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WO2007032396A1 - 脊髄損傷治療剤 - Google Patents

脊髄損傷治療剤 Download PDF

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Publication number
WO2007032396A1
WO2007032396A1 PCT/JP2006/318167 JP2006318167W WO2007032396A1 WO 2007032396 A1 WO2007032396 A1 WO 2007032396A1 JP 2006318167 W JP2006318167 W JP 2006318167W WO 2007032396 A1 WO2007032396 A1 WO 2007032396A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hgf
spinal cord
protein
cord injury
therapeutic agent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/318167
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hideyuki Okano
Yoshiaki Toyama
Masaya Nakamura
Akio Iwanami
Toshikazu Nakamura
Hiroshi Funakoshi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Kringle Pharma Inc
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Keio University
Kringle Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka University NUC, Keio University, Kringle Pharma Inc filed Critical Osaka University NUC
Publication of WO2007032396A1 publication Critical patent/WO2007032396A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for spinal cord injury, and more particularly to a therapeutic agent for spinal cord injury comprising as an active ingredient hepatocyte growth factor (hereinafter abbreviated as HGF) or a DNA encoding the same.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • SCI Spinal cord injury
  • HGF was first identified as a powerful mitogen for mature hepatocytes
  • Non-Patent Documents 1 and 2 The gene was cloned in 1989 (Non-Patent Documents 1 and 2). Although HGF was discovered as a hepatocyte growth factor, numerous recent studies in expression and functional analysis, including the knockout / knock-in mouse approach, also revealed that HGF is a novel neurotrophic factor ( Non-patent literature 3, 4).
  • Patent Document 1 shows an example in which action effects of HGF gene on model rats were examined behaviorally and histologically using Parkinson's disease model rats. Experimental results showed that pre-administration of the gene protected the midbrain dopamine neurons against neurotoxin 6—OHDA and reduced the symptoms in Parkinson's disease model rats. The And in this patent document 1, based on such experimental results, the HGF gene is not only for Parkinson's disease, but also for Alzheimer's disease, spinocerebellar degeneration, multiple sclerosis, striatal nigra degeneration, spinal cord degeneration.
  • Muscular atrophy Huntington's chorea, Shy-Drager syndrome, Charcot-Marie-Tooth disease, Friedreich ataxia, myasthenia gravis, Willis arterial obstruction, amyloidosis, Pick disease, SMON disease, dermatomyositis Polymyositis, Creutsfeld-Jacob disease, Behcet's disease, systemic lupus erythematosus, sarcoidosis, periarteritis, posterior longitudinal ligament ossification, extensive spinal stenosis, mixed connective tissue disease, diabetic peripheral neuritis, It can be applied to the treatment of neurological diseases such as ischemic cerebrovascular disorders (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.), and spinal cord injury is one of the most powerful neurological diseases. To have.
  • neurological diseases such as ischemic cerebrovascular disorders (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.), and spinal cord injury is one of the most powerful neurological diseases. To have.
  • Parkinson's disease is a neurodegenerative disease in which certain types of neurons, dopaminergic neurons in the midbrain substantia nigra are selectively dropped, whereas spinal cord injury is caused mainly by trauma. Many types of neurons are extensively non-selectively damaged, and clinically have completely different pathologies. Therefore, based on the above experimental results only in Parkinson's disease model rats, it cannot be said that it is effective in treating spinal cord injury, and there is no report that it was effective.
  • Patent Document 1 WO2003 / 045439
  • Non-Patent Document 2 Nature, 342, 440-443 (1989)
  • Non-Patent Document 3 Nat. Neurosci., 2, 213-217 (1999)
  • Non-Patent Document 4 Clin. Chim. Acta., 327, 1-23 (2003)
  • An object of the present invention is to provide a drug effective for fundamentally treating spinal cord injury.
  • the present inventors have found that the HGF protein or the DNA encoding the same has an excellent therapeutic effect on spinal cord injury.
  • the present invention has been completed through further studies.
  • a spinal cord injury therapeutic agent comprising an HGF protein or a DNA encoding the same as an active ingredient
  • HGF power A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, a protein comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and acting as HGF
  • the therapeutic agent according to the above (2) which is a protein or a partial peptide thereof and a peptide that acts as HGF,
  • DNA encoding the HGF protein is composed of a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or a nucleotide sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the therapeutic agent according to the above (3) which is a DNA that encodes a protein that hybridizes with a DNA under stringent conditions and acts as HGF,
  • the therapeutic agent according to the above (6) which is a dosage form of an injection for intrathecal administration
  • a method for treating spinal cord injury comprising administering an effective amount of HGF protein or DNA encoding the same to a patient with spinal cord injury, and
  • the therapeutic agent of the present invention exhibits an extremely excellent therapeutic effect on spinal cord injury.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a rat model of spinal cord injury.
  • Adult female rats were deeply anesthetized and a 200 kDyne quantitative spinal cord injury was created using an IH impactor at the T10 level of the spinal cord.
  • a 4 mm piece (rostral, central, caudal) was excised. This fragment is exempt Used for epidemic staining and for quantitative real-time RT_PCR of HGF and c_Met after a certain time from SCI.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes in c_Met and HGF mRNA expression in the spinal cord after spinal cord injury in rats.
  • Total RNA was purified from each piece of spinal cord (rostral, central, caudal) after a certain time from SCI, and quantitative real-time RT-PCR of c_met (A) and hgf (B) was performed using the "Materials and Examples" section below. The method described in the section “Method” was used. GAPDH was used as a control console.
  • FIG. 3 Photographs showing c Met expressed in normal spinal neurons and c-Met induced in reactive astrocytes one week after rat spinal cord injury. Quantitative spinal cord crush injury (200 kDyne) was created at the T10 level of the spinal cord of adult female SD rats as described in the “Materials and Methods” section. Double labeled immunostaining of c-Met using the neuronal marker NeuN and the astrocyte marker GFAP was performed in normal control and SCI rats.
  • A Spinal cord of control rat
  • B Spinal cord of damaged rat 1 week after SCI 4] Photograph showing tissue repaired after spinal cord injury between NSE-HGF mice and wild-type littermates .
  • Quantitative spinal cord crush injury (200 kDyne) was generated at the T10 level of the spinal cord of NSE-HGF-Tg and wild-type littermates as described in the Materials and Methods section, and HE-stained axon fragments and arrows. A shaped piece was made.
  • Wt Wild-type litter
  • NSE-HGF NSE-HGF-Tg
  • FIG. 5 is a diagram showing BBB scores after spinal cord injury in NSE_HGF transgenic mice and wild-type littermates. Quantitative spinal cord crush injury (200 kDyne) was created at the T10 level of the spinal cord of NSE_HGF_Tg and wild-type littermates using the method described in “Materials and Methods”, and hindlimb motor function was analyzed by BBB score at predetermined times Wt: Wild type litter, NSE-HGF: NSE-HGF-Tg
  • HSV_LacZ (l.5 ⁇ 10 9 pfuZml) 5 ⁇ 1 was injected stereotaxically into the spinal cord of adult rats (T10 level) under deep anesthesia using a minipump. Three days after injection, rats were perfused with 4% paraformaldehyde in PBS and cryoprotected with 20% sucrose solution in PBS to make frozen fragments. Then HSV— LacZ solid The expression of j3_galactosidase caused by the protein was stained with j3_gal.
  • FIG. 7 is a photograph showing HE-stained axon fragments and sagittal fragments of HSV-HGF injection group and HSV_LacZ injection group administered 3 days before spinal cord injury.
  • HSV 3 days after HGF injection or HSV_ LacZ injection, quantitative spinal cord crush injury (200 kDyne) was created at the T10 level of the spinal cord of adult female SD rats using the method described in “Materials and Methods” and from SCI.
  • HSV_Lac spinal cord pre-injected with HSV_Lac 3 days before SCI
  • HSV—HGF spinal cord pre-injected with HSV—HGF 3 days before SCI.
  • FIG. 8 is a diagram showing BBB scores in the HSV-HGF injection group and the HSV-LacZ injection group.
  • the hindlimb motor function was analyzed by BBB score after a certain time from SCI.
  • LacZ HSV—LacZ pre-injection group
  • HGF HSV—HGF pre-injection group.
  • the HGF protein used in the present invention is a known substance, and any protein prepared by various methods can be used as long as it is purified to the extent that it can be used as a medicine.
  • a method for producing the HGF protein for example, primary cultured cells or established cells that produce the HGF protein can be cultured, separated from the culture supernatant, etc., and purified to obtain the HGF protein.
  • the gene encoding the HGF protein is incorporated into an appropriate vector by genetic engineering techniques, transformed into a suitable host cell, and transformed from the culture supernatant of the transformant to the desired recombination. HGF protein can also be obtained. (See, for example, JP-A-5-111132, Biochem. Biophys. Res. Commun.
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques such as Escherichia coli, yeast or animal cells can be used.
  • the HGF protein thus obtained has substantially the same action as the natural HGF protein, one or more of the amino acid sequences [for example, several (for example:! To 8; The amino acid may be substituted, deleted or added, and the sugar chain may be similarly substituted, deleted or added.
  • HGF protein And the following 5-amino acid deficient HGF protein.
  • “deletion, substitution or addition of one or more amino acids” means a known technical method such as a genetic method, site-directed mutagenesis method, or the like.
  • HGF protein in which a sugar chain is substituted, deleted, or added is, for example, an HGF protein that is added to a natural HGF protein, treated with an enzyme to remove the sugar chain, and a sugar chain is not added.
  • amino acid sequence at the glycosylation site is mutated, or the amino acid sequence is mutated so that the sugar chain is added to a site different from the natural glycosylation site.
  • a protein having at least about 80% homology with the amino acid sequence of the HGF protein preferably a protein having about 90% or more homology, more preferably a protein having about 95% or more homology.
