JP2008178358A

JP2008178358A - ヒトａｂｈ８タンパク質、それをコードする遺伝子、およびこれらの治療的又は診断的用途

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Publication number: JP2008178358A
Application number: JP2007015501A
Authority: JP
Inventors: Kazutake Tsujikawa; 和丈辻川; Hiroshi Yamamoto; 弘山元; Noboru Konishi; 登小西
Original assignee: Osaka University NUC; Link Genomics Inc
Current assignee: Link Genomics Inc; University of Osaka NUC
Priority date: 2007-01-25
Filing date: 2007-01-25
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2027-01-25
Also published as: JP5354634B2

Abstract

【課題】新たなヒトＡＢＨファミリー分子を同定し、それを癌や神経疾患、発達障害等の疾患の治療または診断等への利用のために提供する。
【解決手段】（ａ）特定な配列のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ）特定な配列のアミノ酸配列からなるヒトＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、ＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または（ｄ）上記のアミノ酸配列（ｂ）において、少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＡｌｋＢホモログ（ＡＢＨ）ファミリーのメンバーであるＡＢＨ８タンパク質、それをコードする遺伝子、およびこれらの治療的又は診断的用途に関する。特に、本発明は、ヒトＡＢＨ８タンパク質、それをコードする遺伝子、およびこれらの治療的又は診断的用途に関する。

ＤＮＡ損傷の修復は、ゲノムの完全性を維持し細胞が生存しつづけるために不可欠である［非特許文献１］。哺乳類の場合、修復系の欠陥は細胞の持つ遺伝情報の変化あるいは損失をもたらすだけでなく、その構造を劇的に変化させることでそこにコード化されている遺伝情報の読み取りに重大な影響を与えることがあり、それは癌や神経疾患、発達障害などに結びつく［非特許文献２］。アルキル化によるＤＮＡ損傷もその一つである。

細胞は、ＤＮＡ中のメチル化された塩基の修復には３−メチルアデニン−ＤＮＡグリコシラーゼを用いて修復するか［非特許文献３、非特許文献４］、Ｏ⁶−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを用いてアルキル基を損傷箇所から酵素自身のシステイン残基へと転移させることで損傷を修復することが知られていた［非特許文献５、非特許文献６］。

２００２年に、Ｂ．ＳｅｄｇｗｉｃｋらとＥ．Ｓｅｅｂｅｒｇらによって、細菌のＡｌｋＢタンパク質がこれまでに例を見ない機構によってＤＮＡのアルキル化損傷を修復することが報告された［非特許文献７、非特許文献８］。彼らは、ＡｌｋＢが、酸素、２−オキソグルタル酸、鉄の存在下において１−メチルアデニン、３−メチルシトシンを酸化的脱メチル化することを示し、２−オキソグルタレート−Ｆｅ（ＩＩ）−オキシゲナーゼスーパーファミリーに属することを示唆した。その後、Ｅ．Ｓｅｅｂｅｒｇ、Ｈ．Ｅ．ＫｒｏｋａｎらによってＡｌｋＢの２種類のヒト相同体ＡＢＨ２、ＡＢＨ３がＡｌｋＢと同様の機構でＤＮＡ、ＲＮＡのアルキル化損傷を修復することが示された［非特許文献９］。ＡＢＨ３は、ヒト前立腺癌で高発現している遺伝子として本発明者らにより既に同定されているＰｒｏｓｔａｔｅＣａｎｃｅｒＡｎｔｉｇｅｎ‐１（ＰＣＡ−１）と同一の分子であり、ＡｌｋＢとＣ末端部分で高い相同性を有していることから、ＡｌｋＢのヒトホモログとしての機能が推測された［非特許文献１０］。

また最近、Ｊ．Ｍ．Ｂｕｊｎｉｃｋｉらは、ＡｌｋＢｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｇｉｏｎの相同性に基づくｉｎｓｉｌｉｃｏの解析により、ＰＣＡ−１は他の６種の分子とともにＡｌｋＢｈｏｍｏｌｏｇ（ＡＢＨ）ファミリーを構成することを報告した［非特許文献１１、非特許文献１２］。彼らはこれまでに報告されている３種類のヒトＡＢＨに加えて、新たにＡＢＨ４からＡＢＨ７までの４つの分子の存在を明らかにし、タンパク質の二次構造のホモロジー解析によりこれらの分子もＡｌｋＢやＡＢＨ２、ＡＢＨ３と同様に、２−オキソグルタレート−Ｆｅ（ＩＩ）−オキシゲナーゼスーパーファミリーに属することを示唆した。それらＡＢＨファミリー分子の模式図を図１に示す。さらにＪ．Ｍ．Ｂｕｊｎｉｃｋｉらは、ＡＢＨ８についてＭａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）などでその存在を推測したが、ヒトのｃＤＮＡデータベース（ＮＣＢＩｌｉｂｒａｒｙ）に基づくホモロジー解析では、エクソン６、９、および１０が欠損しフレームシフトエラーが認められる不完全なスプライシングフォーム体しか検出されなかったと報告している。
ＰＣ．Ｈａｎａｗａｌｔ，ＰｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｐａｉｒｏｆｄａｍａｇｅｉｎａｃｔｉｖｅｔｙｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｖｉｖｏ，Ｇｅｎｏｍｅ．１９８９；３１（２）：６０５−１１，ＲｅｖｉｅｗＶＡ．Ｂｏｈｒ，ＤＮＡｒｅｐａｉｒａｔｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｔｈｅｇｅｎｅ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ，ＪＣａｎｃｅｒＲｅｓＣｌｉｎＯｎｃｏｌ．１９９０；１１６（４）：３８４−９１，ＲｅｖｉｅｗＪ．Ｌａｂａｈｎ，ＯＤ．Ｓｃｈａｒｅｒ，ｅｔａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒｏｆａｌｋｙｌａｔｉｏｎ−ｄａｍａｇｅｄＤＮＡ，Ｃｅｌｌ．１９９６；８６（２）：３２１−９ＢＰ．Ｅｎｇｅｌｗａｒｄ，Ａ．Ｄｒｅｓｌｉｎ，ｅｔａｌ．Ｒｅｐａｉｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ３−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｍｕｔａｎｔｍｏｕｓｅｃｅｌｌｓｈａｖｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏａｌｋｙｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｄａｍａｇｅａｎｄｃｅｌｌｋｉｌｌｉｎｇ，ＥＭＢＯＪ．１９９６；１５（４）：９４５−５２Ｐ．Ｋａｒｒａｎ，Ｔ．Ｌｉｎｄａｈｌ，ｅｔａｌ．ＡｄａｐｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｌｋｙｌａｔｉｎｇａｇｅｎｔｓｉｎｖｏｌｖｅｓａｌｔｅｒａｔｉｏｎｉｎｓｉｔｕｏｆＯ６−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ．１９７９；２８０（５７１７）：７６−７Ｒ．Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，Ｒ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔａｌ．ＲｅｐａｉｒｏｆＤＮＡａｌｋｙｌａｔｉｏｎａｄｄｕｃｔｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．１９８５；６７（９）：９１９−２８，ＲｅｖｉｅｗＳ．Ｃ．Ｔｒｅｗｉｃｋ，Ｔ．Ｆ．Ｈｅｎｓｈａｗ，ｅｔａｌ．ＯｘｉｄａｔｉｖｅｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＡｌｋＢｄｉｒｅｃｔｌｙｒｅｖｅｒｔｓＤＮＡｂａｓｅｄａｍａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ．２００２；４１９（６９０３）：１７４−８．Ｐ．Ｏ．Ｆａｌｎｅｓ，Ｒ．Ｆ．ＪｏｈａｎｓｅｎａｎｄＥｒｌｉｎｇＳｅｅｂｅｒｇ，ＡｌｋＢ−ｍｅｄｉａｔｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｒｅｖｅｒｓｅｓＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ．２００２；４１９（６９０３）：１７８−８２．Ｐ．Ａ．Ａａｓ，Ｍ．Ｏｔｔｅｒｌｅｉ，ｅｔａｌ．ＨｕｍａｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｏｘｉｄａｔｉｖｅｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓｒｅｐａｉｒａｌｋｙｌａｔｉｏｎｄａｍａｇｅｉｎｂｏｔｈＲＮＡａｎｄＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２１（６９２５）：８５９−６３．Ｎ．Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔａｌ．ＨｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｅｗｍａｒｋｅｒＰＣＡ−１ｉｎｈｕｍａｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００５；１１（１４）；５０９０−７Ｍ．Ａ．Ｋｕｒｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｓ．Ｂｈａｇｗａｔ，ｅｔａｌ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｏｍｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｉｖｅｎｅｗｈｕｍａｎｈｏｍｏｌｏｇｏｆｔｈｅＤＮＡｒｅｐａｉｒｅｎｚｙｍｅＡｌｋＢ，ＢＭＣＧｅｎｏｍ．２００３；４（１）：４８．Ｆ．Ｄｒａｂｌｏｓ，Ｅ．Ｆｅｙｚｉ，ｅｔａｌ．ＡｌｋｙｌａｔｉｏｎｄａｍａｇｅｉｎＤＮＡａｎｄＲＮＡ−ｒｅｐａｉｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｍｅｄｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ，ＤＮＡＲｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）．２００４；３（１１）：１３８９−１４０７．Ｒｅｖｉｅｗ

このような状況下で、新たなヒトＡＢＨファミリー分子を同定し、それを癌や神経疾患、発達障害等の疾患の治療または診断等へ利用することが期待されている。

本発明者らは、新たなヒトＡＢＨファミリー分子を同定することを目的として、カニクイザル等で存在が推測されていたＡＢＨ８のヒトカウンターパートのクローニングを試み、それに成功した。さらに、その分子のそのヒト正常組織および癌細胞株における発現解析、発現阻害の影響の解析等を行い、ヒトＡＢＨ遺伝子の発現を阻害することによって、癌細胞のアポトーシスが誘導されることを確認した。また、いくつかのがん組織において、ＡＢＨ８タンパク質が免疫組織化学染色に強く反応することを確認した。

したがって、本発明は、以下のポリヌクレオチド、タンパク質、がん治療剤、がん診断剤、ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質またはヒトＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質のスクリーニング方法、該阻害物質を含む癌治療剤、本発明のＡＢＨ８タンパク質もしくはＡＢＨ８遺伝子を生体試料中のがんマーカーとして検出する方法等を提供する。

（１）（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、ＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（２）上記（１）に記載の上記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドであって、上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
（３）上記（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（４）配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＡＢＨ８タンパク質、または
配列番号２のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＡＢＨ８タンパク質。
（５）上記（４）に記載のＡＢＨ８タンパク質のアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
（６）ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤。
（７）上記ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質が、
（ａ）ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸、
（ｂ）ヒトＡＢＨ８遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、
および
（ｃ）ヒトＡＢＨ８遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸、
からなる群から選択される物質を含む、上記（６）に記載のがん治療剤。
（８）上記核酸が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、上記（７）に記載のがん治療剤。
（９）ヒトＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤。
（１０）上記ヒトＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質が、
該ヒトＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体、
を含む、上記（９）に記載のがん治療剤。
（１１）上記がんが、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんである、上記（６）〜（１０）のいずれかに記載のがん治療剤。
（１２）ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ヒトＡＢＨ８遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程を包含する、スクリーニング方法。
（１３）ヒトＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ヒトＡＢＨ８タンパク質と被検化合物とを接触させる工程、
（ｂ）該ヒトＡＢＨ８タンパク質と被検化合物との結合活性を測定する工程、および
（ｃ）該ヒトＡＢＨ８タンパク質と結合する化合物を選択する工程を包含する、スクリーニング方法。
（１４）ヒトＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体。
（１５）上記（１４）に記載の抗体を含有するがん治療剤。
（１６）放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を担持したベクターをさらに含有する、上記（１５）に記載のがん治療剤。
（１７）上記がんが、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんである、上記（１５）または（１６）に記載のがん治療剤。
（１８ａ）上記（１４）に記載の抗体を含有するがん診断剤。
（１８ｂ）ヒトＡＢＨ８遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含有するがん診断剤。
（１９）上記がんが、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんである、上記（１８ａ）または（１８ｂ）に記載のがん診断剤。
（２０ａ）上記（１４）に記載の抗体を含有するがん診断用キット。
（２０ｂ）ヒトＡＢＨ８遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キット。
（２１）上記がんが、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんである、上記（２０ａ）または（２０ｂ）に記載のがん診断用キット。
（２２）被験者由来の生体試料中のＡＢＨ８タンパク質をがんマーカーとして検出および／または定量する方法。
（２３）（ａ）被験者由来の生体試料と、ＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体とを接触させる工程、および
（ｂ）上記試料中での上記抗体と、ＡＢＨ８タンパク質との結合を検出および／または定量する工程、
を包含する、上記（２２）に記載の方法。
（２４）上記生体試料が、細胞または組織切片である、上記（２２）または（２３）に記載の方法。
（２５）上記生体試料が、血液（全血、血漿、血清等を含む）または尿である、上記（２２）または（２３）に記載の方法。
（２６）上記抗体とＡＢＨ８タンパク質との結合を、免疫組織化学染色により検出および／または定量する、上記（２２）〜（２４）のいずれかに記載の方法。
（２７）がんの診断に用いるための上記（２２）〜（２６）のいずれかに記載の方法。
（２８）上記がんが、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんである、上記（２７）に記載の方法。
（２９）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２１の塩基配列を有する、ポリヌクレオチド。
（３０）ＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤であって、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有する、がん治療剤。
（３１）被験者由来の生体試料中のＡＢＨ８遺伝子をがんマーカーとして検出および／または定量する方法。
（３２）上記生体試料が、細胞または組織切片である、上記（３１）に記載の方法。
（３３）（ａ）被験者由来の生体試料と、ＡＢＨ８遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触させる工程、および
（ｂ）上記試料中での上記ポリヌクレオチドと、ＡＢＨ８遺伝子またはその断片とのハイブリダイゼーションを検出および／または定量する工程、
を包含する、上記（３１）または（３２）に記載の方法。
（３４）被験者由来の生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体をがんマーカーとして検出および／または定量する方法。
（３５）上記生体試料が、細胞または組織切片である、上記（３４）に記載の方法。
（３６）上記生体試料が、全血、血清、血漿、または尿である、上記（３４）に記載の方法。
（３７）ＡＢＨ８抗原を用いて、上記抗ＡＢＨ８自己抗体を検出および／または定量する、上記（３４）〜（３６）のいずれかに記載の方法。
（３８）上記生体試料とＡＢＨ８抗原とを接触させる工程、および
上記生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体とＡＢＨ８抗原との結合を検出および／または定量する工程
を包含する、上記（３７）に記載の方法。
（３９）上記検出および／または定量する工程が、抗ＡＢＨ８自己抗体に対する標識された抗体を用いて、ＡＢＨ８と抗ＡＢＨ８自己抗体との結合を検出および／または定量することを包含する、上記（３８）に記載の方法。
（４０）ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法に従う、上記（３４）〜（３９）のいずれかに記載の方法。
（４１）乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんの診断に用いるための、上記（３４）〜（４０）のいずれかに記載の方法。
（４２）ＡＢＨ８抗原を含有する、被験者由来の生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体をがんマーカーとして検出および／または定量するためのキット。
（４３）抗ＡＢＨ８自己抗体に対する標識された抗体をさらに含み、当該抗体を、上記ＡＢＨ８抗原と上記抗ＡＢＨ８自己抗体との結合を検出および／または定量するために利用する、上記（４２）に記載のキット。
（４４）ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法に従って上記検出および／または定量を行うための、上記（４２）または（４３）に記載のキット。
（４５）乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんの診断に用いるための、上記（４２）〜（４４）のいずれかに記載のキット。
（４６）ＡＢＨ８抗原を含有する、被験者由来の生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体をがんマーカーとして検出および／または定量するための、がん診断剤。

