WO2007125723A1

WO2007125723A1 - 糸球体スリット蛋白誘導剤

Info

Publication number: WO2007125723A1
Application number: PCT/JP2007/057121
Authority: WO
Inventors: Toshikazu Nakamura; Shinya Mizuno; Kunio Iwatani
Original assignee: Osaka University NUC; Kringle Pharma Inc
Current assignee: Kringle Pharma Inc; University of Osaka NUC
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2008-10-28

Abstract

　本発明は（イ）ＨＧＦ蛋白質もしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（２）（イ）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡもしくは（ロ）ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであってＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ又は（ハ）それらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とする糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤である。

Description

明細書

糸球体スリット蛋白誘導剤

技術分野

[oooi] 本発明は糸球体スリット蛋白の誘導剤及び Z又は維持剤に関し、更に詳しくは肝細胞増殖因子（以下、 HGFと略記する。）又はそれをコードする DNAを含む DNAを有効成分とする糸球体スリット蛋白の誘導剤及び Z又は維持剤に関する。

背景技術

[0002] 蛋白尿は、腎障害の重要な症候であるばかりでなぐそれ自体が腎障害進行の悪化因子と考えられていた。し力し、蛋白尿の発症メカニズムについては、ほとんど解明されていなかった。近年、腎臓の糸球体上皮細胞間にスリット膜が存在し、この部位が例えばアルブミンや免疫グロブリンあるいはミオグロビン等の蛋白質の透過を防止するバリア機能を有することが明らかにされた。スリット膜は、ネフリン (n印 hrin)ゃポドシン（podocin)等のスリット蛋白力構成され、ネフリンは、スリット膜のフィルター構造を形成していることが明らかにされている。このため、前記スリット膜を構成する蛋白質の発現抑制やスリット膜のバリア機能が損傷、破壊等されると蛋白尿を引き起こす。蛋白尿は、通常、腎障害ゃ腎疾患を伴うことが多ぐその治療は、腎障害ゃ腎疾患における炎症等を治療する副腎皮質ホルモン製剤、免疫抑制薬、抗血小板薬もしくは抗凝固薬の投与、又は蛋白制限食事療法等によって行なわれている。しかし、これら治療は、前記スリット膜を構成する蛋白質の発現を誘導したり、蛋白尿のバリア機構の破壊抑制又は維持することをターゲットとしているものではないのが現状である。腎疾患を治療するための薬剤の一つとして HGFが知られている（特許文献 1、 2 、非特許文献:!〜 4参照）。 HGFは、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトゲンとして同定され、 1989年にその遺伝子クローニングがなされた（非特許文献 5、 6参照 )。しかし、これら先行文献にも、 HGFと糸球体スリット膜のノくリア機構との関係やまたスリット膜を構成するスリット蛋白との関係についての言及はない。

特許文献 1 :特開平 9 087199号公報

特許文献 2：特表 2001— 516358号公報非特許文献 1：水野（Mizuno)ら、ザ'ジャーナル'ォブ 'タリ二カル'インべスティゲイシヨン (J. Clin. Invest. )、 1998年、第 101卷、 pl827— 1834

非特許文献 2：水野（Mizuno)ら、アメリカン 'ジャーナル'ォブ ·フイジォロジ一'レーナノレ'フィジオロジー（Am. J. Physiol Renal Physiol)、 2004年、第 286卷、 pl 34— 1 43

非特許文献 3 :リウ'ワイ（Liu Y.)、アメリカン 'ジャーナル'ォブ 'フィジオロジー（Am. J. Physiol)、 2004年、第 287卷、 pF7— F16.

非特許文献 4 :マツモト'ケ一（Matsumoto K)ら、キドニ^ ~ ·インターナショナル（Kidne y Int.) 2001年、第 59卷、 p2023— 2038

非特許文献 5 :中村（Nakamura)ら，バイオケミカル'アンド'バイオフィジカル'アンド' リサーチ 'コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun. )， 1984年，第 12 2卷， p. 1450- 1459

非特許文献 6 :中村（Nakamura)ら，ネイチヤー（Nature) , 1989年，第 342卷， p. 44 0-443

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] 本発明の目的は、糸球体スリット蛋白を誘導及び Z又は維持するのに有効な薬剤を提供するものである。

課題を解決するための手段

[0004] 本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、 HGF蛋白質もしくは HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド（以下において、 HGF蛋白質等ということもある。）、あるいはそれらをコードする DNA又は前記 DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNA (以下において、 HGF遺伝子ということもある。）が、糸球体スリット蛋白を誘導及び Z又は維持し、蛋白尿を抑制することを見出した。本発明者らは、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。

[0005] すなわち、本発明は、 [1] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HG F蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAを有効成分として含有することを特徴とする糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤、

[2]有効成分として、（ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであつて HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩を含有することを特徴とする前記 [1]記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤、

[3]HGF蛋白質力（a)配列番号 1、 2又は 5で表されるアミノ酸配列と同一又は (b) 前記（a)のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする前記 [2]記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤、

[4]有効成分として、（ィ） HGF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は（ハ）それら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含有することを特徴とする前記 [ 1]記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤、

