ES2334493T3

ES2334493T3 - Vacuna para la proteccion de animales frente a leishmania.

Info

Publication number: ES2334493T3
Application number: ES02702414T
Authority: ES
Inventors: V. E. Larraga Rodriguez De Vera; G. Gonzalez Aseguinolaza; M. J. Ramiro Ibañez; J. A. Castillo Hernandez; J. Lucientes Curdi
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Laboratorios Hipra SA; Universidad de Zaragoza
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Laboratorios Hipra SA; Universidad de Zaragoza
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2010-03-11
Anticipated expiration: 2022-02-21
Also published as: DE60233391D1; EP1371375A1; ATE439858T1; WO2002066054A1; EP1371375B1; PT1371375E

Abstract

La presente invención se relaciona, en general, con la prevención de la leishmaniasis en animales, en particular, de la infección causada por Leishmania sp., que comprende la proteína P36 de Leishmania infantum, o un fragmento inmunogénico de la misma, o bien un sistema de expresión de dicha proteína o fragmento, opcionalmente junto con un compuesto que estimula la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1; asícomo varios protocolos de vacunación frente a Leishmania sp a partir del empleo de dicha vacuna.

Description

Vacuna para la protección de animales frente a Leishmania.

Sector de la técnica

La invención se relaciona, en general, con la prevención de la leishmaniasis en animales, en particular, con una vacuna para proteger animales de la infección causada por Leishmania sp.,basado en un sistema de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de Leishmania infantum y una secuencia de ADN que codifica interleucina-12 (IL-12) o, alternativamente, un sistema de expresión seleccionado entre un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum, en donde dicha vacuna se administra mediante protocolos de inmunización específicos que comprenden una inmunización inicial y una dosis de refuerzo en el que dicho sistema de expresión está involucrado.

Antecedentes de la invención

La leishmaniasis es un grupo de enfermedades parasitarias causadas por varias especies del género Leishmania. Dependiendo de la respuesta inmune del hospedador, la cepa infecciosa y la virulencia del parásito, las manifestaciones clínicas varían desde lesiones cutáneas que se curan de forma espontánea hasta la forma visceral, y fatal si no se trata, de la enfermedad. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que unos 12 millones de personas de todo el mundo están infectadas y 350 millones de personas tienen riesgo de infección (1). En los países mediterráneos la infección es zoonótica y el perro doméstico es el reservorio principal. La cepa endémica de Leishmania en la zona mediterránea es Leishmania infantum, que infecta tanto a seres humanos como a perros, produciendo leishmaniasis cutánea y visceral (2). Algunos estudios epidemiológicos han indicado que en España podrían estar infectados aproximadamente un 7% de los perros, mientras que otros autores han demostrado que el 10-37% de los perros del sur de Francia desarrollaban la leishmaniasis visceral (3). La OMS ha estimado que entre un 2% y un 9% de todos los pacientes con SIDA del sur de Europa desarrollarán leishmaniasis visceral, ya que L. infantum es el causante de la tercera enfermedad parasitaria más frecuente en individuos HIV-positivos en el área mencionada (4).

Un procedimiento adecuado para combatir la leishmaniasis endémica en los países mediterráneos y en otras partes del mundo sería la creación de una vacuna capaz de conferir inmunidad a largo plazo contra el parásito. La viabilidad de una vacuna contra este parásito complejo viene sugerida por el hecho de que los pacientes recuperados de la infección natural desarrollaron una fuerte inmunidad contra Leishmania (5, 6).

Como es bien conocido, en ratones, perros y en seres humanos, los clones de las células T helper (adyuvantes) CD4^{+} pueden dividirse en dos subseries funcionales, Th1 y Th2, de acuerdo con el perfil de las linfocinas producidas. La subserie Th1 produce preferentemente interferón gamma (IFN-\gamma), mientras que la subserie Th2 produce predominantemente la interleucina (IL) 4 [IL-4] (7-9).

En un modelo murino infectado con Leishmania major (especie que produce leishmaniasis cutánea) se ha encontrado una clara correlación entre la resistencia a la infección y la creación de una respuesta Th1 CD4^{+} y, por otra parte, la susceptibilidad y el desarrollo de respuestas Th2 CD4^{+} (10, 11). Asimismo, en humanos y en perros, la resistencia a la leishmaniasis visceral también está asociada con una respuesta Th1 (12-15).

Recientemente se ha demostrado que la interleucina-12 (IL-12) es indispensable para proporcionar una inmunidad protectora contra L. major, ya que inicia respuestas inmunes Th1 protectoras y regula la proliferación de esta subpoblación de células T (16). De hecho, está bien establecido que IL-12 juega un papel crítico en la generación de células Th1 y en la diferenciación óptima de linfocitos T citotóxicos (CTL) (17). Por otra parte, la IL-12 también se ha usado como un adyuvante protector en otros modelos tales como Schistosoma (25), Listeria (26) o Bordetella (27).

En ensayos de vacunación experimentales contra la leishmaniasis murina, se han usado varios antígenos consiguiendo diferentes niveles de protección. Entre éstos se encuentran: gp63 de L. major (18), gp46 (19), LeIF (20, 21), LACK (22) y bibliotecas genómicas de expresión de L. major (23). Asimismo, el antígeno gp46 de L. amazonensis expresado por un virus vaccinia recombinante proporciona resultados alentadores con un alto grado de protección y memoria inmunológica a largo plazo (24).

LACK es una proteína de 36 kDa de L. major, denominada así por su homología con la proteína RACK (receptor de proteína quinasa C activada en mamíferos). Se ha demostrado que un fragmento de 24 kDa de dicha proteína protege contra la exposición a L. major en ratones cuando se administra por vía subcutánea como una proteína soluble en combinación con la citocina IL-12 co-estimuladora. Además, los ratones que recibieron dicho antígeno junto con IL-12 mostraron una regulación negativa del número de células productoras de IL-4 en los ganglios linfáticos drenantes 6 semanas después de la infección con L. major y una regulación positiva de los transcritos de IFN-\gamma en comparación con los ratones no tratados (22). Los ratones se hicieron tolerantes a LACK (ratones transgénicos que expresaban el antígeno en el timo). Otros estudios han puesto de manifiesto que la eficacia protectora de LACK soluble de L. major junto con IL-12 era similar a la eficacia obtenida mediante la inmunización con 100 \mug de ADN que expresaba el mismo antígeno (28).

Recientemente, se ha clonado y caracterizado la proteína P36 de L. infantum (29). El análisis de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína ha puesto de manifiesto que P36 está muy conservada (96-99%) entre las cepas estudiadas de Leishmania, L. major y L. chagasi (22, 30).

La capacidad protectora de P36 de L. infantum se ha ensayado previamente en ratones Balb/c inmunizados con dicha proteína soluble o con un sistema de expresión que expresa dicha proteína en unos ensayos de descarga que comprenden la administración a dichos animales de una dosis de inicio y otra de refuerzo del antígeno, seguido de exposición a promastigotes de L. major, y se ha determinado mediante la evaluación de las lesiones en la almohadilla de la pata donde se inoculó el parásito, la carga parasitaria presente en los ganglios linfáticos, y los parámetros inmunológicos antes y después de la exposición al parásito [Patente ES200100402, solicitada el 21 de Febrero de 2001 con el título "Vacuna para la protección de animales frente a Leishmania"].

No obstante, hasta ahora, no se ha publicado ni se conoce ningún resultado positivo sobre la protección del animal huésped por excelencia de la enfermedad, el perro, reservorio en Europa y América del Sur, ni se conoce si el tipo de respuesta celular frente a la enfermedad es similar a la mostrada en el modelo murino mediante la infección directa por L. infantum en los perros (Patente española ES200102057, solicitada el 12 de septiembre de 2001 titulada "Adición de la patente ES200100402 Vacuna para la protección de perros frente a Leishmania") que asimismo se incluye como parte de esta solicitud de patente PCT.

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Descripción de la invención Breve descripción de la invención

La presente adición se enfrenta con el problema de proporcionar vacunas y protocolos de inmunización capaces de proteger a animales, perros entre otros,y humanos de la infección causada por Leishmania infantum, agente causal de la enfermedad canina y de la leishmaniosis visceral en Europa.

La solución proporcionada por esta invención se basa en el hecho de que los inventores han observado que la expresión conjunta o no en un animal de los genes que codifican un antigen asociado a Leishmania, e.g., el antigen P36 de L. infantum, y una molécula que estimula la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, por ejemplo, la IL-12 murina, contenida en un rVV o en un plásmido pRSET-B capaz de infectar animales, induce una respuesta inmune celular de tipo Th1 que está correlacionada con la protección contra leishmaniasis.

Los inventores también han observado que un protocolo de inmunización que comprende una inmunización inicial con un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y una dosis de inmunización recuerdo con un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum es capaz de proteger animales, particularmente perros, de la infección producida por L. infantum.

Por lo tanto, un objeto de esta invención lo constituye una vacuna que comprende un sistema de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y una secuencia de ADN que codifica un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, en la que dicho compuesto co-estimulador es interleucina-12 (IL-12), para su uso en la protección de animales de una infección producida por Leishmania sp., en donde la vacuna es administrada mediante un protocolo de inmunización animal que comprende una inmunización inicial con una proteína P36 de L. infantum en forma soluble, seguida de la inmunización con una dosis de refuerzo, en donde dicha dosis de refuerzo comprende dicho sistema de expresión. En una realización particular, dicho sistema de expresión es un plásmido o un virus Vaccinia.

Un objeto adicional de la presente invención lo constituye una vacuna que comprende un sistema de expresión seleccionado del grupo que consiste de un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteínaP36 de Leishmania infantum y un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum para su uso en la protección de animales de la infección producida por L. infantum, en la que la vacuna se administra mediante un protocolo de inmunización animal que comprende una inmunización inicial y una dosis de refuerzo, en donde la inmunización inicial se lleva a cabo con dicho plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y la dosis de inmunización de refuerzo se lleva a cabo con un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína L36 de L. infantum.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una vacuna, seleccionada del grupo que consiste en:

(A): una vacuna que comprende un sistema de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y una secuencia de ADN que codifica un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, en la que dicho compuesto co-estimulador es interleucina-12 (IL-12), para su uso en la protección de animales de una infección producida por Leishmania sp., en donde la vacuna se administra mediante un protocolo de inmunización animal que comprende una inmunización inicial con una proteína P36 de L. infantum en forma soluble, seguida de la inmunización con una dosis de refuerzo, en donde dicha dosis de refuerzo comprende dicho sistema de expresión, y

(B): una vacuna que comprende un sistema de expresión seleccionado del grupo que consiste en un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de Leishmania infantum y un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum, para su uso en la protección de animales de la infección producida por L. infantum, en donde la vacuna se administra mediante un protocolo de inmunización animal que comprende una inmunización inicial y una dosis de refuerzo, en donde la inmunización inicial se lleva a cabo con dicho plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y la dosis de inmunización de refuerzo se lleva a cabo con un virus Vaccinia que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum.

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En una realización particular, la vacuna comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de:

1): una proteína P36 de L. infantum,

2): un sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y una secuencia de ADN que codifica un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1 en donde divo compuesto co-estimulador es interleucina 12 (IL-12) y, opcionalmente,

1): uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

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Tal como se utiliza en esta descripción, el término "animal" se refiere a animales vertebrados, incluyendo los seres humanos. Asimismo, en el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de proteína P36 de L. infantum o de sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum calculada para producir el efecto deseado.

El clonaje y la caracterización de la proteína P36 de L. infantum ha sido descrita por González-Aseguinolaza et al. (29).

En una realización,la vacuna de esta invención contiene, un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, por ejemplo, una interleucina 12 (IL-12).

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1" se refiere a la habilidad de estimular la producción de una respuesta inmune celular en donde la relación IFN-\gamma/IL-10 es superior a 1. La capacidad de producir una respuesta inmune celular de tipo Th1 puede determinarse en animales en base a la producción de IFN-\gamma por los linfocitos a partir del ARN específico de IFN-\gamma de perro mediante PCR utilizando iniciadores específicos y utilizando unidades arbitrarias de absorción frente a un control de células de perro no inmunizado así como un control interno de gliceraldehído deshidrogenasa y un control positivo a base de linfocitos de perro activados en cultivo con fitohemaglutininas (PHA). El mismo protocolo, con los cambios necesarios en cuanto a iniciadores, se puede realizar para determinar la producción de IL-4 o IL-10 en la respuesta inmune celular de tipo Th2.

