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WO2007076974A2 - Method for the production of a chemically modified protein - Google Patents

Method for the production of a chemically modified protein Download PDF

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WO2007076974A2
WO2007076974A2 PCT/EP2006/012434 EP2006012434W WO2007076974A2 WO 2007076974 A2 WO2007076974 A2 WO 2007076974A2 EP 2006012434 W EP2006012434 W EP 2006012434W WO 2007076974 A2 WO2007076974 A2 WO 2007076974A2
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WO
WIPO (PCT)
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protein
modified
intein
group
modification
Prior art date
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Ceased
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PCT/EP2006/012434
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French (fr)
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WO2007076974A3 (en
Inventor
Henning Mootz
Thomas Kurpiers
Christina Ludwig
Steffen Brenzel
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Philipps Universitaet Marburg
Original Assignee
Philipps Universitaet Marburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Philipps Universitaet Marburg filed Critical Philipps Universitaet Marburg
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Publication of WO2007076974A3 publication Critical patent/WO2007076974A3/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1075—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of amino acids or peptide residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a two-stage process for the preparation of a chemically modified protein.
  • NCL Native chemical ligation
  • EPL expressed protein ligation
  • the modification of cysteines is not regioselective, ie, if more cysteines are present in the protein, as is almost always the case with larger proteins, all cysteines will undergo this reaction , This is often problematic, for example when another cysteine is important for the activity of the protein or when a regioselective and stoichiometrically defined modification is to be made. Therefore, a method is presented according to the invention, in which the synthesis of the modified protein is divided into two process steps. Only in the first step, the modification of the intein auxiliary protein, the modification of the cysteine plays a role. Since this step is a well-defined intein auxiliary protein that contains only a single cysteine, this eliminates the problem of lack of selectivity.
  • the subject of the process according to the invention is the preparation of a chemically modified protein in which in a first method step, an auxiliary protein carrying a reactive functional group consisting of an intein fragment and an exine sequence, modified with a group to be introduced into the target protein, and
  • a target protein which is to be modified and fused with a complementary intein fragment is reacted so that the modified extein sequence is linked to the target protein.
  • an auxiliary protein which contains an integer C is used in the method according to the invention in the first method step.
  • the method according to the invention can also be designed such that in the first method step a protein is used which contains an intein N and the target protein used in the second method step is fused with an intein C.
  • the reactive functional group of the auxiliary protein is an SH group. Since the SH group reacts with a maleimide or a haloacetamide in a very simple and clear manner, it is very advantageous to introduce the group to be introduced into the target protein bound to a maleimide or a haloacetamide having one SH group carrying auxiliary protein to modify.
  • the group to be introduced into the target protein if it is to serve as a label, e.g. a fluorophore residue, a biotin residue, an oligonucleotide residue or a radioactive residue.
  • auxiliary protein If an integer C is used as auxiliary protein, then the extra-sequence must consist of at least two amino acids. If, on the other hand, an auxiliary protein is used which contains an intein N, then the extein sequence contained in the auxiliary protein must have at least one amino acid.
  • the crucial step of the present invention is the use of the conventional chemical modification of cysteine in proteins, without the To accept the disadvantages of non-specificity.
  • the reaction is illustrated by the reaction scheme shown in Fig. 1:
  • a protein (auxiliary protein, "Intein C-cystag”) containing only one cysteine is modified by the method described above, and the resulting protein modification, the protein "In C-cystag” modification, is then transformed into purified form reacted with the actual target protein, which in turn was previously partially fused with an intein ("target protein Intein N").
  • target protein Intein N an intein
  • the intein N and intein C halves then interact to form the active intein, which cuts itself out autocatalytically through the process of protein splicing, thereby involving the fused sequences ("target protein” and “cystag modification”) a peptide bond linked together.
  • the principle of the invention is illustrated in FIG.
  • the advantage of this reaction is that additional cysteines contained in the "target protein” are unaffected by this reaction, so the chemical reaction at the "cystag” is regioselectively linked to the target protein, at the C-terminus of the target protein.
  • the "cystag” is a sequence of a few amino acids, which has the advantage that the further modification of the target protein with only a few amino acids, which is worth to carry out the method, is minimal
  • the C-extein sequence may also have a longer sequence, such as, for example, an affinity chromatography a larger part of a protein.
  • intein parts N and C are known and have been developed starting from the Ssp DnaB Intein.
  • two different intein N and intein C parts of the Ssp DnaB mini-link were obtained by genetic engineering methods corresponding to a split of the intein at two different sites.
  • cleavage sites are the sites SO and S1 as reported by Sun et al. in the Journal of Biological Chemistry, (2004), 279: 35281 to 35286.
  • the cleavage site SO was first described by Wu et al., Journal of Biological Chemistry, (1998), 1387: 422-432.
  • the intein halves intein C (SO) and intein C (S1) were prepared as purified, recombinant polypeptides with the "cystag" as C-extein sequence In the auxiliary protein Intein C (SiO), the remaining cysteine at position 50 of the intein
  • the complementary intein halves intein N (SO) and intein N (S1) were fused to the respective target protein.
  • the present invention is not limited to the aforementioned inteins but may be extended to other inteins. All inteins which have no cysteine as the catalytic N- or C-nucleophile but have a serine or threonine and which can be cleaved into active intein N and intein C halides are suitable for this purpose. Further cysteines occurring within the intein must then be removed by mutagenesis if necessary.
  • the method according to the invention can also be carried out by linking an intein N-half to a cystag (see FIG. 1b). Then the target protein can be modified at its N-terminus.
  • a cleaved intein whose catalytic N-nucleophile is serine, and which otherwise contains no cysteine residues, is the Psp-GBD PoM intein described by Southworth et al., EMBO Journal (1998), 17: 918-926 This integer half complies with all requirements if it is appropriately provided with a cystag and modified according to the invention.
  • the products produced by the process of the invention can be distinguished from the products made by the chemical ligation method.
  • the modification reagent for example, fluorescein-maleimide
  • the modification reagent is at the side chain a cysteine residue at the C-terminus or N-terminus of the protein coupled, while possibly. Additional cysteine present in the protein unmodified. This is usually not the case with the previously known methods.
  • the hitherto customary biophysical probes such as fluorophores, biotin, oligonucleotides can be linked to proteins or proteins can be attached to solid phases such as chips and microarrays as well as to synthetic cofactors, but also therapeutically and diagnostically interesting proteins can be produced.
  • These usually have to carry the numerous post-translational modifications that the human body makes to them in order to be biologically and medically effective.
  • synthetic modification of proteins which contribute to the stability and thus longer residence time in the body. Such modifications can also be introduced according to the invention into proteins using the present method.
  • Glycosylations Glycosylations, phosphorylations, acetylations, isoprenylations, farnesylations, lipoylations, myristoylations, palmitoylations, polyethylene glycolylations and the incorporation of chelating agents for metal ions such as technetium for the visualization or irradiation of tumors.
  • pMST Ssp DnaB mini- Intein from pMST (Wu et al., Biochimica et Biophysica Acta 1387 (1998) 422-432).
  • pMST served as a template for a polymerase chain reaction (PCR), wherein the C-terminal part of the DnaB intein (DnaB c ) of the cleavage site SO correspondingly using the oligonucleotides 5'-ATACCATGGGCACTAGTTCACCAGAAATAGAAAAGTTGTC-3 '(recognition sequences of the restriction endonucleases ⁇ / col and Spei are underlined) and ⁇ '-ATAGGTACCAGATCTAATACTGTTATGGACAAT-GATGTC-S '(Kpn ⁇ , BgIW) was amplified.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the purified PCR fragment was then cut with ⁇ / col and BgIW.
  • the resulting fragment was subsequently ligated by means of T4 DNA ligase into the similarly prepared vector pQE60 (Qia gene).
  • the vector pTK048 was obtained.
  • the starting plasmid pTK048 served as a DNA template for a PCR with the two oligonucleotides oHM116 (5'-ATA CCA TGG GCA CTA GTT CAC CAG / VAA TAG AAA AGT TGT C-3 ', ⁇ / col, Spei) and oTK14 (5 '-ATA AGA TCT ACC GCA ACC CTG TTC GAT ACT GTT ATG GAC AAT GAT G-3', BgIW) containing the DnaB c coding fragment with the extein SEQUGCGRSHHHHH sequence.
  • Plasmids pTK048 and pTK049 were cut with the restriction enzymes Spei and Hin ⁇ W ⁇ and the insert ligated into the Xba ⁇ and HindWl-treated vector pHM45 (Mootz et al., J. Am. Chem. Soc.
  • the expression plasmids for the fusion proteins with the N-terminal intein fragment DnaB N were prepared from plasmid pSB13.
  • pTK056 could be obtained (coding for MBP-DnaB N -His 6 ).
  • pTK060 (encoding TyrA-PCP-DnaB N -His 6 ) was recovered after removal of the MBP-encoding fragment in pTK056 by ⁇ / col and / ⁇ coRI treatment followed by ligation with a fragment encoding TyrA-PCP.
  • the latter was amplified by PCR with the oligonucleotides oTL02 (5'-TTT TCC ATG GCG TTG TCC GAG ATC ACC ATG-3 ', ⁇ / col) and oTK19 (5'-ATA GAA TTC TCC GCT CGT GGC GAC ATA CTG GGC CAA CGC- 3 ', EcoRI) from the construct pCLA-PCP2b1 amplified.
  • the construct pCLA-PCP2b1 was isolated from Bacillus brevis chromosomal DNA using primers OTL02 (5'-TTT TCC ATG GCG TTG TCC GAG ATC ACC ATG-3 ', ⁇ / col) and OTL03 (5'-AAA AAG ATC TCG TGG CGA CAT ACT GG-3 ', BgIW) in the vector pQE60 cloned.
  • TyrA-PCP is the tyrosine activating adenylation domain and corresponding non-ribosomal peptidyl carrier protein domain (PCP).
  • Tyrocidin synthetase TycC3 (Mootz and Marahiel, J. Bacteriol. (1997) 179: 6843-6850). This protein contains six cysteine residues, which would also lead to unwanted side reactions under conventional sulfhydryl labeling of proteins.
  • E. coli BL21 cells were transformed with the corresponding plasmids pTK053, pTK054, pTK055, pTK056 and pTK060.
  • the resulting expression strains were grown in a preculture (LB medium with ampicillin (100 ⁇ g / ml) and for the MBP-containing proteins with additional 0.2% glucose) overnight at 37 ° C. and 250 rpm. 6 ml of the respective preculture were used to inoculate 600 ml of the same medium. After the cell cultures at 37 0 C and 250 rpm to an optical density (OD 6 oo nm) reached approximately 0.7, the temperature was lowered to 30 ° C and the production of proteins by the addition of isopropyl - /? - D -thiogalactopyranoside in a final concentration of 0.4 mM.
  • the cells were pelleted by centrifugation after 3-4 hours, the supernatant discarded, and the cell pellet resuspended in wash buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8.0) with 5 mM imidazole.
  • wash buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8.0
  • the digestion of the cells was carried out by 2 passes with an emulsifier (A vestin EmulsiFlex C-5).
  • the insoluble cell constituents were separated by centrifugation at 30,000 g (15 min) and the soluble fraction was then applied to an equilibrated Ni 2+ -NTA gravity flow column (Qiagen company, bed volume about 2 ml).
  • the washing steps were carried out with 50 ml washing buffer with 5 mM imidazole, 30 ml washing buffer with 20 mM imidazole and 10 ml washing buffer with 40 mM imidazole.
  • the bound proteins were then eluted with wash buffer with 250 mM imidazole.
  • the fusion proteins which also contained MBP, were then dialyzed against amylose buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4) and applied to an equilibrated amylose column (New England Biolabs, bed volume about 4 mL).
  • the proteins were finally eluted with amylose buffer with 10 mM maltose.
  • the pooled fractions with the respective purified protein were assayed against splice buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 10% glycerol, pH 7.0) or against modification buffer (20-50 mM phosphate, 150 mM NaCl , 7.2), dialyzed 10% glycerol, pH, and then frozen until further use at -80 0 C.
  • splice buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 10% glycerol, pH 7.0
  • modification buffer 20-50 mM phosphate, 150 mM NaCl , 7.2
  • the splicing reactions were carried out at 25 0 C in Spl bosspuffer wherein DTT was added fresh immediately before the reaction (final concentration 2 mM).
  • An intein construct was placed in splice buffer and the reaction started by addition of the corresponding other infusion protein. The final concentration of proteins was adjusted to 2 ⁇ M unless otherwise stated.
  • the splicing reactions were stopped by addition of 10 ⁇ l of 4x SDS buffer (500 mM Tris / HCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% glycerol, 20% ⁇ -mercaptoethanol, 5 mg / mL bromophenol blue) to 30 ⁇ L aliquots of the splice mixture ,
  • the modification reactions were carried out with the corresponding proteins and the respective modification reagent at 25 ° C. and protected from light.
  • the protein to be modified was used in concentrations of 10-40 ⁇ M, mixed with the 10-fold molar excess of tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) in modification buffer and then mixed with a 10-25-fold molar excess of modification reagent.
  • Modification reactions were performed after 120 min by addition of 1 mM (final concentration) DTT, 1 mM (final concentration) of ⁇ - Mercaptoethanol, or the 0.25-fold volume 4xSDS sample buffer stopped.
  • the modification reaction with various reagents are described in detail below.
  • the modification reaction was stopped with 1 mM DTT (10 min) and used with the corresponding N-terminal intein construct in splice buffer for splicing reaction.
  • the modification reactions were stopped with the 0.25-fold volume of 4x SDS sample buffer, applied directly to an SDS gel, and then the gel was applied on a UV screen (312 nm) or using Coomassie -Brilliant-Blue staining analyzed. Fig.
  • a fresh 10 mM stock solution of BM in modification buffer was prepared.
  • the proteins TK095 and TK097 to be modified were each initially introduced in concentrations of 10-40 ⁇ M and added with 10 times the molar amount of TCEP for 5 minutes 25 ° C preincubated. Subsequently, the 15-fold molar amount of BM was added and the reaction mixture incubated for a further 2 hours at 25 ° C protected from light.
  • Fig. 4 schematically shows the modification reaction of the Cys-tag constructs with BM.
  • the reaction mixture was dialyzed against avidin column buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) to separate excess BM.
  • the dialyzed protein was loaded onto an equilibrated soft-link soft-elute avidin column (Promega), washed with 10-fold column volumes of avidin column buffer and the biotinylated protein then eluted with avidin column buffer (+ 10 mM biotin).
  • the SDS-gel of purification, as well as the mass determination of the eluted, biotinylated protein TK095 are shown in Fig. 5.
  • the modification reagent was dissolved in DMF and then adjusted to 10 mM with modification buffer (final concentration DMF 2% (v / v) in modification buffer).
  • the proteins to be modified were reduced with 10 times the molar amount of TCEP for 5 minutes, then mixed with 25 times the molar amount of 5-IAF and incubated protected from light for a further 2 hours.
  • the analysis of the course of the reaction was carried out as described for the modification with FM and is shown in FIG.
  • the modified protein TK095 was then used for the splicing reaction.
  • splicing reaction For the splicing reaction, the unmodified protein TK095 was presented in splicing buffer. The reaction was then started by adding the protein TK115, or TK117. The final concentrations of the two proteins were 2 ⁇ M each. After different time points, an aliquot was removed from the reaction and the reaction was stopped by adding 4xSDS sample buffer. stops.
  • the splicing reaction of TK095 and TK115 is shown schematically in Fig. 8 and the associated analysis by SDS-PAGE followed by densitometric evaluation in Fig. 9.
  • the C-terminal intein construct TK095 was modified with 5IAF, FM, or BM as described above and optionally purified.
  • the modified protein was then introduced into splicing buffer and the splicing reaction was started by addition of the N-terminal intein construct (TK115 or TK117).
  • the concentration of the two proteins was 2 or 4 ⁇ M in each case.
  • samples were taken for analysis by SDS-PAGE.
  • the splicing reaction was monitored by monitoring the bands on a UV screen (for the 5IAF and FM modified proteins only), by Coomassie staining, and by mass spectrometric analysis.
  • Fig. 10 shows schematically the reaction of modified TK095 with TK115.
  • Figures 11a and 11b show the analysis of the reactions by UV irradiation of the reaction mixture separated by SDS-PAGE.
  • the modified target protein could be detected by the corresponding band in the SDS-PAGE gel, as shown in Fig. 11 by the splicing reactions of TK095 modified with FM (Fig. 11a) and 5IAF (Fig. 11 b).
  • Figure 11c shows a mass spectrometric analysis (ESI-MS) of the reaction mixture of TK115 with TK095 / FM.
  • ESI-MS mass spectrometric analysis
  • the fluorescein-modified splicing product MBP-Cys (FM) -His is clearly detected.
  • Figure 12 shows the analysis of the response of TK117 with TK095 / 5IAF.
  • TyrA-PCP-Cys (5IAF) -His carries the fluorescent marker.
  • Figure 13 shows the analysis of the splicing reactions using Coomassie stained SDS-PAGE gels of biotinylated and purified proteins according to Figure 5 TK095 / BM and TK097 / BM with TK115 and TK117.
  • FIGS. 2 to 13 are shown in FIGS. 2 to 13:
  • Figure 2 shows the schematic representation of the modification reaction of the C-terminal intein Cys-tag constructs TK095 and TK097 with fluorescein-5-maleimide (FM).
  • FIG. 3a shows SDS-PAGE
  • Figure 4 shows the schematic representation of the modification reaction of the C-terminal intein Cys-tag constructs TK095 and TK097 with maleimide PEO 2 - biotin (BM).
  • Figure 5 a shows Coomassie stained SDS gel of purification
  • Figure 5b shows mass determination of the eluted, biotinylated protein TK095 / BM.
  • ESI-MS Mass spectrometric analysis
  • FIG 6 shows the schematic of the modification reaction with 5-iodoacetamidofluorescein (5IAF).
  • FIG. 7a shows SDS-PAGE
  • Figure 8 shows the schematic of the splicing reaction of TK115 and unmodified TK095.
  • the two resulting N- and C-terminal intein splice products are also shown.
  • Figure 9 b shows densitometric analysis of the splice bands, whereby the decrease in the educt band of TK115 at 56.4 kDa and the increase in the E5 edge of the splicing product MBP-Cys-His were observed at 44.8 kDa.
  • Figure 10 shows the schematic representation of the splicing reaction of TK115 with TK095 previously modified with 5IAF.
  • Figure 11 a) shows SDS-PAGE of the splicing reaction of TK115 with TK095 previously modified with fluorescein-5-maleimide, showing the modified protein TK095 / FM and the splicing reaction with TK115 after 0, 1 and 2h.
  • FIG 11 b shows SDS-GeI of the splicing reaction of TK115 with TK095 modified with 5-iodoacetamidofluorescein.
  • the SDS gels were analyzed on a UV screen.
  • the newly arising splicing product MBP-Cys (FM, or 5IAF) -HiS is highlighted by an arrow.
  • Figure 12 shows SDS-PAGE analysis of the splicing reaction of TK117 with the modified protein TK095 / 5IAF. In each case, the progress of the splicing reaction after one hour is shown. Both the gel before Coomassie staining under UV light (left) and the same Coomassie stained SDS gel (right) are shown.
  • Figure 13 shows SDS-PAGE analysis (Coomassie staining) of the splicing reaction of the purified, biotinylated proteins TK095 and TK097. Shown are the splicing reactions after 2 h. The splicing reactions with TK115 (left) show the respective newly formed bands of the splicing products MBP-SIEQGC (BM) GRS-HiS (45.3 kDa) and MBP-SIRSC (BM) G-HiS (44.9 kDa) , In the case of splicing reactions with TK117 (right), the splice products of the calculated quantities (TyrA-PCP-SIEQGC (BM) GRS-His (69.2 kDa) or TyrA-PCP-SIRSC (BM) G-His ( 68.9 kDa)).