[5]HGF蛋白質をコードする DNA力（a)配列番号 3、 4又は 6で表される塩基配列からなる DNA又は (b)前記（a)の塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする前記 [4]記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤、

[6] DNAが、 nakedプラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター又は I型単純へルぺスウィルス（HSV_ 1)ベクターに組み込まれてレ、ることを特徴とする前記 [4]又は [ 5]記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤、 [7]糸球体スリット蛋白が、ネフリン、ポドシン、 CD2関連蛋白等の糸球体上皮細胞の膜表面及び/又は細胞内にあって、スリットそのものを構成する蛋白質、又はこれに会合してスリットを安定化させる蛋白質であることを特徴とする前記 [1]〜 [6]のレ、ずれかに記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤、

[8] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HG F蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAを有効成分として含有することを特徴とする糸球体スリット蛋白減少に関連する蛋白尿の予防又は治療剤、

[9] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HG F蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジ工ントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAを哺乳動物に投与することを特徴とする糸球体スリット蛋白の誘導又は維持方法、

[10] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HG F蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAの糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤の製造の為の使用、 [11] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HG F蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAの糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤としての使用、

[12] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HG F蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAを哺乳動物に投与することを特徴とする糸球体スリット蛋白減少に関連する蛋白尿の予防又は治療方法、

[13] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HG F蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジ工ントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAの糸球体スリット蛋白減少に関連する蛋白尿の予防又は治療剤の製造の為の使用、及び

[14] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HG F蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF 蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら D NAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAの糸球体スリット蛋白減少に関連する蛋白尿の予防又は治療剤としての使用、に関する。

発明の効果

[0006] 本発明に係る糸球体スリット蛋白の誘導剤及び/又は維持剤を哺乳動物等に投与することにより、糸球体上皮細胞においてノリア機能を有するスリット膜を構成する蛋白（スリット蛋白）を誘導し、維持することができる。スリット膜は、例えばアルブミンや免疫グロブリンあるいはミオグロビン等の蛋白質の透過を防止するバリア機能を有するため、尿中に前記蛋白質が漏出することを阻止することができる。このため、本発明に係る糸球体スリット蛋白の誘導剤及び/又は維持剤は、糸球体スリット蛋白減少等に関連する蛋白尿に対して優れた予防又は治療効果を示す。

図面の簡単な説明

[0007] [図 1]図 1は、 ICGNマウスにおけるネフリンスコア一を示す図である。図中、正常は健常対照群を、 14週は投与前対照群を、 18週（生食）は対照群を、及び 18週（HGF) は HGF投与群を示す。

[図 2]図 2は、 ICGNマウスの糸球体におけるネフリンの発現を示す図である。図中、生食（18週）は対照群を、及び HGF (18週）は HGF投与群を示す。

[図 3]図 3は、 ICGNマウスにおける CD2APスコア一を示図である。図中、正常は健常対照群を、 14週は投与前対照群を、 18週（生食）は対照群を、及び 18週（HGF) は HGF投与群を示す。

[図 4]図 4は、 ICGNマウスの糸球体における CD2APの発現を示す図である。図中、生食（18週）は対照群を、及び HGF (18週）は HGF投与群を示す。

[図 5]図 5は、 ICGNマウスにおける糸球体ネフリンスコア一と尿中蛋白濃度の相関を示す図である。図中、〇は 14週齢 (被検液投与前）のマウス、口は対照群を、國は H GF投与群を示す。

[図 6]図 6は、 ICGNマウスにおける糸球体 CD2APスコア一と尿中蛋白濃度の相関を示す図である。図中、〇は 14週齢 (被検液投与前）のマウス、口は対照群を、國は HGF投与群を示す。 [図 7]図 7は、 STZ投与マウスにおけるネフリンスコア一を示す図である。図中、正常は健常対照群を、 STZ (生食）は対照群を、 STZ (HGF)は HGF投与群を示す。

[図 8]図 8は、 STZ投与マウスの糸球体におけるネフリンの発現を示す図である。図中

、 18週（生食）は対照群を、 18週（HGF)は HGF投与群を示す。

[図 9]図 9は、 STZ投与マウスにおける CD2APスコア一を示す図である。図中、正常は健常対照群を、 STZ (生食）は対照群を、 STZ (HGF)は HGF投与群を示す。

[図 10]図 10は、糖尿病マウスにおける糸球体ネフリンスコア一と尿中蛋白濃度の相関を示す図である。図中、口は対照群を、國は HGF投与群を示す。

[図 11]図 11は、糖尿病マウスにおける糸球体 CD2APスコア一と尿中蛋白濃度の相関を示す図である。図中、口は対照群を、國は HGF投与群を示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明で使用される HGF蛋白質は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。