En una realización particular, la vacuna de la invención comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína P36 de L. infantum junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables, y un sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum que comprende, al menos, una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y una secuencia de ADN que codifica un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, donde dicho compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune de tipo Th1 es IL-12.

El sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum presente en un tipo de vacuna de la invención puede ser cualquier sistema de expresión capaz de expresar dicha proteína de forma funcional, es decir, capaz de inducir una respuesta inmune en el animal inmunizado. En una realización particular, dicho sistema de expresión se basa en el virus Vaccinia (VV) que presenta la ventaja de que es un sistema de expresión de antígenos que puede producir una respuesta inmune de tipo Th1. El VV es un virus ADN citoplasmático perteneciente a la familia de los poxvirus, que proporciona un protocolo de vacunación fácil, seguro, estable y barato. El VV es un potente vector usado satisfactoriamente como vacuna viva para erradicar la viruela (31). Se han descrito varios VV recombinantes (VVr) que expresan diferentes genes que pueden provocar efectos inmunológicos a largo plazo que pueden conducir a la protección contra la exposición a un patógeno en numerosos modelos experimentales (32-34). Además, se han usado VVr como vacuna oral, eficaz y segura, contra la rabia, capaz de conferir protección de los animales de vida silvestre, tales como el zorro rojo en Europa y el mapache en los Estados Unidos (35). Por otra parte, se ha descrito que ratones inmunizados con VVr que co-expresan la proteína env de HIV-1 e IL-12 ocasionan un aumento notable de células T CD8^{+} productoras de IFN-\gamma específicas para env (37). La seguridad de VV se garantiza mediante el uso de la cepa Ankara de VV modificada (MVA) que carece de los genes que neutralizan el sistema inmune e induce protección frente a patógenos en sistemas de modelos animales (36).

En una realización particular, dicho sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum presente en un tipo de vacuna de la invención, incluye, al menos, una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y, al menos, una secuencia de ADN que codifica un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1.

La secuencia o secuencias de ADN que codifican la proteína P36 de L. infantum, así como la secuencia o secuencias de ADN que codifican un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1,IL-12, pueden estar, en una realización particular, operativamente enlazadas a una región reguladora de la transcripción.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "región reguladora de la transcripción" incluye todos los elementos necesarios para la transcripción y puede incluir elementos necesarios para la regulación y transcripción específica de célula. Por tanto, una región reguladora de la transcripción incluye, al menos, un promotor, y puede incluir, opcionalmente, otras secuencias reguladoras tales como potenciadores y sitios de unión del factor de transcripción.

Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente enlazado" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes implicados están situados de manera que pueden funcionar en la forma descrita; por ejemplo como un promotor que está operativamente enlazado a una secuencia codificante si el promotor afecta a su transcripción o expresión.

La región reguladora de la transcripción a la que están operativamente enlazados la secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y la secuencia de ADN que codifica dicho compuesto co-estimulador puede ser cualquier región reguladora conocida, por ejemplo, una región reguladora de un gen de VV. La secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y la secuencia de ADN que codifica dicho compuesto co-estimulador pueden estar operativamente enlazadas a la misma secuencia reguladora de la transcripción o, alternativamente, pueden estar operativamente enlazados a secuencias reguladoras de la transcripción diferentes.

El sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum de esta invención puede obtenerse por métodos convencionales de manejo de ácidos nucleicos descritos en cualquier manual de clonaje molecular conocido por el experto en la materia. En una realización particular, dicho sistema de expresión es un VVr llamado VVp36IL12, que expresa simultáneamente el antigen P36 de L. infantum y las subunidades P35 y P40 de la IL-12 murina y cuya construcción está descrita en el Ejemplo 1. La expresión conjunta de la proteína P36 de L. infantum y del compuesto co-estimulador confiere, al menos, inmunidad parcial contra Leishmania. En el sentido usado en esta descripción, la expresión "inmunidad" se refiere a una reducción y/o una prevención de uno o más síntomas asociados con la infección causada por Leishmania sp.

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en la vacuna de la invención son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de vacunas. En una realización particular, dicha vacuna se prepara en forma de una solución o suspensión acuosa en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otro diluyente farmacéuticamente aceptable.

La vacuna de la invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada que dé como resultado una respuesta protectora frente a leishmaniasis, para lo cual dicha vacuna se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la vacuna proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por ejemplo, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc.

En otro aspecto, la invención se refiere al empleo de la proteína P36 de L. infantum y del sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum previamente mencionado, que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y, opcionalmente, una secuencia de ADN que codifica un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, en donde dicho compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo TH1 es IL-12, en la elaboración de una vacuna para proteger animales, perros en particular, de la infección causada por Leishmania sp., en donde la vacuna se administra mediante un protocolo de inmunización animal que comprende una inmunización inicial con una proteína P36 de L. infantum en forma soluble, seguida de una inmunización con una dosis de refuerzo, donde dicha dosis de refuerzo comprende dicho sistema de expresión.

La presente invención también contempla un protocolo de inmunización animal, de perros en particular, frente a Leishmania sp. que comprende la administración a dicho animal, un perro en particular, de una vacuna proporcionada por esta invención, sola o en combinación con otro inmunógeno de Leishmania sp. capaz de producir una respuesta inmune, bien mediante una dosis única o bien mediante una dosis inicial y una o más dosis de refuerzo con dicha vacuna o con dicho inmunógeno de Leishmania.

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Por tanto, la presente invención también se refiere al empleo de un sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum o de un fragmento inmunogénico de la misma, en la elaboración de una vacuna para su administración como

a) una dosis de refuerzo en un protocolo de inmunización de animales, que comprende una inmunización inicial con un inmunógeno de Leishmania sp., en una forma soluble y una inmunización posterior con una dosis de refuerzo o

b) una dosis de inicio o de refuerzo en un protocolo de inmunización de animales, perros entre otros, que comprende una inmunización inicial con un sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum, y una inmunización posterior con una dosis de refuerzo que comprende un sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum en donde la inmunización inicial se lleva a cabo con un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y la dosis de inmunización de refuerzo se lleva a cabo con un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum, como medio para proteger animales de la infección causada por Leishmania sp.

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En una realización particular, el inmunógeno de Leishmania sp. Usado en la inmunización inicial es una proteína P36 de L. infantum y la dosis de refuerzo comprende un sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum que comprende también una o más secuencias de ADN que codifican un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1 tal como IL-12.

Se han ensayado diferentes protocolos de inmunización con la intención de obtener una respuesta inmune Th1 que lleve a la protección contra Leishmania. Para ello, en primer lugar, se generaron VVr que co-expresaban el antígeno P36 de L. infantum y la citocina IL-12 (VVp36IL12) [Ejemplo 1] y se probaron en ratones Balb/c inmunizados con VVr mediante diferentes protocolos de inmunización y se expusieron (liberar) a promastigotes de L. major (Ejemplo 2 2), midiendo la correlación de protección conferida mediante la medida de las lesiones en la almohadilla de las pata en donde el parásito había sido administrado, la carga parasitaria presente en los nódulos linfáticos y algunos parámetros inmunológicos (secreción de IFN-\gamma e IL-10; isotopos específicos de IgG) antes y después de la exposición al parásito, obteniendo protección elevada en los animales vacunados con VVp36IL12.

Una comparación de los diferentes protocolos de inmunización probados permitió establecer que la iniciación con la proteína P36 de L. infantum soluble, seguida de un refuerzo con VVp36IL12 constituye un protocolo de inmunización optimizado, ya que causa una reducción en el tamaño de las lesiones de aproximadamente 52% y una reducción en la carga del parásito de mas del 99% en animales infectados (Ejemplo 2). Esta protección se correlaciona con la activación de una respuesta inmune de tipo Th1, determinada por las relaciones de Ig2a/IgG1 y IFN-g/IL-10 específicas (Ejemplo 3). Estos protocolos son interesantes en la profilaxis contra especies de Leishmania y, quizás, de otras enfermedades parasitarias.

Por otro lado, un segundo protocolo de inmunización se probó de tal manera que los perros se inmunizaron con el gen P36 de L. infantum en un plásmido pRSET-B en dos dosis separadas en el tiempo o en el plásmido en la primera dosis y con una segunda dosis en VVp36, midiendo la producción de interleucina IL4 e IFN gamma así como la producción de anticuerpos anti-P36 específicos en los perros así como sus subtipos IgG1 y IgG2 con el objeto de determinar el tipo de respuesta Th1 o Th2 que inducía en los animales.

El tipo de respuesta parece ser, a partir de los resultados obtenidos (Ejemplo 5 y Tabla 3), que es de tipo Th1 en los perros que han mostrado protección y de tipo Th2 en los controles positivos (enfermos).

Estos protocolos son interesantes en la profilaxis contra especies de Leishmania y, quizás, de otras enfermedades parasitarias y forman parte de esta invención.

La invención también proporciona un sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y una secuencia de ADN que un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, tal como IL-12.

En una realización particular, el sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum comprende, al menos, una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum, y, al menos, una secuencia de ADN que codifica un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, por ejemplo, una IL-12.

La secuencia o secuencias de ADN que codifican la proteína P36 de L. infantum así como la secuencia o secuencias de ADN que codifican uno o más compuestos co-estimuladores capaces de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, tal como IL-12, pueden estar, en un estudio particular, operativamente enlazadas a una región reguladora de la transcripción. La región reguladora de la transcripción a la que están operativamente enlazados la secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y la secuencia de ADN que codifica dicho compuesto co-estimulador puede ser cualquier región reguladora conocida, por ejemplo, una región reguladora de un gen de VV. La secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y la secuencia de ADN que codifica dicho compuesto co-estimulador pueden estar operativamente enlazadas a la misma secuencia reguladora de la transcripción o, alternativamente, pueden estar operativamente enlazadas a secuencias reguladoras de la transcripción diferentes.

El sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum puede ser cualquier sistema de expresión capaz de expresar dicha proteína de forma funcional, es decir, capaz de inducir una respuesta inmune en el animal inmunizado. En una realización particular, dicho sistema de expresión se basa por un lado, en el VV, y por otro lado en el plásmido pCl-neo (Promega).

El sistema de expresión de la proteína P36 de L. infantum proporcionado por esta invención puede obtenerse por técnicas convencionales de manipulación de ácidos nucleicos descritas en cualquier manual de clonaje molecular conocido por los expertos en la materia.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "inducir una respuesta inmune" hace referencia a una reducción y/o prevención de uno o más síntomas asociados con la infección causada por Leishmania sp.

A modo de conclusión, la P36 de L. infantum y un sistema de expresión de la misma, y el protocolo de inmunización de la invención que comprende el empleo de dicha proteína o sistema de expresión, provoca una respuesta inmune de tipo Th1 en perros que produce protección contra la leishmaniasis. Este protocolo, junto con otros antígenos de Leishmania, podría tener una mayor aplicabilidad para controlar ésta y otras enfermedades parasitarias. El empleo de VV muy atenuados, por ejemplo, MVA, asegurará la seguridad en los seres humanos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1.- Generación y caracterización de VVr que expresan P36 de L. infantum mediante un análisis Western de expresión de proteínas. La Figura 1A es una representación esquemática de los genomas de los distintos VVr generados, identificados como VVp36, VVp36IL12 y VVenvIL12 (véase el apartado relativo a Virus y Células en la sección de Materiales y Métodos). El gen que codifica la proteína P36 de L. infantum (p36) se insertó en el locus de la timidina quinasa (TK) del genoma de VV. Se generaron recombinantes dobles de VV mediante la inserción del cassette que contenía los genes que codificaban para la IL-12 murina (p35 y p40) en el locus de la hemaglutinina (HA). Lac-Z y \beta-gluc son los marcadores selectivos, mientras que p11, p7.5 y pe/l son diferentes promotores de VV. Las Figuras 1B y 1C muestran el resultado del análisis Western de expresión de las proteínas recombinantes P36 y P40 (Ejemplo 1.4) utilizando anticuerpos policlonales de conejo anti-P36 (R\alphaP36) de L. infantum (Figura 1B) o anticuerpos monoclonales contra la subunidad P40 de IL-12 (R\alphaP40IL12) murina (Figura 1C).