  • proteins that act as HGF proteins that act as HGF.
  • homologous for the amino acid sequences means the degree of coincidence of amino acid residues constituting the respective sequences by comparing the primary structures of the proteins.
  • HGF protein examples include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the HGF protein represented by SEQ ID NO: 2 is a 5-amino acid deficient HGF protein in which the 5th amino acid residues 161 to 165 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 have been deleted.
  • Both of the proteins having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 are human-derived natural HGF proteins and have mitogenic activity, motogenic activity, etc. as HGF.
  • the protein comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is at least about 80% or more, preferably about 90, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • 1 to several amino acid residues are inserted or deleted from a protein comprising an amino acid sequence having identity of not less than / o, more preferably about 95% or more, such as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • a protein comprising a lost amino acid sequence 'J, an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted with another amino acid residue, or an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are modified It is preferably a protein that acts as HGF.
  • the amino acids to be inserted or substituted are 20 kinds of amino acids encoded by the gene.
  • the unnatural amino acid may be any compound as long as it has an amino group and a carboxyl group, and examples thereof include ⁇ -aminobutyric acid.
  • These proteins may be used alone or as a mixed protein thereof.
  • the C-terminus is any of a carboxyl group (_COOH), a carboxylate (one COO_), an amide (one CONH) or an ester (one COOR).
  • R in the ester is, for example, a C alkyl group such as methinole, ethyl, n-propinole, isopropyl or n_butyl, such as cyclopentyl,
  • C cycloalkyl groups such as cyclohexyl, for example, C such as phenol and ⁇ -naphthyl
  • aryl group eg, phenyl C alkyl group or 12 1 -2
  • alpha-naphthylmethyl alpha - C Ararukiru group such Nafuchinore C alkyl group
  • HGF protein used in the present invention In the case of having a carboxylate group (or carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carboxylate group is amidated or esterified are also included in the HGF protein of the present invention. .
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like can be used.
  • the amino group of the methionine residue at the terminus is a protecting group (for example, C such as formyl group, acetyl group, etc.).
  • the cleaved daltamyl group oxidized with pyrologrenamine and the functional group on the side chain of the amino acid in the molecule are suitable protecting groups.
  • C canolenoinore such as formyl group, acetyl, etc.
  • the HGF protein partial peptide used in the present invention may be any partial peptide of the above-mentioned HGF protein.
  • the number of amino acids of the partial peptide includes at least about 20 or more, preferably about 50 or more, more preferably about 100 or more amino acid sequences of the above-described amino acid sequences of the HGF protein. Peptides are preferred.
  • the C-terminus is a carboxyl group (one COOH), a carboxylate (—C ⁇ 0 1), amide (1C0NH) or ester (1C0OR). More
  • the partial peptide has an amino group of the N-terminal methionine residue protected with a protecting group, and Gin produced by cleavage of the N-terminal side in vivo is pyrogenoletamine oxidized.
  • the functional group on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound.
  • Examples of the salt of the HGF protein or partial peptide thereof used in the present invention include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, And salts with succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • succinic acid tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methane
  • a partial peptide of HGF protein or a salt thereof used in the present invention can be produced by a known peptide synthesis method or by cleaving HGF protein with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, when the partial peptide or amino acid that can constitute the HGF protein is condensed with the remaining part and the product has a protecting group, the target peptide can be produced by removing the protecting group.
  • Known condensation methods and protecting group removal include, for example, M.
  • the partial peptide of HGF protein can be purified and isolated. If the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method, On the other hand, when it is obtained as a salt, it can be converted into a free form by a known method.
  • the therapeutic agent of the present invention contains DNA encoding HGF protein as an active ingredient. You can also.
  • DNA encoding HGF protein examples include DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or DNA comprising a base sequence complementary to DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the DNA that hybridizes with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 is, for example, the colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blotting method or Southern blotting method using the above DNA as a probe. It means DNA obtained by using the hybridization method.
  • hybridization was performed at about 65 ° C in the presence of about 0.7 to 1.0 M sodium chloride using a filter on which colony or plaque-derived DNA was immobilized. After that, using an SSC solution with a concentration of about 0.:! To about 2 times (the composition of a 1-fold concentration of SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate), and a condition of about 65 ° C. Mention may be made of DNA which can be identified by washing the filter below.
  • the DNA that hybridizes with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 above is about 80% or more, preferably about 80% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
  • Examples thereof include DNA having a base sequence having a homology of 90% or more, more preferably about 95% or more.
  • Hybrida I See Chillon a known method, for example, Molecular 'Black 1 Schimmelpenninck , (Molecular Cloning, A laboratory Manual , Third Edition (J. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Lab Press, 2001:.. Or less, This method can be performed according to the method described in “Molequila” (Cloning Version 3).) When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA encoding the HGF protein of the present invention is not limited to the above, and the DNA encoding the HGF protein of the present invention is not limited as long as the expressed protein is a DNA having substantially the same action as the HGF protein.
  • DNA encoding a partial peptide of HGF protein may also encode a partial peptide having an action as HGF.
  • it is included in the category of DNA encoding the HGF protein of the present invention.
  • the DNA encoding the partial peptide of HGF protein may be any DNA as long as it has a base sequence encoding the partial peptide described above.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cell tissue, cDNA library derived from the above-mentioned cell, tissue, or synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of butteriophage, plasmid, cosmid, phagemid, etc. It can also be directly amplified by RT-PCR using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • DNA encoding the partial peptide of the present invention include (a) DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, and (b) SEQ ID NO: 3 or Is a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a base sequence complementary to a DNA having a partial base sequence of the DNA having the base sequence represented by 4, and has substantially the same activity as the HGF protein.
  • SEQ ID NO: 3 or 4 SEQ ID NO: 3 or Is a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a base sequence complementary to a DNA having a partial base sequence of the DNA having the base sequence represented by 4, and has substantially the same activity as the HGF protein.
  • Examples thereof include DNA encoding a protein having the above, or DNA having the partial base sequence of (a) or (b) above.
  • the DNA can be easily obtained by, for example, a usual hybridization method or PCR method, and the DNA is specifically obtained with reference to the basic document such as the Molecular Cloning. it can.
  • the HGF protein used in the present invention or the DNA encoding the same is preferably the above-mentioned human-derived one when applied to humans, but the HGF protein derived from mammals other than humans. Or even the DNA that encodes it.
  • the rat-derived HGF protein is represented by SEQ ID NO: 5
  • the DNA encoding the rat HGF protein is represented by SEQ ID NO: 6.
  • RNA encoding the HGF protein or partial peptide used in the present invention can also be used in the present invention as long as it can express the HGF protein or partial peptide by reverse transcriptase. Is within.
  • the RNA can also be obtained by known means.
  • the therapeutic agent for spinal cord injury of the present invention can be applied not only to humans but also to mammals other than humans (eg, monkeys, mice, horses, pigs, hidges, nu, cats, etc.).
  • the administration form, administration method, dose and the like are slightly different from the case where the active ingredient is HGF protein and the DNA encoding HGF protein.
  • the active ingredient when it is HGF protein, it can take various pharmaceutical forms such as liquids and solids, but in general, only HGF protein or a conventional carrier and injection, propellant, sustained release Sex preparation (for example, depot).
  • the injection may be either an aqueous injection or an oily injection.
  • an aqueous injection according to a known method, for example, an aqueous solvent (water for injection, purified water, etc.) is added to a pharmaceutically acceptable additive such as an isotonic agent (sodium sodium chloride, potassium chloride). , Glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, glucose, propylene glycol, etc.), buffer (phosphate buffer, acetate buffer)
  • appropriately added solution after dissolving the HGF protein, and sterilized by filtration through a filter or the like, can then be prepared by filling a sterile container.
  • solubilizers such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) or nonionic surfactants (Polycarbonate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50, etc.) may be used. Good.
  • sesame oil or soybean oil may be used as the oily solvent, and benzyl benzoate or benzyl alcohol may be used as a solubilizer.
  • the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule or vial.
  • Liquid preparations such as injections can be stored frozen or lyophilized. It is desirable to remove water before storage. The freeze-dried preparation is used by re-dissolving it by adding distilled water for injection at the time of use.
  • the propellant can also be prepared by conventional means in the preparation.
  • the additive may be any additive generally used in inhalation formulations.
  • the above-mentioned solvents, preservatives, Agents, isotonic agents, pH adjusters, etc. are used.
  • a liquefied gas propellant or a compressed gas is used as the propellant.
  • the liquefied gas propellant include fluorinated hydrocarbons (alternative chlorofluorocarbons such as HCFC22, HCFC-123, HCFC-134a, and HCFC142), liquefied petroleum, dimethyl ether, and the like.
  • the compressed gas include soluble gases (such as carbon dioxide and nitrous oxide) and insoluble gases (such as nitrogen).
  • the HGF protein used in the present invention is a sustained-release preparation together with a biodegradable polymer.
  • the sustained-release preparation can be produced according to a known method.
  • the biodegradable polymer used in the sustained-release preparation can be appropriately selected from the strengths of known biodegradable polymers. For example, polysaccharides such as starch, dextran or chitosan, collagen, gelatin, etc.
  • Proteins polygnoretamic acid, polylysine, polyleucine, polyalanine, polymethionine, and other polyamino acids, polylactic acid, polydalicholic acid, lactic acid'glycolic acid polymer or copolymer, polycaprolataton, poly- / 3-hydroxy Butyric acid, polymalic acid, polyanhydride or fumaric acid 'polyethylene glycol.
  • Polyester such as butyl pyrrolidone copolymer, polyorthoester or polyalkyl cyanoacrylic acid such as polymethyl monocyanoacrylate, polyethylene carbonate or polypropylene carbonate, etc. Polycarbonate etc. .
  • Polyester is preferable, and polylactic acid or lactic acid / glycolic acid polymer or copolymer is more preferable.
