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WO2007014977A1 - Vectores recombinantes basados en el virus vaccinia modificado de ankara (mva) como vacunas contra la leishmaniasis - Google Patents

Vectores recombinantes basados en el virus vaccinia modificado de ankara (mva) como vacunas contra la leishmaniasis Download PDF

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WO2007014977A1
WO2007014977A1 PCT/ES2006/070122 ES2006070122W WO2007014977A1 WO 2007014977 A1 WO2007014977 A1 WO 2007014977A1 ES 2006070122 W ES2006070122 W ES 2006070122W WO 2007014977 A1 WO2007014977 A1 WO 2007014977A1
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WO
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lack
vaccination
mva
dose
dna
Prior art date
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Ceased
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PCT/ES2006/070122
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English (en)
French (fr)
Inventor
Eva PÉREZ JIMÉNEZ
Vicente Emilio LARRAGA RODRÍGUEZ DE VERA
Mariano ESTEBAN RODRÍGUEZ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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Priority to ES06778475T priority patent/ES2383324T3/es
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the use of recombinant viruses based on Ankara modified vaccinia virus (MVA) in vaccination. More specifically, the invention relates to MVA-derived recombinant viruses that act as expression systems for the LACK protein or immunogenic fragments thereof and for use in vaccination against leishmaniasis of both humans and other mammals susceptible to get it like dogs
  • MVA Ankara modified vaccinia virus
  • Leishmaniasis is an anthropozoonosis that encompasses a complex group of clinical conditions produced by protozoa of the Leishmania genus, which parasitize cells of the monocyte-macrophage system.
  • Leishmania is a flagellated protozoan belonging to the order Kinetoplastida and the Trypanosomatidae family.
  • the classification of the genus Leishmania in its different species is complex and is currently performed by analyzing the restriction fragments of the Kinetoplast DNA. Is the next:
  • the life cycle develops in two hosts, one vertebrate (mammal) and an invertebrate vector (female mosquito of the Phlebotomidae family, a diptera of the genus Phlebotomus in the Old World and Lutzomya in the New World also known as beatilla of the sands).
  • Leishmania is an obligate intracellular parasite found in macrophages in the form of an amastigote.
  • Amastigotes are rounded shapes with dimensions of 3-5 ⁇ m x 2-3 ⁇ m, with a rudimentary scourge that does not protrude from the soma and that reproduce by binary fission.
  • the amastigotes pass to the insect, with the sting when ingesting blood from a parasitized mammal.
  • amastigotes are transformed into promastigotes, mobile and elongated shape with a single flagellum in their anterior pole, which actively multiply in the midgut of the mosquito. After 15-20 days of ingestion they begin to detach from the intestinal cuticle invading the hypopharynx.
  • the insect By the bite of a new host, the insect inoculates the promastigotes, called metac ⁇ cucos, who once inside the vertebrate host will be phage cited by the cells of the monocyto-macrophage system, where they will transform and multiply as amastigotes.
  • the clinical manifestations of the disease vary depending on the immune response of the host, the strain and the virulence of the parasite, being observed from cutaneous lesions that heal spontaneously, to a visceral form of the disease that can lead to death in case of not receiving treatment .
  • Cutaneous leishmaniasis is typically caused by Leishmania tropic, Leishmania major and Leishmania aethiopica ("Old World” species) and by Mexican Leishmania, Leishmania amazonensis, Leishmania bra ⁇ iliensis, Leishmania panamensis, Leishmania guyanensis, Leishmania peruviana, Leishmania chagasi other species in the New World. It frequently occurs in the form of superficial ulcers with elevated edges, which usually arise in localized or exposed areas of the face and extremities and that may be accompanied by skin lesions and regional adenopathy. The clinical manifestations of cutaneous leishmaniasis in the Old and New World are similar. It takes years to spontaneously resolve the lesions and usually an atrophic flat scar remains.
  • Visceral leishmaniasis also known as Kala-azar or Dum-Dum fever
  • Ula-azar Dum-Dum fever
  • Your symptomatology Characteristic in humans consists of headaches, fever at intervals, asthenia, diarrhea, abdominal pain, cramping, lymphadenopathy, hepatomegaly, splenomegaly, anemia, leukopenia, thrombocytopenia, eye injuries, excessive growth of nails and eyelashes as well as the appearance of opportunistic infections.
  • leishmaniasis is a zoonosis, with dogs being its main reservoir.
  • Epidemiological studies reveal that up to 80% of dogs in endemic areas are infected (3, 31), of which 50% develop the visceral form of the disease (3, 17).
  • Leishmania infantum The species traditionally known as the cause of visceral leishmaniasis in the Mediterranean area is Leishmania infantum. However, its distribution extends to eastern Europe and Asian countries. It is currently considered synonymous with Leishmania chagasi (22), so its distribution would be extended to Latin America and possibly to the southern United States (10).
  • the World Health Organization has estimated that the global prevalence of the disease in humans reaches 12 million people, with an annual incidence of 1.5 to 2 million new cases of cutaneous leishmaniasis and 500,000 new cases of leishmaniasis visceral (WHO 2000). There is also a high incidence of the disease in AIDS patients, since HIV infection increases the risk of developing leishmaniasis 100 to 1000 times (2I) 5 which causes a high mortality. WHO estimates that between 2 and 9% of all AIDS patients in southern Europe will develop visceral leishmaniasis (WHO 1995).
  • the LACK (Leishmania homolog for receptors for Activated C Kinase) antigen is a 36 KDa protein of molecular weight highly conserved among the different species of Leishmania, and which is expressed in both promastigote and amastigote.
  • the LACK protein is a preferential target of the early antiparasitic response, so that it directs the expansion of IL-4 secretory cells that lead to disease.
  • the system used to deliver the coding sequence of the antigen and enable its presence in the cell can be a critical element that determines antigenic efficacy, so LACK can be a useful antigen when its presence in the cell comes determined by the inclusion of its coding sequence in a vector that allows its expression other than naked DNA.
  • Vaccinia virus-based vectors have proven to be a good antigen delivery system for the control of infectious diseases in studies with animal models (37) and, in particular, have shown great capacity to increase the specific cellular immune response when animals are given a first dose of immunization (priming) containing various recombinant vectors (eg naked DNA, proteins, pseudoparticles, viral vectors other than vaccinia virus) subsequently followed by a second booster dose with a recombinant Vaccinia Virus , the vectors of the first and second doses expressing the same antigen (18, 35).
  • immunization primary
  • various recombinant vectors eg naked DNA, proteins, pseudoparticles, viral vectors other than vaccinia virus
  • the protocols that combine the recombinant Vaccinia vectors in the second dose with the administration of recombinant naked DNA vectors in the first dose are allowing to achieve encouraging results in different models animals, obtaining protection that correlates with the activation of a cellular immune response, especially the activation of IFN- ⁇ secreting CD8 + T cells.
  • Immunization with DNA promotes both humoral and cellular immune responses, conferring protection in experimental models (34). This method offers the possibility of manipulating the immune response induced with the coadministration of adjuvants, such as cytokines, to increase the efficacy of vaccination (11, 16).
  • the MVA (Modi ⁇ ed Vaccinia Virus Ankara) is an attenuated form of Vaccinia derived from the Ankara line obtained through more than 500 passes in embryonic fibroblasts of chicken, which has been used in about 120,000 Caucasian individuals without adverse effects (23).
  • This virus is unable to replicate in cell lines and in primary human cultures (6). However, there is no alteration in the levels of viral or recombinant protein expression (32).
  • the locus of LACK coding sequence has been chosen hemagglutinin (HA) instead of the thymidine kinase locus (TK), since inactivation of the hemagglutinin gene in the MVA vector facilitates the cell-cell fusion process (38), which increases antigen presentation after inoculation by intramuscular or intradermal route.
  • HA hemagglutinin
  • TK thymidine kinase locus
  • the early / late synthetic promoter pE / L (early / late) (39) has been chosen as the promoter of the sequence, instead of the p7.5 promoter that is used in the vectors described in the aforementioned applications, which ensures the continued synthesis of the antigen during the infection process and results in high levels of production thereof, facilitating the generation of an immune response against said antigen.
  • infection with MVA produces less cell destruction than infection with the wild strain WR, increasing the antigen presentation. With all this, a vector has been achieved that gives rise to a greater immunological stimulation, a good protection against leishmaniasis with respect to the vectors known in the state of the art used against said disease.
  • the vector of the invention has proven to be stable and maintain the insert it contains after subjecting it to successive you pass
  • the invention provides a recombinant vector derived from the MVA virus that carries a sequence encoding the LACK protein or an immunogenic fragment thereof, a sequence that is under the control of a promoter that allows its expression during the virus infection process.
  • MVA the LACK coding sequence is inserted, in the MVA-derived vector, into the hemagglutinin locus, so that said gene is inactivated.
  • recombinant vectors derived from the MVA virus are also included within the scope of the invention in which the sequence coding for LACK or an immunogenic fragment thereof is inserted into other insertion sites of the vector, such as the locus. of thymidine kinase.
  • the expression of the LACK coding sequence is regulated by the synthetic promoter pE / L, which allows expression at both early and late times of MVA virus infection, although any other could be used. poxvirus promoter.
  • the LACK coding sequence present in the recombinant vector of the invention can encode the complete protein or an immunogenic fragment thereof.
  • immunogenic fragment refers to a fragment of the protein that comprises at least 20% or, preferably, at least 50% of the amino acid sequence of the protein and that is capable of triggering a response immune against it.
  • the coding sequence present in the recombinant vector of the invention encodes the complete LACK protein of Leishmania infamum, whose cloning and characterization / aconon has been described by González-Ascguinolaza et al. (7).
  • the LACK gene was transferred by the coordinator of that group, Dr.
  • compositions comprising at least one recombinant vector of the invention and, optionally, at least one pharmaceutically acceptable adjuvant or carrier.
  • Pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used to form part of a composition comprising at least one recombinant vector of the invention are adjuvants and vehicles known to those skilled in the art, which will be chosen according to the route of administration that is intend to use so that a suitable composition is obtained to be supplied by said route.
  • the route of administration is chosen from the mtraperitoneal route, the intradermal route or the intramuscular route, with the intramuscular route being especially preferred.
  • compositions in the form of an aqueous solution or suspension, whereby the composition would contain a pharmaceutically acceptable diluent such as saline, phosphate buffered saline (PBS) or any other pharmaceutically acceptable diluent.
  • a pharmaceutically acceptable diluent such as saline, phosphate buffered saline (PBS) or any other pharmaceutically acceptable diluent.
  • the vector of the invention is a safe and stable vector, which results in a potent cellular immune response against the LACK antigen and which, as shown later in the Examples, is capable of inducing protection in the murine model against leishmaniasis. That is why another aspect of the invention is the use of the vector of the invention for the manufacture of a medicament intended to protect a mammal capable of developing it from leishmaniasis.
  • the vector of the invention of the second booster dose gives rise to a protection similar to that observed when the virus used in the booster dose is a recombinant virus that also expresses the LACK protein, derived from the Western strain.
  • Reserve of Vaccinia while in the trials in which the protection generated against Leishmania major is evaluated, the vector of the invention results in a superior protection in general to Ia.
  • gcnciada p ⁇ i l ⁇ & viiub recombinants derived from the Western Reserve line and in particular superior to the already known recombinant virus in which the LACK coding sequence is inserted into the TK locus. That is why the medicine may be intended for protection against visceral leishmaniasis or against cutaneous leishmaniasis.
  • the vector of the invention makes the vector of the invention a good candidate to be used in beings humans for protection against leishmaniasis, although it is also an option to be administered in combination with or replacing recombinant viruses derived from the Western Reserve strain of Vaccinia that also express the LACK protein, the use of which has been proposed for the protection of others Animals like dogs.
  • a further aspect of the invention is the vaccination methods in which the vector of the invention is administered.
  • the administration of a single dose of the vector of the invention makes it possible to observe a cellular immune response, preference is given to the methods in which more than one dose, time spaced, is administered.
  • heterologous vaccination methods in which the virus of the invention is administered in the second and / or in subsequent booster doses are preferred, while in the first dose another different recombinant vector is administered which preferably constitutes also an expression system of the LACK protein or an immunogenic fragment thereof.
  • the recombinant vcc ⁇ i that is administered in the first dose is a naked DNA capable of expressing the LACK protein of Leishmania infantum, which has been shown to give good protection in the examples described below. .
  • pCI-neo-LACK DNA-LACK
  • the combination of which with the vector of the invention has resulted in good protection results against Leishmania major and against Leishmania infantum, although it is possible to use several other plasmids such as, for example, pMOK.
  • Another possible embodiment of the vaccination methods of the invention is that in which, in addition to the vaccination vectors, an adjuvant, adjuvant which can be the CD40L protein is administered.
  • FIGURES shows a diagram of the construction of the pHLZ-LACK vector
  • Figure 2 shows, in its upper part, a scheme of the MVA-LACK virus and the location of the areas with which the oligonucleotides used as primers mate in the analysis PCR of the HA and TK locus (for identification of the oligonucleotides , see Table 1).
  • Figure 2 shows, in its upper part, a scheme of the MVA-LACK virus and the location of the areas with which the oligonucleotides used as primers mate in the analysis PCR of the HA and TK locus (for identification of the oligonucleotides , see Table 1).
  • photographs of the gels obtained when performing said PCR analysis are shown; the left part corresponds to the analysis of the HA locus and the right part to the analysis of the TK locus.
  • Figure 4 shows the pattern of bands obtained by reacting with nitrocellulose membranes anti-LACK polyclonal antibody to which the bands resulting from fractionating cell extracts collected at the post-infection times indicated on each cell had transferred on an SDS-PAGE gel One of the streets.
  • M sample in which the infection taken after 48 hours had been simulated.
  • LACK-HIS positive control sample obtained from an E. co ⁇ i strain that expresses a LACK protein that carries a histidine tail.
  • Figure 5 shows the number of IFN- ⁇ secretory cells detected by ELISPOT for every 10 6 splenocytes of Balb / c mice stimulated with the vectors indicated on abscissa, which are: VVp36: VV-LACK HA " ; MVAp36: MVA-LACK ; VVLuc: vector derived from the WR strain containing the luciferase gene P: first dose; B: booster dose Part A corresponds to IFN- ⁇ secretory cells specific for LACK protein and part B a secretory cells specific for viral antigens.
  • Figure 6 shows the concentration of IFN- ⁇ , in ng / ml, detected in the culture supernatant of splenocytes isolated from mice inoculated with the vectors indicated in abscissa and re-stimulated with the LACK protein (first bar, which appears shaded) or with a class II immunostimulatory peptide (second bar, which appears filled in black).
  • the denominations of the vectors correspond to: VVp36: VV-LACK HA " ; MVAp36: MVA-LACK; VVLuc: vector derived from the WR strain containing the luciferase gene inserted into the HA locus, so it is also called VV-Luc HA- P: first dose; B: booster dose
  • Figure 7 shows the optical density values, measured at 450 nm, obtained by detecting antibodies specific for LACK in sera of diluted Balb / c mice 1/10, collected 8 days after the second dose of an immunization protocol with two immunization doses, each of which included the vectors indicated in abscissa, indicating P the vector inoculated in the first dose and B the inoculated in the booster dose.
  • the denominations of the vectors correspond to: Wp36: W-LACK HA " ; MVAp36: MVA-LACK; VVLuc: vector derived from the WR strain containing the luciferase gene inserted into the locus HA, so it is also called VV-Luc HA-.
  • the first bar of each vaccination protocol marked with inclined lines, corresponds to antibodies of the IgGl isotype; the second bar, filled in black, to the antibodies of the IgG2a isotype.
  • Figure 8 shows the structure of plasmid pCI-neo-LACK (DNA-LACK).
  • Figure 9 shows the number of IFN- ⁇ secretory cells detected by ELISPOT for every 10 6 spinocytes of Balb / c mice stimulated with the vectors indicated on abscissa.
  • P first dose
  • B booster dose.
  • Part A corresponds to IFN- ⁇ secretory cells specific for the LACK protein and part B to the specific secretory cells for viral antigens.
  • Figure 10 shows the cytokine pattern secreted after re-stimulation of isolated sphenocytes from Balb / c mice immunized with combinations of recombinant vectors, in which the first vector cited was administered in the first dose and the second vector in the second dose.
  • the graphs located on the left side show the concentration of cytokines associated with Th2 type responses (IL-4 in the case of Figure 10a and both IL-4 (filled bars; scale on each graph) and IL- IO (bars without padding; scale under each graph) in the case of Figure 10b; the graphs located on the right side show the concentration of cytokines associated with ThI type responses detected in each case (IFN- ⁇ only in the case of case of Figure 1 Oa and both IFN- ⁇ (bars with padding; scale on each graph) and TNF- ⁇ (bars without padding; scale on each chart) in the case of Figure 10b.
  • Figure 10a Data obtained after restimulation of Sphenocytes obtained from mice immunized with the combination of DNA-LACK / W-LACK TK- vectors are present only in Figure 10a, not having been included in Figure 10b.
  • Figure 11 corresponds to the evaluation of protection against a challenge of
  • L. major to Balb / c mice immunized with different vaccination protocols The upper part A shows a graph in which, in ordinates, the size of the lesion is indicated, expressed in millimeters, detected after the weeks indicated in abscissa after challenge with promastigotes of L. major to Balb / c mice immunized with DNA-LACK (100 micrograms) in the first dose and, in the second dose with 1 x 10 pfu / mouse of: (*): VV-LACK TK-; (H): VV-LACK HA-; (A): MVA-LACK.
  • the points marked with the symbol (•) correspond to data from mice that were given a control DNA in the first dose and VV Luc HA- in the second.
  • part B the logarithm in base 10 of the parasitic load corresponding to the same experiment, detected in the popliteal ganglia of Balb / c mice is shown.
  • bar 1 corresponds to the spleen mixture of 8 mice immunized with DNA-LACK / VV-LACK TK-;
  • bar 3 spleen mixture of 8 mice immunized with DNA-LACK / VV-LACK HA-;
  • bars 3 to 10 each bar represents a spleen of a mouse immunized with DNA-LACK / MV A-LACK HA-;
  • bar 11 spleen mixture of 7 mice immunized with DNA-control (empty plasmid) / VV Luc HA-.
  • Figure 12 shows, in part A, a graph in which, in ordinates, the size of the lesion, expressed in millimeters, is detected after the weeks indicated in abscissa after the challenge with promastigotes of L. major a Balb / c mice immunized with: pMOK in the first and in the second dose (data indicated with a circle, •; MIDGE-NLS in the first dose and VV-Luc in the second dose (data indicated with the symbol *); pMOCK -LACK in the first dose and MVA-LACK in the second dose (data indicated by the symbol X)
  • part B of the Figure the parasitic load, expressed in parasite number / mg, detected in the same animals is indicated; bar one corresponds to immunization with pMOCK-LACK and MVA-LACK, bar 2 to immunization with MIDGE-NLS and VV-Luc and bar 3 to immunization with pMOK in the first and second doses.
  • Figure 14 shows a graph in which, in ordinates, the size of the lesion, expressed in millimeters, is detected after the weeks indicated in abscissa after the challenge with promastigotes (5 x 10 4 ) of L. major a Balb / c mice immunized with DNA-LACK in the first dose and, in the second dose with: (4 > ): 1 x 10 7 pfu / mouse of MVA-LACK; ("): 5 x 10 7 pfu / mouse of MVA-LACK; (Ik): 5 x 10 7 pfu / mouse of W-LACK; (X): 5 x 10 7 pfu / mouse of VV-Luc. Points marked with the symbol ( 5 H) correspond to data from mice that were administered PBS in both the first and second doses.
  • Figure 15 shows photographs taken of mice subjected to different immunization protocols, after 8 weeks of the challenge with Leishmania major.
  • the "+” signs indicate the legs on which the promastigotes were inoculated (5 x 10 4 ), while the "-" signs correspond to the legs that serve as a control, where no promastigotes were inoculated.
  • Immunizations were performed with: Panel A: DNA-LACK in the first dose and 1 x 10 7 pfu / mouse of MVA-LACK in the second dose; panel B: DNA-LACK in the first dose and 5 x 10 7 pfu / mouse of MVA-LACK in the second dose; panel C: DNA-LACK in the first dose and 5 x 10 7 pfu / mouse of VV-LACK in the second dose; panel D: control DNA in the first dose and 5 x 10 7 pfu / mouse of VV-Luc in the second dose; Panel E: PBS in both the first and second doses (group N: naive).
  • Figure 16 shows graphs representing the parasite load detected in different organs of Balb / c mice, immunized with different treatments, detected one month after an intradermal challenge of 10 7 metacyclic promastigotes with L. infantum.
  • Figure A load detected in spleen
  • Figure B load detected in liver
  • Figure C load detected in draining lymph node.
