[go: up one dir, main page]

WO2007080274A1 - Test des caracterisations des anticorps - Google Patents

Test des caracterisations des anticorps Download PDF

Info

Publication number
WO2007080274A1
WO2007080274A1 PCT/FR2006/002744 FR2006002744W WO2007080274A1 WO 2007080274 A1 WO2007080274 A1 WO 2007080274A1 FR 2006002744 W FR2006002744 W FR 2006002744W WO 2007080274 A1 WO2007080274 A1 WO 2007080274A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
antibodies
antibody
receptor
measuring
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2006/002744
Other languages
English (en)
Inventor
Frédéric Dhainaut
Jean-Luc Teillaud
Laurent Siret
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB Biotechnologies SAS
LFB SA
Original Assignee
LFB Biotechnologies SAS
LFB SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LFB Biotechnologies SAS, LFB SA filed Critical LFB Biotechnologies SAS
Priority to JP2008545044A priority Critical patent/JP2009519455A/ja
Priority to US12/097,084 priority patent/US20090176220A1/en
Priority to CA002633321A priority patent/CA2633321A1/fr
Priority to BRPI0621019A priority patent/BRPI0621019A2/pt
Priority to EP06841947A priority patent/EP1977251A1/fr
Priority to AU2006334549A priority patent/AU2006334549A1/en
Publication of WO2007080274A1 publication Critical patent/WO2007080274A1/fr
Priority to IL192141A priority patent/IL192141A0/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the ability of an antibody preparation to activate an Fc receptor, which method comprises the following steps: a) aggregation of said antibodies with each other, b) contacting cells expressing an Fc receptor with said aggregated antibodies, and c) measuring the reaction of the cells resulting from activation of the Fc receptor of said cells by the Fc region of said antibodies.
  • antibodies are also tools of choice in diagnosis and therapy, where they are an alternative to conventional treatments.
  • the Applicant in document FR 02 11416, describes a method for measuring the functional activity of an antibody.
  • the method comprises contacting cells expressing the CD16 receptor in a reaction medium, in the presence of the antibody and the antigen of said antibody, and measuring the amount of at least one cytokine produced by the expressing cell. the CD16 receptor, this measurement reflecting the activation of the effector cell of the immune system by the antibody.
  • this method makes it possible to evaluate the activation of effector cells by the antigen-antibody complex.
  • activation of the effector cells is both dependent on the affinity of the antibody for its target and the ability of the Fc region to bind to the Fc receptor. This test does not therefore make it possible to evaluate the activation of the effector cells due to the single Fc region of the antibody.
  • the document EP 1 298 219 proposes a method for measuring the functionality of the Fc region of an antibody, without this being influenced by the binding capacity of the Fab region of the antibody.
  • This method consists in immobilizing the antibody to be tested, placing it in the presence of effector cells expressing Fc receptors, and measuring the reaction in the effector cell resulting from the activation of the effector cell by the Fc region of the antibody. .
  • the antibodies are immobilized by coating on a plate or on beads.
  • the number of antibodies thus immobilized is not controllable because it depends both on the good binding of the antibodies on the plate, their orientation on the plate or the beads, and the electrical charge of the antibody. .
  • the electric charge of antibodies depends on their degree of amination, which affects their ability to immobilize on balls or plates.
  • this parameter induces a variability of the test as a function of the antibody to be tested, and the functionality of the Fc region of two antibodies of different sequence and / or specificity can thus hardly be compared.
  • the test is carried out using a human monocyte line (THP-I) which must be activated by interferon Y to express, on the surface, consistently the Fc ⁇ RIIIa receptor. This prior activation is an important source of variability of the test and therefore the experiments can hardly be compared with each other.
  • THP-I human monocyte line
  • the methods of the state of the art offering to discriminate the antibodies for their "efficacy” are either poorly adapted to an evaluation of the activation of the effector cells due to the Fc region of the antibody, or are not very reproducible, and therefore not easy to standardize. That is why it was the intention of the Applicant to develop a new method, to measure the ability of an antibody preparation to activate an Fc receptor, which is both reproducible, and allows to to specifically evaluate the ability of the Fc region of an antibody to activate an Fc 7 receptor without the characteristics of the Fab region of the antibody interfering in this evaluation.
  • a first object of the invention relates to a method for measuring the ability of an antibody preparation to activate an Fc receptor, comprising the following steps: a) the aggregation of said antibodies with each other, b) the setting contacting cells expressing an Fc receptor with said aggregated antibodies, and c) measuring the reaction of the cells resulting from activation of the Fc receptor of said cells by the Fc region of said antibodies.
  • the term "aggregation of antibodies between them” means the association between them dispersed antibodies in the solution containing them, to form a network expressing a strong coupling between the antibodies of the network.
  • This aggregation of the antibodies serves to orient the antibodies in a controlled and homogeneous manner, in the direction adapted to an adequate presentation of the Fc region of all the antibodies or a large majority of them to the Fc receptor of the cells. effector expressing an Fc receptor. Indeed, the Applicant has surprisingly found that such an aggregation has the effect that the Fc regions of certain antibodies are oriented from particular way and whatever the specificity or the primary sequence of the antibodies studied.
  • the method according to the invention has the advantage of allowing the study of the dose-response relationship between the amount of antibody used in the process and the activation of the effector cell, and of being reproducible.
  • the Applicant has surprisingly found that a "Such a method enables an activation of effector cells via Fc receptors, without the presence of target antigen.
  • the Fc receptors are capable, in vivo, of binding to the constant region of the antibodies once the latter have fixed, by their variable region, the target antigen.
  • the absence of cells expressing the target antigen on the surface has the major advantage of being free from the presence of these cells, a source of variability in biological tests, and thus of reducing the parameters likely to induce a variability in the implementation of the method.
  • the biological variability due to the presence, in the methods of the prior art, of target cells, as well as to the influence of the specificity and the primary sequence of the antibody is limited or even nil in the process. of the invention.
  • the antibodies can be aggregated using any means known to those skilled in the art for aggregating antibodies, such as heat or immunological tools, for example whole immunoglobulin G, this list is not being limiting.
  • the method according to the invention has the advantage of being implemented with antibodies in solution.
  • Fc receptor means any receptor of the Fc region of the antibodies, present on effector cells, such as CD16 (FcgammaRIIiy and CD32 (FcgammaRII).
  • the term "antibody” means any antibody, regardless of its specificity and its isotype, provided that it comprises an Fc region or a region having the same functions as the Fc region. Thus, it may be a whole antibody or an antibody fragment, for example an antibody Fc fragment.
  • the antibodies used in the method according to the invention may be IgG (IgG1 or IgG2 or IgG3 or IgG4), IgM, IgE, IgA or IgD, or a mixture of them.
  • the antibodies used in the process of the invention may be monoclonal and / or polyclonal. In the case of monoclonal antibodies, these antibodies can be chimeric, humanized, human or of animal origin.
  • the term "cell expressing an Fc receptor” means any cell expressing on its surface an Fc receptor, this cell being able to express such a receptor in a natural manner or following a genetic modification.
  • NK cells activated monocytes, peripheral blood granulocytes, macrophages, neutrophils, CD8 lymphocytes, T ⁇ lymphocytes, NKT cells, eosinophils, basophils or mast cells. list not being limiting.
  • these cells are capable of reacting when the Fc region of an antibody binds to the Fc receptor expressed on their surface.
  • reaction of cells expressing an Fc receptor means any measurable cellular reaction due to the interaction between the Fc receptor of these cells and the Fc region of the antibodies. This reaction may be intracellular or extracellular. As an example, we can mention measuring one or more cytokines, measuring the level of intracellular calcium, perforin, granzyme or nitric oxide, this list not being limiting.
  • the aggregation is carried out using an F (ab ') 2 anti-IgG fragment.
  • F (ab ') 2 anti-IgG fragment This means allows a particularly advantageous aggregation in terms of control of the orientation of the Fc regions of the antibodies.
  • each F (ab ') 2 fragment binds to two different antibodies to be tested, thus orienting the Fc regions of the antibodies to be adequately tested.
  • This orientation is particularly adapted to the interaction with the Fc receptors of the effector cells, and therefore to the activation of the effector cells.
  • the anti-IgG F (ab ') 2 fragments that can be used in this embodiment can be directed against any fragment, part or domain of the antibodies, for example the Fc region or the Fab region or the whole of the molecule. IgG.
  • the F (Ab ') 2 fragments may also be of monoclonal or polyclonal origin. In this embodiment of the invention, it is possible to precisely control the concentration of antibodies to be tested and the concentration of F (ab ') 2 . It is thus possible to calculate the ratio between the two which allows for reproducible tests and this regardless of the preparation of antibodies to be tested.
  • this anti-IgG F (ab ') 2 fragment is an anti-Fab or an anti-F (ab') 2 directed against the test antibody preparation.
  • This fragment can be a goat or rabbit fragment.
  • each F (ab ') 2 fragment binds to the Fab portions of two Antibody molecules to be tested, thereby directing the Fc regions of the antibodies to be appropriately tested so that they can bind to RFc and activate the cells expressing these RFc at the surface.
  • the aggregation is an aggregation by heat.
  • the antibodies are first heated so that they aggregate them (step a) of the process of the invention), ⁇ - and then contacted with cells expressing an Fc receptor (step b)).
  • Any heating method adapted to the aggregation of the antibodies between them can be used in the implementation of the method of the invention.
  • the aggregation is carried out by cross-linking Fab regions together or heavy and light chains between them.
  • cross-linking is understood to mean any bridging between two antibody molecules, so as to orient the Fc region of these antibodies homogeneously to the CD16 receptors of the effector cells.
  • an antibody may be involved in one or more bypasses.
  • the antibodies are capable of forming a network whose orientation is adequate to optimally bind the CD16 receptors carried by the effector cells.
  • any means for cross-linking (that is to say, to bridge) the antibodies between them is suitable for carrying out the invention.
  • the establishment of chemical bonds, or radiation bypass by means of UV this list is not limiting.
  • the Fc receptor expressed by the effector cells is selected from CD16
  • CDl ⁇ is chosen.
  • the cells expressing the Fc receptor • are cells transfected with the gene encoding said receptor.
  • another factor of variability namely the nature and the amount of Fc receptor (s) present on the surface of the effector cells.
  • the cells expressing the Fc receptor are Jurkat cells expressing CD1 ⁇ , this line being cultured in the presence of an aspecific activator of these cells, such as PMA. (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate).
  • PMA Phorbol 12-Myristate 13-Acetate.
  • this line does not need to be activated prior to contacting the effector cells with the aggregated antibodies. . Indeed, some effector lines need to be activated by means of one or more cytokines (s) to sufficiently express Fc receptors (see for example EP 1 298 219).
  • Jurkat CD16 line transfected with an expression vector coding for the CD16 receptor
  • Jurkat CD16 line has the advantage of being immortalized and therefore of multiplying indefinitely in culture media.
  • Jurkat CD16 cells have the advantage of being activatable when they are doubly stimulated.
  • PMA which is an aspecific activator of T cells
  • Activation of Jurkat cells results in release of IL-2 in the culture supernatant. Therefore, the more the Fc region of an antibody is functional to CD16, the higher the amount of IL-2 released in the supernatant will be.
  • the measurement of the reaction of the cells resulting from the activation of the Fc receptors of said cells by the Fc regions of said antibodies is a measure of the amount of at least one cytokine produced by the cells expressing CD16 receptors.