Figura 2.- Ensayo de protección contra Leishmania de ratones inmunizados con VVp36 en comparación con P36 soluble e IL-12 (véase el Ejemplo 2, Ensayo I). La Figura 2A es un diagrama de barras que muestra el tamaño de la lesión de cada grupo de inmunización infectado con L. major a la semana 7 después de la exposición al parásito. Cada barra representa los valores medios del tamaño de la lesión en la pata trasera infectada en comparación con la pata trasera no infectada de cada grupo de inmunización (n = 4) con SE. Los grupos marcados con un asterisco (*) mostraron una reducción significativa (p<0,01) del tamaño de la lesión en la semana 7 después de la exposición en comparación con el grupo de control (PBS). Los porcentajes de reducción de la lesión en comparación con el grupo de control (PBS) se muestran entre paréntesis. La Figura 2B es un diagrama de barras que muestra las cargas parasitarias detectadas en cada grupo de inmunización 7 semanas después de la exposición al parásito, según el protocolo descrito en la sección de Materiales y Métodos. Las barras representan valores medios de muestras de 4 animales \pm SD de 2 determinaciones diferentes.

Figura 3.- La combinación de VVr que co-expresan P36 e IL-12 seguido de administración de P36 soluble induce una alta protección en ratones infectados con L. major (véase el Ejemplo 2, Ensayo II). La Figura 3A es un diagrama de barras que muestra los valores medios del tamaño de la lesión en la semana 7 después de la exposición al parásito en la pata trasera infectada en comparación con la pata trasera no infectada para el grupo de inmunización (n = 6) con SE. Los grupos marcados con un asterisco (*) demostraron una reducción significativa (p<0,01) del tamaño de la lesión en la semana 7 después de la exposición en comparación con un grupo de control (PBS). Los porcentajes de reducción de la lesión en comparación con el grupo de control se muestran entre paréntesis. La Figura 3B es un diagrama de barras que muestra las cargas parasitarias detectadas en cada grupo de inmunización 7 semanas después de la exposición, según el protocolo descrito en la sección de Materiales y Métodos. Las barras representan valores medios de muestras de 4 animales \pm SAD de 2 determinaciones diferentes.

Figura 4.- Ensayo de protección óptima contra Leishmania en ratones que recibieron una dosis inicial de P36 y fueron reforzados con VVr que co-expresa el antígeno P36 y la citocina IL-12 (véase el Ejemplo 2, Ensayo III). La Figura 4A es un diagrama de barras que muestra el tamaño de la lesión de cada grupo de inmunización infectado con L. major a la semana 7 después de la exposición al parásito. Cada barra representa los valores medios del tamaño de la lesión en la pata trasera infectada infectada en comparación con la pata trasera no infectada de cada grupo de inmunización (n = 8) con SE. Los grupos marcados con un asterisco (*) mostraron una reducción significativa (p<0,01) del tamaño de la lesión en la semana 7 después de la exposición en comparación con un grupo de control (VVenvIL12), mientras que los grupos marcados con 2 asteriscos (**) mostraron una elevada reducción significativa (p<0,05) del tamaño de la lesión en la semana 7 después de la exposición en comparación con el grupo de control. Los porcentajes de reducción de la lesión en comparación con el grupo de control (VVenvIL12) se muestran entre paréntesis. La Figura 4B es un diagrama de barras que muestra las cargas parasitarias detectadas en cada grupo de inmunización 7 semanas después de la exposición, según el protocolo descrito en la sección de Materiales y Métodos. Las barras representan valores medios de muestras de 4 animales \pm SD de 2 determinaciones diferentes.

Figura 5.- Inmunización con P36 soluble más VVp36IL12 proporciona una mayor protección que P36 soluble más VVp36 en ratones infectados con L. major (véase el Ejemplo 2, Ensayo IV). La Figura 5A es un diagrama de barras que muestra el tamaño de la lesión de cada grupo de inmunización infectado con L. major a la semana 7 después de la exposición al parásito. Cada barra representa los valores medios del tamaño de la lesión en la pata trasera infectada infectada en comparación con la pata trasera no infectada de cada grupo de inmunización (n = 8) con SE. Los grupos marcados con un asterisco (*) mostraron una reducción significativa (p<0,01) del tamaño de la lesión en la semana 7 después de la exposición en comparación con un grupo de control (VVenvIL12). Los porcentajes de reducción de la lesión en comparación con el grupo de control (VVenvIL12) se muestran entre paréntesis. La Figura 5B es un diagrama de barras que muestra las cargas parasitarias detectadas en cada grupo de inmunización 7 semanas después de la exposición, según el protocolo descrito en la sección de Materiales y Métodos. Las barras representan valores medios de muestras de 4 animales \pm SD de 2 determinaciones diferentes.

Figura 6.- Producción de IL 4 e IFN\gamma por las células de sangre periférica. Dicha figura muestra la producción de mRNA correspondiente a IL 4 e IFN\gamma en las células periféricas extraídas de los animales de los distintos grupos a lo largo del experimento de inmunización. La inoculación de la infección está marcada como día cero. La medida es en unidades arbitrarias de absorción después de haber descontado la correspondiente al control interno de gliceraldehído deshidrogenasa que se expresa de una forma constante en las células. Cada valor es la media de cinco determinaciones realizadas por duplicado.

Figura 7.- Determinación de anticuerpos específicos anti p36/LACK en el suero de los perros. Esta figura describe la producción de anticuerpos específicos anti p36/LACK en los diferentes grupos de perros midiéndose mediante ELISA. Se muestra la relación IgG2/IgG1. Cada valor representa la media de cinco perros. Los experimentos en este caso se realizaron por triplicado y se expresan en U.A. a 450 nm.

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Ejemplos de la invención

Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma. En la sección de Materiales y Métodos se identifican los virus, células, perros, parásitos y reactivos utilizados en dichos Ejemplos así como los métodos para evaluar la carga parasitaria, la respuesta de anticuerpos específicos frente a P36 de L. infantum, la producción de citocinas y el análisis estadístico. En el aparatado Discusión se comentan los resultados obtenidos y se discuten el significado de estos.

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Materiales y métodos Virus y Células

Los recombinantes de virus vaccinia (VVr) empleados procedían de la cepa tipo silvestre Western Reserve (WR). En el Ejemplo 1 se describe la construcción de los VVr denominados VVp36 (que expresa el antígeno P36 de L. Infantum).

Se cultivaron células de riñón de mono verde africano (BSC-40) y células HeLa en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero de ternera recién nacida [NCS] (Gibco BRL, Paisley, Reino Unido). Todos los virus se cultivaron en células HeLa y se valoraron en células BSC-40.

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Ratones

Se obtuvieron ratones Balb/c hembra del Servicio Animal del Centro Nacional de Biotecnología (Madrid, España) y se mantuvieron en condiciones sin patógenos. Los ratones se usaron cuando tenían entre seis y ocho semanas de edad.

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Perros

Los experimentos de protección se han llevado a cabo en perros hembra de raza Beagle de 13 kg de media y 2 años de edad libres de infección. Los perros se mantuvieron estabulados durante un periodo de veinte meses (dieciocho después de la infección experimental) en una zona protegida frente a posibles infecciones naturales que cumplía las reglas del "Good laboratory practice" exigidas por la UE. El grupo P+V se encontraba separado del resto dado que fue tratado con un virus aunque estuviera atenuado. El animalario se encontraba con las ventanas protegidas con malla metálica que se trataban cada quince días con una solución conteniendo un insecticida activo frente a los mosquitos. Además de la puerta existía una red anti mosquitos con el fin de evitar que pudieran existir los perros enfermos por infección natural. Los cuatro grupos de perros fueron inoculados dos semanas después de la vacunación de los grupos correspondientes (PIP y PAVE) con 10^{8} parásitos por vía endovenosa (día 0 del experimento).

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Parásitos

L. major (WHOM/IR/-173) fue donado por el Dr. Nicholas Glaichenhaus (CNRS, Valbonne, Francia). Los promastigotes se cultivaron a 27ºC en medio de Schneiders (Gibco BRL, Paisley, Reino Unido) suplementado con un 20% de suero de ternera fetal (FCS).

L. infantum (MHOM/FR/78/LEM-75) fue obtenido por los Drs. Castillo y Lucientes (Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza) a partir de ejemplares de perros infectados naturalmente. La identificación de la cepa del parásito se realizó en el Servicio de Prasitología de Majadahonda, I.S. Carlos III.

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Reactivos

Se purificó la proteína recombinante P36 de L. infantum a partir de bacterias, tal como se ha descrito previamente (29).

Se preparó antígeno soluble de Leishmania (LSA) a partir de promastigotes de L. major en fase estacionaria. A modo de resumen, se recogieron 2x10^{8} promastigotes/ml y se resuspendieron en 10 ml de PBS. Después de tres ciclos de congelación-descongelación, la suspensión se centrifugó a 8.000xg y el sobrenadante se recogió en alícuotas de 1 ml. Las concentraciones de proteínas se estimaron por medio del método BCA (Pierce, Rockford, IL).

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Evaluación de la carga parasitaria

El número de parásitos presentes en los ganglios linfáticos drenantes infectados se cuantificó usando un método de dilución limitante (43). Brevemente, cada grupo de ganglios linfáticos poplíteos, antes de la homogeneización, se pesó y después se diluyó en serie en placas de microvaloración de fondo plano de 96 pocillos que contenían medio de Scheiders suplementado con un 20% de FCS. El número de parásitos viables por miligramo de tejido se determinó a partir de la mayor dilución a la que los promastigotes podían desarrollarse después de 7 días de incubación a 27ºC.

El número de parásitos presentes en los ganglios linfáticos drenantes infectados se detectó usando el método de detección por PCR. Usando el mismo método se procedió a detectar los niveles de interleucinas IL 4 y IFN gamma para detectar el estado de activación de las células CD 4+ y la subpoblación dominante (ver más abajo).

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Medida de la respuesta de anticuerpos específicos contra P36 de L infantum

Se obtuvieron muestras de suero reunidas antes y después de la exposición al parásito y se analizaron con respecto a la presencia de anticuerpos específicos para P36 mediante un ELISA. Brevemente, 96 placas Maxisorb (Nunc) se recubrieron con P36 recombinante (3 \mug/ml) durante una noche a 4ºC en PBS a pH 7,5. Las placas se lavaron con PBS-Tween-20 al 0,05% (PBS-T) y se bloquearon con BSA al 1% en PBS-T (tampón bloqueante) durante al menos 1 hora a 37ºC. Las muestras de suero se diluyeron en tampón bloqueante 1:100, 1:500, 1:1.000 y 1:5.000 respectivamente, se añadieron en cantidades de 50 \mul/pocillo y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después, las placas se lavaron tres veces. Se añadió IgG, IgG1 o IgG2a anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa (Souther Biotechnology Associates, Birmingham, AL) durante 1 hora a 37ºC. A continuación, las placas se hicieron reaccionar con el sustrato de peroxidasa OPD (Sigma, St. Louis, MO) y se leyó la absorbancia a 492 nm en un lector de placas Labsystem Multiskan Plus (Chicago, IL). Los datos obtenidos para la IgG total anti-P36 específica no se muestran. Se realizaron ELISAS similares usando antígenos VVr y LSA antes y después de la exposición para comprobar que la inmunización era correcta y el desarrollo de la respuesta inmune humoral de los ratones (aplicable a los Ejemplos 1, 2 y 3).

Por otro lado, y aplicable a los Ejemplos 4 y 5, brevemente, 96 placas Maxisorb (Nunc) se recubrieron con P36 recombinante (4 \mug/ml) durante una noche a 4ºC en tampon carbonato a pH 9,6. Las placas se lavaron con PBS-Tween-20 al 0,05% (PBS-T) y se bloquearon con BSA al 1% en PBS-T (tampón bloqueante) durante al menos 1 hora a 37ºC. Las muestras de suero se diluyeron en tampón bloqueante 1:80 y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después, las placas se lavaron tres veces. Se añadió IgG1 o IgG2 anti-perro de cabra y oveja respectivamente conjugadas con peroxidasa (Bethyl Laboratories Inc.Tx,USA) durante 1 hora a 37ºC (dil 1:500 y 1:3000 respectivamente). A continuación, las placas se hicieron reaccionar con el sustrato de peroxidasa OPD (Sigma, St. Louis, MO) y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas Fluostar Galaxy-copyrigth (C) 2000 BMG Labtechnologies (USA).

