WO2006129717A1

WO2006129717A1 - 膵癌検出用腫瘍マーカー及びそれを用いた膵癌検出用キット

Info

Publication number: WO2006129717A1
Application number: PCT/JP2006/310886
Authority: WO
Inventors: Akira Togawa; Shigetsugu Takano; Masaru Miyazaki; Fumio Nomura; Takeshi Tomonaga; Kazuyuki Sogawa
Original assignee: Chiba University NUC
Current assignee: Chiba University NUC
Priority date: 2005-05-31
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2007-11-30
Also published as: JPWO2006129717A1

Description

明細書

滕癌検出用腫瘍マーカー及びそれを用いた勝癌検出用キット

技術分野

[0001] 本発明は、膝癌検出用マーカー、及び、該マーカーを用いた膝癌検出用キットに関する。

背景技術

[0002] 膝癌の発生は、年々増加の傾向を迪つており、日本での発生率は 1985年には 10 万人中 5. 2人まで増加した。更に、 1995年には脾癌による死亡数は 10万人中 14. 7人となり、男性の癌による死因の第 5位、女性の第 7位を占めている (厚生統計協会：国民衛生の動向 1997年)。

[0003] 脾癌は消ィ匕器癌のなかでも予後不良の癌として知られている。その理由としては、（ 1)早期発見が困難で、診断時既に進行癌となり切除率が低ぐ（2)生物学的悪性度が高ぐ早期に周囲神経叢、腹膜播種や肝転移をきたし、（3)有効な補助療法が確立されてヽな、ことなどが挙げられる。

[0004] 現状、局所進行膝癌に対しては拡大リンパ節郭清や門脈合併切除が試みられ、切除率の向上に寄与し、脾癌症例の 10〜15%が外科的切除の対象となっている。し力しながら、生存率の改善には至っておらず、切除例でも 5年生存率は 5〜10%といわれている。従って、脾癌を早期に診断し、外科的切除を行い治療成績の向上を図ることが、急務である。

[0005] また、脾癌は非常に悪性であり、脾臓と離れた部位に転移 (遠隔転移)をきたしゃすぐこの遠隔転移 (特に、肝臓)のため、多くの患者は外科的切除の対象とならない。手術不能の患者の予後は更に悪ぐ 5年生存率はほぼ 0%である。このため、できる限り早期に診断し、切除を行うことが最も効果的な治療である。従って、早期に脾癌患者の発見方法を開発することが何より重要である。

[0006] 従来、脾癌の診断には画像診断として CTスキャンや超音波検査を中心に行われている。し力しながら、この診断方法では脾癌は進行例として発見されることが大部分である。その理由は、例えば腹痛 ·背部痛 ·黄疸 '食欲不振など脾癌自覚症状が出現した時には既に周囲臓器や遠隔転移をきたしている場合が多いためである。さらに、 CTスキャンや超音波検査では腫瘍径が 2cm未満の小脾癌の発見は困難である。このため、外科的切除の対象となるのは全患者の 10〜 15%程度であり、仮に切除の対象となる患者でも高度に進行してしまっている患者が殆どである。

[0007] 更に一方で、脾癌の腫瘍の検出として CA19— 9、 DUPAN- 2, SPAN—1、 SL X等各種腫瘍マーカーが用いられており、脾癌の診断に寄与している（例えば下記非特許文献 1乃至 4参照)。

非特許文献 1 :張正和ら、 "新しい腫瘍マーカー CA19— 9の臨床的意義膝癌症例を中'、に，，月旦と脾、 1985年、 6卷、 1129— 1135頁

非特許文献 2 :TAKASAKIら" Correlative Study on Expression of CA19 —9 and DU― PAN― 2 in Tumor Tissue and in Serum of Pancreat ic Cancer Patients"Cancer Research, 1988年、 48卷、 1435— 1438頁非特許文献 3 :YONG S. CHUNGら" The Detection of Human Pancrea tic Cancer— Associated Antigen in the Serum of Cancer Patients" Cancer, 1987年、 60卷、 1636— 1643頁