本発明により、ＡＢＨ８遺伝子ならびにAＢＨ８タンパク質高発現に関連する疾患（例えば、癌（例：乳がん、前立腺がん、膀胱癌、大腸癌））の診断・治療等に有用な薬剤、キット、方法等が提供される。

１．本発明のＡＢＨ８タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド
本発明者らは、新たなヒトＡＢＨファミリー分子であるＡＢＨ８のヒトカウンターパートのクローニングに成功し、そのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を決定した。また、そこから推定されるアミノ酸配列（配列番号２）も決定した。

したがって、本発明は、１つの実施形態において、以下の（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、ＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。

好ましい実施形態において、上記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドは、上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなる。

本発明はさらに、これらのポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。

本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＡＢＨ８タンパク質、および配列番号２のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＡＢＨ８タンパク質を提供する。

本発明はさらに、これらのタンパク質のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを提供する。

本明細書中、「本発明のＡＢＨ８タンパク質」という場合、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＡＢＨ８タンパク質のみならず、配列番号２のアミノ酸配列と高い相同性を有するアミノ酸配列からなるＡＢＨ８タンパク質、例えば、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＡＢＨ８タンパク質、および（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と高い（例：約８０％以上の）同一性を有するアミノ酸配列からなるＡＢＨ８タンパク質も含むものとする。

「配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、および／もしくは付加されたアミノ酸配列」の例としては、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。

「配列番号２のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列」の例としては、配列番号２のアミノ酸配列と約８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、本明細書中、アミノ酸配列について用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」とは区別して用いるものとする。例えば、アミノ酸配列間の相同性をいう場合、同じ性質を持つアミノ酸（グルタミン酸とアスパラギン酸など）はひとつのグループとして扱うが、同一性を考える場合は区別される。すなわち、同一性は一致性をさす。

本明細書中、ヌクレオチド配列について「ハイブリダイズする」とは、ヌクレオチド配列同士の相補性が高い場合、二本鎖を形成することをいう。通常、二本鎖は、互いの核酸が相補的になるように設計されているが、必要に応じて（例えば、核酸を検出に使用する場合は、その目的上、問題が生じない範囲において）、その核酸中に、１または数個（例えば、２〜３個）のミスマッチを含んでいてもよい。存在してもよいミスマッチの数は、例えば、要求される検出精度、ヌクレオチド配列（または塩基配列もしくは核酸（配列）もしくはポリヌクレオチド）の長さに応じて変化し得る。なお、ヌクレオチド配列と、それがハイブリダイズする相手のヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション条件を適宜変更することにより、ミスマッチが存在する場合を排除したり、許容できるミスマッチの数を調整したりすることができることは当業者に周知である。

ハイブリダイゼーションの方法としては、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることができる（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ３ｒｄＥｄ．、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９８７−１９９７を参照）。

本明細書中、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、核酸の濃度、核酸の長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えば、ＡｌｋｐｈｏｓＤｉｒｅｃｔＬａｂｅｌｌｉｎｇＲｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを検出することができる。

所望のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列）に「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列」の例としては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、該所望のヌクレオチド配列と約８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の相同性を有するヌクレオチド配列をあげることができる。

なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性（または相同性）は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ，ｅｔａｌ：ＪＭｏｌＢｉｏｌ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いことができる。

２．がん抑制作用を有する薬剤
本発明は、（１）ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤、及び（２）ヒトＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。

本明細書中、「がん治療剤」という用語は、抗癌剤、癌転移阻害剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤、癌細胞の増殖抑制剤、癌細胞の浸潤抑制剤、がん予防剤等を含む意味で使用される。なお、本願明細書中、用語「癌（または、がん）」と「腫瘍」とは同じ意味を有する用語として使用される。

（ＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤）
本発明は、１つの実施形態において、本発明のＡＢＨ８タンパク質をコードする遺伝子（本明細書中、単に「ＡＢＨ８遺伝子」ということもある。）、特に、ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。

本明細書中、「ＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質」には、ＡＢＨ８遺伝子の発現を阻害するものであれば制限はないが、例えば、（ｉ）ＡＢＨ８遺伝子からＡＢＨ８ｍＲＮＡへの転写を阻害する物質、および（ｉｉ）ＡＢＨ８ｍＲＮＡからＡＢＨ８タンパク質への翻訳を阻害する物質が含まれる。

ＡＢＨ８遺伝子からＡＢＨ８ｍＲＮＡへの転写を阻害する物質の例としては、
（ａ）ＡＢＨ８遺伝子またはその一部に対するアンチセンス核酸、
（ｂ）ＡＢＨ８遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、
（ｃ）ＡＢＨ８遺伝子またはその一部に対してドミナントネガティブに作用するＡＢＨ８遺伝子変異体、あるいは
（ｄ）その他の転写阻害化合物
などが含まれる。

また、ＡＢＨ８ｍＲＮＡからＡＢＨ８タンパク質への翻訳を阻害する物質の例としては、
（ｅ）ＡＢＨ８ｍＲＮＡまたはその一部に対してＲＮＡｉ作用を有するポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）、
（ｆ）ＡＢＨ８ｍＲＮＡまたはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｇ）ＡＢＨ８ｍＲＮＡまたはその一部に対してリボザイム活性を有するポリヌクレオチド、あるいは
（ｈ）その他の翻訳阻害化合物
などが含まれる。

本明細書中、「核酸」とはＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。ここでいう「核酸」は、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであって良い。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、糖部分が修飾されていて良く、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されているか、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。

本発明のがん治療剤においては、ＡＢＨ８遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸を有効成分として用いることができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことをいう。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、１９〜３０塩基長のＲＮＡ干渉を生ずる二重鎖ＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖ＲＮＡが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表２００２−５１６０６２号；米国公開許第２００２／０８６３５６Ａ号；ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，２４（２），Ｆｅｂ．，１８０−１８３；Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６（４），Ａｐｒｉｌ，２４０−２４４；Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｐｅ．２１，４０７：６８０２，３１９−２０；Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１６，（８），Ａｐｒ．１６，９４８−９５８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（８），１６Ａｐｒ．，５５１５−５５２０；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６（５５６７），１９Ａｐｒ．，５５０−５５３；ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ａｐｒ．３０，９９：９，６０４７−６０５２；ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），Ｍａｙ，４９７−５００；ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０（５），Ｍａｙ，５００−５０８；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，Ｍａｙ１５など）。

本発明で用いられるＲＮＡｉ効果を奏する二重鎖ＲＮＡの長さは、通常、１９〜３０塩基、好ましくは２０〜２７塩基、より好ましくは２１〜２５塩基、最も好ましくは２１〜２３塩基である。

本明細書中、「アンチセンス核酸」、または「アンチセンスポリヌクレオチド」とは、ある対象となるＤＮＡ領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドを有し、そのポリヌクレオチドが当該領域の少なくとも一部とハイブリダイズすることができる核酸のことをいう。本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。それらは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよい。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、さらにはポリヌクレオチドアミドやオリゴヌクレオチドアミドの分解に抵抗性を有するものなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。

例えば、ＡＢＨ８遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的である。コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核酸は、標的遺伝子の転写産物に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相補性を有する。

アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも約１０塩基以上（例えば、１０〜４０個程度）、好ましくは約１５塩基以上であり、より好ましくは約１００塩基以上であり、さらに好ましくは約５００塩基以上である。アンチセンス核酸は公知の文献を参照して設計することができる（例えば、平島および井上、新生化学実験講座２核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現、日本生化学会編、東京化学同人、１９９３、ｐ．３１９−３４７）、Ｊ．Ｋａｗａｋａｍｉｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍＴｅｃｈＪａｐａｎ．Ｖｏｌ．８，ｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅｅｔａｌ．，ｅｄ．，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９３など参照）。

また、本発明のがん治療剤においては、ＡＢＨ８遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸を有効成分として用いることができる。ここでいう「リボザイム活性」とは、ターゲットとする遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを部位特異的に切断する核酸のことをいう。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（タンパク質核酸酵素、１９９０、３５、ｐ．２１９１）。ハンマーヘッド型リボザイムについては、例えば、ＦＥＢＳＬｅｔｔ，１９８８，２２８，ｐ．２２８；ＦＥＢＳＬｅｔｔ，１９８８，２３９，ｐ．２８５；タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，ｐ．２１９１；ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９８９，１７，ｐ．７０５９などを参照することができる。また、ヘアピン型リボザイムについては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，ｐ．３４９；ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９１，１９，ｐ．６７５１；菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，ｐ．１１２などを参照することができる。このようなリボザイムを用いて本発明におけるＡＢＨ８遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。

さらに、本発明は、ＡＢＨ８遺伝子の転写活性を阻害する核酸以外の化合物を有効成分として用いることができる。そのような化合物は、例えば、ＡＢＨ８遺伝子の発現・転写に関与する因子に結合する化合物である。このような化合物は、天然物でも合成化合物でもよい。このような化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することが可能である。

（ＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤）
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のＡＢＨ８タンパク質、特に、ヒトＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤を提供する。

本明細書中、「ＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質」には、例えば、
（ａ）ＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体、
（ｂ）ＡＢＨ８タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＡＢＨ８タンパク質変異体、あるいは
（ｃ）ＡＢＨ８タンパク質に結合する化合物（上記抗体および変異体を除く）
などが含まれる。

本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明のＡＢＨ８タンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。ＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体（抗ＡＢＨ８抗体）は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。なお、抗ＡＢＨ８抗体の詳細については後述する。

本明細書における「ＡＢＨ８タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＡＢＨ８タンパク質変異体」とは、それをコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型ＡＢＨ８タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す（土田邦博著、遺伝子の活性阻害実験法多比良和誠編、羊土社（２００１）２６−３２など参照）。

さらに、本発明においては、ＡＢＨ８タンパク質の活性を阻害し得る物質として、ＡＢＨ８タンパク質に結合する、上記抗体または変異体以外の化合物を有効成分として用いることができる。そのような化合物は、例えば、ＡＢＨ８タンパク質に結合し、その活性を阻害する化合物である。このような化合物は、天然物でも合成化合物でもよい。このような化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することが可能である。

上記した本発明のＡＢＨ８タンパク質の活性を阻害し得る物質は、がん治療剤として使用することができる。

３．ＡＢＨ８タンパク質の活性もしくは発現を阻害する物質のスクリーニング方法
本発明は、がん抑制作用を有する候補化合物のスクリーニング方法をも提供する。

一つの好ましい態様は、ＡＢＨ８タンパク質と被検化合物との結合を指標とする方法である。通常、ＡＢＨ８タンパク質と結合する化合物は、ＡＢＨ８タンパク質の活性を阻害する効果を有することが期待される。ここで、該化合物は、ＡＢＨ８タンパク質の活性部位に結合することが好ましい。本方法においては、まず、ＡＢＨ８タンパク質と被検化合物とを接触させる。ＡＢＨ８タンパク質は、被検化合物との結合を検出するための指標に応じて、例えば、ＡＢＨ８タンパク質の精製された形態、細胞内または細胞外に発現した形態、あるいはアフィニティーカラムに結合した形態であり得る。この方法に用いる被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。