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Abstract

Disclosed is a method for producing a chemically modified protein, in which an auxiliary protein that carries a reactive, functional group and is composed of an intein fragment and an extein sequence is modified with a group to be introduced into the target protein in a first step, and a target protein that is fused with the intein fragment to be modified and with a complementary intein fragment is reacted in a second step such that the modified extein sequence is combined with the target protein.

Description

Verfahren zur Herstellung eines chemisch modifizierten ProteinsProcess for the preparation of a chemically modified protein

Gegenstand der Erfindung ist ein zweistufiges Verfahren zur Herstellung eines chemisch modifizierten Proteins.The invention relates to a two-stage process for the preparation of a chemically modified protein.

Es gibt bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten Proteinen. Eines der wichtigsten, das in spezieller Form auch der vorlie- genden Erfindung zugrunde liegt, ist die Ausnutzung der besonderen Nukle- ophilie der Cystein-Seitenkette in Proteinen. Die Sulfhydrylgruppe kann bekanntlich chemo-selektiv mit einigen üblichen Chemikalien modifiziert werden, zum Beispiel mit Verbindungen, die eine Maleinimid- oder eine oHalo- acetamidofunktionalität enthalten. Ein Vorteil dieser Methode ist die Einfachheit der Durchführung und die Vielzahl der hierfür geeigneten, kommerziell erhältlichen Reagenzien. Andere Methoden sind technisch wesentlich aufwendiger, wie zum Beispiel die Generierung des C-terminalen Thioesters des Zielproteins und die anschließende chemische Ligation mit einem synthetischen Peptid, welches ein N-terminales Cystein trägt. Diese Reaktion ist in der Literatur auch unter den Bezeichnungen „native chemical ligation (NCL)" und „expressed protein ligation (EPL)" bekannt. Sie kann ebenso für die chemo- wie für die regio- selektive Modifikation von Proteinen verwendet werden und ist in dem Übersichtsartikel von Goody et al. ChemBioChem, (2002), 3: 399 - 403 beschrieben. Bei dieser Reaktion werden Inteine eingesetzt, um aus dem gewünschten, zu modifizierenden Zielprotein zunächst einen C-terminalen Thioester zu erzeugen. Dieses Zwischenprodukt wird dann mit einem synthetischen Peptid umgesetzt, so dass eine kovalente Peptidbindung zwischen dem Zielprotein und dem Peptid erzeugt wird. Dafür muss das synthetische Peptid ein N-terminales Cystein aufweisen.There are already various processes for the production of chemically modified proteins. One of the most important, which is also the basis of the present invention in a special form, is the exploitation of the particular nucleophilicity of the cysteine side chain in proteins. The sulfhydryl group is known to be chemo-selectively modified with some common chemicals, for example, with compounds containing a maleimide or an o-haloacetamido functionality. An advantage of this method is the simplicity of the implementation and the variety of suitable, commercially available reagents. Other methods are technically much more expensive, such as the generation of the C-terminal thioester of the target protein and the subsequent chemical ligation with a synthetic peptide carrying an N-terminal cysteine. This reaction is also known in the literature under the terms "native chemical ligation (NCL)" and "expressed protein ligation (EPL)". It can also be used for the chemo- as well as for the regioselective modification of proteins and is described in the review article by Goody et al. ChemBioChem, (2002), 3: 399-403. Inteine is used in this reaction to first generate a C-terminal thioester from the desired target protein to be modified. This intermediate is then reacted with a synthetic peptide to generate a covalent peptide bond between the target protein and the peptide. For this, the synthetic peptide must have an N-terminal cysteine.