非特許文献 4:河上浩康ら "各種消ィ匕器癌における血清 SLX(sialyl SSEA— 1)測定の臨床的有用性"日本消ィヒ器病学会雑誌、 1989年、 86卷、 1141— 1148頁発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] し力しながら、上記腫瘍マーカーのうち最も特異性が高く感度も良好で、広く用いられている CA19— 9であっても早期脾癌の陽性率は低ぐ病期 Iの脾癌の検索は当該検査では不可能である。さらに、 Lewis抗原陰性患者では CA19— 9は仮に進行脾癌でも陰性となってしまうことがあるという問題点を有する（Hiranoら、" Loss of Le wis antigen expression on erythrocytes in some cancer patients wi th high serum CA19— 9 levels", J Natl Cancer Inst、 1987年、 79卷、 1261〜1268頁)。更に、慢性膝炎ゃ胆管炎、胆石症の患者でも高値を示してしま V、、脾癌を確実に検出する腫瘍マーカーとしては課題が残って、る。

[0009] そこで、本発明は、上記課題を鑑み、より早期脾癌の陽性率が高ぐ脾癌をより確実に検出する腫瘍マーカー及びそれを用いた膝癌検出キットを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは、脾癌患者の手術前と外科的切除が行われ脾癌が切除された手術後の血清 (各 20件)を比較検討していくうちに、 ApoC— 1蛋白が手術前の膝癌患者には発現して、るのに対し、切除後の患者には殆ど発現されてヽな、ことを発見し、この蛋白が脾癌にお！、て腫瘍マーカーとして用いることが出来ることを見！、だし、本発明を完成するに至った。この蛋白は脾癌の早期の患者でも発現しており、従来の腫瘍マーカーよりより鋭敏に広範囲に膝癌患者を検出することが可能である。

[0011] 即ち、本発明の一形態に係る膝癌検出用腫瘍マーカーは、 ApoC— 1蛋白力もなることを特徴とする。これにより、従来の腫瘍マーカーより早期脾癌の陽性率が高ぐ脾癌をより確実に検出することが可能となる。これは例えば、プロテインチップシステム、 ELISA法などを用いて検出することができる。 ELISA法としては、例えば (Micheal D. Curry, Walter J McConathy, Jim D. Fesmire, and Peter

Alaupovic. Quantitative Determination of Apolipoproteins C— 1 and C— II in Huma n Plasma by Separate

Electroimmunoassays. , Clin.Chem. 1981年、 27卷、 543— 548頁、 Caroline Petit— Turcotte, Sheldon M. Stohl, et ai. Apolipoprotein

C— 1 Expression in the Brain in Alzheimer' s Disease.

Neurobiology of Disease 2001年、 8卷、 953— 963頁）等に記載の常法を用いることができる。

[0012] また、本発明の他の一形態に係る脾癌検出キットは、プロテインチップシステムにお V、て用いられ、脾癌のより確実な検出に寄与することができる。

[0013] プロテインチップシステムとは、蛋白質の発現、相互作用、翻訳後修飾などの機能解析ゃ、目的蛋白質の精製'同定などを効率的に行うことを目的として開発されたシステムのことをいい、蛋白質解析に適した様々な化学的性質を表面にもたせたプロティンチップと、測定に用いられるプロテインチップリーダーと、測定'解析に使用するソフトウエアがインストールされたコンピュターを有して構成される。 [0014] プロテインチップシステムは、血清や尿、培養液細胞破砕液などクルードなサンプルから、プロテインチップに対するァフィ-ティ—を利用して目的蛋白質を捕捉し、その質量数を測定することができる。ラベルやタグを使わず、プロテインチップ上で簡便に蛋白質の解析ができ、少量のサンプル力も短時間に結果を得ることができる利点がある。プロテインチップリーダーには限定されるわけではないが、例えば時間飛行型質量分析計 (SELDI— TOF— MS)が好適である。時間非行型質量分析計は、プロティンチップ表面に捕捉されている物質にレ—ザ—を照射し、イオンィ匕させる。そのイオン化した物質は電場の中で加速され、飛行管の中を検出器に向かって飛行して V、く。このとき飛行する速度は分子量 (正確には分子量をイオン化された電荷数で割つた値）に比例する。従って、レ—ザ—が照射されて力も検出器に到達するまでの時間を測定することにより、プロテインチップ表面に存在する物質の分子量を知ることができ、目的蛋白質を同定することができる。