HGF蛋白質は、例えば HGF蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清液から分離、精製して該 HGF蛋白質を分離すること等により得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法により HGF蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に揷入して宿主細胞を形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換え HGF蛋白質を得ることもできる。（例えば、特開平 5— 111382号公報、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989年、第 16 3卷， p. 967等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用レ、ることができる。このようにして得られた HGF蛋白質は、天然型 HGF蛋白質と実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の 1若しくは複数個（複数個とは例えば、 2〜20個、好ましくは 2〜： 10個、より好ましくは 2〜5個；以下同様である。）のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよぐまた同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよレ、。そのような HGF蛋白質として、下記する 5アミノ酸欠損型 H GF蛋白質を挙げること力 Sできる。ここで、アミノ酸配列について、「1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的手段により、又は天然に生じうる突然変異等により 1〜複数個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加した HGF蛋白質とは、例えば天然の HGF蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させた HGF蛋白質、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をレヽう。具体的には、例えば NCBIのデータベースに登録されている Accession No. N P_001010932のヒト HGFに対し、糖鎖付加部位の 289位 Asnを Ginに、 397位 A snを Ginに、 471位 Thrを Glyに、 561位 Asnを Ginに、 648位 Asnを Ginにそれぞれ置換することによって糖鎖が付加しないようにした HGF[Fukuta K et al.， Bioch emical Journal, 388， 555-562 (2005) ]等を挙げることができる。

さらに、 HGF蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約 90%以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約 95%以上の相同性を有する蛋白質であって、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も本発明に使用される HGF蛋白質に含まれる。上記アミノ酸配列にっレ、て「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するァミノ酸残基の一致の程度の意味である。

上記 HGF蛋白質としては、例えば NCBIのデータベース等に登録されている例えば Accession No. P14210 (配列番号 1)又は Accession No. NP— 001010932 ( 配列番号 2)で表されるアミノ酸配列で示されるヒト由来の蛋白質等が好ましく挙げられる。配列番号 2で表される HGF蛋白質は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の第 161〜： 165番目の 5個のアミノ酸残基が欠失している 5アミノ酸欠損型 HGF蛋白質である。配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由来の天然 HGF蛋白質であって、 HGFとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する。

配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95。/₀以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質、例えば配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列から、 1〜複数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、 1〜複数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列又は 1〜複数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白質であって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質であることが好ましレ、。揷入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる 20種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、ァミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えば γ—ァミノ酪酸等が挙げられる。

これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよレ、。配列番号 1又は 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、例えば NCBIのデータベースに登録されている Accession No. BAA14348 又は AAC71655等のヒト由来 HGFが挙げられる力これらに限定されない。

本発明に用いられる HGF蛋白質は、 C末端がカルボキシル基（一 COOH)、カルボキシレート（一 COO— )、アミド（一 CONH )又はエステル（一 COOR)のいずれであつてもよレ、。ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチノレ、ェチル、 n—プロピノレ、イソプロピルもしくは n—ブチル等の C1 6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロへキシル等の C3— 8シクロアルキル基、例えば、フエニル、 a ナフチル等の C6— 12ァリール基、例えば、ベンジル、フエネチル等のフエ二ルー C1— 2アルキル基もしくはひ—ナフチルメチル等の α—ナフチルー C1— 2アルキル基等の C7— 1 4ァラルキル基のほカァセチルォキシメチル、ビバロイルォキシメチル等の C2— 6ァルカノィルメチル基等が用いられる。本発明で用いられる HGF蛋白質力 C末端以外にカルボキシル基又はカルボキシレートを有している場合、カルボキシル基又は力ルポキシレートがアミド化又はエステル化されているものも本発明における HGF蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられる HGF蛋白質には、上記した蛋白質において、 Ν末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 (例えば、ホルミル基、ァセチル等の C2 - 6アル力ノィル基等の C 1 - 6ァシル基等）で保護されてレ、るもの、 Ν末端側が生体内で切断され生成したグノレタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の反応性基 (例えば、— OH、— SH、アミノ基、イミダゾリル基、インドリノレ基、グァニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、ァセチル等の C2— 6ァルカノィル基等の Cl _ 6アシノレ基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したレ、わゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。

[0011] 本発明で用いる HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド（以下、 HGF部分ペプチドと略記する場合がある。）としては、上記した HGF蛋白質の部分ペプチドであって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものであってもよレ、。本発明において、 HGF部分ペプチドとしては、上記した HGF蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約 20 個以上、好ましくは約 50個以上、より好ましくは約 100個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。具体的には、例えば、配列番号 1で表されるヒト HGFアミノ酸配列の N末端側から 32番目のアミノ酸から 210番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（HGFの N末端ヘアピンループから第 1クリングルドメインまでの配歹 IJ)で示されるペプチドや、配列番号 1で表されるヒト HGFアミノ酸配列の N末端側から 32番目のァミノ酸力ら 288番目のアミノ酸までのアミノ酸配列（HGFの N末端ヘアピンループから第 2クリングノレドメインまでの配歹 IJ)で示されるペプチド等が好ましく挙げられる。

本発明の HGF部分ペプチドにおいては、 C末端がカルボキシノレ基（― COOH)、カルボキシレート（一 COO— )、アミド（一 CONH )又はエステル（一 CO〇R;Rは上記と同意義）のいずれであってもよい。さらに、 HGF部分ペプチドには、上記した HGF 蛋白質と同様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N末端側が生体内で切断され生成した Ginがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。

[0012] 本発明に用いられる HGF蛋白質又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等）との塩等が挙げられる。