  • the activation of the effector cells results, inter alia, in the release of IL-2 in the culture supernatant.
  • the concentration of cytokines in the culture medium can be measured using a commercially available ELISA test (bioassay).
  • cytokine such as IL-2
  • the measurement of the quantity of at least one cytokine is carried out by performing an assay of the mRNAs of these cytokines, the quantity of these mRNAs being correlated with the level of expression of the corresponding cytokines, which reflects the level of activation of the effector cells.
  • At least one cytokine selected from IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- ⁇ , MCP-I, TNFalpha (TNF ⁇ ) and IFNgamma (IFN ⁇ ) is quantified. This list is not limiting.
  • the measurement of the reaction of the cell is the quantification of interleukin IL-2.
  • the rate of secreted IL-2 interleurkin is correlated with ADCC activity. Indeed, there is a strong correlation between the secretion of cytokines by the effector cells and the ADCC activity mediated by the CD16 of the effector cells (Document FR 02
  • the method of the invention is particularly advantageous for selecting cytotoxic antibodies, especially for a therapeutic use.
  • measuring the reaction of the cell is a measure of calcium influx, phosphorylation, transcription factors, or apoptosis.
  • the raise of these parameters are correlated with effector cell activation, showing the ability of antibodies to activate Fc receptors in effector cells.
  • the method is adapted to evaluate the ability of a cell to produce a monoclonal antibody capable of interacting with the CD16 receptor, i.e., to evaluate the cytotoxicity of an antibody or a preparation antibody.
  • the affinity of an antibody for CD16 is dependent on the characteristics of the Fc receptor, for example polymorphism of CD16 [2, 3], but also of the Fc region, or the fucose oligosaccharide present on the ace 'paragine in position 297 of the heavy chains of the immunoglobulins play a role in binding to Fc receptors [4, 5].
  • the cell line producing antibodies may be any line capable of dividing, but is more particularly chosen from CHO, YB2 / 0, SP2 / 0, SP2 / 0-AG14, IR983F cell lines, Namalwa human myeloma, PERC6, CHO lines, in particular CHO-KI, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293 -HEK, BHK , K6H6, NSO, SP2 / 0-Ag 14 and P3X63Ag8.653, this list not being limiting.
  • the method is adapted to evaluate the efficiency and integrity of the Fc region of antibody preparations obtained after one or more purification steps.
  • Another application of the method of the invention is the monitoring of the stability of a preparation of monoclonal or polyclonal antibodies, in particular therapeutic, placed in a denaturing condition.
  • the method of the invention is therefore particularly useful in the monitoring over time of preparations for therapeutic use. Indeed, the Applicant has followed for several months the activity of an antibody preparation stored under denaturing conditions and showed that it decreases. Thus, a therapeutic preparation loses its activity over time when it is kept at elevated temperature, for example at 40 ° C.
  • the method of the invention makes it possible to discriminate which part of the antibody is involved. in this loss of activity, unlike tests involving cells carrying the target antigens. We see that it is the Fc region of the antibody which, once denatured, loses its affinity for CD16 (see Example 4).
  • the method is advantageously adapted to measure the functionality of the Fc region of an antibody.
  • Fc region functionality of an antibody is meant for purposes of the invention the ability of this Fc region to activate the effector cells via its binding to the Fc receptor, in particular to the CD16 receptor. Since the method of the invention is highly reproducible (see Example 2, paragraph 5), it can be used routinely to analyze the functionality of antibody preparations, since the efficiency of the measurement is the same for sequence antibodies and of different specificity (s), as well as for the screening of highly cytotoxic antibodies.
  • the method is adapted to evaluate the production of monoclonal antibodies by transgenic plants or transgenic mammals.
  • the antibodies thus produced can be, thanks to the implementation of the method according to the invention, characterized as to the ability of their Fc region to activate an Fc receptor.
  • the method is adapted to select antibodies effective for therapeutic treatment.
  • antibodies for which an increase greater than 100%, or 250%, advantageously 500% or preferably 1000% of the cytokine release rate, for example of IL-2, are selected are compared with control in the absence of antibodies or against a given antibody as a negative reference.
  • the method is suitable for selecting antibody compositions whose fucose content is less than 65%, and preferably less than 40%. Indeed, it has been shown that the activity of the antibody preparations is dependent on the fucose content on the glycan unit at position 297 of the heavy chain.
  • the antibodies consist of heavy chains and light chains, linked together by disulfide bridges. Each chain is constituted, in the N-terminal position, of a variable region (or domain) specific for the antigen against which the antibody is directed, and in the C-terminal position, of a constant region, consisting of a single CL domain for light chains and several domains (CH 1 , CH 2 and CH 3) for heavy chains.
  • variable domains and the CH1 and CL domains of the heavy and light chains forms the Fab portions of the antibody, which are connected to the Fc region by a very flexible hinge region, allowing each Fab to bind to the target antigen.
  • the Fc region mediating the effector properties of the antibody, remains accessible to the molecules effector such as Fc ⁇ R receptors (FcgammaR).
  • the Fc region consisting of 2 globular domains CH 2 and CH 3 , is glycosylated at the CH 2 domain with the presence, on each of the 2 chains, of a biantennal N-glycan linked to asparagine 297 (Asn 297 ).
  • Such an N-glycan is in the following general form (presented form "GO", to which other sugars may be added):
  • fucose is understood to mean the fucose borne by these N-oligosaccharides.
  • the fucose molecule when present, is linked to the N-acetylglucosamine (GIcNAc) of the N-oligosaccharide, this GIcNAc being itself linked to the Asn 297.
  • GIcNAc N-acetylglucosamine
  • Each of the 2 N-glycans carried by each of the 2 heavy chains of each antibody can carry a molecule of fucose or not wear it.
  • each antibody may comprise 0, 1 or 2 fucose molecules, respectively, according to that none of its N-glycans carry fucose, that only one of its N-glycans carries a fucose molecule, or that its 2 N glycans each carry a molecule of fucose.
  • the term "antibody composition whose fucose content is less than 65%” means an antibody composition, of which, among all the glycan structures carried by each glycosylation site (Asn 297), antibodies of the composition, less than 65% comprise a molecule of fucose.
  • compositions exhibit a particularly advantageous ADCC activity.
  • antibody compositions whose fucose content is between 20% and 45%, or between 25% and 40%, are selected. Thanks to the method of the invention, a quantitative relationship has been shown between functional activity and fucose level in the direction of an increase in the functional activity of the antibodies towards CD16 when the fucose level decreases in the composition (preparation) of antibodies.
  • Another subject of the invention relates to a process for preparing a monoclonal antibody composition
  • a process for preparing a monoclonal antibody composition comprising the following steps: a) obtaining antibodies from a hybridoma, a heterohybridoma, or any cell line animal, plant or human transfected with one or more vectors so as to express said antibody, b) aggregation of the antibodies obtained in step a) with an F (ab ') 2 anti-IgG fragment, c) adding the antibodies obtained in step b) into a reaction mixture comprising: effector cells comprising cells expressing CD16, - Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) d) measuring the amount of at least one cytokine produced by the cell expressing CD16, e) selecting the antibody composition (s) for which an increase of greater than 0.5, 1, 2, 5, 10, 100, or 500 times the amount of cytokine measured is measured. related to control in the absence of antibodies or in the presence of a given antibody
  • the measurement of the amount of at least one cytokine is performed by performing an AKNm assay of these cytokines, the amount of these mRNAs being correlated with the level of expression of the corresponding cytokines, which reflects the level of activation of the effector cells.
  • At least one cytokine selected from IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-I, TNFalpha (TNF ⁇ ) and IFNgamma (IFN ⁇ ) is quantified. list not being limiting.
  • the measurement of the reaction of the cell is the quantification of interleukin IL-2.
  • the secreted rate of interleukins, for example of IL-2 is correlated with an activity of the ADCC type. Indeed, there is a strong correlation between the secretion of cytokines by the effector cells and the ADCC activity mediated by the CD16 of the effector cells (Document FR 02 11416).
  • measuring the reaction of the cell is a measure of calcium influx, phosphorylation, transcription factors, or apoptosis. The increase in these parameters is correlated with activation of the effector cells, which shows the ability of the antibodies to activate the Fc receptors of the effector cells.
  • measuring the amount of at least one cytokine produced by the cell expressing CD16 is a measure of the amount of IL-2 produced by the cell expressing CD16.
  • Another subject of the invention relates to a kit for carrying out a biological test for measuring the activity of therapeutic antibodies comprising the elements necessary for the implementation of one of the processes described above, and comprising in particular (i) means for aggregating said therapeutic antibodies, (ii) cells capable of expressing an Fc receptor, (iii) means for measuring the reaction of said cells capable of expressing an Fc receptor when the receptor Fc of said cells is activated by the Fc region of said antibodies, and (iv) the other elements necessary for the implementation of the method according to any one of the preceding claims.
  • Kit for carrying out a biological test for measuring the activity of therapeutic antibodies comprising (i) means for aggregating said therapeutic antibodies, (ii) cells capable of expressing an Fc receptor, (iii) means for measuring the reaction of said cells capable of expressing an Fc receptor when the Fc receptor of said cells is activated by the Fc region of said antibodies, and (iv) the other elements necessary for carrying out the method according to one of any of the preceding claims.
  • the means for measuring the reaction of said cells included in said kit are means for quantifying at least one cytokine produced by said cells.
  • said quantization means Less than one cytokine dud.it kit are means for assaying AElNm said cytokines.
  • the means for measuring the reaction of said cells of said kit are means for measuring calcium influx, phosphorylation, transcription factors or apoptosis.
  • Figure 1 (A) Calibration curve defined by measuring average fluorescence intensities of the bead populations, (B) Expression profile of the CD16 of the JCD16 + Val population obtained by FACS analysis of an anti-inflammatory marker. CDl6.
  • Figure 2 dose-response curves to an anti-D antibody (batch C029-025) aggregated. Specific curve of JCD16 + Phe cells. The vertical red line delimits the range of concentrations (0.625 to 10 ⁇ g / ml) used for the subsequent tests.
  • Figure 3 kinetics of IL-2 secretion for JCD16 + Phe cells.
  • Figure 4 Influence of fucose levels of antibodies on their activity.
  • A activity test anti-HIV Gpl20 antibodies (100% fucose), AD1 (100% fucose), T125 CHO (81% fucose), R270 (64% fucose), R297 (40% fucose) and R297 (25% fucose) in the test in the presence of target cells
  • B ' anti-Gp120 HIV antibody activity test (100% fucose), AD1 (100% fucose), T125 CHO (81% fucose), R270 (64% fucose), R297 (40% fucose), C029-025 (33% fucose) and R297 (25% fucose) in the test without target cells.
  • Figure 5 Monitoring the stability of lot 05-081 at 40 0 C by measuring its activity every month.
  • FIG. 6 Effect of temperature on the activity of an anti-D monoclonal antibody with respect to its ability to activate CD16 at 10 and 5 ⁇ g / ml, the measurements being carried out by ELISA.
  • FIG. 7 Effect of temperature on the activity of an anti-D monoclonal antibody with respect to its ability to activate CD16 at 10 and 5 ⁇ g / ml, the measurements being carried out by quantitative RT-PCR.
  • the Jurkat line, clone E6-1 (ATCC No. TIB-152), was deposited with ATCC by A. Weiss [6] in 1984. Clone E6-1 was obtained from the Jurkat line called " wild ". This was isolated in 1977 by Schneider et al. [7] from the peripheral blood of a 14-year-old child with acute leukemia lymphoblastic. This line, expressing T-cell markers, is capable of producing interleukin-2 (IL-2) when stimulated by two distinct activation signals. However, the level of IL-2 secreted varies according to the origin of the line and the handling conditions. Therefore Jurkat clones from different origins were transfected so that they express at their membrane the Fc ⁇ RIIIa receptor.
  • IL-2 interleukin-2