In zahlreichen Patentschriften sind bereits Proteinsynthesen beschrieben, die auf der Vereinigung von zwei Intein-Hälften zu einem aktiven Intein beruhen.Many patents already describe protein syntheses based on the union of two intein halves into an active intein.

- Zur Synthese von zyklischen Proteinen und Peptiden wird dieses Verfahren in den internationalen Patentanmeldungen WO 00/36093 und WO 01/57183 eingesetzt. Die Kombination unterschiedlicher Peptidketten mit Hilfe von gespleiß- ten Inteinen ist in den US-Patentanmeldungen 2002/017769 A1 , US 2003/0003439 A1 , US 2003/0003506 A1 , US 2003/0013148 A1 und US 2004/0166561 A1 beschrieben. Die Nutzung dieser Reaktion zur regioselekti- ven Einführung spezieller Sonden oder therapeutisch sowie diagnostisch wichtiger Gruppen in Proteine und die damit verbundenen besonderen Vorteile sind dort allerdings nicht erwähnt.For the synthesis of cyclic proteins and peptides, this method is described in International Patent Applications WO 00/36093 and WO 01/57183. The combination of different peptide chains with the aid of spliced inteins is described in US patent applications 2002/017769 A1, US 2003/0003439 A1, US 2003/0003506 A1, US 2003/0013148 A1 and US 2004/0166561 A1. However, the use of this reaction for the regioselective introduction of special probes or therapeutically and diagnostically important groups into proteins and the associated special advantages are not mentioned there.

Aus der Publikation von Giriat und Muir, Journal of the American Chemical Society, (2003), 125: 7180 bis 7181 ist außerdem bereits eine Proteinsynthese bekannt, bei der ein gespaltenes Intein aus zwei Teilen hergestellt wird, von denen ein Teil vollständig synthetisch präpariert wird. Durch die Reaktion der beiden Intein-Teile miteinander kann so eine Modifikation des Zielproteins mit chemischen Gruppen erreicht werden.Moreover, from the publication by Giriat and Muir, Journal of the American Chemical Society, (2003), 125: 7180 to 7181, a protein synthesis is already known in which a split intein is prepared from two parts, a part of which is prepared completely synthetically , As a result of the reaction of the two intein parts with one another, a modification of the target protein with chemical groups can be achieved.

Bei den vorstehend genannten Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten Proteinen ist die Modifikation von Cysteinen allerdings nicht regioselek- tiv, d.h., wenn weitere Cysteine im Protein vorliegen, wie es bei größeren Prote- inen fast immer der Fall ist, werden alle Cysteine diese Reaktion eingehen. Das ist häufig problematisch, zum Beispiel wenn ein anderes Cystein wichtig für die Aktivität des Proteins ist oder wenn eine regioselektive und stöchiometrisch definierte Modifikation vorgenommen werden soll. Deshalb wird erfindungsgemäß ein Verfahren vorgestellt, bei dem die Synthese des modifizierten Proteins in zwei Verfahrensschritte aufgeteilt ist. Dabei spielt nur im ersten Schritt, der Modifikation des Intein-Hilfsproteins, die Modifikation des Cysteins eine Rolle. Da es sich bei diesem Schritt um ein genau definiertes Intein-Hilfsprotein handelt, das nur ein einziges Cystein enthält, entfällt hierbei das Problem der mangelnden Selektivität.However, in the above-mentioned methods for the production of chemically modified proteins, the modification of cysteines is not regioselective, ie, if more cysteines are present in the protein, as is almost always the case with larger proteins, all cysteines will undergo this reaction , This is often problematic, for example when another cysteine is important for the activity of the protein or when a regioselective and stoichiometrically defined modification is to be made. Therefore, a method is presented according to the invention, in which the synthesis of the modified protein is divided into two process steps. Only in the first step, the modification of the intein auxiliary protein, the modification of the cysteine plays a role. Since this step is a well-defined intein auxiliary protein that contains only a single cysteine, this eliminates the problem of lack of selectivity.

Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Herstellung eines chemisch modifizierten Proteins bei dem man in einem ersten Verfahrensschritt ein eine reaktive, funktionelle Gruppe tragendes Hilfsprotein, welches aus einem Inteinfragment und einer Ex- teinsequenz besteht, mit einer in das Zielprotein einzuführenden Gruppe modifiziert undThe subject of the process according to the invention is the preparation of a chemically modified protein in which in a first method step, an auxiliary protein carrying a reactive functional group consisting of an intein fragment and an exine sequence, modified with a group to be introduced into the target protein, and

in einem zweiten Verfahrensschritt ein mit dem zu modifizierenden und mit einem komplementären Inteinfragment fusioniertes Zielprotein umsetzt, so dass die modifizierte Exteinsequenz mit dem Zielprotein verbunden wird.in a second process step, a target protein which is to be modified and fused with a complementary intein fragment is reacted so that the modified extein sequence is linked to the target protein.

Im Allgemeinen wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren im ersten Verfahrensschritt ein Hilfsprotein eingesetzt, das ein lntein C enthält. Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch auch so gestaltet werden, dass im ersten Verfahrensschritt ein Protein eingesetzt wird, das ein lntein N enthält und das im zweiten Verfahrensschritt eingesetzte Zielprotein mit einem lntein C fusioniert ist.In general, an auxiliary protein which contains an integer C is used in the method according to the invention in the first method step. However, the method according to the invention can also be designed such that in the first method step a protein is used which contains an intein N and the target protein used in the second method step is fused with an intein C.

Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die reaktive, funktionelle Gruppe des Hilfsproteins eine SH-Gruppe ist. Da die SH-Gruppe in einer sehr einfa- chen und übersichtlichen Weise mit einem Maleinimid oder einem HaIo- Acetamid reagiert, ist es sehr vorteilhaft, die in das Zielprotein einzuführende Gruppe gebunden an ein Maleinimid oder ein Halo-Acetamid mit einem eine SH-Gruppe tragenden Hilfsprotein zu modifizieren. Die in das Zielprotein einzuführende Gruppe kann, wenn sie als Label dienen soll, z.B. ein fluorophorer Rest, ein Biotinrest, ein Oligonukleotidrest oder ein radioaktiver Rest sein.Particularly preferred is a method in which the reactive functional group of the auxiliary protein is an SH group. Since the SH group reacts with a maleimide or a haloacetamide in a very simple and clear manner, it is very advantageous to introduce the group to be introduced into the target protein bound to a maleimide or a haloacetamide having one SH group carrying auxiliary protein to modify. The group to be introduced into the target protein, if it is to serve as a label, e.g. a fluorophore residue, a biotin residue, an oligonucleotide residue or a radioactive residue.

Wird als Hilfsprotein ein lntein C eingesetzt, dann muss die Exteinsequenz aus mindestens zwei Aminosäuren bestehen. Wird hingegen ein Hilfsprotein eingesetzt, das ein lntein N enthält, dann muss die im Hilfsprotein enthaltene Extein- sequenz mindestens eine Aminosäure aufweisen.If an integer C is used as auxiliary protein, then the extra-sequence must consist of at least two amino acids. If, on the other hand, an auxiliary protein is used which contains an intein N, then the extein sequence contained in the auxiliary protein must have at least one amino acid.

Der entscheidende Schritt der vorliegenden Erfindung liegt in der Verwendung der herkömmlichen chemischen Modifikation von Cystein in Proteinen, ohne die Nachteile der Unspezifität in Kauf nehmen zu müssen. Die Reaktion wird durch das in Abb. 1 dargestellte Reaktionsschema verdeutlicht:The crucial step of the present invention is the use of the conventional chemical modification of cysteine in proteins, without the To accept the disadvantages of non-specificity. The reaction is illustrated by the reaction scheme shown in Fig. 1:

Dabei wird zunächst ein Protein (Hilfsprotein; „Intein C-cystag"), welches nur ein Cystein enthält, mit der vorstehend beschriebenen Methode modifiziert. Die dadurch erhaltene Protein-Modifikation, das Protein „Intein C-cystag"-Modifikation" wird dann in gereinigter Form mit dem eigentlichen Zielprotein umgesetzt, welches seinerseits zuvor mit einem Intein teilfusioniert wurde („Zielprotein-Intein N"). Die Intein N- und Intein C-Hälften treten daraufhin in Interaktion, bilden das aktive Intein, welches sich durch den Prozess des Protein-Spleißens (protein splicing) autokatalytisch herausschneidet und dabei die fusionierten Sequenzen („Zielprotein" und „Cystag Modifikation") mit einer Peptidbindung miteinander verknüpft. Dadurch entsteht das gewünschte Reaktionsprodukt, die „Zielprotein- Cystag-Modifikation". Das Prinzip der Erfindung ist in Abb. 1 illustriert.First, a protein (auxiliary protein, "Intein C-cystag") containing only one cysteine is modified by the method described above, and the resulting protein modification, the protein "In C-cystag" modification, is then transformed into purified form reacted with the actual target protein, which in turn was previously partially fused with an intein ("target protein Intein N"). The intein N and intein C halves then interact to form the active intein, which cuts itself out autocatalytically through the process of protein splicing, thereby involving the fused sequences ("target protein" and "cystag modification") a peptide bond linked together. This produces the desired reaction product, the "target protein Cystag modification." The principle of the invention is illustrated in FIG.

Der Vorteil dieser Reaktion ist, dass weitere Cysteine, die im „Zielprotein" enthalten sind, von dieser Reaktion nicht betroffen sind. Die chemische Reaktion am „Cystag" wird somit regioselektiv an das Zielprotein geknüpft, und zwar am C-Terminus des Zielproteins. Der „Cystag" ist eine Sequenz aus wenigen Ami- nosäuren. Das hat den Vorteil, dass die für die Durchführung der Methode in Kauf zu nehmende weitere Veränderung des Zielproteins mit nur wenigen Aminosäuren minimal ist. Das modifizierte Zielprotein wird anschließend gereinigt, was durch eine geeignete Strategie wie z.B. die Affinitätschromatographie sehr vereinfacht werden kann. Ggfs. kann die C-Extein-Sequenz („Cystag") aber auch eine längere Sequenz, wie z.B. einen größeren Teil eines Proteins, darstellen.The advantage of this reaction is that additional cysteines contained in the "target protein" are unaffected by this reaction, so the chemical reaction at the "cystag" is regioselectively linked to the target protein, at the C-terminus of the target protein. The "cystag" is a sequence of a few amino acids, which has the advantage that the further modification of the target protein with only a few amino acids, which is worth to carry out the method, is minimal For example, the C-extein sequence ("cystag") may also have a longer sequence, such as, for example, an affinity chromatography a larger part of a protein.