  • the composition ratio (lactic acid / daricholic acid) (mol%) varies depending on the sustained release period.
  • the sustained release period is about 2 weeks to 3 months.
  • the weight average molecular weight of the polylactic acid-glycolic acid polymer or copolymer is generally about 5,000 to 20,000.
  • Polylactic acid-glycolic acid co The polymer can be produced according to a known production method, for example, the production method described in JP-A-61-28521.
  • the mixing ratio of the biodegradable polymer and the HGF protein is not particularly limited.
  • the HGF protein is about 0.0 :! to about 30 wZw% with respect to the biodegradable polymer.
  • the administration method includes direct injection (intrathecal administration, continuous intrathecal administration with sustained-release pump, etc.) or spraying an injection or spray directly into a tissue with spinal cord injury or It is preferable to implant a sustained-release preparation (depot) at a site close to the tissue with spinal cord injury.
  • the dose is appropriately selected according to the dosage form, the degree of disease, age, etc. Usually, the dose is 1 to 500 mg ⁇ , preferably 10 / ig to 50 mg per dose.
  • the number of administrations is appropriately selected according to the dosage form, the degree of disease, age, etc., and can be administered once or continuously at a certain interval. In the case of continuous administration, the dosing interval should be once a day to once every several months.
  • sustained release preparation depot
  • intrathecal continuous administration by sustained release pump several months It may be once.
  • the administration method is preferably local administration as described above, but intramuscular administration, subcutaneous administration, infusion administration, etc. are also possible.
  • the administration method is divided into the case of using a non-viral vector and the case of using a viral vector, and the administration method is conventional. Can be performed.
  • a non-viral vector When a non-viral vector is used, it is introduced into a spinal cord injury tissue using a recombinant expression vector in which a conventional gene expression vector is incorporated.
  • Methods for gene transfer to tissues include gene transfer methods using encapsulated ribosomes, gene transfer methods using electrostatic ribosomes, HVJ-ribosome methods, methods using HVC-E vectors, improved HVJ-liposome methods, By using the HVC-E vector method, receptor-mediated gene transfer method, transferring a DNA molecule together with a carrier with a partial gun, direct naked DNA transfer method, positive charge polymer transfer method, etc.
  • the recombinant expression vector can be incorporated into cells such as spinal cord neurons.
  • a viral vector When a viral vector is used, a detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, polio
  • a DNA virus or RNA virus such as Winores, Synbis virus, Sendai virus, SV40, or immunodeficiency virus (HIV) and then infecting the cell with a recombinant virus, It is possible to introduce DNA encoding.
  • the gene therapeutic agent of the present invention is applied to a patient by an in vivo method in which the therapeutic agent is directly introduced into a tissue with spinal cord injury (for example, intrathecally), and cells are removed from the tissue.
  • a gene therapy agent is introduced into the cell outside the body, and the cell is returned to the site where the spinal cord is damaged.
  • the in vivo method is preferred.
  • various known dosage forms for example, injections, sprays, sustained-release preparations (depots), microcapsules, etc.
  • Injections, sprays, and sustained-release preparations (depots) can be prepared in the same manner as for HGF protein.
  • a host cell into which an expression plasmid containing DNA encoding HGF protein or DNA encoding HGF protein is introduced as a core substance is used as a known method (eg, coacervation method, By coating with a coating material according to an interfacial polymerization method or a double nozzle method, etc., fine particles having a diameter of about 1 to 500, preferably about 100 to 400 xm can be produced.
  • coating materials include carboxymethylenosenorose, cenololose acetate phthalate, ethinoresenololose, anoregic acid or its salts, gelatin, gelatin 'gum arabic, nitrocellulose, polybulal alcohol or hydroxypropylcellulose, polylactic acid , Polyglycolic acid, chitosan-alginate, cellulose sulfate monopoly (dimethyldiaryl) ammonium chloride, hydroxyethyl methacrylate-methyl methacrylate, chitosan monocarboxymethyl cellulose, arginate-polylysine-alginate, etc. These film-forming polymers can be mentioned.
  • the DNA content and dosage in the drug product can be adjusted as appropriate depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but the dosage is usually HCV—HGF (herpes simplex virus).
  • HGF herpes simplex virus
  • _ 1-derived vector with HGF gene introduced 1.5 ⁇ 10 6 pfi! ⁇ 1.5 ⁇ 10 12 pfu, preferably ⁇ 1.5 ⁇ 10 7 pfu ⁇ l .5 ⁇ 10 10 pfu, which is preferably administered once every few days for several days.
  • rat HGF protein cDNA was used as the DNA encoding the HGF protein.
  • the gene sequence of this rat HGF cDNA is as shown in SEQ ID NO: 6.
  • HGF overexpressing transgenic mice which are characterized by the target expression of HGF in postnatal neurons and under the control of the neuron-specific enolase gene promoter, were obtained by the method of Sun et al. Ti. Neuro sci. 2002, 22, 6537-6548). Wild-type litters were used as control lines. All experiments were conducted according to the “Guidelines for Breeding and Using Experimental Animals” of Keio University School of Medicine.
  • T10 10th thoracic vertebra
  • T9 9th thoracic vertebra
  • T11 11th thoracic vertebra
  • a 200 kDyne crush injury model was created using a 1H impactor on the exposed dura mater at the T10 level. After spinal cord injury, the rat muscle layer was sutured at the laminectomy site and the skin was closed with injury clips. Postoperatively, daily 5 ml saline injections and intramuscular antibiotics are given daily until manual urination is restored. Urine was administered twice a day (Fig. 1).
  • mice Due to spinal cord injury in mice, adult NSE-HGF transgenic mice and their wild-type littermates were injected with HSV-HGF or HSV_LacZ 3 days prior to spinal cord injury. That is, the mice were deeply anesthetized, the T10 dura mater was exposed in the same manner as in rats, and 5 ⁇ l of HSV-HGF or HSV-LacZ was injected using a Kopf stereotaxic injector. In the next stage, using 1H impactor caused 60kDyne spinal cord injury
  • HSV1764 / —4 / pRl 9 -HGF viral vector was prepared by the method of Zhao et al. That is, the green fluorescent protein (GFP) gene in HSV1764 / -4 / pR19GFP (j. Neurosci. 2002, 22, 6537-654 8) is replaced with the full-length rat HGF cDNA tagged with KT3 epitope (rat HGFKT3). The reliability of this vector (pR19 rat HGFKT3WPR E) was confirmed by sequence analysis.
  • GFP green fluorescent protein
  • HSV1764Z_4ZpR19_HGF virus was obtained at a concentration of:! ⁇ 2 ⁇ 10 9 pfuZml. This was used in this experiment.
  • Vector suspension 5 ⁇ l was stereotaxically injected into the T10 level of the spinal cord of adult female SD rats using a minipump. Thereafter, over time, the rats were fixed by perfusion in ice-cold 4% paraformaldehyde, and sections were prepared. In order to visualize the expression of lacZ, the injection site and the connection site in the nervous system were defined as 5 mM K Fe (CN), 5 mM K Fe (CN) ⁇ 6 ⁇ 0,
  • the experimental samples were compared with a standard curve prepared by amplifying serial dilutions using the same PCR protocol. To correct for variations in RNA recovery and ensure reverse transcription efficiency, gapdh cDNA was amplified and each cDNA was quantified. The relative number was calculated as the target gene Zgapdh.
  • HGF levels in the tissues were quantified by the method of Funakoshi et al. (Clin Chim Acta, 2003, 327, 1-23) using an anti-rat HGF polyclonal antibody (manufactured by Special Immunology Laboratories).
  • the rat HGF ELISA system specifically detects rat and mouse HGF with similar capabilities. [0039] (Tissue analysis)
  • mice are deeply anesthetized by inhalation of jetyl ether and then in phosphate buffered saline (PBS) 4.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Intracardiac perfusion with / 0 paraformaldehyde solution Three 4mm spinal segments (rostral, middle, caudal) were removed and postfixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 24 hours at 4 ° C.
  • Tissue samples were soaked in 10% -20% sucrose solution in PBS for 24 hours at 4 ° C and embedded in OCT compound (Sakura Fine Technical).
  • the encapsulated tissue was immediately frozen in liquid nitrogen and excised into 8 ⁇ m axial or longitudinal sections. Subsequently, the sections were double-stained with hematoxylin and eosin (HE) and subjected to general histological examination.
  • HE hematoxylin and eosin
  • HGF and c Met mRNA show characteristic changes over time did.
  • HGF and c_MetZHGF receptor are regulated after spinal cord injury using quantitative real-time RT-PCR. That is, an adult female rat was anesthetized and a quantitative spinal cord crush injury was made at the T10 level by the method described in “Materials and Methods”. Sham operated rats were used as controls. After a certain period of time after spinal cord injury, three 4 mm thoracic spinal segments (rostral, middle, caudal) were excised, and total RNA was purified and analyzed for mRNA. As a result of real-time PCR, c Met mRNA levels were significantly increased in rostral fragments 1 and 2 days after spinal cord injury.
  • c_Met is expressed in neurons of control non-injured spinal cord and is induced in reactive astrocytes one week after spinal cord injury in rats.
  • HGF transgenic mice
  • NSE neuron-specific enolase
  • HGF Tg mice
  • induced HGF expression was specifically localized to postnatal neurons, as described in J. Neurosci., 2002, 22, 6537-6548.
  • the NSE-HGF-Tg mouse and its wild-type littermate T10 level produced a 60 kDyne spinal bruise disorder, and histological differences in HE-stained axial and sagittal fragments was analyzed.
  • HGF gene transfer using a HSV1-derived vector that does not have the ability to replicate improves the condition of spinal cord neurons and axons and improves motor function in a rat spinal cord injury model. Promote recovery.