  • a line was obtained by transfection with an expression vector encoding a chimeric human RFcDIIIa (extracellular domain of CD16 associated with the transmembrane and intracellular domains of the Y chain) and the neomycin selection gene.
  • JCD16 + Phe cells will be named because they express human CD16 having a phenylalanine at position 158.
  • the JCD16 + Phe cells are maintained in IMDM medium (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) + 4mM L-Glutamine + 25 mM HEPES buffer (Gibco, Invitrogen) supplemented with 10% FCS (Fetal calf serum) irradiated with Y-rays and decomplemented (Invitrogen), and a neomycin analogue (G418 sulfate) at 0.5 mg / ml (Promega).
  • IMDM medium Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • 4mM L-Glutamine 25 mM HEPES buffer (Gibco, Invitrogen) supplemented with 10% FCS (Fetal calf serum) irradiated with Y-rays and decomplemented (Invitrogen), and a neomycin analogue (G418 sulfate) at 0.5 mg / ml (Promega).
  • This phenotyping involves the analysis of different membrane markers that are CD45 (marker of leukocyte cells), CD19 (specific marker B lymphocytes), CD2, CD3, CD4 and CD8 (T-cell specific markers), CD58 (CD2 ligand), but also the different IL-2 receptor chains (CD25 or IL-2 Ra , CD122 or IL-2 R ⁇ and CD132 or IL-2 R ⁇ ).
  • the labels are carried out on 10 6 cells in 100 ⁇ l of PBS (phosphate buffer) IX. The conditions are as follows:
  • CD25 PC5 (IOTest, Coulter Clone).
  • isotype control is performed and correspond respectively to:> 10 .mu.l IgG1-FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 .mu.l IgG1-RD1 (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 .mu.l IgG2b-ECD (Coulter Clone, Beckman Coulter) +10 ⁇ l IgG1-PC5 (IOTest, Beckman Coulter).
  • IgG2 ⁇ -PC5 > 10 ⁇ l IgG2 ⁇ -PC5 (IOTest, Coulter Clone).
  • the cells are incubated in the presence of the different monoclonal antibodies for 30 minutes at room temperature. After washing the cells in PBS IX and centrifugation at 1200 rpm for 5 minutes, the markings are directly analyzed by the cytometer.
  • the number of RFc ⁇ lIIa receptors expressed on the cell surface is evaluated according to the QIFIKIT technique
  • the determination of the number of CD16 sites is carried out on 2, 5.10 5 cells according to the protocol provided in the kit (No. K0078).
  • the cells are incubated with 500 ng of antibodies of interest for 30 minutes at room temperature. room. After washing and centrifugation (5 minutes at 1200 rpm), the cells are incubated with 100 ⁇ l of FIT (ab ') 2 anti-mouse IgG coupled FITC diluted 1/50 ⁇ (Qifikit), for 30 minutes, at room temperature. ambient and black.
  • the cells are then washed and analyzed directly at the FACS.
  • Anti-D antibody samples are tested at an eight-point concentration range defined as: 3.125 ng / ml, 6.25 ng / ml, 9.4 ng / ml, 12.5 ng / ml, 18, 75 ng / ml, 25 ng / ml, 37.5 ng / ml and 50 ng / ml. Each concentration is obtained by dilution of the sample in IMDM + 5% FCS decomplemented.
  • the target cells are D + Rhesus red cells from donors preferentially O + . They are treated with papain (Bio-Rad). This is added volume to
  • the Jurkat cells transplanted between 48 and 72 hours before the test, are counted on a Malassez slide in order to define the volume of cell suspension to be taken in order to have 10 7 cells (quantity required for a microplate).
  • the volume of cell suspension is centrifuged for 10 minutes at 1200 rpm.
  • the cell pellet obtained is then resuspended in IMDM + 5% FCS at a concentration of 2.10 6 cells / ml.
  • a new count is made to ensure the concentration of the suspension and if necessary it is adjusted precisely by addition of IMDM + 5% FCS.
  • a reference anti-D solution is deposited as well as a control sample corresponding to a polyclonal anti-D antibody (Rhophylac 300 TM, Biotest).
  • the wells are homogenized by stirring.
  • the plate is incubated overnight at 37 ° C.
  • the following day, the cells are decanted by centrifugation for 1 minute at 125g.
  • the supernatant is removed and the concentration of IL-2 is determined by ELISA assay.
  • the antibodies studied are tested as above in a range of eight concentrations defined in Chapter 3.1.1.
  • the red blood cells are substituted with an F (ab ') 2 anti-IgG specific fragment
  • Anti-D antibodies and F (ab ') 2 anti-IgG are studied according to a ratio
  • the PMA solution is prepared at a concentration of 10 ng / ml.
  • Jurkat cells are diluted with IMDM + 5% FCS at a concentration defined in Chapter 2.1.4.
  • the wells are homogenized by stirring.
  • the plate is incubated overnight at 37 ° C.
  • the next day the cells are decanted by centrifugation for 1 minute at 125 g.
  • the supernatant is removed and the IL-2 concentration is determined by ELISA assay or IL-2-encoding messenger AKN assay (AKNm).
  • the amount of IL-2 secreted is assayed according to the procedure of the kit Duoset ® human IL-2 (DY202, TUDCN Systems).
  • a capture antibody is distributed in each well of a microplate. After saturation with a bovine albumin solution, the supernatants to be assayed are deposited at different dilutions, as well as a standard range of IL-2.
  • a biotinylated human anti-IL-2 antibody is then added followed by a solution of streptavidin peroxidase HRP. After addition of the substrate (tetramethylbenzidine), a blue color develops. After stopping the reaction with sulfuric acid (H 2 SCj), the optical density of each well is determined by reading the plate at 450 nm.
  • IL-2 concentrations determined by ELISA assay make it possible to determine the activity of each anti-D antibody tested. This is calculated as follows:
  • a second degree equation curve is established by plotting the measured IL-2 concentrations as a function of the concentration range of the antibody. For each deposited sample concentration, the equivalent reference anti-D concentration is calculated using the equation of the second degree of the curve. Each of the equivalent anti-D values is reduced to the theoretical concentration of 50 ng / ml for the target cell test or 10 ⁇ g / ml for the test without target cells, taking into account the dilution of the antibody studied. The average of the values for each sample is then calculated. To determine the percentage of activity in the sample, an activity of 100% is arbitrarily assigned to the reference. It is then sufficient to calculate the following ratio: average of the recalculated concentrations of the sample / average of the recalculated concentrations of the reference
  • the percentage of activity is less than 100 for an unknown anti-D, it means that the activity of this antibody is lower than that of the reference antibody.
  • the percentage of activity is greater than 100, this means that the anti-D studied has a higher activity than the reference.
  • the technique is based on the assay of the messenger AKN (mRNA) encoding IL-2.
  • mRNA messenger AKN
  • a first step the total RNA is extracted from the cells.
  • RNA is converted to complementary DNA (cDNA) using an enzyme called reverse transcriptase.
  • cDNA complementary DNA
  • reverse transcriptase an enzyme called reverse transcriptase.
  • the genetic sequence corresponding to IL-2 is detected by means of specific primers by the quantitative technique of Polymerase Chain Reaction (PCR).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • AKNm encoding IL-2 are transient. • The time for which gene expression is maximal after stimulation under experimental conditions (4-6 hours) is therefore determined.
  • the test is performed according to the following conditions:
  • the cells are then incubated at 37 ° C. in a controlled atmosphere incubator (95% air + 5% CO2).
  • RNA extracted is assayed by spectrophotometry at
  • the cDNA is obtained by incubating for 1 hour at 42 ° C.
  • the PCR step is carried out using the specific primers described below:
  • IL-2 H1 AAC AGT GCA CCT ACT TCA AG
  • IL-2 H2 GTT ATG GG ATG CTT TGA CA
  • Quantitative PCR is performed using Applied Biosystems 7300 and the use of the Power Syber kit Green master mix (Applied Biosystems). The program used for both pairs of primers is
  • Two anti-D mAb preparations at 2 different concentrations (5 and 10 ⁇ g / ml) were compared.
  • One of the preparations was stored at 5 ° C. while the other was kept for 3 months at 40 ° C.
  • the samples were taken 4 hours after the start of cell culture cultivation to extract 1 RNA.
  • the concentration of IL-2 present in the supernatants 16 hours after the introduction of the test was quantified by means of a dosing kit (R & D
  • the intensity of expression of I 1 IL-2 gene depends on the nature of mAb studied and its concentration. This technique can therefore be used to study the interactions between the Fc region of a mAb and the CD16 receptor.
  • genotyping of each line was performed by allelic discrimination by Q-PCR (Applied 7300). Genotyping was verified by RT-PCR.
  • the Jurkat CD16 "line does not express on the surface of its membrane the RFc ⁇ lII receptor
  • the Jurkat CD16 + so-called Phe line expresses well the T (Phe) genotype 1.2 Phenotyping of lines
  • the line thus has the following phenotype CD45 + , CD2 + , CD3 + , CD4 + CD16 + , CD58 + and CD132 + .
  • This experiment aims to quantify the number of CD16 antigenic sites by indirect labeling analyzed by cytometry.
  • the technique is based on the use of five populations of 10 ⁇ m diameter beads coated with monoclonal antibodies (human mouse anti-CD5) in defined increasing amounts (10 3 to 10 6 Antibody-Binding Capacity or ABC). These different populations allow the construction of a calibration line corresponding to the average fluorescence intensities (MFI) versus the antibody binding capacity (ABC).
  • the cells are saturated with the primary antibody of interest (anti-CD1 ⁇ ) which is revealed by a labeled secondary antibody, also introduced under saturating conditions. By observing these conditions, the fixed number of primary antibodies corresponds to the number of antigenic sites present on the surface of the cells. Therefore, the fluorescence is correlated with the number of primary antibodies attached to the cells.
  • the ABC of the cells is determined by the calibration line.
  • each line is monitored on several subcultures in a selective medium in order to verify the maintenance of CDl ⁇ expression.
  • the activation of CD16 requires the aggregation of antibodies because in the absence of F (ab ') 2 , secretion of IL-2 is obtained but much less than a secretion obtained in the presence of PMA and aggregates anti-D / F (ab ') 2 . Furthermore, during each experiment, the maximum activation is verified using PMA and Ionomycine. These results therefore make it possible to demonstrate the need for double stimulation of JCD16 + cells in order to obtain secretion of IL-2.
  • R297 (lot C029-025) was tested in the reaction medium. The experiment was carried out in quintuplate (see figure n ° 2).
  • a kinetic study of IL-2 secretion of both cell lines was performed. For this, the cells were stimulated for 8, 24, 32, 48, 5 ⁇ or 72 hours over a range of defined anti-D concentrations (from 0.625 to 10 ⁇ g / ml of lot C029-025). The concentrations of IL-2 in the supernatant were assayed for each concentration of anti-D, and for each incubation period thus making it possible to obtain the lines of FIG.
  • Biological variability is introduced when cells are used in a test, even if they are cell lines. So, for the purpose of To standardize a test, it must be ensured that the test is reproducible. This is all the more necessary when the test is to be used to evaluate the influence of the purification method on the activity of an antibody, but also when stability studies over time of therapeutic preparations are performed.
  • Reproducibility test determination of the percentage of activity of a sample (batch C029-025) during n experiments.
  • FIGS. 4A and 4B respectively represent the results obtained in the presence of target cells in the test (4A) and in the absence of target cells but with antibody preparations aggregated by means of an F (ab ') 2 .
  • F (ab ') 2 an antibody having a 100% fucose level
  • An antibody having a 100% fucose level such as AD1 even has a totally zero activity with respect to this receptor.
  • This study confirms that the fucose level influences the binding of the antibody to CD1 ⁇ .
  • a completely fucosylated immunoglobulin at the oligosaccharide of asparagine at position 297 of the heavy chain prevents any interaction of the antibody with CD1 ⁇ , which does not then cause its activation.
  • This study shows a loss of activity of the sample when exposed to a high temperature. This loss is proportional to. the. duration of exposure of the sample to heat. This study also shows that similar results are obtained for both tests. These two tests can therefore be used for stability monitoring over the course of preparations for therapeutic use.
  • the aggregated monoclonal antibodies were incubated with Jurkat CD16 + cells for 16 hours at 37 ° C. before assaying IL-2 in the supernatants.
  • Table 1 shows that there is a dose / effect relationship between the amount of IL-2 secreted by the cells in the supernatant 'and the concentration of this monoclonal antibody aggregate in the test, and this irrespective of the method used for aggregate the monoclonal antibody.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé pour mesurer la capacité d'une préparation d'anticorps à activer un récepteur Fc, ce procédé comprenant les étapes suivantes : a) l'agrégation desdits anticorps entre eux, b) la mise en contact de cellules exprimant un récepteur Fc avec lesdits anticorps agrégés, et c) la mesure de la réaction des cellules résultant de l'activation du récepteur Fc desdites cellules par la région Fc desdits anticorps.