[0013] 本発明に用いられる HGF蛋白質の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは HGF蛋白質を適当なぺプチダーゼで切断することによつて製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、 HGF蛋白質を構成し得る保護基を有していてもょレ、部分ペプチドもしくはアミノ酸と保護基を有してレ、てもよレ、残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造すること力 Sできる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、 M. Bodansz ky及び M. A. Ondetti、ペプチド 'シンセシス（P印 tide Synthesis) , Interscience Publ ishers, New York ( 1966年）、 Schroeder及び Luebke、ザ'ペプチド（The Peptide) , A cademic Press, New York ( 1965年）等に記載された方法等が挙げられる。反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、結晶化又は再結晶等を組み合わせて HGF蛋白質の部分ペプチドを精製単離すること力 Sできる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。

[0014] 本発明において「HGF蛋白質をコードする DNA」とは、 HGF蛋白質を発現し得る DNAをいう。 HGF蛋白質をコードする DNAを含む DNAとしては、例えば、 Nature, 342, 440 ( 1989)；特許第 2777678号公報； Biochem. Biophys, Res. Commun. , 198 9年,第 163卷， p. 967-973 ; Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 1991年,第 88卷（16号 ) , p. 7001- 7005等に記載され、例えば、 GeneBank/EMBL/DDBJに Accession No. M60718、 M73240, AC004960、 AY246560, M29145又は M73240等として登録されているヒト由来の HGF蛋白質をコードする DNA等が好ましく挙げられる。また、本発明の HGF蛋白質をコードする DNAには、前記 DNAと相補的な塩基配列力、らなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、 HGF 蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードする DNA等が包含される。 [0015] HGF蛋白質をコードする DNAの具体例としては、例えば、配列番号 3又は配列番号 4で表わされる塩基配列を有する DNA、若しくは配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、 HGF蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードする DNA等が好ましく挙げられる。ここで、配列番号 3で表される塩基配列は、 Accession No. M60718の塩基配列第 73乃至 2259に相当し、該 DNAは配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる HGF蛋白質をコードする DNAに相当する。配列番号 4で表される塩基配列は、 A ccession No. M73240の塩基配歹 [J第 66乃至 2237に相当し、該 DNAは配列番号 2 で表されるアミノ酸配列からなる HGF蛋白質をコードする DNAに相当する。

[0016] 配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、例えば上記 DNAの部分配列をプローブとして、コロニーハイブリダィゼーシヨン法、プラークハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNA を意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、約 0. 7〜： 1. 0Mの塩化ナトリウム存在下、約 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、約 0.：!〜 2倍の濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM 塩化ナトリウム、 15mM クェン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約 65°Cの条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAを挙げることができる。ストリンジェントな条件は、以下において同様である。

[0017] 上記の配列番号 3又は 4で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAとして具体的には、配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列と約 80%以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を有する DNA等が挙げられる。ハイブリダィゼーシヨンは、公知の方法、例えば、モレキュラー 'クローニング（Molecular Cloning , A laboratory Manual, Third Edition (J. ^ambrook et al. , し old Spring Harbor

Lab. Press, 2001 :以下、モレキュラー 'クローニング第 3版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

[0018] さらに、本発明の HGF蛋白質をコードする DNAは上記に限定されず、発現する蛋白質が HGF蛋白質と実質的に同じ作用を有する DNAである限り、本発明の HGF 蛋白質をコードする DNAとして使用できる。例えば HGF蛋白質の部分ペプチドをコードする DNAであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA等も好ましく使用できる。

[0019] HGF蛋白質の部分ペプチドをコードする DNAとしては、上記した部分ペプチドをコードする塩基配歹 1Jを有しかつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するぺプチドをコードする DNAであればいかなるものであってもよレ、。具体的な本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、例えば、（a)配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNAであって、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA、 (b)配列番号 3又は 4で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配歹 IJからなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNA等が挙げられる。このような DNAとしては、より具体的には、例えば、配列番号 3で表されるヒト HG Fの塩基配列の第 94番目力ら第 630番目までの塩基配列（HGFの N末端ヘアピンループから第 1クリングルドメインまでのペプチドをコードする DNA)を有する DNAや、配列番号 3で表されるヒト HGFの塩基配列の第 94番目力第 864番目までの塩基配列（HGFの N末端ヘアピンループから第 2クリングルドメインまでのペプチドをコードする DNA)を有する DNA等が好ましく挙げられる。

[0020] HGF蛋白質をコードする DNA又は HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNAは、例えば通常のハイブリダィゼーシヨン法や PCR法等により容易に得ることができ、該 DNAの取得は具体的には例えば前記モレキュラー 'クローニング第 3版等の基本書等を参考にして行うことができる。

[0021] なお、本発明で用いられる HGF蛋白質をコードする DNA又は HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNAを含む DNAとしては、ゲノム DNA、ゲノム DNAライブラリー、細胞'組織由来の cDNA、細胞もしくは組織由来の cDNAライブラリー又は合成 DNA等が好ましく挙げられる。前記ライブラリーにゲノム DNA断片がクローニングされるベクターとしては、バタテリオファージ、プラスミド、コスミド又はファージミド等が挙げられる。