  • HGF overexpression is an artificial approach and is difficult to apply to human patients. For this reason, the present inventors next asked the question of whether the results of NSE-HGF-Tg mice could be reproduced using the ability to transfer HGF using a herpes simplex virus 1-1 vector (HSV) that has no replication ability.
  • HSV herpes simplex virus 1-1 vector
  • Herpes simplex virus type-1 is a neurogenic double-stranded DNA virus that has the ability to incorporate large genes. Therefore, the present inventors used HSV which has no replication ability due to deletion of essential immediate early genes ICP27 and ICP4. This is neuron-specific and lacks HS V replication ability I. Virol., 2001, 75 (9), 4343-4356).
  • HSV1764 / -4 / pR19-HG F virus-derived vector (HSV—HGF) was prepared by the method described in the “Materials and Methods” section.
  • HSV1764 / -4 / pR19-LacZ virus-derived vector (HSV-LacZ) was used as a control.
  • the present inventors first confirmed whether LacZ can be efficiently introduced into spinal cord neurons by inoculating HSV_LacZ directly into the T10 spinal cord of a rat using a stereotaxic injector incorporating a minipump. .
  • ⁇ _gal (i3-galactosidase) staining revealed that many green j3-gal stained LacZ-expressing neurons were clearly visible in the spinal cord 3 days after injection, which resulted in HSV Can be successfully introduced into spinal neurons.
  • HSV—HGF-injected rats and HS V_LacZ-injected rats were induced with 200 kDyne spinal cord bruise using the 1H impactor as described in the “Materials and Methods” section. From the HE-stained fragment of the spinal cord, it was found that the HS V-HGF injection group had a higher proportion of tissues repaired after spinal cord injury and fewer neuronal deaths and axonal degeneration than the HSV_LacZ injection group ( ( Figure 7) In addition, the BBB score showed that the HSV-HGF injection group showed significantly better exercise capacity than the HSV_LacZ injection group (Fig. 8). This indicates that introduction of rat HGF into the spinal cord with HSV-mediated genes is beneficial for neuronal protection and recovery of motor function in a rat model of spinal cord injury.
  • the HGF gene was introduced, but instead of the HGF gene,
  • HGF protein was injured by spinal cord injury. It can be confirmed that it becomes a therapeutic agent.
  • the present invention provides a drug useful for the treatment of spinal cord injury.

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Abstract

　本発明は、脊髄損傷を根本的に治療するのに有効な薬剤を提供することを目的とする。本発明の薬剤は、ＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡを有効成分とする脊髄損傷治療剤である。  

Description

明 細 書
脊髄損傷治療剤
技術分野
[0001] 本発明は脊髄損傷治療剤に関し、更に詳しくは肝細胞増殖因子（以下、 HGFと略 記する。）またはそれをコードする DNAを有効成分とする脊髄損傷治療剤に関する。 背景技術
[0002] 脊髄損傷（spinal cord injury : SCI)とは、交通事故や高所転落に伴う脊脱臼骨折な どの外傷で、脊髄実質が損傷されることにより、損傷部以下の末梢の運動 '感覚'自 律神経系の麻瘅を呈する病態のことである。
現在、脊髄損傷の患者は、 日本では約 10万人、米国では 25万人に及ぶとされて おり、年間日本では 5千人、米国では 1万人以上の患者が増加している。
[0003] 近年医療の進歩に伴い受傷後の生存率は上昇し、障害の進行を抑えるべく脊椎 骨損傷の再建手術の方法も飛躍的に進歩してきた。したがって、 2次的な神経症状 の増悪を抑えることも成功しはじめている。さらに、リハビリテーションによる機能回復 訓練技術の向上や補助器具 (電動車レ、す等)の開発等により、患者の日常生活動作 (ADUが向上してきてはいる。しかし、根本的な脊髄損傷自体 (神経損傷からの神 経保護 ·再生)への有効な治療法がなレ、ために、 自立した排尿 ·排便 ·手作業や歩行 が不能な患者が大量に存在しているのが現状である。
[0004] 一方、 HGFは、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイト一ジェンとして同定され、
1989年にその遺伝子クローユングがなされた（非特許文献 1、 2)。 HGFは肝細胞増 殖因子として発見されたが、ノックアウト/ノックインマウスの手法を含む発現および 機能的解析における近年の多数の研究により、 HGFは新規な神経栄養因子である ことも明らかにされた (非特許文献 3、 4)。
[0005] なお、特許文献 1には、パーキンソン病モデルラットを用いて、 HGF遺伝子のモデ ルラットへの作用効果を行動学的におよび組織学的に検討した実施例が示されてお り、 HGF遺伝子の前投与により中脳黒質ドーパミンニューロンを神経毒 6— OHDA 力 保護し、パーキンソン病モデルラットの症状を抑えたとの実験結果が示されてレ、 る。そして、この特許文献 1では、このような実験結果に基づいて、 HGF遺伝子がパ 一キンソン病のみならず、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線 条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン舞踏病、シャイ'ドレーガー症候群 、シャルコー ·マリー ·トース病、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輸 閉塞症、アミロイド一シス、ピック病、スモン病、皮膚筋炎'多発性筋炎、クロイツフエ ルド ·ャコブ病、ベーチェット病、全身性エリテマドーデス、サルコイドーシス、結節性 動脈周囲炎、後縦靭帯骨化症、広範性脊柱狭窄症、混合性結合組織病、糖尿病性 末梢神経炎、虚血性脳血管障害 (脳梗塞、脳出血など)などの神経疾患の治療にも 適用できるとし、力かる神経疾患の 1つとして脊髄損傷も挙げられている。
[0006] し力 ながら、パーキンソン病は中脳黒質部のドーパミン作動性ニューロンという特 定種のニューロンが選択的に脱落する神経変性疾患であるのに対して、脊髄損傷は 主に外傷により脊髄内の多くの種類のニューロンゃグリアが広汎に非選択的に傷害 される疾患であり、臨床的には全く異なる病態を示す。このため、パーキンソン病モデ ルラットの上記実験結果のみから、脊髄損傷の治療に有効であるとは到底いえず、ま た有効であったとする報告もなレ、。
特許文献 1： WO2003/045439
非特許文献 l : Biochem. Biophys. Res. Commun. , 122, 1450- 1459 (1984 )
非特許文献 2 : Nature, 342, 440-443 (1989)
非特許文献 3 : Nat. Neurosci.， 2, 213- 217 (1999)
非特許文献 4 : Clin. Chim. Acta.， 327, 1— 23 (2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は、脊髄損傷を根本的に治療するのに有効な薬剤を提供するもので ある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、 HGF蛋白質また はそれをコードする DNAが脊髄損傷に対して優れた治療効果を奏することを見出し 、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。
[0009] すなわち、本発明は、
(1) HGF蛋白質またはそれをコードする DNAを有効成分とする脊髄損傷治療剤、
(2)有効成分が HGF蛋白質である前記（1)記載の治療剤、
(3)有効成分が HGF蛋白質をコードする DNAである前記（1)記載の治療剤、
(4) HGF力 配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号 1又 は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であって H GFとして作用する蛋白質、又はこれらの部分ペプチドであって HGFとして作用する ペプチドである前記（2)記載の治療剤、
(5) HGF蛋白質をコードする DNAが、配列番号 3又は 4で表される塩基配列からな る DNA、あるいは配列番号 3又は 4で表される塩基配列からなる DNAと相補的な塩 基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGFとして 作用する蛋白質をコードする DNAである前記（3)記載の治療剤、
(6)脊髄損傷部位に局所適用するための前記（1)〜（5)のいずれかに記載の治療 剤、
(7)髄腔内投与用注射剤の剤型である前記（6)記載の治療剤、
(8)脊髄損傷患者に有効量の HGF蛋白質またはそれをコードする DNAを投与する ことを特徴とする脊髄損傷治療方法、および
(9)脊髄損傷治療剤を製造するための HGF蛋白質またはそれをコードする DNAの 使用、
に関する。
発明の効果
[0010] 本発明の治療剤は、脊髄損傷に対して極めて優れた治療効果を発揮するものであ る。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1は脊髄損傷のラットモデルを模式的に示した図である。 成体雌性ラットを 深く麻酔し、脊髄の T10レベルで IHインパクターを用いて、 200kDyneの定量的脊 髄圧挫損傷を作成した。 4mmの断片（吻側、中央、尾側）を切除した。この断片は免 疫染色に用いると共に、 SCIから一定時間後に HGFおよび c_Metの定量的リアル タイム RT_ PCRを行うために用いた。
[図 2]ラットの脊髄損傷後の脊髄における c_Metおよび HGFの mRNAの発現変化 を示す線図である。 全 RNAを SCIから一定時間後に脊髄の各断片（吻側、中央、 尾側）から精製し、 c_met (A)および hgf (B)の定量的リアルタイム RT—PCRを後 記実施例の"材料および方法"の項で記載した方法で実施した。 GAPDHをコント口 ールとして使用した。