Die Vereinigung der beiden Teile des Inteins, des Inteins N und des lnteins C, sowie die Tatsache, dass das Intein C kein Cystein enthält und durch die F:usi- on mit „Cystag" mit genau einem Cystein versehen werden kann, um diesen modifizierten „Cystag" anschließend an ein Zielprotein spleißen zu können, stellen somit das wesentliche Element der vorliegenden Erfindung dar. Die Intein-Teile N und lntein C sind bekannt und sind vom Ssp DnaB Intein ausgehend entwickelt worden. Dafür wurden zwei verschiedene Intein N- und Intein C-Teile des Ssp DnaB mini-lnteins mit gentechnischen Methoden gewonnen, die einer Spaltung des Inteins an zwei verschiedenen Stellen entsprechen. Diese beiden Spaltstellen sind die Stellen SO und S1 , wie sie von Sun et al. im Journal of Biological Chemistry, (2004), 279: 35281 bis 35286 beschrieben worden sind. Die Spaltstelle SO wurde erstmals von Wu et al., Journal of Biological Chemistry, (1998), 1387: 422 bis 432 beschrieben. Die Intein-Hälften Intein C (SO) und Intein C (S1 ) wurden als gereinigte, rekombinante Polypeptide mit dem „Cystag" als C-Exteinsequenz hergestellt. Im Hilfsprotein Intein C(SiO) wurde dabei das verbleibende Cystein an Position 50 des Inteins gegen Serin ausgetauscht. Die komplementären Intein-Hälften Intein N(SO) und Intein N(S1 ) wurden mit dem jeweiligen Zielprotein fusioniert.The union of the two parts of the intein, the intein N lnteins and C, as well as the fact that the intein C contains no cysteine and by the F: USI on with "Cystag" by exactly one cysteine may be provided to these modified Being able to subsequently splice "cystag" to a target protein thus constitutes the essential element of the present invention. The intein parts N and C are known and have been developed starting from the Ssp DnaB Intein. For this purpose, two different intein N and intein C parts of the Ssp DnaB mini-link were obtained by genetic engineering methods corresponding to a split of the intein at two different sites. These two cleavage sites are the sites SO and S1 as reported by Sun et al. in the Journal of Biological Chemistry, (2004), 279: 35281 to 35286. The cleavage site SO was first described by Wu et al., Journal of Biological Chemistry, (1998), 1387: 422-432. The intein halves intein C (SO) and intein C (S1) were prepared as purified, recombinant polypeptides with the "cystag" as C-extein sequence In the auxiliary protein Intein C (SiO), the remaining cysteine at position 50 of the intein The complementary intein halves intein N (SO) and intein N (S1) were fused to the respective target protein.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die vorstehend genannten Inteine beschränkt, sondern kann auch auf andere Inteine ausgeweitet werden. Hierfür kommen alle Inteine in Betracht, die als katalytisches N- oder C-Nukleophil kein Cystein, sondern ein Serin oder Threonin besitzen und die sich in aktive Intein N- und Intein C-Hälften spalten lassen. Weitere innerhalb des Inteins vorkom- mende Cysteine müssen dann ggfs. durch Mutagenese entfernt werden. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren auch durchführbar, wenn man eine Intein N-Hälfte mit einem Cystag verknüpft (siehe Abbildung 1b). Dann lässt sich das Zielprotein an seinem N-Terminus modifizieren. Ein gespaltenes Intein, dessen katalytisches N-Nukleophil Serin ist, und das auch sonst keine Cysteinreste enthält, ist das Psp-GBD PoM Intein, das beschrieben worden ist von Southworth et al., im EMBO Journal (1998), 17: 918 bis 926. Diese Intein- Hälfte erfüllt alle Anforderungen, wenn sie entsprechend mit einem Cystag versehen ist und erfindungsgemäß modifiziert wird.The present invention is not limited to the aforementioned inteins but may be extended to other inteins. All inteins which have no cysteine as the catalytic N- or C-nucleophile but have a serine or threonine and which can be cleaved into active intein N and intein C halides are suitable for this purpose. Further cysteines occurring within the intein must then be removed by mutagenesis if necessary. In particular, the method according to the invention can also be carried out by linking an intein N-half to a cystag (see FIG. 1b). Then the target protein can be modified at its N-terminus. A cleaved intein whose catalytic N-nucleophile is serine, and which otherwise contains no cysteine residues, is the Psp-GBD PoM intein described by Southworth et al., EMBO Journal (1998), 17: 918-926 This integer half complies with all requirements if it is appropriately provided with a cystag and modified according to the invention.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkte lassen sich von den Produkten, die durch die chemische Ligationsmethode hergestellt worden sind, unterscheiden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist das Modifikationsreagenz (zum Beispiel Fluorescein-Maleinimid) an die Seitenkette eines Cysteinrestes am C-Terminus bzw. N-Terminus des Proteins gekoppelt, während ggfs. weitere Cysteine im Protein unmodifiziert vorliegen. Das ist in aller Regel bei den bisher bekannten Verfahren nicht der Fall.The products produced by the process of the invention can be distinguished from the products made by the chemical ligation method. In the method of the invention, the modification reagent (for example, fluorescein-maleimide) is at the side chain a cysteine residue at the C-terminus or N-terminus of the protein coupled, while possibly. Additional cysteine present in the protein unmodified. This is usually not the case with the previously known methods.

Erfindungsgemäß können nicht nur die bisher üblichen biophysikalischen Sonden wie Fluorophore, Biotin, Oligonukleotide mit Proteinen verbunden werden oder Proteine an feste Phasen wie Chips und Mikroarrays sowie an synthetische Cofaktoren geknüpft werden, sondern es lassen sich auch therapeutisch und diagnostisch interessante Proteine herstellen. Diese müssen meist die zahlreichen posttranslationalen Modifikationen, die der menschliche Körper an ihnen vornimmt, ebenfalls tragen, um biologisch und medizinisch wirksam zu sein. Darüber hinaus gibt es viele Anwendungen der synthetischen Modifikation von Proteinen, die zur Stabilität und damit längerer Verweildauer im Körper beitragen. Auch solche Modifikationen können erfindungsgemäß mit dem vorlie- genden Verfahren in Proteine eingeführt werden.According to the invention not only the hitherto customary biophysical probes such as fluorophores, biotin, oligonucleotides can be linked to proteins or proteins can be attached to solid phases such as chips and microarrays as well as to synthetic cofactors, but also therapeutically and diagnostically interesting proteins can be produced. These usually have to carry the numerous post-translational modifications that the human body makes to them in order to be biologically and medically effective. In addition, there are many applications of the synthetic modification of proteins, which contribute to the stability and thus longer residence time in the body. Such modifications can also be introduced according to the invention into proteins using the present method.

Folgende Modifikationen können erfindungsgemäß durchgeführt werden:The following modifications can be carried out according to the invention:

Glykosylierungen, Phosphorylierungen, Acetylierungen, Isoprenylierungen, Far- nesylierungen, Lipoylierungen, Myristoylierungen, Palmitoylierungen, Polyethy- lenglykolylierungen sowie der Einbau von Chelatbildnern für Metallionen wie Technetium zur Sichtbarmachung oder Bestrahlung von Tumoren.Glycosylations, phosphorylations, acetylations, isoprenylations, farnesylations, lipoylations, myristoylations, palmitoylations, polyethylene glycolylations and the incorporation of chelating agents for metal ions such as technetium for the visualization or irradiation of tumors.

Die vorstehend genannten Reaktionen können nach dem vorliegenden Verfah- ren auch in mit einfachen technischen Mitteln ausgestatteten Laboratorien leicht durchgeführt werden. Damit unterscheidet sich dieses Verfahren grundsätzlich von den chemischen Ligationsmethoden, bei denen mit großem experimentellen Aufwand die Reaktionskomponenten hergestellt werden müssen, was meist nur chemisch sehr versierten Laboratorien möglich ist.The abovementioned reactions can also easily be carried out in the laboratories equipped with simple technical means according to the present process. Thus, this method differs in principle from the chemical ligation methods, in which the reaction components must be prepared with great experimental effort, which is usually only chemically well-versed laboratories possible.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das nachstehende Beispiel im Einzelnen erläutert: Herstellung der ExpressionsplasmideThe process according to the invention is explained in detail by the following example: Preparation of expression plasmids