また、本発明で用いられる HGF蛋白質をコードする RNA又は HGF蛋白質の部分ペプチドをコードする RNAであって、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする RNAも、逆転写酵素により HGF蛋白質又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用いることができる。該 RNAとしては、例えば細胞又は組織より mRNA画分を調製して、 RT—PCR法によって増幅した R NA等が挙げられ、本発明の範囲内である。また該 RNAも公知の手段により得ることができる。

[0022] なお、本発明で用いられる HGF蛋白質又はそれをコードする DNAは、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、チンパンジー等）に由来する HGF蛋白質又はそれをコードする DNAであってもよい。このような HGFとしては、例えば NCBIのデータベース等に登録されている例えば、マウス由来 HGF (例えば Accession No. AAB31855, NP— 034557, BAA01065, BAA01064等；)、ラット由来 HGF [例えば Accession No. NP— 58713 (配列番号 5で表されるアミノ酸酉己列からなる蛋白質）等]、ゥシ由来 HGF (例えば Accession No. NP— 00102692 1 , XP874086, BAD02475等）、ネコ由来 HGF (例えば Accession No. NP— 00 1009830、 BAC10545, BAB21499等;)、ィヌ由来 HGF (例えば Accession No. NP_001002964、 BAC57560等）又はチンパンジー由来 HGF (例えば Accessio n No. XP519174等）等が挙げられる力これらに限定されない。

[0023] 本発明における「糸球体スリット蛋白」とは、糸球体上皮細胞においてバリア機能を有するスリット膜を構成する蛋白質をいい、例えば、ネフリン、ポドシン又は CD (cluste r of differentiation) 2関連蛋白質（CD2AP ; CD2- associated protein)又はひァクチニン等を包含する。スリット膜の機能としては、糸球体上皮細胞において例えばアルブミンや免疫グロブリンあるいはミオグロビン等の血清蛋白質等の蛋白質透過を防ぐ、バリア機能が挙げられる。スリット膜は、電子顕微鏡等で糸球体上皮細胞の足突起の間に存在する約 5〜60nmの幅の隙間に、電子密度の高い線状の物質構造として観察し得る。「糸球体スリット蛋白の誘導」とは、スリット膜を構成する蛋白質の合成が促進されることをいい、スリット膜において減少した該蛋白質の合成が促進される場合や、新たなスリット膜生成のために蛋白質の合成が促進される場合を含む。蛋白質の合成には、スリット蛋白質の遺伝子が発現され、翻訳される過程を含む。「糸球体スリット蛋白の維持」とは、スリット膜を構成する蛋白質が同じ状態を保ち、スリット膜における上記したノリア機能を維持することをレ、い、例えばスリット蛋白が減少するのを抑制すること等が含まれる。「蛋白尿」とは、通常尿中に蛋白質が一定量 (通常約 15 OmgZ日）以上現れる状態をいうが、本発明においては、糸球体スリット蛋白減少等に関連して、前記状態になる場合が挙げられる。本発明における蛋白尿には、糸球体スリット蛋白減少等に関連するすべての蛋白尿が含まれ、例えば、糸球体スリット蛋白減少を伴う腎臓疾患等において見られる蛋白尿、起立性蛋白尿等の無症候性蛋白尿、又は過激な運動後等に見られる生理的な蛋白尿等が包含される。糸球体スリット蛋白減少には、例えばスリット蛋白によって構成されるスリット膜の損傷や破壊、分解等によりスリット膜が量的に減少する場合やスリット膜に量的変化はなレ、もののスリット膜を構成する蛋白質が量的に減少する場合等が含まれる。またスリット産生細胞である糸球体上皮細胞の生存や機能が失われた結果としてスリット蛋白のトータル量が減少する場合も含まれる。

スリット蛋白の変異又は減少を原因とする疾患としては、先天性小児ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症等が含まれる。一方、スリット蛋白の減少が腎不全進行の危険因子となる疾患としては、糖尿病性腎症、後天性ネフローゼ症候群 (微小変化型又はステロイド抵抗性を含む）、アルポート腎症を始めとする腎疾患等が含まれる。本発明に係る糸球体スリット蛋白の誘導剤及び/又は維持剤は、糸球体スリット蛋白減少等に関連する蛋白尿に対して極めて優れた予防又は治療効果を発揮する。本発明の糸球体スリット蛋白の誘導剤及び Z又は維持剤は、ヒトのほ力 \ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、ゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、ゥサギ、ハムスター、モルモット、チンパンジー等）にも適用できる。本発明の糸球体スリット蛋白の誘導剤及び/又は維持剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方法、投与量等は、有効成分が HGF蛋白質の場合と、 HGF蛋白質をコードする DNAの場合と若干異なってもよい。

例えば、有効成分が HGF蛋白質である場合の本発明の製剤は、種々の製剤形態、例えば液剤、固形剤等をとりうるが、一般的には HGF蛋白質のみを又はそれを慣用の担体と共に注射剤、噴射剤、徐放性製剤 (例えば、デポ剤)等に製剤されるのが好ましレ、。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒 (注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤 (塩ィ匕ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、ィプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラォキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、パラォキシ安息香酸プロピル、パラォキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザノレコユウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビュルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、ァスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又は pH調整剤 (塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）等を適宜添加した溶液に、 H GF蛋白質を溶解した後、フィルタ一等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製すること力 Sできる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリソルベート 80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 50等）等をさらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はべンジルアルコ一ル等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤中の HGF蛋白質含量は、通常約 0. 0002-0. 2w/v%、好ましくは約 0. 001〜0. lwZv%に調整され得る。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。