[図 3]正常な脊髄ニューロンにおいて発現される c Metと、反応性星状細胞におい てラット脊髄損傷 1週間後に誘導される c— Metを示す写真である。 定量的脊髄圧 挫損傷（200kDyne)を"材料および方法"の項で記載した方法で成体雌性 SDラット の脊髄の T10レベルで作成した。ニューロンマーカー NeuNと星状細胞マーカー GF APを用いる c— Metの二重標識免疫染色を正常コントロールラットと SCIラットで実 施した。 （A) :コントロールラットの脊髄、（B) : SCIから 1週間後の障害ラットの脊髄 園 4]NSE— HGFマウスと野生型同腹子との、脊髄損傷後に補修した組織を示す写 真である。 定量的脊髄圧挫損傷（200kDyne)を"材料および方法"の項で記載し た方法で NSE— HGF— Tgおよび野生型同腹子の脊髄の T10レベルで作成し、 H E染色した軸索断片および矢状断片を作成した。 Wt :野生型同腹子、 NSE-HGF ： NSE-HGF-Tg
[図 5]NSE_HGFトランスジヱニックマウスと野生型同腹子との、脊髄損傷後の BBB スコアを示す線図である。 定量的脊髄圧挫損傷（200kDyne)を"材料および方法'' の項で記載した方法で NSE_HGF_Tgおよび野生型同腹子の脊髄の T10レベル で作成し、後肢運動機能を所定時間に BBBスコアで分析した。 Wt :野生型同腹子、 NSE-HGF : NSE-HGF-Tg
園 6]複製能力のない HSV_LacZを脊髄に注入し、その 3日後に β—gal染色した 矢状断片の写真である。 HSV_LacZ (l . 5 X 109pfuZml) 5 μ 1を、深麻酔下に、 成体ラットの脊髄 (T10レベル）に、ミニポンプを用いて定位固定的に注入した。注入 3日後、ラットを PBS中の 4%パラホルムアルデヒドで灌流し、 PBS中の 20%シュクロ ース溶液でクレオプロテクションし、冷凍断片を作成した。ついで、 HSV— LacZベタ ターに起因する j3 _ガラクトシダーゼ発現を j3 _gal染色した。
[図 7]脊髄損傷 3日前に投与した HSV—HGF注入群と HSV_LacZ注入群の HE 染色した軸索断片と矢状断片を示す写真である。 HSV— HGF注入または HSV_ LacZ注入 3日後に、定量的脊髄圧挫損傷（200kDyne)を"材料および方法"の項 で記載した方法で、成体雌性 SDラットの脊髄の T10レベルで作成し、 SCIから 1週 間後に、 HE染色した軸索断片および矢状断片を作成した。 HSV_Lac : SCIの 3日 前に HSV_Lacを前注射した脊髄、 HSV— HGF : SCI3日前に HSV—HGFを前 注射した脊髄。
[図 8]HSV— HGF注入群と HSV— LacZ注入群における BBBスコアを示す線図で ある。 HSV— HGFまたは HSV— LacZを SCIの 3日前に前注射した成体雌性 SD ラットの脊髄の T10レベルで、定量的脊髄圧挫損傷（200kDyne)を"材料および方 法"の項で記載した方法で作成し、 SCIから一定時間後に後肢運動機能を BBBスコ ァにより分析した。 LacZ : HSV— LacZ前注射群、 HGF： HSV— HGF前注射群。 発明を実施するための最良の形態
本発明で使用される HGF蛋白質は公知物質であり、医薬として使用できる程度に 精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。 HGF 蛋白質の製造方法としては、例えば HGF蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細 胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該 HGF蛋白質を得ることができる。ある いは遺伝子工学的手法により HGF蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに 組み込み、これを適当な宿主細胞に揷入して形質転換し、この形質転換体の培養上 清から目的とする組換え HGF蛋白質を得ることもできる。 （例えば、特開平 5— 1113 82号公報、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989年、第 163卷， p. 967等 を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いら れている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いることができ る。このようにして得られた HGF蛋白質は、天然型 HGF蛋白質と実質的に同じ作用 を有する限り、そのアミノ酸配列中の 1若しくは複数個〔例えば、数個（例えば：!〜 8個 ；以下同様である。）〕のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよぐまた同 様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。そのような HGF蛋白質として 、下記する 5アミノ酸欠損型 HGF蛋白質を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列 について、「1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子ェ 学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に 生じうる程度の数（1〜数個）が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する 。糖鎖が置換、欠失若しくは付加した HGF蛋白質とは、例えば天然の HGF蛋白質 に付加してレ、る糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させた HGF蛋白質、また糖鎖が 付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然 の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施され たもの等をいう。
さらに、 HGF蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上の相同性を有する蛋白 質、好ましくは約 90%以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約 95%以上の 相同性を有する蛋白質であって、かつ HGFとして作用する蛋白質も含まれる。上記 アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各 々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
上記 HGF蛋白質としては、例えば配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列等が挙 げられる。配列番号 2で表される HGF蛋白質は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列 の 161〜165番目の 5個のアミノ酸残基が欠失している 5アミノ酸欠損型 HGF蛋白質 である。配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由 来の天然 HGF蛋白質であって、 HGFとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を 有する。
配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む 蛋白質としては、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上、 好ましくは約 90。/o以上、より好ましくは約 95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を 含む蛋白質、例えば配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列から、 1〜数個のァミノ 酸残基を揷入又は欠失させたアミノ酸配歹' J、 1〜数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸 残基と置換させたアミノ酸配列又は 1〜数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配 列等を含む蛋白質であって HGFとして作用する蛋白質であることが好ましい。揷入さ れるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる 20種類のアミノ酸 以外の非天然アミノ酸であってもよレ、。非天然アミノ酸は、ァミノ基とカルボキシル基 を有する限りどのような化合物でもよいが、例えば γ—ァミノ酪酸等が挙げられる。 これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい。
[0014] 本発明に用いられる HGF蛋白質は、 C末端がカルボキシル基（_C〇OH)、カル ボキシレート（一 CO〇_)、アミド（一 CONH )又はエステル（一 COOR)のいずれで
2
あってもよレ、。ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチノレ、ェチル、 n—プロピ ノレ、イソプロピルもしくは n_ブチル等の C アルキル基、例えば、シクロペンチル、
1 -6
シクロへキシル等の C シクロアルキル基、例えば、フエ二ノレ、 α ナフチル等の C
3-8 6 ァリール基、例えば、ベンジル、フエネチル等のフエ二ルー C アルキル基もしく 12 1 -2
は α ナフチルメチル等の α—ナフチノレー C アルキル基等の C ァラルキル基
1 - 2 7- 14
のほか、ビバロイルォキシメチル基等が用いられる。本発明で用いられる HGF蛋白 質力 C末端以外にカルボキシノレ基（又はカルボキシレート）を有している場合、カル ボキシノレ基がアミド化又はエステル化されているものも本発明における HGF蛋白質 に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のエステル等が用 レヽられる。さらに、本発明に用いられる HGF蛋白質には、上記した蛋白質において、 Ν末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、ァセチル等の C
2- アルカノィル基等の C アシノレ基等）で保護されているもの、 Ν末端側が生体内で
6 1 -6
切断され生成したダルタミル基がピログノレタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側 鎖上の官能基 (例えば、 ΟΗ、— SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グ ァニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、ァセチル等の C ァノレカノイノレ
2-6
基等の C アシノレ基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖
1 -6
蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
[0015] 本発明で用いる HGF蛋白質の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合 がある。）としては、上記した HGF蛋白質の部分ペプチドであればいずれのものであ つてもよレ、。本発明において、部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した HGF蛋白質 の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約 20個以上、好ましくは約 50個以上、より好まし くは約 100個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。本発明の部分 ペプチドにおいては、 C末端がカルボキシル基（一 COOH)、カルボキシレート（—C 〇0一）、アミド（一 C〇NH )又はエステル（一C〇OR)のいずれであってもよレ、。さら
2
に、部分ペプチドには、上記した HGF蛋白質と同様に、 N末端のメチォニン残基の ァミノ基が保護基で保護されてレ、るもの、 N端側が生体内で切断され生成した Ginが ピログノレタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の官能基が適当な保護基で 保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド 等も含まれる。
[0016] 本発明に用いられる HGF蛋白質又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基 との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩 が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素 酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ レイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸 、ベンゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。