本方法においては、次いで、ＡＢＨ８タンパク質と被検化合物との結合を検出する。

本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。

ＡＢＨ８タンパク質と被検化合物との結合は、例えば、ＡＢＨ８タンパク質に結合した被検化合物に付された標識によって検出することができる。また、細胞内または細胞外に発現しているＡＢＨ８タンパク質への被検化合物の結合により生じるＡＢＨ８タンパク質の活性の変化を指標として検出することもできる。タンパク質と被検化合物との結合活性は、公知の手法によって測定することができる（例えば、Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｆ．Ｘ．，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，８１９３−８２０２；Ｏｈｙａｍａ，Ｃ．ｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１４５８２−１４５８７；Ｎｏｄａ，Ｋ．，ｅｔａｌ．（２００３）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６３，６２８２−６２８９参照）。

本方法においては、次いで、ＡＢＨ８タンパク質と結合し、その活性を阻害する被検化合物を選択する。

本方法により単離される化合物は、がん抑制作用を有することが期待され、がん治療剤として有用である。

本発明のスクリーニング方法の他の態様は、ＡＢＨ８遺伝子の発現を指標とする方法である。本方法においては、まず、ＡＢＨ８遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、トリなど、ペット、家畜等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「ＡＢＨ８遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のＡＢＨ８遺伝子を発現している細胞、または外因性のＡＢＨ８遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外因性のＡＢＨ８遺伝子が発現した細胞は、通常、それぞれＡＢＨ８遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。

本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が用いられる。

ＡＢＨ８遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、それぞれＡＢＨ８遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。

本方法においては、次いで、該ＡＢＨ８遺伝子の発現レベルを測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ＡＢＨ８遺伝子を発現する細胞からｍＲＮＡを常法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。あるいは、ＡＢＨ８遺伝子のプロモーター領域を常法に従って単離し、その下流に標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ガラクトシダーゼ等の発光、蛍光、発色などを指標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない）をつなげ、その標識遺伝子の活性を見ることによっても該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、ＡＢＨ８遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、それぞれＡＢＨ８タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、ＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。ＡＢＨ８タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。

本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（コントロール）と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、がん治療剤のための候補化合物となる。

４．抗ＡＢＨ８抗体及びこの抗体を含有する治療剤、複合体および組成物
本発明はまた、抗ＡＢＨ８抗体、この抗体を含有するがん治療剤などを提供する。本発明の１つの好ましい態様では、上記がん治療剤は、がんの標的化療法または標的化薬物送達のために使用される。

（抗ＡＢＨ８抗体）
本明細書中、「抗ＡＢＨ８抗体」には、本発明のＡＢＨ８タンパク質（その断片（部分ペプチド）もしくはその塩を含む）に特異的に結合する抗体が含まれる。本明細書中、抗体が、あるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋ_a）が少なくとも１０⁷Ｍ^-1、好ましくは、少なくとも１０⁸Ｍ^-1、より好ましくは、１０⁹Ｍ^-1、さらにより好ましくは、１０¹⁰Ｍ^-1、１０¹¹Ｍ^-1、１０¹²Ｍ^-1またはそれより高い、例えば、最高で１０¹³Ｍ^-1またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。

本発明において使用する抗ＡＢＨ８抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮すると、より好ましくはＩｇＧである。また、ここでいう「抗体」という用語は、任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’₂、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）などを含む。本発明の抗体は、公知の方法で製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である（例えばＨａｒｌｏｗＥ．＆ＬａｎｅＤ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８８）を参照）。

（１）抗原の調製
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、通常、本発明のＡＢＨ８タンパク質またはその塩である。上記ＡＢＨ８タンパク質には、その部分ペプチドも含まれ、これは、限定されることはないが、例えば、配列番号２のアミノ酸配列の断片であって、例えば、２０個以上、４０個以上、６０個以上、８０個以上、１００個以上の、連続するアミノ酸配列部分を有する部分ペプチドである。これらの断片として、例えば、アミノ（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が用いられる。本発明で用いられる部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜６個））のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたものであってもよい。ここで用いられるＡＢＨ８タンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸）との塩などが用いられる。抗体取得の感作抗原として使用される本発明のＡＢＨ８タンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばマウス、霊長類、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。

（２）ＡＢＨ８タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
（ｉ）抗体産生細胞の採取
上記のようなＡＢＨ８タンパク質、その部分ペプチド又はその塩（本明細書中、抗体に関する説明では、これらをまとめて、「ＡＢＨ８タンパク質」という。）を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１〜１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。

（ｉｉ）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＸ６３Ａｇ．８．６５３、ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、ＮＳ０／１などのマウスミエローマ細胞株、ＹＢ２／０などのラットミエローマ細胞株が挙げられる。

次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０⁶〜１×１０⁷個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０⁵〜２×１０⁶個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比２：１〜３：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。

（ｉｉｉ）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０⁵個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。

次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、ＡＢＨ８タンパク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行う。そして、最終的に、ＡＢＨ８タンパク質と反応するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。

（ｉｖ）モノクローナル抗体の採取
上記のようにして得たハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ₂濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０⁷個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。

（３）ＡＢＨ８タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製
まず、上記した抗原を哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１０〜１０００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｕｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓｙ）又はＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。

次いで、例えば、抗血清中のポリクローナル抗体を、ＡＢＨ８タンパク質で固定されたアフィニティーカラムにかけてＡＢＨ８タンパク質と反応する抗体（カラム吸着画分）を採取する。ＡＢＨ８タンパク質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性は、ＥＬＩＳＡ法などで測定することができる。

（４）抗体の断片など
ＦａｂまたはＦａｂ’₂断片は、従来の方法によるプロテアーゼ（例えば、ペプシンまたはパパイン）を用いた消化により作製することができる。ヒト化抗体は、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎら（ＲｉｅｃｈｍａｎｎＪＭｏｌＢｉｏｌ．Ｏｃｔ５；２０３（３）：８２５−８，１９８８）、およびＪｏｎｅｓら（ＪｏｎｅｓらＮａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５，１９８６）に記載のような方法の１つにより調製することができる。

また、キメラ抗体は、例えば、「実験医学（臨時増刊号）、Ｖｏｌ．１．６，Ｎｏ．１０，１９８８」、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば、「ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１４６−１５６，１９９７」、「ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．７，ｐ．１３−２１，１９９４」、特表平４−５０４３６５号公報、国際出願公開ＷＯ９４・２５５８５号公報等、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６８，ｐ．８５６−８５９，１９９４」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。本発明のＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体は、例えば、癌細胞の増殖もしくは転移の抑制等を目的とした使用が考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。

抗体は、診断剤として用いる場合は、モニタリング等のための標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質など）で標識されていてもよい。必要に応じて、放射性物質、蛍光化合物などにより標識することができる。最も慣用の蛍光標識化合物の中には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンおよびフルオレスカミンがある。同様に、生体発光性化合物を用いて、抗体ＡＢＨ８抗体を標識することもできる。生体発光性タンパク質の存在は、蛍光の存在を検出することによって測定される。この標識目的に重要な生体発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびイエクオリンである。

なお、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するＡＢＨ８タンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。また、ＡＢＨ８タンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中のＡＢＨ８タンパク質等の検出、被検細胞内におけるＡＢＨ８タンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。

（抗ＡＢＨ８抗体を含有する複合体など）
また、本発明において使用する抗ＡＢＨ８抗体は、本発明の治療剤または診断剤において、それ自体が、抗原の活性を減弱させるような中和活性を有する薬剤（ａｇｅｎｔ）であり得るが、必要に応じて、治療効果を奏するための他の薬剤と組み合わせて用いることができる。したがって、本発明は、もう一つの態様において、がん（例えば、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がん）の標的化療法または標的化イメージング等に使用するための、抗ＡＢＨ８抗体と他の薬剤との複合体、そのような複合体を含有する組成物などをも提供する。このような態様によれば、本発明において使用する抗ＡＢＨ８抗体を用いて、治療効果を奏する他の薬剤または診断のための標識剤などを、ＡＢＨ８タンパク質を高発現する標的部位へ送達することができる。

本発明において用いられる「その他の薬剤」としては、例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、または低分子の薬剤など、標的への遺伝子導入のためのウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターなどが例示される。

本発明において、「放射性同位元素」の例としては、フッ素−１８、ヨウ素−１２５（¹²⁵Ｉ）、およびヨウ素−１３１などの放射性ハロゲン元素が挙げられる。これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属元素と同様に抗体やペプチドに標識して、放射性治治療剤あるいは放射性診断剤として広く利用し得る。例えば、¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉでのヨード化は、クロラミンＴ法等の公知の方法により、抗体または抗体断片に結合させることができる。さらに、診断用としてはテクネチウム−９９ｍ、インジウム−１１１およびガリウム−６７（⁶⁷Ｇａ）など、また治療用としてはイットリウム−９０（⁹⁰Ｙ）、レニウム−１８６（¹⁸⁶Ｒｅ）またはレニウム−１８８（¹⁸⁸Ｒｅ）などが使用され得る。放射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、通常、金属キレート剤が用いられる。金属キレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ジアミノジチオ化合物、サイクラム、およびＤＯＴＡなどが知られている。これらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、その後放射性金属で標識する場合と、放射性金属キレートを形成後、抗体に結合して標識する方法がある。

本発明において、「治療タンパク質」の例としては、免疫を担う細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２等が挙げられる。また、がん細胞（例えば、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がん細胞）を直接殺傷するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、治療タンパク質との融合抗体については、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに治療タンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。

「低分子の薬剤」は、本明細書中で「放射性同位元素」や「治療タンパク質」等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いられる。「低分子の薬剤」の例としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロファスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ，ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学（日本臨床腫瘍研究会編１９９６年癌と化学療法社））、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法昭和５７年医歯薬出版株式会社）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。

「ウイルスベクター」の例としては、本発明の抗ＡＢＨ８抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクターが使用し得る（例えば、アデノウイルスベクター（Ｗａｎｇ，Ｐ．，ｅｔａｌ．（１９９５）ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．２１，４２９−４４１）、レトロウイルスベクター（ＮａｖｉａｕｘＲ．Ｋ．，ｅｔａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７０，５７０１−５７０５）、レンチウイルスベクター（Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，４５７−４６３）などが挙げられる）。このようなウイルスベクターには、細胞増殖関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、免疫制御遺伝子等の、標的部位（例えば、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がん）において、例えば、癌細胞のアポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子（治療遺伝子）が組み込まれる。抗ＡＢＨ８抗体に結合するウイルスベクターは、抗ＡＢＨ８抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場合、抗ＡＢＨ８抗体が認識する抗原（すなわち、ＡＢＨ８）が存在する部位に標的化することができる。

抗ＡＢＨ８抗体と上記他の薬剤とは、化学的または遺伝子工学的に結合され得る。ここで、「化学的な結合」には、イオン結合、水素結合、共有結合、分子間力による結合、疎水性相互作用による結合などが含まれるものとし、「遺伝子工学的な結合」には、例えば、抗体と治療タンパク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用いて作製した場合の、抗体と治療タンパク質との間の結合様式などが含まれるものとする。

５．製剤化および製剤の投与方法
本発明のＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤、ＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤、本発明の抗ＡＢＨ８抗体を含有する治療剤、または本発明において使用する抗ＡＢＨ８抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、および治療遺伝子を担持したウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている治療剤は、公知の手法に基づいて製剤化することができる。

本発明の治療剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。

本発明の治療剤の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分としてのＡＢＨ８タンパク質の活性（またはＡＢＨ８遺伝子の発現）阻害物質は、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。

本発明の薬剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して一日につき約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。

このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。ヒト以外の動物の場合も、上記の６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。

本発明の治療剤は、がん（例えば、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、胃がん、肺がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、子宮がん（例：子宮頸がん、子宮体がん）、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、卵巣がん、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療、好ましくは、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんの予防・治療に用いられる。

本発明の薬剤は、ＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質またはＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有しているため、抗癌剤、癌転移阻害剤、癌細胞のアポトーシス誘導剤等として使用し得る。対象となる細胞、組織、臓器、または癌の種類は特定のものに限定されない。また、本発明の薬剤は、ＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質およびＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質の両方を含んでいても良い。

本発明の治療剤において、アンチセンス核酸を用いる場合、該アンチセンス核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、公知の手段に従って投与することができる。アンチセンス核酸は、単独で、あるいは生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。

また、本発明において組換えアデノウイルス粒子のようなウイルスベクターと抗ＡＢＨ８抗体との組み合わせを癌治療のために使用する場合は、これら単独で使用してもよいが、一般には製薬的に許容できる担体と共に使用される。そのような担体としては、既に上記したような担体、ならびに水、生理食塩水、グルコース、ヒトアルブミン等の水性等張溶液が好ましい。更に、製薬的に通常使用される添加剤、保存剤、防腐剤、衡量等を添加することもできる。そのように調製した医薬組成物は、治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、投与経路によって投与することができる。投与形態としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル、錠剤、顆粒剤、注射剤、軟膏等が挙げられる。本発明の抗ＡＢＨ８抗体−ウイルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物を治療のために投与する場合は、通常成人一人当たり１回に１０³〜１０¹⁵個のウイルス粒子を投与するのが好ましいが、疾病の状態や標的細胞・組織の性質によって変更してよい。投与回数は、１日１回〜数回でよく、投与期間は１日〜数ヶ月以上にわたってもよく、１〜数回の投入を１セットとして、長期にわたって断続的に多数セットを投与してもよい。また、本発明において使用されるウイルスベクター粒子またはウイルスベクター核酸分子は、特定の細胞および／または組織の検出、または疾病状態の診断に使用することができる。例えば、ウイルスベクターの核酸分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み、これを適切な宿主細胞にトランスフェクションして得られたウイルスベクター粒子は、抗ＡＢＨ８抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。あるいは、抗ＡＢＨ８抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。