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Evaluación de la producción de citocinas

Los niveles de citocinas en los sobrenadantes de cultivo de las células se determinaron por ELISA. A diversos tiempos (inmediatamente antes de la exposición y 7 semanas después de la exposición) los ratones se sacrificaron y se extrajeron los bazos y los ganglios linfáticos drenantes. Se cultivaron en placas preparaciones celulares individuales de estos órganos, por triplicado, a una densidad de 4x10^{6} células/ml. Se añadió proteína P36 soluble entera a 2 \mug/ml, 1 \mug/ml de LPS (Sigma, St. Louis, MO) (control positivo) o RPMI solo (control de fondo) en un volumen final de 1 ml/pocillo. Los sobrenadantes se recogieron a 24, 48 y 72 horas y se almacenaron a -80ºC hasta su empleo. Las medidas de IFN-\gamma e IL-10 se evaluaron mediante un ELISA específico usando anticuerpos de captura y secundarios de Genzyme y siguiendo las instrucciones del fabricante. El límite inferior de detección de IFN-\gamma e IL-10 fue de 5 pg/ml y de 15 pg/ml respectivamente (aplicable a los Ejemplos 1, 2 y 3).

Por otro lado, y aplicable a los Ejemplos 4 y 5, los niveles de citocinas se determinaron mediante la medida del ARN específico procedente de células periféricas (PMBC) correspondiente a cada una de ellas que fue amplificado mediante PCR. A diversos tiempos (inmediatamente antes de la exposición y quincenalmente durante 76 semanas después de la infección) se extrajeron células periféricas (PMBC) que se extrajeron con Trizol para obtener el ARN correspondiente que luego se midió por PCR. En todos los caso se realizó un control interno con fosfogliceraldehido deshidrogenasa que se expresa de una forma constante en las células.

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Obtención del antígeno para el test de Aglutinación Directa (DAT) 1.1. Organismo

Leishmania infantum (MHOM/FR/78/LEM-75). Cepa cedida por el Dr. Jorge Alvar del Centro Nacional de Microbiología, Instituto de salud Carlos III, Majadahonda, Madrid.

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1.2. Metodología para la elaboración del antígeno para la técnica de Aglutinación Directa

1.- Los promastigotes fueron cultivados a 26ºC en medio RPMI 1640, al que se le adiciono con antibióticos penicilina-estreptomicina (100UI/mL y 100\mug/mL respectivamente) y suero fetal bovino al 10%(v/v) inactivado por calor, el medio así preparado fue esterilizado por filtración a través de membranas de 0,22 \mum de poro con de entre tres y cinco días de crecimiento, fueron cosechados mediante centrifugación a 4000G durante 10 minutos a 4ºC.

2.- Se realizaron cinco lavados con solución de Locke fría 3200G por 10 minutos y a 4ºC.

3.- La digestión artificial se realizo mediante la adición de (0.4% p/v de tripsina 1:250 de Difco) en solución de Locke fría y con pH de 7.7.

4.- La relación de promastigotes y tripsina fue de 1/20.

5.- Se mezclan de promastigotes y tripsina y se incuban a 37ºC durante 45 minutos.

6.- Posteriormente se centrifugo la suspensión cinco veces con solución de Locke fría a 3200G durante 10 minutos.

7.- Luego se contaron las células y se les suspendió a una concentración de 2x10^{8} células/mL.

8.- Una vez ajustado el número de células, se adicionó un volumen igual de formaldehído en solución de Locke fría y se dejó en reposo durante toda la noche.

9.- Para retirar los restos del formaldehído se centrifugó a 3200G durante 10 minutos a 4ºC con Solución Citrato Salina y se resuspendió a la misma concentración de (8).

10.- Se adicionó Azul de Coomassie a una concentración final de 0.1% (p/v) y se dejó en agitación moderada durante 90 minutos.

11.- Los restos de colorante se lavaron mediante centrifugación a 3200G durante 10 minutos y se lavo el precipitado, dos veces en solución de Citrato Salina.

12.- Se resuspendió en Solución Formolada al 0.4% en solución Citrato Salina en la misma concentración de (10).

13.- El antígeno se almacenó en refrigeración a 4ºC y protegido de la luz. (Ver apéndice I).

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1.3. Desarrollo de la técnica de DAT

1.- Se utilizaron placas de microtitulación de 12 por 8 pocillos y de fondo en "V".

2.- Se realizan diluciones al duplo de los sueros, iniciando en 1/100, para lo cual.

3.- Se adicionaron 50 \mul de la solución diluente en cada pocillo excepto segundo pocillo.

4.- En el segundo pocillo se adicionan 100 \mul de la dilución 1/100 del suero problema.

5.- Se transfieren 50 \mul del segundo pocillo al tercero, se mezclaron bien y se pasaron 50 \mul del tercer pocillo al cuarto, se continuo esta operación a lo largo de toda la placa y se descartaron los últimos 50 \mul del pocillo número 12.

6.- Se colocaron sueros control positivo y negativo en pocillos por separado.

7.- Se agitó el antígeno para resuspender las células, posteriormente se tomaron 50 \mul de este y se adicionaron a cada pocillo.

8.- Se cubrieron las placas y se agitaron 60 segundos a favor y en contra de las manecillas del reloj y se dejaron incubar toda la noche en posición horizontal, cuidando de dejarles en un sitio estable y sin movimiento, protegidas de la luz y de la sequedad.

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1.4. Interpretación de los resultados

Se leyeron colocándolas sobre un fondo blanco, el resultado positivo es aquel en el que el pocillo visualizado presenta un color uniforme, sin apreciarse precipitaciones en el centro, todos los pocillos con precipitaciones del antígeno distintas al control negativo se consideran como positivas, los resultados fueron leídos por dos personas y se compararon los resultados.

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1.5.- Bibliografía

Boelaert, M., El Safi, S., Goetghebeur, E., Gomes-Pereira, S., Le Ray, D. y P. Van der Stuyft. 1999a. Latent class analysis permits unbiased estimates of the validity of DAT for the diagnosis of visceral leishmaniasis. Tropical Medicine and international Health. 4(5):395-401.

Boelaert, M., El Safi, M. Musa., Githure, J., Mbati, P., Gurubacharya, V.L., Shrestha, J., Jacquet, D., De Muynck, A., Le Ray, D y P. Van der Stuyft. 1999. Multi-centre evaluation of repeatability and reproducibility of the direct agglutination test for visceral leihmaniasis. Tropical Medicine and international Health. 4(1):31-37.

Boelaert, M., El Safi, S., Jacquet, D., De Muynck., Van der Stuyft, P. y D. Le Ray. 1999b Operational Validation of The Direct agglutination Test for Diagnosis of Visceral Leishmaniosis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60(1) 129-134.

De Korte, P.M., Harith, A.E., Dereure, J., Huigen, E., Faucherre, V. & van der Kaay, H.J. 1990. Introduction of an improved direct agglutination test for the detection of Leishmania infantum infection in southern France. Parasitology Research, 76: 526-530.

Harith, A.E., Kolk, A.H.J., Kager, P.A., Leeuwenburg, J., Muigai, R., Kiugu, S., Kiugu, S. y J.J. Laarman. 1986. A simple and economical direct agglutination test for serodiagnosis and sero-epidemiological studies of visceral leishmaniasis. Transactions of the Royal Society Medicine and Hygiene. 80, 583-587.

Harith, A.E., Kolk, A.H.J., Kager, P.A., Leeuwenburg, J., Faber, F.J., Muigai, R., Kiugu, S. y J.J. Laarman. 1987. Evaluation of a newly developed direct agglutination test (DAT) for serodiagnosis and ser-epidemiological studies of visceral leishmaniasis: comparison with IFAT and ELISA. Transactions of the Royal Society Medicine and Hygiene. 81.603-606.

Harith, A.E., Slappendel, R.J., Reiter, I., van Knapen, F., de Korte, P., Huigen, E. y A.H.J. Kolk. 1989. Application of a direct agglutination test for the detection of specific anti-Leishmania antibodies in the canine reservoir. Journal of Clinical Microbiology. 27:2252-2257.

Oskam, L., Nieuwenhuijs, J.L. y A. Hailu. 1999. Evaluation of the direct agglutination test (DAT) using freeze-dried antigen for the detection of anti-leismania antibodies in stored sera from various patient groups in Ethiopia. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 93,275-277.

Slappendel, R and E. Teseke. A revew of canine leishmaniasis presenting outside endemic areas. 1999. Canine Leishmaniasis an update. Proceding of International Canine Leishmaniasis Forum. Barcelona, Spain. pp. 54-59.

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Apéndice I Reactivos y Soluciones para la preparación del antígeno usado en la técnica de Aglutinación Directa a).- Reactivos

Cloruro de sodio (NaCl)

Cloruro de potasio (KCl)

Cloruro de calcio (CaCl_{2})

Bicarbonato de sodio (NaHCO_{3})

Tris-citrato de sodio

Gelatina (Difco, USA)

Tripsina (1:250 Difco,USA)

B-mercaptoetanol

Azul brillante de Coomassie (R 250, Merck)

Formaldehído 38%

Suero fetal bovino (Gibco BRL, Scotland)

Medio RPMI 1640 (Gibco BRL, Scotland)

Penicilina-streptomicina (Gibco BRL, Scotland)

Gentamicina (Schering-Plough, España)

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B).- Soluciones B.1.- Solución Amortiguadora de Fosfato Salino (PBS), pH 7,2

Cloruro de sodio (Na Cl): 8 gm

Fosfato monopotásico (KH_{2}PO_{4}): 0,2 gm

Fosfato disodico (Na_{2}HPO_{4}.12H_{2}0): 2,88 gm

Cloruro de Potasio (KCl): 0,2 gm

Agua Destilada (c.s.p): 1000 mL

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B.2.- Suero Fisiológico Salino

Cloruro de sodio (Na Cl): 8,9 gm

Agua Destilada (c.s.p): 1000 mL

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B.3.- Solución de Locke

D-Glucosa: 0,25% (p/v)

Cloruro de Sodio: 0,9% (p/v)

Cloruro de Potasio: 0,04% (p/v)

Cloruro de Calcio: 0,02% (p/v)

Bicarbonato de Sodio: 0,02% (p/V)

Agua Destilada (c.s.p): 1000 mL

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B.4.- Solución Citrato salina

Cloruro de Sodio: 8,77 gm

Agua Destilada (c.s.p): 1000 mL

pH ajustado a 7.4 mediante la adición de 0.056M de tris-citrato de sodio(16.46 gm/1000 mL).

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B.5.- Diluente

Se preparó la solución Citrato Salina a pH 7,4 y se le adicionó 1%(v/v) de Suero Fetal Bovino inactivado y 0,1M de 2-mercaptoetanol.

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B.6.- Solución de Tripsina al 0,4% en Solución de Locke a pH 6,9: Con la finalidad de digerir parcialmente la superficie del parásito y exponer adecuadamente los determinantes antigenicos deseados se preparó una solución de tripsina al 0.4% en solución de Locke 0,4 gm de Tripsina (1:250) en 100 mL de Solución de Locke, ó 4 gm de Tripsina en 1000 mL de Solución de Locke (Nota: Se agregaron 1ml de la concentración de Promastigotes en 20 mL de la Solución de Tripsina es decir una relación de 1/20).

B.7.- Formaldehído al 2% en Sol. de Locke a PH 6,9. Se prepararon 60 mL de Formaldehído al 38% en 940 mL de Solución de Locke.

B.8.- Tinción de Azul Brillante de Coomassie: 0.02 gm de Azul Brillante de Coomassie R-250 Merck./100 mL de Solución de Citrato Salina (Nota: No todos los Promastigotes se tiñen Uniformemente).

B.9.- Solución de Conservación: 1 mL de formaldehído al 38% en 99 mL de Solución de Citrato Salina.

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Aislamientos del parásito 1- Cultivo in vitro

Con la finalidad de aislar el parásito, se utilizó el medio NNN (Novy-Nicolle-McNeal), ver apéndice(II). Cada tres meses, se realizaron cultivos a partir de punción de ganglio linfático poplíteo, los cultivos se revisaron periódicamente y los resultados fueron registrados.

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2- Punción de ganglio linfático

Por su fácil localización, además de requerir una metodología poco traumática, se decidió utilizar la punción del ganglio linfático poplíteo, como fuente de inoculo para el aislamiento del parásito, para lo cual se sujeto al los animales y seles desinfecto con alcohol la zona posterior del muslo y haciendo un poco de presión con los dedos oprimiendo el ganglio contra la piel, se consiguió fijarlo en la superficie, luego se introdujo una aguja de 0,90 X 21 mm ensamblada a una jeringa de 5 mL la cual contenía 1 mL de solución salina fisiológica estéril, haciendo un poco se masaje y moviendo la aguja se consiguió obtener las muestras, el material así colectado fue vertido en el interior de tubos con medio NNN, se les identificó y colocó en incubación a 27ºC (Groulade y Bourdeau 1988)(WHO/LEIS/96 p28. (ver apéndice II).