Description

Test de caractérisâtion des anticorps
Introduction et art antérieur
La présente invention se rapporte à un procédé pour mesurer la capacité d'une préparation d'anticorps à activer un récepteur Fc, ce procédé comprenant les étapes suivantes : a) l'agrégation desdits anticorps entre eux, b) la mise en contact de cellules exprimant un récepteur Fc avec lesdits anticorps agrégés, et c) la mesure de la réaction des cellules résultant de l'activation du récepteur Fc desdites cellules par la région Fc desdits anticorps .
De plus en plus utilisés en recherche, les anticorps constituent également des outils de choix en diagnostic et en thérapeutique, où ils sont une alternative aux traitements conventionnels .
De nombreuses préparations d' anticorps à usage thérapeutique, d'origine plasmatique ou biotechnologique, sont actuellement sur le marché, ou en phase de développement clinique. Leurs propriétés sont exploitées pour obtenir des outils thérapeutiques capables de se lier de manière spécifique à leur cible, et de recruter de manière efficace les cellules de l'immunité.
Ces dernières années, la recherche s'est orientée sur l'amélioration de l'efficacité des anticorps, et plus particulièrement vers la manipulation de leur région constante Fc. C'est cette dernière qui est responsable des propriétés « effectrices » des anticorps, car elle permet la mobilisation des cellules immunitaires effectrices et des molécules du complément. Cette faculté est rendue possible par la présence, sur certaines cellules immunitaires, de glycoprotéines, les récepteurs Fc ou RFc. Ces récepteurs sont capables de se lier à la région constante des anticorps, une fois que ces derniers ont fixé, par leur région variable, l'antigène cible. Au contact des ces cellules, les anticorps déclenchent différents mécanismes cellulaires comme la phagocytose et l 'ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) .
Ainsi se pose la question de savoir comment discriminer les anticorps pour leur « efficacité », c'est-à-dire sur leur capacité à déclencher les mécanismes cellulaires de l'immunité, due à la liaison de la région Fc des anticorps sur les récepteurs Fc.
Le Demandeur, dans le document FR 02 11416, décrit un procédé pour mesurer l'activité fonctionnelle d'un anticorps. Ce procédé consiste en une mise en contact de cellules exprimant le récepteur CDl6 dans un milieu réactionnel, en présence de l'anticorps et de l ' antigène dudit anticorps , et la mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le récepteur CDl6, cette mesure traduisant l'activation de la cellule effectrice du système immunitaire par l'anticorps.
Ainsi, ce procédé permet d'évaluer l'activation de cellules effectrices par le complexe antigène- anticorps. Toutefois, dans ce procédé, l'activation des cellules effectrices est à la fois dépendante de l'affinité de l'anticorps pour sa cible et de la capacité de la région Fc à se lier au récepteur Fc. Ce test ne permet donc pas d'évaluer l'activation des cellules effectrices due à la seule région Fc de l'anticorps .
Pour répondre à ce problème, le document EP 1 298 219 propose un .procédé permettant de mesurer la fonctionnalité de la région Fc d'un anticorps, sans que cette mesure ne soit influencée par la capacité de liaison de la région Fab de l'anticorps. Ce procédé consiste à immobiliser l'anticorps à tester, à le mettre en présence de cellules effectrices exprimant des récepteurs Fc, et à mesurer la réaction dans la cellule effectrice résultant de l'activation de la cellule effectrice par la région Fc de l'anticorps. Dans ce procédé, les anticorps sont immobilisés par coating sur une plaque ou sur des billes .
Or, le nombre d'anticorps ainsi immobilisé n'est pas contrôlable, car il dépend à la fois de la bonne fixation des anticorps sur la plaque, de leur orientation sur la plaque ou les billes, et de la charge électrique de l'anticorps. En effet, la charge électrique des anticorps dépend de leur degré d'amination, qui influe sur leur capacité à s'immobiliser sur des billes ou des plaques. Ainsi, ce paramètre induit une variabilité du test en fonction de l'anticorps à tester, et la fonctionnalité de la région Fc de deux anticorps de séquence et/ou de spécificité différentes peut ainsi difficilement être comparée. De plus, le test est réalisé au moyen d'une lignée monocytaire humaine (THP-I) qui doit être activée par de l'interféron Y pour exprimer, en surface, de façon conséquente, le récepteur FcγRIIIa. Cette activation préalable est une source importante de variabilité du test et donc les expériences peuvent difficilement être comparées entre elles.
Ainsi, les procédés de l'état de la technique proposant de discriminer les anticorps pour leur « efficacité », sont soit peu adaptés à une évaluation de l'activation des cellules effectrices due à la région Fc de l'anticorps, soit peu reproductibles, et donc peu standardisables . C'est pourquoi il était dans l'intention du Demandeur de mettre au point un nouveau procédé, permettant de mesurer la capacité d'une préparation d'anticorps à activer un récepteur Fc, qui soit à la fois reproductible, et qui permette d'évaluer spécifiquement la capacité de la région Fc d'un anticorps à activer un récepteur Fc7 sans que les caractéristiques de la région Fab de l'anticorps ne viennent interférer dans cette évaluation.
Description détaillée de l'invention
Ainsi, un premier objet de l'invention se rapporte à un procédé pour mesurer la capacité d'une préparation d'anticorps à activer un récepteur Fc, comprenant les étapes suivantes : a) l'agrégation desdits anticorps entre eux, b) la mise en contact de cellules exprimant un récepteur Fc avec lesdits anticorps agrégés, et c) la mesure de la réaction des cellules résultant de l'activation du récepteur Fc desdites cellules par la région Fc desdits anticorps.
Aux fins de l'invention, on entend par « agrégation des anticorps entre eux » l'association entre eux des anticorps dispersés dans la solution les contenant, pour former un réseau exprimant un couplage fort entre les anticorps du réseau.
Cette agrégation des anticorps a pour fonction d'orienter les anticorps de façon maîtrisée et homogène, dans le sens adapté à une présentation adéquate de la région Fc de tous les anticorps ou d'une grande majorité d'entre eux vers le récepteur Fc des cellules effectrices exprimant un récepteur Fc. En effet, le Demandeur a constaté de manière surprenante qu'une telle agrégation a pour effet le fait que les régions Fc de certains anticorps sont orientées de façon particulière et ce quelle que soit la spécificité ou la séquence primaire des anticorps étudiés .
Le procédé selon l'invention a pour avantage de permettre l'étude de la relation dose-réponse entre la quantité d'anticorps mise en œuvre dans le procédé et l'activation de la cellule effectrice, et d'être reproductible . De plus, le Demandeur a constaté de manière surprenante qu'un' tel procédé permet une activation des cellules effectrices via les récepteurs Fc, et ce sans présence d'antigène cible. En effet, les récepteurs Fc sont capables, in vivo, de se lier à la région constante des anticorps une fois que ces derniers ont fixé, par leur région variable, l'antigène cible. L'absence de cellules exprimant en surface l'antigène cible présente l'avantage majeur de s'affranchir de la présence de ces cellules, source de variabilité dans les tests biologiques, et donc de diminuer les paramètres susceptibles d'induire une variabilité dans la mise en œuvre du procédé. Ainsi, la variabilité biologique due à la présence, dans les procédés de l'art antérieur, de cellules cibles, ainsi qu'à l'influence de la spécificité et de la séquence primaire de l'anticorps, est limitée voire nulle dans le procédé de l'invention.
Pour la mise en œuvre de l'invention, les anticorps peuvent être agrégés en utilisant tous les moyens connus de l'homme du métier pour agréger les anticorps, comme la chaleur ou les outils immunologiques, par exemple des immunoglobulines G entières, cette liste n'étant pas limitative. Par ailleurs, le procédé selon l'invention possède l'avantage d'être mis en œuvre avec des anticorps en solution.
Aux fins de l'invention, on entend par « récepteur Fc » tout récepteur de la région Fc des anticorps, présent sur les cellules effectrices, comme le CD16 (FcgammaRIIiy et le CD32 (FcgammaRII) .
Aux fins de l'invention, on entend par « anticorps » tout anticorps, quelle que soit sa spécificité et son isotype, à condition qu'il comporte une région Fc ou une région possédant les mêmes fonctions que la région Fc. Ainsi, il peut s'agir d'un anticorps entier ou d'un fragment d'anticorps, par exemple un fragment Fc d'anticorps. De plus, les anticorps mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention peuvent être des IgG (IgGl ou IgG2 ou IgG3 ou IgG4) , des IgM, des IgE, des IgA ou des IgD, ou encore un mélange d'ente eux. De plus, les anticorps mis en œuvre dans le procédé de l'invention peuvent être monoclonaux et/ou polyclonaux. Dans le cas où il s'agit d'anticorps monoclonaux, ces anticorps peuvent être chimériques, humanisés, humains ou d'origine animale. Aux fins de l'invention, on entend par « cellule exprimant un récepteur Fc » toute cellule exprimant à sa surface un récepteur Fc, cette cellule pouvant exprimer un tel récepteur de manière naturelle ou suite à une modification génétique. A titre d'exemple on peut citer les cellules NK, les monocytes activés, les granulocytes du sang périphérique, les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes CD8, les lymphocytes Tγδ, les cellules NKT, les éosinophiles, les basophiles ou les mastocytes, cette liste n'étant pas limitative. Avantageusement, ces cellules sont capables de réagir lorsque la région Fc d'un anticorps se lie au récepteur Fc exprimé à leur surface.
Aux fins de l'invention, on entend par « réaction des cellules exprimant un récepteur Fc» toute réaction cellulaire mesurable due à l'interaction entre le récepteur Fc de ces cellules et la région Fc des anticorps. Cette réaction peut être intracellulaire ou extracellulaire. On peut citer à titre d'exemple la mesure d'une ou de plusieurs cytokines, la mesure du niveau de calcium intracellulaire, de la perforine, du granzyme ou du monoxyde d'azote, cette liste n'étant pas limitative.
De manière avantageuse, l'agrégation est effectuée au moyen d'un fragment F(ab')2 anti-IgG. Ce moyen permet une agrégation particulièrement avantageuse en terme de maîtrise de l'orientation des régions Fc des anticorps. En effet, chaque fragment F(ab')2 se lie à deux anticorps différents à tester, orientant ainsi les régions Fc des anticorps à tester de manière adéquate. Cette orientation est particulièrement adaptée à l ' interaction avec les récepteurs Fc des cellules effectrices, et donc à l'activation des cellules effectrices .
Les fragments F(ab')2 anti-IgG susceptibles d'être utilisés dans ce mode de réalisation peuvent être dirigés contre tout fragment, partie ou domaine des anticorps, par exemple la région Fc ou la région Fab ou la totalité de la molécule d'IgG. Les fragments F(Ab') 2 peuvent aussi être d'origine monoclonale ou polyclonale. Dans ce mode de réalisation de l'invention, on peut maîtriser de manière précise la concentration en anticorps à tester et la concentration en F(ab')2. Il est ainsi possible de calculer le rapport entre les deux ce qui permet de réaliser des tests reproductibles et ceci quelle que soit la préparation d'anticorps à tester.
De manière particulièrement avantageuse, ce fragment F(ab')2 anti-IgG est un anti-Fab ou un anti-F(ab')2 dirigé contre la préparation d'anticorps testée. Ce fragment peut être un fragment de chèvre ou de lapin. Dans ce mode de réalisation particulier, chaque fragment F(ab')2 se lie aux parties Fab de deux molécules d'anticorps à tester, orientant ainsi les régions Fc des anticorps à tester de manière appropriée pour qu'ils puissent se lier au RFc et activer les cellules exprimant ces RFc en surface.
Selon un autre mode de réalisation, l'agrégation est une agrégation par la chaleur. Les anticorps sont d'abord chauffés de manière à ce qu'ils s'agrègent entre eux (étape a) du procédé de l'invention),^- puis mis en contact avec les cellules exprimant un récepteur Fc (étape b) ) . Toute méthode de chauffage adaptée à l'agrégation des anticorps entre eux peut être utilisée dans la mise en œuvre du procédé de l'invention. On peut citer à titre d'exemple un chauffage à 600C pendant 30 min des anticorps [I].
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'agrégation est effectuée par cross-linking des régions Fab entre elles ou des chaînes lourdes et légères entre elles. Aux fins de l'invention, on entend par « cross-linking » tout pontage entre deux molécules d'anticorps, de manière à orienter la région Fc de ces anticorps de façon homogène vers les récepteurs CD16 des cellules effectrices. De manière avantageuse, un anticorps peut être impliqué dans un ou plusieurs pontages . Ainsi, les anticorps sont susceptibles de former un réseau, dont l'orientation est adéquate pour lier de manière optimisée les récepteurs CDlβ portés par les cellules effectrices. De manière avantageuse, tout moyen permettant de cross-linker (c'est-à-dire de ponter) les anticorps entre eux est adapté à la réalisation de l'invention. On peut citer à titre d'exemple l'établissement de liaisons chimiques, ou un pontage par radiation au moyen d'UV, cette liste n'étant pas limitative. De manière avantageuse, le récepteur Fc exprimé par les cellules effectrices est sélectionné parmi le CD16
(FcγRIIIa et FcγRIIIb) , le CD32 (FcγRIIa et FcyRIIb) , et le CD64. De manière particulièrement avantageuse, on choisit le CDlβ.
Dans un mode de réalisation préféré, les cellules •exprimant le récepteur Fc sont des cellules transfectées avec le gène codant pour ledit récepteur. Dans ce mode de réalisation, il est possible de contrôler le ou les allotypes des récepteurs présentés par les cellules effectrices. En effet, il est possible de réaliser le procédé de l'invention avec des cellules présentant uniquement un récepteur choisi en fonction de ses propriétés, ou bien une combinaison de ces récepteurs, en fonction du test souhaité. Par exemple, il est possible de mettre en œuvre l'invention en choisissant d'utiliser des cellules effectrices exprimant uniquement le CDlβ, en transfectant des cellules avec le gène codant pour le CD16. Ainsi, il est possible de s'affranchir d'un autre facteur de variabilité, à savoir la nature et la quantité de récepteur (s) Fc présent (s) à la surface des cellules effectrices .
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules exprimant le récepteur Fc sont des cellules Jurkat exprimant le CDlβ, cette lignée étant cultivée en présence d'un activateur aspécifique de ces- cellules comme le PMA. (Phorbol 12-Myristate 13- Acétate) . L'un des intérêts particulièrement avantageux dans la mise en œuvre du procédé selon l'invention avec cette lignée cellulaire tient au fait que cette lignée n'a pas besoin d'être activée préalablement à la mise en contact des cellules effectrices avec les anticorps agrégés. En effet, certaines lignées effectrices ont besoin d'être activées au moyen d'une ou plusieurs cytokine(s) pour exprimer de façon suffisamment significative des récepteurs Fc (voir par exemple le document EP 1 298 219). Cette activation préalable avec des cytokines est souvent aléatoire, et a pour conséquence à la fois une perte de temps, et une difficulté peu surmontable dans la standardisation des expérimentations. De plus, la lignée Jurkat transfectée avec un vecteur d'expression codant pour le récepteur CD16 (« lignée Jurkat CD16 ») présente l'avantage d'être immortalisée et donc de se multiplier indéfiniment dans les milieux de cultures.
