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WO2006115080A1 - 多能性幹細胞増殖促進剤 - Google Patents

多能性幹細胞増殖促進剤 Download PDF

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Publication number
WO2006115080A1
WO2006115080A1 PCT/JP2006/307898 JP2006307898W WO2006115080A1 WO 2006115080 A1 WO2006115080 A1 WO 2006115080A1 JP 2006307898 W JP2006307898 W JP 2006307898W WO 2006115080 A1 WO2006115080 A1 WO 2006115080A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
visfatin
cell
pluripotent stem
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/307898
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shinya Yamanaka
Mirei Murakami
Masako Nishizawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nara Institute of Science and Technology NUC
Sumitomo Chemical Co Ltd
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Nara Institute of Science and Technology NUC
Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nara Institute of Science and Technology NUC, Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd, Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Nara Institute of Science and Technology NUC
Publication of WO2006115080A1 publication Critical patent/WO2006115080A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]

Definitions

  • the present invention relates to a proliferation promoter for pluripotent stem cells.
  • Embryonic stem cells are pluripotent stem cells derived from the inner cell mass present in the blastocyst before implantation, and were first established in 1981 in mice. (See Non-Patent Document 1). ES cells can proliferate indefinitely in culture, presumably retaining their ability and normal chromosome type. By injecting it into the blastocyst, it can participate in embryonic development and create a chimeric animal. Since the first knockout mouse was created in 1987 (see Non-Patent Document 2), a large number of knockout mice have been created so far, and the functions of their gene products have been analyzed in detail.
  • Non-Patent Document 3 The power that mouse ES cells have been used as a tool for developmental engineering so far The establishment of human ES cells was reported in 1998 (see Non-Patent Document 3), which is expected to be applied in regenerative medicine. Began to be. If human ES cell strength can be differentiated into blood cells, nerve cells, cardiomyocytes, etc. in the future, cell transplantation therapy will enable treatment of diseases that currently have no cure. This expectation is due to the ability of ES cells to differentiate into all somatic cells (potentiation of differentiation) and the ability to proliferate indefinitely while maintaining an undifferentiated state (self-renewal ability).
  • ES cells are becoming increasingly important for research and clinical applications in regenerative medicine, but at present, the presence of serum or feeder cells is essential for their culture. is there.
  • mouse ES cells can be maintained without using feeder cells with a serum-free medium supplemented with LIF when the number of cells is large.
  • serum or feeder cells are essential.
  • serum and feeder cells are essential for culturing human ES cells.
  • LIF is ineffective in human ES cells.
  • human ES cells are clinically applied, it is essential to culture them without using animal serum or feeder cells from the viewpoint of safety. Therefore, ES in serum-free medium There is a desire to identify factors that maintain cell growth.
  • Visfatin is also known as PBEF (Pre-B cell colony-enhancing factor), and in previous studies, it has been reported that it is a differentiation and proliferation stimulating factor of B cell progenitor cells. (See Patent Document 1 and Non-Patent Document 4). Recently, it has been clarified that visfatin has an insulin mimic effect of binding to the insulin receptor and lowering the blood gnolecose concentration (see Non-Patent Document 5). However, the relevance of ES cells to embryo development has not been clarified.
  • PBEF Pre-B cell colony-enhancing factor
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 8-505373
  • Non-Patent Document 1 Evans, M. J. and Kauftnan, M. H. Nature, 292 (5819): pl54-156 (198 1)
  • Non-Patent Document 2 Hooper, M. et al, Nature, 326 (6110): p292-295 (1987)
  • Non-Patent Document 3 Thomson, JA et al., Science, 282 (5391): pi 145-1147 (1998)
  • Non-Patent Document 4 Samal, B. et al., Mol. Cell. Biol, Feb; 14 (2 ): pl431-1437 (1994)
  • Non-Patent Document 5 Fukuhara A. et al., Science, vol.307, p426-430 (2005)
  • the present inventors analyzed the expression of the visfatin gene in ES cells.
  • the bisfatin gene was highly expressed in undifferentiated ES cells, whereas its expression was greatly increased by differentiation. Decreasing was clearly a force. At the protein level as well, it became clear that the abundance of visfatin similarly decreased with ES cell sorting.
  • the present inventors produced a knockout mouse in order to analyze the function of visfatin in vivo.
  • Heterogeneous mutant mice developed normally and had fertility, but sugar Abnormalities in metabolic capacity were observed.
  • homozygous mice were not born from crosses between heterozygous mice.
  • homozygous mutant mice were found to be lethal immediately after implantation.