  • the bars correspond to the following vaccination protocols: first bar (shaded), DNA-LACK in the first dose and 10 7 pfu / mouse of VV-LACK in the second dose; second bar (with reticle ;, DNA-LACK in the first dose and 5x10 pfu / ration of VV-LACK in the second dose; third bar (with inclined lines), DNA-LACK in the first dose and 10 7 pfu / mouse of MVA-LACK in the second dose, fourth bar, DNA-LACK in the first dose and 5x10 7 pfu / mouse of MVA-LACK in the second dose; fifth bar (filled in black), plasmid pCI-neo in the first dose and 5x10 pfu / mouse VV-Luc in the second dose; last bar (with vertical lines), PBS in both doses.
  • FIG. 17 shows graphs that correspond to the immune response detected from splenocytes of Balb / c mice subjected to different immunization treatments, mice that had not been inoculated L. infantum.
  • Graph A corresponds to IFN- ⁇ levels, in ng / ml, detected in the supernatant of splenocyte cultures re-stimulated with the LACK protein.
  • Graph B corresponds to the number of IFN- ⁇ producing cells specific for LACK 5 detected by ELISPOT 5 present per 10 6 splenocytes.
  • Graph C corresponds to the levels of TNF ⁇ / LT, in ng / ml, detected in the supernatant of splenocyte cultures re-stimulated with the LACK protein.
  • Graph D corresponds to the levels of IL-IO, in ng / ml, also detected in the supernatant of splenocyte cultures re-stimulated with the LACK protein.
  • the bars correspond to the following vaccination protocols: first bar, DNA-LACK in the first dose and 10 7 pfu / mouse of VV-LACK in the second dose; second bar, DNA-LACK in the first dose and 5x10 7 pfu / mouse of VV-LACK in the second dose; third bar, DNA-LACK in the first dose and 10 7 pfu / mouse of MVA-LACK in the second dose; fourth bar, DNA-LACK in the first dose and 5xlO 7 pfu / mouse of MVA-LACK in the second dose; fifth bar, plasmid pCI-neo in the first dose and W-Luc in the second dose; Last bar, PBS in both doses.
  • Figure 18 shows graphical paths, referring to the growth efficiency of the MVA-LACK recombinant virus, graphs in which the log of the MVA-LACK virus concentration is represented in ordinates (data represented by filled squares: B) and of the wild-type virus MVA-WT (data represented by rhombuses: ⁇ ) detected or associated with cells (Intracel: intracellular; upper graph: A) or in the cell growth medium (Extracel: extracellular; inferior graph: B) by immunostains performed on BHK-21 cells . after the times (t) post-infection (pi) indicated in hours (h) on the abscissa axis.
  • Figure 19 shows the lesions developed by mice that were inoculated with promastigotes of L. major, depending on the previous treatment of immunization.
  • the upper part of the Figure, A shows a graph in which the size of the lesion (Lesn.) Is shown in ordinates, in millimeters (mm) observed in mice, after time has elapsed, expressed in weeks, which is Indicates in abscissa, from the moment of inoculation to the mice of promastigotes of L. major, the combinations of immunization vectors administered to each group of mice prior to the inoculation of L major are indicated on the graph.
  • the abbreviations of the immunization groups correspond to: DNA-LACK / MVA-LACK l_10 7 : DNA-LACK in the first dose and 1 x 10 7 pfu / mouse of MVA-LACK in the second dose; DNA-LACK / MVA-LACK 5JO 7 : DNA-LACK in the first dose and 5 x 10 7 pfu / mouse of MVA-LACK in the second dose; DNA-LACK / VV-LACK-HA " : DNA-LACK in the first dose and 5 x 10 7 pfu / mouse of VV-LACK in the second dose; DNA-Control / VV-LUC-HA " : lacking control plasmid of LACK coding insert in the first dose and 5 x 10 7 pfu / mouse of VV-Luc in the second dose; PBS / PBS: PBS in both the first and second doses.
  • Figure 20 corresponds to the test of the evaluation of the increased protection conferred by the administration of an adjuvant, the CD40L protein, to Balb / c mice subjected to different immunization treatments and to a challenge with promastigotes of L. major.
  • A a schematic representation of the immunization protocol followed is shown.
  • B a graph is shown in which the size of the lesion (Lesn.), In millimeters (mm) observed in mice, is shown in ordinates, after the time elapsed, expressed in weeks, which is indicates in abscissa, from the moment of inoculation to the mice of promastigotes of L.
  • the “f” signs next to a circle of part C indicate that the mouse was sacrificed before 27 weeks.
  • the groups correspond to the following combinations in immunization: Group 1 (Gl): DNA-LACK / MVA-LACK / MVA-LACK; Group 2 (G2): DNA-LACK + MegaCD40L (l ⁇ g) / MVA-LACK + MegaCD40L (l ⁇ g); Group 3 (G3): DNA-LACK + MegaCD40L (10 ⁇ g) / MVA-LACK + MegaCD40L (10 ⁇ g) / MVA-LACK; Group 4 (G4): DNA-LACK + MegaCD40L (20 ⁇ g) / MVA-LACK + MegaCD40L (20 ⁇ g) / MVA-LACK + MegaCD40L (20 ⁇ g); Group 5 (G5): DNA-Control / MVA-WT; Group 6 (G6): PBS / PBS; Group 7 (G7): PBS + MegaCD40L (10 ⁇ g) / PBS + MegaCD40L (10 ⁇
  • Figure 21 shows graphs showing the evolution over time of the concentration of anti-SLA antibodies (soluble Leishmcmi ⁇ antigen) IgGl type (upper part, A) or IgG2 type (upper part, B) in Beagle dogs those who had been inoculated promastigotes of Leishmania infantum.
  • anti-SLA antibodies soluble Leishmcmi ⁇ antigen
  • IgGl type upper part, A
  • IgG2 type upper part, B
  • Each curve corresponds to a different prior immunization group: filled squares, ⁇ : Negative control (C (-)); filled triangles, A: Positive control (C (+)); filled diamonds, ⁇ : group immunized with DNA-LACK / rVV-LACK prior to challenge with promastigotes; six-pointed asterisks, *: group immunized with DNA-LACK / MV A-LACK prior to challenge with promastigotes.
  • Example 1 Construction and characterization of the MVA-LACK recombinant virus
  • plasmid vector pHLZ-LACK For the construction of a recombinant MVA virus that contains a coding sequence of the LACK protein of L. infantum, an intermediate step of construction of a plasmid, pHLZ LACK, was necessary that allowed the insertion of the coding sequence of the LACK protein in the HA locus of the MVA genome.
  • This plasmid contains the right and left flanking regions of the hemagglutinin (HA) gene, and the ampicillin resistance gene.
  • Vaccinia promoters in opposite orientation: the p7.5 viral promoter that directs the expression of the ⁇ -gal gene, and the early / late synthetic promoter (pE / L), which directs Linfantum LACK protein gene expression.
  • pE / L early / late synthetic promoter
  • Two other plasmids were used for its construction: - pUC LACK: plasmid derived from the vector pUC19 containing the gene encoding the LACK protein of L. infantum at the EcoRI cutting site, in addition to the elements necessary for replication and selection in E coll
  • This vector was generated by Dr. Gloria González-Aseguinolaza from a genomic DNA template of L. infantum by PCR.
  • the PCR product has a length of 942 base pairs (bp) and the coding region 312 amino acids (7).
  • pHLZ-LACK vector (7400 bp). Plasmid generated in the inventors' laboratory that allows the insertion of genes into the Vaccinia genome by homologous recombination in the HA coding region. After the addition of the ⁇ -galactosidase substrate, X-gal, the development of blue plaques allows the selection of recombinant viruses.
  • the pHLZ-LACK vector was generated from these two plasmids as follows:
  • a 942 bp DNA fragment containing the LACK protein coding sequence of L. infantum was purified from plasmid pUC LACK.
  • the pUC LACK vector was digested with the restriction enzyme Eco Ki, and the fragment corresponding to the LACK gene was purified on agarose gels. The ends of said fragment were blunt by treatment with K ⁇ enow and cloned into the insertion plasmid in Vaccinia pHLZ (previously digested with Sma I, and dephosphorylated by The incubation with alkaline phosphatase (CIP), thus generating the insertion vector pHLZ-LACK (8342 bp).
  • CIP alkaline phosphatase
  • CEF chicken embryo fibroblast
  • Recombinant viruses containing the L. infantum LACK gene and the ⁇ -gal gene were selected by consecutive purification passes on CEF cells and staining with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -galactosidase (300 ⁇ g / ml) After 6 rounds of purification the purified recombinant virus was obtained, without contamination of wild MVA virus.
  • the recombinant, called 3,111.2.1.1.2 (MVA pass 592) was used to prepare a second stock, P2, with title 3 x 10 7 pfu / ml.
  • the P3 stock was prepared from infected CEF cells at a multiplicity of 0.05 pfu / cell and purified by two 36% sucrose mattresses. The title of this stock is 0.975x 10 9 pfu / ml. Sequencing of the insert present in its genome resulted in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • PCR analysis was carried out.
  • Viral DNA was purified from CEF cells infected with the MVA LACK virus (stock P2) at a multiplicity of infection of 5 pfu / cell.
  • PCR analyzes were carried out for the hemagglutinin and thymidine kinase locus, using the oligonucleotides indicated in Table 1 as primers, whose location with respect to the hemagglutinin and thymidine kinase locus is shown in the upper part of Figure 2.
  • TK-R 5 'TGTCCTTGATACGGCAG 3' SEQ ID NO: 2
  • HA-MVA 5 'TGACACGATTACCAATAC 3' SEQ ID NO: 5
  • VV-LACK HA in those cases in which you want to distinguish from the VV-LACK TK virus " , in which the LACK sequence is inserted in the thymidine kinase locus.
  • MVA LACK can be amplified without loss of exogenous gene expression
  • a stability test was carried out.
  • the recombinant virus was amplified from the P2 to P4 stock in CEF cells at a multiplicity of infection of 0.05 pfu / cell. Plates generated with the P4 stock were analyzed by immunomarking with an anti-WR and anti-LACK polyclonal antibody. The results, shown in Figure 3, show that 100% of the plates recognized by the anti-WR antibody are also positive for LACK.
  • the LACK gene therefore, is stably maintained in the MVA-LACK recombinant virus.
  • the ELISPOT results show that the number of CD8 + secreting ⁇ - ⁇ secreting agents for LACK is 3.15 times lower in animals inoculated with MVA-LACK compared to those that received VV-LACK when they received a single dose. In line with this, the amount of IFN- ⁇ secreted by splenocytes stimulated with the protein was 5 times less. However, the number of IFN- ⁇ -secreting CD 8+ cells specific for viral antigens was approximately 5 times higher in animals inoculated with VV-LACK. The fact that the immune response induced against the vector in the case of MVA allows a booster effect after a second dose of immunization.
  • VV-LACK Two doses of VV-LACK dramatically decrease the number of IF8- ⁇ secreting CD8 + cells; however, when the animals received in the first dose MVA-LACK and MVA-LACK or VV-LACK in the second booster dose, both the one and the other recombinant vector were able to amplify the immune response. Although the number of IFN- ⁇ secreting CD 8+ cells was similar in both cases, the amount of IFN- ⁇ secreted and measured by ELISA was 70 times higher when the booster dose was performed with MVA-LACK, and 86 times higher than when a single dose of MVA-LACK was received.
  • IgGs Different isotypes of IgGs are considered indicators of the response against L. infantum.
  • IgG2a is associated with asymptomatic conditions while the IgG1 isotype is related to disease. 8 days after the second immunization, the serum from the animals was collected and the presence of antibodies specific for
  • IgG2a associated with a ThI response
  • the immune response generated by the MVA-LACK recombinant virus was also evaluated in a heterologous immunization protocol based on a first dose of immunization with a recombinant naked DNA vector that allows the expression of the LACK protein in mammalian cells and a second dose.
  • a recombinant naked DNA vector that allows the expression of the LACK protein in mammalian cells and a second dose.
  • viruses derived from Vaccinia recombinant viruses derived from Vaccinia.
  • the plasmid pCI-neo_LACK was used in the first immunizations, which will be referred to as DNA-LACK, which is an expression vector in mammalian cells which, like the
  • MVA-LACK expresses the LACK protein of L. infantum. This plasmid was generated by insertion of the LACK gene into the Smal site of pCI-neo, and differs from that patented by the
  • CSIC Higher Council for Scientific Research
  • W-LACK TK- previously used and generated in the laboratory was inoculated and has been shown to confer some degree of protection when used at a dose of 5 x 10 7 pfu / mouse (9), VV-LACK HA- and VV Luc.
  • ELISPOT ELISPOT
  • ThI related to protection
  • Th2 associated with susceptibility
  • the type of cellular response induced after the immunization described above was evaluated.
  • the splenocytes isolated from the immunized mice were re-stimulated with the LACK protein (upper part of Figure 10a) or with a class II immunodominant peptide thereof (lower part of Figure 10a).
  • the supernatants were collected and the presence of ThI (IFN- ⁇ ) or Th2 (IL-4) type cytokines was determined therein by ELISA.
  • the graphs in Figure 10a show that splenocytes from mice immunized with DNA-LACK in the first dose and MVA-LACK in the second produced more IFN- ⁇ and IL-4 than the other groups.
  • mice that the highest levels of IFN- ⁇ are detected (the groups of mice immunized with DNA-LACK in the first dose and MVA-LACK in the second) in which the highest levels are also detected of TNF- ⁇ (35.9 pg / ml when re-stimulated with LACK and 63.3 pg / ml when re-stimulated with the peptide), data clearly higher than those corresponding to groups immunized with DNA-LACK / VV-LACK -HA "(where detected 18 pg / ml when restimulated with LACK and is 25 pg / ml when restimulated with peptide) and control groups (where 9 pg detected / ml and 18 pg / ml, respectively).
  • Th2 type cytokines the inclusion of data referring to IL-10 confirms that the highest levels are detected in groups immunized with DN AL ACKTM V AL ACK, regardless of the levels of IL-4 and IL- IO, the Thl: Th2 ratio corresponded to the groups that received MVA-LACK in the second dose, confirming a clear trend of the immune response to the ThI type response in this group.
  • the next step was to determine which population of T cells (CD4 + or CD8 +) was involved in the secretion of ThI-type cytokines (IFN- ⁇ and TNF- ⁇ ).
  • animals were immunized with immunization regimens similar to those used to obtain the results represented in Figure 8, that is, a first dose of initiation of the response with DNA-LACK and a second dose of reinforcement of the response with MVA -LACK (dose of 1 xlO 7 pfu or 5 x 10 7 pfu) or VV-LACK-HA ' (dose of 1 xlO 7 pfu or 5 x 10 7 pfu), while animals used as controls received DNA- CONTROL (the plasmid vector pCI-neo, without LACK sequence) in the first dose of initiation of the response and VV-LUC-HA- in the second dose, of reinforcement of the response.
  • DNA- CONTROL the plasmid vector pCI-neo, without LACK sequence
  • the animals were immunized with a DNA vector that expresses the LACK protein other than DNA-LACK, pMOK-LACK, and as controls the minimalistic vector MIDGE (minimalistic, immunologicatty deflned gene expression: minimalistic expression of immunologically defined genes) MIDGE-NLS ( MOLGEN®) or the empty vector without pMOK insert. 15 days later, the group that had been inoculated with pMOK received a second dose with pMOK, the group that had received the MIDGE-iNij ⁇ recioio v V -LUL.
  • MIDGE minimalistic, immunologicatty deflned gene expression: minimalistic expression of immunologically defined genes
  • LACK / MVA LACK turned out to be protected against leishmaniasis caused by L. major, since the mice that integrated it hardly developed an injury. This measure is correlated with a decrease in the parasite load: they present 4 times less parasites than the control groups.
  • the lesion presented is significantly different in the groups immunized with recombinant vectors derived from Vaccinia with respect to the control groups.
  • the group immunized with 5 x 10 7 pfu of VV-LACK presents a certain degree of injury, although this is significantly different from the control group as of week 8 after the challenge.
  • the lesion in the control groups continues to increase exponentially while in the group immunized with DNA-LACK / VV-LACK the lesion begins to stabilize.
  • the animals of the control groups were sacrificed for ethical reasons 9 weeks after the challenge. At the same time the animals of the group immunized with DNA-LACK and VV-LACK were sacrificed. The animals of the groups that received MVA-LACK remain without injury for at least 11 weeks, and are under observation to analyze whether protection is maintained over time.
  • the murine model can be predictive of the results obtained in vaccination trials conducted with nonhuman primate models (40, 41, 42), the model was used Intradermal murine to test the potential of heterologous vaccination regimens with recombinant DNA and virus vectors derived from Vaccinia.
  • Balb / c mice 4 to 6 weeks old were inoculated intradermally with 100 ⁇ g of the plasmid DNA vector expressing the LACK DNA-LACK protein (pCINeo -DNA-LACK) or Control DNA. Fifteen days later they received the second dose of immunization, intraperitoneally, with ix IO 7 pfu / mouse or 5 x IO 7 pfu / mouse of MVA-LACK or the recombinant virus derived from the Western Reserve wild strain that also has the antigen inserted LACK in the hemagglutinin locus (W-LACK), providing 5 x 10 7 pfu / mouse of VV-Luc to the group that had received Control DNA A control group that received PBS was included in both the first and second immunization doses.
  • W-LACK hemagglutinin locus
  • mice were infected intradermally in the auditory pavilion using 10 7 metacyclic promastigotes of L. infantum as previously described (43).
  • parasitic loads were evaluated by limiting dilution analysis in the groups of immunized and control mice, evaluations performed on the spleen, liver and draining lymph node.
  • Figure 16 represents the average values obtained from at least 4 mice per group, demonstrate that the mice that were immunized following a vaccination regimen with a first initiation dose of the response and a second booster dose using vectors capable of expressing the LACK antigen were significantly protected against infection.
  • the level of protection in each tissue was comparable between the various groups of mice that had received vectors capable of expressing the antigen and did not differ statistically between the mice that received VV-LACK or MVA-LACK.
  • variations in the level of protection between the different organs were observed, observing the highest levels of protection in the draining lymph node (part C of Figure 16).
  • the level of protection in this organ ranged from a reduction factor of 144 to 244 times in parasitic loads compared to control mice.
  • the spleen part A of Figure 15
  • the liver part B of Figure 16
  • IFN- ⁇ and the TNF-ct / LT ratio appear to be involved in resistance to infection in murine visceral leishmaniasis (27,29,30,46), while IL-IO appears to be associated with susceptibility (26,33), spleens of immunized and non-immunized mice were removed both before proceeding with the challenge with L. infantum as well as one month after performing this one. With them, an ELISPOT test was carried out to evaluate the number of IFN- ⁇ -secreting cells specific for LACK present for every 10 6 splenocytes, as well as to perform tests of produced cytokine levels present in the culture supernatants of said splenocytes isolated from mice re-stimulated with the LACK protein during their culture.
  • Part A corresponding to the concentration of IFN- ⁇ , in ng / ml, detected in the supernatants of the re-stimulated splenocyte cultures, shows that mice that received 10 7 pfu of VV-LACK or 5x10 7 pfu of MVA-LACK appear to produce somewhat higher levels of IFN- ⁇ (100-113 ng / ml), compared to mice that received in the 5x10 booster dose 7 pfu of VV-LACK or 10 7 pfu of MVA-LACK (55-67 ng / ml).
  • IFN- ⁇ -producing cells specific for LACK performed by ELISPOT, which is represented in part B of Figure 17, indicates that the number of IFN- ⁇ secreting cells correlates with IFN- ⁇ levels detected by ELISA, oscillating the frequency of IFN- ⁇ producing cells between 380 and 640 cells / 10 6 splenocytes.
  • significant levels of TNF ⁇ / LT (58 and 134 pg / ml) were observed in mice that had received VV-LACK, while levels of TNF ⁇ / LT produced in response to the LACK antigen by mice that had received MVA- LACKs were lower (27 pg / ml and 8 pg / ml, respectively).
  • TNF ⁇ may reflect, in part, the different ability of WR and MVA to induce inflammatory responses and activation of NF- ⁇ B, which results in OerfHc of different ciiocn ⁇ rmi; "MVA notices the activation of NF- ⁇ R while WR appears to inhibit it.
  • the cytokine responses detected in splenocytes isolated one month after mice were subjected to a challenge with L. infantum showed variations between samples parallel to those found before the challenge, although they were somewhat higher. Significant levels of IL-IO and TNF ⁇ / LT were also produced.
  • the concentrations of IFN- ⁇ detected by ELISA in the supernatants of splenocytes undergoing stimulation, the IFN- ⁇ / IL-10 ratio and the reduction factors in the parasite load in the analyzed tissues, all evaluated one month after challenge with L. infantum, are shown below in Table 5, where it can be seen that both the IFN- ⁇ level and the IFN- ⁇ / IL-10 ratio seem to correlate with the protection found.