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3.- Bibliografía

Groulade, P. & P. Bourdeau. 1988. Moyens practiques de mise en évidence des leihmanies. Practique Médicale et chirugicale de l'Animal de compagnie, 5 (supplément): 73-79.

UNDP/Word Banck/WHO. 1989. Handbook on Isolation Characterization and Cryopreservation of Leishmania. Geneva. pp.1-45.

WHO. 1996. Manual on Visceral Leishmaniasis Control. Who/LEISH/96.40, Geneva. pp.51-53.

Zijlstra, E.E and A.M. El-Hassan. 2001. Leishmaniasis in Sudan. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 95,S1/27- S1/58.

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4.- Apéndice II Soluciones y reactivos 4.1- Medio NNN (Novy-Nicolle-McNeal)

La fase sólida del medio esta compuesta por 1,4 g de agar base, 0,6g de cloruro de sodio (Na Cl) y aforado a 90 mL con agua destilada, se calienta la mezcla hasta su disolución y se le esteriliza a 121ºC por 15 minutos, se le deja enfriar hasta los 50ºC y se le mantiene e esta temperatura dejando en baño María y agitación, posteriormente en esterilidad se le adicionan 10 mL de sangre fresca de conejo desfibrinada a la que previamente se le añaden 5 mg de gentamicina (Schering-Plough, España), se le dispensa en tubos estériles a razón de 2 mL por tubo, se deja enfriar los tubos en posición horizontal, se comprueba su esterilidad por incubación a 37ºC y una vez descartados los tubos contaminados el resto es dejado en refrigeración hasta su uso.

La fase liquida del medio generalmente se forma por la condensación de los vapores producidos por los cambios de temperatura, en aquellos tubos que posean muy poco liquido de condensación se les puede añadir no más de cinco gotas de PBS, suero salino fisiológico o incluso un poco de medio RPMI 1640 ó 199 (Gibco BRL, Scotland).

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4.2.- Solución Amortiguadora de Fosfato Salino (PBS), pH 7,2

Cloruro de sodio (Na Cl): 8 gm

Fosfato monopotásico (KH_{2}PO_{4}): 0,2 gm

Fosfato disodico (Na_{2}HPO_{4}.12H_{2}0): 2,88 gm

Cloruro de Potasio (KCl): 0,2 gm

Agua Destilada (c.s.p): 1000 mL

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4.3.- Suero Fisiológico Salino:

Cloruro de sodio (Na Cl): 8,9 gm

Agua Destilada (c.s.p): 1000 mL

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Análisis estadístico

Se determinó el significado estadístico (p<0,01 o p<0,05) de las diferencias existentes entre los grupos de inmunización de perros y el análisis de regresión mediante ANOVA y el ensayo t de Student.

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Ejemplo 1 Construcción de virus Vaccinia recombinantes

Para estudiar la viabilidad de la protección de ratones susceptibles contra la infección causada por Leishmania, se generaron 2 VVr diferentes, uno que expresa el antígeno P36 de L. infantum (VVp36) y otro que expresa simultáneamente el antígeno P36 de L. infantum y las subunidades P35 y P40 de la IL-12 murina (VVp36IL12). Asimismo, se construyó un VVr control que expresa el producto del gen env de HIV-1 y las subunidades P35 y P40 de IL-12 murina (VVenvIL12). En la Figura 1A se muestra una representación esquemática de los genomas de dichos VVr.

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1.1 Construcción de un VVr que expresa el antígeno P36 de L. infantum

El gen que codifica para la proteína P36 de L. infantum se obtuvo a partir de una biblioteca genómica descrita previamente (29). Se clonó en el plásmido de inserción de VV pSC11 bajo el control del promotor viral temprano/tardío p7.5 en el locus de la timidina quinasa (TK). Este plásmido contiene el gen de la \beta-galactosidasa de E. coli bajo el control del promotor viral tardío p11.

VVp36 se preparó mediante la transfección con el plásmido previamente preparado de células BSC-40 infectadas con WR y los virus recombinantes se recogieron a las 48-72 horas post infección y se seleccionaron después del ensayo en placas mediante la adición de X-gal al agar. Se seleccionaron las placas productoras de \beta-galactosidasa, se clonaron tres veces y se amplificaron siguiendo procedimientos convencionales.

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1.2 Construcción de un VVr que expresa el antígeno P36 de L. infantum y la citocina IL-12 murina

Se aislaron los ADNc que codificaban para las dos subunidades de IL-12 (p35 y p40) seguidas por una secuencia interna del sitio de unión a ribosomas (IRES) a partir del plásmido pBSIL-12 (donado por el Dr. Zavala, Universidad de Nueva York), mediante digestión con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. Los extremos del cassette que contenía la secuencia completa de IL-12 (p35-IRES-p40) se hicieron romos mediante tratamiento con la enzima de Klenow y el cassette se clonó en el sitio SmaI del vector de inserción de VV pJR101. El plásmido resultante, pJR101-IL12, contiene los genes de la IL-12 bajo el control de un promotor sintético temprano/tardío de VV (p e/l) (39) y el gen marcador de la \beta-glucuronidasa de E. coli bajo el control del promotor temprano/tardío viral (p7.5). Todas estas secuencias están flanqueadas por regiones del gen de la hemaglutinina (HA) de VV.

El doble recombinante VVp36IL12 se preparó mediante la infección de células BCS-40 con VVp36 y la transfección de las mismas con el plásmido pJR101-IL12. Los cultivos celulares se recogieron a las 48 horas post infección y los virus dobles recombinantes se seleccionaron después del ensayo en placas mediante la adición de X-gluc a la capa de agar (40). Después de tres vueltas de selección, los virus se purificaron siguiendo procedimientos convencionales mediante centrifugación en gradiente de sacarosa (41).

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1.3 Construcción de VVr control

Como control, se utilizó un VVr que contenía el gen env de HIV-1 (en lugar del gen p36) y las secuencias codificantes de las subunidades P35 y P40 de IL-12 murina (VVenvIL12), mediante un protocolo descrito previamente (33).

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1.4 Análisis Western de expresión de proteínas

Para comprobar la expresión de las proteínas recombinantes de los VVr generados, P36 y la proteína de la subunidad P40 de IL-12, en células BCS-40 infectadas con VVp36, VVp36IL12 o VVenvIL12 se realizó un análisis de transferencia Western. Brevemente, se infectaron células BSC-40 (5 unidades formadoras de placa (ufp)/célula) con VVp36, VVp36IL12 o VVenvIL-12, y a las 24 horas post infección, los extractos celulares se fraccionaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) en condiciones reductoras, se transfirieron a papel de nitrocelulosa y se hicieron reaccionar con anticuerpos policlonales de conejo anti-P36 (R\alphaP36) o con anticuerpos monoclonales contra la subunidad P40 de IL-12 (R\alphaP40IL12).

La Figura 1B pone de manifiesto que tanto VVp36 como VVp36IL12, pero no VVenvIL-12, sintetizan un producto con reactividad frente a un anticuerpo específico para P36. En la transferencia Western se muestra la proteína P36 derivada de E. coli purificada con una señal de histidina para comparar la reactividad inmune en la banda derecha. La diferencia de tamaño con la P36 expresada a partir de los VVr se debe a los aminoácidos histidina extra añadidos al extremo amino terminal.

La Figura 1C muestra la reactividad inmune de los mismos extractos celulares con anticuerpos dirigidos contra la subunidad de 40 kDa de IL-12. El doblete de proteína que aparece en el gel probablemente está relacionado con diferencias de las modificaciones post-traduccionales.

Por otra parte, para investigar si la IL-12 expresada por VVp36IL12 y VVenvIL12 era bioactiva, se realizó un bioensayo de IL-12, mediante el protocolo descrito por Hogan et al. (42) con los sobrenadantes de las células BSC-40 infectadas con dichos virus recombinantes, observándose que la proteína IL-12 expresada por dichos VVr era biológicamente activa.

Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la expresión correcta de P36 de L. infantum y de IL-12 murina en los VVr generados.

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Ejemplo 2 Inmunización y exposición a la infección 2.1 Ensayo I

Después de comprobar la expresión correcta de P36 de L. infantum y de IL-12 murina en los VVr generados (VVp36 y VVp36IL12) se realizó un experimento de vacunación para establecer si la inmunización con VVp36 inducía protección en comparación con la proteína P36 de L. infantum purificada (Ensayo I). Para ello, grupos de 4 ratones fueron tratados inicialmente (cebados) con VVp36 (5x10^{7} ufp/ratón), vía intraperitoneal (i.p.), o con P36 soluble (30 \mug), en este último caso, la inmunización se realizó en las condiciones óptimas para la protección presentadas por otros investigadores (22) y, por lo tanto, el cebado incluía P36 junto con IL-12 murina recombinante soluble (1 \mug) (Genzyme, Cambridge, MA), vía subcutánea (s.c.). Como control se utilizó un grupo de ratones no inmunizados (tratados con PBS). Dos semanas después de la primera inmunización (14 días post inmunización (d.p.i.)), a los animales se les administró una dosis de refuerzo bien con P36 soluble (30 \mug) o con VVp36 (5x10^{7} ufp/ratón). Tres semanas después, los animales se expusieron a 10^{5} promastigotes de una solución madre congelada de L. major administrada en la almohadilla de la pata trasera derecha y se midió el desarrollo de las lesiones en el sitio de inoculación semanalmente hasta 7 semanas después de la exposición (12 semanas después de la dosis inicial), con un calibre digital (Mauser Digital, Suiza), expresándose como el aumento de grosor de la pata trasera infectada en comparación con una pata trasera no infectada. También se midió la carga parasitaria en los ganglios linfáticos de los animales 7 semanas después de la exposición al parásito mediante el protocolo descrito en la sección de Materiales y Métodos. Se compararon los resultados obtenidos entre los distintos grupos de animales, que se presentan como reducción en el tamaño de la lesión y en la carga parasitaria en comparación con un grupo no inmunizado (control con PBS). La Figura 2A muestra el tamaño medio de la lesión de cada uno de los grupos de inmunización, mientras que la Figura 2B muestra la carga parasitaria en los ganglios linfáticos. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la proteína P36 de L. infantum administrada en forma de proteína soluble, así como la expresada por VVp36, eran capaces de inducir alguna protección frente a L. major en comparación con los animales no inmunizados. En los animales inmunizados con VVp36 parece haber un efecto de reducción parasitaria mayor que en los animales que recibieron la proteína soluble.

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2.2 Ensayo II

Puesto que la IL-12 murina aumenta la respuesta inmune celular a un antígeno y dirige el sistema inmune a una respuesta Th1 (44-46), se ha estudiado la potencia adyuvante de IL-12 cuando se co-expresa junto con P36 (Ensayo II). Para que los resultados fueran significativos, se aumentó el número de animales inmunizados a 10 por grupo (cuatro animales se sacrificaron antes de la exposición para realizar estudios inmunológicos). Se usaron 6 grupos de animales:

-: el grupo de control recibió PBS;

-: el segundo grupo recibió el antígeno soluble de L. major (LSA);

-: el tercer grupo recibió VVp36IL12;

-: el cuarto grupo recibió VVp36IL12;

-: el quinto grupo recibió VVp36; y

-: el sexto grupo recibió VVenvIL12.

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A los ratones se les administró una dosis inicial de VVr (5x10^{7} ufp/ratón), vía i.p. o de P36 de L. infantum recombinante (30 \mug/ratón), vía s.c. Dos semanas después de la primera inmunización, es decir, a los 14 d.p.i., a cada grupo de animales se le administró una dosis de refuerzo con los inmunógenos homólogos excepto en el tercer grupo, que recibió P36 soluble. Tres semanas después del refuerzo (34 d.p.i) se obtuvieron sueros, bazos y ganglios linfáticos de cada grupo de inmunización. Al día siguiente (35 d.p.i.), todos los ratones se expusieron a 5x10^{4} promastigotes de L. major metacíclicos vivos virulentos en fase estacionaria que se administraron en la almohadilla de la pata trasera derecha. Se midió el desarrollo de las lesiones en el sitio de inoculación semanalmente con un calibre digital (Mauser Digital, Suiza), expresándose como el aumento de grosor de la pata trasera infectada en comparación con una pata trasera no infectada, así como la carga parasitaria hasta 7 semanas después de la exposición a los promastigotes. Al final de los experimentos (7 semanas después de la exposición) los ratones se sacrificaron y se recogieron sueros, ganglios linfáticos y bazos para realizar ensayos inmunológicos.