  • blastocysts homo-deficient in visfatin are cultured, an inner cell mass is normally formed, and this inner cell mass force ES cell colony is formed, whereas visfatin-deficient blastocyst is cultured in vitro.
  • the inner cell mass and the subsequent ES cells could not grow. From this result, it became clear that visfatin is essential for the proliferation of pluripotent stem cells.
  • the present inventors also used a visfatin gene hetero-knockout ES cell (bisfatin hetero KO-ES cell) using a serum-free medium containing no insulin !, a serum-free medium containing insulin, and a serum medium.
  • a visfatin gene hetero-knockout ES cell bisfatin hetero KO-ES cell
  • serum-free medium containing no insulin a serum-free medium containing insulin
  • serum-free medium containing insulin serum-free medium containing insulin
  • the present inventors have introduced a siRNA of visfatin into ES cells to knock down the amount of protein and examined the growth rate. As a result, the growth rate was significantly reduced compared to wild-type ES cells. From the above, it was confirmed that visfatin was a factor that maintained the proliferation of ES cells as described above.
  • the visfatin of the present invention can be used as a proliferation promoter for pluripotent stem cells such as ES cells. Visfatin is particularly useful because it is a factor expressed (produced) by pluripotent stem cells themselves.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention provides:
  • a method for culturing pluripotent stem cells characterized by using the culture solution or culture kit according to (3) or (4) above,
  • pluripotent stem cell is an embryonic stem cell.
  • the visfatin and visfatin gene of the present invention are useful as a proliferation promoter for pluripotent stem cells such as ES cells.
  • pluripotent stem cells such as ES cells.
  • a serum-free medium serum-free medium
  • visfatin (visfatin protein) is not particularly limited as long as pluripotent stem cell proliferation promoting activity is maintained, but specifically, the following (a) to (1) :
  • Examples of the protein having any amino acid sequence and having the activity of promoting proliferation of pluripotent stem cells are exemplified.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of human visfatin, which is described in the literature (Mol. Cell. Biol, Feb; 14 (2): pl431-1437 (1994)) and GenBanc. Acc. No. U02020 is a known sequence.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of mouse bisfatin, and is a known sequence in GenBank Acc. No. AF234625.
  • amino acid deletion, addition or substitution in (b) and “80% or more sequence identity” in (e) and (h) include, for example, SEQ ID NO: 2 or 4 It includes the processing that a protein having the amino acid sequence shown in the cell undergoes in the cell, the species that the protein is derived from, species differences, individual differences, differences between tissues, and the like, and artificial amino acid variations.
  • amino acid modification As a technique for artificially performing the “amino acid deletion, addition, or substitution” in the above (b) (hereinafter sometimes referred to as amino acid modification as a whole), for example, SEQ ID NO: 2 or 4
  • a conventional site-directed mutagenesis can be performed on the DNA encoding the amino acid sequence shown in FIG.
  • a site-specific mutation introduction method for example, a method using amber mutation (gapped 'duplex' Method, Nucleic Acids Res., 12,9441-9456 (1984)), and a PCR method using a mutagenesis primer.
  • the number of amino acids modified as described above is at least one residue, specifically one or several, or more.
  • the number of such modifications may be within a range where the pluripotent stem cell proliferation promoting activity of the protein can be found.
  • the modification relating to amino acid substitution is particularly preferable.
  • the substitution is more preferably substitution with an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, pK, and structural features.
  • Examples of such substitution include (1) glycine, alanine; (2) parin, isoleucine, leucine; (3) aspartic acid, glutamic acid, asnoragin, glutamine, (4) serine, threonine; (5) Substitution within the group of lysine, arginine; (6) ferulanine, tyrosine.
  • sequence identity refers to sequence identity or homology between two DNAs or two proteins.
  • sequence identity is determined by comparing two sequences that are optimally aligned over the region of the sequence to be compared.
  • the DNA or protein to be compared may have an addition or a deletion (for example, a gap) in the optimal alignment of the two sequences.
  • Such sequence identity can be calculated, for example, by creating an alignment using the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673_4680 (1994)) using Vector NTI.
  • sequence identity is measured using sequence analysis software, specifically analysis tools provided by Vector NTI, GENETY X-MAC, and public databases, such as the website address http It is generally available at: //www.ddbj.nig.ac.jp.
  • sequence identity may be 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • hybridization under stringent conditions in (i) above, the hybridization performed here is, for example, by Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T., Molecular Claw- 2nd edition (Molecular Cloning 2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratories (Cold Spring Harbor Laboratory press), etc. It can be performed according to the usual method.
  • under stringent conditions means, for example,
  • a hybrid containing 6 X SSC (1.5 M NaCl, 0.1M trisodium citrate solution as 10 X SSC), 50% formamide in a solution at 45 ° C, 2 X SSC (Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6).