  • nitric oxide is critical for the leishmanicidal activity of murine macrophages (44,45,46). It was observed that in the mice that had received vectors capable of expressing LACK significant amounts of this antimicrobial agent were detected, ranging from 6 to 7 ⁇ M, while in the control groups the NO / nitrite levels were much smaller, ranging from 0.5 ⁇ M and 1 ⁇ M. Therefore, vaccinated mice, consistent with levels of IFN- ⁇ detected, have higher levels of induction of nitric oxide production and greater potential leishmanicidal activity.
  • the assays described in this example demonstrate that the administration of Vaccinia-derived recombinant viruses capable of expressing the LACK antigen as part of immunization protocols in which they are delivered in the second booster dose, while the first dose is delivered a DNA vector that expresses the same antigen, is highly immunogenic and confers protection against L. infantum infection in mice, while the protective effect is not achieved with vaccinations with DNA vectors in both doses.
  • the vector derived from the highly attenuated strain MVA and the derivative of the virulent strain of Vaccinia competent for Western Reserve replication resulted in comparable levels of protection.
  • the highly attenuated MVA line guarantees greater safety for use in humans makes this vector a good candidate to be used for the protection of human beings against visceral leishmaniasis.
  • Example 8. Growth Efficiency of MVA-LACK An additional test was performed to determine the growth efficiency of the recombinant MVA-LACK virus. For this, permissive cells (BHK-21) were infected at a multiplicity of infection of 0.01, either with the recombinant virus MVA-LACK or with the parental virus lacking inserts, MVA-WT. At different post-infection times (1, 24, 48 and 72 hours), the virus present in the culture medium (extracellular) and the virus associated with cells (intracellular) were titrated by immunostaining of the virus.
  • Figure 18 shows graphs showing the results obtained as a function of time. Both in the graph that refers to the intracellular virus (A) and in the graph that refers to the extracellular virus ⁇ ), it can be seen that there is no inhibition of the growth of the recombinant MVA-LACK viruses compared to the parental virus. - Example 9.- Duration of the protection induced by the administration of DNA-LACK and MVA-LACK
  • DNA-LACK was replaced by an "empty" plasmid, devoid of insert with LACK coding sequences (DNA-Control), and the recombinant viruses with LACK sequences were replaced by the VV-LUC virus, a virus derived from Vaccinia that contains the luciferase gene inserted at the hemagglutinin site but lacks an insert with LACK coding sequences;
  • VV-LUC virus a virus derived from Vaccinia that contains the luciferase gene inserted at the hemagglutinin site but lacks an insert with LACK coding sequences
  • the animals were not stimulated with any vector ("naive"), but received PBS at the two immunization doses.
  • the promastigotes were inoculated subcutaneously in the plantar pad of the right hind leg.
  • the development of lesions in the plantar pad in which the inoculation had occurred was monitored, taking weekly measures.
  • the assay was extended for 30 weeks after the challenge, to check if the protection conferred by immunization was prolonged over time.
  • Figure 19 in its upper part (A) shows a graph in which the evolution of the size of the lesions is represented with the time elapsed after the challenge.
  • All the animals of the control groups, Group 4 (DN A-contro W V-LUC) and Group 5 (PBS / PBS) developed severe lesions, as can be seen in the photographs shown in part B of Figure 19, taken 8 weeks after the challenge.
  • the animals of the control groups had to be slaughtered for ethical reasons.
  • mice immunized with MVA-LACK again showed a higher degree of protection than mice immunized with VV-LACK (VV-LACK-HA- in Figure 19) .
  • mice were immunized with a first dose of
  • DNA-LACK and a subsequent dose of MVA-LACK inoculating the animals, one day after each of the doses of vaccination vectors, different amounts of an adjuvant, specifically the pro theme CD4ÜL (Mega CD40L: m-ACRP30 m -CD40L, from APOXIS).
  • mice The animals, Balb / c mice, were immunized intradermally, on day 0, with 100 ⁇ g of the DNA-LACK plasmid or DNA-Control plasmid, lacking LACK insert and one day later the animals received the adjuvant by the same route (1, 10 or 20 ⁇ g of Mega CD40L, depending on the group). Fifteen days later, the mice received the booster dose with 1 x 10 7 pfu / mouse of MVA-LACK or MVA-WT intraperitoneally, and one day later they were inoculated by the same route different amounts of adjuvant (1, 10 or 20 ⁇ g of Mega CD40L, depending on the group).
  • mice were inoculated with 5 x 10 4 metacyclic promastigotes of L. major.
  • mice in groups 1, 3 and 4 received a second booster dose with 5 ⁇ 10 7 pfu MVA-LACK; in the case of group 4, together with that second booster dose, the mice also received 20 ⁇ g of the adjuvant, also via intraperitoneal
  • a schematic representation of the immunization protocol followed is shown at the top, A, of Figure 20.
  • the size of the lesions was monitored weekly, obtaining the results that are represented in the graph that appears in the intermediate part of Figure 20, marked as "B".
  • the graph at the bottom of Figure 20, marked "C” allows us to observe the sizes of the lesions measured in each of the surviving mice of groups 1, 2, 3, 4, 5 and 7 after 27 weeks from the challenge; Group 6 mice, which had received only PBS prior to the challenge, had to be sacrificed 12 weeks after the challenge, as was done with a group 2 mouse after the same period of time and with a group 5 mouse a week later.
  • mice 1 and 3 In the groups imnuiiizau ⁇ i) e ⁇ n DNA-LACK and MVA-LACK MU ⁇ tuyuvdmc (groups 1 and 3), only 1 mouse from each group developed an injury; in group 3, in particular, the size of the lesion caused the mouse to be sacrificed before the 27-week period after the challenge of the study. In the mice of these Two groups that did not develop an injury (75%), the growth of the parasite was controlled, as evidenced by the fact that they did not develop lesions after 27 weeks had passed since the challenge and also because they did not present inflammation of the draining lymph node. In group 1, which was not given adjuvant, the administration of the second booster dose weeks after the challenge facilitated the control of parasite replication.
  • the data obtained seem to indicate both that the administration of a second booster dose is positive with respect to increasing the immunity already generated thanks to the previous doses and that the administration of vaccination vectors expressing the LACK protein is compatible with the administration of adjuvants , although it is preferable to do so.
  • the first group which was used as a negative control, received neither vaccination nor inoculation of L. infantum. Dogs in this group received 0.5 ml of saline intravenously on day 0 (47.48). - The second group was used as a positive control. The dogs did not receive vaccination, although L. infantum was inoculated.
  • the third group was vaccinated with two doses of the gene encoding LACK May 1 on day -30 with DNA-LACK plasmid (100 ug) and the second on day -15 with the recombinant virus derived from vaccinia rVV-LACK ( 10 pfu / dog).
  • the fourth group was inoculated with a dose of plasmid DNA-LACK (100 ⁇ g) on day -30 and a second dose of the gene coding for LACK using the MVA-LACK virus (IO 8 pfu / dog).
  • Table 8 shows a summary of the inoculations that each group received.
  • DNA-LACK 100 ⁇ g
  • rVV-LACK (lx l ⁇ 8 pfu)
  • L. infantum (1 xlO 8 pfu)
  • DNA-LACK 100 ⁇ g
  • MVA-LACK I x 10 8 pfu
  • L. infantum (1 xlO 8 pfu) (4 dogs)
  • L. infantum used to trigger the experimental infection were obtained from a dog in the Zaragoza area, naturally infected with L. infantum and who had not received treatment (MON l / MCAN / ES / 01 / LLM 996, Parasitology Reference Service, Majadahonda, Spain).
  • the parasites were obtained by aspiration of the bone marrow and popliteal nodes, were grown in NNN medium (Novy-Nicolle-McNeal), medium in which two passes were made, and then multiplied in RPMI 1640 (Sigma, United Kingdom) supplemented with 2 mM glutamine, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 100 U / ml penicillin and containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FCS) (Sigma, United Kingdom).
  • FCS heat-inactivated fetal bovine serum
  • Promastigotes of L. infantum were also cultured in RPMI medium containing fetal calf serum to 10%, to 26 0 C, for use in the direct agglutination test and the immunofluorescence. Promastigotes were collected at 3600 xg for 10 minutes at 4 0 C. After five washes, 20 volumes of trypsin (0.4% w / v, Difco) were added to the sediment, the mixture was incubated at 37 ° C for 45 minutes and then washed five more times in cold Locke solution (154 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM NaHCO 3 pH 7.7).
  • cold Locke solution 154 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM NaHCO 3 pH 7.7
  • the cells were counted and resuspended until reaching a final concentration of 1x10 cells / ml.
  • promastigotes were grown in RPMI 1640 medium (Gibco) supplemented with 10% heat-inactivated FCS, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 100 U / ml penicillin (Gibco).
  • the parasites were collected at the end of the logarithmic phase, washed with PBS and fragmented by three freeze-thaw cycles. The parasites were then sonicated and centrifuged at 16,000 xg for 3 minutes at 4 0 C, the supernatant being collected. Next, the protein concentration in it was determined using the Bradford method with the BioRad protein assay kit (Bio-Rad Protein Assay, BioRad Laboratories).
  • the test was carried out on a V-shaped 96 well microtiter plate (Costar, USA). 50 ⁇ l of the parasite suspension was added to each of the wells, in which serial dilutions of the dogs' sera had previously been loaded, starting from the 1: 100 dilution. The plates were shaken gently for 1 minute and then incubated at RT overnight in a humid chamber. The presence of blue aggregates was detected by direct observation (two independent measures), which correlated with the dilutions of the sera. Values greater than 1: 800 were considered positive.
  • the serum of the dog to be analyzed is reacted with a Leishmania preparation on a slide, incubated at 4 ° C for 30-45 minutes and then the preparation is incubated with an anti-dog serum conjugated with fluorescein, for at least 1 hour, so that, if in the dog's serum there is a specific antibody capable of recognizing the Leishmania parasite, it will be marked in green. Serums that gave a value equal to or greater than 1/80 (55.56) were considered positive.
  • IgGl and IgG2 were carried out on plasma samples obtained from blood samples taken over the period of testing. Specifically, an ELISA determination was made of the specific antibodies against the soluble Leishmania antigen (SLA), obtained as described in section 11.2. Briefly, the ELISA plates were coated with 10 ⁇ g / ml of PBS blocked SLA containing 1% BSA, and then incubated with 100 ⁇ l of 1: 100 diluted dog serum.
  • SLA soluble Leishmania antigen
  • HRP conjugated antibodies 100 ⁇ l / well of the following HRP conjugated antibodies were added: a goat anti-dog IgGl antibody (1: 15000) or a sheep anti-dog IgGl antibody (1: 20,000), both from Bethyl Laboratories (Montgomery, TX, USA).
  • the antibodies were incubated with the OPD substrate (Zymed Laboratories, Invitrogen Immunodetection).
  • the absorbance was read at 450 nm, arbitrarily assigning in each group the value 1 to the average value corresponding to the samples obtained on the day -30 of the experiment and calculating for the rest of the samples the value n, corresponding therefore by 1 increment in absorbance with respect to the value obtained on day -30.

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Abstract

Vectores recombinantes basados en el virus vaccinia modificado de Ankara (MVA) como vacunas contra la leishmaniasis. Los vectores de la invención contienen secuencias codificantes de la proteína LACK, preferentemente insertadas en el locus de hemaglutinina del virus y bajo el control de un promotor que permite su expresión a lo largo del ciclo de infección del virus. Son vectores seguros, estables, que dan lugar a una potente respuesta inmune que confiere protección frente a la leishmaniasis, por lo que son buenos candidatos para ser utilizados en vacunación frente a esta enfermedad, especialmente en seres humanos, así como en el reservorio animal más importante de esta antropozoonosis, los perros..

Description

VECTORES RECOMBINANTES BASADOS EN EL VIRUS VACCINIA MODIFICADO DE ANKARA (MVA) COMO VACUNAS CONTRA LA
LEISHMANIASIS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la utilización de virus recombinantes basados en el virus vaccinia modificado de Ankara (MVA) en vacunación. Más concretamente, la invención se refiere a virus recombinantes derivados del MVA que actúan como sistemas de expresión de la proteína LACK o de fragmentos inmunogénicos de la misma y a su uso en la vacunación frente a la leishmaniasis tanto de seres humanos como de otros mamíferos susceptibles de contraerla como los perros.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La leishmaniasis es una antropozoonosis que abarca un complejo grupo de cuadros clínicos producidos por protozoos del género Leishmania, los cuales parasitan células del sistema monocito-macrófago. Leishmania es un protozoo flagelado que pertenece al orden Kinetoplastida y a la familia Trypanosomatidae. La clasificación del género Leishmania en sus diferentes especies es compleja y en la actualidad se realiza mediante el análisis de los fragmentos de restricción del ADN del Kinetoplasto. Es la siguiente:
ORDEN: Kinetoplastida FAMILIA: Trypanosomatidae GÉNERO: Leishmania
SUBGÉNERO: Leishmania Complejo: L. donovani
L. donovani; L. infantum; L. chagasi; L. archibaldi Especies fuera del complejo L. donovani
L. trópica; L. aethiopica; L. major; L. gerbilli Complejo: L, mexicana
SUBGÉNERO: Viannia
Complejo: L. braziliensis
L. braziliensis; L. panamensis; L. guyanensis; L. peruviana El ciclo vital se desarrolla en dos huéspedes, uno vertebrado (mamífero) y un vector invertebrado (mosquito hembra de la familia Phlebotomidae, un díptero del género Phlebotomus en el Viejo Mundo y Lutzomya en el Nuevo Mundo también conocido como beatilla de las arenas). En el huésped vertebrado, Leishmania es un parásito intracelular obligado que se encuentra en los macrófagos en forma de amastigote. Los amastigotes son formas redondeadas con unas dimensiones de 3-5 μm x 2-3 μm, con un flagelo rudimentario que no sobresale del soma y que se reproducen por fisión binaria. Los amastigotes pasan al insecto, con la picadura al ingerir sangre de un mamífero parasitado. En la bolsa peritrófica del intestino medio del insecto, los amastigotes se transforman en promastigotes, forma móvil y alargada con un único flagelo en su polo anterior, que se multiplican activamente en el intestino medio del mosquito. Al cabo de 15-20 días de su ingestión comienzan a desprenderse de la cutícula intestinal invadiendo la hipofaringe. Por la picadura a un nuevo huésped, el insecto inocula los promastigotes, denominados metací cucos, quienes una vez en el interior del huésped vertebrado serán fago citados por las células del sistema monocito- macrófago, donde se transformarán y multiplicarán como amastigotes.
Las manifestaciones clínicas de la enfermedad varían dependiendo de la respuesta inmune del hospedador, la cepa y la virulencia del parásito, observándose desde lesiones cutáneas que curan espontáneamente, hasta una forma visceral de la enfermedad que puede conducir a la muerte en caso de no recibir tratamiento.
La leishmaniasis cutánea, típicamente, es causada por Leishmania trópica, Leishmania major y Leishmania aethiopica (especies del "Viejo Mundo") y por Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania bra∑iliensis, Leishmania panamensis, Leishmania guyanensis, Leishmania peruviana, Leishmania chagasi y otras especies en el Nuevo Mundo. Se presenta, con frecuencia, en forma de úlceras superficiales con bordes elevados, que surgen por lo común en zonas localizadas o expuestas de la cara y las extremidades y que pueden acompañarse de lesiones cutáneas y adenopatía regional. Las manifestaciones clínicas de la leishmaniasis cutánea en el Viejo y en ei Nuevo Mundo son simiiares. Se necesita que transcurran años pata ia resolución espontánea de las lesiones y suele quedar una cicatriz plana atrófica.
La leishmaniasis visceral, conocida también como Kala-azar o fiebre Dum-Dum, es causada por las especies L. donovani, L. chagasi y L. infantum. Su sintomatología característica en humanos consiste en cefaleas, fiebre a intervalos, astenia, diarrea, dolores abdominales, cólicos, adenopatías, hepatomegalia, esplenomegalia, anemia, leucopenia, trombocitopenia, lesiones oculares, crecimiento excesivo de uñas y pestañas así como la aparición de infecciones oportunistas. En España y Sudoeste de Europa la leishmaniasis es una zoonosis, siendo los perros su reservorio principal. Estudios epidemiológicos revelan que hasta el 80% de los perros en zonas endémicas están infectados (3, 31), de los cuales el 50% desarrolla la forma visceral de la enfermedad (3, 17).
La especie tradicionalmente conocida como causante de la leishmaniasis visceral en la zona mediterránea es Leishmania infantum. Sin embargo, su distribución se extiende hacia el este de Europa y países asiáticos. En la actualidad se considera como sinónimo de Leishmania chagasi (22), por lo que su distribución se ampliaría hasta América latina y posiblemente hasta la zona sur de Estados Unidos (10).
La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que la prevalencia mundial de la enfermedad en humanos alcanza los 12 millones de personas, con una incidencia anual de 1,5 a 2 millones de nuevos casos de leishmaniasis cutánea y 500000 nuevos casos de leishmaniasis visceral (WHO 2000). Existe además una elevada incidencia de la enfermedad en pacientes de SIDA, ya que la infección con HIV incrementa el riesgo de desarrollar leishmaniasis de 100 a 1000 veces (2I)5 lo que provoca una elevada mortalidad. La OMS estima que entre el 2 y el 9% de todos los pacientes de SIDA en la zona sur de Europa desarrollarán leishmaniasis visceral (WHO 1995). Aunque existen fármacos que pueden utilizarse para tratar la enfermedad, las variantes del parásito en casos de leishmamasis visceral y cutánea que son resistentes a esos fármacos son cada vez más comunes, por lo que es importante el desarrollo de estrategias alternativas para Ia lucha contra esta enfermedad como puedan ser el desarrollo de vacunas. El hecho de que pacientes que se han recuperado de una infección natural desarrollan una fuerte respuesta inmune frente a Leishmania sugiere la posibilidad del desarrollo de una vacuna contra este complejo parásito (19).
Diferentes anügerios haii sido udiizadυü cυiiílrienuυ uibüiiιυ& giadυs Ue protección. Un estudio reciente en el que se comparan diferentes candidatos en forma de ADN ha demostrado que el gen de la proteína LACK es el más prometedor (1). El antígeno LACK (Leishmania homolog for receptors for Activated C Kinase) es una proteína de 36 KDa de peso molecular altamente conservada entre las diferentes especies de Leishmania, y que se expresa tanto en el promastigote como en el amastigote. La proteína LACK es una diana preferencial de la respuesta temprana antiparasitaria, de forma que dirige la expansión de células secretoras de IL-4 que conducen a la enfermedad. Los estudios indican que la administración de vectores de ADN desnudo que codifican el antígeno LACK es capaz de proporcionar protección frente a L. major aunque, a pesar de su alta inmunogenicidad, no logran proteger frente a la leishmaniasis visceral (VL) murina cuando son inoculados por vía intradérmica o intravenosa (36), lo que podría interpretarse como indicación de que LACK podría no ser un antígeno útil para vacuna general contra la leishmaniasis basada en vectores de ADN desnudo.
Sin embargo, el sistema utilizado para hacer llegar la secuencia codificante del antígeno y posibilitar la presencia de éste en la célula puede ser un elemento crítico que determina la eficacia antigénica, por lo que LACK puede ser un antígeno útil cuando su presencia en la célula viene determinada por la inclusión de su secuencia codificante en un vector que posibilite su expresión que no sea ADN desnudo. Los vectores basados en virus Vaccinia han demostrado ser un buen sistema de aporte de antí genos para el control de enfermedades infecciosas en estudios con modelos animales (37) y, en particular, han demostrado gran capacidad para aumentar la respuesta inmune celular específica cuando a los animales se les administra una primera dosis de inmunización (priming) que contiene diversos vectores recombinantes (ej. ADN desnudo, proteínas, seudopartículas, vectores virales distintos al virus vaccinia) seguida posteriormente de una segunda dosis de refuerzo (booster) con un Virus Vaccinia recombinante, expresando los vectores de la primera y de la segunda dosis el mismo antígeno (18, 35). Los protocolos que combinan los vectores Vaccinia recombinantes en la segunda dosis con la administración de vectores recombinantes de ADN desnudo en la primera dosis (5, 8, 12-15, 20, 28, 30, 33) están permitiendo lograr resultados esperanzadores en distintos modelos animales, obteniéndose protección que se correlaciona con la activación áe una respuesta inmune celular, especialmente la activación de células T CD8+ secretoras de IFN-γ. La inmunización con ADN promueve la respuesta inmune tanto humoral como celular, confiriendo protección en modelos experimentales (34). Este método ofrece la posibilidad de manipular la respuesta inmune inducida con la coadministración de adyuvantes, como puedan ser citoquinas, para aumentar la eficacia de la vacunación (11, 16).