La Figura 3A muestra el tamaño medio de la lesión y la Figura 3B muestra la media de la carga parasitaria en los ganglios linfáticos drenantes más próximos a la lesión. Aunque el grupo de control (PBS) desencadenó una infección grave, los grupos (VVp36 + VVp36), (VVp36IL12 + VVp36IL12) pudieron controlar la infección en alguna medida, ya que se descubrió una reducción en el tamaño de la lesión y en la carga parasitaria. El mejor protocolo de inmunización consistía en administrar VVp36IL12 como inmunógeno inicial seguido de P36 soluble. En este grupo, el tamaño medio de la lesión, 7 semanas después de la exposición, fue significativamente menor que en el resto de los grupos (reducción media del 47% en comparación con el grupo de control), y al mismo tiempo la carga parasitaria se redujo notablemente (99%).

La doble inmunización con VVp36IL12 no mejoró los resultados obtenidos por una sola dosis; el tamaño de la lesión sólo se redujo en un 25% en comparación con el grupo de control. La carga parasitaria encontrada en este grupo de animales inmunizados se mantuvo relativamente baja (8,9x10^{3} parásitos/mg), aunque superior a la del grupo de animales que se habían protegido de la mejor manera (VVp36IL12 + P36: 1,1x10^{3} parásitos/mg). Debe destacarse que se obtuvieron resultados similares con los ratones no inmunizados (PBS) y los ratones de control VV (VVenvIL12). Esta observación indica que la infección con VV no ayuda a exacerbar el curso de la infección parasitaria.

Los resultados obtenidos con este ensayo ponen de manifiesto que el VVr que co-expresa P36 e IL-12 (VVp36IL12) induce una mayor protección contra L. major que VVp36.

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2.3 Ensayo III

Como en el experimento de inmunización previo (Ensayo II) se obtuvo una protección significativa contra L. major con un protocolo basado en la administración secuencial de los inmunógenos VVp36IL12 seguido de P36 soluble, se procedió a determinar si el protocolo de inmunización invertido también podía inducir la protección contra Leishmania (Ensayo III), ya que, como es conocido, VVr administrado en una dosis de refuerzo expande las células T CD8^{+} primarias (66). Para que los resultados fueran significativos, el número de ratones inmunizados por grupo se aumentó a 12. Cuatro grupos de animales recibieron dosis iniciales y de refuerzo con diferentes combinaciones de inmunógenos y se expusieron mediante un procedimiento similar al descrito para el Ensayo II.

En la Figura 4 se muestran los resultados que indican el efecto de distintos protocolos de inmunización sobre el tamaño de las lesiones y la carga parasitaria. El grupo P36+VVp36IL12 proporcionó una reducción de aproximadamente un 50% en el tamaño de la lesión (3,77''0,31 mm) en comparación con el control (VVenvIL12+VVenvIL12: 7,61''0,62 mm). El segundo mejor grupo constaba de VVp36 más P36 soluble (reducción del 40%; 4,53''0,80 mm). En este experimento, el protocolo opuesto (P36+VVp36) sólo proporcionó una reducción del 30% (5,38''0,95 mm). Cuando se midió la carga parasitaria, se descubrió que disminuía notablemente (99%) en animales inmunizados con P36+VVp36IL12.

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2.4 Ensayo IV

Para demostrar adicionalmente que la protección obtenida mediante el protocolo P36+VVp36IL12 es muy significativa, se realizó otro experimento con 13 animales por grupo y se comparó la eficacia protectora frente a animales inmunizados con P36+VVp36 (Ensayo IV) siguiendo un procedimiento similar al del Ensayo II. En la Figura 5 se muestran los resultados de los tamaños de las lesiones y de la carga parasitaria. En los animales inmunizados con P36+VVp36IL12 se observó, claramente, una reducción en el tamaño de las lesiones y en la carga parasitaria mayor que en los animales inmunizados con P36+VVp36.

Los resultados mostrados en las Figuras 4 y 5 permiten establecer que entre los distintos protocolos de inmunización ensayados, el que comienza con la administración de la proteína P36 soluble seguido de un refuerzo con VVp36IL12 induce la mayor protección frente a la infección causada por L. major.

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Ejemplo 3 Características de la respuesta inmune producida por distintos VVr antes y después de la exposición a promastigotes de L. major 3.1 Respuestas inmunes humorales y celulares antes de la exposición a L. major

La respuesta inmune desencadenada en ratones susceptibles por la infección con Leishmania es de tipo Th2, y esta respuesta se ha correlacionado con la progresión de la enfermedad (47-49), mientras que la producción de citocinas como IFN-\gamma e IL-12 se ha correlacionado con la resolución de la enfermedad (50, 51). Como para inducir una protección contra la infección por Leishmania (10, 11) podría requerirse la activación de una respuesta inmune de tipo Th1, se ha determinado el tipo de respuesta inmune generada antes de la inmunización con los VVr generados. Para ello, los inventores caracterizaron la relación entre una respuesta de tipo Th1 característica (con la producción mayoritaria de IgG de isotipo 2a e IFN-\gamma) (52) y una respuesta de tipo Th2 (con la producción mayoritaria de IgG de isotipo 1 e IL-10), en los grupos de ratones inmunizados en un régimen de dosis inicial y de refuerzo tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. Tres semanas después del refuerzo, se extrajo suero de cada grupo de animales y se evaluaron los niveles de inmunoglobulinas G anti-P36 específicas (de los isotipos 1 y 2a) en los sueros reunidos. Los resultados para los animales usados en los Ensayos II-IV (Ejemplo 2) se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Producción específica de IgG1, IgG2a, IFN-\gamma e IL-10 antes de la exposición a L. major

1

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2

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3

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^{a} IgG2a/IgG1 representa la relación de las absorbancias a 492 nm de anticuerpos específicos de cada grupo de inmunización diluidos 1:100, tal como se determina por un ELISA indirecto. Cada valor representa la media de dos determinaciones independientes \pm SD para las muestras reunidas (Ensayo II, n=4; Ensayo III, n=4 Ensayo IV, n=6). Los sueros se recogieron 7 semanas después de la exposición al parásito.

^{b} Se recogieron células de bazo de cada grupo inmunizado de ratones 7 semanas después de la exposición y se cultivaron con proteína P36 soluble a una concentración de 2 \mug/ml durante 48 horas. La producción de citocinas se determinó a partir de los sobrenadantes de cultivo como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cada valor representa la media \pm SD de dos determinaciones diferentes.

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Como era de esperar, todos los grupos de ratones inmunizados con VVr desarrollaron una respuesta inmune específica contra proteínas de VV en un ensayo ELISA (datos no mostrados), lo que indica que el procedimiento de inmunización fue correcto. Los protocolos de inmunización basados en la proteína P36 soluble junto con VVp36IL12 (Ensayos III y IV) obtuvieron la mayores relaciones globales (IgG2a/IgGl de 1,81 y 2,34 respectivamente). Por el contrario, el grupo de ratones inmunizados con LSA (Ensayo II) proporcionó la mayor cantidad de IgG1 específica. Esto es coherente con los resultados en los tamaños de las lesiones y en la carga parasitaria de este grupo de ratones, lo que indica que LSA induce preferentemente una respuesta de tipo Th2 antes de la exposición (53).

Con respecto a la respuesta inmune celular, todos los grupos de animales inmunizados con VVp36 o VVp36IL12 produjeron grandes cantidades de IFN-\gamma en comparación con los niveles de IL-10. Considerando las relaciones de IFN-\gamma/IL-10 (Tabla 1), sólo los animales inmunizados con VVp36IL12 desarrollaron niveles elevados significativos (p<0,01) en comparación con los grupos de control, lo que indica una activación específica de una respuesta de tipo Th1 en estos animales. Claramente, los protocolos que incluyeron VVp36IL12 como vector inmunizante desencadenaron una respuesta Th1 definida por altas cantidades de IgG2a específica e IFN-\gamma.

En general, después de la estimulación específica in vitro de células de bazo antes de la exposición al parásito, los ratones inmunizados inicialmente con P36 seguido de VVp36IL12 produjeron las mayores cantidades de IFN-\gamma y las menores cantidades de IL-10. Significativamente, una inmunización doble con VVp36IL12 (Ensayo II) produjo una alta producción de IFN-\gamma, pero también una alta producción de IL-10 después de la exposición, lo que podría explicar por qué este protocolo no pudo mejorar los resultados de protección obtenidos con una sola inmunización con VVp36IL12. De forma coherente, la mayor relación IFN-\gamma/IL-10 antes de la exposición al parásito se obtuvo después de la inmunización con protocolos de inmunización que contenían VVp36IL12.

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3.2 Respuestas inmunes humorales y celulares después de la exposición a L. major

Debido a que las consecuencias de la enfermedad pueden determinarse por el grado de activación del sistema inmune, tiene interés la caracterización de los cambios de relaciones de inmunoglobulinas y citocinas después de la exposición de los animales previamente inmunizados con VVr. Así pues, 7 semanas después de la exposición a los promastigotes, los ratones se sacrificaron, se obtuvieron los bazos y sueros de cada grupo y se evaluó la producción de IgG específicas, IFN-\gamma e IL-10 (Tabla 2).

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TABLA 2 Producción específica de IgG1, IgG2a, IFN-\gamma e IL-10 tras la exposición a L. major

4

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5

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6

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7

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^{a} IgG2a/IgG1 representa la relación de las absorbancias a 492 nm de anticuerpos específicos de cada grupo de inmunización diluidos 1:100, tal como se determina por un ELISA indirecto. Cada valor representa la media de dos determinaciones independientes \pm SD para las muestras reunidas (Ensayo I, n=4, Ensayo II, n= 6; Ensayo III, n=8; Ensayo IV, n = 10). Los sueros se recogieron 7 semanas después de la exposición al parásito.

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El análisis de los niveles de IgG específicas (isotipos 1 y 2a) reveló que se obtienen elevadas relaciones significativas (p<0,05) en el grupo de ratones inmunizados con VVp36IL12. Asimismo, se obtuvieron las mayores relaciones IgG2a/IgG1 después de la inmunización con VVp36IL12 (Ensayo II: 1,66, 1,39: Ensayo III: 2,62 y Ensayo IV: 1,45). Considerados conjuntamente, estos resultados revelaron una correlación inversa entre las relaciones IgG2a/IgG1 específicas de P36 y el tamaño de las lesiones (r=-0,63, p<0,01), así como entre las cargas parasitarias e IgG2a específica (r=-0,56, p<0,01), lo que confirma que el modelo animal se comportaba como se ha descrito previamente (7, 10, 11).

De forma coherente con los resultados obtenidos a partir de las muestras ensayadas antes de la exposición al parásito, la inmunización doble con VVp36IL12 reveló altos niveles de citocinas de tipo Th1 y Th2 (seis veces más IL-10 que una sola dosis con VVp36IL12; Ensayo II). Estos datos podrían explicar, en parte, las diferencias de protección observadas (25% frente a 47% de reducción de la lesión). Considerando todos los datos de los tres ensayos (II, III y IV), los ratones inmunizados con VVp36IL12 proporcionan significativamente (p<0,01) las mayores relaciones IFN-\gamma/IL-10 en comparación con los grupos de control. Los protocolos basados en VVp36 también proporcionan relaciones elevadas, pero no alcanzan diferencias estadísticamente significativas en comparación con los grupos control. Resulta interesante el hecho de que se encontraran repetidamente niveles elevados de producción de las citocinas estudiadas en ratones de los grupos de control con VV (VVenvIL12) a las 7 semanas posteriores a la exposición al parásito. Esto podría deberse a una producción no específica de citocinas después de la exposición al parásito, ya que también se encontraron niveles elevados en los controles negativos (esplenocitos del mismo grupo de ratones cultivados en ausencia de estímulo, datos no mostrados).

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Ejemplo 4 Construcción de virus Vaccinia recombinantes

Para estudiar la viabilidad de la protección de perros susceptibles contra la infección causada por Leishmania, se generó un VVr que expresa el antígeno P36 de L. infantum (VVp36) de la misma manera que la descrita en el Ejemplo 1 de esta invención.