  • the salt concentration in the washing step can be selected from, for example, 2 X SSC, 50 ° C conditions (low stringency conditions) to 0.2 X SSC, 50 ° C conditions (high stringency conditions).
  • the temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 ° C. (high stringency conditions). It is also possible to change both the salt concentration and the temperature.
  • the "partial amino acid sequence" in (j) above is any amino acid sequence of (a) to (i) above, preferably 15 to L00 residues in the amino acid sequence of (a) above, preferably Represents a partial amino acid sequence of 15 to 50 residues, and is not particularly limited as long as the peptide fragment having the amino acid sequence ability has the activity of promoting the proliferation of pluripotent stem cells.
  • the visfatin of the present invention shown above may be derived not only from humans and mice but also from any species, and specifically, mammals such as humans, mice, rats, monkeys, marmosets, horsetails, horses, etc. Animal-derived visfatin is exemplified.
  • visfatin gene refers to a gene encoding visfatin. Specifically, a gene encoding a protein having the amino acid sequence ability of any of the above (a) to (j) and having the activity of promoting proliferation of pluripotent stem cells is shown.
  • (H) a nucleotide sequence represented by nucleotides 96 to 1571 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3;
  • Examples thereof include a gene encoding such a protein, wherein the protein encoded by the nucleotide sequence is a protein having a proliferation promoting activity of pluripotent stem cells.
  • the visfatin gene can be obtained by conventional genetic engineering methods (for example, Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning 2nd edition), published by Konored Spring Nono 1 Laboratory (Cold Acquired according to the method described in Spring Harbor Laboratory pres). Specifically, in the case of the human 'visfatin gene represented by SEQ ID NO: 1, for example, a cDNA library derived from human intraperitoneal adipose tissue was used as a cage, and an appropriate part of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 was used as a primer. Cloning can be performed by performing PCR.
  • mouse bisfatin gene shown in SEQ ID NO: 3 for example, by performing a PCR using a mouse liver-derived cDNA library as a cage and using an appropriate part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 as a primer. Can be cloned.
  • a visfatin protein is produced and obtained according to a normal genetic engineering method by using the visfatin gene. For example, it can be obtained by preparing an expression vector that can express the visfatin gene in a host cell, introducing it into the host cell, transforming it, and then culturing the transformed host cell (transformant). Visfatin protein can be obtained from the culture medium.
  • the visfatin gene expression vector includes, for example, genetic information that can be replicated in a host cell, can be propagated autonomously, can be easily isolated and purified from the host cell, and functions in the host cell. Examples include those in which a gene encoding the visfatin of the present invention is inserted into an expression vector having a detectable promoter and a detectable marker.
  • the expression vector can be appropriately selected according to the host to be used and the purpose, and examples thereof include plasmids, phage vectors, and virus vectors.
  • examples of the vector include plasmid vectors such as pUC118, pUC119, pBR322, pCR3, and pETlla, and phage vectors such as ⁇ and ⁇ gtll.
  • examples of the vector include pYES2, pYEUra3 and the like.
  • the host is an insect cell, pAcSGHisNT-A and the like can be mentioned.
  • plasmid vectors such as pCEP4, pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc / RSV, pRc / CMV, pcDL-SRa296, retrovirus vector, adenovirus vector, adeno Virus vectors such as related virus vectors. These are vectors available to those skilled in the art.
  • the vector may appropriately have factors such as a promoter capable of inducing expression, a gene encoding a signal sequence, a marker gene for selection, and a terminator.
  • a sequence expressed as a fusion protein with thioredoxin, His tag, or GST may be added to facilitate isolation and purification.
  • a GST fusion protein vector such as pGEX4T
  • an appropriate promoter such as lac, tac, trc, tr p, CMV, or SV40 early promoter
  • a tag sequence such as Myc or His Vectors (such as pcDNA3.1 / Myc-His) and vectors that express fusion proteins with thioredoxin and His tags (pET32a)
  • a transformant By transforming a host with the visfatin gene expression vector prepared above, a transformant (transformed cell) containing the expression vector can be prepared.
  • the host used here include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like.
  • E. coli include E. coli K-12 strains HB101 strain, C600 strain, JM109 strain, DH5 ⁇ strain, AD494 (DE3) strain, and the like.
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae.
  • animal cells include L929 cells, BALB / c3T3 cells, C127 cells, CHO cells, COS cells, Vero cells, Hela cells, and 293-EBNA cells. Insect cells include sl9.