Un ejemplo de Ia utilización de estas estrategias en las que se combinan citoquinas con virus recombinantes derivados de Vaccinia lo constituye la solicitud de patente española ES2171360, en la que se describe la utilización de un virus recombinante derivado de la cepa de tipo salvaje Western Reserve (WR) de Vaccinia, que incorpora la secuencia codificante de la proteína LACK bajo el control del promotor p7.5 del virus, realizándose pruebas de administración a ratones tanto de distintas dosis de este vector como combinándolo con otro que contenía, además de la secuencia de LACK, la secuencia codificante de la citoquina IL-12 bajo el control del promotor pE/L. Por su parte, en la solicitud de adición a la patente española anterior, ES2172482, se describe la administración a perros del primero de los recombinantes, el que incorpora únicamente la secuencia codificante de LACK, en la segunda dosis de vacunación que forma parte de un protocolo de inmunización en el que se administra en la primera dosis un ADN desnudo recombinante que contiene igualmente la secuencia codificante de la proteína LACK. Tanto en la primera solicitud citada como en la adición a la misma, se propone la utilización de los vectores recombinantes derivados de la cepa virulenta (WR, Western Reserve) del virus Vaccinia tipo salvaje como vacunas para animales, admitiendo la necesidad de desarrollar vectores más seguros para poder ser utilizados para la vacunación de seres humanos proponiendo al virus MVA como candidato para ser utilizado para la generación de vectores recombinantes de vacunación adecuados para la utilización en seres humanos. Hasta ahora, sin embargo, seguía sin haberse generado un vector recombinante análogo basado en MVA con capacidad para generar protección frente a Leishmania y cuya estabilidad permitieran plantearse su uso como vacuna frente a la leishmaniasis en seres humanos.
El MVA (Modiβed Vaccinia Virus Ankara) es una forma atenuada de Vaccinia derivada de la estirpe Ankara obtenida mediante más de 500 pases en fibroblastos embrionarios de pollo, que ha sido utilizada en unos 120000 individuos caucásicos sin efectos adversos (23). Durante ia atenuación se ha deltícionado el i 5% deí genoma parental (25), incluyendo genes implicados en la inmunorregulación (4) y el rango de hospedadores (2, 25). Este virus es incapaz de replicarse en líneas celulares y en cultivos primarios humanos (6). Sin embargo, no se produce alteración en los niveles de expresión de las proteínas virales o recombinaníes (32). Su baja virulencia y su buena capacidad para desencadenar respuestas celulares (27) lo convierten en un buen candidato para ser utilizado para la generación de formas recombinantes que permitan la expresión de antígenos contra los cuales se quiera desencadenar una respuesta inmune. Por ello, en la presente invención se decidió elegir este virus como base para conseguir crear un recombinante capaz de expresar una secuencia codificante de la proteína LACK de L. infantum o de un fragmento irrmunogénico de la misma. Sin embargo, a diferencia de los vectores recombinantes basados en la cepa WR descritos en la solicitud ES2171360 y en la adición a la misma ES2172482, en la realización descrita de la invención se ha elegido para la inserción de la secuencia codificante de LACK el locus de hemaglutinina (HA) en lugar del locus de timidina quinasa (TK), pues la inactivación del gen de la hemaglutinina en el vector MVA facilita el proceso de fusión célula-célula (38), lo que aumenta la presentación antigénica después de una inoculación por vía intramuscular o intradérmica. Además, en dicha realización se ha elegido como promotor que regula la expresión de la secuencia el promotor sintético temprano/tardío pE/L (early/late) (39), en lugar del promotor p7.5 que se utiliza en los vectores descritos en las citadas solicitudes, lo que asegura la síntesis continuada del antígeno durante el proceso de infección y da lugar a altos niveles de producción del mismo, facilitándose la generación de una respuesta inmune contra dicho antígeno. También a diferencia de la anterior invención, la infección con MVA produce una menor destrucción celular que la infección con la cepa salvaje WR, aumentando la presentación antigénica. Con todo ello se ha conseguido un vector que da lugar a una mayor estimulación inmunológica, una buena protección frente a la leishmaniasis con respecto a los vectores conocidos en el estado de la técnica utilizados frente a dicha enfermedad. Es más, a diferencia de otros vectores basados en MVA conocidos en la técnica que se han intentado utilizar para la vacunación de seres humanos frente a otras enfermedades, el vector de la invención ha demostrado ser estable y mantener el inserto que contiene tras someterlo a sucesivos pases. Estas características y los resultados de respuesta inmune y protección freme a LeLhmania υbieníuυü cu las piucbctá ícaiizadaa en el modelo murino demuestran que se ha conseguido un vector adecuado para ser considerado para la vacunación de seres humanos frente a Leishmania, en especial si se administra en la dosis de refuerzo de un protocolo de vacunación en el que se administra, en la primera dosis de desencadenamiento de la respuesta inmune un vector recombinante diferente, a partir del cual puede expresarse el mismo antígeno, como puede ser un ADN desnudo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un vector recombinante derivado del virus MVA que lleva inserta una secuencia codificante de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma, secuencia que se encuentra bajo el control de un promotor que permite su expresión durante el proceso de infección del virus MVA. En la realización descrita de la invención, la secuencia codificante de LACK se encuentra insertada, en el vector derivado de MVA, en el locus de hemaglutinina, de forma que se inactiva dicho gen. Sin embargo, están incluidos también dentro del alcance de la invención los vectores recombinantes derivados del virus MVA en los que la secuencia codificante de LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma está insertada en otros sitios de inserción del vector, como puede ser el locus de timidina quinasa.
En la realización descrita de la invención, la expresión de la secuencia codificante de LACK está regulada por el promotor sintético pE/L, que permite la expresión tanto a tiempos tempranos, como tardíos, de la infección del virus MVA, aunque podría utilizarse cualquier otro promotor de poxvirus.
La secuencia codificante de LACK presente en el vector recombinante de la invención puede codificar la proteína completa o un fragmento inmunogénico de la misma. Con el término "fragmento inmunogénico" se hace referencia a un fragmento de la proteína que comprende, al menos, un 20% o, preferentemente, al menos un 50% de la secuencia de aminoácidos de la proteína y que es capaz de desencadenar una respuesta inmune contra la misma. En la realización concreta de la invención cuya construcción se describe con detalle, la secuencia codificante presente en el vector recombinante de la invención codifica la proteína LACK completa de Leishmania infamum, cuya clonación y caracceri/acíón ha sido descrita pυr González- Ascguinolaza et al. (7). El gen de LACK fue cedido por el coordinador de dicho grupo, el Dr. Vicente Larraga del Centro de Investigaciones Biológicas de Madrid. La invención se refiere también a composiciones que comprenden al menos un vector recombinante de la invención y, opcionalmente, al menos un adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse para formar parte de una composición que comprende al menos un vector recombinante de la invención son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia, que se elegirán de acuerdo con la vía de administración que se pretenda utilizar de forma que se obtenga una composición adecuada para ser suministrada por dicha vía. En realizaciones particulares de la invención, la vía de administración se elige entre la vía mtraperitoneal, la vía intradérmica o la vía intramuscular, prefiriéndose especialmente la vía intramuscular. En esos casos, se tiene preferencia por las composiciones en forma de solución o de suspensión acuosa, por lo que la composición contendría un diluyente farmacéuticamente aceptable tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o cualquier otro diluyente farmacéuticamente aceptable. El vector de la invención es un vector seguro y estable, que da lugar a una potente respuesta inmune celular contra el antígeno LACK y que, como se muestra posteriormente en los Ejemplos, es capaz de inducir protección en el modelo murino frente a leishmaniasis. Es por ello que otro aspecto de la invención lo constituye el uso del vector de la invención para la fabricación de un medicamento destinado a proteger de la leishmaniasis a un mamífero susceptible de desarrollarla. Cuando se realizan ensayos en los que se evalúa la protección generada frente a Leishmania infantum, la utilización del vector de la invención en protocolos de inmunización en los que se administra en la primera dosis un ADN desnudo recombinante que expresa también la proteína LACK, formando parte el vector de la invención de la segunda dosis de refuerzo, da lugar a una protección similar a la que se observa cuando el virus que se utiliza en la dosis de refuerzo es un virus recombinante que expresa también la proteína LACK, derivado de la estirpe Western Reserve de Vaccinia, mientras que en los ensayos en los que se evalúa la protección generada frente a Leishmania major el vector de ía invención da iugar a una protección superior en general a Ia. gcnciada pυi lυ& viiub recombinantes derivados de la estirpe Western Reserve y en particular superior al virus recombinante ya conocido en el que la secuencia codificante de LACK se encuentra inserta en el locus de TK. Es por ello que el medicamento puede estar destinado a la protección frente a la leishmaniasis visceral o frente a la leishmaniasis cutánea. La seguridad del vector de la invención y los resultados de protección observados en el modelo murino, que se considera predictivo de las respuestas que pueden observarse al realizar pruebas en primates no humanos, hacen del vector de la invención un buen candidato para ser utilizado en seres humanos para la protección frente a la leishmaniasis, aunque es también una opción para ser administrado en combinación con o reemplazando a virus recombinantes derivados de la estirpe Western Reserve de Vaccinia que expresan también la proteína LACK, cuyo uso ha sido propuesto para la protección de otros animales como los perros. Los ensayos realizados con animales de esta especie que se describen posteriormente en la presente memoria confirman que los vectores de la invención son una alternativa válida a los virus recombinantes derivados de la estirpe Western Reserve, pues los perros inmunizados con vectores recombinantes derivados de MVA muestran una protección similar a la conseguida con los vectores derivados de la estirpe Western Reserve de Vaccinia, por lo que el mamífero al que vaya destinado el medicamento puede ser también un perro.
Un aspecto adicional de la invención lo constituyen los métodos de vacunación en los que se administra el vector de la invención. Aunque la administración de una única dosis del vector de la invención permite observar una respuesta inmune celular, se tiene preferencia por los métodos en los que se administra más de una dosis, espaciadas en el tiempo. El hecho de que el virus de la invención, derivado de MVA, induzca una baja respuesta frente a los antígenos propios de Vaccinia en comparación con virus recombinantes como los derivados de la estirpe Western Reserve, hace posible su utilización tanto en la primera dosis de iniciación de la respuesta inmune como en dosis posteriores de refuerzo. Se prefieren, sin embargo, los métodos de vacunación heterólogos en los que el virus de la invención se administra en la segunda y/o en dosis posteriores de refuerzo, mientras que en la primera dosis se administra otro vector recombinante diferente que, preferentemente, constituye también un sistema de expresión de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma. Se prefieren especialmente aquellos métodos de vacunación en los que el vccíυi recombinante que se administra en la primera dosis es un ADN desnudo capaz de expresar la proteína LACK de Leishmania infantum, que han demostrado dar lugar a una buena protección en los ejemplos que se describen posteriormente. Una realización particular especialmente preferida de estos métodos de vacunación de la invención es aquella en la que el vector de ADN recombinante utilizado es el plásmido al que se ha aludido en la memoria como DNA-LACK (pCI-neo-LACK), cuya combinación con el vector de la invención ha dado lugar a buenos resultados de protección frente a Leishmania major y frente a Leishmania infantum, aunque es posible la utilización de otros diversos plásmido s como, por ejemplo, pMOK. Otra posible realización de los métodos de vacunación de la invención es aquella en la que se administra, adicionalmente a los vectores de vacunación, un adyuvante, adyuvante que puede ser la proteína CD40L.
La invención se describirá ahora con más detalle a partir de las Figuras y Ejemplos que se describen a continuación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un esquema de la construcción del vector pHLZ-LACK
(parte inferior de la figura) a partir de los plásmidos pHLZ (parte superior izquierda) y pUC LACK (parte superior derecha).
La Figura 2 muestra, en su parte superior, un esquema del virus MVA-LACK y la localización de las zonas con las que se aparean los oligonucleótidos utilizados como cebadores en las PCR de análisis de los locus HA y TK (para identificación de los oligonucleótidos, ver Tabla 1). En la parte inferior se muestran fotografías de los geles obtenidos al realizar dicho análisis por PCR; la parte izquierda corresponde al análisis del locus HA y la parte derecha al análisis del locus TK. En ambos las calles corresponden a las siguientes muestras: +: pHLZ-LACK; 1: VV-LACK HA' (vector recombinante derivado de Vaccinia que contiene la secuencia codificante de LACK (p36) insertada en el locus HA, al que se denomina también en otras figuras Wp36; 2: MVA-LACK; 3: VV-LACK TK" (vector recombinante derivado de Vaccinia que contiene la secuencia codificante de LACK (p36) insertada en el locus TK); WR: estirpe Western Reserve. La Figura 3 muestra las fotografías obtenidas tras la inmunotinción de placas generadas por infección de células CEF con el stock P4 de MVA-LACK, utilizando un anticuerpo policlonal anti-LACK (fotografía de la izquierda) o anti-WR (fotografía de la derecha).
La Figura 4 muestra el patrón de bandas obtenido al hacer reaccionar con un anticuerpo policlonal anti-LACK membranas de nitrocelulosa a las que habían transferido las bandas resultantes de fraccionar en un gel SDS-PAGE extractos celulares recogidos a los tiempos post-infección indicados sobre cada una de las calles. M: muestra en la que se había simulado la infección tomada tras 48 horas. LACK-HIS: muestra de control positivo obtenida a partir de una cepa de E. coϊi que expresa una proteína LACK que lleva una cola de histidina. La Figura 5 muestra el número de células secretoras de IFN-γ detectados mediante ELISPOT por cada 106 esplenocitos de ratones Balb/c estimulados con los vectores indicados en abscisas, que son: VVp36: VV-LACK HA"; MVAp36: MVA- LACK; VVLuc: vector derivado de la cepa WR que contiene el gen de la luciferasa. P: primera dosis; B: dosis de refuerzo. La parte A corresponde a las células secretoras de IFN-γ específicas para la proteína LACK y la parte B a las células secretoras específicas para antígenos virales.
La Figura 6 muestra la concentración de IFN-γ, en ng/ml, detectada en el sobrenadante del cultivo de esplenocitos aislados de ratones inoculados con los vectores indicados en abscisas y reestimulados con la proteína LACK (primera barra, que aparece sombreada) o con un péptido inmunoestimulante de clase II (segunda barra, que aparece rellena en negro). Las denominaciones de los vectores corresponden a: VVp36: VV-LACK HA"; MVAp36: MVA-LACK; VVLuc: vector derivado de la cepa WR que contiene el gen de la luciferasa insertado en el locus HA, por lo que se le denomina también VV-Luc HA-. P: primera dosis; B: dosis de refuerzo. La Figura 7 muestra los valores de densidad óptica, medidos a 450 nm, obtenidos al realizar la detección de anticuerpos específicos para LACK en sueros de ratones Balb/c diluidos 1/10, recogidos 8 días después de la segunda dosis de un protocolos de inmunización con dos dosis de inmunización, cada una de las cuales incluía los vectores que se indican en abscisas, indicando P el vector inoculado en la primera dosis y B el inoculado en la dosis de refuerzo. Las denominaciones de los vectores corresponden a: Wp36: W-LACK HA"; MVAp36: MVA-LACK; VVLuc: vector derivado de la cepa WR que contiene el gen de la luciferasa insertado en el locus HA, por lo que se le denomina también VV-Luc HA-. La primera barra de cada protocolo de vacunación, marcada con líneas inclinadas, corresponde a los anticuerpos del isotipo IgGl ; la segunda barra, rellena en negro, a los anticuerpos del isotipo IgG2a.
La Figura 8 muestra la estructura del plásmido pCI-neo-LACK (DNA-LACK). La Figura 9 muestra el número de células secretoras de IFN-γ detectados mediante ELISPOT por cada 106 espíenocitos de ratones Balb/c estimulados con los vectores indicados en abscisas. P: primera dosis; B: dosis de refuerzo. La parte A corresponde a las células secretoras de IFN-γ específicas para la proteína LACK y la parte B a las células secretoras específicas para antígenos virales. La Figura 10 muestra el patrón de citoquinas secretado tras la reestimulación de espíenocitos aislados de ratones Balb/c inmunizados con combinaciones de vectores recombinantes, en las que el primer vector citado se administró en la primera dosis y el segundo vector en la segunda dosis. Tanto en la Figura 10a como en la Figura 10b, los gráficos de la parte superior de la Figura corresponde a resultados obtenidos al reestimular los espíenocitos con la proteina LACK, mientras que los de la parte inferior corresponden a la reestimulación con un péptido inmunodominante de clase II (PEPT- II). Las combinaciones de vectores con las que se inmunizaron a los ratones son las que se indican junto a las barras, en las que DNA-CTRL: DNA de control carente de inserto con secuencia codificante de LACK. En ambas figuras, los gráficos situados en la parte izquierda muestran la concentración de citoquinas asociadas a respuestas tipo Th2 (IL-4 en el caso de la Figura 10a y tanto IL-4 (barras con relleno; escala sobre cada gráfico) como IL-IO (barras sin relleno; escala bajo cada gráfico) en el caso de la Figura 10b; los gráficos situados en la parte derecha muestran la concentración de citoquinas asociadas a respuestas tipo ThI detectada en cada uno de los casos (IFN-γ sólo en el caso de la Figura 1 Oa y tanto IFN-γ (barras con relleno; escala sobre cada gráfico) como TNF-α (barras sin relleno; escala sobre cada gráfico) en el caso de la Figura 10b. Los datos obtenidos tras la reestimulación de espíenocitos obtenidos de ratones inmunizados con la combinación de vectores DNA-LACK/W-LACK TK- están presentes sólo en la Figura 10a, no habiéndose incluido en la Figura 10b. La Figura 11 corresponde a la evaluación de la protección frente a un desafío de
L. major a ratones Balb/c inmunizados con distintos protocolos de vacunación. La parte A superior muestra un gráfico en el que, en ordenadas, se indica el tamaño de la lesión, expresada en milímetros, detectada transcurridas las semanas que se indican en abscisas tras el desafío con promastigotes de L. major a ratones Balb/c inmunizados con DNA- LACK (100 microgramos) en la primera dosis y, en la segunda dosis con 1 x 10 ufp/ratón de: (*): VV-LACK TK-; (H): VV-LACK HA-; (A): MVA-LACK. Los puntos marcados con el símbolo (•) corresponden a datos de ratones a los que se les administró un ADN de control en la primera dosis y VV Luc HA- en la segunda. En la parte B se muestra el logaritmo en base 10 de la carga parasitaria correspondiente al mismo experimento, detectada en los ganglios poplíteos de los ratones Balb/c. De izquierda a derecha, la barra 1, corresponde a la mezcla de bazos de 8 ratones inmunizados con DNA-LACK/VV-LACK TK- ; barra 3, mezcla de bazos de 8 ratones inmunizados con DNA-LACK/VV-LACK HA-; barras 3 a 10, cada barra representa un bazo de un ratón inmunizado con DNA-LACK/MV A-LACK HA- ; barra 11 , mezcla de bazos de 7 ratones inmunizados con DNA-control (plásmido vacío)/VV Luc HA-.
La Figura 12 muestra, en la parte A, un gráfico en el que, en ordenadas, se indica el tamaño de la lesión, expresada en milímetros, detectada transcurridas las semanas que se indican en abscisas tras el desafío con promastigotes de L. major a ratones Balb/c inmunizados con: pMOK en la primera y en la segunda dosis (datos indicados con un círculo, •; MIDGE-NLS en la primera dosis y VV-Luc en la segunda dosis (datos indicados con el símbolo *); pMOCK-LACK en la primera dosis y MVA-LACK en la segunda dosis (datos indicados con el símbolo X). En la parte B de la Figura se indica la carga parasitaria, expresada en número de parásito/mg, detectada en los mismos animales; la barra uno corresponde a la inmunización con pMOCK-LACK y MVA- LACK, la barra 2 a la inmunización con MIDGE-NLS y VV-Luc y la barra 3 a la inmunización con pMOK en la primera y en la segunda dosis. La Figura 13 muestra un gráfico en el que se indican, en ordenadas, el número de células secretoras de IL-2, específicas para la proteína LACK, detectadas por cada 106 esplenocitos de ratones Balb/c inmunizados con: DNA-LACK en la primera dosis y 1 x 107 ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis (primera barra); DNA-LACK en ia primera dosis y 5 x 10 ufp/ratón de MVA-LACK en la bcguiidd uo=>ϊ;> (bcgundd barra); DNA-LACK en la primera dosis y 5 x 107 ufp/ratón de VV-LACK en la segunda dosis (tercera barra); DNA Control en la primera dosis y 5 x 107 ufp/ratón de W-Luc en la segunda (cuarta barra); PBS tanto en la primera como en la segunda dosis (quinta barra).