発明の効果

[0015] 以上、本発明により、より早期脾癌の陽性率が高ぐ脾癌をより確実に検出する腫瘍マーカー及びそれを用いた膝癌検出キットを提供することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 以下、本発明に係る膝癌検出用腫瘍マーカー、検出キットとしての効果について、実際の患者を対象とした具体的な例を用いて説明する。

[0017] 2001年 6月から 2003年 10月までに治癒手術が施行され、浸潤性脾管癌の病理組織診断のついた 20症例を対象症例とし、これらの術前、術後の血清をサンプルとして用いた。この 20症例を表 1に示す。なお、この症例全てにおいて、術前の血清は補助療法 (化学療法や放射線療法等)を施行しなかった血清を、術後の血清は手術の影響を考慮し、術後状態が安定した後、少なくとも術後 3、 4週間後の術後補助療法を行う前に採取した血清を用いた。なお、各血清は、採血後速やかに 5分間、 300 0回転数で遠心分離を行い、その上清を分注し— 30°Cにて保存した。

[表 1] Background of Patients ( n = 20 )

No Age Sex Stage pre-CEA pre - CA19-9 Apo C-1

1 57 M IVa 2.0 18.1 (+++)

2 68 F I 1.8 46.6 (+)

3 37 I 2.3 26.2 (+++)

4 63 M IVb 5.8 5920.0 (-)

5 65 F III 1.9 11.1 (-)

6 49 IVa 4.3 40.0 (++)

7 65 M III 4.8 2438.0 (+-)

8 54 M III 2.1 61.1 (++)

9 68 F IVa 2.9 25.8 (+-)

10 71 M III 3.5 398.6 (+-)

11 49 M IVa 7.6 636.0 (+-)

12 73 M IVb 4.2 1439.0 (+++)

13 54 F III 4.6 196.1 (+++)

14 69 F IVa 4.8 8190.0 (+++)

15 58 M III 4.4 396.3 (+-)

16 62 M III 3.3 175.2 (++)

17 45 F III 4.0 1205.0 (+-)

18 66 M IVa 5.0 266.7 (+-)

19 61 F IVb 3.4 680.0 (+++)

20 61 F III 2.6 14.3 (++)

Sex Histology

M 12 moderately 12

F 8 poorly 5

Age Invasive carcinoma 2

Mean 59_ 8 derived from IPMT

SD ± 9 Giant cell 1

Stage

2 Survival (M)

III Q Average 25.7

III

₀ MST 23.5

IVa Vb プロテインチップシステムにおけるプロテインチップリーダーとしては時間飛行型質量分析計（SELDI - TOF— MS)を用いた。プロテインチップとしては WCX2 (陽ィオン交換チップ）（CIPHERGEN社製）を用い、 Bufferとしては pH6. 5 (50mM so dium phosphate) ureaを用いた。サンプルの組成は urea;患者血清 20 μ 1+変性 buffer 20 ^ 1+pH buffer 160 l ( lZlO希釈）とし、プロテインチップの各スポットに 100 1ずつ投与し、それぞれ同一サンプルを 2スポットずつ行った。そして各スポットに対しシナピン酸を EAM溶解液（50%ァセトノトリル ZO. 5%TFA)に溶かして塗布した。これをプロテインチップ検出器である SELDI - TOF— MSを用いて血清中にある蛋白を検出し、術前術後の蛋白比較 (Serum protein profiling)を行い、同一個体間で術前上昇し術後低下する peak (蛋白）を見つけ、その候補蛋白として質量数およそ 6630Daの peakを検出した。この代表的な peak例を図 1に、この蛋白の術前、術後 peak intensityを図 2に示す。