  • a method for introducing an expression vector into a host cell a conventional method suitable for the host cell may be used. Specific examples include a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, an electo-poration method, a method using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL), and a method using a virus vector.
  • a transformant in which the expression vector is introduced into the host cell can be selected by culturing in a normal medium containing a selection marker.
  • the transformant can be cultured by a usual method used for culturing microorganisms, yeast, insect cells or mammalian cells.
  • culturing is performed in a medium appropriately containing a suitable carbon source, nitrogen source, and micronutrients such as vitamins.
  • the culture method may be either solid culture or liquid culture, and liquid culture such as aeration and agitation culture is preferable.
  • a visfatin protein can be produced by continuing to culture the transformant under suitable conditions.
  • the obtained protein can be further isolated and purified by a general biochemical purification means.
  • the purification means include salting out, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and the like.
  • visfatin protein is expressed as a fusion protein with the aforementioned thioredoxin, His tag, GST or the like, it can be isolated and purified by a purification method utilizing the properties of these fusion protein and tag.
  • Expression vector expressing human visfatin protein (SEQ ID NO: 2) prepared as described above 1.
  • Transform mammalian cells such as COS-1.
  • OPTI-MEM medium containing antibiotics
  • human visfatin is secreted into the medium.
  • the culture supernatant is filtered through an ultrafiltration membrane, and purified on human bisfatin proteins by using DEAEsepharose, ANX- Sepharose, Octy Oct Sepharose, Mono-Q columns (all manufactured by Amersham Pharmacia).
  • This part is encoded to produce a protein having an amino acid sequence with methionine added to the amino terminus of the amino acid sequence shown in amino acid numbers 27 to 491 of human visfatin protein (SEQ ID NO: 2).
  • the gene to be cloned is cloned into an expression vector for Escherichia coli such as pETl la (Novagen).
  • E. coli (DE3 strain: Novagen, etc.) is transformed with the expression plasmid.
  • the obtained transformant was cultured at 37 ° C until the OD 600 reached 0.6, and isopropyl mono- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside (hereinafter referred to as IPTG) at a final concentration of ImM was added. And further overnight culture.
  • IPTG isopropyl mono- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside
  • the cells were then collected by centrifugation, and the cells were collected from lOOmM Tris-hydrochloric acid ( ⁇ 7.6), 5 mM ethylenediammine tetraacetate ninatrime (hereinafter referred to as EDTA '2Na), 5 mM dithiothreitol (hereinafter referred to as DTT). ) And ImM phenol methylsulfur fluoride (hereinafter referred to as PMSF) and suspended in a buffer (hereinafter referred to as buffer A) and sonicated (3 times for 5 minutes under ice-cooling). ), And centrifuge the lysate at 12,000 Xg for 15 minutes at 4 ° C to collect the sediment (hereinafter referred to as the inclusion body fraction).
  • buffer A a buffer
  • sonicated 3 times for 5 minutes under ice-cooling
  • buffer A containing 2M urea is added, suspended, and subjected to ultrasonic treatment (XI times for 5 minutes under ice-cooling). The solution after sonication is centrifuged at 12,000 Xg for 15 minutes at 4 ° C, and the resulting precipitate is suspended by adding buffer A containing 4M urea, sonication, and centrifugation. The operation of separating is performed in the same manner as described above. Furthermore, buffer A containing 6M urea is added to the resulting precipitate, followed by suspension, sonication, and centrifugation as described above.
  • the obtained precipitate was suspended in a buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 2 mM DTT and 8 M urea, and the suspension was centrifuged at 12,000 Xg for 15 minutes at 4 ° C. Collect the supernatant. The obtained supernatant was added to HiLoad Superdex 200pg (A flow rate; 1. OmlZ min., Detection wavelength: 280 nm). Peak fractions eluting between 45 and 55 minutes are collected and concentrated with Centricon (Grace Japan, molecular weight cut off 30 000), then Mono Q HR10 / 10 ion exchange column (Falmacia) For chromatography (flow rate 1.
  • pluripotent stem cells refer to cells that maintain undifferentiated / pluripotent typified by ES cells.
  • the ES cell may be an ES-like cell generated by nuclear reprogramming from a somatic cell.
  • Embryonic Germ Cell derived from primordial germ cells
  • mGS cell mutipotent germline stem cell isolated from testis
  • bone marrow Examples include multipotent adult progenitor cells (MAPC) that are released.
  • MPC multipotent adult progenitor cells
  • the “proliferation promoting activity of pluripotent stem cells” possessed by visfatin or a visfatin gene is compared to the proliferation of pluripotent stem cells in the absence of visfatin or without introduction of a visfatin gene.