La Figura 14 muestra un gráfico en el que, en ordenadas, se indica el tamaño de la lesión, expresada en milímetros, detectada transcurridas las semanas que se indican en abscisas tras el desafío con promastigotes (5 x 104) de L. major a ratones Balb/c inmunizados con DNA-LACK en la primera dosis y, en la segunda dosis con: (4>): 1 x 107 ufp/ratón de MVA-LACK; ("): 5 x 107 ufp/ratón de MVA-LACK; ( Ik): 5 x 107 ufp/ratón de W-LACK; (X): 5 x 107 ufp/ratón de VV-Luc. Los puntos marcados con el símbolo (5H) corresponden a datos de ratones a los que se les administró PBS tanto en la primera como en la segunda dosis.
La Figura 15 muestra fotografías tomadas de ratones sometidos a distintos protocolos de inmunización, trascurridas 8 semanas del desafío con Leishmania major. Los signos "+" indican las patas en las que se inocularon los promastigotes (5 x 104), mientras que los signos "-" corresponden a las patas que sirven como control, donde no se inocularon promastigotes. Las inmunizaciones se realizaron con: Panel A: DNA- LACK en la primera dosis y 1 x 107 ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis; panel B: DNA-LACK en la primera dosis y 5 x 107 ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis; panel C: DNA-LACK en la primera dosis y 5 x 107 ufp/ratón de VV- LACK en la segunda dosis; panel D: ADN de control en la primera dosis y 5 x 107 ufp/ratón de VV-Luc en la segunda dosis; Panel E: PBS tanto en la primera como en la segunda dosis (grupo N: naive).
La Figura 16 muestra gráficos que representan la carga de parásitos detectada en distintos órganos de ratones Balb/c, inmunizados con distintos tratamientos, detectadas un mes después de un desafío intradérmico de 107 promastigotes metacíclicos con L. infantum. Gráfico A: carga detectada en bazo; gráfico B: carga detectada en hígado; gráfico C: carga detectada en nodulo linfático drenante. En cada uno de ellos, las barras corresponden a los siguientes protocolos de vacunación: primera barra (sombreada), DNA-LACK en primera dosis y 107 ufp/ratón de VV-LACK en la segunda dosis; segunda barra (con retícula;, DNA-LACK en Ia primera dosis y 5x10 ufp/raiύn de VV- LACK en la segunda dosis; tercera barra (con líneas inclinadas), DNA-LACK en la primera dosis y 107 ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis; cuarta barra, DNA- LACK en la primera dosis y 5x107 ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis; quinta barra (rellena en negro), plásmido pCI-neo en la primera dosis y 5x10 ufp/ratón VV-Luc en la segunda dosis; última barra (con líneas verticales), PBS en ambas dosis. Los asteriscos sobre las barras indican la existencia de diferencias significativas estadísticamente entre los datos: ***: p<0,001; **: p<0,01; *: p<0,05. La Figura 17 muestra gráficos que corresponden a la respuesta inmune detectada a partir de esplenocitos de ratones Balb/c sometidos a distintos tratamientos de inmunización, ratones a los que no se les había inoculado L. infantum. El gráfico A corresponde a los niveles de IFN-γ, en ng/ml, detectados en el sobrenadante de cultivos de esplenocitos reestimulados con la proteína LACK. El gráfico B corresponde al número de células productoras de IFN-γ específicas para LACK5 detectadas mediante ELISPOT5 presentes por cada 106 esplenocitos. El gráfico C corresponde a los niveles de TNFα/LT, en ng/ml, detectados en el sobrenadante de cultivos de esplenocitos reestimulados con la proteína LACK. El gráfico D corresponde a los niveles de IL-IO, en ng/ml, detectados igualmente en el sobrenadante de cultivos de esplenocitos reestimulados con la proteína LACK. En cada uno de los gráficos, las barras corresponden a los siguientes protocolos de vacunación: primera barra, DNA-LACK en primera dosis y 107 ufp/ratón de VV-LACK en la segunda dosis; segunda barra, DNA- LACK en la primera dosis y 5x107 ufp/ratón de VV-LACK en la segunda dosis; tercera barra, DNA-LACK en la primera dosis y 107 ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis; cuarta barra, DNA-LACK en la primera dosis y 5xlO7 ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis; quinta barra, plásmido pCI-neo en la primera dosis y W-Luc en la segunda dosis; última barra, PBS en ambas dosis.
La Figura 18 muestra sendas gráficas, referidas a la eficiencia de crecimiento del virus recombinante MVA-LACK, gráficas en las que se representa, en ordenadas, el logaritmo de la concentración de virus MVA-LACK (datos representados por cuadrados rellenos: B) y del virus de tipo silvestre MVA-WT (datos representados por rombos: ^) detectados o asociados a las células (Intracel: intracelular; gráfico superior: A) o en el medio de crecimiento celular (Extracel: extracelular; gráfico inferior: B) mediante inmunotinciones realizadas en células BHK-21. transcurridos los tiempos (t) post- infección (p.i.) indicados en horas (h) en el eje de abscisas.
La Figura 19 muestra las lesiones desarrolladas por ratones a los que se les inocularon promastigotes de L. major, en función del tratamiento previo de inmunización. La parte superior de la Figura, A, muestra una gráfica en la que se representa en ordenadas el tamaño de la lesión (Lesn.), en milímetros (mm) observadas en ratones, tras haber transcurrido el tiempo, expresado en semanas, que se indica en abscisas, desde el momento de la inoculación a los ratones de promastigotes de L. major, las combinaciones de vectores de inmunización administrados a cada grupo de ratones previamente a la inoculación de L major se indican sobre el gráfico. En la parte inferior, B, se muestran fotografías de las patas de los ratones sometidos a distintos protocolos de inmunización, trascurridas 9 semanas desde el desafío con Leishmania major, fotografías en las letras "I" situadas sobre las mismas indican las patas en las que se inocularon los promastigotes (5 x 104), mientras que las letras "N/I" indican las patas que sirven como control, donde no se inocularon promastigotes. Las abreviaturas de los grupos de inmunización corresponden a: DNA-LACK/MVA-LACK l_107: DNA- LACK en la primera dosis y 1 x 107 ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis; DNA-LACK/MVA-LACK 5JO7: DNA-LACK en la primera dosis y 5 x 107 ufp/ratón de MVA-LACK en la segunda dosis; DNA-LACK/VV-LACK-HA": DNA-LACK en la primera dosis y 5 x 107 ufp/ratón de VV-LACK en la segunda dosis; DNA-Control/VV- LUC-HA": plásmido de control carente de inserto codificante de LACK en la primera dosis y 5 x 107 ufp/ratón de VV-Luc en la segunda dosis; PBS/PBS: PBS tanto en la primera como en la segunda dosis. La Figura 20 corresponde al ensayo de la evaluación del incremento de la protección conferida por la administración de un adyuvante, la protema CD40L, a ratones Balb/c sometidos a distintos tratamientos de inmunización y a un desafío con promastigotes de L. major. En la parte superior, A, se muestra una representación esquemática del protocolo de inmunización seguido. En la parte intermedia, B, se muestra una gráfica en la que se representa en ordenadas el tamaño de la lesión (Lesn.), en milímetros (mm) observadas en los ratones, tras haber transcurrido el tiempo, expresado en semanas, que se indica en abscisas, desde el momento de la inoculación a los ratones de promastigotes de L. major; las abreviaturas Gl a G7 sobre cada una de las líneas de daios indica ei grupo de ensayo al que se refieren (Grupo I a Grupo 7), los signos "f" indican los momentos en los que se sacrificaron ratones y la flecha marcada como "B2" indica el momento en el que recibieron la tercera dosis de vector de inmunización (2a dosis de refuerzo, "booster 2") los ratones de los grupos 1, 3 y 4. En la parte inferior de la Figura, marcada como C, se representan los tamaños de las lesiones, medidas en milímetros, observadas en cada uno de los ratones supervivientes de los grupos 1, 2, 3, 4, 5 y 7 trascurridas 27 semanas desde el desafío; cada círculo representa a un ratón, correspondiendo la altura en la que se localiza al tamaño de la lesión observada en él, estando indicado el grupo al que pertenece por el número indicado en abscisas. Los signos "f" junto a un círculo de la parte C indican que el ratón fue sacrificado antes de las 27 semanas. Los grupos corresponden a las siguientes combinaciones en la inmunización: Grupo 1 (Gl): DNA-LACK/MVA-LACK/MVA- LACK; Grupo 2 (G2): DNA-LACK+ MegaCD40L(lμg) / MVA-LACK+ MegaCD40L(lμg); Grupo 3 (G3): DNA-LACK+ MegaCD40L(10μg) / MVA-LACK+ MegaCD40L(10μg) / MVA-LACK; Grupo 4 (G4): DNA-LACK+ MegaCD40L(20μg) / MVA-LACK+MegaCD40L(20μg) / MVA-LACK+ MegaCD40L(20μg); Grupo 5 (G5): DNA-Control/MVA-WT; Grupo 6 (G6): PBS/PBS; Grupo 7 (G7): PBS+MegaCD40L(10μg) / PBS+MegaCD40L(10μg). La Figura 21 muestra gráficas en los que se representa la evolución con el tiempo de la concentración de los anticuerpos anti-SLA (antígeno soluble de Leishmcmiά) tipo IgGl (parte superior, A) o tipo IgG2 (parte superior, B) en perros Beagle a los que se les había inoculado promastigotes de Leishmania infantum. Para ello, en cada gráfico se indica, en ordenadas, el valor de la absorbancia correspondiente a la transformación del sustrato OPD producida por muestras de plasma de los perros sometidas a ELISA, n, valor que se expresa como tanto por 1 con respecto al valor obtenido en el día -30; en abscisas se indica el día de toma de la muestra, correspondiendo el día 0 a la inoculación de los promastigotes. Cada curva corresponde a un grupo de inmunización previa diferente: cuadrados rellenos, β: Control negativo (C(-)); triángulos rellenos, A: Control positivo (C(+)); rombos rellenos, ^: grupo inmunizado con DNA-LACK/rVV-LACK previamente al desafío con promastigotes; asteriscos de seis puntas, *: grupo inmunizado con DNA-LACK/MV A-LACK previamente al desafío con promastigotes. EJEMPLOS
Ejemplo 1.- Construcción y caracterización del virus recombinante MVA- LACK
1.1.- Construcción del vector plasmídico pHLZ-LACK Para la construcción de un virus MVA recombinante que contiene una secuencia codificante de la proteína LACK de L. infantum, fue necesario un paso intermedio de construcción de un plásmido, pHLZ LACK, que permitió la inserción de la secuencia codificante de la proteína LACK en el locus HA del genoma de MVA. Este plásmido contiene las regiones flanqueantes derecha e izquierda del gen de la hemaglutinina (HA), y el gen de resistencia a ampicilina. Entre las dos regiones flanqueantes del gen HA se encuentran dos promotores de Vaccinia en orientación opuesta: el promotor viral p7.5 que dirige la expresión del gen de β-gal, y el promotor sintético temprano/tardío (pE/L), que dirige la expresión del gen de la proteína LACK de Linfantum. Para su construcción se utilizaron otros dos plásmidos: - pUC LACK: plásmido derivado del vector pUC19 que contiene el gen codificante de la proteína LACK de L. infantum en el sitio de corte EcoRI, además de los elementos necesarios para la replicación y selección en E. coll Este vector fue generado por la Dra. Gloria González-Aseguinolaza a partir de un molde de ADN genómico de L. infantum mediante PCR. El producto de PCR tiene una longitud de 942 pares de bases (pb) y la región codificante 312 aminoácidos (7).
- pHLZ: (7400 pb). Plásmido generado en el laboratorio de los inventores que permite la inserción de genes en el genoma de Vaccinia por recombinación homologa en la región codificadora de la HA. Tras la adición del sustrato de la β-galactosidasa, X- gal, el desarrollo de placas azules permite la selección de virus recombinantes. A partir de estos dos plásmidos se generó el vector pHLZ-LACK de la siguiente manera:
Un fragmento de ADN de 942 pb que contiene la secuencia codificante de la proteína LACK de L. infantum se purificó a partir del plásmido pUC LACK. Para ello, el vector pUC LACK se digirió con la enzima de restricción Eco Ki, y el fragmento correspondiente al gen LACK se purificó en geles de agarosa. Los extremos de dicho fragmento se hicieron romos por tratamiento con Kϊenow y se clonó en el plásmido de inserción en Vaccinia pHLZ (previamente digerido con Sma I, y defosforilado mediante Ia incubación con Fosfatasa Alcalina (CIP)), generándose de este modo el vector de inserción pHLZ-LACK (8342 pb) La selección de plásmidos recombinantes se realizó mediante análisis de la actividad β-gal.
La construcción de este vector de inserción pHLZ-LACK aparece esquematizada en la Figura 1.
1.2. Construcción del virus recombinante MVA-LACK
Células primarias procedentes de embriones de pollo (CEF: chicken embryo fibroblast) obtenidas de huevos SPF de 11 días de edad (INTERVET), fueron infectadas con MVA (concretamente con MVA-F6, pase 586, proporcionado por Gerd Sutter) a una multiplicidad de infección de 0,05 ufp/célula. Tras una hora de adsorción, se transfectaron las células con 5 μg de ADN del plásmido pHLZ-LACK utilizando lipofectamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (INVITROGEN). 72 horas post-infección las células se recogieron en 1 mi de medio, se realizaron tres rondas de congelación/descongelación, se sónico y se utilizó para la selección de virus recombinantes.
Los virus recombinantes que contenían el gen LACK de L. infantum y el gen β- gal fueron seleccionados mediante pases de purificación consecutivos en células CEF y tinción con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-galactosidasa (300 μg/ml). Tras 6 rondas de purificación se obtuvo el virus recombinante purificado, sin contaminación de virus MVA salvaje. El recombinante, llamado 3.111.2.1.1.2 (MVA pase 592) fue utilizado para preparar un segundo stock, P2, con título 3 x 107 ufp/ml. El stock P3 se preparó a partir de células CEF infectadas a una multiplicidad 0,05 ufp/célula y se purificó por dos colchones de sacarosa al 36%. El título de este stock es 0,975x 109 ufp/ml. La secuenciación del inserto presente en su genoma dio lugar a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:6.
1.3. Caracterización del virus MVA LACK
Para confirmar la homogeneidad y la integridad de los genes incluidos en el virus recombinante MVA-LACK se llevó a cabo un análisis por PCR. El ADN viral fue purificado a partir de células CEF infectadas con el virus MVA LACK (stock P2) a una multiplicidad de infección de 5 ufp/célula. Tras comprobar la integridad del ADN mediante análisis en gel de agarosa, se llevaron a cabo análisis de PCR para los locus de hemaglutinina y timidina quinasa, utilizando como cebadores los oligonucleótidos que se indican en la Tabla 1, cuya localización respecto a los locus de hemaglutinina y timidina quinasa se muestra en la parte superior de la Figura 2.
Tabla 1.- Cebadores de las PCR de análisis de los lociis HA y TK
Oligonucleótidos Secuencia
TK-L 5' TGATTAGTTTGATGCGATTC 3' (SEQ ID NO:1)
TK-R 5' TGTCCTTGATACGGCAG 3' (SEQ ID NO:2)
HA-I 5' GTCACGTGTTACCACGCA 3 (SEQ ID NO:3)'
HA-2 5' GATCCGCATCATCGGTGG 3 ' (SEQ ID NO :4)
HA-MVA 5' TGACACGATTACCAATAC 3 ' (SEQ ID NO :5)
Para realizar el análisis, con fines comparativos, se utilizó como control negativo el ADN extraído de células CEF infectadas con la estirpe salvaje de Western Reserve (WR) y como control positivo el plásmido pHLZ-LACK. Se incluyó también en el análisis el virus recombinante VV-LACK HA", que fue preparado de forma análoga al MVA-LACK y que contiene la misma secuencia codificante de LACK insertada igualmente en el locus HA aunque, ha diferencia del MVA-LACK5 se utilizó para su construcción la estirpe Western Reserve, competente para replicación, de Vaccinia. A lo largo de la presente memoria, siempre que se habla del virus VV-LACK se hará referencia a este virus recombinante, denominándole VV-LACK HA" en aquellos casos en los que se le quiera distinguir del virus VV-LACK TK", en el que la secuencia de LACK está insertada en el locus de timidina quinasa. En éste y en los restantes Ejemplos, así como en las leyendas de las Figuras y en la descripción de las mismas, la utilización del guión medio o del guión bajo en las denominaciones de los vectores no supone ninguna diferencia alguna, de manera que las denominaciones "MVA-LACK" y "MVA_LACK" corresponden a un mismo vector e igual sucede con las parejas "VVJLACK HA"" / "VV-LACK HA"", "W_LACK TK"' / "VV-LACK TK" y "VVJLACK" / "W-LACK". La ausencia o presencia de guión entre las abreviaturas que componen el nombre de un vector no debe interpretarse tampoco como indicativo de diferencia alguna; así, el W-Luc y VVLuc aluden a un mismo vector, al que también se denomina algunos puntos de la memoria, de forma más informativa, VV-Luc HA-. Las fotografías de los geles obtenidos se muestran en la parte inferior de la Figura 2. En la parte izquierda de la misma, que corresponde a la PCR de análisis del locus de hemaglutinina se observa que tanto el MVA-LACK (calle 2) como el virus recombinante VV-LACK HA", , dan lugar a bandas que se localizan a la altura de la control positivo pHLZ-LACK, lo que es compatible con la presencia del inserto completo integrado en el sitio HA. En la parte de la derecha, correspondiente a las PCR de análisis del locus TK5 se comprueba que tanto MVA-LACK (calle 2) como VV- LACK HA" (calle 1) dan lugar a bandas de tamaños idénticos a las generadas a partir del ADN extraído de células infectadas con la estirpe salvaje WR, mientras que el vector VV-LACK TK" (calle 3), que contiene la misma secuencia pero insertada en el locus TK, da lugar a una banda mucho mayor.
- Ejemplo 2.- Estabilidad de MVA-LACK
Para verificar que MVA LACK puede ser amplificado sin la pérdida de la expresión del gen exógeno, se llevó a cabo un test de estabilidad. El virus recombinante fue amplificado desde el stock P2 al P4 en células CEF a una multiplicidad de infección de 0,05 ufp/célula. Las placas generadas con el stock P4 fueron analizadas por inmunomarcaje con un anticuerpo policlonal anti-WR y anti-LACK. Los resultados, mostrados en la Figura 3, muestran que el 100% de las placas reconocidas por el anticuerpo anti-WR son también positivas para LACK. El gen LACK, por tanto, se mantiene de forma estable en el virus recombinante MVA-LACK.
- Ejemplo 3.- Cinética de expresión de la proteína LACK
Para evaluar la expresión de la proteína LACK en el tiempo, monocapas de células BHK-21 se infectaron con 5 ufp/célula de MVA-LACK. Los extractos celulares se recogieron a diferentes tiempos post-infección, se fraccionaron en geles SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se hicieron reaccionar con un anticuerpo policlonal anti-LACK (generado en el laboratorio de los inventores inmunizando conejos con ia proieína LACK purificada)- Los resultados obtenidos t>e muesiran en Ia Figura 4. En ella puede apreciarse que se detecta altos niveles del antígeno LACK a partir de las 4 horas después de la infección, acumulándose su producción con el tiempo hasta las 48 horas. - Ejemplo 4.- Inmnnogenicidad de MVA-LACK
Para evaluar la respuesta inmune inducida por MVA-LACK en comparación con la inducida por VV-LACK, se inmunizaron ratones hembra de la especie susceptible Balb/C (n=4) con una (1 x 107 ufp/ratón) o dos (5 x 107 ufp/ratón) dosis de VV-LACK HA", MVA-LACK o VV Luc como control. 8 días después de la segunda inmunización, los animales fueron sacrificados y los bazos fueron procesados mediante la técnica de ELISPOT. Se realizaron dos ensayos utilizando la técnica de ELISPOT, (que se ha descrito previamente (33), para evaluar el número de células secretoras de IFN-γ: en el primero, mostrado en la parte A de la Figura 5, se detectó el número de células secretoras de IFN-γ específicas para LACK; en el segundo, mostrado en la parte B de la Figura 5, se detectó el número de células CD8+ secretoras de IFN-γ específicas para los antígenos virales de los propios vectores MVA y VV.
Adicionalmente se realizó un ensayo en el que los esplenocitos aislados de los animales inoculados fueron cultivados y reestimulados con la proteína LACK, detectándose a continuación mediante ELISA la cantidad de IFN-γ secretada por los esplenocitos presente en los sobrenadantes de los cultivos. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 6.