[0026] また、本発明で用いられる HGF蛋白質は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤

(例えばデポ剤）とすることもできる。 HGF蛋白質は特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類；コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質；ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチォニン等のポリアミノ酸;ポリ乳酸、ポリダリコール酸、乳酸—グリコール酸共重合体;ポリ力プロラクトン、ポリ— β—ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸'ポリェチレングリコール.ビュルピロリドン共重合体等のポリエステル；ポリオルソエステル又はポリメチルー α シァノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸；ポリエチレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸ダリコ一ル酸共重合体である。乳酸ーグリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸/ダリコール酸） ( モル％)は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約 2週間ないし 3力月、好ましくは約 2週間ないし 1力月の場合には、約 100/0乃至 50/50が好ましい。該ポリ乳酸又は乳酸ーグリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約 5, 00 0乃至 20, 000力 S好ましレ、。ポリ乳酸又は乳酸ーグリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭 61— 28521号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子と HGF蛋白質の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、 HGF蛋白質が約 0. 01〜30wZw%が好ましい。

[0027] 投与方法としては、注射剤を皮下、筋肉、静脈注射、又は腎動脈局所注入するか、直接腎臓の糸球体に近い部位に注射するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）を腎臓の糸球体に近い部位に坦め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、 1回当たり約 1 μ g〜500mg、好ましくは約 10 x g〜100mg、さらに好ましくは約 l〜50mgである。また、投与回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、 1回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は 1日 1回から数ケ月に 1 回でよぐ例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与の場合は、数ケ月に 1回でもよい

[0028] 一方、 HGF遺伝子を患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社， 1996、別冊実験医学，遺伝子導入 &発現解析実験法，羊土社， 1997、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、ェヌ 'ティー ·エス， ₁₉₉₉等に記載の方法に従って、行うことが好ましい。

具体的な投与方法としては、例えば、 HGF遺伝子が組み込まれた発現ベクター等を腎臓又は近隣臓器に局所注射する方法、又は naked HGFcDNA (プラスミド）を直接腎動脈、腎静脈又は尿管より注入して例えば糸球体細胞等の腎細胞にエレクト口ポレーシヨン法を行う方法等が挙げられる。さらに、患者の腎臓組織等から細胞を体外に取り出して、該細胞に HGF遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを導入し形質転換させた後に、形質転換された前記細胞を、患者の腎臓 (好ましくは糸球体）に移植する方法等が挙げられる。

[0029] 発現ベクターとしては、 nakedプラスミド、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス（I型単純へルぺスウィルス等）、ワクシニアゥィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンビスウィルス、センダイウィルス、 SV40 又は免疫不全症ウィルス (HIV)等の DNAウィルス又は RNAウィルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウィルスを感染させることにより、細胞内に HGF蛋白質をコードする DNAを導入することが可能である。中でも、 I型単純へルぺスウィルス (HSV_ 1)ベクター、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウィルス（AAV)ベクタ一等が好ましい。

[0030] HGF遺伝子の製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態 [例えば、注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）、マイクロカプセル剤等]をとり得ること力 Sできる。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）は HGF蛋白質の場合と同様にして調製できる。また、マイクロカプセル剤は、例えば HGF遺伝子を含む発現プラスミドを導入した宿主細胞等を芯物質としてこれを公知の方法 (例えばコアセルべーシヨン法、界面重合法又は二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約:!〜 500、好ましくは約 100〜400 /i mの微粒子として製造することができる。被膜物質としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ェチルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン 'アラビアゴム、ニトロセノレロース、ポリビュルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸—グリコール酸共重合体、キトサン—アルギン酸塩、硫酸セルロース— メタタリレート、キトサン一カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩一ポリリジン一アルギン酸塩等の膜形成性高分子等が挙げられる。

製剤中の DNAの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができる。また投与量は、 HGF遺伝子導入ベクターの種類により異なるが、 HGF遺伝子導入ベクターに換算して、通常 1 X 10⁶pfu〜l X 10¹²pfu、好ましくは l X lO pfi！〜 2 X 10"pfu、さらに好ましくは 1. 5 X 10⁷pfu〜： ! · 5 X 10ⁿpfu¾r 数日ないし数ケ月に 1回投与するのが好ましい。

[0031] 本発明の使用は、（1) (ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ） HGF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は（ハ）それら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAの糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤としての使用である。また、上記の（1)あるいは（2)の成分の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤の製造の為の使用である。

[0032] 本発明の糸球体スリット蛋白の誘導又は維持方法は、哺乳動物に上記の（1)あるレ、は（2)の成分を投与する方法である。

[0033] さらに、本発明の使用は、上記の（1)あるいは（2)の成分の糸球体スリット蛋白減少に関連する蛋白尿の予防又は治療剤としての使用である。また、上記の（1)あるいは (2)の成分の糸球体スリット蛋白減少に関連する蛋白尿の予防又は治療剤の製造の為の使用である。