６．がんの診断剤、診断用キット及び診断方法
本発明はまた、がんの診断剤を提供する。１つの好ましい態様において、本発明のがんの診断剤は、（ａ）ＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体、又は（ｂ）ＡＢＨ８遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。

（抗ＡＢＨ８抗体を用いる診断剤及び診断方法）
ＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体は、ＡＢＨ８タンパク質等を特異的に認識することができるので、被検液中のＡＢＨ８タンパク質を定量することができる。具体的には、本発明の抗ＡＢＨ８抗体を用いる診断方法は、例えば、（ａ）被験者由来の生体試料と、ＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体とを接触させる工程、および（ｂ）前記試料中での前記抗体と、ＡＢＨ８タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を検出および／または定量する工程を包含する。好ましくは、上記検出および／または定量する工程において、標識された抗ＡＢＨ８抗体を用いて、ＡＢＨ８タンパク質またはその断片と抗ＡＢＨ８抗体との結合が検出および／または定量される。

本明細書中、「被験者由来の生体試料」は、被験者由来の組織、細胞、または体液（例えば、血液（全血、血漿、血清等を含む）、尿、リンパ液、唾液、汗、精液等）を含む。また、「被験者」は、通常、がん検診を受ける、または受けることが望まれるヒト被験体であり、がんに罹患しているか、または罹患していると疑われるヒト被験体等が含まれる。このようながんの例としては、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、胃がん、肺がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、子宮がん（例：子宮頸がん、子宮体がん）、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、卵巣がん、脳腫瘍、血液腫瘍などが含まれるが、とりわけ、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんが好ましい。

上記のような被験者由来の生体試料におけるＡＢＨ８の発現を検出するための免疫測定は、がんを有すると疑われるか、がんの危険性を有する被験体から採取した生体試料を、特異的抗原−抗体結合を生じさせる条件下で抗ＡＢＨ８抗体と接触させ、次いで、抗体による免疫特異的結合量を測定することを包含する。このような抗体の結合を使用して、ＡＢＨ８タンパク質の存在および／または増大した発現が検出される。この場合、増大したＡＢＨ８タンパク質発現の検出が疾病状態の指標となる。必要に応じて、生体試料中のＡＢＨ８タンパク質のレベルを、がんを有しない健常者のレベルと比較してもよい。

上記免疫測定法の１つの態様では、例えば、血清試料などの生体試料を、試料中に存在する全部のタンパク質を固定する目的で、ニトロセルロースなどの固相支持体または担体と接触させる。次いで、この支持体を緩衝液で洗浄し、続いて検出可能に標識した抗ＡＢＨ８抗体により処理する。次いで、この固相支持体を緩衝液で２回洗浄し、未結合抗体を除去する。固相支持体上の結合した抗体の量を、周知の方法に従って測定する。各測定に適する検出条件は、慣用的な試験方法を使用して当業者により適宜決定され得る。

抗ＡＢＨ８抗体を検出可能に標識する方法の１つにおいて、当該抗体を、酵素、例えば、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）に使用されるもののような酵素に結合させる［Ｖｏｉｌｅｒ，Ａ．による「酵素標識した免疫吸着アッセイ」（“ＴｈｅＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ），１９７８，ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＨｏｒｉｚｏｎｓ，２：１〜７，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｅｓＱｕａｒｔｅｒｌｙＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ．ＭＤ；Ｖｏｉｌｅｒ，Ａ．によるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，３１：５０７〜５２０，１９７８：Ｂｕｔｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．によるＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：４８２〜５２３，１９８１］。抗体に結合する酵素を、例えば分光光度測定により、可視手段による蛍光測定により検出することができる化学分子が生成されるような方法で、適当な基質、好ましくは色素原性基質と反応させる。抗体に検出可能な標識を付けるために使用することができる酵素は、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを包含するが、これらに限定されない。この検出はまた、酵素に対する色素原性基質を用いる比色法により達成することができる。

その他の本発明において使用し得る方法としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ免疫測定法、イムノメトリック法、ネフロメトリー、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法などが挙げられる（ＷＯ００／１４２２７号公報第３９頁第２５行〜第４２頁第８行、ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報段落［０１１５］第１９頁第３５行〜第２０頁第４７行など参照）。

以上のように、本発明の抗体を用いる、生体内でのＡＢＨ８タンパク質の定量法を利用することにより、ＡＢＨ８タンパク質の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。例えば、ＡＢＨ８タンパク質の濃度増加が検出された場合は、例えば、ＡＢＨ８タンパク質の過剰発現に起因する疾患（例えば、がん（例：乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がん））である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。

なお、本発明の抗ＡＢＨ８抗体は、ｉｎｖｉｖｏでの診断に用いることもできる。ここで使用し得る抗体調製物の調製および使用方法は当該分野でよく知られている。例えば、抗体−キレート剤について、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９９０１７：２４７−２５４に記載されている。また、磁気共鳴イメージングで用いる標識としての常磁性イオンを有する抗体については、例えば、ＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ１９９１２２：３３９−３４２に記載されている。

（ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）プローブを用いる診断剤及び診断方法）
本発明の診断方法においては、ＡＢＨ８遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるプローブ又はプライマーを用いることができる。具体的には、そのような診断方法は、例えば、（ａ）被験者由来の生体試料と、ＡＢＨ８遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチド（プローブ）とを接触させる工程、および（ｂ）前記試料中での前記ポリヌクレオチドと、ＡＢＨ８遺伝子またはその断片とのハイブリダイゼーションを検出および／または定量する工程を包含する。

上記本発明の方法では、被験者由来の生体試料中のＡＢＨ８遺伝子のＤＮＡ（またはその遺伝子断片）を、上記プローブを使用して検出および／または定量する。プローブとして用いる塩基配列の長さは、例えば、１２塩基以上、１５塩基以上、１８塩基以上、２１塩基以上、２４塩基以上、２７塩基以上、３０塩基以上、またはさらに長い長さのポリヌクレオチド断片であり得る。ハイブリダイゼーションには、上記した低、中又は高ストリンジェントな条件を使用し得る。なお、本明細書中、「ＡＢＨ８遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列」には、ＡＢＨ８遺伝子またはその断片の塩基配列に相補的な塩基配列（アンチセンスポリヌクレオチド）も含まれるものとする。プローブおよび核酸のハイブリダイゼーションの方法は当業者に知られており、例えば国際公開公報第８９／０６６９８号、ＥＰ−Ａ０２００３６２、米国特許第２，９１５，０８２号、ＥＰ−Ａ００６３８７９、ＥＰ−Ａ０１７３２５１、ＥＰ−Ａ０１２８０１８に記載されている。

本発明の診断方法においては、ＡＢＨ８遺伝子に対する特異的ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて、公知の手法を用いて標的配列を検出または定量することができる。そのような公知の手法として、例えば、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年））、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））、ＦＩＳＨ法、ＤＮＡチップあるいはアレイＣＧＨ（ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＧｅｎｏｍｉｃＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法などを用いることができる。定量的な検出は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって実施可能である。

アレイＣＧＨ法は、染色体ＣＧＨ法（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８，８１８−８２１）を応用した方法で、スライド上に染色体領域をカバーするゲノムＤＮＡ断片（ＢＡＣ，ＰＡＣ，ＹＡＣなど）を高密度にスポットしたＤＮＡチップを用いて、別々の色素で標識したがん由来ＤＮＡと正常ＤＮＡを、スライド上のゲノムＤＮＡ断片に対して同時にハイブリダイゼーションを行い、その結合状態を検出することにより、がんにおけるＤＮＡコピー数異常を高解像度に検出する方法である（Ｐｉｎｋｅｌ，Ｄ．ｅｔａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０，２０７−２１１）。

なお、本発明においては、ＡＢＨ８遺伝子の発現が上方制御されるか否かを検出するために、細胞のＡＢＨ８のｍＲＮＡレベルを標準遺伝子（ハウスキーピング遺伝子（例えば、Ｓｈａｐｅｒ，Ｎ．Ｌ．ら、Ｊ．ＭａｍｍａｒｙＧｌａｎｄＢｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ３（１９９８）３１５−３２４；Ｗｕ，Ｙ．Ｙ．およびＲｅｅｓ，Ｊ．Ｌ．、ＡｃｔａＤｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．８０（２０００）２−３）のｍＲＮＡレベルと、好ましくはＲＴ−ＰＣＲによって比較することもできる。

上記のような手法によって標的配列（ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）を検出・定量し、ＡＢＨ８遺伝子の発現過多が確認された場合は、例えば、ＡＢＨ８の過剰発現に起因する疾患（例えば、がん（例：乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がん））である可能性が高い、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。

（質量分析装置を用いる診断方法）
本発明の診断方法の別の実施形態では、被検試料中の標的タンパク質またはその断片の存在を、質量分析装置（ＭＳ）を用いて同定することができる。すなわち、質量分析装置を用いることによって、標的タンパク質またはその断片のアミノ酸配列の決定を行うことができ、被験者由来の生体試料中にＡＢＨ８タンパク質が存在するか否かを判定することができる。質量分析法は、ＭＳを用いてタンパク質やペプチドのような試料をイオン化し、得られた質量／電荷（ｍ／ｚ）に従って分離し、その強度を測定することにより、試料の質量を決定する方法である。その質量分析の結果から、タンパク質やペプチドのアミノ酸配列を構成する個々のアミノ酸を同定することができる。

イオン化には、マトリクスアシステッドレーザーデソープションイオン化法（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、気相法（ＥＩ，ＣＩ）、電界脱離（ＦＤ）法など種々の方法が使用され得る。イオン分離には、イオン化法と相性のよいイオン分離法が用いられ、例えば、ＭＡＬＤＩの場合には、飛行時間型（ｔｉｍｅｏｆｆｌｉｇｈｔ：ＴＯＦ）質量分析計、ＥＳＩの場合には、四重極型（ＱＭＳ）、イオントラップ型、磁場型などの質量分析計がそれぞれ用いられる。質量分析装置は、タンデムで用いられることもある。例えば、ＬＣ−ＥＳＩＭＳ／ＭＳ、Ｑ−ＴＯＦＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ等が挙げられる。なお、その他のアミノ酸配列決定法、例えば、シークエンサー（例：気相シークエンサー）によるアミノ酸配列決定法が利用されてもよい。

（診断用キット）
本発明はまた、抗ＡＢＨ８抗体を含有する、被験者の生体試料中のＡＢＨ８タンパク質またはその断片をがんマーカーとして検出および／または定量するためのキットを提供する。さらに、ＡＢＨ８遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含有する、被験者由来の生体試料中のＡＢＨ８遺伝子またはその断片をがんマーカーとして検出および／または定量するためのキットをも提供する。これらのキットは、上述の免疫学的手法またはハイブリダイゼーション法等により、がんマーカーを検出するために用いられる。このようながんとしては、例えば、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、胃がん、肺がん、食道がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、子宮がん（例：子宮頸がん、子宮体がん）、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、卵巣がん、脳腫瘍、血液腫瘍などが含まれるが、とりわけ、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんが好ましい。

本明細書中、「がんマーカー」とは、被験者の体液（例えば、血液、尿、リンパ液、唾液、汗、精液等）または細胞もしくは組織中における、正常組織に由来していないか、あるいはがん細胞または組織において有意に発現の亢進している分子のことをいい、被験者の体液または細胞もしくは組織中における当該分子の存在ががんの存在を示すかまたは示唆するものをいう。

上記第一の態様のキットは、被験者からの生体試料中のＡＢＨ８抗原（ＡＢＨ８タンパク質およびその部分ペプチドを含む）を検出および／または定量する成分を含有する。例えば、ＡＢＨ８タンパク質がＥＬＩＳＡで検出および／または定量される場合、このような成分は、例えば、組織切片、または血液や尿のような体液試料中のＡＢＨ８のレベルを検出および／または定量するために使用され得る。このような抗体は放射能、蛍光、比色、または酵素標識で標識されていてもよい。本発明のキットは、標識された二次抗体を含有していてもよい。

上記第二の態様のキットは、ＡＢＨ８遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。例えば、本発明のキットは、ＤＮＡチップ上に固定された上記ポリヌクレオチドを含有し得る。

本発明のキットは、抗ＡＢＨ８抗体、ＡＢＨ８遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列等の他に、容器およびラベルを含んでいてもよい。容器上のまたは容器に伴うラベルには、薬剤ががんマーカーの検出に使用されることが示されていてもよい。また、他のアイテム、例えば、使用説明書等がさらに含まれていてもよい。

（ＡＢＨ８抗原を用いて抗ＡＢＨ８自己抗体を検出する方法）
本発明はまた、生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体をがんマーカーとして検出および／または定量する方法を提供する。この方法は、がんの診断に利用することができる。さらに抗ＡＢＨ８自己抗体レベルのモニタリングにより、がんの進行を予知することができる。本発明はまた、このような方法に使用するためのＡＢＨ８抗原を含む診断剤および診断用キットを提供する。