[0017] 本発明に用いられる HGF蛋白質の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチド の合成法に従って、あるいは HGF蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断することによ つて製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合 成法のいずれでも良い。すなわち、 HGF蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくは アミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離す ることにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱 離としては、例えば、 M. Bodanszky及び M. A.〇ndetti、ペプチド 'シンセシス（P eptide Synthesis; , Interscience Publishers, New York (1966^) ^ Schro eder及び Luebke、ザ'ペプチド (The Peptide) , Academic Press, NewYork (1965年)等に記載された方法が挙げられる。反応後は通常の精製方法、例えば、 溶媒抽出 '蒸留'カラムクロマトグラフィー ·液体クロマトグラフィー '再結晶等を組み合 わせて HGF蛋白質の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られ る部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換するこ とができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換すること ができる。
[0018] 本発明の治療剤は、 HGF蛋白質をコードする DNAを有効成分として含有すること もできる。
HGF蛋白質をコードする DNAとしては、例えば、配列番号 3又は 4で表わされる塩 基配列を有する DNA、又は配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列を有する DNA と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aであって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲ ン活性等を有する蛋白質をコードする DNA等が挙げられる。なお、配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列を有する DNAとハイブリダィズする DNAとは、例えば上記 DNAをプローブとして、コロニ^ ~ ·ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク'ノヽイブリダィゼ ーシヨン法あるいはサザンブロットノヽイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得ら れる DNAを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化 したフィルターを用いて、約 0. 7〜： 1. 0M程度の塩化ナトリウム存在下、約 65°C程度 でハイブリダィゼーシヨンを行った後、約 0.：!〜 2倍程度の濃度の SSC溶液（1倍濃 度の SSC溶液の組成は、 150mM 塩化ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムより なる。）を用い、約 65°C程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる D NAを挙げることができる。
[0019] 上記の配列番号 3又は 4で表される塩基配列を有する DNAとハイブリダィズする D NAとして具体的には、配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列と約 80%以上、好ま しくは約 90 %以上、より好ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を有する DNA等が挙げられる。ハイブリダィゼーシヨンは、公知の方法、例えば、モレキュラー 'クロ1 ~ニンク、、 (Molecular Cloning, A laboratory Manual, Third Edition (J. Sambrook et al. ， Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001 :以下、モレ キユラ一 'クローニング第 3版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。ま た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って 行うことができる。
[0020] さらに、本発明の HGF蛋白質をコードする DNAは上記に限定されず、発現する蛋 白質が HGF蛋白質と実質的に同じ作用を有する DNAである限り、本発明の HGF 蛋白質をコードする DNAとして使用できる。例えば HGF蛋白質の部分ペプチドをコ ードする DNA等も HGFとしての作用を有する部分ペプチドをコードするものであれ ば、本発明の HGF蛋白質をコードする DNAの範疇に含まれる。 HGF蛋白質の部 分ペプチドをコードする DNAとしては、上記した部分ペプチドをコードする塩基配列 を有する DNAであればいかなるものであってもよレ、。また、上記の HGF蛋白質をコ ードする DNAと同様に、ゲノム DNA、ゲノム DNAライブラリー、上記した細胞'組織 由来の cDNA、上記した細胞.組織由来の cDNAライブラリー、合成 DNAのいずれ でもよレ、。ライブラリーに使用するベクターは、バタテリオファージ、プラスミド、コスミド 、ファージミド等いずれであってもよレ、。また、上記した細胞 ·組織より mRNA画分を 調製したものを用いて、直接 RT— PCR法によって増幅することもできる。具体的な本 発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、例えば、（a)配列番号 3又は 4で表 わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 (b)配列番号 3又 は 4で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNAと相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであつ て、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNA、又は上 記（a)或いは (b)の部分塩基配列を有する DNA等が挙げられる。
該 DNAは、例えば通常のハイブリダィゼーシヨン法や PCR法等により容易に得るこ とができ、該 DNAの取得は具体的には前記 Molecular Cloning等の基本書等を 参考にして行うことができる。
[0021] なお、本発明で用いられる HGF蛋白質またはそれをコードする DNAは、ヒトに適 用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物に 由来する HGF蛋白質またはそれをコードする DNAであってもよレ、。たとえば、ラット 由来の HGF蛋白質は配列番号 5で表され、ラット HGF蛋白質をコードする DNAは 配列番号 6で表される。
また、本発明で用いられる HGF蛋白質又は部分ペプチドをコードする RNAも、逆 転写酵素により HGF蛋白質又は部分ペプチドを発現することができるものであれば 、本発明に用いることができ、本発明の範囲内である。また該 RN Aも公知の手段によ り得ること力 Sできる。
[0022] 本発明の脊髄損傷治療剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、ゥシ 、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ィヌ、ネコなど）にも適用できる。 本発明の脊髄損傷治療剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方法、投 与量などは、有効成分が HGF蛋白質の場合と、 HGF蛋白質をコードする DNAの場 合と若干異なる。
たとえば、有効成分が HGF蛋白質である場合は、種々の製剤形態、例えば液剤、 固形剤等をとりうるが、一般的には HGF蛋白質のみ又はそれと慣用の担体と共に注 射剤、噴射剤、徐放性製剤 (例えば、デポ剤)などとされる。上記注射剤は、水性注 射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従つ て、例えば、水性溶媒 (注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば 等張化剤（塩ィ匕ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ 酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液
、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、 ィプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラォキシ安息香酸メチル、パラォキ シ安息香酸ェチル、パラォキシ安息香酸プロピル、パラォキシ安息香酸プチル、クロ ロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニゥム、デヒドロ酢酸ナトリウム、 ェデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキ シプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤 (亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、 ァスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又は pH調整剤（塩酸、水酸化ナトリ ゥム、リン酸、酢酸等）などを適宜添加した溶液に、 HGF蛋白質を溶解した後、フィル ター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することが できる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール (エタノール等）、ポリアルコール（ プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリカレ ペート 80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 50等）などを使用してもよい。油性注射 剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補 助剤として安息香酸ベンジル又はべンジルアルコール等を使用してもよい。調製され た注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアルに充填される。注射剤中の HGF蛋 白質含量 fま、通常約 0. 0002〜0. 2w/v0/0程度、好ましく ίま糸勺 0. 001〜0. lw/v %程度に調整される。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等に より水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水 等を加え、再溶解して使用される。
[0024] 噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する 場合、その添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれ のものであってもよぐ例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張 化剤、 pH調整剤などが用いられる。噴射剤としては、液化ガス噴射剤又は圧縮ガス 等が用いられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（HCFC22、 H CFC— 123、 HCFC— 134a、 HCFC142等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチ ルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸 化窒素ガス等）又は不溶性ガス（窒素ガス等）などが挙げられる。
[0025] また、本発明で用いられる HGF蛋白質は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤