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4.1 Construcción del vector pRSET-B

Por otro lado, el plásmido pRSET-B (pCI-neo/p36/LACK) se construyó a partir del plásmido pCI-neo de Promega® mediante la inserción la secuencia que codifica la proteína p36 de L. infantum en dicho plásmido con la enzima de restricción EcoRI en 5' y SmaI en 3'.

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4.2 Análisis Western de expresión de proteínas

Para comprobar la expresión de la proteína recombinante del VVr generado, P36 en células BCS-40 infectadas con VVp36 se realizó un análisis de transferencia Western. Brevemente, se infectaron células BSC-40 (5 unidades formadoras de placa (ufp)/célula) con VVp36 y a las 24 horas post infección, los extractos celulares se fraccionaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) en condiciones reductoras, se transfirieron a papel de nitrocelulosa y se hicieron reaccionar con anticuerpos policlonales de conejo anti-P36 (R\alphaP36). Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la expresión correcta de P36 de L. Infantum ya que VVp36 sintetizó un producto con reactividad frente a un anticuerpo específico para P36 (datos no mostrados).

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Ejemplo 5 Ensayo de p36/LACK como vacuna frente a la leishmaniasis inducida por L. infantum en perros

Después de comprobar la expresión correcta de P36 de L. infantum en el VVr generado (VVp36) y por el plásmido pCI-neo/p36/LACK se realizó un experimento de vacunación para establecer si la inmunización con pCI-neo/36/LACK y VVp36 inducían protección. Los perros de los grupos de protección fueron inmunizados con dos dosis, bien con el plásmido pRSET-B (400\mug en total) en dos dosis separadas por un intervalo de dos semanas (grupo P+P), bien con una dosis de plásmido pRSET-B (200\mug) y otra dosis de VVp36 (10^{8} pfu) a las dos semanas (grupo P+V) (Tabla I). Los perros se dividieron en cuatro grupos de cinco perros cada uno. Los grupos se designaron respectivamente como:

Control negativo: Sin tratamiento de protección previo ni inoculación con el parásito.

Control positivo: Sin tratamiento de protección previo e inoculados con el parásito.

Grupo P+P: Inmunizados con el plásmido pCl-neo/p36/LACK (pCl-neo de Promega) que contiene la secuencia codificante completa para el antígeno p36/LACK de L. infantum. Se administraron dos dosis de 100 \mug en un periodo de 15 días en solución salina por vía subcutánea.

Grupo P+V: Inmunizados con una dosis inicial de 100 \mug del mismo vector pC1-neo/p36/LACK por vía subcutánea y una segunda dosis 15 días después con el virus vaccinia (cepa WR, atenuado) que contiene una copia completa del gen que codifica para p36/LACK (VVp36). Se suministraron 10^{7} pfu en solución salina por vía subcutánea.

Inmediatamente después se procedió a la infección experimental con 10^{8} promastigotes de L. infantum (MHOM/
FR/78/LEM-75) por vía intravenosa a los dos semanas del tratamiento de protección con los vehículos recombinantes (día cero) a la vez que se infectaba a los grupos control (día 0 del experimento).

Los perros fueron analizados previamente en sus constantes hematológicas, se les siguió diariamente en su estado físico, peso, ingesta de comida y condiciones generales. Con objeto de conocer el tipo de respuesta inmune que se estaba produciendo en los animales se extrajeron, cada quince días, muestras de sangre periférica heparinizada desde el día cero hasta el ciento veintinueve. A partir de estas muestras se obtuvieron células mononucleares (PMBC) mediante centrifugación en gradiente de Ficoll (Histopaque®, Sigma). Se obtenía así mismo una muestra de plasma.

Se extrajo el ARN total usando Trizol® de acuerdo con las instrucciones del fabricante: En cada experimento de forma paralela, como control interno, se detectaron los niveles de Gliceraldehido deshidrogenasa (GAPDH). Se utilizó la técnica de RT-PCR para detectar los niveles de ARNm de las interleucinas IL4 e IFN\gamma, relacionados con la proliferación de las subpoblaciones Th2 y Th1 respectivamente.

Las muestras obtenidas se corrieron en geles de agarosa (2,0%) y la intensidad de las bandas se analizó mediante el programa Scion Image para PC, National Institutes of Health, USA. Las determinaciones se hicieron siempre por duplicado y cada punto de determinación en las gráficas es la media de cinco determinaciones (una por cada animal de grupo). En las muestras de plasma correspondientes se determinó la presencia de anticuerpos específicos anti p36/LACK y su clase: IgG2 (correspondiente a la proliferación de la subpoblación Th1 de linfocitos (CD4+) e IgG1 (correspondiente a la subpoblación Th2). Los anticuerpos específicos se determinaron mediante la técnica de ELISA usando placas de 96 pocillos (Maxisorp®, Nunc) la lectura se realizo con el programa Fluostar Galaxy-BMG-Labtechnologies. En cada caso los valores (en unidades arbitrarias) representan la media de los valores referidos a su control interno.

Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 6 y 7 y en la Tabla 3. La Tabla 3 muestra los datos clínicos de la enfermedad en los perros, así como los datos para la positivización serológica y el aislamiento del parásito en aquellos perros clínicamente enfermos. Se consideraron cuatro signos clínicos que normalmente definen la enfermedad clínica: Presencia de linfadenopatías (L), atrofia muscular (AM), palidez de las membranas mucosas (PM) y lesiones cutáneas (LP). Como puede observarse, el grupo control negativo (not vacunados no infectados) es negativo en el 100% de los casos que no muestran señales clínicas ni ningún tipo de prueba serológicamente positiva. El grupo de control positivo (infectados, no vacunados) muestra la presencia de signos clínicos de la enfermedad en el 100% de los casos. La positivización de las pruebas serológicas también es del 100% y el parásito ha podido asilarse en el 60% de los casos. La positivización serológica fue secuencial en todo los casos, siendo el método DAT de aglutinación de antígenos de Leishmania (72) el más fiable sin falsos positivos y una progresión secuencial de los títulos de anti-suero con la progresión de la infección. El grupo vacunado con dos dosis del gen p36 en un plásmido recombinante pRSET-B antes de la infección experimental muestra la presencia de signos clínicos de la enfermedad en todos los casos (alguno de ellos con solo uno de los cuatro considerados como que definen la enfermedad). Los ensayos serológicos fueron positivos casi en todos los casos y el parásito se recuperó en casi todos los perros que muestran síntomas clínicos. El grupo vacunado con dos dosis del gen p36, uno el plásmido pREST-B (P) y otro en el VVp36 (V) antes de la infección, indujeron protección contra la infección en al menos el 60% de los casos (un perro tuvo solo un síntoma clínico y no serología positiva pero, aunque es ima linfoadenopatía que pudo deberse a otra razón no específica, se ha mostrado positivo). Sólo uno de los perros mostró signos clínicos de la enfermedad, con serología positiva, siendo posible aislar el parásito a partir de él.

TABLA 3 Resultados observados en el mes 18 del ensayo correspondiente al mes 15 post-infección

8

*: valores a partir de 1/800 se consideraron positivos.

**: Signos clínicos: L: linfoadenopatía; AM: atrofia muscular; PM: palidez de membranas mucosas; LP: lesiones cutáneas.

***: Detección de anticuerpos frente a los antígenos de superficie de Leishmania.

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5.1.- Producción de IL4 e IFN\gamma por las células de sangre periférica

Como puede verse, la expresión de las citocinas consideradas muestra una variación a lo largo del tiempo del experimento, fundamentalmente debida a la variabilidad de la respuesta individual. En cualquier caso, se pueden concluir varias tendencias en la expresión de las mismas. Así, la interleucina 4 (IL4) muestra unos valores medios elevados en el grupo control positivo (animales sin protección con leishmanisis canina inducida experimentalmente). Estos valores permanecen altos a lo largo de todo el experimento (hasta el día 113) y por encima de los determinados para interferón gamma(IFN gamma) que presenta solo dos elevaciones puntuales. Esto sugiere un predominio de la subpoblación Th2 sobre la Th1 en estos perros que muestran la enfermedad establecida en todos los casos. El grupo vacunado con un plásmido conteniendo el gen p36/LACK y el virus VVp36 conteniendo el mismo gen muestra una subida más rápida de los valores de interferón gamma (IFN gamma) que de los de interleucina 4 (IL4) en las primeras semanas después de la inmunización coincidiendo con la inoculación del parásito. Esto indicaría un predominio de la subpoblación Th1 sobre la Th2 en este grupo de perros que ha mostrado un elevado grado de protección frente a la enfermedad (véase Tabla 3).

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5.2.- Determinación de anticuerpos específicos anti p36/LACK en el suero de los perros

La Figura 7 muestra la relación entre los anticuerpos específicos anti p36/LACK en los grupos de perros a lo largo del experimento. Es clara la existencia de una respuesta humoral con anticuerpos específicos anti p36 en los grupos de perros que han sido vacunados que no se presenta en los grupos control (sin vacunación). La respuesta, con presencia de anticuerpos específicos anti p36/LACK, aparece durante los primeros 75 días del experimento y además puede verse el predominio de la producción de IgG2 sobre IgG1 que indica un predominio en la respuesta celular de Th1 sobre Th2. Esto concuerda con los datos anteriores de las citocinas. Es interesante resaltar que los grupos correspondientes a los controles tanto negativo como positivo esto no ocurre, mostrando un equilibrio entre los niveles detectados de los anticuerpos IgG1 e IgG2. Estos resultados indican que en los grupos de perros vacunados se ha producido una respuesta específica de anticuerpos frente a la proteína codificada por el gen introducido en vehículos recombinantes. El tipo de respuesta indica que el tipo de células CD4+ que ha proliferado ha sido el Th1

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5.3.- Ensayo de protección frente a la infección por Leishmania infantum

Además de los estudios de la producción de interleucinas y de anticuerpos específicos para conocer factores que reflejan el tipo de respuesta inmune, se ha llevado a cabo el estudio de la evolución de la infección y la enfermedad en los grupos de perros objeto del estudio. Se ha medido la presencia de anticuerpos frente a antígenos de Leishmania, DAT, mediante aglutinación directa, utilizado habitualmente como método de diagnóstico. Se ha utilizado como comprobación otro test específico (kit de Operón S.A.) que mide la existencia de anticuerpos anti superficie de Leishmania. Se ha medido la evolución clínica de los perros a lo largo del periodo utilizando cuatro criterios clínicos universalmente aceptados: La existencia o no de linfoadenopatías, la atrofia muscular, la palidez de las mucosas y la existencia de lesiones en la piel. Así mismo, se ha intentado el aislamiento del parásito en medio NNN a partir de ganglios de los perros con serología y clínica positivas.

El experimento se dio por concluido en el décimo octavo mes después de la infección en el momento en que todos los perros del grupo de control positivo presentaron signos clínicos de la enfermedad y serología positiva.

En ese momento el grupo control positivo mostró un 100% de los perros con serología positiva y clínica de la enfermedad. El grupo de control negativo dio un 100% de los perros sin ningún signo de enfermedad y con la serología negativa. De los dos grupos vacunados, el grupo de las dos dosis de la vacuna en un vehículo plasmídico presentaron serología positiva y signos clínicos variables de la enfermedad.

El grupo vacunado con dos dosis del gen codificante para p36/LACK, una con el plásmido pCl-neo y la segunda con el gen introducido en un virus vaccinia-WR recombinante muestra resultados negativos en los métodos de diagnóstico en el 80% de los casos y ausencia de signos clínicos en al menos el 60% de los casos (existe en un caso la presencia de linfoadenopatías).

Parece pues que los perros del grupo P+V, esto es, vacunados con una dosis del gen en el plásmido pCl-neo/p36/
LACK y la segunda con el gen en un virus vaccinia-WR/p36/LACK presentan una protección frente a la infección experimental de al menos el 60% con respecto a los controles positivos que mostraron la infección y signos clínicos claros en el 100% de los casos.