[0019] 図 1によると、 pH6. 5の条件下、 urea bufferにおいて術前から術後に有意に pea kが低下する質量がみいだされ、その質量数は 6630Da (p = 0. 0038)であった。 pe akを有する患者を陽性と判定すると 20例中 18例（90%)が脾癌陽性であると判定できた。なお従来の脾癌に対する特異的な腫瘍マーカーである CA19— 9は 20例中 1 5例（75%)の陽性にすぎず、また、 CEAの陽性率は 2例（10%)にすぎなかった。その中で、症例 20は Lewis抗原（a— , b+)患者で CA19— 9正常値であった力この蛋白では陽性であり、更に、症例 2及び 3は早期の脾癌である病期 Iで、両者ともこの蛋白では陽性であった力症例 3では CA19— 9は陰性であった。（表 1参照）すなわち、この蛋白によると、早期の膝癌においてもより高い頻度で検出が可能で、従来の CA19— 9に比しても鋭敏であり、し力も Lewis抗原（a— , b+)患者に対しても検出可能な膝癌検出用腫瘍マーカーとして用いることができることがわ力つた。

[0020] そこで、上記の結果を踏まえ、血清から特異的蛋白質の精製を行い、膝癌検出用のマーカーと期待される蛋白質についての特定を行った。なおこの特異的蛋白質の精製は、至適 pH (pi)の検討及び至適塩 (NaCl)濃度の検討を通じて行った。

[0021] まず、 urea bufferにお!/、て pHを 4. 5, 5. 0, 5. 5, 6. 0と段階的に pHを上げ、ていき、最も 6630Daの peakが高くなる至適 pH、すなわち最も単離、精製するのに適した pHを調べた。その結果、 pH4. 5の条件下で最も peakが高力つた。次に塩濃度を 0、 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500mMと段階的にあげ、て!ヽき、 6630Da の peakが下がり始める塩濃度を調べた。その結果、 500mMまで塩濃度をあげていつても peakが下がり始めることはなかった。

[0022] そして、上記至適な条件を踏まえて FPLCを行い、 peakの高い FPLC fractionを HPLCにかけた。 FPLCの条件は、 NaClを 15mMずつ分離した fractionを作製し、 165mM〜： LOOOmMまで 30mMごとの fractionを用い、 NP 20 chipにて SELDI — TOF— MS解析を行った。 HPLCの条件はリニア—グラディエントにて Buffer;0. 1% (A)〜80% (B)ァセトニトリル、流量； 200 1/minで行い、分離カラムは C— 18 を用いた。これにより精製された目的蛋白を、 N末端アミノ酸シ一クエンスにてァミノ酸 15残基目までを解析し同定を行った結果、 2つの蛋白はそれぞれ 6630Daの本体が mature型の Apolipoprotein C— 1 (57アミノ酸）（成熟型 ApoC— 1蛋白）、 6 420Daの本体は mature型の N末端側のアミノ酸が 2つ欠失した Apolipoprotein C— 1 (55アミノ酸)であることが判明した。この結果を図 3〜9に示す。即ち、上記脾癌検出用腫瘍マーカーとして使用可能な蛋白は、 ApoC— 1蛋白であることが判明した。

[0023] 次に、この蛋白の血清値と臨床病理学的因子及び生存期間との関連を検討することにより、この蛋白と脾癌悪性度との相関がないかを検討した。 ApoC— 1蛋白のプロティンチップシステムによる解析で得られた peak intensityのデータ—（図 2参照）の術前値の中央値で血清 ApoC— 1高値群、低値群を 2群にわけ、 2群間を Kaplan— M eier法にて統計解析を行ったところ、 ApoC— 1血中濃度が高値の患者は無再発生存期間（P = 0. 0011 ;Logrank)及び生存期間（p = 0. 006² ;Logrank)が共に有意に短、ことが判明した（図 10参照)。