本明細書中、生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体をがんマーカーとして使用する態様で使用する「ＡＢＨ８」、「ＡＢＨ８タンパク質」、または「ＡＢＨ８抗原」には、本発明のＡＢＨ８タンパク質のみならず、ＡＢＨ８タンパク質のエピトープを含むかまたはエピトープとして抗ＡＢＨ８抗体に認識され得る断片、およびこれらの誘導体をも含むものとする。ここで、断片の長さとしては、抗ＡＢＨ８抗体に特異的な抗原として認識され得る長さであれば制限はないが、好ましくは６アミノ酸以上、より好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは１０アミノ酸以上である。また、これらの分解産物または断片は、ＡＢＨ８タンパク質の任意の部分であり得るが、ＡＢＨ８タンパク質のエピトープに対応するか、エピトープに対応する部分を含んでいることがより好ましい。また、「誘導体」とは、ＡＢＨ８タンパク質またはその断片のアミノ酸配列において１または数個（例えば、６個）のアミノ酸残基の変異、置換、欠失および／または付加を含み、実質的にＡＢＨ８タンパク質と同じ抗原特異性を有するペプチドまたはポリペプチドを含むものとする。
被験者からの生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体の検出は、任意の多くの方法で行うことができるが、代表的な方法には、免疫アッセイがあり、例えば、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、プロテインＡ免疫検定法等が挙げられる。

このようなイムノアッセイは、様々な方法で実施することができる。例えば、このようなアッセイを実施するための１つの方法は、ＡＢＨ８タンパク質の固相支持体上への繋留、およびそれに対して特異的な抗ＡＢＨ８抗体の検出を包含する。本発明のアッセイに用いられるＡＢＨ８タンパク質は、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって調製し得る。例えば、ＡＢＨ８タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に遺伝子組換え技術により導入して、ＡＢＨ８タンパク質を大規模に発現することができる。好ましくは、ＡＢＨ８の標識、固定化または検出を容易にすることができる融合タンパク質が遺伝子操作される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載された技術を参照）。別法として、ＡＢＨ８タンパク質は天然の供給源から精製することができる。たとえば、当該分野において周知のタンパク質分離技術を用いてがん細胞から精製する。このような精製技術には、分子シーブクロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーが包含されるが、これらに限定されない。実際にはＡＢＨ８タンパク質の固体支持体としては、マイクロタイタープレートが好都合に使用される。

（ＡＢＨ８抗原を用いる診断剤または診断用キット）
本発明のＡＢＨ８抗原を用いる診断剤または診断用キットは、被験者からの生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体を検出および／または定量するために必要な成分を含有する。例えば、自己抗体がＥＬＩＳＡによって検出および／または定量される場合、そのような成分は、固相支持体に結合された少なくとも１種、好ましい複数種の異なるＡＢＨ８抗原またはそれらのエピトープの形態における標的抗原、および標的抗原に結合する抗ＡＢＨ８自己抗体を検出するための手段から構成される。このような検出手段は、例えば、抗ＡＢＨ８自己抗体の定常部領域に向けられた抗体（例えば、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体）であり、それ自体で検出可能なように標識されている（例えば、放射能、蛍光、比色、または酵素標識）か、または標識された二次抗体（例えば、ヤギ抗−ウサギ抗体）によって検出される。これらの診断剤または診断用キットは、上述の免疫学的手法により、抗ＡＢＨ８自己抗体を検出および／または定量するために用いられる。診断用キットは、他に、容器およびラベルを含んでいてもよい。容器上のまたは容器に伴うラベルには、薬剤が抗ＡＢＨ８自己抗体の検出に使用されることが示されていてもよい。また、他のアイテム、例えば、使用説明書等がさらに含まれていてもよい。

上記本発明のＡＢＨ８検出のためのアッセイまたは抗ＡＢＨ８自己抗体検出のためのアッセイは、単独で、がんの診断および／または予後評価等に使用し得る新たな方法であり得るが、本発明はそのような形態に限定されず、例えば、他の診断方法と組み合わせて用いることで、診断の精度をさらに向上させることもできる。

７．本発明の組換えベクター、形質転換体、およびそれらを用いるＡＢＨ８タンパク質の製造方法
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のＡＢＨ８タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入物として含有する組換えベクターに関する。具体的には、本発明は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかからなるＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する、組換えベクターを提供する。

さらに本発明は、（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列、または（ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列、のいずれかからなるポリヌクレオチドを含有する、組換えベクターを提供する。

ここで、上記（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｖ）に対応するヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列と約９７％以上の相同性を有し、ＡＢＨ８タンパク質をコードすることが好ましい。

本発明の好ましい態様において、組換えベクターは、その挿入物を発現させ得る組換え発現ベクターである。そのような組換えベクターは、当該技術分野における公知の任意の方法で作製することができる。

本発明において、本発明のＡＢＨ８タンパク質を発現させるために用いるベクターには、無細胞発現系（インビトロトランスクリプション−トランスレーション）に、および宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物培養細胞を用いるタンパク質発現系に適するベクターとすることができ、そのようなベクターは市販されているかまたは公知のベクターから容易に作製することができる。例えば、インビトロトランスレーションおよび動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒトサイトメガロウイルスのimmeadiate-early エンハンサー／プロモーター領域を組込み、その下流域にＴ７のプロモーター配列／マルチクローニング部位を有するｐＴａｒｇｅｔＴベクターやＳＶ４０エンハンサーとＳＶ４０のｅａｒｌｙプロモーターを有するｐＳＩベクター（プロメガ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−ＴａｇおよびｐＢＫ−ＲＳＶ（ストラタジーン社）などである。また、大腸菌、酵母などの微生物宿主における発現に適するベクターは、例えば大腸菌系のＴ７のプロモーターを有するｐＥＴシリーズベクター発現システム（例えばｐＥＴ３ａ，ｐＥＴ２７ｂ（＋）やｐＥＴ２８ａ（＋）；ノバジェン社）、および酵母系においてはアルコールオキシダーゼのプロモーターを有するピチア発現系ベクターｐＩＣシリーズベクター（例えばｐＰＩＣ９ＫやＰＩＣ３.５Ｋ；インビトロジェン社）などである。

また、精製のためのペプチド配列としては、当該技術分野にて用いられているペプチド配列とすることができるが、例えば、ヒスチジン残基が４個以上、好ましくは６個以上連続したヒスチジンタグ配列、モノクローナル抗体への結合能を持つエピトープタグ配列、グルタチオンＳ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインまたはプロテインＡをコードする配列などが包含される。これらペプチド配列をコードするＤＮＡを挿入物として含有するベクターは市販されている。例えば、大腸菌、酵母などの微生物宿主に用いるベクターは、大腸菌系のＴ７のプロモーターを有し、ヒスチジン残基を１０個をアミノ末端に融合発現ベクター（例えばｐＥＴ１６ｂ；ノバジェン社）、ヒスチジン残基を６個をアミノ末端に有する発現ベクター（例えばｐＨＢ６；ロッシュダイアグノスチィック社、pＴｒｃ−Ｈｉｓシリーズベクター；インビトロジェン社、ｐＨＡＴベクターシリーズ；クローンテック社）などである。動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒスチジン残基６個をアミノ末端に融合発現するベクター（例えば、ｐＨＭ６やｐＶＭ６；ロッシュダイアグノスチィック社）の使用が可能である。昆虫培養細胞系ではバキュロウイルス系のヒスチジン残基６個をアミノ末端に融合発現するベクター（例えば、pＢａｃPＡK−Ｈｉｓベクター；クローンテック社）。また、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼと融合発現するpＧＥＸシリーズベクター（ファルマシア）、プロテインＡを発現するｐＲＩＴ２またはｐＥＺＺ１８ベクター（ファルマシア）が使用可能である。

本発明のＡＢＨ８タンパク質を製造するためのインビトロトランスレーションは、公知の方法、例えばSpirin, A.S., et.al., Science 242: 1162-1164(1988年)および Patnaik, R. & Swartz, J.M. Biotechniques 24: 862-868(1998年)に記載の方法で実施することができ、市販のインビトロトランスレーションキット（例えば、ＴＮＴ−インビトロトランスクリプション−トランスレーションキット、プロメガ社製）を用いてもよい。

本発明または、上述の組換えベクターで形質転換した形質転換体（例えば、宿主細胞（例：微生物（大腸菌、酵母など））および動物培養細胞（昆虫培養細胞、哺乳類培養細胞（例：ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞）））に関する。

本発明はまた、上記本発明の組換えベクターまたは上記本発明の形質転換体を用いるＡＢＨ８タンパク質の製造方法に関する。本発明のＡＢＨ８タンパク質の製造方法は、例えば、本発明の組換え発現ベクターを用いてインビトロトランスクリプション−トランスレーションを実施することからなる。あるいは、上記組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養し、所望のタンパク質を単離することからなる。

本発明のＡＢＨ８タンパク質の製造方法において、発現させたタンパク質は、宿主細胞の培養後、その培地からまたは菌体の可溶性画分から単離することができる。

本発明のＡＢＨ８タンパク質の製造方法において、発現させたタンパク質は公知の方法により単離・精製されるが、その精製法としては公知の任意の方法から適宜選択することができる。例えば、本発明のＡＢＨ８タンパク質が上述した精製のためのペプチド配列を包含する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、ヒスチジンタグ配列にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインにはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、プロテインＡまたは他のタンパク質の配列の場合には抗体アフィニティークロマト法を用いることができる。

以下、本発明を実施例を用いてより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。

実施例１：ＡＢＨ８のクローニング
《実験材料》
実験材料としては、以下のものを使用した。

（１）ヒト正常膵臓 cDNA：
Human Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel 1. Human Pancreas First-strand cDNA（BD バイオサイエンス）, Lot# 1100541

（２）プライマー：
hABH8-F2-TOPO 5'-CACCATGGACAGCAACCATCAAAG-3'（配列番号３）
hABH8-R2 5'-ATCAGGCCTTTTGAAGAATCA-3'（配列番号４）
hABH8-F3 5'-AAAAAGTGCAGTGGAAGGA-3'（配列番号５）
hABH8-F4 5'-TGATGACAGGAGAATCTAGA-3'（配列番号６）
hABH8-F5 5'-ATTGGATGTGGTAATGGAAAG-3'（配列番号７）
M13 Forward 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'（配列番号８）
M13 Reverse 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'（配列番号９）

（３）DNA ポリメラーゼ：
(i)PrimeSTARHS DNA Polymerase Sample (タカラ) , Cat. No. R010Q
(ii)BigDye（登録商標） Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (アプライドバイオシステム
ス), Cat. No. 4337036

（４）ベクター構築Kitおよび使用プラスミド：
pENTR^TM Directional TOPO（登録商標） Clonig Kits (インビトロジェン)
pENTR^TM/D-TOPO（登録商標） vector (インビトロジェン）

（５）アガロースゲルからのDNA精製キット：
Wizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up System (プロメガ)，Cat. No. A9282

《実験方法》
実験は、以下の手順で行った。

（１）PCR

ヒト正常膵臓cDNAをテンプレートとして以下に示す組成にしたがってサンプルを調製し、マスターサイクラー ep グラジエント S Manual Lid (エッペンドルフ)を用いてPCRを行った。この際、条件として98℃で10秒、52℃で5秒、72℃で2分の増幅を40サイクル行った。

（PCRサンプルの組成）
Human Pancreas cDNA 1.0
5x Prime STAR^TM Buffer 5.0
dNTP Mixture (2.5 mM each) 2.0
10μM hABH -F2-TOPO 0.5
10μM hABH -R2 0.5
Prime STAR^TM HS DNA Polymerase (2.5 U/μl) 0.25
dH ₂ O 15.75
25.0 μl

（２）クローニング
PCR後のサンプル全量を１％アガロースゲルで電気泳動し、2 kbpの位置に見られた単一バンドを切り出して、Wizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up System で精製した。このPCR産物をpENTR^TM Directional TOPO（登録商標） Clonig Kits を用いてpENTR^TM/D-TOPO（登録商標）とligationし、Top10 (インビトロジェン)をトランスフォーメイションしてプラスミドを複製した。プラスミドはWizard（登録商標）Miniprep Kit (プロメガ)により精製した。こうして得られたプラスミドは以下pENTR-ABH8と表記する。

（３）シークエンス解析
pENTR-ABH8をテンプレートとして、以下に示す組成にしたがって、それぞれ5つの異なるプライマー（hABH8-F3、hABH8-F4、hABH8-F5、M13 Forward、M13 Reverse）の一つを含む5種類のサンプルを調製し、マスターサイクラー ep グラジエント S Manual Lid を用いてPCRを行った。この際、条件として96℃で1分間前変性させ、96℃で10秒、50℃で5秒、60℃で4分の増幅を25サイクル行った（以下の操作はサンプルごとに別々に行った）。PCR後のサンプルを1.5 mlチューブに移し、5μlの125 mM EDTAと60μlの100% エタノールを加えてボルテックス後、15分間遮光下で放置した。その後15000 rpm , 4℃で20分間遠心し上清を捨てた後、60μlの70％エタノールを加え再度15000 rpm , 4℃で15分間遠心し、上清を捨てて2分間乾燥させた。そこに25μlのHi Di Formamideを加えボルテックスした後フラッシュし、95℃で2分間インキュベートした。インキュベート後に氷上で冷却しフラッシュ後、シークエンス用チューブに移してABI PRISM（登録商標）310 Genetic Analyzer (ABI)を用いてシークエンス解析を行った。解析結果を図3 示した。

（PCRサンプルの組成）
Ready Reaction Premix 4.0
BigDye Sequencing Buffer 2.0
10μM Primer 0.32
Template (150〜300ng）
dH ₂ O to 20.0μl
20.0μl