Los resultados del ELISPOT muestran que el número de células CD8+ secretoras de ÍFN-γ específicas para LACK es 3,15 veces menor en los animales inoculados con MVA-LACK en comparación con los que recibieron VV-LACK cuando recibieron una única dosis. En consonancia con ello, la cantidad de IFN-γ secretada por los esplenocitos reestimulados con la proteína fue 5 veces menor. Sin embargo, el número de células CD 8+ secretoras de IFN-γ específicas para los antígenos virales fue aproximadamente 5 veces mayor en los animales inoculados con VV-LACK. El hecho de que la respuesta inmune inducida frente al vector en el caso de MVA permite un efecto de refuerzo (booster) después de una segunda dosis de inmunización. Dos dosis de VV-LACK disminuyen dramáticamente el número de células CD8+ secretoras de IFN-γ; sin embargo, cuando los animales recibieron en la primera dosis MVA-LACK y MVA-LACK o VV-LACK en la segunda dosis de refuerzo, tanto el uno como el otro vector recombinante fueron capaces de amplificar la respuesta inmune. Aunque el número de células CD 8+ secretoras de IFN-γ fue similar en ambos casos, la cantidad de IFN-γ secretado y medido por ELISA fue 70 veces mayor cuando la dosis de refuerzo se realizó con MVA-LACK, y 86 veces mayor que cuando se recibió una única dosis de MVA-LACK.
A continuación se evaluó el patrón de anticuerpos generado tras la inmunización. Diferentes isotipos de IgGs se consideran indicadores de la respuesta frente a L. infantum. IgG2a está asociado con condiciones asintomáticas mientras que el isotipo IgGl se relaciona con enfermedad. 8 días después de la segunda inmunización se recogió el suero de los animales y se evaluó la presencia de anticuerpos específicos para
LACK y sus isotipos. En la Figura 7 se muestran los resultados obtenidos en una dilución 1/10 de los sueros. En ellos puede apreciarse que los niveles más altos de
IgG2a (asociado a una respuesta de tipo ThI) se encontraron tras dos dosis con MVA-
LACK.
Tomados en conjunto, los resultados obtenidos demuestran que dos dosis de MVA-LACK inducen una fuerte respuesta de tipo TM frente al antígeno LACK.
- Ejemplo 5.- Respuesta inmune generada en protocolos de inmunización heterólogos con ADN desnudo en la primera dosis y MVA-LACK en la dosis de refuerzo
Se evaluó también la respuesta inmune generada por el virus recombinante MVA-LACK en un protocolo de inmunización heterólogo basado en una primera dosis de inmunización con un vector recombinante de ADN desnudo que permite la expresión de la proteína LACK en células de mamífero y una segunda dosis con virus recombinantes derivados de Vaccinia. Para ello, se utilizó en las primeras inmunizaciones el plásmido pCI-neo_LACK, al que en adelante se hará referencia como DNA-LACK, que es un vector de expresión en células de mamífero que, al igual que el
MVA-LACK, expresa la proteína LACK de L. infantum. Este plásmido fue generado por inserción del gen LACK en el sitio Smal de pCI-neo, y difiere del patentado por el
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) como vector ADN-LACK en el sitio úe msercion üe LACK, pues ei vector del CSIC fue clonado en ei sirio EcoRI/Xbal de pCI-neo. Contiene el promotor de citomegalovirus y los genes de resistencia a ampicilina y neomicina, dispuestos según se muestra en la Figura 8. Hembras de ratones Balb/c de 6-8 semanas de edad fueron inoculadas por vía intradérmica con el vector plasmídico de ADN, DNA-LACK. 15 días después se realizó una segunda inoculación con 1x107 ufp/ratón por vía intraperitoneal de MVA-LACK (stock P3). Como controles se inocularon W-LACK TK- (previamente utilizado y generado en el laboratorio) y que ha demostrado conferir cierto grado de protección cuando se usa a una dosis de 5 x 107 ufp/ratón (9), VV-LACK HA- y VV Luc. Tres semanas después de la última inmunización los animales fueron sacrificados y los bazos fueron procesados mediante la técnica de ELISPOT. Se realizó un ELISPOT para evaluar tanto el número de células secretoras de IFN-γ específicas para la proteína LACK como el de las específicas para antígenos de Vaccinia.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 9. En la parte A de la misma puede apreciarse que el grupo inmunizado con MVA-LACK en la segunda dosis (tercera barra de cada uno de los gráficos) demostró desarrollar una respuesta inmune celular frente a LACK mayor que los virus basados en la estirpe salvaje WR. La parte B de la figura muestra que la respuesta anti- viral fue mucho menor en ese mismo grupo inmunizado con MVA-LACK, como era de esperar al tratarse de un vector atenuado.
Al ser el balance de la respuesta inmune entre los tipos ThI (relacionado con protección) y Th2 (asociado a susceptibilidad) crítico para el control de la leishmaniasis, se evaluó el tipo de respuesta celular inducida tras la inmunización descrita más arriba. Para ello, los esplenocitos aislados de los ratones inmunizados fueron reestimulados con la proteína LACK (parte superior de la Figura 10a) o con un péptido inmunodominante de clase II de la misma (parte inferior de la Figura 10a). Tras 72 horas de reestimulación, los sobrenadantes se recogieron y se determinó la presencia de citoquinas de tipo ThI (IFN-γ) o Th2 (IL-4) en los mismos mediante ELISA. Los gráficos de la Figura 10a muestran que los esplenocitos de los ratones inmunizados con DNA-LACK en la primera dosis y MVA-LACK en la segunda produjeron más IFN-γ e IL-4 que los demás grupos. A pesar de los niveles más altos de IL-4, el balance Thl/Th2, medido indirectamente como la cantidad de IFN-γ/IL-4, fue mayor en el grupo que recibió MVA-LACK en la segunda dosis (IFN-γ/IL-4 = 1641 en el caso de la reestimulación con la proteína LACK e IFN-γ/IL-4 = 1163 en el caso del péptido de clase II), indicando un desarrollo de una respuesta inmune de tipo ThI. Estos resultados se confirman cuando se realiza una representación de estos mismos resultados, en la que se añaden los datos referentes al TNF-α (asociado a respuestas de tipo ThI como el IFN-γ) y los referentes a la IL-IO (asociada a respuestas tipo Th2 como la IL-4), tal como se representan en la Figura 10b. Es en los ratones en los que se detectan los niveles más altos de IFN-γ (los grupos de los ratones inmunizados con DNA-LACK en la primera dosis y MVA-LACK en la segunda) en los que se detectan también los niveles más altos de TNF-α (35,9 pg/ml cuando se reestimulan con LACK y 63,3 pg/ml cuando se reestimulan con el péptido), datos claramente más elevados que los correspondientes a los grupos inmunizados con DNA- LACK/VV-LACK-HA" (donde se detectan 18 pg/ml si se reestimulan con LACK y 25 pg/ml si se reestimulan con el péptido) y a los grupos control (donde se detectan 9 pg/ml y 18 pg/ml, respectivamente). Con respecto a las citoquinas de tipo Th2, la inclusión de los datos referentes a la IL-10 corrobora que los niveles más elevados se detectan en los grupos inmunizados con DN A-L ACKTM V A-L ACK. Independientemente de los niveles de IL-4 e IL-IO, la relación Thl:Th2 correspondía a los grupos que recibieron MVA- LACK en la segunda dosis, lo que confirma una clara tendencia de la respuesta inmune hacia la respuesta de tipo ThI en este grupo.
El siguiente paso fue determinar qué población de células T (CD4+ o CD8+) estaba implicada en la secreción de citoquinas de tipo ThI (IFN-γ y TNF-α ). Con este propósito se inmunizaron animales con regímenes de inmunización análogos a los utilizados para obtener los resultados representados en la Figura 8, es decir, una primera dosis de iniciación de la respuesta con DNA-LACK y una segunda dosis de refuerzo de la respuesta con MVA-LACK (dosis de 1 xlO7 ufp o de 5 x 107 ufp) o VV-LACK-HA' (dosis de 1 xlO7 ufp o de 5 x 107 ufp), mientras que los animales utilizados como controles recibieron ADN-CONTROL (el vector plasmídico pCI-neo, sin secuencia de LACK) en la primera dosis de iniciación de la respuesta y VV-LUC-HA- en la segunda dosis, de refuerzo de la respuesta. 14 días después de la administración de la dosis de refuerzo, se recogieron los bazos y los esplenocitos fueron reestimulados con proteína LACK o con RPMI como control. Durante las últimas 5 horas de reestimulación se añadió nuevo estímulo junto con Brefeldina A. Posteriormente se llevó a cabo una tinción de citoquinas intracelulares y se realizó un análisis por citometría de flujo. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 2. Tabla 2.- Tipos celulares detectados por citometría de flujo tras tinción de citoquinas celulares según el protocolo de inmunización
DOSIS DOSIS DE
CD8+ CD8+ CEF4* COM+ INICIAL REFUERZO PRODUCTORAS PRODUCTORAS PRODiICTORAS PRODUCTORAS DE IFNγ DE TNFα DE tFNy DE TM Fa
DNA LACK VV-LACK 10,1 10,4 1,8 1,6
1 « 107
DNAiACK VV-LACK 8,3 7,5 2,9 1,9 5 * 107
DNAiLAGK MVA-LACK 15,7 2,9 t,9 1 x 1(F
DNALACK MVA4.ACIC 12,7 1t,2 2,5 1,9 5 x 107
DNACONTROL VVLUC 1,7 1,5 0,7 •1,0 5 x 107
PBS PBS 1,5 1,2 0,3
Los datos de la Tabla 2 demuestran que la respuesta inmune celular es debida principalmente a la población CD8+. Como conclusión, la inmunización basada en DNA LACK/MV A-LACK confiere mayores porcentajes de células específicas CD4+ y CD8+ secretoras de IFN-γ y TNF-α.
- Ejemplo 6.- Ensayos de protección frente a Leishmania major
6.1. Comparación de la protección generada por inoculación en la dosis de refuerzo de distintos vectores recombinantes derivados de Vaccinia que expresan LACK Habiendo establecido que la inmunización con MVA-LACK es una potente inductora de una respuesta inmune celular y estando ésta relacionada con protección frente a la leishmaniasiss se realizó a continuación un ensayo de protección frente a Leishmania major, utilizando un régimen de inmunización heieróiogo basado en DNA- LACK/MVA-LACK. Hembras de ratones Balb/c 6-8 semanas de edad fueron inoculadas por vía intradérmica con 100 μg del vector plasmídico de ADN que expresa la proteína LACK DNA-LACK o con un ADN vacío (sin inserto) como control. 15 días después se realizó una segunda inoculación con 1 x 107 ufp/ratón por vía intraperitoneal de MVA-LACK, VV-LACK TK-, VV-LACK HA- o VV Luc. Tres semanas después de la última inmunización los animales fueron desafiados con 5 x 10 promastigotes de L. major por vía subcutánea en la almohadilla plantar. Como parámetros de protección se consideraron el desarrollo de lesión en el lugar de inoculación y la carga parasitaria en el ganglio que drena la almohadilla plantar (ganglio poplíteo) medida 7 semanas después del desafío.
Los resultados obtenidos al representar la evolución del tamaño de la lesión con el tiempo se muestran en la parte superior de la Figura 11. En ella puede observarse que el grupo inmunizado con DNA-LACK/MVA-LACK presentó una reducción del 20% comparado con los grupos inmunizados con DNA-LACK y uno de los vectores VV-
LACK.
Para confirmar que la reducción en el tamaño de la lesión se correlaciona con protección, y no únicamente con inflamación, se midió la carga parasitaria en los ganglios poplíteos, obteniéndose los resultados que se representan en Ia parte inferior de la Figura 11. Los ratones que recibieron DNA-LACK/MVA-LACK presentaron una reducción en la carga parasitaria mayor (hasta 1000 veces) que los grupos inmunizados con DNA-LACK/W-LACK.
6.2. Protección generada utilizando en la primera dosis un vector de ADN diferente
Se realizó otro experimento para evaluar protección frente a L. major. Los animales fueron inmunizados con un vector de ADN que expresa la proteína LACK distinto de DNA-LACK, pMOK-LACK, y como controles el vector minimalístico MIDGE (minimalistic, immunologicatty deflned gene expression: expresión minimalística de genes inmunológicamente definida) MIDGE-NLS (MOLGEN®) o el vector vacío sin inserto pMOK. 15 días después, el grupo al que se había inoculado pMOK recibió una segunda dosis con pMOK, el grupo que había recibido el MIDGE- iNijύ recioio v V -LUL. en ia segunαa αosis αe reiuerzo αe ia respuesta y ei grupo que había recibido pMOK-LAK recibió MVA-LACK. Tres semanas después de la administración de la dosis de refuerzo los animales fueron desafiados con 5 x 104 promastigotes de L. major por vía subcutánea en la almohadilla plantar. Como parámetros de protección se consideraron el desarrollo de lesión en el lugar de inoculación y la carga parasitaria en el ganglio que drena la almohadilla plantar (ganglio poplíteo) medida 7 semanas después del desafío.
Los resultados obtenidos al representar la evolución del tamaño de la lesión con el tiempo se muestran en la parte A de la Figura 12. Los correspondientes a la carga de parásitos detectada en los ganglios poplíteos de cada uno de los grupos, expresada como número de parásitos detectados por miligramo, en la parte B de dicha Figura.
Como se aprecia en dichas figuras, el grupo inmunizado con pMOK-
LACK/MVA LACK resultó estar protegido frente a leishmaniasis producida por L. major, ya que los ratones que lo integraban no desarrollaron apenas lesión. Esta medida se correlaciona con una disminución en la carga parasitaria: presentan 4 veces menos parásitos que los grupos controles.
6.3. Determinación de la dosis viral óptima de MVA-LACK en protocolos de inmunización heterólogos
Tras haber demostrado que la inmunización con MVA-LACK es una potente inductora de una respuesta inmune celular y que ésta se correlaciona con protección frente a la infección por Leishmania major, se llevó a cabo un experimento adicional para determinar la dosis viral óptima de MVA-LACK en un protocolo de inmunización heterólogo: una primera dosis de inmunización (priming) basada en ADN y una segunda dosis de refuerzo de la inmunización (booster) con virus recombinantes derivados de Vaccinia.
Como modelo animal se utilizaron de nuevo ratones BALB/c, al tratarse de una cepa altamente susceptible a la infección por Leishmania. Hembras de nueve semanas de edad fueron inoculadas por vía intradérmíca con 100 μg del vector plasmídico de ADN que expresa la proteína DNA-LACK (pCINeo-DNA_LACK) o ADN Control. Quince días después recibieron la segunda dosis de inmunización, por vía intraperitoneal, con 1 x 107 ufp/ratón o 5 x 107 ufp/ratón de MVA-LACK, 5 x 107 ufp/ratón de VV-LACK o 5 x lü7 uíp/raton de V V-LUC, siendo suministrado este último al grupo que había recibido el ADN Control. Se incluyó un grupo control que recibió PBS tanto en la primera como en la segunda dosis de inmunización, al que se denominó N ζιnaivé\ denominación habitual en Biología Molecular para designar a lo que no ha tenido contacto con algo. Los grupos de inmunización están representados en la Tabla 3.
Tabla 3.- Grupos de inmunización para Ia evaluación de la dosis óptima de MVA-LACK
DOSIS INICIAL DOSIS DE REFUERZO
GRUPO 1 DNA-LACK 100 μg MVA-LACK I x 107ufp
GRUPO 2 DNA-LACK 100 μg MVA-LACK S x 107 ufp
GRUPO 3 DNA-LACK 100 μg W-LACK 5 x 107ufp
GRUPO 4 DNA CONTROL 100 μg W-LUC S x 107xrfp
GRUPO N PBS PBS
Tres semanas después de la última inmunización los animales fueron desafiados con 5 x 104promastigotes de L major por vía subcutánea en la almohadilla plantar. Para asegurar la infectividad de los promastigotes, estos fueron aislados utilizando aglutinina de cacahuete (β-D-galactosa-(l-»3)-iV-acetil-D-galactosamina, PNA). La PNA aglutina específicamente los promastigotes no infectivos, mientras que no aglutina a los promastigotes metacíclicos, que es la forma infectiva de Leishmania. Estos promastigotes infectivos se recogieron en el sobrenadante después de una centrifugación diferencial y fueron utilizados como dosis infectiva.
Cinco días después del desafío se sacrificaron 3 animales de cada grupo para evaluar cómo era la respuesta inmune temprana frente a la infección por L. major en los animales inmunizados. Se realizó un ensayo de ELISPOT para evaluar el número de células secretoras de IL-2 por cada 106 esplenocitos específicos para la proteína LACK. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 13. En ella se aprecia que el único grupo que presentó cantidades significativas de IL-2 fue el grupo inmunizado con DNA- LACK y 1 x 107 ufp de MVA-LACK.
Como parámetro de protección se evaluó el desarrollo de lesión en el lugar de inoculación, obteniéndose el gráfico de evolución del tamaño de la lesión con respecto a las semanas transcurridas desde ei desafío que se muesira en ia Figura 14. Adicionalmente, se obtuvieron fotografías del estado de la lesión en la semana 8 posterior al desafío de ratones inmunizados siguiendo cada uno de los distintos protocolos indicados. Como se aprecia en el gráfico de la Figura 13, los grupos inmunizados con 1 x 107 ufp de MVA-LACK en la dosis de refuerzo no desarrollan lesión. De los ratones inmunizados con 5 x 107 ufp de 3VtV A-LACK, un ratón de cinco desarrolló una pequeña lesión en el lugar de inoculación a partir de la semana 7 posterior al desafío. Desde la cuarta semana posterior al desafío la lesión presentada es significativamente diferente en los grupos inmunizados con vectores recombinantes derivados de Vaccinia con respecto a los grupos control. El grupo inmunizado con 5 x 107 ufp de VV-LACK, presenta cierto grado de lesión, aunque ésta es significativamente diferente al grupo control a partir de la semana 8 posterior al desafío. La lesión en los grupos control sigue aumentando exponencialmente mientras que en el grupo inmunizado con DNA-LACK / VV-LACK la lesión comienza a estabilizarse.
Los porcentajes de reducción en el tamaño de la lesión están representados en la Tabla 4.
Tabla 4. Reducción en el tamaño de la lesión ocho semanas después del desafío
Figure imgf000031_0001
En las fotografías de la Figura 15 se demuestra que, claramente, aquellos ratones inmunizados con MVA-LACK demostraron un alto grado de protección frente a leishmaniasis cutánea, mayor que los inmunizados con el vector VV-LACK. En la figura se observa el grado de lesión en la pata derecha, marcada con un signo "+" encima de la cada una de las fotografías por haber sido donde se inocularon los promastigotes, mientras que la pata izquierda, marcada con un signo "-", sirve como control, sin inocular promastigotes.
Como se observa en las fotografías de la Figura 15, los animales inmunizados con DNA-LACK en la primera dosis, de inicio de la respuesta, y 1 x 10' ufp de MVA- LACK en la dosis de refuerzo de la respuesta, no presentan lesión 8 semanas después del desafío (panel A). Cuando se utilizaron 5 x 107 ufp de MVA-LACK en la dosis de refuerzo, solamente uno de los cinco ratones empezó a desarrollar lesión en la semana séptima después el desafío (panel B izquierda). En el grupo que recibió VV-LACK en el boosíer el grado de protección fiie menor y se observaron lesiones en el 75% de los animales, aunque significativamente menores que en los grupos controles (panel C). Los grupos control presentaban lesión en el lugar de inoculación (paneles D y E). Los animales de los grupos control fueron sacrificados por razones éticas 9 semanas después del desafío. En el mismo tiempo se sacrificaron los animales del grupo inmunizado con DNA-LACK y VV-LACK. Los animales de los grupos que recibieron MVA-LACK permanecen sin lesión durante al menos 11 semanas, y están bajo observación para analizar si la protección se mantiene en el tiempo.
- Ejemplo 7.- Ensayos de protección frente a Leishmania infantum Se procedió también a ensayar si la potente inducción de respuesta inmune celular provocada por MVA-LACK cuando se administra en la segunda dosis de refuerzo de la inmunización, tras haber sido los sujetos inmunizados en la primera dosis con un vector de ADN que expresa igualmente el antígeno LACK, se correlacionaba también con la generación de protección frente a Leishmania infantum, que causa mayoritariamente leishmaniasis visceral, utilizando de nuevo un régimen de inmunización heterólogo basado en DNA-LA CK/M V A-L ACK. Dado que estudios previos sobre la vacunación frente a la leishmaniasis han demostrado que el modelo murino puede ser predictivos de los resultados que se obtienen en los ensayos de vacunación realizados con modelos de primates no humanos (40, 41, 42), se utilizó el modelo murino intradérmico para ensayar el potencial de los regímenes de vacunación heterólogos con vectores de ADN y virus recombinantes derivados de Vaccinia.