[0034] 本発明の糸球体スリット蛋白減少に関連する蛋白尿の予防又は治療方法は、哺乳動物に上記の（1)あるいは（2)の成分を投与する方法である。

[0035] 本発明の医薬及び方法は、蛋白尿の症候またはスリット蛋白の変異又は減少を原因とする疾患を有するヒトへの使用が好適である。蛋白尿には糸球体スリット蛋白減少等に関連するすべての蛋白尿が含まれ、例えば、糸球体スリット蛋白減少を伴う腎臓疾患等において見られる蛋白尿、起立性蛋白尿等の無症候性蛋白尿、又は過激な運動後等に見られる生理的な蛋白尿等が包含される。また、スリット蛋白の変異又は減少を原因とする疾患には先天性小児ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症等が含まれ、さらに糖尿病性腎症、後天性ネフローゼ症候群 (微小変化型又はステロイド抵抗性を含む）、アルポート腎症を始めとする腎疾患等も含まれる。

実施例

[0036] 以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例における HGFは、リコンビナント HGF (5アミノ酸欠損型 HGF蛋白質；配列番号 2で示される HGF蛋白質）をレ、う。

〔実施例 1〕

HGF投与によるネフローゼ症候群モデル (ICGNマウス）の糸球体スリット蛋白発現誘導

(被検液）

HGF濃度が 130 μ g/mLとなるよう生理食塩水（大塚製薬製)で調製した。

(投与方法）

アルポート症候群と類似したネフローゼ徴候を自然発症する 18週齢の ICGNマウス 12匹を実験に用いた。そのうち 6匹のマウスに、 HGF500 gZkg/日を連日 4週間（18週齢まで)皮下投与した（HGF投与群）。残り 6匹のマウスには連日 4週間（18 週齢まで）生理食塩水のみを皮下投与し、対照群として用いた。さらに HGFを投与する前の 14週齢の ICGNマウス（6匹）を投与前対照群として用い、 18週齢の ICRマウス (6匹）を健常対照群 (正常）として用いた。

[0037] (病理標本作成）投薬終了後すベてのマウスに全身麻酔を実施し、剖検を行った。摘出した腎臓をすみやかに 70 (V/V) %エタノールに固定し、定法にしたがってパラフィン切片を作成した。切片を脱パラフィンして、これにスリット蛋白の発現をみる目的で抗ネフリンモノレモット IgG (PROGEN社製）又は抗 CD2関連蛋白（CD2AP)ゥサギ IgG (Santa Cruz社製）である 1次抗体を室温で 4時間反応させた。次に反応させた切片をピオチン標識抗モルモット IgG (CHEMICON社製）又はピオチン標識抗ゥサギ IgG (Ve ctOT社製）である 2次抗体で室温で 1時間反応させた。これをリン酸緩衝生理食塩水にてよく洗浄し、アビジン/ペルォキシダーゼ複合体 (Vector社製、 Eliteキット）を含むリン酸緩衝生理食塩水を切片上に添加して室温にて 1時間反応させた。最後にこのように処理した切片を 3， 3 '—ジァミノベンチジン (ナカライテスタ株式会社製)及び過酸化水素（和光純薬工業株式会社製）を含むリン酸緩衝生理食塩水と室温で 4 〜8分間反応させ、ネフリン又は CD2APを可視化させた。

[0038] (スコア一化）

次に各マウスの腎組織を顕微鏡にて観察し、ネフリン又は CD2APの発現強度を以下のスコア一により数値化した。

スコア一 0；糸球体全体にネフリン又は CD2APが認められない。

スコア一 0. 5 ;糸球体全体の 4分の 1以下にネフリン又は CD2APが認められる。スコア一 1 ;糸球体全体の 4分の 1から 4分の 2程度にネフリン又は CD2APが認められる。

スコア一 2；糸球体全体の 4分の 2から 4分の 3程度にネフリン又は CD2APが認められる。

スコア一 3 ;糸球体全体の 4分の 3以上にネフリン又は CD2APが認められる。

なお、以下においてネフリンの発現強度をスコア一化したものをネフリンスコア一とレ、い、 CD2APの発現強度をスコア一化したものを CD2APスコア一とレ、う。

[0039] なお、該数値化は、マウス 1匹あたり 20個以上の糸球体についてネフリン又は CD2 APのスコア一を集計した上で平均スコア一を算出し、そのマウスのネフリンスコア一又は CD2APスコア一とした。各グループの各スコア一はマウス 6匹の各スコア一の平均値（土標準偏差）として示し、 student t_テストにより群間での有意差検定を行った。ネフローゼ発症により減少するネフリン（図 1 , 2)又は CD2AP (図 3、 4)が、 HGF投与により有意に増加した。このこと力、 ICGNマウスへの HGF投与は、スリツト蛋白であるネフリン及び CD2APを誘導させることが判明した。