Die Inteinfusionen mit dem Cys-tag wurden ausgehend vom Ssp DnaB mini- Intein aus pMST (Wu et al., Biochimica et Biophysica Acta 1387 (1998) 422- 432) hergestellt. pMST diente als Templat für eine Polymerase Kettenreaktion (PCR), wobei der C-terminale Teil des DnaB-Inteins (DnaBc) der Spaltstelle SO entsprechend unter Verwendung der Oligonukleotide 5'- ATACCATGGGCACTAGTTCACCAGAAATAGAAAAGTTGTC-3' (Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen Λ/col und Spei sind unterstrichen) und δ'-ATAGGTACCAGATCTAATACTGTTATGGACAAT-GATGTC-S' (Kpn\, BgIW) amplifiziert wurde. Das gereinigte PCR-Fragment wurde anschließend mit Λ/col und BgIW geschnitten. Das so erhaltene Fragment wurde anschließend mittels T4 DNA Ligase in den gleichermaßen präparierten Vektor pQE60 (Qia- gen) ligiert. Nach Transformation von kompetenten E. coli-Ze\\er\ mit dem Liga- tionsansatz und Selektion auf Ampicillin-resistente Kolonien wurde der Vektor pTK048 erhalten. Durch eine Punktmutations-PCR mit den beiden Oligonukleo- tiden oTK15 (5'-CAT AAC AGT ATT AGA TCC TGC GGT CAT CAC CAT CAC CAT C-3') und oTK16 (5'-G ATG GTG ATG GTG ATG ACC GCA GGA TCT AAT ACT GTT ATG-3') wurde die kodierende Sequenz im resultierenden pTK052 so verändert, dass das Genprodukt das zu modifizierende Cystein des Cys-tags in der Exteinsequenz SIRSCGHHHHHH beinhaltet. Ebenso diente das Ausgangsplasmid pTK048 als DNA-Templat für eine PCR mit den beiden Oligonukleotiden oHM116 (5'-ATA CCA TGG GCA CTA GTT CAC CAG /VAA TAG AAA AGT TGT C-3', Λ/col, Spei) und oTK14 (5'-ATA AGA TCT ACC GCA ACC CTG TTC GAT ACT GTT ATG GAC AAT GAT G-3', BgIW), die das DnaBc kodierende Fragment mit der Exteinsequenz SIEQGCGRSHHHHHH enthält. Nach Behandlung mit Λ/col und BgIW wurde auch dieses Fragment wie oben beschrieben in den Vektor pQE60 ligiert, so dass das Expressionsplasmid pTK049 erhalten wurde. Die Plasmide pTK048 und pTK049 wurden mit den Restriktionsenzymen Spei und HinόW\ geschnitten und das Insert in den mit Xba\ und HindWl behandelten Vektor pHM45 (Mootz et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125: 10561-10569) ligiert. Dies lieferte die Plasmide pTK054 (kodierend für MBP-DnaBc-SIRSCGHHHHHH, MBP = maltose-binding protein) und pTK053 (kodierend für MBP-DnaBc-SIEQGCGRSHHH-HHH). Als Negativkontrolle wurde das Plasmid pTK048 (kodierend für ein Protein ohne Cystein) e- benfalls Spei, H/ndlll geschnitten und gleichermaßen in den Vektor pHM45 klo- niert. Auf diese Weise wurde pTK055 (kodierend für MBP-DnaBc- SIRSRSHHHHHH) erhalten. Die Fusion des DnaBc-Fragmentes mit MBP diente der Steigerung der Expressionsausbeute der jeweiligen Fusionsproteine und konnte ferner zur besseren Reinigung derselben durch eine Amylosesäule verwendet werden.The in-gut infusions with the Cys-tag were prepared from Ssp DnaB mini- Intein from pMST (Wu et al., Biochimica et Biophysica Acta 1387 (1998) 422-432). pMST served as a template for a polymerase chain reaction (PCR), wherein the C-terminal part of the DnaB intein (DnaB c ) of the cleavage site SO correspondingly using the oligonucleotides 5'-ATACCATGGGCACTAGTTCACCAGAAATAGAAAAGTTGTC-3 '(recognition sequences of the restriction endonucleases Λ / col and Spei are underlined) and δ'-ATAGGTACCAGATCTAATACTGTTATGGACAAT-GATGTC-S '(Kpn \, BgIW) was amplified. The purified PCR fragment was then cut with Λ / col and BgIW. The resulting fragment was subsequently ligated by means of T4 DNA ligase into the similarly prepared vector pQE60 (Qia gene). After transformation of competent E. coli cells with the ligation mixture and selection for ampicillin-resistant colonies, the vector pTK048 was obtained. By a point mutation PCR with the two oligonucleotides oTK15 (5'-CAT AAC AGT ATT AGA TCC TGC GGT CAT CAC CAT CAC CAT C-3 ') and oTK16 (5'-G ATG GTG ATG GTG ATG ACC GCA GGA TCT AAT ACT GTT ATG-3 '), the coding sequence in the resulting pTK052 was changed such that the gene product contains the cysteine to be modified of the cys tag in the extein sequence SIRSCGHHHHHH. Likewise, the starting plasmid pTK048 served as a DNA template for a PCR with the two oligonucleotides oHM116 (5'-ATA CCA TGG GCA CTA GTT CAC CAG / VAA TAG AAA AGT TGT C-3 ', Λ / col, Spei) and oTK14 (5 '-ATA AGA TCT ACC GCA ACC CTG TTC GAT ACT GTT ATG GAC AAT GAT G-3', BgIW) containing the DnaB c coding fragment with the extein SEQUGCGRSHHHHH sequence. After treatment with Λ / col and BgIW, this fragment was also ligated into the vector pQE60 as described above, so that the expression plasmid pTK049 was obtained. Plasmids pTK048 and pTK049 were cut with the restriction enzymes Spei and HinόW \ and the insert ligated into the Xba \ and HindWl-treated vector pHM45 (Mootz et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125: 10561-10569) , This provided the plasmids pTK054 (encoding MBP-DnaB c -SIRSCGHHHHHH, MBP = maltose-binding protein) and pTK053 (encoding MBP-DnaB c -SIEQGCGRSHHH-HHH). As a negative control, the plasmid pTK048 (coding for a protein without cysteine) was also cut Spei, Hlllll and likewise cloned into the vector pHM45. In this way, pTK055 (encoding MBP-DnaB c -SIRSRSHHHHH) was obtained. The fusion of the DnaB c fragment with MBP served to increase the expression yield of the respective fusion proteins and could also be used for better purification of the same by an amylose column.

Die Expressionsplasmide für die Fusionsproteine mit dem N-terminalen In- teinfragment DnaBN (Spaltstelle SO) wurden ausgehend von Plasmid pSB13 hergestellt. Zu dessen Herstellung wurde die Sequenz, die für DnaBN kodiert, mit den Oligonukleotiden 5'-ATAGAATTCTCCGGCTGCATCAGTGGAGATAG- 3' (EcoRI) und δ'-ATAAAGCTTTTATCTAGATAAAGAGGAGCTTTCTAG- TTTACG-3' (H/ndlll, Xba\) von dem Plasmid pMST PCR-amplifiziert und über die integrierten EcoRI und Xba\ Schnittstellen in den Vektor pHM41 (Mootz et al., JACS 125 (2003) 10561-10569) kloniert. Das resultierende Plasmid pSB13 wurde mit den Restriktionsenzymen Xba\ und Spei geschnitten und das entstehende Vektorfragment religiert, wodurch pTK056 gewonnen werden konnte (kodierend für MBP-DnaBN-His6).The expression plasmids for the fusion proteins with the N-terminal intein fragment DnaB N (cleavage site SO) were prepared from plasmid pSB13. For its production, the sequence coding for DnaB N with the oligonucleotides 5'-ATAGAATTCTCCGGCTGCATCAGTGGAGATAG- 3 '(EcoRI) and δ'-ATAAAGCTTTTATCTAGATAAAGAGGAGCTTTCTAG- TTTACG-3' (H / ndIII, Xba \) of the plasmid pMST PCR- amplified and cloned via the integrated EcoRI and Xba \ interfaces in the vector pHM41 (Mootz et al., JACS 125 (2003) 10561-10569). The resulting plasmid pSB13 was cut with the restriction enzymes Xba \ and Spei and the resulting vector fragment religated, whereby pTK056 could be obtained (coding for MBP-DnaB N -His 6 ).

pTK060 (kodierend für TyrA-PCP-DnaBN-His6) wurde nach Entfernung des für MBP kodierenden Fragmentes in pTK056 durch Λ/col- und /ΞcoRI-Behandlung und anschließender Ligation mit einem für TyrA-PCP kodierenden Fragment gewonnen. Letzteres wurde durch PCR mit den Oligonukleotiden oTL02 (5'-TTT TCC ATG GCG TTG TCC GAG ATC ACC ATG-3', Λ/col) und oTK19 (5'-ATA GAA TTC TCC GCT CGT GGC GAC ATA CTG GGC CAA CGC-3', EcoRI) aus dem Konstrukt pCLA-PCP2b1 amplifiziert. Das Konstrukt pCLA-PCP2b1 wurde ausgehend von chromosomaler DNA aus Bacillus brevis mittels der Primer OTL02 (5'-TTT TCC ATG GCG TTG TCC GAG ATC ACC ATG-3', Λ/col) und OTL03 (5'-AAA AAG ATC TCG TGG CGA CAT ACT GG-3', BgIW) in den Vektor pQE60 kloniert. TyrA-PCP ist die Tyrosin-aktivierende Adenylierungs-Domäne und entsprechende Peptidyl-Carrier-Protein-Domäne (PCP) der nichtribosoma- len Tyrocidin-Synthetase TycC3 (Mootz und Marahiel, J. Bacteriol. (1997) 179: 6843-6850). Dieses Protein enthält sechs Cysteinreste, die unter herkömmlichen Methoden zur Sulfhydrylmarkierung von Proteinen ebenfalls zu unerwünschten Nebenreaktionen führen würden.pTK060 (encoding TyrA-PCP-DnaB N -His 6 ) was recovered after removal of the MBP-encoding fragment in pTK056 by Λ / col and / ΞcoRI treatment followed by ligation with a fragment encoding TyrA-PCP. The latter was amplified by PCR with the oligonucleotides oTL02 (5'-TTT TCC ATG GCG TTG TCC GAG ATC ACC ATG-3 ', Λ / col) and oTK19 (5'-ATA GAA TTC TCC GCT CGT GGC GAC ATA CTG GGC CAA CGC- 3 ', EcoRI) from the construct pCLA-PCP2b1 amplified. The construct pCLA-PCP2b1 was isolated from Bacillus brevis chromosomal DNA using primers OTL02 (5'-TTT TCC ATG GCG TTG TCC GAG ATC ACC ATG-3 ', Λ / col) and OTL03 (5'-AAA AAG ATC TCG TGG CGA CAT ACT GG-3 ', BgIW) in the vector pQE60 cloned. TyrA-PCP is the tyrosine activating adenylation domain and corresponding non-ribosomal peptidyl carrier protein domain (PCP). Tyrocidin synthetase TycC3 (Mootz and Marahiel, J. Bacteriol. (1997) 179: 6843-6850). This protein contains six cysteine residues, which would also lead to unwanted side reactions under conventional sulfhydryl labeling of proteins.

