1.2 以上であった検体組 織 （大腸癌患者由来） を用いて、 D U S P 1 5遺伝子が位置する BAC Clone RP11-243J16 の DNA Probe でハイブリダイゼーションを実施した。 結果
図 8は、 各検体組織 (A〜： Πで観察したがん細胞の一部（6 細胞分）の光 学顕微鏡写真 (蛍光像） を示す。 示されるように、 がん細胞においてシ グナルが.3スポッ ト以上見出された。 アレイ CGH法により遺伝子増幅度 力 1.2 以上であった 10検体において、 DU S P 1 5遺伝子領域が増幅 していることが確認された。 また、 病態ステージの初期から後期にわた り遺伝子増幅が起きていることが示された。 このことは、 DU S P 1 5 遺伝子領域が、 がん治療薬の分子標的としてだけでなく、 FISH 法によ るがん診断に応用できることを示している。 実施例 7 ： 質量分析による血中 DU S P 1 5タンパク質の検出
1 ) 血液検体の前処理
大腸癌患者の血清検体 及び健常者血清検体 10/zLを、 希釈バッ フ ァ溶液 （ 10mM Tris HC1 ph 7.4+150mM NaCl ) 500 L で希釈後、 ProteomeLab IgY-12 SC プロテオームパーティ シ ョ ニングキッ ト (BECKMAN COULTER： A24618) を用いてアルブミン、 グロブリ ン等の血 清中多量蛋白質を除去した。 得られた画分に終濃度 10mM となるように ジチすスレイ トール （Wako:049- 08972) を加え、 還元反応を 60 で 30 分間行った。. 反応終了後、 終濃度 10mM となるようにョードアセト,アミ ド （SIGMA: 144- 48-9) を加え、 アルキル化反応を室温で 30 分間、 遮光 状態で行った。 反応終了後、 .反応液の 4 倍量の冷アセトン （Wako:014- 08681, —20で） を加え、 一 80 に 1 時間静置した後に 15, 000 x g で 30 分間遠心してタンパク質を沈殿として回収した。 回収したタンパク 質は 80 L の 2 M尿素 + lOOmM重炭酸アンモニゥム溶液に溶解した。 溶 解後に一部を BCA法によるタンパク質濃度測定に供した。 試料タンパク 質と 1/50 (w/w)となるように 卜 リプシン （Promega： V511C) を加え、 37でで 16時間消化反応を行った。
2 ) Nano-HPLC直結質量分析装置による解析
ペプチド断片 0.7 g 量を X - Precoluinn cartridge (C18 PepMap300, 5 m, 300A, 300 M m i. d. x 5 mm LC PACKINGS : 163589)と直結させた ナノ カ ラ ム （C18 PepMap 3 m, 100 A , 75 m i. d. χ· 150 mm LC PACKINGS:160321) によ り分離した。 HPLC 装置は Ultimate Plus (LC PACKINGS)を用いた。 流速は 200nL/min、 0. ギ酸 (Wako:062-02901) 含有 ^ァセ 卜二トリル （MERCK: 1287229) と 0. ギ酸含有 90%ァセトニ トリルの濃度勾配が 0.57¾/minの直線グラジェントを設定して解析を行 つた。 Nano-HPLCで分離した試料は PicoTip (New Object ive:FS360-20- 10-D-20) を通して直結したイオントラップ型質量分析装置に連続的に 導入した。 質量分析装置は HCT Plus (Bruker Dal tonics)を用いた。 試 料のイオン化はキヤピラリー電圧 1500V、 エンドプレートオフセッ ト値 500V, ドライガス流量 12 L/min、 ドライガス温度 250での条件で行った。 イオントラップの設定は標的 m/z の前後 1 Da の取り込みとし、 MRM モ ードでの MS/MS解析を行った。
3) データ解析 .
質量分析装置から得た全分析デ一夕は Data Analysis ソフ トウエア (Bruker Dal tonics) を介して出力した。 出力した全データ中から標的 分子の分析データのみを抽出した。 抽出したデータの中から各分析時間 における MS/MSデータを精査し、 標的分子のフラグメントイオンに相当 する質量を持つイオンピークの有無を解析した。 ¾ .