Ces cellules présentent l'intérêt d'être activables lorsqu'elles sont doublement stimulées. Dans le procédé de l'invention, l' activation des cellules Jurkat CD16 se fait par le PMA (qui est un activateur aspécifique des cellules T) et la liaison du CD16 avec la région Fc d'un anticorps. L'activation des cellules Jurkat se traduit par une libération d'IL-2 dans le surnageant de culture. Par conséquent, plus la région Fc d'un anticorps est fonctionnelle vis-à-vis du CD16, et plus la quantité d'IL-2 libérée dans le surnageant sera élevée.
De manière avantageuse, la mesure de la réaction des cellules résultant de l' activation des récepteurs Fc desdites cellules par les régions Fc desdits anticorps est une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par les cellules exprimant des récepteurs CD16. En effet, l' activation des cellules effectrices se traduit, entre autres, par une libération d'IL-2 dans le surnageant de culture. Par exemple, la concentration de cytokines dans le milieu de culture peut être mesurée grâce à un test ELISA disponible dans le commerce (bioassay) . D'autres méthodes peuvent permettre d'apprécier la synthèse d'une cytokine telle que l'IL-2 : ce sont les techniques de RT-PCT quantitative et de Northern blot pour le dosage des AKN messagers de l'IL-2 ou le Western blot et la cytométrie pour la quantification de l'IL-2 intracellulaire et dans le surnageant de culture, cette liste n'étant pas limitative.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la mesure de la quantité d'au moins une cytokine est réalisée en effectuant un dosage des ARNm de ces cytokines , la quantité de ces ARNm étant corrélée au niveau d'expression des cytokines correspondantes, ce qui traduit le niveau d'activation des cellules effectrices.
De manière avantageuse, on quantifie au moins une cytokine sélectionnée parmi IL-I, IL-2, IL-3 , IL-4, IL-5, IL-β, MCP-I, TNFalpha (TNFα) et IFNgamma (IFNγ), cette liste n'étant pas limitative.
De manière particulièrement avantageuse, la mesure de la réaction de la cellule est la quantification de 1 ' interleukine IL-2.
Le taux d' interleurkine IL-2 sécrétée est corrélé à une activité du type ADCC. En effet, il existe une forte corrélation entre la sécrétion de cytokines par les cellules effectrices et l'activité ADCC médiée par le CD16 des cellules effectrices (Document FR 02
11416). Ainsi, le procédé de l'invention est particulièrement avantageux pour sélectionner des anticorps cytotoxiques, notamment pour un usage thérapeutique .
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la mesure de la réaction de la cellule est une mesure de l'influx calcique, de la phosphorylation, des facteurs de transcription ou de l'apoptose. L'augmentation de ces paramètres est corrélée à une activation des cellules effectrices, ce qui montre la capacité des anticorps à activer les récepteurs Fc des cellules effectrices .
De manière avantageuse, le procédé est adapté pour évaluer la capacité d'une cellule à produire un anticorps monoclonal capable d' interagir avec le récepteur CDl6, c'est-à-dire à évaluer la cytotoxicité d'un anticorps ou d'une préparation d'anticorps. Dans la littérature, il a été démontré que l'affinité d'un anticorps pour le CD16 est dépendante des caractéristiques du récepteur Fc comme par exemple du polymorphisme du CD16 [2, 3], mais aussi de la région Fc, ou le taux de fucose de l'oligosaccharide présent sur l'as'paragine en position 297 des chaînes lourdes des immunoglobulines joue un rôle dans la liaison avec les récepteurs Fc [4, 5] .
La lignée cellulaire produisant des anticorps peut être toute lignée capable de se diviser, mais est plus particulièrement choisie parmi les lignées cellulaires CHO, YB2/0, SP2/0, SP2/0-AG14, IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO- K-I, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3 , CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293 -HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653 , cette liste n'étant pas limitative.
De manière avantageuse, le procédé est adapté pour évaluer l'efficacité et l'intégrité de la région Fc de préparations d'anticorps obtenues après une ou plusieurs étapes de purification. Une autre application du procédé de l'invention est le suivi de la stabilité d'une préparation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux, notamment thérapeutique, placée en condition dénaturante. Le procédé de l'invention est donc particulièrement utile dans le suivi au cours du temps de préparations à usage thérapeutique. En effet, le Demandeur a suivi sur plusieurs mois l'activité d'une préparation d'anticorps conservée en conditions dénaturantes et a montré que celle-ci décroît. Ainsi, une préparation thérapeutique perd de son activité au cours du temps lorsqu'elle est conservée à température élevée, par exemple à 4O0C. Par ailleurs, le procédé de l'invention permet de discriminer quelle est la partie de l'anticorps impliquée dans cette perte d'activité, contrairement aux tests faisant intervenir les cellules portant les antigènes cible. On voit qu'il s'agit de la région Fc de l'anticorps qui, une fois dénaturée, perd de son affinité pour le CD16 (cf exemple 4) .
Par ailleurs, le procédé est, de manière avantageuse, adapté pour mesurer la fonctionnalité de la région Fc d'un anticorps. Par « fonctionnalité de la région Fc d'un anticorps», on entend aux fins de l'invention la capacité de cette région Fc à activer les cellules effectrices par l'intermédiaire de sa liaison au récepteur Fc, notamment au récepteur CDl6. Le procédé de l'invention étant hautement reproductible (cf exemple 2, paragraphe 5), il peut être utilisé en routine pour analyser la fonctionnalité des préparations d'anticorps, car l'efficacité de la mesure est la même pour des anticorps de séquence et/ou de spécificité différente (s) , ainsi que pour le criblage d'anticorps hautement cytotoxiques .
De manière avantageuse, le procédé est adapté pour évaluer la production d'anticorps monoclonaux par des plantes transgéniques ou des mammifères transgéniques. Les anticorps ainsi produits pourront être, grâce à la mise en œuvre du procédé selon l'invention, caractérisés quant à la capacité de leur région Fc à activer un récepteur Fc.
De manière avantageuse, le procédé est adapté pour sélectionner des anticorps efficaces pour un traitement thérapeutique. A titre d'exemple, on sélectionne les anticorps pour lesquels une augmentation supérieure à 100%, ou 250%, avantageusement 500% ou de préférence 1000% du taux de libération de cytokine, par exemple d'IL-2, est observée par rapport au contrôle en absence d'anticorps ou par rapport à un anticorps donné comme référence négative.
De manière avantageuse, le procédé est adapté pour sélectionner des compositions d'anticorps dont la teneur en fucose est inférieure à 65%, et de manière préférentielle inférieure à 40%. En effet, il a été démontré que l'activité des préparations d'anticorps était dépendante de la teneur en fucose sur le motif glycannique en position 297 de la chaîne lourde. Les anticorps sont constitués de chaînes lourdes et de chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région (ou domaine) variable spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour les chaînes légères et de plusieurs domaines (CH1, CH2 et CH3) pour les chaînes lourdes. L'association des domaines variables et des domaines CHl et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab de l'anticorps, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible, permettant à chaque Fab de se fixer à l'antigène cible. La région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps, reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcγR (FcgammaR) . La région Fc, constituée de 2 domaines globulaires CH2 et CH3, est glycosylée au niveau du domaine CH2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné, lié à l'asparagine 297 (Asn 297) . Un tel N-glycanne se présente sous la forme générale suivante (forme présentée « GO », à laquelle d'autres sucres peuvent s'ajouter):
Figure imgf000016_0001
liaison à l'Asn297
H GIcNAc φ Mannose
Ainsi, dans la composition d'anticorps selon l'invention, on entend par « fucose » le fucose porté par ces N-oligosaccharides . La molécule de fucose, lorsqu'elle est présente, est liée à la N- acétylglucosamine (GIcNAc) du N-oligosaccharide, cette GIcNAc étant elle-même liée à l 'Asn 297. Chacun des 2 N-glycannes porté par chacune des 2 chaînes lourdes de chaque anticorps, peut porter une molécule de fucose ou ne pas en porter. Ainsi, chaque anticorps peut comporter 0, 1 ou 2 molécules de fucose, selon respectivement qu'aucun de ses N- glycannes ne porte de fucose, qu'un seul de ses N- glycannes porte une molécule de fucose, ou que ses 2 N-glycannes portent chacun une molécule de fucose. Ainsi, on entend par « composition d'anticorps dont la teneur en fucose est inférieure à 65% » une composition d'anticorps, dont, parmi la totalité des structures glycanniques portées par chaque site de glycosylation (Asn 297) des anticorps de la composition, moins de 65% comportent une molécule de fucose.
Il a été démontré par le Demandeur que de telles compositions présentent une activité ADCC particulièrement avantageuse.
Préférentiellement, on sélectionne des compositions d'anticorps dont la teneur en fucose est comprise entre 20% et 45%, ou entre 25% et 40%. ^- Grâce au procédé de l'invention, il a été montré une relation quantitative entre l'activité fonctionnelle et le taux de fucose dans le sens d'une augmentation de l'activité fonctionnelle des anticorps vis-à-vis du CD16 lorsque le taux de fucose diminue dans la composition (préparation) d'anticorps.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un procédé de préparation d'une composition d'anticorps monoclonaux comprenant les étapes suivantes : a) obtention d'anticorps à partir d'un hybridome, d'un hétérohybridome, ou de toute lignée cellulaire animale, végétale ou humaine transfectée à l'aide d'un ou plusieurs vecteurs de manière à exprimer ledit anticorps, b) agrégation des anticorps obtenus à l'étape a) par un fragment F(ab')2 anti-IgG, c) addition des anticorps obtenus à l'étape b) dans un mélange réactionnel comprenant : des cellules effectrices comprenant des cellules exprimant le CDl6, - du Phorbol 12-Myristate 13-Acétate (PMA) d) mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le CD16, e) sélection de la ou des compositions d'anticorps pour lesquelles on mesure une augmentation supérieure à 0,5, 1, 2, 5, 10, 100 ou à 500 fois de la quantité de cytokine mesurée par rapport au contrôle en absence d'anticorps ou en présence d'un anticorps donné comme référence négative. De manière avantageuse, les cellules effectrices comprenant des cellules exprimant le CDl6 sont des cellules Jurkat CDl6.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la mesure de la quantité d'au moins une cytokine est réalisée en effectuant un dosage des AKNm de ces cytokines, la quantité de ces ARNm étant corrélée au niveau d'expression des cytokines correspondantes, ce qui traduit le niveau d'activation des cellules effectrices .
Par exemple, on quantifie au moins une cytokine sélectionnée parmi IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-I, TNFalpha (TNFα) et IFNgamma (IFNγ) , cette liste n'étant pas limitative.
De manière avantageuse, la mesure de la réaction de la cellule est la quantification de l' interleukine IL-2. Le taux d'interleurkines, par exemple d'IL-2, sécrétées est corrélée à une activité du type ADCC. En effet, il existe une forte corrélation entre la sécrétion de cytokines par les cellules effectrices et l'activité ADCC médiée par le CD16 des cellules effectrices (Document FR 02 11416) . Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la mesure de la réaction de la cellule est une mesure de l'influx calcique, de la phosphorylation, des facteurs de transcription ou de l'apoptose. L'augmentation de ces paramètres est corrélée à une activation des cellules effectrices, ce qui montre la capacité des anticorps à activer les récepteurs Fc des cellules effectrices .
De manière avantageuse, la mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le CD16 est une mesure de la quantité d'IL-2 produite par la cellule exprimant le CDl6. Un autre objet de l'invention se rapporte à un kit pour la mise en œuvre d'un test biologique de mesure de l'activité d'anticorps thérapeutiques comprenant les éléments nécessaires à la mise en œuvre de l'un des procédés précédemment décrits, et comprenant notamment (i) des moyens d'agrégation desdits anticorps thérapeutiques, (ii) des cellules capables d'exprimer un récepteur Fc, (iii) des moyens de mesure de la réaction desdites cellules capables d'exprimer un récepteur Fc lorsque le récepteur Fc desdites cellules est activé par la région Fc desdits anticorps, et (iv) les autres éléments nécessaires à la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
Kit pour la mise en œuvre d'un test biologique de mesure de l'activité d'anticorps thérapeutiques comprenant (i) des moyens d'agrégation desdits anticorps thérapeutiques, (ii) des cellules capables d'exprimer un récepteur Fc, (iii) des moyens de mesure de la réaction desdites cellules capables d'exprimer un récepteur Fc lorsque le récepteur Fc desdites cellules est activé par la région Fc desdits anticorps, et (iv) les autres éléments nécessaires à la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes .
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les moyens de mesure de la réaction desdites cellules compris dans ledit kit sont des moyens de quantification d'au moins une cytokine produite par lesdites cellules.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdits moyens de quantification d'au moins une cytokine dud.it kit sont des moyens de dosage des AElNm desdites cytokines.
Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, les moyens de mesure de la réaction desdites cellules dudit kit sont des moyens de mesure de l'influx calcique, de la phosphorylation, des facteurs de transcription ou de l'apoptose.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas 1 ' étendue de l ' invention .
Description des figures
Figure 1 : (A) Courbe de calibration définie par la mesure des intensités moyennes de fluorescence des 5 populations de billes, (B) Profil d'expression du CD16 de la population JCD16+ Val obtenu par analyse au FACS d'un marquage anti- CDl6.
Figure 2 : courbes de dose-réponse à un anticorps anti-D (lot C029-025) agrégé. Courbe spécifique des cellules JCD16+ Phe. Le trait rouge vertical délimite la gamme de concentrations (0,625 à lOμg/ml) utilisée pour la suite des tests.
Figure 3 : cinétique de sécrétion en IL-2 pour les cellules JCDl6+ Phe.
Figure 4 : Influence du taux de fucose des anticorps sur leur activité. (A) test d'activité des anticorps anti-Gpl20 VIH (100% de fucose) , ADl (100% de fucose), T125 CHO (81% de fucose), R270 ( 64% de fucose) , R297 (40% de fucose) et R297 (25% de fucose) dans le test en présence de cellules cibles, (B) ' test d'activité des anticorps anti-Gpl20 VIH (100% de fucose) , ADl (100% de fucose), T125 CHO (81% de fucose), R270 ( 64% de fucose), R297 (40% de fucose), C029-025 (33% de fucose) et R297 (25% de fucose) dans le test sans cellules cibles.
Figure 5 : Suivi de la stabilité du lot 05-081 à 400C par mesure de son activité tous les mois.
Figure 6 : Effet de la température sur 1 ' activité d'un anticorps monoclonal anti-D vis à vis de sa capacité à activer le CD16 à 10 et 5 μg/ml, les mesures étant réalisées par test ELISA.
Figure 7 : Effet de la température sur l'activité d'un anticorps monoclonal anti-D vis à vis de sa capacité à activer le CD16 à 10 et 5 μg/ml, les mesures étant réalisées par RT-PCR quantitative.
Exemples
1. Culture cellulaire
1.1 Lignées cellulaires