Expression und Reinigung der ProteineExpression and purification of the proteins

Für die Expression der Proteine TK095 (MBP-DnaBc-SIEQGCGRSHHHHHH), TK097 (MBP-DnaBc-SIRSCGHHHHHH), TK117 (MBP-DnaBc- SIRSRSHHHHHH), TK115 (MBP-DnaBN-His6) und TK107 (TyrA-PCP-DnaBN- Hisε) wurden E. coli BL21 -Zellen mit den entsprechenden Plasmiden pTK053, pTK054, pTK055, pTK056 und pTK060 transformiert. Die erhaltenen Expressionsstämme wurden in einer Vorkultur (LB-Medium mit Ampicillin (100 μg/mL) und für die MBP-enthaltenden Proteine mit zusätzlich 0,2% Glukose) über Nacht bei 37°C und 250 upm angezogen. 6 ml_ der jeweiligen Vorkultur wurden zur Animpfung von 600 mL des gleichen Mediums verwendet. Nachdem die Zellkulturen bei 370C und 250 upm eine optische Dichte (OD6oo nm) von ca. 0,7 erreicht hatten, wurde die Temperatur auf 30°C gesenkt und die Produktion der Proteine durch Zugabe von lsopropyl-/?-D-thiogalaktopyranosid in einer End- konzentration von 0,4 mM induziert. Die Zellen wurden nach 3-4 Stunden durch Zentrifugation pelletiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet in Wasch- Puffer (50 mM Tris, 300 mM NaCI, pH 8,0) mit 5 mM Imidazol resuspendiert. Der Aufschluß der Zellen erfolgte durch 2 Durchgänge mit einem Emulsifier (A- vestin EmulsiFlex C-5). Die unlöslichen Zellbestandteile wurden durch Zentrifu- gation bei 30.000 g (15 min) abgetrennt und die lösliche Fraktion anschließend auf eine äquilibrierte Ni2+-NTA-Gravity-Flow-Säule (Firma Qiagen, Bettvolumen ca. 2 mL) aufgetragen. Die Waschschritte wurden durchgeführt mit 50 mL Waschpuffer mit 5 mM Imidazol, 30 mL Waschpuffer mit 20 mM Imidazol und 10 mL Waschpuffer mit 40 mM Imidazol. Die gebundenen Proteine wurden an- schließend mit Waschpuffer mit 250 mM Imidazol eluiert. Die Fusionsproteine, die auch MBP enthielten, wurden anschließend gegen Amylosepuffer (20 mM Tris, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7,4) dialysiert und auf eine äquilibrierte Amylosesäule (Firma New England Biolabs, Bettwolumen ca. 4 mL) aufgetra- gen. Nach Waschen der Amlyosesäule mit 50 ml_ Amylosepuffer wurden die Proteine schließlich mit Amylosepuffer mit 10 mM Maltose eluiert. Die vereinigten Fraktionen mit dem jeweiligen gereinigten Protein wurden gegen Spleißpuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCI, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, pH 7,0) oder gegen Modifikationspuffer (20-50 mM Phosphat, 150 mM NaCI, 10% Glycerin, pH 7,2) dialysiert und dann bis zur weiteren Verwendung bei -800C eingefroren.For the expression of the proteins TK095 (MBP-DnaB c -SIEQGCGRSHHHHH), TK097 (MBP-DnaB c -SIRSCGHHHHHH), TK117 (MBP-DnaB c -SIRSRSHHHHHH), TK115 (MBP-DnaB N -His 6 ) and TK107 (TyrA- PCP-DnaB N -Hisε), E. coli BL21 cells were transformed with the corresponding plasmids pTK053, pTK054, pTK055, pTK056 and pTK060. The resulting expression strains were grown in a preculture (LB medium with ampicillin (100 μg / ml) and for the MBP-containing proteins with additional 0.2% glucose) overnight at 37 ° C. and 250 rpm. 6 ml of the respective preculture were used to inoculate 600 ml of the same medium. After the cell cultures at 37 0 C and 250 rpm to an optical density (OD 6 oo nm) reached approximately 0.7, the temperature was lowered to 30 ° C and the production of proteins by the addition of isopropyl - /? - D -thiogalactopyranoside in a final concentration of 0.4 mM. The cells were pelleted by centrifugation after 3-4 hours, the supernatant discarded, and the cell pellet resuspended in wash buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8.0) with 5 mM imidazole. The digestion of the cells was carried out by 2 passes with an emulsifier (A vestin EmulsiFlex C-5). The insoluble cell constituents were separated by centrifugation at 30,000 g (15 min) and the soluble fraction was then applied to an equilibrated Ni 2+ -NTA gravity flow column (Qiagen company, bed volume about 2 ml). The washing steps were carried out with 50 ml washing buffer with 5 mM imidazole, 30 ml washing buffer with 20 mM imidazole and 10 ml washing buffer with 40 mM imidazole. The bound proteins were then eluted with wash buffer with 250 mM imidazole. The fusion proteins, which also contained MBP, were then dialyzed against amylose buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4) and applied to an equilibrated amylose column (New England Biolabs, bed volume about 4 mL). After washing the column of amylose with 50 ml of amylose buffer, the proteins were finally eluted with amylose buffer with 10 mM maltose. The pooled fractions with the respective purified protein were assayed against splice buffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 10% glycerol, pH 7.0) or against modification buffer (20-50 mM phosphate, 150 mM NaCl , 7.2), dialyzed 10% glycerol, pH, and then frozen until further use at -80 0 C.

Spleißreaktionensplicing reactions

Die Spleißreaktionen wurden bei 250C in Spleißpuffer durchgeführt, wobei DTT unmittelbar vor der Reaktion frisch zugegeben wurde (Endkonzentration 2 mM). Ein Inteinkonstrukt wurde in Spleißpuffer vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe des entsprechenden anderen Inteinfusionsproteins gestartet. Die Endkon- zentration der Proteine wurde auf 2 μM eingestellt, wenn nicht anders angegeben. Gestoppt wurden die Spleißreaktionen durch Zugabe von 10 μl_ 4x SDS- Puffer (500 mM Tris/HCI, pH 6.8, 8 % SDS, 40 % Glycerin, 20 % ß- Mercaptoethanol, 5 mg/mL Bromphenolblau) zu 30 μL-Aliquots des Spleißansatzes. Die Auswertung der Spleißreaktion erfolgte nach SDS-PAGE- Auftrennung mit Coomassie-Brilliant Blue-Färbung oder durch Visualisierung von Fluorophor-markierten Proteinen auf einem UV-Schirm (Λmax = 312 nm). Die Intensität der Proteinbanden wurde densitometrisch ausgewertet.The splicing reactions were carried out at 25 0 C in Spleißpuffer wherein DTT was added fresh immediately before the reaction (final concentration 2 mM). An intein construct was placed in splice buffer and the reaction started by addition of the corresponding other infusion protein. The final concentration of proteins was adjusted to 2 μM unless otherwise stated. The splicing reactions were stopped by addition of 10 μl of 4x SDS buffer (500 mM Tris / HCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% glycerol, 20% β-mercaptoethanol, 5 mg / mL bromophenol blue) to 30 μL aliquots of the splice mixture , The evaluation of the splicing reaction was carried out after SDS-PAGE separation with Coomassie-Brilliant Blue staining or by visualization of fluorophore-labeled proteins on a UV screen (λ ma = 312 nm). The intensity of the protein bands was evaluated densitometrically.

Modifikationsreaktionenmodification reactions

Die Modifikationsreaktionen wurden mit den entsprechenden Proteinen und dem jeweiligen Modifikationsreagenz bei 250C und vor Licht geschützt durchgeführt. Hierfür wurde das zu modifizierende Protein in Konzentrationen von 10-40 μM eingesetzt, mit dem 10fachen molaren Überschuß an Tris(2- carboxyethyl)phosphin hydrochlorid (TCEP) in Modifikationspuffer versetzt und anschließend mit einem 10-25fachen molaren Überschuß an Modifikationsreagenz versetzt. Die Modifikationsreaktionen wurden nach 120 min durch Zugabe von 1 mM (Endkonzentration) DTT, 1 mM (Endkonzentration) ß- Mercaptoethanol, oder dem 0.25fachen Volumen 4xSDS-Probenpuffer gestoppt. Die Modifikationsreaktion mit verschiedenen Reagenzien sind nachfolgend im Detail beschrieben.The modification reactions were carried out with the corresponding proteins and the respective modification reagent at 25 ° C. and protected from light. For this purpose, the protein to be modified was used in concentrations of 10-40 μM, mixed with the 10-fold molar excess of tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) in modification buffer and then mixed with a 10-25-fold molar excess of modification reagent. Modification reactions were performed after 120 min by addition of 1 mM (final concentration) DTT, 1 mM (final concentration) of β- Mercaptoethanol, or the 0.25-fold volume 4xSDS sample buffer stopped. The modification reaction with various reagents are described in detail below.

Modifikation mit Fluorescein-5-Maleimid (FM)Modification with fluorescein-5-maleimide (FM)

Für die Modifikation der Proteine TK095, bzw. TK097 mit Fluorescein-5- Maleimid (FM) wurde FM (Pierce, Bestellnummer 46130) in DMF gelöst und anschließend mit Modifikationspuffer auf 1 mM eingestellt (Endkonzentration von DMF 2% (v/v) in Modifikationspuffer). Vor Beginn der Modifikationsreaktion wurden die Proteine mit der 10fachen molaren Menge an TCEP für 5 Minuten vorinkubiert. Anschließend wurde FM im 25fachen molaren Überschuß zugegeben und für weitere 2 Stunden bei RT oder 25°C vor Licht geschützt inkubiert. Eingesetzt wurden die beiden Proteine TK095 und TK097. In Abb. 2 ist die Mo- difikationsreaktion mit FM für Protein TK095 schematisch dargestellt. Zur weiteren Verwendung der modifizierten Proteine in Spleißreaktionen wurde die Modifikationsreaktion mit 1 mM DTT abgestoppt (10 min) und mit dem entsprechenden N-terminalen Inteinkonstrukt in Spleißpuffer zur Spleißreaktion eingesetzt. Zur Analyse der Modifikation mittels SDS-PAGE wurden die Modifikationsreak- tionen mit dem 0,25fachen Volumen 4x SDS-Probenpuffer gestoppt, direkt auf ein SDS-GeI aufgetragen und das Gel anschließend auf einem UV-Schirm (312 nm) oder mit Hilfe einer Coomassie-Brilliant-Blue Anfärbung analysiert. In Abb. 3 sind die massenspektrometrische Analyse sowie die Ergebnisse der SDS- PAGE und Detektion der Fluoreszensbanden der Modifikationsreaktion des Proteins TK095 vor (M+ berechnet: 50354,52 Da) und nach Modifikation (M+ ber. 50781 ,52 Da; beobachtet: 50782,9 Da) gezeigt.For the modification of proteins TK095 or TK097 with fluorescein-5-maleimide (FM), FM (Pierce, order number 46130) was dissolved in DMF and then adjusted to 1 mM with modification buffer (final concentration of DMF 2% (v / v) in modification buffer). Before starting the modification reaction, the proteins were preincubated with 10 times the molar amount of TCEP for 5 minutes. Subsequently, FM was added in a 25-fold molar excess and incubated protected from light for a further 2 hours at RT or 25 ° C. The two proteins TK095 and TK097 were used. Fig. 2 shows schematically the modification reaction with FM for protein TK095. For further use of the modified proteins in splicing reactions, the modification reaction was stopped with 1 mM DTT (10 min) and used with the corresponding N-terminal intein construct in splice buffer for splicing reaction. To analyze the modification by means of SDS-PAGE, the modification reactions were stopped with the 0.25-fold volume of 4x SDS sample buffer, applied directly to an SDS gel, and then the gel was applied on a UV screen (312 nm) or using Coomassie -Brilliant-Blue staining analyzed. Fig. 3 shows the mass spectrometric analysis as well as the results of SDS-PAGE and detection of the fluorescence bands of the modification reaction of the protein TK095 (M + calculated: 50354.52 Da) and after modification (M + calc. 50781, 52 Da; 50782.9 Da).

Modifikation mit Maleimid-PEO2-Biotin (BM)Modification with maleimide-PEO 2 -biotin (BM)

Für die Modifikation mit BM (Pierce, Bestellnummer 21901 ) wurde eine frische 10 mM Stocklösung von BM in Modifikationspuffer hergestellt. Die zu modifizierende Proteine TK095 und TK097 wurden jeweils in Konzentrationen von 10-40 μM vorgelegt und mit der 10fachen molaren Menge an TCEP 5 Minuten bei 25°C vorinkubiert. Anschließend wurde die 15fache molare Menge an BM zugegeben und der Reaktionsmix für weitere 2 Stunden bei 25°C vor Licht geschützt inkubiert. In Abb. 4 ist die Modifikationsreaktion der Cys-tag Konstrukte mit BM schematisch dargestellt. Nach Quenchen von überschüssigem Reagenz durch Zugabe von 1 mM DTT oder 1 mM /?-Mercaptoethanol, wurde das Reaktionsgemisch gegen Avidin-Säulenpuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 7,5) dialysiert, um überschüssiges BM abzutrennen. Das dialysierte Protein wurde auf eine äquilibrierte Soft-Link-Soft-Elute-Avidin-Säule (Promega) gegeben, mit dem 10fachen Säulenvolumen Avidin-Säulenpuffer gewaschen und das biotiny- lierte Protein anschließend mit Avidin-Säulenpuffer (+ 10 mM Biotin) eluiert. Das SDS-GeI der Reinigung, sowie die Massenbestimmung des eluierten, bioti- nylierten Proteins TK095 sind in Abb. 5 gezeigt.For modification with BM (Pierce, Order No. 21901), a fresh 10 mM stock solution of BM in modification buffer was prepared. The proteins TK095 and TK097 to be modified were each initially introduced in concentrations of 10-40 μM and added with 10 times the molar amount of TCEP for 5 minutes 25 ° C preincubated. Subsequently, the 15-fold molar amount of BM was added and the reaction mixture incubated for a further 2 hours at 25 ° C protected from light. Fig. 4 schematically shows the modification reaction of the Cys-tag constructs with BM. After quenching excess reagent by adding 1 mM DTT or 1 mM / --mercaptoethanol, the reaction mixture was dialyzed against avidin column buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) to separate excess BM. The dialyzed protein was loaded onto an equilibrated soft-link soft-elute avidin column (Promega), washed with 10-fold column volumes of avidin column buffer and the biotinylated protein then eluted with avidin column buffer (+ 10 mM biotin). The SDS-gel of purification, as well as the mass determination of the eluted, biotinylated protein TK095 are shown in Fig. 5.