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Discusión

Durante una infección natural, la mosca Phlebotomus, mediante una picadura, transfiere a través de la piel promastigotes al hospedador vertebrado. Dentro de los macrófagos, los promastigotes se transforman muy rápidamente en organismos densos y redondeados (amastigotes) que permanecen en el hospedador a lo largo de toda la vida del parásito. El control de la infección requiere la activación dependiente de células T de los macrófagos para conseguir un estado antiparasitario que pueda detener la infección. Los estudios realizados con ratones en los que se han eliminado ciertos genes (54, 55) y otros procedimientos inmunológicos han definido requisitos para las moléculas del complejo de histocompatibilidad mayoritario (MHC) de clase II y células T CD4^{+} (56), así como la citocina efectora IFN-\gamma (44), la citocina mediadora de Th1 IL-12 (16) y la enzima microbicida de macrófagos, óxido nítrico sintasa de tipo 2 (NOS2), en el control de la infección (57, 58). En este escenario, la presentación de epítopos derivados de parásitos en moléculas del MHC clase II a las células T CD4^{+} inducirá una diferenciación a una célula de tipo Th1 con la producción de IFN-\gamma y su aumento por IL-12. A su vez, la producción de IFN-\gamma ocasiona la inducción de la NOS2 de los macrófagos y la represión de la infección parasitaria (59, 60).

Los ratones Balb/c proporcionan un sistema modélico para estudiar la infección por Leishmania, ya que mantienen la infección, conduciendo ésta finalmente a la muerte. Las lesiones y la serie de infecciones producidas en ratones susceptibles con L. major son bastantes similares a las producidas en los seres humanos (5). Por lo tanto, L. major es un modelo muy bueno para ensayos de vacunación. Se ha demostrado que montando un tipo de respuesta inmune Th1 sólida, puede conseguirse protección en el modelo de ratón y que la infección se correlaciona con la respuesta de células T CD4^{+} aberrantes. Este estado inmune del ratón podría imitar lo que ocurre en el hospedador humano y probablemente en perros. Las formas convencionales de crear vacunas contra enfermedades parasitarias han sido insatisfactorias en su mayor parte. Ahora es evidente que los medios inmunológicos en los que se inicia la respuesta inmune probablemente son más importantes que el antígeno usado (61). Se ha demostrado que la inmunización con algunos antígenos definidos (gp63 soluble de L. major o LSA soluble de L. major) podría tener algún efecto protector sólo cuando estas proteínas se administraban junto con IL-12 (62).

En un esfuerzo por dirigir la respuesta inmune al tipo Th1 y conseguir protección contra la leishmaniasis, se han comparado varias estrategias de inmunización en ratones Balb/c usando como inmunógeno el antígeno LACK del parásito (proteína P36) y como vector de liberación al VV. Se han generado unos virus recombinantes que expresan sólo P36 (VVp36) o que co-expresan P36 e IL-12 (VVp36IL12) y se han ensayado en ratones en relación con su capacidad de provocar una respuesta inmune protectora después de la exposición a promastigotes. Los inventores han descubierto que aunque los ratones inmunizados con VVp36 desarrollan una protección significativa contra el parásito, la inmunización con VVp36IL12 induce mayores niveles de protección. Entre los diferentes protocolos analizados, el mejor protocolo proporcionó una reducción media de aproximadamente un 52% en el tamaño de la lesión y una reducción de aproximadamente un 99% en la carga parasitaria, cuando los animales recibieron una dosis inicial de la proteína P36 purificada, soluble, de L. infantum, seguida de un refuerzo con VVp36IL12. En otro protocolo de inmunización se obtuvo un 47% de protección cuando la dosis inicial era de VVp36IL12 y era seguida por un refuerzo con dicha proteína P36 purificada, pero con este protocolo (VVp36IL12 + P36) se obtuvieron menores respuestas inmunológicas de tipo Th1 que la combinación inversa (P36 + VVp36IL12). La expresión de IL-12 resultó importante para conseguir mayores niveles de protección, ya que los otros protocolos que implicaban la administración inicial de P36 soluble y el refuerzo con VVp36 fueron menos eficaces en la protección que cuando IL-12 se co-expresaba con el antígeno. En general, se ha observado constantemente la mayor reducción del tamaño de la lesión y de la carga parasitaria cuando los animales se reforzaron con VVp36IL12. Los inventores, interesantemente, no apreciaron ningún efecto protector cuando la citocina IL-12 se administraba de forma inespecífica dos veces (inmunizaciones con VVenvIL12). Sin embargo, otros autores han descrito que con la administración simple de IL-12 suministrada por un adenovirus recombinante a ratones susceptibles, es posible proteger a los animales de la leishmaniasis fatal (63). Aunque no desean estar vinculados por ninguna teoría o hipótesis, los inventores creen que este efecto beneficioso se debe al momento de administración de la citocina, administrada en el mismo día de la infección con L. major. Sin embargo, en los ensayos realizados en relación con esta invención, la IL-12 se administró 5 y/o 3 semanas antes de la exposición al parásito, no observándose ningún efecto protector.

Debe destacarse que la inmunización con VV vivos no exacerba el curso de la infección con L. major, ya que el grupo de animales que recibió VVenvIL12 desarrolló un nivel de infección similar o ligeramente menor que el grupo de animales que no se inmunizó (grupo de control de PBS).

Los inventores han descrito previamente (37) que la IL-12 expresada a partir de VVr actúa sobre la eliminación del virus dentro del hospedador. Ésta es una observación importante, ya que indica que la eliminación del vector no interfiere con la capacidad del inmunógeno para inducir una respuesta inmune potente contra el antígeno recombinante. Además, el uso de un VVr vivo que se elimina es deseable para solucionar los problemas de la multiplicación de virus con la activación posterior de respuestas inmunes específicas contra el vector.

Para comprender mejor la correlación de la protección conferida con las respuestas inmunes, se han caracterizado las respuestas inmunes celulares y humorales antes y después de la exposición a promastigotes, midiendo las relaciones de IgG2a/IgG1 e IFN-\gamma/IL-10. Usando estos parámetros, se ha podido demostrar que la protección estaba correlacionada con la activación de una respuesta inmune de tipo Th1. Los animales mejor protegidos en este estudio (con menores tamaños de las lesiones y menores cargas parasitarias) fueron los animales que mostraron los menores niveles de IL-10 e IgG1 específica, mientras que mantenían los mayores niveles de IFN-\gamma e IgG2a específica (véanse las Tablas 1 y 2). Esto está de acuerdo con las observaciones realizadas por otros grupos de que se necesita un tipo de respuesta inmune Th1 para controlar la infección por Leishmania (10, 11). Así pues, la combinación de la dosificación inicial con P36 y el refuerzo con VVp36IL12 es un protocolo de inmunización eficaz contra Leishmania.

Como es conocido, la presentación de proteínas purificadas al sistema inmune desencadena preferentemente una respuesta Th2. Además, se ha demostrado que los animales inmunizados con la proteína P36 de L. major más IL-12 soluble no podían mantener células CD8^{+} productoras de IFN-\gamma durante dos semanas, mientras que en los animales inmunizados con ADN que expresaban el mismo antígeno podían detectarse células T CD8^{+} específicas hasta 12 semanas después de la vacunación. Estos estudios concluyeron que los antígenos proteicos administrados junto con IL-12 sólo son eficaces en la generación de una inmunidad protectora a corto plazo. Para evocar un efecto protector más duradero se necesita el uso de otros vectores (64). A la vista de estos descubrimientos, se cree que después de la dosificación inicial de P36 hay una activación de las subseries de células T CD4^{+} y CD8^{+}, pero que tras el refuerzo con VVp36IL12 hay una expansión de células T CD8^{+} preparadas que reconocen las células diana infectadas con el parásito. Aunque el número de células T CD8^{+} activadas por dicho protocolo de inmunización no puede determinarse en ausencia de epítopos de P36 de células T CD8^{+} conocidas, por comparación con el modelo de malaria murina en el que se ha caracterizado minuciosamente un epítopo bien definido de la proteína CS (65, 66), parece claro que tienen que activarse números significativos de células T CD8^{+} específicas de memoria y efectoras para destruir las células presentadoras de antígenos de Leishmania. Además, la contribución de la expresión de NOS inducida por IFN-\gamma en los macrófagos a su vez inhibirá la replicación de los parásitos. Considerando que el inóculo usado en estos estudios es bastante grande, de 500.000 promastigotes (Ensayos II-IV), mientras que en la infección natural con una sola picadura de mosquito se liberan algunos cientos de promastigotes (5), el hecho de que el protocolo de inmunización proporcionado por esta invención reduzca la carga parasitaria en aproximadamente un 99% sugiere que la infección por la picadura de un mosquito no se realizará en un hospedador con los parámetros inmunes mostrados en los animales vacunados de esta descripción. Debido a las limitaciones técnicas del ensayo usado en el desarrollo de esta invención, que requiere altas dosis de parásitos para evaluar la infección, los inventores no pueden garantizar que dicho protocolo de inmunización elimine completamente la infección en los animales inmunizados, pero probablemente reducirá la gravedad y la progresión de la enfermedad, es decir, producirá, al menos, una inmunidad parcial al animal inmunizado.

En otros modelos de patógenos de animales, se ha demostrado que VVr administrado en una dosis de refuerzo aumenta la respuesta inmune celular específica contra la proteína env de HIV (39), el epítopo CS de Plasmodium yoelii (66) o el epítopo CS de Plasmodium berghei (67). Se ha demostrado que el procedimiento de dosis inicial-refuerzo puede mejorar la eficacia de la respuesta inducida especialmente cuando se emplean diferentes vectores (66-69). El protocolo de dosis inicial/refuerzo fue el más eficaz cuando VVr se suministró en la dosis de refuerzo, mientras que para la dosis inicial pudieron usarse independientemente diferentes vectores (66, 67). También se ha demostrado que el refuerzo con un MVA muy atenuado aumenta en gran medida el nivel de células T CD8^{+} específicas para HIV-1 en una combinación de dosis inicial/refuerzo de vectores, asegurando la seguridad del procedimiento de inmunización (70).

En el modelo murino de Leishmania, se ha obtenido una protección significativa contra la infección por L. major cuando a los animales se les administró P36 purificada seguida por un refuerzo con un VVr que co-expresaba P36 y IL-12 (VVp36IL12). Este efecto protector indica que la citocina proporciona un medio para mejorar la respuesta inmune específica a P36 de Leishmania. La relevancia del protocolo de inmunización proporcionado por esta invención se realza por una combinación de dosis inicial-refuerzo de gp120 de la subunidad de HIV-1 y el poxvirus canario recombinante que se evalúa en ensayos humanos de Fase 1/2 contra HIV-1 (71). En el presente sistema, la atenuación del vector viral se garantiza por la expresión de la citocina IL-12, ya que se ha demostrado previamente que la expresión de IL-12 de VVr atenúa el vector y permite una respuesta inmune celular significativa contra un antígeno como env de HIV-1 (37).

En conclusión, el VVp36IL12, y el protocolo de inmunización proporcionado por esta invención, que comprende el empleo de dicha VVr, induce una respuesta inmune de tipo Th1 en ratones que produce protección contra la leishmaniasis. Este protocolo, en combinación con otros antígenos de Leishmania, podría tener una mayor aplicabilidad para controlar ésta y otras enfermedades parasitarias. El empleo de VV muy atenuados, por ejemplo, MVA, asegurará la seguridad en los seres humanos.

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Depósito de microorganismos

Un cultivo de la bacteria derivada de Escherichia coli, portadora de un plásmido que contiene el gen que codifica la proteína P36 de L. infantum, identificado como tCI-neo-36, ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot, Valencia, España, el 5 de octubre de 2000, correspondiéndole el número de depósito CECT 5351.

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Claims

1. Una vacuna que comprende un sistema de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de Leishmania infantum y una secuencia de ADN que codifica un compuesto co-estimulador capaz de estimular la producción de una respuesta inmune celular de tipo Th1, en la que dicho compuesto co-estimulador es interleucina 12 (IL-12), para su uso en la protección de animales de una infección producida por Leishmania sp., en donde la vacuna es administrada mediante un protocolo de inmunización animal que comprende una inmunización inicial con una proteína P36 de L. infantum en forma soluble, seguida de inmunización con una dosis de refuerzo, en donde dicha dosis de refuerzo comprende dicho sistema de expresión.

2. Vacuna según la reivindicación 2, en donde dicho sistema de expresión es un plásmido o un virus Vaccinia.

3. Una vacuna que comprende un sistema de expresión seleccionado del grupo que consiste en un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de Leishmania infantum y un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum, para su uso en la protección de animales de la infección producida por L. infantum, en la que la vacuna es administrada mediante un protocolo de inmunización animal que comprende una inmunización inicial y una dosis de refuerzo, en donde la inmunización inicial se lleva a cabo con dicho plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína P36 de L. infantum y la dosis de inmunización de refuerzo se lleva a cabo con un virus Vaccinia recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína L36 de L. infantum.