《実験結果》
（１）PCR後の電気泳動写真
図２にヒト正常膵臓におけるＡＢＨ８の発現を示すＰＣＲ後の電気で移動写真を示す。

（２）シークエンス解析結果
図３は、クローニングしたヒトABH8 cDNAの塩基配列とアミノ酸配列を示す。

解析後のヒトABH8 cDNAの配列をプラスミドの配列、およびヒトゲノムの配列とホモロジー解析した。得られたABH8 cDNAは2073 bp（配列番号１）であり、ORFは664個のアミノ酸（配列番号２）から構成されていた。またABH8は11番染色体に存在し、少なくとも12個のエクソンから構成されていることも明らかとなった（図4）。

（３）ABH8 の構造的特徴
図4は、ABH8のエクソン構成およびモチーフ・ドメインの模式図である。ABH8の推定される全664個のアミノ酸配列のモチーフ・ドメイン検索により、AlkB homologous regionとともに， RNA-recognition motif, methyltransferase domainが認められた。

以上のとおり、ヒトゲノム配列とMacaca fascicularisのABH8配列からプライマーを設計し、ヒト膵臓cDNAを用いてRT-PCRを行ったところ、約2 kbpの単一バンドが増幅できた。増幅された約2 kbpのバンドを切り出しpENTR/D-TOPOにライゲーションし、得られたプラスミド中のヒトABH8 cDNAの塩基配列を決定した。塩基配列解析ならびにホモロジー解析の結果、得られたヒトABH8 cDNAはカニクイザル ABH8 cDNAと96％以上という高い相同性を有することが明らかとなり、この結果から、得られたcDNAをヒトABH8であると断定した。さらに推定される全664個のアミノ酸配列のモチーフ・ドメイン検索から、AlkB homologous regionとともに， RNA recognition motif, methyltransferase domainが認められたことから、ヒトABH8が同一分子でメチル化、脱メチル化を担う可能性、またRNAがそのターゲットとなる可能性が示唆された。そこで次に、ヒト正常組織および各種ヒト癌細胞株におけるABH8 mRNAの発現を検討した。

実施例２：ヒト正常組織real-time PCRによるABH8の定量的発現解析
《実験材料》
以下の実験材料を使用した。

（１）ヒト正常臓器 cDNA：
Human Multiple Tissue cDNA (MTC) Panel 1 and Panel 2 （BD バイオサイエンス）

（２）プライマー：
β-actin-F 5'-CTACGAGCTGCCTGACGGC-3'（配列番号１０）
β-actin-R 5'-GCCACAGGACTCCATGCCC-3'（配列番号１１）
HA058356-F 5'-TGCTGAGACATGAAGGCATTGAG-3'（配列番号１２）
HA058356-R 5'-ACGGCTTGTTAGGTGGCATTAAGA-3'（配列番号１３）

（３）DNA ポリメラーゼ：
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ｉ(ロシュ) , Cat. No. 2239264

《実験方法》
実験は、以下の手順に従って行った。

（１）real-time PCR
16種のヒト正常臓器cDNAをテンプレートとして、β-actinとABH8 mRNAの発現をそれぞれに特異的なプライマー（β-actin：β-actin-F , β-actin-R , ABH8：HA058356-F , HA058356-R）を用いて調べた。サンプルは以下に示す組成にしたがって調製し、LightCycler (ロシュ)を用いてreal-time PCRを行った。この際、条件としてβ-actinでは、95℃で10分間前変性させ、95℃で15秒、62℃で30秒、72℃で10秒の増幅を40サイクル行った。またABH8では、95℃で10分間前変性させ、95℃で10秒、60℃で10秒、72℃で10秒の増幅を40サイクル行った。

（real-time PCRサンプルの組成）
Human Tissue cDNA 1.0
25mM MgCl₂ stock solution 0.8
10μM Primer-F 0.5
10μM Primer-R 0.5
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ｉ 1.0
dH ₂ O 6.2
10.0 μl

《実験結果》
ABH8 mRNAの発現を比較のために解析したABH2、3とともに、β-actinの発現に対する割合として計算し、小腸での発現を１として図5に示した。赤いバーで示したヒト正常臓器におけるABH8の発現はそれぞれ異なるが、検討した全てのヒト正常臓器において確認できた。また、その発現はABH2およびABH3の発現と類似していることが分かった。また精巣において特に発現量が高いことが分かった。

このように、ヒト正常臓器におけるABH8 mRNAの発現解析で、全ての組織でその発現を確認できたことから、ABH8が正常なすべての組織において恒常的に発現しており、組織の保護や生体のホメオスタシスにおいて重要な役割を担う可能性が考えられる。精巣において特に発現が高いことからヒトの正常な生殖、発生においてなんらかの役割を担うことも考えられる。

実施例３：ヒト癌細胞株RT-PCRによるABH8の発現解析
《実験材料》
実験材料は、以下のものを使用した。

（１）ヒト癌細胞株：
DU145 , PC3 , LNCap , A549 , AGS , HUH7 , SW480 , HeLa , U2OS , HL60 , HO , KLM , PANAC , Paca2 , PKI , PK45P (American Type Culture Collection）

（２）プライマー：
hABH8-F2-TOPO 5'-CACCATGGACAGCAACCATCAAAG-3'（配列番号３）
hABH8-R2 5'-ATCAGGCCTTTTGAAGAATCA-3'（配列番号４）
β-actin-F 5'-CTACGAGCTGCCTGACGGC-3'（配列番号１０）
β-actin-R 5'-GCCACAGGACTCCATGCCC-3'（配列番号１１）

（３）DNA ポリメラーゼ：
(i)TaKaRa LA Taq（登録商標） (タカラ) , Cat. No. RR002A
(ii)LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ｉ(ロシュ) , Cat. No. 22392
64

（４）逆転写酵素：
M-MLV Reverse Transcriptase (インビトロジェン) , Cat. No. 28025-013

（５）試薬類：
Trizol (インビトロジェン）
Chloroform (和光純薬）
pd (T)_12-18 (アマシャムバイオサイエンス), Cat. No. 27-7858-01
40 units/μl RNase inhibitor (和光純薬）
2 mM dNTP (アプライドバイオシステムス）

《実験方法》
実験は、以下の手順に従って行った。

（１）APGC法による各種癌細胞株のRNA調製
［１］各種癌細胞をはがし取りそれぞれエッペンチューブにとり遠心して細胞を集めた（以下の操作はすべて各細胞株ごとに行った）。［２］上清を捨て1 mlのトリゾールを加え、ピペッティングとボルテックスで細胞を塊が見えなくなるまでよく懸濁させた。［３］室温で5分間放置し、0.2 mlのクロロホルムを加えてボルテックスした後、室温で3分間放置した。［４］遠心して上清を新しいチューブに移し、イソプロパノールを0.5 ml加えて室温で10分間置いた。［５］遠心し上清を捨て、80％エタノールを 1 ml加えてボルテックスした後、再度遠心を行い上清を捨てた。［６］乾燥させた後、適当量のdH₂Oに溶かして電気泳動でDNAのコンタミネーションがないことを確認した。

（２）逆転写によるcDNA合成
［１］5μgのRNAをRNse-freeチューブにいれ、1μlの0.5μg/μl pd(T)_12-18 を添加した。［２］冷RNase-free dH₂Oを加えて軽くボルテックスし、70℃で10分間インキュベートした後氷冷した。［３］以下に示す試薬を加えて軽くボルテックスし、37℃で60分間インキュベートした。［４］70℃で15分間インキュベートして酵素を不活化し、氷上で反応を止めた。

（［３］で加えた試薬：μl）
0.1 M DTT(インビトロジェン) 2.5
40 units/μl Rnase inhibitor (和光純薬) 0.5
5x First-Strand Buffer (インビトロジェン) 5.0
2mM dNTPs (ABI) 6.0
200 units/μl MMLV 1.0

（３）β-actinによるcDNAの標準化
合成した16種の癌細胞株cDNAをテンプレートとして、以下に示す組成にしたがってサンプルを調製し、LightCycler (ロシュ)を用いてreal-time PCRを行った。この際、条件として95℃で10分間前変性させ、95℃で15秒、62℃で30秒、72℃で10秒の増幅を40サイクル行った。解析したそれぞれの細胞株におけるβ-actinの発現量からその濃度比を算出し、HL60由来のcDNAの濃度に合わせて希釈した。

（real-time PCRサンプルの組成）
Human Cancer Cell Line cDNA 1.0
25 mM MgCl₂ stock solution 0.8
β-actin-F 0.5
β-actin-R 0.5
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ｉ 1.0
dH ₂ O 6.2
10.0 μl

（４）PCR
β-actinで標準化した16種のヒト癌細胞株cDNAをテンプレートとして、以下に示す組成にしたがってサンプルを調製し、RT-PCRを行った。この際、条件として94℃で2分間前変性させ、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で2分の増幅を40サイクル行った。PCR後の各サンプルの電気泳動写真を《実験結果》の図6に示した。

（RT-PCRサンプルの組成）
Human Cancer Cell Line cDNA 1.0
10x LA PCR（登録商標）Buffer II 2.5
25mM MgCl₂ 2.5
dNTP Mixture (2.5 mM each) 4.0
hABH8-F2-TOPO 0.5
hABH8-R2 0.5
TaKaRa LA Taq（登録商標） (5 units/μl) 0.25
dH ₂ O 13.75
25.0 μl

《実験結果》
このように、前立腺癌細胞株（DU145, PC3, LNCap）をはじめとして、調べたすべての癌細胞株においてABH8の発現が確認できた。

実施例４：ABH8およびABHファミリー分子の細胞内局在
《実験材料》
以下の実験材料を使用した。

（１）細胞培養：
ヒト子宮頸癌細胞株であるHeLa（ATCC）を10％の非動化FCS(ニチレイ)を添加したDMEM (シグマ)で培養した。

（２）トランスフェクション試薬：
TransIT（登録商標）-HeLa MONSTER（登録商標） Transfection Kit (マイラス) , Cat. No. MIR2904

（３）ベクター構築キットおよび使用プラスミド：
Gateway（登録商標）LR Clonase^TM Enzyme Mix (インビトロジェン) , Cat. No. 11791-043
pENTR^TM/D-TOPO（登録商標） vector (インビトロジェン) Cat. No. K2400-20
pcDNA^TM 6.2/N-EmGFP-DEST （インビトロジェン） Cat. No. V356-20

（４）試薬類：
PBS
(組成) NaCl 8.0 g , Na₂HPO₄・12H₂O 2.9 g , KH₂PO₄ 0.2 g , KCl 0.2 gをdH₂Oに溶解して1 Lとし、オートクレーブ後使用
Trypsin/EDTA溶液
(組成) EDTA 0.04 g , trypsin 0.1 gをPBS 200 mlで溶解
Tris-EDTA Buffer (pH 8.0）
(組成) tris塩基 0.6055 g , EDTA 0.1861 g を400 mlのdH2Oに溶解し、6 Nの塩酸を加えながらpHを8.0にあわせて500 mlにメスアップし、オートクレーブ後使用した。

《実験方法》
実験は、以下の手順に従って行った。

（１）ABH8の細胞発現ベクターの作製
［１］pENTR-ABH8をエントリークローンとして、またpcDNA^TM 6.2/N-EmGFP-DESTをデスティネーションベクターとして用い、以下に示す組成にしたがって1.5 mlチューブにサンプルを調製した。［２］タッピング後、LA Clonase Enzyme Mixを4μｌ加えてボルテックスした後フラッシュし、25℃で60分間インキュベートした。［３］Proteinase K solutionを2μｌ加えてボルテックスした後フラッシュし、37℃で10分間インキュベートした。［４］Nova Blue（ノバジェン）をトランスフォーメイションしてプラスミドを複製し、プラスミドはWizard（登録商標）Miniprep kit(プロメガ)により精製した。こうして得られたプラスミドは以下pEGFP-ABH8と表記する。

（サンプルの組成）
Entry clone (100〜300ng）
Destination vector (150 ng/μl) 2.0
5x LR Clonase ^TM Reaction Buffer 4.0
Tris-EDTA buffer (pH 8.0) to 16.0 μl

（２）トランスフェクション
［１］トランスフェクションの前日にHeLa細胞を5x10⁴ cells/ml/12-well dishにまき、細胞が50-70％になるまでCO₂ incubaterで培養した（約24 hr）。［２］1.5 mlのシリコンチューブ2本にOpti-MEM（インビトロジェン）を100μl入れ、TransIT（登録商標） HeLa Reagentを2μl加えた後ボルテックスして室温で5分間インキュベートした。［３］1μgのpEGFP-ABH8およびコントロールとしてpcDNA^TM 6.2/N-EmGFP-DEST （以下pEGFPとする）をそれぞれ別のチューブに加えピペッティングし、室温で5分間インキュベートした（以下の操作はすべてチューブごとに行った）。［４］MONSTER Reagentを1μl加えピペッティングし、室温で5分間インキュベートした。［５］あらかじめ温めておいたDMEM (シグマ)を1 ml加えて転倒攪拌した後、培養液を除いた細胞上に滴下し、プレートを前後左右にふって攪拌した。［６］24時間後に培養液をDMEM (シグマ)に交換した。

（３）EGFPによる蛍光観察
pEGFP-ABH8 , pEGFPをトランスフェクションした24時間後のHeLa細胞のEGFPによる蛍光を、BZ-8000 (キーエンス)を用いて観察した。

《実験結果》
ｐEGFP−ABH8およびpEGFPをトランスフェクションしたHeLa細胞の染色像に加えて、比較のために同様の方法で他のABHファミリー分子をトランスフェクションしたHeLa細胞の染色像も並べて図7に示した。観察の結果、pEGFP-ABH8をトランスフェクションしたHeLaではコントロールに比べて蛍光が細胞質に偏り、核が染まっていなかった。このような極端な細胞質への局在は、ABH2、3など他のABHファミリー分子では見られていないことからABH8の細胞質タンパク質としての機能が推測される。さらに、組織がなんらかの障害を受けたときに特異的に発現誘導がかかり核内への移行を伴って機能発現するという可能性についても推測される。