Modifikation mit 5-lodoacetamido-Fluorescein (5-IAF)Modification with 5-iodoacetamido-fluorescein (5-IAF)

Für die Modifikation mit 5-IAF (Molecular Probes, Bestellnummer 130451 ), wie schematisch in Abb. 6 dargestellt, wurde das Modifikationsreagenz in DMF gelöst und anschließend mit Modifikationspuffer auf 10 mM eingestellt (Endkonzentration DMF 2 % (v/v) in Modifikationspuffer). Die zu modifizierenden Protei- ne wurden mit der 10fachen molaren Menge an TCEP 5 Minuten lang reduziert, anschließend mit der 25fachen molaren Menge an 5-IAF versetzt und für weitere 2 Stunden vor Licht geschützt inkubiert. Die Analyse des Reaktionsverlaufs erfolgte wie für die Modifikation mit FM beschrieben und ist in Abb. 7 gezeigt. Das modifizierte Protein TK095 wurde anschließend zur Spleißreaktion einge- setzt.For the modification with 5-IAF (Molecular Probes, order number 130451), as shown schematically in FIG. 6, the modification reagent was dissolved in DMF and then adjusted to 10 mM with modification buffer (final concentration DMF 2% (v / v) in modification buffer). , The proteins to be modified were reduced with 10 times the molar amount of TCEP for 5 minutes, then mixed with 25 times the molar amount of 5-IAF and incubated protected from light for a further 2 hours. The analysis of the course of the reaction was carried out as described for the modification with FM and is shown in FIG. The modified protein TK095 was then used for the splicing reaction.

Spleißreaktion mit unmodifiziertem ProteinSplicing reaction with unmodified protein

Für die Spleißreaktion wurde das unmodifizierte Protein TK095 in Spleißpuffer vorgelegt. Die Reaktion wurde daraufhin durch Zugabe des Proteins TK115, bzw. TK117 gestartet. Die Endkonzentrationen der beiden Proteine war jeweils 2 μM. Nach verschiedenen Zeitpunkten wurde ein Aliquot aus dem Reaktionsansatz entfernt und die Reaktion durch Zugabe von 4xSDS-Probenpuffer ge- stoppt. Die Spleißreaktion von TK095 und TK115 ist schematisch in Abb. 8 und die zugehörige Analyse mittels SDS-PAGE und folgender densitometrischer Auswertung in Abb. 9 gezeigt.For the splicing reaction, the unmodified protein TK095 was presented in splicing buffer. The reaction was then started by adding the protein TK115, or TK117. The final concentrations of the two proteins were 2 μM each. After different time points, an aliquot was removed from the reaction and the reaction was stopped by adding 4xSDS sample buffer. stops. The splicing reaction of TK095 and TK115 is shown schematically in Fig. 8 and the associated analysis by SDS-PAGE followed by densitometric evaluation in Fig. 9.

Spleißreaktion mit modifiziertem ProteinSplicing reaction with modified protein

Zur Spleißreaktion wurden das C-terminale Inteinkonstrukt TK095 mit 5IAF, FM, bzw. BM wie oben beschrieben modifiziert und gegebenenfalls gereinigt. Anschließend wurde das modifizierte Protein in Spleißpuffer vorgelegt und die Spleißreaktion durch Zugabe des N-terminalen Inteinkonstrukts (TK115, bzw. TK117) gestartet. Die Konzentration der beiden Proteine betrug jeweils 2 oder 4 μM. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben für die Analyse mittels SDS- PAGE entnommen. Die Spleißreaktion wurde sowohl durch Kontrolle der Banden auf einem UV-Schirm (nur für die 5IAF und FM modifizierten Proteine), durch Coomassie-Anfärbung, als auch durch massenspektrometrische Analyse verfolgt.For the splicing reaction, the C-terminal intein construct TK095 was modified with 5IAF, FM, or BM as described above and optionally purified. The modified protein was then introduced into splicing buffer and the splicing reaction was started by addition of the N-terminal intein construct (TK115 or TK117). The concentration of the two proteins was 2 or 4 μM in each case. At various times samples were taken for analysis by SDS-PAGE. The splicing reaction was monitored by monitoring the bands on a UV screen (for the 5IAF and FM modified proteins only), by Coomassie staining, and by mass spectrometric analysis.

Durch das Protein-Spleißen wurde die modifizierte C-Exteinsequenz (einschließlich des Cys-tags) der Proteine TK095 mit dem Zielprotein, dem N- Extein des Proteins TK115, bzw. TK117 verknüpft. In Abb. 10 ist die Reaktion von modifiziertem TK095 mit TK115 schematisch dargestellt. Abbildungen 11a und 11 b zeigen die Analyse der Reaktionen durch eine UV-Bestrahlung des durch SDS-PAGE aufgetrennten Reaktionsgemisches. Das modifizierte Zielprotein konnte durch die entsprechende Bande im SDS-PAGE-GeI nachgewiesen werden, wie in Abb. 11 anhand der Spleißreaktionen von mit FM (Abb. 11a) und 5IAF (Abb. 11 b) modifiziertem TK095 erkennbar ist. Die neu auftretende fluoreszierenden Bande zeigt jeweils die richtige Größe des erwarteten Spleißproduktes (MBP-Cys(FM)-His = 45270,42 Da; bzw. MBP-Cys(5IAF)-His = 45231 ,78 Da). Abbildung 11c zeigt eine massenspektrometrische Analyse (ESI- MS) des Reaktionsgemisches von TK115 mit TK095/FM. Neben den anderen Produkten der Spleißreaktion ist eindeutig das Fluorescein-modifizierte Spleißprodukt MBP-Cys(FM)-His nachgewiesen. Abbildung 12 zeigt die Analyse der Reaktion von TK117 mit TK095/5IAF. Auch hier ist deutlich erkennbar, dass das gewünschte Produkt der Spleißreaktion, TyrA-PCP-Cys(5IAF)-His, den Fluoreszenzmarker trägt.Protein splicing linked the modified C-extein sequence (including the cys tag) of proteins TK095 to the target protein, the N-extein of protein TK115, and TK117, respectively. Fig. 10 shows schematically the reaction of modified TK095 with TK115. Figures 11a and 11b show the analysis of the reactions by UV irradiation of the reaction mixture separated by SDS-PAGE. The modified target protein could be detected by the corresponding band in the SDS-PAGE gel, as shown in Fig. 11 by the splicing reactions of TK095 modified with FM (Fig. 11a) and 5IAF (Fig. 11 b). The newly occurring fluorescent band shows in each case the correct size of the expected splice product (MBP-Cys (FM) -His = 45270.42 Da, or MBP-Cys (5IAF) -His = 45231, 78 Da). Figure 11c shows a mass spectrometric analysis (ESI-MS) of the reaction mixture of TK115 with TK095 / FM. In addition to the other products of the splicing reaction, the fluorescein-modified splicing product MBP-Cys (FM) -His is clearly detected. Figure 12 shows the analysis of the response of TK117 with TK095 / 5IAF. Here, too, it can be clearly seen that the desired product of the splicing reaction, TyrA-PCP-Cys (5IAF) -His, carries the fluorescent marker.

Abbildung 13 zeigt die Analyse der Spleißreaktionen mittels Coomassie- gefärbten SDS-PAGE-Gelen von biotinylierten und gemäß Abbildung 5 gereinigten Proteinen TK095/BM und TK097/BM mit TK115 bzw. TK117.Figure 13 shows the analysis of the splicing reactions using Coomassie stained SDS-PAGE gels of biotinylated and purified proteins according to Figure 5 TK095 / BM and TK097 / BM with TK115 and TK117.

Zusammenfassend ist in den Abb. 2 - 13 folgendes dargestellt:In summary, the following are shown in FIGS. 2 to 13:

Abbildung 2 zeigt die schematische Darstellung Modifikationsreaktion der C- terminalen Intein-Cys-tag-Konstrukte TK095 und TK097 mit Fluorescein-5- Maleimid (FM).Figure 2 shows the schematic representation of the modification reaction of the C-terminal intein Cys-tag constructs TK095 and TK097 with fluorescein-5-maleimide (FM).

Abbildung 3a) zeigt SDS-PAGE undFigure 3a) shows SDS-PAGE and

Abbildung 3b) zeigt massenspektrometrische (ESI-MS) Analyse der Modifikation des Proteins TK095 mit FM. Es ist sowohl das Coomassie gefärbte SDS-GeI (links) als auch dasselbe Gel vor der Coomassie-Färbung unter UV-Licht (rechts) dargestellt. Gezeigt sind die Proteinbanden vor (-FM) und nach Modifikation (+FM). Der Massenpeak in b) zeigt das modifizierte Protein (TK095/FM) (berechnet: M+ = 50781 ,52 Da; gemessen: M+ = 50781 ,9 Da).Figure 3b) shows mass spectrometric (ESI-MS) analysis of the modification of the protein TK095 with FM. Both the Coomassie stained SDS-GeI (left) and the same gel are shown before Coomassie staining under UV light (right). Shown are the protein bands before (-FM) and after modification (+ FM). The mass peak in b) shows the modified protein (TK095 / FM) (calculated: M + = 50781, 52 Da, measured: M + = 50781, 9 Da).

Abbildung 4 zeigt die schematische Darstellung der Modifikationsreaktion der C-terminalen Intein-Cys-tag-Konstrukte TK095 und TK097 mit Maleimid PEO2- Biotin (BM).Figure 4 shows the schematic representation of the modification reaction of the C-terminal intein Cys-tag constructs TK095 and TK097 with maleimide PEO 2 - biotin (BM).