La lignée Jurkat, clone E6-1 (n° ATCC TIB-152), a été déposée à l'ATCC par A. Weiss [6] en 1984. Le clone E6-1 a été obtenu à partir de la lignée Jurkat dite « sauvage ». Celle-ci fut isolée en 1977 par Schneider et al . [7] à partir du sang périphérique d'un enfant âgé de 14 ans présentant une leucémie aiguë lymphoblastique. Cette lignée, exprimant les marqueurs de cellules T, est capable de produire de 1 ' interleukine 2 (IL-2) lorsqu'elle est stimulée par deux signaux d'activation distincts. Toutefois, le taux d'IL-2 sécrété varie selon l'origine de la lignée et les conditions de manipulation. C'est pourquoi des clones Jurkat de ' différentes origines ont été transfectés afin qu'ils expriment au niveau de leur membrane le récepteur FcγRIIIa. Une lignée a été obtenue par transfection par un vecteur d'expression codant pour un RFcDIIIa humain chimérique (domaine extracellulaire du CDl6 associé aux domaines transmembranaire et intracellulaire de la chaîne Y) et le gène de sélection de la néomycine. On nommera ces cellules JCD16+ Phe car elles expriment le CD16 humain présentant une phénylalanine en position 158.
1.2 Milieux de culture et repiquage
Les cellules JCD16+ Phe sont maintenues en milieu IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Médium) + 4mM de L- Glutamine + 25 mM de tampon HEPES (Gibco, Invitrogen) additionné de 10% SVF (Sérum de Veau Fœtal) irradié aux rayons Y et décomplémenté (Invitrogen) , et d'un analogue de la néomycine (G418 sulfate) à 0,5 mg/ml (Promega) . Cette lignée cellulaire est maintenue en culture à raison de deux repiquages par semaine avec un taux d'ensemencement de 0, 2.106 cellules/ml.
2. Cytométrie en flux
Les différents marquages sont analysés sur un cytomètre EPICS XL (Beckman Coulter)
2.1 Phénotypage de la lignée cellulaire JCDlβ"1' Phe
Ce phénotypage porte sur l'analyse de différents marqueurs membranaires qui sont le CD45 (marqueur des cellules leucocytaires) , le CD19 (marqueur spécifique des lymphocytes B), les CD2, CD3 , CD4 et CD8 (marqueurs spécifiques des lymphocytes T) , le CD58 (ligand du CD2), mais aussi les différentes chaînes du récepteur à l'IL-2 (le CD25 ou IL-2 Ra, le CD122 ou IL-2 Rβ et le CD132 ou IL-2 Rγ) . Les marquages sont réalisés sur 106 cellules dans lOOμl de PBS (tampon phosphate) IX. Les conditions sont les suivantes :
> 10 μl d'anti-CD2 FITC (2-fluorescein isothio- cyanate, Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl d'anti-CD3 RDI (R-phycoerythrin, Coulter
Clone, Beckman Coulter) + 10 μl d'anti-CDl9 ECD
(R-phycoerythrin/Texas Red tandem dye, Coulter
Clone, Beckman Coulter) + 10 μl d'anti-CDlβ PC5
(R-phycoerythrin/cyanine 5 tandem dye, IOTest, Beckman Coulter) .
> 10 μl d'anti-CD45 FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl d'anti-CD3 RDI (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl d'anti-CD4 ECD
(Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl d'anti-CD8 PC5 (Coulter Clone, Beckman Coulter) .
> 10 μl d'anti-CD58 PC5 (IOTest, Coulter Clone) .
> 5 μl d'anti-CDl22 FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl d'anti-CDl32 PE (Phycoerythrin, BD Pharmigen) + 10 μl d'anti-
CD25 PC5 (IOTest, Coulter Clone) .
En parallèle de ces quatre marquages des contrôles isotypiques sont réalisés et correspondent respectivement à : > 10 μl IgGl-FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl IgGl-RDl (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl IgG2b-ECD (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl IgGl-PC5 (IOTest, Beckman Coulter) . > 10 μl IgGl-FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl IgGl-RDl (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl IgGl-CD4 ECD (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl IgGl-PC5 (Coulter Clone, Beckman Coulter) .
> 10 μl IgG2a-PC5 (IOTest, Coulter Clone) .
> 5 μl IgGl-FITC (Coulter Clone, Beckman Coulter) + 10 μl IgGl-PE (BD Pharmigen) + 10 μl IgG2a-
PC5 (IOTest, Coulter Clone) .
Les cellules sont incubées en présence des différents anticorps monoclonaux pendant 30 minutes au noir, à température ambiante. Après un lavage des cellules en PBS IX et une centrifugation à 1200 rpm pendant 5 minutes, les marquages sont directement analysés au cytomètre .
2.2 Détermination du nombre de sites CD16
Le nombre de récepteurs RFcγlIIa exprimés à la surface de cellules est évalué selon la technique QIFIKIT
(Dako Cytomation) . Cette technique requiert au préalable de déterminer la dose saturante d'anticorps anti-CD16 (clone 3G8 , IgGl anti-CDlβ conjugué avec la fluorescéine, Immunotech) nécessaire pour occuper tous les sites antigéniques à la surface des cellules. Les cellules (0, 25.106/100μl sérum physiologique) sont incubées avec des doses croissantes d' anti-CDlβ 3G8 pendant 30 minutes à température ambiante. Après un lavage en sérum physiologique suivi d'une centrifugation à 1200 rpm pendant 5 minutes, les cellules sont alors incubées avec 50 μl de F(ab')2 anti-IgG de souris (H+L) marqué PE dilué au l/20ème (Beckman Coulter) pendant 30 minutes au noir. A la fin de l'incubation, les cellules sont lavées et directement analysées par FACS (fluorescence-activated cell sorting) .
La détermination du nombre de sites CD16 est réalisée sur 2, 5.105 cellules selon le protocole fourni dans le kit (n° K0078) . Les cellules sont incubées avec 500 ng d'anticorps d'intérêt pendant 30 minutes à température ambiante. Après un lavage et une centrifugation (5 minutes à 1200 rpm) , les cellules sont incubées avec lOOμl de F(ab')2 anti-IgG de souris couplé FITC dilué au 1/50^ (Qifikit) , pendant 30 minutes, à température ambiante et au noir. Les cellules sont ensuite lavées et analysées directement au FACS.
3. Test de production d'IL-2 par les cellules Jurkat
3.1 Test en présence d'hématies portant l'antigène spécifique
3.1.1 Préparation des échantillons à tester
Des échantillons d'anticorps anti-D sont testés selon une gamme de concentrations définie en huit points qui sont : 3,125 ng/ml, 6,25 ng/ml , 9,4 ng/ml, 12,5 ng/ml, 18,75 ng/ml, 25 ng/ml, 37,5 ng/ml et 50 ng/ml. Chaque concentration est obtenue par dilution de l'échantillon en IMDM + 5% SVF décomplémenté.
3.1.2 Préparation des cellules cibles
Les cellules cibles sont des hématies Rhésus D+ issues de donneurs préférentiellement O+. Elles sont traitées à la papaïne (Bio-Rad) . Celle-ci est ajoutée volume à
•volume au culot globulaire et laissée incuber pendant
10 minutes à 37°C. La réaction est stoppée par l'addition d'un grand volume de sérum physiologique
(NaCl 0,9%, Ecotainer, B BRAlM). Les cellules sont alors lavées trois fois en NaCl 0,9% et centrifugées à 3000 tr/min pendant 5 minutes pour les deux premiers lavages et 10 minutes pour le lavage final. Le culot globulaire est ensuite dilué en IMDM + 5% SVF afin d'obtenir une suspension cellulaire à la concentration de 8.106 cellules/ml (0,08%). 3.1.3 Préparation de la solution de PMA
Une solution de PMA (10 μg/ml, Sigma) à une concentration de 40 ng/ml est préparée par dilution au l/250ème en IMDM + 5% SVF.
3.1.4 Préparation des cellules effectrices
Les cellules Jurkat, repiquées entre- 48 et 72 heures avant le test, sont dénombrées sur lame de Malassez afin de définir le volume de suspension cellulaire à prélever pour disposer de 107 cellules (quantité nécessaire pour une micro-plaque) . Le volume de suspension cellulaire est centrifugé pendant 10 minutes à 1200 rpm. Le culot cellulaire obtenu est alors re-suspendu en IMDM + 5% SVF à la concentration de 2.106 cellules/ml. Une nouvelle numération est effectuée afin de s'assurer de la concentration de la suspension et si besoin celle-ci est ajustée précisément par addition d'IMDM + 5% SVF.
3.1.5 Réalisation du test
En plaque de 96 puits à fond en U, il est déposé pour chaque puits :
> 50 μl d'anticorps anti-D à tester,
> 50μl de la suspension globulaire (soit 4.105 hématies pour 50μl) ,
^ 50 μl de la suspension cellulaire (soit 105 cellules pour 50μl) ,
> 50μl de PMA (soit 2ng pour 50μl) .
Pour chaque plaque, une solution d' anti-D de référence est déposée ainsi qu'un échantillon témoin correspondant à un anticorps polyclonal anti-D (Rhophylac 300 TM, Biotest) . Les puits sont homogénéisés par agitation. La plaque est incubée pendant une nuit à 370C. Le lendemain, les cellules sont décantées par centrifugation pendant 1 minute à 125g. Le surnageant est prélevé et la concentration en IL-2 est déterminée par dosage ELISA.
3.2 Test en absence de cible antigénique
Les anticorps étudiés sont testés comme précédemment selon une gamme de huit concentrations définies au chapitre 3.1.1. Dans ce test, les hématies sont substituées par un F(ab')2 anti-IgG fragment spécifique
(1,3 mg/ml, Jackson Immuno-Research Laboratories).
Celui-ci est également dilué en IMDM + 5% SVF à huit concentrations différentes. Les anticorps anti-D et les F(ab')2 anti-IgG sont étudiés selon un rapport
1/1,5. La solution de PMA est préparée à une concentration de 10 ng/ml . Les cellules Jurkat sont diluées en IMDM + 5% SVF à une concentration définie au chapitre 2.1.4.
En plaque 96 puits à fond en U, il est déposé pour chaque puits : y 50 μl d'anticorps anti-D à tester,
> 50μl de F(ab')2 anti-IgG fragment spécifique, > 50 μl de suspension cellulaire,
> 50μl de PMA (soit 0,5ng pour 50μl) .
Les puits sont homogénéisés par agitation. La plaque est incubée pendant une nuit à 370C. Le lendemain, les cellules sont décantées par centrifugation pendant 1 minute à 125g. Le surnageant est prélevé et la concentration en IL-2 est déterminée par dosage ELISA ou par le dosage des AKN messagers (AKNm) codant pour l'IL-2.
3.3 Dosage de l'IL-2 du surnageant cellulaire par technique ELISA
3.3.1 Matériel et méthodes La quantité d'IL-2 sécrétée est dosée selon le mode opératoire du kit Duoset® human IL-2 (DY202, RScD Systems) . Un anticorps de capture est distribué dans chaque puits d'une micro-plaque. Après saturation au moyen d'une solution d'albumine bovine, les surnageants à doser sont déposés .à différentes dilutions, ainsi qu'une gamme étalon d'IL-2. Un anticorps anti-IL-2 humaine biotinylé est ensuite ajouté suivi d'une solution de streptavidine peroxydase HRP. Après addition du substrat (Tétraméthylbenzidine) , une coloration bleue se développe. Après avoir stoppé la réaction avec de l'acide sulfurique (H2SCj) , la densité optique de chaque puits est déterminée par lecture de la plaque à 450 nm. La concentration en IL-2 pour chaque puits est calculée grâce au logiciel biolise qui détermine la courbe de régression de la gamme IL-2 ([IL-2] = a [anticorps]2 + b [anticorps] + c) et qui prend en compte le facteur de dilution de l'échantillon dans chaque puits .
3.3.2 Interprétation des résultats
Les concentrations d'IL-2 déterminées par dosage ELISA permettent de déterminer l'activité de chaque anticorps anti-D testé. Celle-ci se calcule de la façon suivante :
A partir d'un anticorps de référence, une courbe d'équation du second degré est établie en reportant les concentrations en IL-2 mesurées en fonction de la gamme de concentration de l'anticorps. Pour chaque concentration d'échantillon déposé, il est calculé la concentration équivalente en anti-D de référence au moyen de l'équation du second degré de la courbe. Chacune des valeurs équivalentes en anti-D est ramenée à la concentration théorique de 50ng/ml pour le test avec cellules cibles ou lOμg/ml pour le test sans cellules cibles en tenant compte de la dilution de l'anticorps étudié. La moyenne des valeurs pour chaque échantillon est alors calculée. Pour déterminer le pourcentage d'activité de l'échantillon, on attribue de façon arbitraire une activité de 100% à la référence. Il suffit alors de calculer le rapport suivant : moyenne des concentrations recalculées de l'échantillon / moyenne des concentrations recalculées de la référence
Ainsi, si le pourcentage d'activité est inférieur à 100 pour un anti-D inconnu, cela signifie que l'activité de cet anticorps est inférieure à celle de l'anticorps de référence. En revanche, si le pourcentage d'activité est supérieur à 100, cela signifie que l' anti-D étudié a une activité supérieure à la référence.
3.4 Dosage de 1 ' IL-2 par le dosage des AKNm codant pour l'lL-2
La technique repose sur le dosage des AKN messager (ARNm) codant pour 1 ' IL-2. Dans un premier temps, 1 'ARN total est extrait à partir des cellules. L 'ARN est converti en ADN complémentaire (ADNc) au moyen d'une enzyme appelée Transcriptase inverse. La séquence génétique correspondant à l ' IL-2 est détectée au moyen d'amorces spécifiques par la technique quantitative de Polymerase Chain Reaction (PCR) . Pour pouvoir comparer des échantillons entre eux, il est nécessaire de normaliser le dosage. Ceci est effectué par le dosage simultané des ARNm codant pour un gène ubiquitaire ou constitutif dont le niveau d'expression est identique dans toutes les cellules quelles que soient les conditions de culture et de stimulation. Le gène ubiquitaire choisi dans ces essais est la b- actine qui est un des constituants du cytosquelette des cellules. Plus la cellule sera activée, plus le rapport ADNc IL-2 / ADNc b-actine sera élevé. Les AKNm codant pour 1 ' IL-2 sont transitoires. • On détermine donc le temps pour lequel l'expression du gène est maximale après stimulation dans les conditions expérimentales (4-6 heures) .
3.4.1 Matériel et méthodes
1) Culture cellulaire
Le test est réalisé selon les conditions suivantes :
- 200 μl de suspension cellulaire JURKAT CD16+ à 107 cellules /ml ;
- Anticorps monoclonaux (AcM) anti-D avec F(ab')2 :
- 200 μl d'AcM anti-D à 10 μg/ml avec 200 μl de F(ab')2 (Jackson Immuno-Research) anti-fragment spécifique à 15 μg/ml ; ou -• 200 μl d'AcM anti-D à 5 μg/ml avec 200 μl de F(ab')2 (Jackson Immuno-Research) anti-fragment spécifique à 7,5 μg/ml ; -200 μl de PMA à 40 ng/ml .
Toutes les solutions utilisées sont préparées dans le milieu IMDM avec 5 % SVF.
Les cellules sont ensuite incubées à 370C dans un incubateur à atmosphère contrôlée (95% air + 5% CO2) .
2) Extraction de l 'ARN total
L 'ARN total est extrait au moyen de 2 kits commerciaux
(QIAGEN) :
-QIAshredder kit;
-RNeasy Protect mini kit; puis I1ARN extrait est dosé par spectrophotométrie à
260 nm. 3) Etape de transcriptase inverse
L 'ADNc est obtenu en incubant 1 heure à 420C :
- 1 μg d'ARN linéarisé (chauffage à 650C suivi d'un refroidissement immédiat à 40C) ;
- amorce d'oligo dT ;
- dATP, dCTP, dGTP et dTTP ;
- Dithiothréitol (DTT) ;
- Inhibiteur de RNase ; - Transcriptase Inverse.
4) Etape de PCR
L'étape de PCR est réalisée au moyen des amorces spécifiques décrites ci-dessous :
Pour l'IL-2
IL-2 Hl : AAC AGT GCA CCT ACT TCA AG IL-2 H2 : GTT GAG ATG ATG CTT TGA CA
Pour la b-actine
BACT Hl : GGG TCA GAA GGA TTC CTA TG
BACT H2 : GGT CTC AAA CAT GAT CTG GG
La PCR quantitative est réalisée au moyen de l'appareil Applied Biosystems 7300 et l'utilisation du kit Power Syber Green master mix (Applied Biosystems) . Le programme utilisé pour les 2 couples d'amorces est
- 1 cycle de Déshybridation à 950C pendant 10 minutes ;
- 40 cycles :
- Déshybridation à 950C pendant 10 secondes ; - « Annealing » (accrochage des amorces) à 600C pendant 15 secondes ;
- Elongation à 720C pendant 60 secondes. A l ' issue de la PCR, les produits amplifiés sont dénaturés lentement et progressivement pour définir la courbe de dissociation et la Tm • ( température de fusion) en 0C qui sont spécifiques du produit amplifié .
3 .4 . 2 Résultats
Deux préparations d'AcM anti-D à 2 concentrations différentes (5 et 10 μg/ml) ont été comparées. L'une des préparations a été conservée à 50C tandis que l'autre a été conservée 3 mois à 400C.
Pour la technique de RT-PCR quantitative, les échantillons ont été prélevés 4 heures après le début de mise en culture du test cellulaire pour extraire I1ARN.
Pour la technique de dosage de l'IL-2 dans le surnageant de culture par ELISA, les échantillons ont été prélevés 16 heures après la mise en culture.