(例えばデポ剤）とすることもできる。 HGF蛋白質は特にデポ剤とすることにより、投薬 回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製 剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内 分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のな力から適宜選択できるが、例え ばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類、コラーゲン又はゼラチン等の蛋白 質、ポリグノレタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチォニン等のポ リアミノ酸、ポリ乳酸、ポリダリコール酸、乳酸'グリコール酸重合体又は共重合体、ポ リカプロラタトン、ポリ— /3 —ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸 'ポリエチレングリコール.ビュルピロリドン共重合体等のポリエステル、ポリオルソエス テル又はポリメチル一ひ一シァノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸、ポリエ チレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等である。 好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸 ·グリコール酸重合体又は 共重合体である。ポリ乳酸ーグリコール酸重合体又は共重合体を使用する場合、そ の組成比（乳酸/ダリコール酸）（モル％)は徐放期間によって異なるが、例えば徐放 期間が約 2週間ないし 3力月、好ましくは約 2週間ないし 1力月の場合には、約 100Z 0ないし 50/50である。該ポリ乳酸—グリコール酸重合体又は共重合体の重量平均 分子量は、一般的には約 5, 000ないし 20, 000である。ポリ乳酸ーグリコール酸共 重合体は、公知の製造法、例えば特開昭 61— 28521号公報に記載の製造法に従 つて製造できる。生体分解性高分子と HGF蛋白質の配合比率は特に限定はないが 、例えば生体分解性高分子に対して、 HGF蛋白質が約 0. 0：!〜 30wZw%程度で ある。
[0026] 投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤を直接脊髄損傷のある組織に直接注射（ 髄腔内（intrathecal)投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与など)もしくは噴霧す るカ あるいは徐放性製剤（デポ剤）を脊髄損傷のある組織に近い部位に埋め込む のが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択さ れる力 通常、 1回当たり l i g〜500mgヽ好ましくは 10 /i g〜50mgである。また、投 与回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、 1回投与とするか、 ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は 1日 1 回から数ケ月に 1回でよぐ例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与や徐放性ポンプ による髄腔内持続投与の場合は、数ケ月に 1回でもよい。なお、投与方法は、前記の とおり局所投与が望ましいが、筋肉内投与、皮下投与、点滴投与などでも可能である
[0027] —方、有効成分が HGF蛋白質をコードする DNAである場合は、その投与形態とし ては非ウィルスベクターを用いる場合と、ウィルスベクターを用いる場合とに別れ、そ の投与方法は常法により行うことができる。
非ウィルスベクターを用いる場合は、慣用の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組 換え発現ベクターを用いて脊髄損傷の組織へ導入される。組織への遺伝子導入法と しては、内包型リボソームによる遺伝子導入法、静電気型リボソームによる遺伝子導 入法、 HVJ—リボソーム法、 HVC— Eベクターを用いる方法、改良型 HVJ—リポソ一 ム法、 HVC— Eベクターを用いる方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーテイク ル銃で担体と共に DNA分子を細胞に移入する方法、 naked— DNAの直接導入法 、正電荷ポリマーによる導入法などに供することにより、組換え発現ベクターを脊髄神 経細胞などの細胞に取り込ませることができる。
[0028] また、ウィルスベクターを用いる場合は、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオ ゥイノレス、シンビスウィルス、センダイウィルス、 SV40、免疫不全症ウィルス（HIV)な どの DNAウィルスまたは RNAウィルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換え ウィルスを感染させることにより、細胞内に HGF蛋白質をコードする DNAを導入する ことが可能である。
[0029] 本発明の遺伝子治療剤の患者への適用法は、該治療剤を直接脊髄損傷のある組 織 (例えば、髄腔内）に直接導入する in vivo法、および該組織から細胞を取り出し 体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を脊髄損傷のある部位へ戻す ex vivo法がある。本発明では in vivo法が好ましい。
[0030] HGF蛋白質をコードする DNAを患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医 学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社， 1996、別冊実験医学，遺伝子導入 &発現解 析実験法，羊土社， 1997、 日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブッ ク、ェヌ ·ティー ·エス， 1999等に記載の方法に従って、行うこと力 Sできる。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態 (例えば、 注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）、マイクロカプセル剤など）をとり得ることがで きる。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤 (デポ剤）は HGF蛋白質の場合と同様にして調 製できる。また、マイクロカプセル剤とする場合、例えば HGF蛋白質をコードする DN A若しくは HGF蛋白質をコードする DNAを含む発現プラスミドを導入した宿主細胞 等を芯物質としてこれを公知の方法（例えばコアセルべーシヨン法、界面重合法又は 二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約 1〜500、好ましくは約 10 0〜400 x mの微粒子として製造することができる。被膜物質としては、カルボキシメ チノレセノレロース、セノレロースアセテートフタレート、ェチノレセノレロース、ァノレギン酸又 はその塩、ゼラチン、ゼラチン 'アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビュルアルコール 又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン—アルギン 酸塩、硫酸セルロース一ポリ（ジメチルジァリル）アンモニゥムクロライド、ヒドロキシェ チルメタタリレート一メチルメタタリレート、キトサン一カルボキシメチルセルロース、ァ ルギン酸塩—ポリリジン—アルギン酸塩等の膜形成性高分子が挙げられる。
製剤中の DNAの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により 適宜調節することができるが、投与量は、通常、 HCV— HGF (ヘルぺス単純ウィルス _ 1由来ベクターに HGF遺伝子を導入したもの)に換算して、 1. 5 X 106pfi！〜 1. 5 X 1012pfu、好ましく ίま 1. 5 X 107pfu〜l . 5 X 1010pfuであり、これを数日なレヽし数 ヶ月に 1回投与するのが好ましい。
[0031] 以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるもので はない。
また、以下の実施例においては、 HGF蛋白質をコードする DNAは、ラット HGF蛋白 質の cDNAを用いた。このラット HGFcDNAの遺伝子配列は配列番号 6の通りであ る。
実施例
[0032] [材料および方法]
(試験動物）
妊娠正期の SDラットを、 12時間明 · 12時間喑サイクル下にある温度調整された部 屋で個々の飼育箱で飼育した。一方、生後ニューロン中の HGFの目標発現に特徴 を有し、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーターのコントロール下にある HG F過剰発現トランスジエニックマウス（NSE— HGF— Tg)を、 Sunらの方法 ti. Neuro sci. 2002, 22, 6537— 6548)によって作成した。野生型同腹子をコントローノレとし て使用した。全ての実験は慶應義塾大学医学部の"実験動物の飼育と使用ガイドラ イン"に従って実施した。
[0033] (脊髄損傷動物の調製）
ラットに脊髄損傷を生じさせるために、成体雌性 SDラットをケタミンおよびキシラジ ンの腹腔内投与により麻酔し、第 10胸椎 (以下、 T10という。）の椎弓および棘突起 を除去して硬膜の環状部位を露出させた。第 9胸椎 (以下、 T9という。）および第 11 胸椎 (以下、 T11という。）の棘突起を組織鉗子で挟みつけ、ついでそれをコプフ（K opf)のラット脊椎止め具で固定して脊柱を安定化させた。棘突起によりラットの胸部 が懸垂するように止め具を上昇させた。 T10レベルの露出した硬膜上に 1Hインパク ターを用いて 200kDyneの圧挫損傷モデルを作成した。脊髄損傷後、ラットの筋層 を椎弓切除部位で縫合し、皮膚を損傷クリップで閉じた。術後、生理食塩水 5mlの皮 下注射と抗生物質の筋肉内注射を毎日行い、排尿反射が回復するまで、用手的排 尿を 1日 2回施行した（図 1)。
[0034] マウスの脊髄損傷のために、成体 NSE— HGFトランスジエニックマウスおよびそれ の野生型同腹子に HSV—HGFまたは HSV_LacZを脊髄損傷 3日前に注射した。 すなわち、マウスを深く麻酔し、 T10硬膜をラットの場合と同様にして露出させ、 5 μ 1 の HSV— HGFまたは HSV— LacZをコプフ（Kopf)の定位固定インジェクターを用 レ、て注射した。次レ、で 1Hインパクターを用いて 60kDyneの脊髄損傷を引き起こした
[0035] (HSV調製とそのインビボ遺伝子導入）
HSV1764/— 4/pRl 9 - HGFウィルスベクターを Zhaoらの方法で調製した。 すなわち、 HSV1764/-4/pR19GFP (j. Neurosci. 2002, 22, 6537-654 8)中の緑色蛍光蛋白質（GFP)遺伝子を、 KT3ェピトープ（ラット HGFKT3)でタグ ィ匕した全長ラット HGFcDNAで置き換え，このベクター（pR19ラット HGFKT3WPR E)の信頼性をシークェンス分析で確認した。そしてプラスミド pR19ラット HGFKT3 WPREの DNAと HSV1764/— 4/pR19GFPウィルス DNAのコトランスフエクショ ンにより M49細胞において相同組み換えを実施した。 白色プラークを選択し、 3回精 製し、抗ラット HGFポリクローナル抗体を用いる免疫染色法で、パルマー（Palmer) らの方法 ϋ. Virol. , 2000, 74, 5604— 5618) ίこより、複製會力のなレヽウイ/レスを 増殖させた。 pR19ラット HGFKT3WPREの HSV— 1ウィルスで感染させた Μ49細 胞のならし培地中で、ラット HGF— KT3の発現と産生をウェスターンブロット分析お よびラット HGFの ELISAにより確認した。最終的に、：!〜 2 X 109pfuZmlの濃度で HSV1764Z_4ZpR19 _HGFウィルス（HSV— HGF)を得た。これを本実験に 用いた。
[0036] 成体雌性 SDラットの脊髄の T10レベルの箇所に、ミニポンプを用いてベクター懸 濁液 5 μ 1を定位注射した。その後経時的に、ラットを氷冷した 4%パラホルムアルデヒ ド中で灌流固定し、切片を作成した。 lacZ発現を視覚化するために、注射部位およ び神経系内での接続部位を、 5mM K Fe (CN) 、 5mM K Fe (CN) 〇· 6Η 0、
3 6 4 6 2
ImM MgCl、および 150 x gZmlの 4_クロ口一 5_ブロモ _ 3_インドリル一ガラ
2
クトシダーゼ (X— Gal)を含む 1 Xリン酸緩衝化生理食塩水（PBS)で染色した。 [0037] (定量的リアルタイム RT PCR)
障害を受けた脊髄または擬似手術された脊髄の近位、中位および遠位切片 (各 4 mm)から、障害後所定時間後に、イソゲン (ISOGEN)試薬（日本ジーン社製)を用 いて、全 RNAを採取した。全 RNAのうち、 RNase無含有の DNase Iで前処理した 1 μ gを、 Superscript II逆転写酵素（ライフ テクノロジ一社製）を用いてランダムへ キサプライマーにより逆転写して第 1鎖 cDNAとした。 PRISM7000リアノレタイム PC Rシステム (ABI社製）を用いて増幅とオンライン定量を行った。リアルタイム PCR用 のプライマーおよびプローブ、 HGF、 Met,および GAPDHは ABI社から入手した。 プライマーおよびマウス HGFの TaqMan蛍光プローブ（パーキン 'エルマ一'バイオ システムズ社製）のための配列は次の通りである。
マウス HGFフォワードプライマー：
5，- AAG AGT GGC ATC AAG TGC CAG- 3'
配列番号 7