Abbildung 5 a) zeigt Coomassie gefärbtes SDS-GeI der Reinigung undFigure 5 a) shows Coomassie stained SDS gel of purification and

Abbildung 5b) zeigt Massenbestimmung des eluierten, biotinylierten Proteins TK095/BM. Gezeigt ist in a) das modifizierte Protein vor dem Auftragen auf die Soft-Link-Soft-Elute-Säule (v.S.), der Durchlauf von ungebunden Protein (DL), die Waschfraktionen (WS 1-3), sowie vier Elutionsfraktionen (E 1-4) von biotiny- liertem Protein (M = Proteinmarker). b) Massenspektrometrische Analyse (ESI- MS) des biotinylierten Protein (berechnet: M+ = 50565,84 Da; gemessen: M+ = 50566 Da).Figure 5b) shows mass determination of the eluted, biotinylated protein TK095 / BM. The modified protein is shown in a) before application to the soft-link soft-elute column (vS), unbound protein (DL), washing fractions (WS 1-3), and four elution fractions (E 1 -4) by biotiny- liertem protein (M = protein marker). b) Mass spectrometric analysis (ESI-MS) of the biotinylated protein (calculated: M + = 50565.84 Da, measured: M + = 50566 Da).

Abbildung 6 zeigt die schematische Darstellung der Modifikationsreaktion mit 5- lodoacetamidofluorescein (5IAF).Figure 6 shows the schematic of the modification reaction with 5-iodoacetamidofluorescein (5IAF).

Abbildung 7a) zeigt SDS-PAGE undFigure 7a) shows SDS-PAGE and

Abbildung 7b) zeigt massenspektrometrische Analyse (ESI-MS) der Modifikation des Proteins TK095 mit 5-lodoacetamidofluorescein (5IAF). Gezeigt sind die Proteinbanden vor (-5IAF) und nach Modifikation (+5IAF). Es ist sowohl das Coomassie gefärbte SDS-GeI (links), als auch dasselbe Gel vor der Coomas- sie-Färbung unter UV-Licht (rechts) dargestellt (M = Proteinmarker). Der Mas- senpeak in b) entspricht dem modifizierten Protein (berechnet: M+ = 50742,88 Da; gemessen: M+ = 50741 ,7 Da).Figure 7b) shows mass spectrometric analysis (ESI-MS) of the modification of the protein TK095 with 5-iodoacetamidofluorescein (5IAF). Shown are the protein bands before (-5IAF) and after modification (+ 5IAF). Both the Coomassie stained SDS-GeI (left) and the same gel before Coomass staining under UV light (right) are shown (M = protein marker). The mass peak in b) corresponds to the modified protein (calculated: M + = 50742.88 Da, measured: M + = 50741, 7 Da).

Abbildung 8 zeigt die schematische Darstellung der Spleißreaktion von TK115 und nicht-modifizierten TK095. Gezeigt sind neben dem Spleißprodukt ME3P- Cys-His auch die beiden entstehenden N- und C-terminalen Inteinspleißproduk- te.Figure 8 shows the schematic of the splicing reaction of TK115 and unmodified TK095. In addition to the splice product ME3P-Cys-His, the two resulting N- and C-terminal intein splice products are also shown.

Abbildung 9 a) zeigt Coomassie gefärbtes SDS-GeI der Spleißreaktion von un- modifiziertem TK095 mit TK115 (M = Proteinmarker).Figure 9 a) shows Coomassie stained SDS gel of the splicing reaction of unmodified TK095 with TK115 (M = protein marker).

Abbildung 9 b) zeigt Densitometrische Auswertung der Spleißbanden wobei die Abnahme der Eduktbande von TK115 bei 56,4 kDa und die Zunahme der E5an- de des Spleißproduktes MBP-Cys-His bei 44,8 kDa verfolgt wurde.Figure 9 b) shows densitometric analysis of the splice bands, whereby the decrease in the educt band of TK115 at 56.4 kDa and the increase in the E5 edge of the splicing product MBP-Cys-His were observed at 44.8 kDa.

Abbildung 10 zeigt die schematische Darstellung der Spleißreaktion von TK115 mit TK095, welches vorher mit 5IAF modifiziert wurde. Abbildung 11 a) zeigt SDS-PAGE der Spleißreaktion von TK115 mit TK095, welches vorher mit Fluorescein-5-Maleimid modifiziert wurde, wobei das modifizierte Protein TK095/FM und der Verlauf der Spleißreaktion mit TK115 nach 0, 1 und 2h zu sehen ist.Figure 10 shows the schematic representation of the splicing reaction of TK115 with TK095 previously modified with 5IAF. Figure 11 a) shows SDS-PAGE of the splicing reaction of TK115 with TK095 previously modified with fluorescein-5-maleimide, showing the modified protein TK095 / FM and the splicing reaction with TK115 after 0, 1 and 2h.

Abbildung 11 b) zeigt SDS-GeI der Spleißreaktion von TK115 mit TK095, welches mit 5-lodoacetamidofluorescein modifiziert wurde. Die SDS-GeIe wurden auf einem UV-Schirm analysiert. Das neu entstehende Spleißprodukt MBP- Cys(FM, bzw. 5IAF)-HiS ist jeweils durch einen Pfeil hervorgehoben. C) ESI- MS-Analyse des Reaktionsgemisches von TK115 mit TK095/FM. Hervorgehoben ist der Massenpeak des Spleißproduktes MBP-Cys(FM)-His (berechnet: M+ = 45270,42 Da; gemessen: M+ = 45270,08 Da)Figure 11 b) shows SDS-GeI of the splicing reaction of TK115 with TK095 modified with 5-iodoacetamidofluorescein. The SDS gels were analyzed on a UV screen. The newly arising splicing product MBP-Cys (FM, or 5IAF) -HiS is highlighted by an arrow. C) ESI-MS analysis of the reaction mixture of TK115 with TK095 / FM. Highlighted is the mass peak of the splicing product MBP-Cys (FM) -His (calculated: M + = 45270.42 Da, measured: M + = 45270.08 Da)

Abbildung 12 zeigt SDS-PAGE Analyse der Spleißreaktion von TK117 mit dem modifizierten Protein TK095/5IAF. Es ist jeweils der Fortschritt der Spleißreaktion nach einer Stunde gezeigt. Es ist sowohl das Gel vor der Coomassie- Färbung unter UV-Licht (links), als auch dasselbe Coomassie gefärbte SDS-GeI (rechts) dargestellt.Figure 12 shows SDS-PAGE analysis of the splicing reaction of TK117 with the modified protein TK095 / 5IAF. In each case, the progress of the splicing reaction after one hour is shown. Both the gel before Coomassie staining under UV light (left) and the same Coomassie stained SDS gel (right) are shown.

Abbildung 13 zeigt SDS-PAGE-Analyse (Coomassie-Färbung) der Spleißreaktion der gereinigten, biotinylierten Proteine TK095 und TK097. Gezeigt sind jeweils die Spleißreaktionen nach 2 h. Bei den Spleißreaktionen mit TK115 (links) erkennt man die jeweiligen neu gebildeten Banden der Spleißprodukte MBP- SIEQGC(BM)GRS-HiS (45,3 kDa) , bzw. MBP-SIRSC(BM)G-HiS (44,9 kDa). Im Falle der Spleißreaktionen mit TK117 (rechts) erkennt man ebenfalls die Spleißprodukte der berechneten Größen (TyrA-PCP-SIEQGC(BM)GRS-His (69,2 kDa), bzw. TyrA-PCP-SIRSC(BM)G-His (68,9 kDa)). Figure 13 shows SDS-PAGE analysis (Coomassie staining) of the splicing reaction of the purified, biotinylated proteins TK095 and TK097. Shown are the splicing reactions after 2 h. The splicing reactions with TK115 (left) show the respective newly formed bands of the splicing products MBP-SIEQGC (BM) GRS-HiS (45.3 kDa) and MBP-SIRSC (BM) G-HiS (44.9 kDa) , In the case of splicing reactions with TK117 (right), the splice products of the calculated quantities (TyrA-PCP-SIEQGC (BM) GRS-His (69.2 kDa) or TyrA-PCP-SIRSC (BM) G-His ( 68.9 kDa)).

Claims

Patentansprüche: claims: 1. Verfahren zur Herstellung eines chemisch modifizierten Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass man1. A process for the preparation of a chemically modified protein, characterized in that in einem ersten Verfahrensschritt ein eine reaktive, funktionelle Gruppe tragendes Hilfsprotein, welches aus einem Inteinfragment und einer E:x- teinsequenz besteht, mit einer in das Zielprotein einzuführenden Gruppe modifiziert undin a first method step, an auxiliary protein bearing a reactive, functional group, which consists of an intein fragment and an E: teinsequenz, modified with a group to be introduced into the target protein and in einem zweiten Verfahrensschritt ein mit dem zu modifizierenden und mit einem komplementären Inteinfragment fusioniertes Zielprotein um- setzt, so dass die modifizierte Exteinsequenz mit dem Zielprotein verbunden wird.in a second method step, a target protein which is fused with the target fragment which is to be modified and fused with a complementary intein fragment is reacted so that the modified extein sequence is linked to the target protein. 2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das im ersten Verfahrensschritt eingesetzte Hilfsprotein ein lntein C enthält und das im zweiten Verfahrensschritt eingesetzte Zielprotein mit einem lntein N fusioniert ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the auxiliary protein used in the first process step contains a cleavage C and the target protein used in the second process step is fused with an integer N. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das im ersten Verfahrensschritt eingesetzte Hilfsprotein ein lntein N enthält und das im zweiten Verfahrensschritt eingesetzte Zielprotein mit einem lntein C fusioniert ist.3. Process according to claims 1, characterized in that the auxiliary protein used in the first process step contains an intein N and the target protein used in the second process step is fused with an integer C. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive, funktionelle Gruppe des Hilfsproteins eine SH-Gruppe ist.4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the reactive functional group of the auxiliary protein is an SH group. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktive Teil der einzuführenden Gruppe ein Maleinimid ist. 5. The method according to claim 4, characterized in that the reactive part of the group to be introduced is a maleimide. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktive Teil der einzuführenden Gruppe ein Haloacetamid ist.6. The method according to claim 4, characterized in that the reactive part of the group to be introduced is a haloacetamide. 7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktive Teil der einzuführenden Gruppe eine Sulfhydrylfunktion ist.7. The method according to claim 4, characterized in that the reactive part of the group to be introduced is a sulfhydryl function. 8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktive Teil der einzuführenden Gruppe ein Haloalkyl ist.8. The method according to claim 4, characterized in that the reactive part of the group to be introduced is a haloalkyl. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die in das Zielprotein einzuführende Gruppe als Label einen fluorophoren Rest, einen Biotinrest, einen Oligonukleotidrest oder einen radioaktiven Rest trägt.9. Process according to claims 1 to 8, characterized in that the group to be introduced into the target protein carries as label a fluorophore residue, a biotin residue, an oligonucleotide residue or a radioactive residue. 10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die im Hilfsprotein enthaltene Exteinsequenz aus mindestens zwei Aminosäuren besteht.10. The method according to claim 2, characterized in that the extra protein contained in the auxiliary protein consists of at least two amino acids. 11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die im Hilfsprotein enthaltene Exteinsequenz aus mindestens einer Aminosäure besteht.11. The method according to claim 3, characterized in that the extra protein contained in Hilfsprotein consists of at least one amino acid. 12. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass es ein nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 11 hergestelltes modifiziertes Protein enthält.12. Medicament, characterized in that it contains a modified protein prepared according to the process of claims 1 to 11. 13. Diagnostikum, dadurch gekennzeichnet, dass es ein nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 11 hergestelltes modifiziertes Protein enthält. 13. diagnostic agent, characterized in that it contains a modified protein produced by the process of claims 1 to 11.
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