図 9 Aおよび図 9 Bは、 （A) 大腸がん患者由来の血清、 および (B) 健常者由来の血清について、 上記の方法で解析した結果をそれぞ れ示す。
図 1 0 A〜Cは、 MS/MS 解析によって決定された、 図 9に示すピーク とアミノ酸 （またはアミノ酸配列） との対応関係を示す。
図 9および図 1 0に示されるように、 標的分子のフラグメン小イオン に相当するイオンピークが、 .大腸がん患者由来の血清中に明確に認めら れた。 すなわち、 図 1 0 Bに示すように、 .少なくとも C末端側から S A WG F E Eという部分配列が決定され、 これは、 D U S P 1 5タンパク 質のアミノ酸配列 （K列番号 2 ) 中の 1 3 6位〜 1 4 2位のアミノ酸配 列に相当する。 よって、 図 1 0. Aに示すよう 、 アミノ酸配列 1 3 3位 〜 1 4 5位の標的ペプチドフラグメント （配列番号 1 4) が同定された。 このような部分配列に対応する有意なイオンピークは健常者血清を用い た解析では認められなかった （図 1 0 Cを参照） 。 よって、 この標的分 子 （すなわち、 DU S P 1 5タンパク質） は癌特異的に血中存在量が増 加している可能性が強く示唆された。 実施例 8 ： 子宮頸がん由来株 HeLa細胞株での RNAi効果の評価
大腸がん細胞株では、 DU S P 1 5遺伝子のノックダウンにより、 増 殖押制効果が認められたが、 子宮頸がん細胞株においてどのような効果 が認められるのか、 前述の RNAi解析法により、 評価した。
子宮頸がん由来細胞の HeLa細胞株を用いて、 前出の 3種の siRNA を 用いて RNAi 解析を実施した。 s i RN Aの細胞内への導入は、 O 1 i g o f e c .t am i n e ( I n v i t r Q g e n を使用し、 1 0 0 nMの s i RN Aを添付のプロ トコールに従い細胞に導入した。 対照に は N e g a t i v e C o n t r o l s i RNA (Q. I AGE N) を 使用した。 . . .
01 1は、 HeLa 細胞に D U S P 1 5遺伝子の s i RNAを T r a n s f e c t i o n後、 4日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞.数を 測定 （MTT assay) した結果を示す。 グラフは N C (Negat ive control siRNA (Qiagen 社製））に対する相対量を示した。 図に示されるように、 D U S P 1 5遺伝子の s i R N A 3種 （ a， b， c ). その内'、 siRNA a において 26%の増殖抑制効果が認められた （p〈0.01の t検定において有 さらに、 時系列に従い、 顕微鏡下で微分干渉像を撮影し、 その動態を 詳細に観察した。 具体的には、 HeLa細胞に siRNA (a, b, c)を トランス フエクシ.ヨン後、 1， ，2, 3， .4 日後の同視野の微分干渉像を観察した。 その結果を図 1 2に示す。 NCは Negative control s iRNA (Qiagen社製） を使用した。 NC と比較して増殖速度の抑制と、 細胞死の誘導（一部を矢 印で示す）が確認された。 図中、 a、 b、 および cはそれぞれ、 図 1 1 の s i R N A a , s i RNAb、 および s i R N A cに対応する。 増殖 抑制が認められた aにおいて細胞死の誘導が認められた。
この結果より、 DU S P 1 5遺伝子機能の阻害が大腸がんだけでなく、 子宮頸がんにおいても抗腫瘍性効果を示すことが示唆された。 産業上の利用可能性 本発明は、 がんの治療剤、 診断剤、 診断方法、 治療方法、 ならびにそ れに使用するキッ トなどを提供する.。 したがって、 本発明は、 がんの診 断、 または標的治療等の分野において有用である。

Claims

請求の範囲
1. DU S P.l 5.遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん 治療剤。
2. 前記 DUS P 1 5遺伝子:の発現阻害物質が、
( a ) DUS P 1 5遺伝子の発現を RN A i効果により阻害する作用 を有する核酸、
(b) DU S P 1 5遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチ センス核酸、
および
( c ) DU S P 1 5遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザィム 活性を有する核酸、
からなる群から選択される物質を含む、 請求項 1に記載のがん治療剤。
3. DU S P 1 5タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有する がん治療剤。
4. 前記 DU S P 1 5タンパク質の活性阻害物質が、
該 DU S P 1 5タンパク質に対する抗体、 .