また、連日 4週間生理食塩水のみを投与した 18週齢の ICGNマウス（6匹；対照群）及び HGFを連日 4週間投与した 18週齢の ICGNマウス（6匹； HGF投与群）の尿中蛋白濃度を測定した。尿は 2時間おきに膀胱マッサージにより採取し、 12回分を集めて 24時間分の尿とした。前記 24時間分の尿中の蛋白は、 A/G Bテストヮコー（和光純薬工業株式会社製)を用いて測定した。その結果を尿中蛋白濃度とネフリン又は CD2APスコア一の散布図として示した（図 5及び 6)。尿中蛋白濃度とネフリン又は CD2APスコア一の間には負の相関関係が認められた。このことは、ネフリン又は C D2APスコア一の増加力尿蛋白濃度の減少をもたらすことを示す。 HGF投与群では、対照群に比較してネフリン又は CD2APスコア一の増加と共に尿中蛋白の減少が認められた。

〔実施例 2〕

HGF投与による糖尿病性腎症 (ストレプトゾトシン投与マウス）の糸球体スリット蛋白発現誘導

(被検液）

HGF濃度が 80 μ g/mLとなるよう生理食塩水（大塚製薬製）で調製した。

(試験方法）

8週齢の C57/B6雌性マウスにストレプトゾトシン（STZ)を 120mg/kg、 1日 1回を 2日、及び 80mg/kg、 1日 1回を 2日、連続 4日間にわたり腹腔内投与することにより糖尿病を誘導した。前記糖尿病を誘導したマウス（12匹）を 6週間（14週齢まで）飼育し、 6匹のマウスに 7週目より HGF300 μ g/kg/12時間を 4週間（18週齢まで )皮下投与した (HGF投与群）。残り 6匹のマウスには HGFの代わりに 4週間（18週齢まで）生理食塩水のみを皮下投与し、対照群として用いた。さらに HGF投与前の S TZ投与後 6週目の糖尿病マウス（6匹）を投与前対照群及び同齢正常 C57ZB6マウス（6匹）を健常対照群として用いた。

次に、上記方法と同様にして病理標本作成を行い、スコア一化を行った。糖尿病が誘導されることにより減少するネフリン（図 7, 8)又は CD2AP (図 9)力 HGF投与により有意に増加した。このこと力ら、 HGF投与は、スリット蛋白であるネフリン及び CD 2APを誘導させることが判明した。

また、生理食塩水のみを投与した 18週齢の STZ投与マウス（6匹）及び HGFを連日 4週間投与した 18週齢の STZ投与マウス（6匹）の尿アルブミン濃度を経日的に測定した。尿は 2時間おきに膀胱マッサージにより採取し、 6回分を集めて 12時間分の尿とした。前記 12時間分の尿中のアルブミンは、 AZG Bテストヮコー（和光純薬ェ業株式会社製)を用いて測定した。その結果を尿中アルブミン濃度とネフリン又は C D2APスコア一の散布図として示した（図 10又は 11)。尿中アルブミン濃度とネフリン又は CD2APスコア一の間には負の相関関係が認められた。このことは、ネフリン又は CD2APのスコア一の増加は、尿アルブミン濃度の減少をもたらすことを示す。 HG F投与群では、対照群に比較してネフリン又は CD2APスコア一の増加と共に尿中ァルブミンの減少が認められた。

産業上の利用可能性

本発明の糸球体スリット蛋白の誘導剤及び/又は維持剤は、蛋白尿の予防又は治療のための医薬として利用し得る。

Claims

請求の範囲

[1] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力つ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAを有効成分として含有することを特徴とする糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤。

[2] 有効成分として、（ィ) HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであつて HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩を含有することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤。

[3] HGF蛋白質力（a)配列番号 1、 2又は 5で表されるアミノ酸配列と同一又は (b)前記（a)のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第 2項記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤。

[4] 有効成分として、（ィ） HGF蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は（ハ）それら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含有することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤。

[5] HGF蛋白質をコードする DNA力（a)配列番号 3、 4又は 6で表される塩基配列からなる DNA又は (b)前記（a)の塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする請求の範囲第 4項記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤。

[6] DNAが、 nakedプラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター又は I型単純へルぺスウィルス (HSV— 1)ベクターに組み込まれてレ、ることを特徴とする請求の範囲第 4項記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤。

[7] 糸球体スリット蛋白力ネフリン、ポドシン、 CD2関連蛋白等の糸球体上皮細胞の膜表面及び/又は細胞内にあって、スリットそのものを構成する蛋白質、又はこれに会合してスリットを安定化させる蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤。

[8] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力、つ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAを有効成分として含有することを特徴とする糸球体スリット蛋白減少に関連する蛋白尿の予防又は治療剤。

[9] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力つ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAを哺乳動物に投与することを特徴とする糸球体スリット蛋白の誘導方法又は維持方法。

[10] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力、つ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAの糸球体スリット蛋白の誘導剤又は維持剤の製造の為の使用。

[11] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力、つ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAを哺乳動物に投与することを特徴とする糸球体スリット蛋白減少に関連する蛋白尿の予防又は治療方法。

[12] (1) (ィ） HGF蛋白質もしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチド又はこれらの塩、あるいは（2) (ィ) HGF 蛋白質をコードする DNAもしくは（口） HGF蛋白質の部分ペプチドであって HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードする DNA又は (ハ）それら DN Aと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力つ HGF蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードする DNAを含む DNAの糸球体スリット蛋白減少に関連する蛋白尿の予防又は治療剤の製造の為の使用。