実施例５：抗ABH8ペプチド抗体の作製
《実験材料》
以下の実験材料を使用した。

（１）ELISAプレート：
MULTI WELL PLATE [for ELISA] H Type Plate (スミロン) , Cat. No. MS-8596F

（２）二次抗体：
goat anti-rabbit IgG-HRP (サンタクルスバイオテクノロジー）

（３）ELISA発色液
A液：ABTS Peroxidase Substrate (KPL), Product Code 50-64-00
B液：Peroxidase Solution B [H₂O₂] (KPL), Product Code 50-65-00

（４）試薬類：
PBS
SKIM MILK (森永）

《実験方法》
実験は、以下の手順に従って行った。

（１）抗原ペプチドの設計および合成
ABH8の全アミノ酸配列のペプチド抗原性サーチを北山ラベス株式会社に委託した。解
析の結果得られたいくつかの候補配列の中から511-524の配列（NKQKSKYLRGNRNS）を抗原部位に決定し、この配列の頭部にCysをつけたペプチドの合成、および合成したペプチドとキャリアータンパク（KLH）との接合をSIGMA Aldrich Japan（株）に委託した。

（２）抗血清の作製
合成した抗原ペプチドを用いたウサギによる抗血清の作製を再度北山ラベス株式会社
に委託した。ウサギ(No.1 , No.2)への免疫は2005/9/1から2005/10/13まで二週間おきに計4回行い、免疫開始から0週目、4週目、6週目、7週目の時点で採血した血清サンプルの抗体価を、ELISA法を用いて測定した。測定の結果、6週目と7週目のサンプルで十分な抗体価が確認できたので、免疫開始から11週目でNo.1 , No.2のウサギをともに全採血した。

（３）ELISA
［１］抗原ペプチドをPBSで1 mMに調整後、10μMに希釈し、100μl/wellとなるようにELISAプレートに入れ、４℃、湿箱中で一晩インキュベートした。［２］各wellを3回洗ったあとSKIM MILK/PBSを200μl/well加え、室温、湿箱中で1時間インキュベートした。［３］各wellを3回洗ったあと、1％BSA/PBSでそれぞれの血清サンプルの16000倍からの2倍希釈系列をつくり、100μl/well加えて室温、湿箱中で1時間インキュベートした。［４］各wellを3回洗ったあと、1％BSA/PBSで1000倍に希釈した二次抗体を50μl/well加え、室温、湿箱中で1時間インキュベートした。［５］各wellを3回洗ったあと、ELISA発色液のA液とB液を１：1で混合攪拌し100μl/well加えて、遮光下で20分間インキュベートした。［６］415nmで吸光度を測定した。

《実験結果》
測定の結果、免疫7週目において十分な抗体価を確認することができたので、11週目でNo.1のウサギ、No.2のウサギともに全採血し、抗血清を得た。またグラフのように、No.2に比べてNo.1から得られた抗血清で比較的高い抗体価が得られたので、次にABH8タンパクの発現をこのNo.1の抗血清を用いたウエスタンブロットで解析した。

実施例６：ABH8タンパクの発現解析
《実験材料》

以下の実験材料を使用した。

（１）細胞培養：
ヒト前立腺癌細胞株であるDU145（ATCC）を10％の非動化FCS(ニチレイ)を添加したRPMＩ 1640 (シグマ)で培養した

（２）トランスフェクション試薬：
TransIT（登録商標）-Prostate Transfection Kit (マイルス) , Cat. No. MIR2130

（３）ベクター構築Kitおよび使用プラスミド：
Gateway（登録商標）LR Clonase^TM Enzyme Mix (インビトロジェン) , Cat. No. 11791-043
pENTR^TM/D-TOPO（登録商標） vector (インビトロジェン) Catalog No. K2400-20
pDEST^TM 26 （インビトロジェン）Catalog No. 11809-019

（４）１次抗体：
ウサギ抗ABH8ペプチド抗体(抗血清) No.1

（５）２次抗体：
goat anti-rabbit IgG-HRP (サンタクルーズ）

（６）化学発光試薬
Lumigen^TM PS-3 detection reagent (アマシャムバイオサイエンス), Cat. No. RPN2132V

（７）試薬類：
3％ BSA/TBS-T
(組成)TBS-T：1 M tris buffer (pH 7.5) 10 ml, 5 M NaCl 30 ml, Tween 20 1 mlをdH₂Oに溶解して1 Lにメスアップした

《実験方法》
実験は、以下の手順に従って行った。

（１）ABH8の細胞用発現ベクターの作製
［１］pENTR-ABH8をエントリークローンとして、またpDEST^TM26をデスティネーションベクターとして用い、以下に示す組成にしたがって1.5 mlチューブにサンプルを調製した。［２］タッピング後、LA Clonase Enzyme Mixを4μl加えてボルテックスした後フラッシュし、25℃で60分間インキュベートした。［３］Proteinase K solutionを2μl加えてボルテックスした後フラッシュし、37℃で10分間インキュベートした。［４］Nova Blue（ノバジェン）をトランスフォーメイションしてプラスミドを増幅し、プラスミドはWizard（登録商標）Miniprep Kit(プロメガ)により精製した。こうして得られたプラスミドは以下pDEST26-ABH8と表記する。

（２）トランスフォーメイション
［１］トランスフォーメイションの前日にDU145細胞を2x10⁵ cells/35 Φ dishにまき、細胞が50-70％になるまでCO₂ incubaterで培養した（約24 hr）。［２］1.5 mlのシリコンチューブにOpti-MEM（インビトロジェン）を200μl入れ、TransIT（登録商標）-Prostate Transfection Reagentを6μl加えた後ボルテックスして室温で5分間インキュベートした。［３］2μgのpDEST26-ABH8をチューブに加えピペッティングし、室温で5分間インキュベートした。［４］Prostate Boost Reagentを2μl加えピペッティングし、室温で5分間インキュベートした。［５］あらかじめ温めておいたRPMI 1640 (シグマ)を2ml加えて転倒攪拌した後、培養液を除いた細胞上に滴下し、プレートを前後左右にふって攪拌した。［６］24時間後に細胞をはがして全量を90 Φ dishにまきなおし、さらに48時間インキュベートした。

（３）ライセートの回収
［１］pDEST26-ABH8をトランスフェクションしたDU145細胞、およびコントロールとしてワイルドタイプのDU145細胞をそれぞれはがして1 mlのPBSに懸濁し、別々の1.5 mlチューブに全量回収した。［２］1500 rpmで2分間遠心して上清を取り除いた後、lysis buffer 200μlと100倍希釈したprotein inhibitor 2μlを加えて氷上で30分間インキュベートした。［３］1500 rpmで10分間遠心してそれぞれの上清を回収した。

（４）ウエスタンブロット
［１］回収したそれぞれのライセートを12％SDS-PAGEを用いて電気泳動した。［２］これをニトロセルロース膜(スクレイチャーアンドスクウェル)に転写した後、3％ BSA/TBS-Tを用いてブロッキングした。［３］TBS-Tで3回洗浄した後、１次抗体として10000倍に希釈したNo.1由来の抗ABH8ペプチド抗体を含む抗血清10 mlを加え1時間振とうし、再度TBS-Tで3回洗浄した。［４］２次抗体として10000倍に希釈したHRP標識抗rabbit IgG抗体（サンタクルスバイオテクノロジー）10 mlを加え1時間振とうし、TBS-Tで3回洗浄した。［５］化学発光試薬（アマシャム）を用いて抗原抗体複合体を検出した。

《実験結果》
図9では左のレーンにpDEST26-ABH8をトランスフェクションしたDU145細胞、右のレーンにワイルドタイプのDU145細胞のウエスタンの結果を示している。図のように、ABH8高発現株とワイルドタイプのDU145細胞でともにABH8の推定質量 75 kDaに近い82 kDaのバンドを確認することができた。

以上示した実施例１〜６では、ヒト正常臓器および各種ヒト癌細胞株におけるABH8 mRNAの発現解析の結果発現量はそれぞれ異なるものの、検討した全ての臓器および癌細胞株でその発現を確認することができた。ヒト正常臓器における発現については、すべての臓器において発現が確認できることから、正常な組織の維持に重要な役割を担うことが推測された。また精巣における高発現といったように各臓器において発現の度合いが異なることから、それぞれの臓器において組織特異的な役割を担っていることも考えられる。またABH8の細胞内における局在性の解析からABH8が特に細胞質に存在することが示され、細胞質タンパク質としての機能が推測された。

ABH8をトランスフェクションしたDU145細胞およびワイルドタイプのDU145細胞を用いたウエスタンブロット解析では、その両方においてABH8の推定質量 75 kDaに近い82 kDaのバンドを確認することができた。この結果は、ヒト癌細胞株におけるABH8 mRNAの発現解析の結果とも一致するものでありABH8の機能性タンパク質の細胞内における存在を裏付けるものである。

実施例７：ヒトＡＢＨ８の免疫組織化学染色
ｔｉｓｓｕｅａｒｒａｙを用いてヒトＡＢＨ８の免疫組織化学染色を行った。

＜手順＞
全ての組織は１０％中性緩衝ホルマリンにより固定し、パラフィン中に包埋し、組織病理学的解析のために４μｍに切片化した。脱パラフィン化の後、切片を１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に浸し、オートクレーブ中１２０℃で５分間熱した。切片を３７℃にて１時間、抗血清の１：３０００希釈（濃度１μｍ／ｍｌ）とインキュベートした。反応は引き続きＨｉｓｔｏｆｉｎｅＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット（ニチレイ社製）および色素としてジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を用いて可視化し、ヘマトキシリンにより対比染色した。

＜結果＞
以下は、癌種（陽性検体／試験検体）で表されている。
乳癌（２６／２８）、肺癌（腺癌３／１３、扁平上皮癌３／１６；但しいずれも極めて弱い）、腎癌（９／１６；但し正常尿細管の方が強い）、膀胱癌（１３／２０）、前立腺癌（２６／５０）、胃癌（１４／５２）；正常腺管、特に胃固有腺に強い反応）、大腸癌（３３／５７；但し正常腺管も弱いながら反応）、胆嚢癌（３／１６；但し極めて弱い）、肝癌（４／８；但し正常幹細胞の方が強い）。

以上の結果から、乳癌（ＭＭＫ）、膀胱癌（ＢＴ）、前立腺癌（ＰＫ）、大腸癌（ｃｏｌｏｎ）が背景の反応も少なく、腫瘍に比較的反応しているようであった。代表的な染色写真を、図１０Ａ〜Ｄに示す。

実施例８：ＡＢＨ８遺伝子のＲＮＡｉ解析
本実施例では、乳がん細胞株Ｔ４７Ｄ、前立腺がん細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３、大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を用いて、ＡＢＨ８遺伝子についてＲＮＡｉ解析を行い、その表現型を解析した。

＜ＲＮＡｉ解析＞
細胞株はＡＴＣＣより購入し、添付のプロトコールに従い培養を行った。ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡはＡＢＨ８遺伝子内の特異的な２１ｍｅｒを選択しその配列を標的とするｓｉＲＮＡを合成した（株式会社日本バイオサービスに合成委託）。

ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡの細胞内への導入は、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、１０ｎＭのＡＢＨ８ｓｉＲＮＡを添付のプロトコールに従い細胞に導入した。対照にはＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。

＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析＞
定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡの効果をｍＲＮＡレベルで検証した。ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡ導入後２４時間の細胞から、Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−ＭｉｄｉＴｏｔａｌＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、添付のプロトコールに従い、全ＲＮＡを抽出した。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、添付のプロトコールに従い、ｃＤＮＡを合成した。

このｃＤＮＡを鋳型にして、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。定量的ＰＣＲは、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、添付のプロトコールに従い、７５００Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。プライマーは、以下の配列を合成し（ＯＰＥＲＯＮに合成委託）使用した。

プライマー配列：
５’−ＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＴＴＧＧＴＣＣＣＡＴＡＧ−３’（配列番号１４）
５’−ＣＴＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＧＴＡＧＴＡＡＣＧ−３’（配列番号１５）

相対比を算出するための標準遺伝子にはＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）ＣｏｎｔｒｏｌＲｅａｇｅｎｔｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＧＡＰＤＨの発現量を求め、相対比を算出した。

＜生細胞数の測定＞
ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡ導入後、４日目の生細胞数をＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて、添付のプロトコールに従い、Ｗａｌｌａｃ１４２０Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ／ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＣｏｕｎｔｅｒＡＲＶＯ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により測定した。

＜ｓｉＲＮＡのトランスフェクション＞
まず、ＡＢＨ８遺伝子内の配列に特異的な表１に示すようなｓｉＲＮＡを合成した。（以下「ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡａ」とする）。

このＡＢＨ８ｓｉＲＮＡａを乳癌細胞株であるＴ４７Ｄ細胞及び前立腺癌細胞株であるＤＵ１４５細胞にトランスフェクション後、４日目の生細胞数を用いて測定試薬により生細胞数を測定した。

結果を図１１Ａ、Ｂに示した。グラフはＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）に対する相対量を示した。示されるように、生細胞数の測定を行った結果、ＮＣと比較して顕著に細胞数が減少していた（図１１Ａ，Ｂ）。なおグラフはＮ＝２の結果を示しておりほぼ再現性は確保されている。