7.1. Evaluación de la carga parasitaria
Ratones Balb/c de 4 a 6 semanas de edad fueron inoculados por vía intradérmica con 100 μg del vector plasmídico de ADN que expresa la proteína LACK DNA-LACK (pCINeo -DNA-LACK) o ADN Control. Quince días después recibieron la segunda dosis de inmunización, por vía intraperitoneal, con i x ÍO7 ufp/ratón o 5 x ÍO7 ufp/ratón de MVA-LACK o del virus recombinante derivado de la estirpe salvaje Western Reserve que lleva insertado igualmente el antígeno LACK en el locus de hemaglutinina (W-LACK), suministrándose 5 x 107 ufp/ratón de VV-Luc al grupo que había recibido el ADN Control. Se incluyó un grupo control que recibió PBS tanto en la primera como en la segunda dosis de inmunización.
Tres semanas y media después de la administración de la dosis de refuerzo, los ratones fueron infectados por vía intradérmica en el pabellón auditivo utilizando 107 promastigotes metacíclicos de L. infantum tal como se ha descrito previamente (43). Un mes después de la infección, se evaluaron las cargas parasitarias mediante el análisis por dilución limitante en los grupos de ratones inmunizados y de control, evaluaciones que se realizaron en el bazo, el hígado y el nodulo linfático drenante. Los resultados obtenidos, que se muestran en la Figura 16, en la que se representan los valores medios obtenidos a partir de al menos 4 ratones por grupo, demuestran que los ratones que fueron inmunizados siguiendo un régimen de vacunación con una primera dosis de iniciación de la respuesta y una segunda dosis de refuerzo utilizando vectores capaces de expresar el antígeno LACK resultaron protegidos de forma significativa frente a la infección. El nivel de protección en cada tejido era comparable entre los diversos grupos de ratones que habían recibido vectores capaces de expresar el antígeno y no diferían estadísticamente entre los ratones que recibieron VV-LACK o MVA-LACK. Sin embargo, sí se observaron variaciones en el nivel de protección entre los distintos órganos, observándose los niveles de protección más elevados en el nodulo linfático drenante (parte C de la Figura 16). El nivel de protección en este órgano oscilaba entre un factor de reducción de 144 a 244 veces en las cargas parasitarias en comparación con los ratones control. En el bazo (parte A de la Figura 15) y en el hígado (parte B de la Figura 16) se observaron niveles de protección más bajos, que oscilaban entre factores de reducción de 6 a 9 veces en las cargas parasitarias en el hígado y de 9 a 30 veces en el bazo. En el bazo se observó también un pequeño efecto protector en el caso de los ratones que recibieron el ADN control y el virus VV-Luc, que puede ser debido a la baja respuesta de IFN-γ observada en estos animales, tal como se muestra posteriormente. Aún así, las diferencias entre las cargas parasitarias observadas en los ratones inmunizados con VV-Luc y los que recibieron VV-LACK o MVA-LACK íueron significativas (p<U,U2-υ,U5), lo que demuestra un efecto especifico dei antígeno LACK. 7. 2. Respuesta celular y producción de citoquinas
Dado que el IFN-γ y la relación TNF-ct/LT parecen estar implicados en la resistencia a la infección en la leishmaniasis visceral murina (27,29,30,46), mientras que la IL-IO parece estar asociada a la susceptibilidad (26,33), se extrajeron bazos de ratones inmunizados y no inmunizados tanto antes de proceder al desafío con L. infantum como un mes después de haber realizado éste. Con ellos se procedió tanto a realizar un ensayo de ELISPOT para evaluar el número de células secretoras de IFN-γ específicas para LACK presentes por cada 106 esplenocitos, como a realizar ensayos de niveles de citoquinas producidas presentes en los sobrenadantes de cultivos de dichos esplenocitos aislados de ratones reestimulados con la proteína LACK durante su cultivo. Los resultados obtenidos con los esplenocitos extraídos antes de proceder al desafío se muestran en la Figura 17. La parte A, correspondiente a la concentración de IFN-γ, en ng/ml, detectada en los sobrenadantes de los cultivos de esplenocitos reestimulados, muestra que los ratones que recibieron 107 ufp de VV-LACK o 5x107 ufp de MVA- LACK parecen producir niveles algo más elevado de IFN-γ (100-113 ng/ml), comparados con los ratones que recibieron en la dosis de refuerzo 5x107 ufp de VV- LACK o 107 ufp de MVA-LACK (55-67 ng/ml). La evaluación de las células productoras de IFN-γ específicas para LACK realizado mediante el ELISPOT, que aparece representado en la parte B de la Figura 17, indica que el número de células secretoras de IFN-γ se correlaciona con los niveles de IFN-γ detectados por ELISA, oscilando la frecuencia de células productoras de IFN-γ entre 380 y 640 células/106 esplenocitos. Además, se observaron niveles significativos de TNFα/LT (58 y 134 pg/ml) en los ratones que habían recibido VV-LACK, mientras que los niveles de TNFα/LT producidos en respuesta al antígeno LACK por los ratones que habían recibido MVA-LACK eran más bajos (27 pg/ml y 8 pg/ml, respectivamente). Estas diferencias en la inducción de TNFα pueden reflejar, en parte, la diferente capacidad del WR y el MVA para inducir respuestas inflamatorias y activación de NF-κB, lo que da como resultado OerfHc de ciiocnñrmi diferentes;" MVA noterteia Ia activación de NF-κR mientras que WR parece inhibirlo. Las cantidades de IL-10 producidas por los esplenocitos aislados antes del desafío, representadas en la parte D de la Figura 17, también variaban según el protocolo de inmunización utilizado, oscilando entre 0,1 ng/ml en los ratones que habían recibido 5x107 ufp de VV-LACK en la dosis de retuerzo y 0,7 ng/ml en los que habían recibido 107 ufp de W-LACK o MVA-LACK.
Las respuestas de citoquinas detectadas en esplenocitos aislados un mes después de ser sometidos ratones a un desafío con L. infantum mostraban variaciones entre las muestras paralelas a las encontradas antes del desafío, aunque eran algo superiores. También se produjeron niveles significativos de IL-IO y TNFα/LT. Las concentraciones de IFN-γ detectadas por ELISA en los sobrenadantes de los esplenocitos sometidos a reestimulación, la relación IFN-γ/IL-10 y los factores de reducción en la carga de parásitos en los tejidos analizados, evaluado todo ello un mes después del desafío con L. infantum, se representan a continuación en la Tabla 5, donde se puede observar que tanto el nivel de IFN-γ como la relación IFN-γ/IL-10 parecen correlacionarse con la protección encontrada.
Tabla 5.- Niveles de citoquinas y factores de reducción de la carga de parásitos detectados un mes después del desafío con L. infantum
Figure imgf000035_0001
Adicionalmente, se examinó la inducción de NO/nítrico un mes después del desafío, pues se ha demostrado que el óxido nítrico es crítico para la actividad leishmanicida de los macrófagos murinos (44,45,46). Se observó que en los ratones que habían recibido vectores capaces de expresar LACK se detectaban cantidades significativas de este agente antimicrobiano, que oscilaban entre 6 y 7 μM, mientras que en los grupos control los niveles de NO/nitrito eran mucho más reducido, oscilando entre 0,5 μM y 1 μM. Por tanto, los ratones vacunados, en consonancia con los niveles de IFN-γ detectados, presentan niveles más elevados de inducción de producción de óxido nítrico y mayor actividad potencial leishmanicida. Estos resultados son consistentes con la protección hallada en los ratones vacunados con DNA-LACK y VV- LACK o MVA-LACK. Por tanto, los ensayos descritos en este ejemplo demuestran que la administración de virus recombinantes derivados de Vaccinia capaces de expresar el antígeno LACK como parte de protocolos de inmunización en los que se suministran en la segunda dosis de refuerzo, mientras que la primera dosis se suministra un vector de ADN que expresa el mismo antígeno, es altamente inmunogénica y confiere protección frente a la infección de L. infantum en ratones, mientras que el efecto protector no se consigue con vacunaciones con vectores de ADN en las dos dosis. El vector derivado de la estirpe altamente atenuada MVA y el derivado de la estirpe virulenta de Vaccinia competente para replicación Western Reserve dieron lugar a niveles comparables de protección. Sin embargo, el hecho de que la estirpe altamente atenuada MVA garantiza mayor seguridad para su uso en seres humanos convierte a este vector en un buen candidato para ser utilizado para la protección de seres humanos frente a la leishmaniasis visceral.
- Ejemplo 8.- Eficiencia de crecimiento de MVA-LACK Se realizó un ensayo adicional para determinar la eficiencia de crecimiento del virus recombinante MVA-LACK. Para ello, se infectaron células permisivas (BHK-21) a una multiplicidad de infección de 0,01, bien con el virus recombinante MVA-LACK o con el virus parental que carece de insertos, MVA-WT. A diferentes tiempos postinfección (1, 24, 48 y 72 horas), se tituló el virus presente en el medio de cultivo (extracelular) y el virus asociado a células (intracelular) mediante la inmunotinción del virus.
La Figura 18 muestra gráficas en las que se representan los resultados obtenidos en función del tiempo. Tanto en la gráfica que se refiere al virus intracelular (A) como en la gráfica que se refiere ai virus extracelular φ), puede apreciarse que no se produce inhibición del crecimiento de los virus recombinantes MVA-LACK en comparación con el virus parental. - Ejemplo 9.- Duración de Ia protección inducida por la administración de DNA-LACK y MVA-LACK
Para comprobar que el protocolo de inmunización basado en la administración de DNA-LACK y MVA-LACK es reproducible y que la protección inducida por su administración es duradera, se llevó a cabo otro experimento con ratones Balb/c, a los que se les administró una primera dosis inicial, de desencadenamiento de la respuesta inmune, que contenía el vector plasmídico DNA-LACK (pCI-neo_LACK} 100 μg por ratón) y en los que se reforzó la respuesta inmune mediante la administración, 14 días más tarde, del vector MVA-LACK (107 ó 5xlO7 ufp/ratón) o del vector W-LACK (5x107 ufp/ratón). En el ensayo se incluyeron dos controles negativos: en uno de ello, el DNA-LACK se sustituyó por un plásmido "vacío", carente de inserto con secuencias codificantes de LACK (DNA-Control), y los virus recombinantes con secuencias de LACK se sustituyeron por el virus VV-LUC, un virus derivado de Vaccinia que contiene el gen de la luciferasa insertado en el sitio de la hemaglutinina pero que carece de inserto con secuencias codificantes de LACK; en el segundo control negativo, los animales no fueron estimulados con ningún vector ("naive"), sino que recibieron PBS en las dos dosis de inmunización.
En total se formaron 5 grupos, constituidos por 5 ratones cada uno. Los distintos grupos de inmunización y los tratamientos recibidos se resumen a continuación en la Tabla 6:
Tabla 6: Grupos de inmunización del ensayo de duración de la protección
DOSIS INICIAL DOSIS DE REFUERZO
GRUPO 1 DNA-LACK 100 μg MVA-LACK l x 107ufp
GRUPO 2 DNA-LACK 100 μg MVA-LACK 5 x lθ7ufp
GRUPO 3 DNA-LACK 100 μg W-LACK 5 x 107ufp
GRUPO 4 DNA-CONTROL 100 μg W-LUC 5 x lθ7 ufp
GRUPO 5 PBS PBS
Tres semanas después de la administración de la dosis de refuerzo, se produjo el desafío de la respuesta inmune inducida mediante la inoculación de 5 x 104 promastigotes metacíclicos de Leishmania major, aislados de cultivos estacionarios de Leishmania tras la incubación con aglutinina de cacahuete. Los promastigotes se inocularon por vía subcutánea en la almohadilla plantar de la pata trasera derecha. Como parámetro para evaluar la protección, se realizó un seguimiento del desarrollo de lesiones en la almohadilla plantar en la que se había producido la inoculación, tomando medidas semanalmente. A diferencia de los ensayos descritos previamente en la presente memoria, el ensayo se prolongó durante 30 semanas tras el desafío, para comprobar si la protección conferida por la inmunización se prolongaba en el tiempo.
La Figura 19, en su parte superior (A) muestra un gráfico en el que se representa la evolución del tamaño de las lesiones con el tiempo transcurrido tras el desafío. Corroborando los resultados obtenidos en los experimentos análogos realizados, todos los animales de los grupos de control, el Grupo 4 (DN A-contro W V-LUC) y el Grupo 5 (PBS/PBS) desarrollaron lesiones severas, como puede comprobarse en las fotografías mostradas en la parte B de Ia Figura 19, tomadas 8 semanas tras el desafío. En la semana 9, los animales de los grupos de control tuvieron que ser sacrificados por razones éticas. En cuanto a los animales que recibieron vectores que contenían insertos de LACK, los ratones inmunizados con MVA-LACK mostraron de nuevo un grado de protección más elevado que los ratones inmunizados con VV-LACK (VV-LACK-HA- en la Figura 19). Ninguno de los animales inmunizados con DNA-LACK seguido de MVA-LACK había desarrollado lesiones 8 semanas después del desafío y sólo un ratón del grupo inmunizado con MVA-LACK a una dosis de 1x107 ufp/ratón comenzó a desarrollar una lesión (3 mm) transcurridas 15 semanas desde el desafío.
- Ejemplo 10.- Aumento de la protección mediante el uso de adyuvantes
Para comprobar si la protección lograda con el vector de la invención podía mejorarse mediante la adición de adyuvantes durante el protocolo de inmunización, se llevó a cabo un experimento en el que se inmunizaron ratones con una primera dosis de
DNA-LACK y una dosis posterior de MVA-LACK, inoculando a los animales, un día después de cada una de las dosis de vectores de vacunación, diferentes cantidades de un adyuvante, concretamente ía pro tema CD4ÜL (Mega CD40L: m-ACRP30 m-CD40L, de APOXIS).
Los animales, ratones Balb/c, fueron inmunizados intradérmicamente, en el día 0, con 100 μg del plásmido DNA-LACK o del plásmido DNA-Control, carente de inserto de LACK y un día más tarde los animales recibieron el adyuvante por la misma ruta (1, 10 ó 20 μg de Mega CD40L, según el grupo). Quince días más tarde, los ratones recibieron la dosis de refuerzo con 1 x 107 ufp/ratón de MVA-LACK o MVA-WT intraperitonealmente, y un día más tarde se les inocularon por la misma ruta diferentes cantidades de adyuvante (1, 10 ó 20 μg de Mega CD40L, según el grupo). Se incluyeron dos grupos de control adicionales, a uno de los cuales se le administró sólo PBS, mientras al otro se le administró PBS junto con el adyuvante, para descartar un posible efecto debido al adyuvante por sí mismo. Los diferentes grupos de inmunización, compuestos cada uno de ellos de 4 ratones por grupo, y los tratamientos recibidos se resumen a continuación en la Tabla7:
Tabla 7: Grupos de inmunización del ensayo con adyuvante
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Tres semanas después de recibir la primera dosis de refuerzo, se inocularon a los ratones 5 x 104 promastigotes metacíclicos de L. major. Tal como se refleja en la Tabla 7, diez semanas después del desafío (15 semanas después de haber sido administrada la dosis inicial), los ratones de los grupos 1, 3 y 4 recibieron una segunda dosis de refuerzo con 5 x 107 ufp de MVA-LACK; en el caso del grupo 4, junto con esa segunda dosis de refuerzo, los ratones recibieron también 20 μg del adyuvante, igualmente por vía intraperitoneal. En la parte superior, A, de la Figura 20 se muestra una representación esquemática del protocolo de inmunización seguido.
El tamaño de las lesiones se monitorizó semanalmente, obteniéndose los resultados que se representan en la gráfica que aparece en la parte intermedia de la Figura 20, marcada como "B". La gráfica de la parte inferior de la Figura 20, marcada como "C", permite observar los tamaños de las lesiones medidas en cada uno de los ratones supervivientes de los grupos 1, 2, 3, 4, 5 y 7 trascurridas 27 semanas desde el desafío; los ratones del grupo 6, que habían recibido sólo PBS previamente al desafío, tuvieron que ser sacrificados 12 semanas después del desafío, al igual que se hizo con un ratón del grupo 2 transcurrido el mismo período de tiempo y con un ratón del grupo 5 una semana después.
Ambas gráficas permiten apreciar que el desarrollo de lesiones en los ratones inmunizados con DNA-LACK y MVA-LACK fue menor que en los grupos de control, excepto en el caso del grupo inmunizado con 1 μg de Mega-CDL40 adicionalmente a los vectores de vacunación DNA-LACK y MVA-LACK (grupo 2), grupo en el que todos los ratones desarrollaron lesiones, cuyo tamaño era comparable al observado en los grupos de control. La adición de 10 μg de Mega-CD40L tras las inmunizaciones con los vectores DNA-LACK y MVA-LACK (grupo 3) parece no tener ningún efecto sobre la protección, pues da lugar a resultados similares a los obtenidos en el grupo 1: un único ratón de los 4 que componían el grupo 3 desarrolló lesión, cuyo tamaño 27 semanas después del desafío era de aproximadamente 6,5 mm. La adición de 20 μg de Mega-CD40L tras las inmunizaciones con los vectores DNA-LACK y MVA-LACK (grupo 4) sí parecen mejorar los resultados obtenidos al inmunizar con DNA-LACK y MVA-LACK sin adyuvante, pues en el grupo 4 sólo un ratón desarrolló una pequeña lesión, de aproximadamente 2 mm 27 semanas después del desafío. En los grupos de control, por su parte (grupos 5 y 7), el tamaño medio de las lesiones observadas a las 27 semanas del desafío era de aproximadamente 3 mm, aunque uno de los ratones había desarrollado una lesión menor, de aproximadamente 1 mm..
En los grupos imnuiiizauυi) eυn DNA-LACK y MVA-LACK MU ¿tuyuvdmc (grupos 1 y 3), sólo 1 ratón de cada grupo desarrolló lesión; en el grupo 3 en concreto el tamaño de la lesión hizo que el ratón hubiera de ser sacrificado antes de transcurrir el período de 27 semanas posteriores al desafío que duró el estudio. En los ratones de estos dos grupos que no desarrollaron lesión (75%), estaba controlado el crecimiento del parásito, como demuestra el hecho de que no desarrollaron lesiones tras haber transcurrido 27 semanas desde el desafío y también porque no presentaban inflamación del nodulo linfático drenante. En el grupo 1, al cual no se le administró adyuvante, la administración de la segunda dosis de refuerzo semanas después del desafío facilitó el control de la replicación del parásito.
Los datos obtenidos parecen indicar tanto que la administración de una segunda dosis de refuerzo es positiva con respecto a aumentar la inmunidad ya generada gracias a las dosis anteriores como que la administración de vectores de vacunación que expresan la proteína LACK es compatible con la administración de adyuvantes, aunque es preferible hacerlo .
- Ejemplo 11: Ensayo de vacunación de perros
Con el propósito de comprobar la efectividad como vacunas de los vectores de la invención, al ser aplicados a animales que constituyen un reservorio natural de la enfermedad, los perros, se efectuó un ensayo en el que se comprobó la protección frente a Leishmania infantum conferida por la vacunación del vector de la invención MVA-
LACK en combinación con una dosis inicial del plásmido DNA-LACK, comparando su eficacia con la del viras recombinante derivado de vaccinia rVV-LACK que lleva insertada la secuencia correspondiente a LACK en los locus de timidina quinasa, TK (es decir, es el vector que se ha denominado VV-LACK TK- anteriormente en la presente memoria) .
11.1 Animales Para los experimentos descritos en este ensayo se utilizaron cuatro grupos de perros. Se seleccionaron 16 animales de una colonia de perros de la raza Beagle, procedentes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Zaragoza y mantenidos en ella en condiciones diseñadas para excluir cualquier posible infección contaminante con Leishmania. Los perros eran de edades comprendidas entre ios i S meses y los 4,5 años, estaban bien alimentados, habían sido mantenidos en vigilancia continua por veterinarios para controlar la aparición de problemas de salud y habían recibido todas las vacunaciones rutinarias contra leptospirosis, moquillo, adenovirosis- 2, hepatitis, parainfluenza y parvo virosis (Hipradog 7, Hipra, Amer, España). Los perros fueron tratados también con fármacos antihelmínticos (Dontal Plus, Bayer, Alemania). Todos ellos eran negativos respecto a la presencia de anticuerpos contra Leishmania según las pruebas realizadas por inmunofluorescencia indirecta (IFI), ensayos de aglutinación directa (DAT) y ELISA.