[0024] 以上、本脾癌検出用腫瘍マーカーによって、より早期脾癌の陽性率が高ぐ脾癌をより確実に検出する腫瘍マーカー及びそれを用いた膝癌検出キットを実現することができる。さらに、この腫瘍マーカーの値は患者の生存期間と関連があり、膝癌悪性度にも密接な関係を認めることから、予後の指標となる可能性も併せ持つ既存の膝癌検出用腫瘍マーカーにはない特徴を有する。本発明の実施には少量の患者血清で十分であり、また— 30°Cにて保存し、いつでも測定可能である。従って、プロテインチップ法とそのチップに用いること、より好ましくは WCX2 (陽イオン交換チップ）を用いれば、陽性率も高ぐ早期の病期 Iでも陽性で脾癌を検出可能である。なお脾癌検出用腫瘍マーカーとして ApoC— 1を検出する時の好ましい条件は、 pH3以上 7以下であり、より好ましくは pH6以上 7以下である。

[0025] なお、健常人の血清中にも Apolipoprotein C— 1は存在しており、現在まででは脂質代謝関与し、トリグリセリド転送リポ蛋白であるカイロミクロンや VLDLに多く認められ、肝臓の粗面小胞体内で合成され、血中平均濃度は約 6mg/dlといわれている。 A poC— 1の脂質関連の機能は他のアポリポ蛋白に比べ未解明の部分が非常に多ぐ (1) ΑροΕ蛋白の形態を変化させ LDL receptor(LDLR)や LDLR related proteinとリポ蛋白の結合を阻害すること、（2) LCAT活性を促進させる働きをもつこと等が示唆され " いる。 (The interaction or human apolipoproteinし一 I

with sub— micellar phospholipid. Benjamin W.

Atcliffe et al. Eur. J. Biochem. 2001 ;268: 2838-2846.)

[0026] 最近、 ApoC— 1遺伝子の癌への関連が大規模な遺伝子クラスタ—解析により 100 種近くの候補の 1つとしてあげられ、特に脾癌組織で発現が増強されるとの報告があり（Byungwoo et al. Cancer Research 2002年、 61卷、 1833〜1838頁）、他の臓器での正常部、癌部での遺伝子発現の相違について National Cancer Instituteのデーターべース内 (http:// cgap.nci.nih.gov/ bAGE/Viewer

に登録されている。これらのことからも ApoC—1は脾癌検出用腫瘍マーカーとなりうる可能性が非常に高ぐさらに、膝癌患者血清中での ApoC— 1値増加の原因として脾癌組織中での発現増強が遺伝子レベルに留まらず、蛋白レベルでも同様に認められればさらに脾癌特異的なマーカーとしての信憑性が揺るぎな、ものとなる。そこで、本発明者は実際に Apolipoprotein C— 1が脾癌の組織中で発現されているか否かを確認するために手術標本より得られた脾癌の癌部、非癌部の凍結標本を用いて脾癌組織及び正常膝組織の八 0じー1遺伝子発現を1^ー？^？、 Real-time RT— PCRならびに ApoC— 1蛋白発現を Western blot法、さらに今回プロテインチップ解析を行った全 20症例のホルマリン固定されたパラフィン包埋標本を用いて免疫染色法で ApoC— 1蛋白の腫瘍内局在を確認した。

[0027] まず、脾癌組織、正常脾組織および脾癌細胞株の ApoC— 1遺伝子発現を確認するために RT— PCRを行った。まず、凍結標本組織を粉砕し RNeasy Mini

Kit (キアゲン， Tokyo,

Japan)を用い total RNAを作成、その後 T— Primed

First— Strand it for reverse transcription— PCR (アマシャムバイオサイエンス， USA社)を使用し cDNA を作成した。さらに cDNAを AmpliTaq