を含む、 請求項 3に記載のがん治療剤。
5. 前記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 1〜4のい ずれかに記載のがん治療剤。
6. DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方法であ つて、
( a ) DU S P 1 5遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物を接触させ る工程、
( b ) 該 DU S P 1 5遺伝子の発現レベルを測定する工程、 および
(c ) 被検化合物を接触させない場合と比較して、 該発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程を包含する、 スクリーニング方法。
7. D U S P 1 5夕ンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする方法 であって、 ( a ) ' D U S P 1 5タンパク質と被検化合物とを接触させる工程、
(b) 該 DU S P 1.5タンパク質と被検化合物との結合活性を測定す る工程、 および .
(c ) 該 DU S P 1 5タンパク質と結合する化合物を選択する工程を 包含する、 スクリーニング方法。
8. 前記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 6または 7 に記載の方法。 '
9. D U S P 1 5タンパク質に対する抗体。 .
1 0. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん治療剤。
1 1..放射性同位元素、.治療タンパク質、 低分子の薬剤、 または治療遺 伝子を担特したベクターをさらに含有する、 請求項 1 0に記載のがん治 療剤。
1 2. 前記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 1 0.また は 1 1 に記載のがん治療剤。
1 3. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん診断剤。
1 4. D U S P 1 5遺伝子またはその一部の塩基配列にス 卜リンジェン 卜なハイプリダイゼーション条件下でハイブリダィズ可能な塩基配列を 含有するがん診断剤。
1 5. 前記がんが大腸がんである、 請求項 1 3または 1 4に記載のがん 診断剤。
1 6. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん診断用キッ ト。
1 7. DU S P 1 5遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリンジェン 卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列か らなるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キッ ト。
1 8. 前記がんが大腸がんである、 請求項 1 6または 1 7に記載のがん 診断用キッ ト。
1 9. 被験者由来の生体試料中の D U S P 1 5タンパク質または DU S P 1 5遺伝子をがんマーカーとして検出および または定量する方法。
2 0. 前記生体試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 請求項 1 9に 記載の方法。
2 1. 質量分析装置を用いて、 DU S P 1 5タンパク質を検出および Z または定量する、 ，請求項 1 9または 2 0に記載の方法。
2 2. 抗 DU S P 1 5抗体を用いて、 DU S P 1 5タンパク質を検出お よびノまたは定量する、 請求項 1 9〜 2 1のいずれかに記載の方法。
2 3. ( a ) 被験者由来の生体試料と、 DU S P 1 5タンパク質に対す る抗体とを接触させる工程、 および
(b ) 前記試料中での前記抗体と、 DU S P 1 5タンパク質との結合 を検出および Zまたは定量する工程、 ； ：
を包含する、 請求項 2 ,2に記載の方法。
2 4. ( a ) 被験者由来の生体試料と、 DU S P 1 5遺伝子またはその 断片の塩基配列にス トリンジェン卜なハイプリダイゼーション条件下で ハイプリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触させ る工程、 および
( b ) 前記試料中での前記ポリ.ヌクレオチドと、 DU S P 1 5遺伝子 またはその断片とのパイブリダイゼ一ションを検出およびノまたは定量 する工程、 .
を包含する、 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。
2 δ . がんの診断に用いるための請求項 1 9〜 2 4のいずれかに記載の 方法。
2 6. 前記がんが、 大腸がんである、 請求項 2 5に記載の方法。
2 7. 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 配列番号 8、 配列番号 9、 または配列番号 1 0の塩基配列を有する、 ポリヌクレオチド。
2 8. DU S Ρ 1 δ遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するが ん治療剤であって、 配列番号 5、 配列番号 6.、 配列番号 7、 配列番号 8、 配列番号 9、 または配列番号 1 0の塩基配列を有するポリヌクレオチド を含有する、 がん治療剤。
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