1) Résultats ΞLISA
La concentration en IL-2 présente dans les surnageants 16 heures après la mise en place du test a été quantifiée au moyen d'un kit de dosage (R&D
Systems) . Les résultats obtenus sont représentés à la figure 6.
2) Résultats RT-PCR quantitative
L'expression du gène de l'IL-2 dans les cellules JURKAT CD16+, 4 heures après la mise en place du test a été estimée par RT-PCR en temps réel. Les résultats ont été normalisés vis à vis du gène ubiquitaire de la b-actine. Les résultats sont représentés à la figure 7. 3.4.3 Conclusion
II existe une corrélation entre la méthode de dosage direct de la concentration en cytokine IL-2 dans le surnageant des cellules JURKAT CD16+ stimulées et la méthode de dosage de l'expression de son gène par RT- PCR quantitative.
Comme pour le test ELISA, l'intensité de l'expression du gène de I1IL-2 dépend de la nature de l'AcM étudié et de sa concentration. Cette technique peut donc être utilisée pour étudier les interactions entre la région Fc d'un AcM et le récepteur CDl6.
Exemple 1
1. Caractérisation des lignées cellulaires
1.1 Génotypage des lignées
Préalablement à la mise au point de ce test, le génotypage de chaque lignée a été réalisé par discrimination allélique par Q-PCR (Applied 7300) . Le génotypage a été vérifié par RT-PCR.
Figure imgf000033_0001
Analyse du génotype des lignées par Q-PCR (ADN) et RT-PCR (ARN) .
La lignée Jurkat CD16" n'exprime pas à la surface de sa membrane le récepteur RFcγlII. La lignée Jurkat CD16+ dite Phe exprime bien le génotype T (Phe) 1.2 Phénotypage des lignées
L'analyse des marqueurs membranaires par marquage FACS a permis d'obtenir les résultats suivants :
Figure imgf000034_0001
Analyse par cytométrie des marqueurs membranaires des deux lignées Jurkat transfectées.
La lignée présente donc le phénotype suivant CD45+, CD2+, CD3+, CD4\ CD16+, CD58+ et CD132+.
1.3 Détermination du nombre de sites CD16
Cette expérience a pour but de quantifier le nombre de sites antigéniques CD16 par un marquage indirect analysé en cytométrie. La technique est basée sur l'utilisation de cinq populations de billes de 10 um de diamètre recouvertes d'anticorps monoclonaux (anti- CD5 humain de souris) en quantités croissantes définies (103 à 106 Antibody-Binding Capacity ou ABC) . Ces différentes populations permettent la construction d'une droite de calibration correspondant à la moyenne des intensités de fluorescence (MFI) versus la capacité de fixation des anticorps (ABC) . Les cellules sont saturées avec l'anticorps primaire d'intérêt (anti-CDlβ) qui est révélé par un anticorps secondaire marqué, également introduit en condition saturante. En respectant ces conditions, le nombre d'anticorps primaire fixé correspond au nombre de sites antigéniques présents à la surface des cellules . Par conséquent, la fluorescence est corrélée au nombre d'anticorps primaires fixés sur les cellules. L'ABC des cellules est déterminée grâce à la droite de calibration.
Le tableau ci-dessous est le tableau récapitulatif de la détermination du nombre de sites CDl6 pour la lignée étudiée (étude réalisée sur plusieurs repiquages) :
Figure imgf000035_0001
Après décongélation d'une ampoule provenant d'une banque, chaque lignée est suivie sur plusieurs repiquages en milieu sélectif afin de vérifier le maintien de l'expression du CDlβ.
Ainsi, il a pu être constaté qu'après plusieurs passages, l'expression du CDlβ est maintenue et ne varie que très faiblement dans des conditions de culture identiques d'un repiquage à l'autre. Par ailleurs, la pression de sélection et les résultats tendent à montrer qu'une sélection des clones à fort potentiel d'expression s'opère. De plus, cette technique permet d'analyser précisément l'hétérogénéité de l'expression du CD16 à la surface des cellules par la détermination du nombre de sites pour les populations extrêmes (les 10% inférieurs et les 10% supérieurs) .
Exemple 2 : Test d' activât!on du CD16
1 Spécificité du test
La spécificité du test a été vérifiée de la manière suivante : plusieurs témoins sont introduits dans le test de sécrétion d'IL-2 par les cellules Jurkat afin de confirmer le mécanisme d'activation des cellules. Un seuil limite de détection de 15 pg/ml est défini par le dernier point de la gamme étalon IL-2 fournie dans le kit de dosage. En dessous de ce seuil, la sécrétion d'IL-2 par les cellules est considérée comme non détectable. Le tableau ci-dessous est le tableau récapitulatif des taux moyens d'IL-2 sur n expériences et les écart-types de chaque témoin introduit dans le test de production d'IL-2. (< SL = inférieur au seuil limite de 15pg/ml)
Figure imgf000037_0001
Le dosage du surnageant de culture des cellules seules permet de définir leur niveau de sécrétion basai gui s'avère donc non détectable. Ce témoin permet de vérifier qu'en l'absence de tout stimulus, les cellules ne sécrètent pas d'IL-2. Par ailleurs, ces témoins permettent de confirmer la nécessité de deux stimuli (PMA et complexe anti-D/F (ab' ) 2) pour entraîner l'activation des cellules. En- effet, la sécrétion d'IL-2 est minime voire nulle lorsque l'un des deux stimuli est absent (témoins PMA + F(ab')2 ou F(ab')2 + anti-D) . De même, l'activation du CD16 nécessite l'agrégation des anticorps car en absence de F(ab')2, une sécrétion d'IL-2 est obtenue mais de manière largement inférieure à une sécrétion obtenue en présence de PMA et d'agrégats anti-D/F (ab' )2. Par ailleurs, au cours de chaque expérimentation, l'activation maximum est vérifiée par utilisation de PMA et de Ionomycine. Ces résultats permettent donc de démontrer la nécessité d'une double stimulation des cellules JCD16+ afin d'obtenir une sécrétion en IL-2.
2. Effet dose et détermination de la gamme de concentration d'anticorps
Afin de déterminer la gamme optimale de concentrations en anti-D pour la suite des expérimentations, un test dose-réponse (représenté par les deux courbes suivantes) a été réalisé. Pour cela, une gamme de concentrations allant de 1 à 100 μg/ml d'anticorps
R297 (lot C029-025) a été testée dans le milieu réactionnel . L'expérience a été réalisée en quintuplate (voir figure n°2) .
Pour les faibles concentrations en anti-D, la courbe de concentration en IL-2 dans le surnageant après 24 heures de stimulation est proportionnelle à la concentration en anti-D introduite dans le test. Pour les fortes concentrations en anti-D, la courbe atteint un plateau. 3. Cinétique df activâtion et détermination du temps d' incubation
Afin de déterminer la durée optimale d'incubation, une étude cinétique de la sécrétion en IL-2 des deux lignées cellulaires a été réalisée. Pour cela, les cellules ont été stimulées pendant 8, 24, 32, 48, 5β ou 72 heures par une gamme de concentrations en anti-D définie (de 0,625 à 10 μg/ml du lot C029-025) . Les concentrations en IL-2 dans le surnageant ont été dosées pour chaque concentration en anti-D, et pour chaque durée d'incubation permettant ainsi d'obtenir les droites de la figure 3.
Cette étude permet de montrer qu'après 8 heures de stimulation, les cellules ne sécrètent que très peu d'IL-2. A partir de 24 heures, les taux d'IL-2 atteignent des valeurs maximales. Après 24 heures de stimulation, les courbes tendent même à se superposer. La durée d'incubation optimale a été fixée à 24 heures de façon à limiter la durée du test.
4. Effet de la concentration cellulaire dans le test
II est relativement difficile de standardiser la concentration cellulaire dans un test biologique. L'objet de cette étude est de vérifier si le pourcentage d'activité d'un échantillon donné est dépendant ou non de la concentration cellulaire. Pour cela, au cours de trois expériences indépendantes, un échantillon d'anticorps monoclonal anti-D (lot R297 n°05-081, T0) a été testé avec cinq concentrations cellulaires différentes (Cl=IO5 cellules/puits, C2=2,5.105 cellules/puits, C3=5.105 cellules/puits, C4=7,5.105 cellules/puits et C5=106 cellules/puits) . Son pourcentage d'activité a ensuite été déterminé par comparaison avec un anti-D de référence (lot C029-025) dont le pourcentage d'activité est fixé arbitrairement à 100%. Les résultats obtenus pour chaque concentration, lors des trois expériences, sont présentés dans les tableaux suivants .
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000040_0002
Pourcentage d'activité de l'échantillon R297 n°05-081 testé au cours de trois expériences indépendantes regroupant cinq conditions de concentration cellulaire, cellules Jurkat CDl6+ Phe.
Dans cette étude, l'analyse des coefficients de variation (CV) montre que les trois expériences donnent une activité comparable de l'échantillon n°05- 081 quelle que soit la concentration cellulaire étudiée .
5. Reproductibilité du test
Une variabilité biologique est introduite lorsque des cellules sont utilisées dans un test, même s'il s'agit de lignées cellulaires. Ainsi, dans le but de standardiser un test, il faut s'assurer que ce dernier est bien reproductible. Ceci est d'autant plus nécessaire lorsque le test doit être mis en œuvre pour évaluer l'influence du procédé de purification sur l'activité d'un anticorps, mais aussi lorsque des études de stabilité au cours du temps de préparations thérapeutiques sont réalisées .
L'activité d'un échantillon (lot C029-025) a ainsi été testée au cours de plusieurs expériences. Son pourcentage d'activité est calculé par rapport à une référence qui correspond au même échantillon dont l'activité est fixée arbitrairement à 100%.
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000041_0002
Figure imgf000042_0001
Test de reproductibilité : détermination du pourcentage d'activité d'un échantillon (lot C029-025) au cours de n expériences.
Dans le cas d'un test biologique, il est admis un coefficient de variation maximum de 15-20% pour que le test soit valide. Dans le cas de notre test, les CV obtenus (5% pour les cellules JCD16+ Phe) sont donc inférieurs à ce qui est admissible. L'utilisation de ce test est donc possible en routine pour le suivi de stabilité d'échantillons mais aussi lors de la
<- vérification du niveau d'activité d'un échantillon au cours de son procédé de purification.
Exemple 3 : Evaluation de la cytotoxicité d' un anticorps vis-à-vis du CD16
Dans la littérature, il a été démontré que le taux de fucosylation des oligosaccharides présents au niveau des chaînes lourdes des immunoglobulines influence les propriétés effectrices des anticorps. En effet, un faible taux de fucose augmenterait la capacité de fixation de l'anticorps sur le CDl6 [26] . Par ailleurs, ce mécanisme serait totalement indépendant du polymorphisme du CDl6 [27] . Dans cette étude, nous nous sommes donc intéressés à l'impact du taux de fucose sur l'activité fonctionnelle des anticorps. Le LFB dispose de différentes préparations d'anticorps monoclonaux qui ont été caractérisées par leur taux de fucose présent sur les chaînes glycaniques . Un anticorps 100% fucosylé correspond à une immunoglobuline dont les deux chaînes glycaniques en position 297 de la chaîne lourde sont totalement fucosylées . Différents échantillons ayant divers taux de fucose ont été étudiés dans le test en présence de cellules cibles et dans le test sans cellules cibles : - un anti-Gpl20 VIH à 100% de fucose,
- ADl (anti-D) à 100% de fucose,
- T125 CHO (anti-D produit dans des cellules CHO) à 81% de fucose, - - R270 (anti-D) à 64% de fucose,
- R297 à 40% de fucose,
- C029-025 à 33% de fucose,
- R297 à 25% de fucose.
Les figures 4A et 4B représentent respectivement les résultats obtenus en présence de cellules cibles dans le test (4A) et en l'absence de cellules cibles mais avec des préparations d'anticorps agrégées au moyen d'un F(ab')2. Quel que soit le test utilisé pour déterminer l'activité des échantillons, il est constaté une diminution de l'activité fonctionnelle des anticorps vis à vis du CDl6 lorsque le taux de fucose augmente. Un anticorps présentant un taux de fucose de 100% comme ADl possède même une activité totalement nulle vis-à-vis de ce récepteur. Cette étude permet de confirmer que le taux de fucose influence la fixation de l'anticorps sur le CDlβ. Une immunoglobuline totalement fucosylée au niveau de l'oligosaccharide de l'asparagine en position 297 de la chaîne lourde empêche toute interaction de l'anticorps avec le CDlβ n'entraînant pas alors son activation.
Exemple 4 : Etude du suivi de la stabilité d' un anticorps monoclonal
Une autre application de ce test est le suivi accéléré de la stabilité d'une préparation thérapeutique placée en conditions dénaturantes (cf figure 5) . Ce suivi est fait sur plusieurs mois par une mesure tous les mois de l'activité de l'échantillon. Cette étude a été réalisée sur l'échantillon n°05-081 placé à 4O0C. Son activité a été testée à différents temps (TO, T+l mois et T+2mois) dans le test avec cellules cibles mais aussi dans le test sans cellules cibles appelé aussi test générique. Le 100% d'activité est déterminé au moyen d'un anticorps de référence (le lot recherche R297 pour le test avec cellules cibles, et, le lot pilote C029-025 pour le test générique) .
Cette étude permet de mettre en évidence une perte d'activité de l'échantillon lorsqu'il est exposé à une température élevée. Cette perte est proportionnelle à. la. durée d'exposition de l'échantillon à- la chaleur. Cette étude montre également que des résultats semblables sont obtenus pour les deux tests . Ces deux tests peuvent donc être utilisés pour les suivis de stabilité au cours du temps de préparations à usage thérapeutique .
Exemple 5 : Comparaison de la production spécifique d' IL-2 par des anticorps agrégés par la chaleur ou par un fragment F (ab) ' 2 dirigé contre un fragment (Fab) ' 2
L'effet dose de préparations d'anticorps monoclonaux anti-D agrégés soit par la chaleur (20 min à 630C), soit par un fragment F(ab); 2 dirigé contre un fragment
(Fab) '2 IgG sur la production d'IL-2 par une lignée
Jurkat recombinée génétiquement pour exprimer le CDl6 a été étudié.
Les anticorps monoclonaux agrégés ont été incubés avec les cellules Jurkat CD16+ pendant 16 heures à 370C avant de doser l'IL-2 dans les surnageants.
Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci- dessous :
Ac monoclonaux Production spécifique d'IL-2 en pg/ml Anti-D (ng/ml) IgG agrégées par la IgG agrégées avec chaleur des F(ab) '2
10 000 2965 8652
5000 897 8190
1000 102 856
500 22 171
0 < 12 <12
Tableau 1
Le tableau 1 montre qu'il existe une relation effet/dose entre la quantité d'IL-2 sécrétée par les cellules dans le surnageant' et la concentration en anticorps monoclonal agrégé présente dans le test, et ceci quelle que soit la méthode utilisée pour agréger l'anticorps monoclonal.
Cependant, on observe que la quantité d 1IL-2 sécrétée par les anticorps monoclonaux agrégés par la chaleur est plus faible que si les anticorps sont agrégés par un anti-F(ab')2 IgG.
BIBLIOGRAPHIE
1. Van Mirre et al. (2004). Monomeric IgG in intravenous Ig préparations is a functional antiagonist of FcgRII and FcgRIIIb. The journal of Immunology ; 332:339
2. Farag S. S., Flinn I. W., Modali R., Lehman T. A., Young D., and Byrd J. C. (2004) Blood, vol. 103, n°4, 1472-1474. 3.Wu J., Edberg J. C, Redecha P. B., Bansal V., Guyre P. M., Coleman K., Salmon J. E., and Kimberly R. P. (1997) J. Clin. Invest. Vol. 100, n°5, 1059-1070.
4. Shields R. L., Lai J., Keck R., O'Connell L: Y., Hong K., Meng Y. G., Weikert S. H. A., and Presta L. G. (2002) J. Biol. Chem. , vol. 277, n°30, 26733-26740.
5. Niwa R., Hatanaka S., Shoji-Hosaka E., Sakurada M., Kobayashi Y., -Uehara A., Yokoi H., Nakamura K., and Shitara K. (2004), Clinical Cancer Research, 10, 6248-6255.
δ.Weiss A., Wiskocil R.L., and Stobo J.D. (1984) J. Immunol., vol. 133, n°l, 123-128.
7. Schneider U., Schwenk H. U., and Bornkamm G. (1977) Int. J. Cancer., vol. 19, n°5, 621-626.