Gold PCR Master Mix (バイオシステム， Foster City, CA社)を用い、 37サイクノレ、了二リング温度 58°Cの条件下で RT— PCRを行った。得られた PCR産物を 2%ァガロ —スゲノレにて電気泳動をおこなった。 ApoC—lprimerとして Forward— primer, 5， - CTCCAGTGCCTTGGATAAGC

3，

Reverse -primer, 5，一 TTGAGTTTCTCCTTCACTTTCTGA

—3'の配列を用い、 ApoC—lPCR産物の長さは 150bpとなるようデザインした。その結果、癌部では非癌部より明らかに ApoC—1遺伝子が強発現していた。その結果を図 11に示す。

[0028] 次に手術で切除された脾癌の癌部、非癌部各 16検体の凍結標本を用いて上記と同様の過程でそれぞれ cDNAを作成。その後、 ApoC— 1の mRNAレベルを定量化するために LightCycler装置と LightCycler— Fast Start DNA Master SYBR Green I kit and PCR amplifications (ロッシュダイァグノスティック， Tokyo, Japan社)を用い Real— ti me RT— PCRを行った。組織間の mRNA量を同一にするためにそれぞれの GAPDHの mRNA値比を算出した。その結果、すべての検体において癌部では非癌部より Apo C 1遺伝子の発現が増強しており（p>0. 0001) (図 12参照）、同一個体内での癌部、非癌部 13対においては癌部では非癌部より平均値 252倍、中央値 39. 1倍の発現量の差を認めた。

[0029] さらに、上記の検体のうち癌部、非癌部が同一個体力もの対となる 13ペアを癌部の mRNA値 (Tumor)を非癌部の ApoC— lmRNA値 (Normal)でわり、その値の中央値で高値群、低値群の 2群に分け脾癌の悪性度との相関関係を検討したところ、高値群では低値群に比べ有意に生存期間が短く、前述のプロテインチップシステムによる血清中 ApoC— 1と脾癌患者の生存期間の関係と相関する結果となった (図 13参照)。ちなみにこの 13対の患者はプロテインチップシステム解析に用いた患者グループとは異なる群である。

[0030] 続、て、脾癌組織の癌部、非癌部および 4種類の脾癌細胞株 (MIA PaCaII、 PanC— 1、 CFPAC— 1、 AsPC— 1)の ApoC— 1蛋白レベルを確認するために Western blottingを行った。 1次抗体として Mouse— anti— human— Apolipopro tein C— 1 monoclonal antibody (CHEMICON INTERNATIONAL社）を用いた。コント口一ノレとして goat anti- β -actin antibody (Santa Cruz社）を用いた。

[0031] 脾癌、脾正常組織および培養細胞より蛋白を抽出した後、それぞれ 20 /z gの蛋白量をアプライし 10〜20%、および 15— 25%グラディエントゲル（DRC社）を用い SD S— PAGEを行った。その後 PVDF膜（Millipore社）に転写し、 0.5%スキムミルクにて非特異的反応をブロッキングした後 1： 500に希釈した抗 ApoC— 1抗体を 1次抗体として用いた。 2次抗体として 1 : 3000に希釈した Goat—antiMouse—IgG antibo dy (HRP) (Bio— Rad社）を使用した。発色液として ECL液（Amersham Pharma cia Biotech社)を使用した。その結果、 ApoC— 1蛋白発現は脾正常組織においては認められず、脾癌組織で発現しており、さらに 4つの脾癌細胞株すべてにおいて発現を確認した (図 14参照)。

[0032] 次に、今回プロテインチップ解析を行った全 20症例を対象とし、免疫組織学的染色を行い、 ApoC— 1蛋白発現の脾癌組織中の発現及び局在を確認した。免疫染色は 10%ホルマリン固定され、パラフィン包理された組織標本を用い、ストレプトァビジン—ビォチンペルォキシダ―ゼ法（Dako LSAB2 kit, Dako Japan社）にて行つた。その際、抗 ApoC— 1抗体の希釈濃度は 1 : 100で行った。その結果、非癌部特に正常膝管において ApoC— 1蛋白は発現を認めず、癌部においては脾管癌の細胞質に特異的に発現して、ることが確認された（図 15参照)。