リバースプライマー：
5，— CTG GAT TGC TTG TGA AAC ACC—3'
配列番号 8
プローブ：
5' (FAM)-TGA TCC CCC ATG AAC ACA GCT TTT TG— (TAMARA)3， 配列番号 9
実験サンプルは、同じ PCRプロトコールを用レ、、連続希釈物を増幅することによつ て作成した標準曲線と対比した。 RNA回収における変動を是正し逆転写の効率を 確実にするために、 gapdh cDNAを増幅して、各 cDNAを定量した。相対的な数を 目的遺伝子 Zgapdhとして算出した。
[0038] (HGFの固相酵素免疫検定法 (ELISA)分析）
組織中の HGFレベルを，抗ラット HGFポリクローナル抗体 (特殊免疫研究所社製） を用い、船越らの方法（Clin Chim Acta, 2003, 327, 1— 23)により定量した。 ラット HGF ELISAシステムは同様のァフィ二ティーでもって、ラットおよびマウスの HGFを特異的に検出する。 [0039] (組織解析）
脊髄損傷もしくは擬似手術から一定時間後、マウスをジェチルエーテル吸入により 深く麻酔し、次いでリン酸緩衝化生理食塩水（PBS)中 4。/0パラホルムアルデヒド溶液 で心臓内灌流した。 3つの 4mm脊椎断片（吻側、中央、尾側）を取り出し、 PBS中 4 %パラホルムアルデヒドで 24時間、 4°Cで後固定（postfixed)した。組織サンプルを P BS中 10%〜20%シュクロース溶液に 24時間 4°Cで浸漬し、 OCTコンパゥンド（サク ラファインテクニカル社）中に包埋した。包坦組織を液体窒素中で直ちに凍結し、 8 μ mの軸方向もしくは長手方向の切片に切除した。ついで、切片をへマトキリンおよび ェォシン (HE)で二重染色し、一般の組織検査を行った。
[0040] (免疫組織化学）
特異的抗体：（1)モノクローナル抗 NeuN抗体（1 : 500希釈）、（2)モノクローナル 抗 GFAP抗体（1 : 500希釈）（ケミコン'インターナショナル社製）、（3)ポリクローナル 抗 c— Met抗体（1 : 50希釈）（サンタ'クルツ'バイオテック社製）で切片を染色した。 すなわち、 PBS中 5%ャギ血清 · 0. 1 %トリトン X— 100で室温 1時間ブロッキングを 行った後、前記の抗体を 4°Cで一晩切片に適用した。この切片を PBSで洗浄後、 A1 exa488 (緑）または Alexa546 (赤）フルォレツセンス（1 : 1 , 000希釈）で標識した二 次抗体を用い、室温 1時間インキュベートして免疫反応性を視覚化した。 Hoechst3 3342 (10 μ Μ)を用いるカウンター染色を実施して核形態を視覚化した。蛍光免疫 染色した切片を蛍光顕微鏡で観察した。
[0041] (行動分析）
脊髄損傷から一定時間後に、 Basso _Beattie _Bresnahan (BBB)運動評価ス ケール (J. Neurotrauma, 1995, 12, 1— 21)を用いて、ラットまたはマウスの行動 機能を評価した。
[0042] (統計解析）
統計解析は Statview software package (SAS社製）を用いて実施し、統計的 差分は対応のなレ、 t_検定により評価した。
[0043] [結果]
1)ラットの脊髄損傷後、 HGFおよび c Metの mRNAは特徴的な経時的変化を示 した。
脊髄損傷における HGFの役割を調べるために、 HGFおよび c_MetZHGFレセ プターの mRNAが脊髄損傷後に調節されているかどうかを定量的リアルタイム RT— PCRを用いて検討した。すなわち、成体雌性ラットを麻酔し、 "材料および方法"の項 で述べた方法により、定量的脊髄圧挫損傷を T10レベルで作成した。擬似手術ラット をコントロールとした。脊髄損傷から一定時間後に、 3つの 4mm胸部脊椎断片（吻側 、中央、尾側）を切除し、全 RNAを精製し、 mRNA分析した。リアルタイム PCRの結 果、脊髄損傷から 1日および 2日後に、吻側断片において、 c Metの mRNAレべ ルが著しく増大した。その後、脊髄損傷から 1週間まで c Metの mRNAレベルは減 少したが、コントロールの非障害脊髄のそれよりも高いレベルで維持された。 c Met の mRNAは脊髄損傷から 2および 3週間後に再び上昇し、そのレベルはコントロール の非障害脊髄に較べて 3倍になった（図 2A)。他方、 HGFの mRNAレベルは脊髄 の中央断片において、緩やかに上昇した。 HGFの mRNAレベルは脊髄損傷後 1〜 2週間で特に高い値であった。吻側および尾側の脊髄断片において、 HGF mRN Aレベルは障害後わずかに上昇しただけであった（図 2B)。これらの知見は、脊髄損 傷後の脊髄における HGFおよび c Metの誘導を明らかに示しており、かつ障害由 来栄養因子としての機能を果たしている可能性を高めている。し力しながら、 c-Met の高度の誘導とは対照的に、障害から:!〜 3日後の初期時点での著しい HGF誘導 の欠如は、脊髄損傷後の初期の時点において HGFが不十分なレベルで存在するこ とを示唆しており、注目に値する。
2) c_Metは、コントロールの非障害脊髄のニューロンで発現しラットで脊髄損傷か ら 1週間後に反応性星状細胞において誘導される。
c_Metおよび NeuN (ニューロンマーカー）または星状細胞マーカーのいずれか とを二重免疫染色することにより、脊髄損傷後にどのタイプの細胞が HGF機能にか かわっているかを調べた。蛍光免疫染色により、 c_Met免疫反応性（c_Met_IR) が正常な脊髄の NeuN 陽性のニューロンに存在していることが明らかになった。免 疫反応性は大運動ニューロンにおいてより大きかった。。_1^6 _11¾は0 八？陽性 の星状細胞には存在していな力 た（図 3A)。これとは対照的に、 c— Met— IRは損 傷から 1週間後に反応性星状細胞において誘導された（図 3B)。この知見は、 ALS 力 入手したマウスモデルの反応性星状細胞における c_ Metの誘導 ti. Neurosci .， 2002, 22, 6537— 6548)と一致しており、脊髓ニューロンおよび反応†生星状糸田 胞における脊髄損傷後の HGFに対する役割を示唆している。
[0045] 3) HGFのニューロン特異的なトランスジェニック渦剰発現が脊髄組織像と運動機能 瞳害を B女善する。
脊髄損傷後の脊髄ニューロンにおける HGFの役割を直接評価するために、本発 明者らはニューロン特異的エノラーゼ（NSE)遺伝子プロモーターのコントロール下 にある HGFを過剰発現しているトランスジエニックマウス（NSE— HGF— Tgマウス） を利用した。ここで、誘導された HGFの発現は、 J. Neurosci. , 2002, 22, 6537 — 6548に記載されているように、生後ニューロンに特異的に局在していた。 1Hイン パクターを用いて、 NSE— HGF—Tgマゥスぉょびその野生型同腹子のT10レべル で、 60kDyne脊髄打撲障害を作成し、 HE染色した軸断片および矢状断片におい て組織学的差異を解析した。
[0046] 野生型同腹子の脊髄の HE染色した軸方向像において、脊髄構造が大きく破壊さ れていた。すなわち、多量の神経細胞死および炎症細胞浸潤がはっきりと見られた。 カロえて、脊髄損傷後、脊髄にいくつかの空洞が形成された（図 4、上部パネル)。野 生型同腹子の矢状方向像において、脊髄の広範囲にわたる神経細胞死に加えて、 軸索変性が長い範囲ではっきりと見られた。野性型同腹子とは対照的に、 NSE-H GF_Tgマウスの軸方向像および矢状方向像のいずれにおいても、より少ない神経 細胞死とより少ない軸索変性が見られた（図 4)。 BBBスケールにより後肢運動機能 解析から、脊髄損傷 7日後から良好な機能回復が観察され、スコアは、その後、脊髄 損傷 42日後までさらに増加した（図 5)。これらの知見は、ニューロン特異的な HGF の過剰発現は脊髄ニューロンにおける神経細胞変性および軸索変性を改善すること 、および HGFが脊髄の再生にとってより良好な環境を生じていることを明確に立証し ている。
[0047] 4)複製能力のない HSV1由来ベクターを用いる HGFの遺伝子導入は脊髄ニューロ ンおよびその軸索の 件を 5ケ善しラットの脊髄槽傷モデルにおいて運動機能の回 復を促進する。
トランスジヱニックにおける HGF過剰発現は人為的なアプローチであり、ヒトの患者 に適用することは難しい。このため、本発明者らは次に、複製能力のないヘルぺス単 純ウィルス一 1由来ベクター（HSV)を用いる HGFの遺伝子導入力 NSE-HGF- Tgマウスの結果を再現できるかどうかという問題に取り組んだ。ヘルぺス単純ウィル ス タイプ— 1は向神経性の二重鎖 DNAウィルスであり、大きな遺伝子を組み込む 能力を有している。そのため、本発明者らは、必須の前初期遺伝子 ICP27および IC P4の欠損による複製能力のない HSVを用いた。これはニューロン特異的でかつ HS Vの複製能を欠失させたものである I. Virol. , 2001 , 75 (9) , 4343— 4356)。複 製能力のない HSVを用いた理由は、ニューロンを効率的に形質転換することが示さ れており、かつ筋萎縮性側索硬化症のトランスジエニックマウスモデルにおいて安全 にかつ非毒性的にニューロンへ遺伝子導入して持続的な発現を行うために HSVベ クタ一を用いる可能性が示されていたためである。 HSV1764/-4/pR19 -HG Fウィルス由来ベクター（HSV— HGF)は、 "材料および方法"の項で記載した方法 で調製した。また、 HSV1764/— 4/pR19— LacZウィルス由来ベクター（HSV— LacZ)はコントロールとして用いた。
[0048] 本発明者らは、まず、ミニポンプを組み込んだ定位固定インジェクターを用いてラッ トの T10脊髄に HSV_LacZを直接接種することにより脊髄ニューロンに LacZを効 率的に導入できるかどうかを確認した。図 6に示されているように、 β _gal ( i3—ガラ クトシダーゼ）染色により、多数の緑色 j3—gal染色された LacZ発現ニューロンが、 注入 3日後に、脊髄にはっきりと認められ、これにより HSVを脊髄ニューロンへ首尾よ く導入できることが立証された。
[0049] 本発明者らは、次に、 HSV—HGFの脊髄ニューロンへの直接接種が NSE— HG F_Tgで示された向神経性活性を再現でき、ラットにおける脊髄損傷後の自発運動 機能の結果に影響を与えるかどうかを検討した。脊髄損傷 3日前に、成体雌性 SDラ ットに HSV—HGFまたは HSV_LacZを前注入することにより、脊髄損傷後早い時 点で、脊髄ニューロンに HGFまたは LacZを発現させた。その理由は、 hgfレベルが 、脊髄で高度に誘導された c metレベルと較べて、損傷後早い時点、すなわち:!〜 7日目には、相対的に低力つたからである（図 2)。 HSV— HGF注入ラットおよび HS V_LacZ注入ラットに、 1Hインパクターを用いて、 "材料および方法"の項で述べた 方法で、 200kDyne量の脊髄打撲障害を生じさせた。脊髄の HE染色断片から、 HS V—HGF注入群は HSV_LacZ注入群に較べて、脊髄損傷後に補修した組織の比 率が大きぐまた神経細胞死およびその軸索変性が少なかったことが分かった（図 7) 。さらに、 BBBスコア力ら、 HSV—HGF注入群は HSV_LacZ注入群に較べて、顕 著に良好な運動能力を示したことが分かった（図 8)。このことから、脊髄にラット HGF を HSV介在遺伝子で導入することが神経細胞保護および脊髄障害のラットモデル において運動機能の回復に有益であることが分かる。
[0050] なお、上記実施例は HGF遺伝子を導入したものであるが、 HGF遺伝子の代わりに
5残基欠失型リコンビナントヒト HGF蛋白質 (配列番号 2)を髄腔内注射 (投与量： 20 O i g/月）する以外は、上記と同様の実験を行うことにより、 HGF蛋白質が脊髄損 傷治療剤となることが確認できる。
産業上の利用可能性
[0051] 本発明により、脊髄損傷の治療に有用な薬剤が提供される。

Claims

請求の範囲
[1] HGF蛋白質またはそれをコードする DNAを有効成分とする脊髄損傷治療剤。
[2] 有効成分が HGF蛋白質である請求の範囲第 1項に記載の治療剤。
[3] 有効成分が HGF蛋白質をコードする DNAである請求の範囲第 1項に記載の治療 剤。
[4] HGF蛋白質が、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号
1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であつ て HGFとして作用する蛋白質、又はこれらの部分ペプチドであって HGFとして作用 するペプチドである請求の範囲第 2項に記載の治療剤。
[5] HGF蛋白質をコードする DNA力 配列番号 3又は 4で表される塩基配列からなる D NA、あるいは配列番号 3又は 4で表される塩基配列からなる DNAと相補的な塩基 配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGFとして作 用する蛋白質をコードする DNAである請求の範囲第 3項に記載の治療剤。
[6] 脊髄損傷部位に局所適用するための請求の範囲第 1〜5項のいずれかに記載の治 療剤。
[7] 髄腔内投与用注射剤の剤型である請求の範囲第 6項に記載の治療剤。
[8] 脊髄損傷患者に有効量の HGF蛋白質またはそれをコードする DNAを投与すること を特徴とする脊髄損傷治療方法。
[9] 脊髄損傷治療剤を製造するための HGF蛋白質またはそれをコードする DNAの使用
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