Claims

Revendications
1. Procédé pour mesurer la capacité d'une préparation d',anticorps à activer un récepteur Fc, comprenant : a) l'agrégation desdits anticorps entre eux, b) la mise en contact de cellules exprimant un récepteur Fc avec lesdits anticorps agrégés, et c) la mesure de la réaction desdites cellules résultant de l'activation du récepteur Fc desdites cellules par la région Fc desdits anticorps .
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite agrégation se fait au moyen d'un fragment F(ab')2 anti-IgG.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit fragment F(ab')2 anti-IgG est un anti-Fab ou un anti-F(ab')2 dirigé contre la préparation d'anticorps testée.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite agrégation est une agrégation par la chaleur.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite agrégation est effectuée par cross-linking des régions Fab entre elles ou des chaînes lourdes et légères entre elles .
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit récepteur Fc est sélectionné parmi le CD16 (FcγRIIIa et FcγRIIIb) , le CD32 (FcγRIIa et FcγRIIb) , et le CD64 (FcγRI) .
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites cellules exprimant ledit récepteur Fc sont des cellules transfectées avec le gène codant pour ledit récepteur.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites cellules exprimant ledit récepteur Fc sont des cellules Jurkat exprimant le CDl6 et que cette lignée est cultivée en présence d'un activateur aspécifique de ces cellules comme le PMA (Phorbol 12- Myristate 13-Acétate) .
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mesure de la réaction des cellules résultant de l'activation du récepteur Fc desdites cellules par la région Fc desdits anticorps est une mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par les cellules exprimant ledit récepteur Fc.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la mesure d'au moins une cytokine est réalisée en effectuant un dosage des ARNm desdites cytokines .
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que l'on quantifie au moins une cytokine sélectionnée parmi IL- 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-I, TNFalpha (TNFα) et IFNgamma (IFNγ) .
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que l'on quantifie l ' interleukine IL-2.
.
13. Procédé selon la • revendication 12, -caractérisé en ce que le taux d' interleurkine IL-2 sécrétée est corrélé à une activité du type ADCC.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la mesure de la réaction de la cellule est une mesure de l'influx calcique, de la phosphorylation, des facteurs de transcription ou de l'apoptose.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour évaluer la capacité d'une cellule à produire un anticorps monoclonal capable d' interagir avec le récepteur CDl6.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ladite cellule produisant des anticorps est choisie parmi les cellules CHO, YB2/0, SP2/0, SP2/0-AG14, IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-I, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CH0-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour évaluer l'efficacité et l'intégrité de la région Fc d'anticorps après une ou plusieurs étapes de purification, ou pour suivre la stabilité d'une préparation thérapeutique placée en conditions dénaturantes.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour mesurer la fonctionnalité de la région Fc d'un anticorps'.
19. -Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour évaluer la production d'anticorps monoclonaux par des plantes transgéniques ou des mammifères transgéniques.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour sélectionner des anticorps efficaces pour un traitement thérapeutique.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 pour sélectionner des compositions d'anticorps dont la teneur en fucose est inférieure à 65%, et de manière préférentielle inférieure à 40%.
22. Procédé de préparation d'une composition d'anticorps monoclonaux capable d'activer le récepteur CD16 (FcγRIII) comprenant les étapes suivantes :
a) obtention d'anticorps monoclonaux à partir d'hybridome, d'hétérohybridome, ou de toute lignée cellulaire animale, végétale ou humaine transfectée à l'aide d'un ou plusieurs vecteurs de manière à exprimer ledit anticorps, b) agrégation des anticorps obtenus à l'étape a) par un fragment F(ab')2 anti-IgG, c) addition des anticorps obtenu à l'étape b) dans un mélange réactionnel comprenant : a. des cellules effectrices comprenant des cellules exprimant le récepteur CD16 (FcγRIII), b. du Phorbol 12-Myristate 13-Acétate d) ' mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la .cellule exprimant le CDl6, e) sélection de la ou des compositions d'anticorps pour lesquelles on mesure une augmentation supérieure à 0,5, 1, 2, 5, 10, 100 ou à 500 fois de la quantité de cytokine mesurée par rapport au contrôle en absence d'anticorps ou en présence d'un anticorps donné comme référence négative.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la mesure de la quantité d'au moins une cytokine produite par la cellule exprimant le CD16 est une mesure de la quantité d'IL-2 produite par la cellule exprimant le CDl6.
24. Kit pour la mise en œuvre d'un test biologique de mesure de l'activité d'anticorps thérapeutiques comprenant (i) des moyens d'agrégation desdits anticorps thérapeutiques, (ii) des cellules capables d'exprimer un récepteur Fc, (iii) des moyens de mesure de la réaction desdites cellules capables d'exprimer un récepteur Fc lorsque le récepteur Fc desdites cellules est activé par la région Fc desdits anticorps, et (iv) les autres éléments nécessaires à la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes .
25. Kit pour la mise en œuvre d'un test biologique de mesure de l'activité d'anticorps thérapeutiques selon la revendication 24, caractérisé en ce que les moyens de mesure de la réaction desdites cellules sont des moyens de quantification d'au moins une cytokine produite par lesdites cellules.
26. Kit pour la mise en œuvre d'un test biologique de mesure de l'activité d'anticorps thérapeutiques selon la revendication 25, caractérisé en ce que les moyens de quantification d'au moins une cytokine sont des moyens de dosage des ARNm desdites cytokines .
27. Kit pour la mise en œuvre d'un test biologique de mesure de l'activité d'anticorps thérapeutiques selon la revendication 24, caractérisé en ce que les moyens de mesure de la réaction desdites cellules sont des moyens de mesure .de 1 ' influx calcique, de la phosphorylation, des facteurs de transcription ou de l'apoptose.
PCT/FR2006/002744 2005-12-16 2006-12-15 Test des caracterisations des anticorps Ceased WO2007080274A1 (fr)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008545044A JP2009519455A (ja) 2005-12-16 2006-12-15 抗体評価試験
US12/097,084 US20090176220A1 (en) 2005-12-16 2006-12-15 Antibody characterization test
CA002633321A CA2633321A1 (fr) 2005-12-16 2006-12-15 Test des caracterisations des anticorps
BRPI0621019A BRPI0621019A2 (pt) 2005-12-16 2006-12-15 teste de caracterização de anticorpos
EP06841947A EP1977251A1 (fr) 2005-12-16 2006-12-15 Test des caracterisations des anticorps
AU2006334549A AU2006334549A1 (en) 2005-12-16 2006-12-15 Antibody characterization test
IL192141A IL192141A0 (en) 2005-12-16 2008-06-12 Antibody characterization test

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0512813 2005-12-16
FR0512813A FR2894983B1 (fr) 2005-12-16 2005-12-16 Test de caracterisation des anticorps.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007080274A1 true WO2007080274A1 (fr) 2007-07-19

Family

ID=36809043

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2006/002744 Ceased WO2007080274A1 (fr) 2005-12-16 2006-12-15 Test des caracterisations des anticorps

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20090176220A1 (fr)
EP (1) EP1977251A1 (fr)
JP (1) JP2009519455A (fr)
KR (1) KR20080094777A (fr)
CN (1) CN101375165A (fr)
AU (1) AU2006334549A1 (fr)
BR (1) BRPI0621019A2 (fr)
CA (1) CA2633321A1 (fr)
FR (1) FR2894983B1 (fr)
IL (1) IL192141A0 (fr)
WO (1) WO2007080274A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013038113A1 (fr) * 2011-09-16 2013-03-21 Cisbio Bioassays Procede de determination de la glycosylation d'un anticorps

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2915398B1 (fr) * 2007-04-25 2012-12-28 Lab Francais Du Fractionnement "ensemble de moyens pour le traitement d'une pathologie maligne, d'une maladie auto-immune ou d'une maladie infectieuse"
EP2233500A1 (fr) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Variantes Fc optimisées
WO2015048413A1 (fr) * 2013-09-30 2015-04-02 X-Body Biosciences, Inc. Dosage pour le criblage de récepteur d'antigène

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1298219A1 (fr) * 2000-07-04 2003-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Proc d pour l'essai de la fonction du fragment fc d'un anticorps
US20040002587A1 (en) * 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
FR2844521A1 (fr) * 2002-09-13 2004-03-19 Lab Francais Du Fractionnement Mesure de la production de cytokines comme marqueur d'activation de cellules effectrices
WO2005070963A1 (fr) * 2004-01-12 2005-08-04 Applied Molecular Evolution, Inc Variants de la region fc

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0091760B1 (fr) * 1982-04-09 1986-07-02 FUJIREBIO KABUSHIKI KAISHA also trading as FUJIREBIO INC. Anticorps anti-immunocomplexe et sa préparation
EP1646401A4 (fr) * 2003-06-30 2007-07-18 Bio Technology General Israel Anticorps humains specifiques

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1298219A1 (fr) * 2000-07-04 2003-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Proc d pour l'essai de la fonction du fragment fc d'un anticorps
US20040002587A1 (en) * 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
FR2844521A1 (fr) * 2002-09-13 2004-03-19 Lab Francais Du Fractionnement Mesure de la production de cytokines comme marqueur d'activation de cellules effectrices
WO2005070963A1 (fr) * 2004-01-12 2005-08-04 Applied Molecular Evolution, Inc Variants de la region fc

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HODONICZKY JASON ET AL: "Control of recombinant monoclonal antibody effector functions by Fc N-glycan remodeling in vitro", BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. 21, no. 6, 7 October 2005 (2005-10-07), pages 1644 - 1652, XP002395988, ISSN: 8756-7938 *
MARSH C B ET AL: "MONOCYTE FCGAMMA RECEPTOR CROSS-LINKING INDUCES IL-8 PRODUCTION", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS CO. BALTIMORE, US, vol. 155, 1995, pages 3161 - 3167, XP002945688, ISSN: 0022-1767 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013038113A1 (fr) * 2011-09-16 2013-03-21 Cisbio Bioassays Procede de determination de la glycosylation d'un anticorps
FR2980271A1 (fr) * 2011-09-16 2013-03-22 Cisbio Bioassays Procede de determination de la glycosylation d'un anticorps
CN103959063A (zh) * 2011-09-16 2014-07-30 Cisbio生物试验公司 用于对抗体的糖基化进行测定的方法
CN103959063B (zh) * 2011-09-16 2016-11-09 Cisbio生物试验公司 用于对抗体的糖基化进行测定的方法
US9880176B2 (en) 2011-09-16 2018-01-30 Cisbio Bioassays Method for determining the glycosylation of an antibody

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0621019A2 (pt) 2016-08-30
CN101375165A (zh) 2009-02-25
CA2633321A1 (fr) 2007-07-19
US20090176220A1 (en) 2009-07-09
IL192141A0 (en) 2008-12-29
AU2006334549A1 (en) 2007-07-19
KR20080094777A (ko) 2008-10-24
JP2009519455A (ja) 2009-05-14
FR2894983A1 (fr) 2007-06-22
FR2894983B1 (fr) 2012-08-17
EP1977251A1 (fr) 2008-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1824887B1 (fr) Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoïetiques lymphoïdes de type b
JP6309940B2 (ja) インスリン受容体結合抗体
TWI485160B (zh) 抗cd6單株抗體於治療疾病之用途
JP5885664B2 (ja) スクリーニング法
EP2062047B1 (fr) Methode d&#39;investigation de la reponse a un traitement par un anticorps monoclonal
WO2016156450A1 (fr) Anticorps monoclonaux anti-cd303
JP2020512359A5 (fr)
EP1648513A2 (fr) Utilisation d&#39;anticorps anti-rhesus de produits dans la lignee yb2/0
KR102594943B1 (ko) 혈관신생 저해제와 조합하여 사용하기 위한 항t세포 항원 결합 분자
EP3464359A1 (fr) Anticorps pour le traitement de cancers
EP1977251A1 (fr) Test des caracterisations des anticorps
EP1537419B1 (fr) Procédé d&#39;évaluation de l&#39;efficacité ADCC médiée par le CD16 d&#39;anticorps monoclonaux ou polyclonaux
JP6274542B2 (ja) 抗ｃｄ４抗体を有効成分とする抗がん剤の治療効果を判定する方法
Yadav et al. HIV-1 transgenic rat CD4+ T cells develop decreased CD28 responsiveness and suboptimal Lck tyrosine dephosphorylation following activation
FR2844521A1 (fr) Mesure de la production de cytokines comme marqueur d&#39;activation de cellules effectrices
JP2023552762A (ja) Ｃｄ６ｈｉｇｈ細胞を選択的に標的化してｔｅｆｆ細胞の活性を低下する方法
Getahun et al. IgG-and IgE-mediated antigen presentation on MHC class II
FR2861078A1 (fr) NOUVELLES IgG3 UTILES POUR STIMULER LA PHAGOCYTOSE
EP1933137A1 (fr) Méthode d&#39;investigation de la réponse à un traitement par un anticorps monoclonal
Tashiro et al. An asymmetric antibody repertoire is shaped between plasmablasts and plasma
EP1969368A2 (fr) Potentialisation de l&#39; apoptose par des anticorps monoclonaux

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008545044

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006334549

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 5143/DELNP/2008

Country of ref document: IN

Ref document number: 2633321

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006334549

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20061215

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006334549

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020087016838

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006841947

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680052870.7

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12097084

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0621019

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20080616