[0033] 以上より、本研究者は初めて脾癌組織中及び脾癌細胞株の ApoC— 1遺伝子および蛋白発現を実証することに成功し、さらに脾癌組織における ApoC— 1蛋白発現の局在も明らかとした。これらの研究結果は ApoC— 1蛋白が脾臓の癌化と密接に関係し、発現量の増大に伴い血中に逸脱し、その血清中の濃度を測定することにより鋭敏なかつ確実な膝癌の診断に大きく寄与できることとなる。さらに、膝癌の悪性度の指標としても ApoC— 1蛋白を活用することができる。

[0034] 次に、実際に ApoC— 1蛋白が脾癌の癌化作用にどのように携わっているかを解明するために 4種類の脾癌細胞株（MIA PaCaII、 PanC— 1、 CFPAC— 1、 AsPC— 1)で、 RNAi(RNA interference)を用い ApoC— 1遺伝子を特異的に抑制する siRNAを細胞株に transfectionし検討した。 ApoC— 1遺伝子が真に抑制されているかを確認するために、 Real-time RT— PCRを用い ApoC— 1RNAレベルを定量化し、 ApoC— 1蛋白レベルを Western blotにて検討した。

[0035] まず、 RNAiを用いた ApoC— 1遺伝子の特異的な抑制を起こすための siRNAを 2種類デザインし、より効果的に ApoC— 1遺伝子を抑制することのできる siRNAを選択した。この Oligonucleotideの配列は以下に示す通りである、 Target sequence, siRNA - 2; CTG GAG GAC AAG GCT CGG

GAA₀

[0036] ここで、 Real— time RT— PCRおよび Western blot法は前述と同様の過程でおこなつた。癌細胞で特異的に発現が認められる ApoC— 1にどのような癌化への作用が認められるかを検討する。 RNAiを用ヽることにより特異的に ApoC - lmRNAの発現を抑制することで、脾癌細胞株における ApoC— 1の機能解析を行った。

[0037] まず、 10%FBS入りの培養液で lOxlO⁴ cells/mlの細胞浮遊液を作る。 6well plate に 2ml (20xl0⁴cells/well)ずつ細胞を撒き、顕微鏡で確認、翌日 50%confluentを目標にする。 37°C、 5%C02インキュベータ一にて 24時間培養する。

続いて、 24時間後以下の手順で siRNA Transfectionを行う。

1. Oligoを解凍

2. Transfection

Reagentの調整

Lipofectamine2000 (Invitrogen

life

technologies社) 6 μ 1を upti— MEM medium(GIBし O, Invitrogen Corporation) 244 μ 1 で希釈し、室温で 5分から 10分放置

3. Oligo

dilutionの調整

20nMの annilingした Oligo 10 μ 1< (200ηΜ

final cone.の場合)、濃度により適宜調整する >を Opti— MEM medium 240 μ 1で希釈する。

4. Transfection

Reagent 250 μ 1を oligo dilutionに加え、軽く混合し total 500 μ 1とする。室温で 15分から 20分放置。

5. Opti—MEMを 50Ο 1カ卩ぇ total 1000 にする。

6. plate培養液を吸引し、 Opti— MEM medium 2mlで洗浄。

7. 5の Transfection

mixtureを細胞にふりかける。

8. 37°C、 5%C02インキュベータ一で 4時間培養後、 FBS150 1、 DMEM350 1カロえ、 total 1500 μ 1(10%血清)とする。

その後適宜、細胞から cell lysateを用い mRNA、 proteinを得、その後の実験に使用する。

[0038] 脾癌細胞株の ApoC— 1遺伝子が ApoC— IsiRNAにより特異的に抑制されているかを確認するために、上記の手順で行って得られた cDNAを用い Real— time RT— P CRを行った。その結果、 4種類の脾癌細胞株すべてにおいて 90%前後の遺伝子抑制が認められた。さらに ApoC— 1蛋白レベルを Western blotにて検討したところ、 Ml A PaCa IIに ApoC— IsiRNAを transfectionし 48時間後の蛋白レベルは、 siRNA oligo 最終濃度 20nMより発現が低下して、ることが確認できた（図 16参照)。