次に、表２に示すように、ＡＢＨ８遺伝子内の別の配列に特異的なＡＢＨ８ｓｉＲＮＡａとは別のｓｉＲＮＡを合成した（以下「ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｂ」とする）。

このＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｂを前立腺癌細胞株であるＰＣ３細胞及び大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクション後、４日目の生細胞数を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果を図１１Ｃ，Ｄに示した。グラフはＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＮＣ）に対する相対量を示した。この結果、図に示されるように生細胞数の測定を行った結果、ＡＢＨ８遺伝子に特異的な、ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡaとは別の配列のＡＢＨ８ｓｉＲＮＡbによってもＮＣと比較して顕著に細胞数が減少していた（図１１Ｃ，Ｄ）。なおグラフはＮ＝２の結果を示しておりほぼ再現性は確保されている。

我々は同時に、ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡａ及びＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｂによってＡＢＨ８遺伝子の発現が阻害されていたかどうかを検証するため、それぞれのｓｉＲＮＡをトランスフェクション後、１日目の細胞におけるＡＢＨ８遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。図１２に、ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡａをＴ４７Ｄ及びＤＵ１４５にトランスフェクション後、またＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｂをＰＣ３及びＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクション後の結果を示した。標準遺伝子にはＧＡＰＤＨを用いた。グラフはＮＣに対する相対量を示した。示されるように、どの細胞株においてもＮＣと比較して顕著に発現量が減少していた（図１２Ａ，Ｂ、Ｃ、Ｄ）。

よって、ＲＮＡｉ効果によりＡＢＨ８遺伝子の発現が抑制された結果、Ｔ４７Ｄ、ＤＵ１４５、ＰＣ３，ＨＣＴ１１６細胞において、顕著にがん細胞の増殖が抑制されることが見出された。

以上のことから、乳がん、前立腺がん、および大腸がんにおいて、ＡＢＨ８遺伝子機能の抑制が、それらのがん治療において有効である可能性が示唆された。

実施例８：ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡによるＤＵ１４５細胞での増殖抑制及びアポトーシス誘導
我々は更に別のＡＢＨ８ｓｉＲＮＡ配列を用いて、ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡによるＤＵ１４５細胞での増殖抑制効果の検証を行い、増殖抑制の要因としてアポトーシス誘導について検証した。

《ABH8siRNAの配列》
用いたＡＢＨ８ｓｉＲＮＡの配列を表３に示す（以下「ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｃ」とする）。

《コントロールsiRNA》
コントロールｓｉＲＮＡとして、B-Bridge ネガティブコントロール S5C-0600を使用した。

《RNAiのトランスフェクションプロトコール》
ＲＮＡｉのトランスフェクションプロトコールは、以下のとおりであった。
１．３５φdishに２ｘ１０⁵ cellsのＤＵ１４５細胞（血清（−）、抗生物質（−）のＲＰＭＩ１６４０）で播種し、３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。
２．２μＭ siRNA １００μlと血清（−）、抗生物質（−）のＲＰＭＩ１６４０１００μlを混合する（［１］）。
３．DharmaFECT^TM 1（ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ）４μlと血清（−）、抗生物質（−）のＲＰＭＩ１６４０１９６μl を混合し室温で５分間放置する（［２］）。
４．［１］［２］を混合し、室温で２０分間放置する（［３］）。
５．培養中のＤＵ１４５細胞の培地を血清（＋）、抗生物質（−）のＲＰＭＩ１６４０に変え、［２］を滴下して撹拌３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートする。

《増殖アッセイ》
増殖アッセイは、以下のプロトコールに従って行った。
１．siRNAトランスフェクションから４８時間後に９６ウェルプレートに１ｘ１０³cells/wellで播種する（Ｄａｙ０）。
２．Ｄａｙ１からＤａｙ６までの増殖をWST−１（ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いてそのプロトコールに従い測定する。
３．Ｄａｙ１のOD値を1として比率で増殖率を表す。

《アポトーシス解析》
アポトーシス解析を以下のプロトコールの通り行った。
１．siRNAトランスフェクションから４８時間後に播種しなおす（Ｄａｙ０）。
２．Ｄａｙ０とＤａｙ３の細胞を回収し、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣＡｐｏｐｔｏｓｉｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いてプロトコールに従い染色し、フローサイトメーターで解析する。

《カスパーゼアッセイ解析》
１．Promega社より市販されている「Caspase-Glo 3/7 Assay」を用いて、プロトコールに従い測定した。
２．siRNAトランスフェクショから４８時間後に９６ウェルプレートに１ｘ１０⁴cells/wellで播種する。
３．24時間後、Caspase-Glo 3/7 Assayの試薬を100μl添加し、1時間室温でインキュベーション後発光度をルミノメーターで測定する。グラフは、Control siRNAをトランスフェクションした細胞の発光度を1として示している。

＜結果＞
図１３は、増殖アッセイの結果を示す。
図に示されるように、コントロールｓｉＲＮＡに比較して、ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｃをトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞では、増殖が抑制されていることが確認された。

図１４は、アポトーシス解析の結果を示す。

アポトーシス細胞は、Annexin V陽性propidium iodide陰性の位置に検出された。Day 0では、control siRNA 3％, ABH8 siRNAｃ 4%であった。Day3ではcontrol siRNA 11％であるのに対して、ABH8 siRNAｃでは40%と増加していた。このように、ABH8 siRNAｃはＤＵ１４５細胞においてアポトーシス誘導作用を示すことが確認された。

図１５は、上記カスパーゼアッセイ解析の結果を示す。図に示されるように、コントロールｓｉＲＮＡを用いた場合と比較して、ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｃでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞では、カスパーゼ３／７活性が上昇していることが確認された。これは、ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｃでトランスフェクションしたＤＵ１４５細胞でアポトーシスが誘導されることを示す。

本発明は、ヒトＡＢＨ８遺伝子に関連する疾患（例えば、癌（例：乳がん、前立腺がん、膀胱癌、大腸癌））の診断・治療等に有用である。

ＡＢＨファミリー分子の模式図を示す。ヒト正常膵臓におけるABH8の発現を示す電気泳動写真である。クローニングしたヒトABH8 cDNAの塩基配列とアミノ酸配列を示す。 ABH8のエクソン構成、およびモチーフ・ドメインの模式図である。ヒト正常臓器におけるABH2、ABH3、およびABH8の発現を示すグラフである。ヒト各種癌細胞株におけるABH8の発現を示す電気泳動写真である。 HeLa細胞におけるABH8およびその他のABHファミリー分子の細胞内局在を示す写真である。免疫後各週における抗血清の抗体価の比較（x2048000でのODを１とする）を示すグラフである。左のレーンにpDEST26-ABH8をトランスフェクションしたDU145細胞、右のレーンにワイルドタイプのDU145細胞のウエスタンの結果を示す電気泳動写真である。ヒトＡＢＨ８の免疫組織化学染色の結果を示す染色写真である。それぞれ、（Ａ）乳癌、（Ｂ）膀胱癌、（Ｃ）前立腺癌、および（Ｄ）大腸癌の組織の染色結果を示す。ヒトＡＢＨ８の免疫組織化学染色の結果を示す染色写真である。それぞれ、（Ａ）乳癌、（Ｂ）膀胱癌、（Ｃ）前立腺癌、および（Ｄ）大腸癌の組織の染色結果を示す。ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡａを乳癌細胞株であるＴ４７Ｄ細胞（Ａ）、前立腺癌細胞株であるＤＵ１４５細胞（Ｂ）、またＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｂを前立腺癌細胞株であるＰＣ３細胞（Ｃ）、及び大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞（Ｄ）にトランスフェクション後、４日目の生細胞数を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果を示す。ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡａを乳癌細胞株であるＴ４７Ｄ細胞（Ａ）、前立腺癌細胞株であるＤＵ１４５細胞（Ｂ）、またＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｂを前立腺癌細胞株であるＰＣ３細胞（Ｃ）、及び大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞（Ｄ）にトランスフェクション後、４日目の生細胞数を用いて測定試薬により生細胞数を測定した結果を示す。ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡａをＴ４７Ｄ（Ａ）及びＤＵ１４５（Ｂ）にトランスフェクション後、またＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｂをＰＣ３（Ｃ）及びＨＣＴ１１６細胞（Ｄ）にトランスフェクション後１日目の細胞におけるＡＢＨ８遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定したの結果を示す。ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡａをＴ４７Ｄ（Ａ）及びＤＵ１４５（Ｂ）にトランスフェクション後、またＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｂをＰＣ３（Ｃ）及びＨＣＴ１１６細胞（Ｄ）にトランスフェクション後１日目の細胞におけるＡＢＨ８遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定したの結果を示す。ＡＨＢ８ｓｉＲＮＡｃ導入ＤＵ１４５細胞の増殖抑制を示すグラフである。ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｃによるＤＵ１４５細胞のアポトーシス誘導効果を示すフローサイトメーター解析からのグラフである。ＡＢＨ８ｓｉＲＮＡｃ導入ＤＵ１４５細胞におけるカスパーゼ３／７活性の上昇を示すグラフである。

Claims

（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、ＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＡＢＨ８タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
請求項１に記載の前記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドであって、前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド。
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
配列番号２のアミノ酸配列からなるヒトＡＢＨ８タンパク質、または
配列番号２のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるＡＢＨ８タンパク質。
請求項４に記載のＡＢＨ８タンパク質のアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤。
前記ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質が、
（ａ）ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果により阻害する作用を有する核酸、
（ｂ）ヒトＡＢＨ８遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、
および
（ｃ）ヒトＡＢＨ８遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザイム活性を有する核酸、
からなる群から選択される物質を含む、請求項６に記載のがん治療剤。
前記核酸が、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載のがん治療剤。
ヒトＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤。
前記ヒトＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質が、
該ヒトＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体、
を含む、請求項９に記載のがん治療剤。
前記がんが、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんである、請求項６〜１０のいずれかに記載のがん治療剤。
ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ヒトＡＢＨ８遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該ヒトＡＢＨ８遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程を包含する、スクリーニング方法。
ヒトＡＢＨ８タンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ヒトＡＢＨ８タンパク質と被検化合物とを接触させる工程、
（ｂ）該ヒトＡＢＨ８タンパク質と被検化合物との結合活性を測定する工程、および
（ｃ）該ヒトＡＢＨ８タンパク質と結合する化合物を選択する工程を包含する、スクリーニング方法。
ヒトＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体。
請求項１４に記載の抗体を含有するがん治療剤。
放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を担持したベクターをさらに含有する、請求項１５に記載のがん治療剤。
前記がんが、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんである、請求項１５または１６に記載のがん治療剤。
請求項１４に記載の抗体を含有するがん診断剤。
前記がんが、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんである、請求項１８に記載のがん診断剤。
請求項１４に記載の抗体を含有するがん診断用キット。
前記がんが、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんである、請求項２０に記載のがん診断用キット。
被験者由来の生体試料中のＡＢＨ８タンパク質をがんマーカーとして検出および／または定量する方法。
（ａ）被験者由来の生体試料と、ＡＢＨ８タンパク質に結合する抗体とを接触させる工程、および
（ｂ）前記試料中での前記抗体と、ＡＢＨ８タンパク質との結合を検出および／または定量する工程、
を包含する、請求項２２に記載の方法。
前記生体試料が、細胞または組織切片である、請求項２２または２３に記載の方法。
前記生体試料が、全血、血漿、血清、または尿である、請求項２２または２３に記載の方法。
前記抗体とＡＢＨ８タンパク質との結合を、免疫組織化学染色により検出および／または定量する、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
がんの診断に用いるための請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法。
前記がんが、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんである、請求項２７に記載の方法。
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１の塩基配列を有する、ポリヌクレオチド。
ＡＢＨ８遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治療剤であって、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有する、がん治療剤。
被験者由来の生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体をがんマーカーとして検出および／または定量する方法。
前記生体試料が、細胞または組織切片である、請求項３１に記載の方法。
前記生体試料が、全血、血清、血漿、または尿である、請求項３１に記載の方法。
ＡＢＨ８抗原を用いて、前記抗ＡＢＨ８自己抗体を検出および／または定量する、請求項３１〜請求項３３のいずれかに記載の方法。
前記生体試料とＡＢＨ８抗原とを接触させる工程、および
前記生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体とＡＢＨ８抗原との結合を検出および／または定量する工程
を包含する、請求項３４に記載の方法。
前記検出および／または定量する工程が、抗ＡＢＨ８自己抗体に対する標識された抗体を用いて、ＡＢＨ８と抗ＡＢＨ８自己抗体との結合を検出および／または定量することを包含する、請求項３５に記載の方法。
ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法に従う、請求項３１〜請求項３６のいずれかに記載の方法。
乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんの診断に用いるための、請求項３１〜請求項３７のいずれかに記載の方法。
ＡＢＨ８抗原を含有する、被験者由来の生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体をがんマーカーとして検出および／または定量するためのキット。
抗ＡＢＨ８自己抗体に対する標識された抗体をさらに含み、当該抗体を、前記ＡＢＨ８抗原と前記抗ＡＢＨ８自己抗体との結合を検出および／または定量するために利用する、請求項３９に記載のキット。
ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法に従って前記検出および／または定量を行うための、請求項３９または請求項４０に記載のキット。
乳がん、膀胱がん、前立腺がん、または大腸がんの診断に用いるための、請求項３９〜請求項４１のいずれかに記載のキット。
ＡＢＨ８抗原を含有する、被験者由来の生体試料中の抗ＡＢＨ８自己抗体をがんマーカーとして検出および／または定量するための、がん診断剤。