Los perros se dividieron en cuatro grupos de vacunación:
- El primer grupo, que se utilizó como control negativo, no recibió ni vacunación ni inoculación de L. infantum. Los perros de este grupo recibieron en el día 0 0,5 mi de solución salina por vía intravenosa (47,48). - El segundo grupo se utilizó como control positivo. Los perros no recibieron vacunación, aunque sí se les inoculó L. infantum.
- El tercer grupo fue vacunado con dos dosis del gen codificante de LACK5 una en el día -30 con el plásmido DNA-LACK (100 μg) y la segunda en el día -15 con el virus recombinante derivado de vaccinia rVV-LACK (10 ufp/perro). - Al cuarto grupo se le inoculó una dosis del plásmido DNA-LACK (100 μg) en el día -30 y una segunda dosis del gen codificante de LACK mediante el virus MVA- LACK (IO8 ufp/perro).
A los perros de todos los grupos, excepto los del Grupo 1 (control negativo), se les inocularon por vía intravenosa, en 0,5 mi de solución salina, 108 promastigotes de Leishmania infantum, obtenidos tal como se especifica en el apartado 11.2. El día de la inoculación de los parásitos se consideró el día 0 del experimento. El experimento concluyó 300 días después del día 0. En la Tabla 8 se muestra un resumen de las inoculaciones que recibieron cada grupo
Tabla 8: Grupos del ensayo de vacunación de perros
DOSIS INICIAL DOSIS DE REFUERZO DESAFÍO
(Día -3 O)) (Día 15) (Día 0)
GRUPO l - 0,5 mi solución salina
(5 perros)
GRUPO 2
- L. infantum (1 x 10 ' uφ) (3 perros)
GRUPO 3
DNA-LACK (100 μg) rVV-LACK (l x lθ8 ufp) L. infantum (1 xlO8 ufp)
(4 perros)
GRUPO 4
DNA-LACK (100 μg) MVA-LACK (I x 108ufp) L. infantum (1 xlO8 ufp) (4 perros)
11.2. Aislamiento de parásitos para infección experimental, ensayos de aglutinación directa y ELISA
Los promastigotes de L. infantum utilizados para desencadenar la infección experimental se obtuvieron de un perro de la zona de Zaragoza, infectado de forma natural con L. infantum y que no había recibido tratamiento (MON l/MCAN/ES/01/LLM 996, Servicio de Referencia de Parasitología, Majadahonda, España). Los parásitos se obtuvieron por aspiración de la médula ósea y los ganglios poplíteos, se cultivaron en medio NNN (Novy-Nicolle-McNeal), medio en el que se realizaron dos pases, y a continuación se multiplicaron en RPMI 1640 (Sigma, Reino Unido) suplementado con glutamina 2 mM, 100 μg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina y que contenía suero bovino fetal (FCS) inactivado por calor (Sigma, Reino Unido) al 10%. Los promastigotes estacionarios se recuperaron mediante centrifugación, se resuspendieron en PBS, se ajustó su concentración a (1 x 10 ufp)/0,5 mi y se les inyectaron a los perros por vía intravenosa (49,50).
También se cultivaron promastigotes de L. infantum en medio RPMI que contenía suero fetal de ternera al 10%, a 260C, para utilizarse en el ensayo de aglutinación directa y en el inmunofluorescencia. Los promastigotes se recolectaron a 3600 x g durante 10 minutos a 40C. Después de cinco lavados, se añadieron al sedimento 20 volúmenes de tripsina (0,4% p/v, de Difco), se incubó la mezcla a 37°C durante 45 minutos y posteriormente se lavó cinco veces más en solución de Locke fría (NaCl 154 mM, KCl 6 mM, NaHCO3 2 mM pH 7,7). Se contaron las células y se resuspendieron hasta alcanzar una concentración final de 1x10 células/mi. Para la preparación del antígeno soluble de Leishmania, los promastigotes fueron cultivados en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con FCS inactivado por calor al 10%, 100 μg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina (Gibco). Los parásitos se recolectaron al final de la fase logarítmica, se lavaron con PBS y se fragmentaron mediante tres ciclos de congelación-descongelación. Después los parásitos se sonicaron y se centrifugaron a 16000 x g durante 3 minutos a 40C, recogiéndose el sobrenadante. A continuación, se determinó la concentración de proteínas en el mismo utilizando el método de Bradford con el kit para ensayo de proteínas de BioRad (Bio-Rad Protein Assay, BioRad Laboratories).
11.3. Evaluación de la susceptibilidad o resistencia a la infección Se comprobó regularmente en los perros el establecimiento de la infección parasitaria y el subsiguiente desarrollo de la enfermedad realizando en dichos animales los exámenes rutinarios en busca de signos clínicos clásicos tales como lesiones cutáneas, alopecia, presencia de linfoadenopatías poplíteas, pérdida de peso, ulceración de la piel y palidez en las mucosas. Durante los primeros 6 meses del experimento, se tomaron muestras de sangre de los animales cada 2 semanas para realizar determinaciones bioquímicas, serológicas y de ARNm de citoquinas. A partir de ese momento y hasta el final del experimento, las extracciones de sangre se llevaron a cabo mensualmente. La presencia de parásitos y el posible desarrollo de la enfermedad se detectó mediante un ensayo de aglutinación directa (DAT), según se describe en el apartado 11.4. (51,52,53), así como mediante un ensayo serológico de inrmmofluorescencia indirecta (IFI) con anticuerpos específicos anú-Leishmania, tal como se describe en el mismo apartado. La carga de parásitos en el hígado y el bazo se cuantificó siguiendo el método de
Baumann (54). Brevemente, cada grupo de muestras de tejido se pesó antes de contar en muestras finas de tejido observadas al microscopio el número de parásitos correspondiente a 500 núcleos celulares. La carga total de parásitos por órgano se determino según ia formula Carga total de parásitos = n° amastigotes/núcleo x peso del órgano (mg) x 2 x 105 y es la media de tres determinaciones independientes. La presencia o ausencia de parásito define si ha habido infección o no. Adicionalmente al examen de biopsias, la presencia de parásitos se intentó determinar también mediante el método de "aislamiento", que consiste en cultivar tejido de ganglio linfático en medio NNN para intentar que crezca el parásito y aislarlo. Las dificultades para obtener éxito con este método son considerables y, por eso, no en todos los casos en los que se detecta el parásito por biopsia se consigue el aislamiento. Por ello, el dato de presencia de parásitos obtenido por biopsia se consideró suficiente para hacer el diagnóstico.
11.4. Ensayos serológicos de presencia de parásitos: DAT e IFI Para realizar el ensayo de DAT, a una suspensión de células promastigóticas de
L. infantum (1x108 células/mi, preparadas para el ensayo de aglutinación según se describe en el apartado 11.2) se le añadió un volumen igual de solución de formaldehído y se incubó la mezcla durante toda la noche a temperatura ambiente (RT). La suspensión se centrifugó (3600 x g, 10 minutos) para retirar el formaldehído y se resuspendió en una solución con citrato sódico (NaCl 150 mM, curato sódico 50 mM pH 7,4) que contenía 0,1% (p/v) de azul de Coomasíe. Tras 90 minutos de incubación a RT, se retiró el exceso de colorante por centrifugación en la misma solución con citrato (3600 x g, 10 minutos) y se resuspendió finalmente en solución con citrato que contenía 0,4% de formaldehído. Las muestras se almacenaron en oscuridad a 40C, listas para utilizarse.
El ensayo se llevó a cabo en una placa de microtitulación de 96 pocilios con forma de V (Costar, EE.UU). Se añadieron 50 μl de la suspensión de parásitos a cada uno de los pocilios, en los que previamente se habían cargado diluciones seriadas de los sueros de los perros, partiendo de la dilución 1:100. Las placas se agitaron suavemente durante 1 minuto y a continuación se incubaron a RT durante toda la noche en una cámara húmeda. Se detectó la presencia de agregados azules mediante observación directa (dos medidas independientes), lo que se correlacionó con las diluciones de los sueros. Los valores superiores a 1:800 se consideraron positivos.
En cuanto al ensayo de inmunofiuorescencia, ei suero dei perro que se desea analizar se hace reaccionar con una preparación de Leishmania sobre un portaobjetos, se incuba a 4°C durante 30-45 minutos y a continuación se incuba la preparación con un suero anti-perro conjugado con fluoresceína, durante al menos 1 hora, de manera que, si en el suero del perro existe un anticuerpo específico capaz de reconocer el parásito Leishmania, éste se marcará en verde. Se consideraron positivos aquellos sueros que dieron un valor igual o superior a 1/80 (55,56).
Los resultados obtenidos con cada uno de los perros se resumen en la Tabla 9, junto a los correspondientes a la presencia de parásitos y el desarrollo o no de infección. En dicha Tabla, las celdas correspondientes a los ensayos serológicos y de presencia de parásitos en los que aparecen datos corresponden a perros en los que se obtuvieron resultados positivos; los números indicados entre paréntesis corresponden al día de estabilización de los datos correspondientes.
Tabla 9.- Resultados de presencia de parásitos y desarrollo de la enfermedad en perros según el grupo de vacunación
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11.5. Determinación de IgGl e IgG2
Adicionalmente, se llevó a cabo una determinación de IgGl e IgG2 en las muestras de plasma obtenidas de las muestras de sangre extraídas a lo largo del período de ensayo. En concreto, se realizó una determinación mediante ELISA de los anticuerpos específicos contra el antígeno soluble de Leishmania (SLA), obtenido según se describe en el apartado 11.2. Brevemente, las placas de ELISA se recubrieron con 10 μg/ml de SLA bloqueado con PBS que contenía 1% de BSA, y luego se incubaron con 100 μl de suero de perro diluido 1 :100. Después de lavar tres veces, se añadieron 100 μl/pocillo de los anticuerpos conjugados con HRP siguientes: un anticuerpo de cabra anti-IgGl de perro (1:15000) o un anticuerpo de oveja anti-IgGl de perro (1:20000), ambos de Bethyl Laboratories (Montgomery, TX, EE.UU.). Los anticuerpos se incubaron con el sustrato OPD (Zymed Laboratories, Invitrogen Immunodetection). La absorbancia se leyó a 450 nm, asignando arbitrariamente en cada grupo el valor 1 al valor medio correspondiente a las muestras obtenidas en el día -30 del experimento y calculando para el resto de las muestras el valor n, correspondiente al tanto por 1 de incremento en la absorbancia con respecto al valor obtenido en el día -30.
Los resultados obtenidos se representan en la Figura 21. Tal como puede observarse en ella, la producción de IgGl e IgG2 es similar en los dos grupos de perros vacunados, aunque ligeramente más elevada en los perros vacunados con el vector derivado de la cepa Western Reserve de Vaccinia, (rVV-LACK). La activación del sistema Thl/Th2 parece ser similar en ambos casos. En el caso de las IgGl, al cabo de seis meses los valores se acercan a los del control, mientras que en el caso de las IgG2, que se relacionan con la respuesta protectora, los niveles se mantienen altos por encima de los controles (positivo y negativo) hasta el final del experimento, tanto en los perros inmunizados con el vector rW-LACK como en los inmunizados con MVA-LACK. Esto sugiere que la vacunación con DNA-LACK/MV A-LACK induce una respuesta ThI protectora frente a la infección como sucede con la vacunación con DNA- LACK/rVV-LACK.
Tomados en conjunto, los resultados indican que la vacunación con DNA- LACK y MVA-LACK confiere a los perros a los que se les administra una protección frente al desarrollo de la enfermedad similar tt la conferida poi la vacunación cυii DNA- LACK y rVV-LACK, obteniéndose en ambos casos una protección experimental de al menos el 75% con respecto a los controles positivos, los cuales mostraron la infección y signos clínicos claros de enfermedad en el 100% de los casos. El ensayo confirma la validez del MVA-LACK, como alternativa a los vectores recombinantes derivados de cepas virulentas de Vaccinia, (como es el caso de rVV-LACK) para la vacunación de animales mamíferos susceptibles de ser infectados por Leishmania y en particular de perros. Frente a esos vectores, además, el MVA-LACK representa una alternativa mucho más segura, al tratarse de un virus atenuado.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un vector recombinante derivado del virus atenuado MVA que lleva inserta una secuencia codificante de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma secuencia que se encuentra bajo el control de un promotor que permite su expresión durante el proceso de infección del virus MVA.
2. Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 1, en el que la secuencia codificante de la proteína LACK o del fragmente inmunogénico de la misma está insertada en el locus de hemaglutinina, de forma que se inactiva dicho gen.
3. Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 2, en el que la secuencia codificante de la proteína LACK o del fragmento inmunogénico de la misma está bajo el control del promotor sintético pE/L.
4. Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 3, en el que la secuencia codificante de la proteína LACK o el fragmento inmunogénico de la misma se derivan de la especie Leishmania infantum.
5. Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 4, en el que la secuencia codificante de la proteína LACK da lugar al expresarse a una forma de la proteína LACK que contiene la totalidad de sus aminoácidos y se localiza en el citoplasma celular.
6. Una composición que comprende un vector recombinante derivado del virus MVA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y, opcionalmente, al menos un adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.
7. Uso de un vector recombinante derivado del virus MVA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un medicamento destinado a ser administrado a un mamífero susceptible de ser infectado por una especie del género Leishmania, para la prevención o el tratamiento en dicho mamífero de una enfermedad provocada por una especie del género Leishmania.
8. Uso según la reivindicación 7, en el que la enfermedad es una leishmaniasis visceral.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que la leishmaniasis visceral está provocada por Leishmania infantum.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el mamífero susceptible de ser infectado por dicha especie del género Leishmania al que está destinado el medicamento es un ser humano.
11. Uso según la reivindicación 7, en el que la enfermedad es una leishmaniasis cutánea.
12. Uso según la reivindicación 11, en que la leishmaniasis cutánea está provocada por Leishmania major.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que el mamífero susceptible de ser infectado por dicha especie del género Leishmania al que está destinado el medicamento es un ser humano.
14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 en el que el medicamento está destinado a ser administrado en una única dosis de vacunación.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 en el que el medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de las dosis de
V αL/uii-UjiOii
Figure imgf000054_0001
COilü UtUiLlU ύLL iii^IiUa UΛjύ dosis de vacunación, cada una de las cuales se administra espaciadas en el tiempo.
16. Uso según la reivindicación 15 en el que el medicamento está destinado a ser administrado tanto en la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune como en al menos una de las dosis de vacunación posteriores a Ia primera.
17. Uso según la reivindicación 15 en el que el medicamento está destinado a ser administrado solamente en la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune, estando ausente de las dosis de vacunación posteriores a la primera.
18. Uso según la reivindicación 17 en el que el medicamento está destinado a ser administrado solamente en la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune, conteniendo al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera de las que está ausente el medicamento un vector recombinante diferente que es también un sistema de expresión de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma.
19. Uso según la reivindicación 15 en el que el medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera, estando ausente de la primera dosis de vacunación.
20. Uso según la reivindicación 19 en el que el medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera, conteniendo la primera dosis de vacunación de la que está ausente el medicamento un vector recombinante diferente que es también un sistema de expresión de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma.
21. Uso según la reivindicación 20 en el que el medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera, conteniendo la primera dosis de vacunación de la que está ausente el medicamento un rüy±N úcSiiUüO qüc ct> LdiTiOicii lϊiϊ Siáicϊiiά uc CXpi'cSiOil CiC id plutciύct JJΛCJV O ÜC Üi± fragmento inmunogénico de la misma.
22. Uso según la reivindicación 21 en el que el medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera, conteniendo la primera dosis de vacunación de la que está ausente el medicamento el vector DNA-LACK.
23. Un método de vacunación en el que se administra un vector recombinante derivado de MVA según cualquiera de las reivindicaciones I a S o una composición según la reivindicación 6.
24. Un método de vacunación según la reivindicación 23 en el que se administra una única dosis de vacunación que contiene al menos un vector recombinante derivado de MVA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición según la reivindicación 6.
25. Un método de vacunación según la reivindicación 23 en el que se administran varias dosis de vacunación, de las cuales al menos una contiene al menos un vector recombinante derivado de MVA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición según la reivindicación 6.
26. Un método de vacunación según la reivindicación 25 en el que la primera dosis de vacunación y al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera contienen al menos un vector recombinante derivado de MVA según las reivindicaciones 1 a 4 o una composición según la reivindicación 5.
27. Un método de vacunación según la reivindicación 23 en el que sólo la primera dosis de vacunación contiene al menos un vector recombinante derivado de MVA según las reivindicaciones 1 a 4 o una composición según la reivindicación 6.
28. Un método de vacunación según Ia reivindicación 23 en el que esu± aumente de la primera dosis de vacunación cualquier vector recombinante derivado de MVA según las reivindicaciones 1 a 5 o cualquier composición según la reivindicación 6, conteniendo al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera al menos un vector recombinante derivado de MVA según las reivindicaciones 1 a 5 o una composición según la reivindicación 6.
29. Un método de vacunación según la reivindicación 28 en el que la primera dosis de vacunación contiene al menos un vector recombinante que es un sistema de expresión de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma y que es distinto de cualquier vector recombinante derivado de MVA según las reivindicaciones
I a 5.
30. Un método de vacunación según la reivindicación 29 en el que la primera dosis de vacunación contiene al menos un ADN desnudo que es un sistema de expresión de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma.
31. Un método de vacunación según la reivindicación 30 en el que la primera dosis de vacunación contiene el vector DNA-LACK.
32. Un procedimiento de obtención de un plásmido para ser utilizado para la construcción de un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 5, que comprende las etapas de: a) obtener un fragmento de ADN puro que contiene la secuencia codificante de la proteína LACK de L. infantum escindiéndolo del plásmido pUC LACK mediante digestión con la enzima de restricción EcoRI y purificándolo en geles de agarosa; b) convertir en romos los extremos del fragmento obtenido en la etapa anterior por tratamiento con Klenow; c) obtener un fragmento del plásmido de inserción en Vaccinia pHLZ que permita la unión al fragmento de ADN de extremos romos mediante la digestión con Smal y la desfosforilación con fosfatasa alcalina (CIP);
U) ügtU ci
Figure imgf000057_0001
úci piítSíiϊiάü pniujL, tu iYagiliciitO Cíe .rU-viN pUϊú άc extremos romos que contiene la secuencia codificante de la proteína LACK de l. infantum; e) seleccionar los plásmidos recombinantes mediante análisis de la actividad β- gal, comprobando que las bacterias en las que estén presentes muestren actividad de la enzima β-galactosidasa, mientras que las bacterias en las que no se encuentre el plásmido sean negativas para dicha actividad.
33. Plásmido pHLZ-LACK representado en la Figura I5 obtenible según el procedimiento de la reivindicación 32, caracterizado por comprender un gen de resistencia a ampicilina y las regiones flanqueantes derecha e izquierda del gen de la hemaglutmina (HA) flanqueando una secuencia en cuya parte más alejada de los extremos se encuentran, en orientación opuesta, los promotores de Vaccinia p7.5, al que está unido un gen de β-gal de forma que el promotor p7.5 dirige su expresión, y el promotor sintético temprano/tardío pE/L, al que está unida una secuencia codificante de la proteína LACK de Leishmania infantum de forma que el promotor dirige la expresión de dicha secuencia codificante para dar lugar a la proteína LACK.
34. Uso del plásmido de la reivindicación 33 en la construcción de vectores recombinantes derivados del virus MVA que llevan inserta en el locus de hemaglutmina una secuencia que codifica una forma de la proteína LACK que contiene la totalidad de sus aminoácidos, secuencia que está bajo el control del promotor sintético pE/L.
35. Una composición según la reivindicación 6, en la que está presente la proteína CD40L.
36. Uso según la reivindicación 7, en el que el mamífero susceptible de ser infectado por una especie del género Leishmania al que está destinado el medicamento es un perro.
37. Uso según la reivindicación 36, en el que la leishmaniasis está provocada por Leishmania infantum.
38. Un método de vacunación según la reivindicación 37, en el que el DNA- LACK se administra por vía intradérmica y el vector recombinante según las reivindicaciones 1 a 5 se administra por vía intraperitoneal.
39. Método de vacunación según la reivindicación 38, en el que se administra un adyuvante en el período que comprende las 24 horas posteriores a la administración de la primea dosis de vacunación.
40. Método de vacunación según la reivindicación 39, en el que se administra un adyuvante en el período que comprende las 24 horas posteriores a la administración de la segunda dosis de vacunación.
41. Método de vacunación según las reivindicaciones 39 y 40, en el que el adyuvante administrado es la proteína CD40L.
42. Método de vacunación según la reivindicación 41, en el que la cantidad de proteína CD40L administrada en cada dosis es de al menos 20 μg.
43. Método de vacunación según la reivindicación según la reivindicación 28, en el que tanto la segunda dosis de vacunación como una tercera dosis de vacunación contienen un vector recombinante derivado de MVA según las reivindicaciones 1 a 5 o una composición según la reivindicación 6.
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