[0039] ApoC— 1の脾癌細胞株における細胞増殖への関わりを調べる目的で Cell

proliferation assayを行つ 7こ。 96well microplateに 0. 5xl0⁴個/ lwellの糸田胞入れ、 24時間 37°C、 5%CO条件下でインキュベートし、その後特異的 ApoC—lsiRN

2

Aを最終濃度 20nMとなるように、 transfection用培養液に混入し、 4時間後培養液を交換し、同条件下でインキュベートし細胞培養を行い、 24、 48、 72、 96、 120、 144 時間後に Cell Counting Kit— 8 [CCK— 8] ( DOJINDO JAPAN社）を用い Cel 1 proliferation assayを行った。吸光度 450nmにて測定し、培養細胞に特異的 ApoC IsiRNAを投与した細胞とコントロール siRNAを投与した細胞との増殖能を比較したところ特異的 ApoC— IsiRNAを投与した細胞の方がコントロールの細胞より細胞増殖能が有意に抑制されると、う結果を得た（図 17参照)。ネガティブコント口ールとして non— silencing siRNA (Luciferase;GL2) (キアゲン、 Japan社）を使用した。

図面の簡単な説明

[図 1]プロテインチップシステムを用いた脾癌術前術後血清の典型的な protein peak ( 質量 6000〜7000Da)を示す図。上が術前、下が術後の結果を示す。

[図 2]質量数 6630Daの蛋白の術前術後における発現を検討した結果を示す図。

[図 3]プロテインチップシステムを用いた解析にぉ、て、 pHを変化させた場合における結果を示す図。

[図 4]プロテインチップシステムを用いた解析にお!、て、 NaCl濃度を 0mM〜500m Mまで段階的に変化させた場合における結果を示す図。

[図 5]HPLCの peakを示す図。

[図 6]peakの高い HPLC fractionに対し SELDI— TOF— MSを用いて解析を行つた結果を示す図。

[図 7]2回目の HPLCの peakを示す図。

[図 8]peakの高い HPLC fractionに対し SELDI— TOF— MSを用いて解析を行つた結果を示す図。

[図 9]N末端アミノ酸配列の分析結果を示す図。

[図 10]プロテインチップシステム解析で得られた術前血清における ApoC— 1蛋白の peakintensity中央値で分けた 2群間を Kaplan— Meier法により無再発生存期間及び生存期間の解析を行った図。

[図 11]脾癌組織、正常脾組織および脾癌細胞株の ApoC— 1遺伝子発現を RT— PC Rで検討した図。

[図 12]脾癌の癌部、非癌部各 16検体の凍結標本を用いて Rea卜 time RT— PCRを行い、 ApoC—lmRNAを定量化した図。

[図 13]ApoC—lmRNA値の中央値で 2群間に分けたときの悪性度との相関を示す図

[図 14] ApoC— 1蛋白発現を脾正常および癌組織、 4つの脾癌細胞株において West ernblot法にて確認した図。

[図 15]、免疫組織学的染色を行い、 ApoC— 1蛋白発現の脾癌組織中の発現及び局在を確認した図。

[図 16]睥癌細胞株の ApoC— 1遺伝子を ApoC— IsiRNAにより特異的に抑制し、それを Real— time RT— PCRと Western blot法を用いて確認した図。

[図 17]ApoC— 1の脾癌細胞株における細胞増殖への関わりを Cell proliferationassa yにて検討した図。

Claims

請求の範囲

[1] ApoC— 1蛋白力もなる脾癌検出用腫瘍マーカー。

[2] ApoC— 1蛋白を至適条件下で検出するためのプロテインチップを含む脾癌検出用キット。

[3] 前記プロテインチップは、請求項 2記載の膝癌検出用キット。