  • it means such activity that the growth is promoted when visfatin is added to the medium or when the bisfatin gene is transfected into cells.
  • the proliferation promoting activity of pluripotent stem cells possessed by visfatin or visfatin gene can be measured, for example, as follows.
  • pluripotent stem cells are cultured in a serum-free medium supplemented with visfatin (or its candidate substance) at a concentration of about lng / ml to 10 ⁇ g / ml. It can be examined by measuring the cell growth promoting activity. At that time, it is preferable to cultivate the same pluripotent stem cells in a serum-free medium without bisfatin as a control (negative control cells) and to compare with these negative control cells. When cell growth is promoted when visfatin (or its candidate substance) is added compared to negative control cells, it is judged that the bisfatin (or candidate substance) used has cell growth promoting activity.
  • the same pluripotent stem cells are cultured using a serum medium (positive control cells) and compared with the positive control cells.
  • a serum medium positive control cells
  • the visfatin used or (Candidate substance) is judged to have cell growth promoting activity.
  • the evaluation of maintaining pluripotency can be easily evaluated by analyzing the expression of marker genes such as Oct3 / 4 and ECAT genes by Northern blot, RT-PCR, Western plot, and immunostaining. It can also be determined by examining whether a chimeric mouse is born by microinjecting cells into a blast cyst.
  • the serum-free medium used for the measurement is any medium that does not contain serum. Any serum-free medium can be used. It may also include growth factors and site power in.
  • the serum-free medium is a serum-free medium in which the proliferation of pluripotent stem cells (pluripotent stem cells used for measurement) is not normally maintained in the absence of visfatin.
  • ES cells are preferred as pluripotent stem cells used for measurement. Specifically, RF8 cells (Meiner'V. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14041-14046 (1996)), JI cells (Li, E. et al., Cell, 69 : 915-926 (1992)), CGR8 cells (NicholsJ. Et al, Development, 110: 1341-1348 (1990), MG1.19 cells (Gassmann, M. et al., Proc. Natl. Acad.
  • mouse ES cells include KhES-l, KhES- 2 or KhES-3 (the Center for Stem Cell Medicine, Kyoto University Research Institute), and monkey ES cells include force-quizal ES cells (Asahi Techno Glass).
  • a transformant prepared by transfecting a pluripotent stem cell with a visfatin gene or candidate gene incorporated into an expression vector is used.
  • Serum-free medium It can be performed by culturing and measuring whether cell growth is promoted.
  • pluripotent stem cells are cultured using a serum medium (positive control cells) and compared with the positive control cells. Visfatin gene-introduced cells maintain approximately 10% or more of the growth compared to positive control cells, and the cells maintain pluripotency. ) Is judged to have cell growth promoting activity.
  • the evaluation of maintaining pluripotency can be easily performed by analyzing the expression of marker genes such as Oct3 / 4 and ECAT gene group by Northern blot, RT-PCR, Western blot, and immunostaining. In addition, the cells become blast cysts It can be determined by examining whether a small mouse is injected and a chimeric mouse is born.
  • Gene transfer to pluripotent stem cells can be performed by a generally known technique. Specifically, for example, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electoporation method, a DEAE-dextran method, a method using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; G3 ⁇ 4co-BRL), or a method using a virus vector (virus And the like).
  • the ES cells and serum-free medium used for the measurement are the same as in the case of visfatin.
  • cell proliferation promoting activity can also be measured by a technique using bisfatin gene hetero knockout ES cells as described in Examples 6 and 7.
  • the proliferation promoter for pluripotent stem cells containing visfatin of the present invention as an active ingredient is used as it is or a known pharmaceutically acceptable carrier (excipient, diluent, extender, binder, lubricant) Agents, flow aids, disintegrants, surfactants, etc.), conventional additives, stabilizers, and the like can be mixed to prepare a reagent composition or a pharmaceutical composition.
  • the composition can be produced by blending and dissolving bisfatin, which is an effective component, in an acceptable normal carrier, excipient, binder, stabilizer, diluent, buffer and the like.
  • the amount of visfatin of the present invention added to the medium (culture solution) may be a concentration of about 1 ng / ml to 10 ⁇ g / ml.
  • the concentration is preferably about 0.1 ⁇ g / ml to 10 g / ml.
  • pluripotent stem cells to which visfatin of the present invention is applied include ES cells.
  • the ES cell may be an ES cell generated by reprogramming a somatic cell nucleus.
  • Embryonic Germ Cell derived from primordial germ cells
  • mGS cell mutipotent germline stem cell isolated from testis
  • MPC Multipotent adult progenitor cell isolated from bone marrow, etc.
  • the origin of these pluripotent stem cells may be derived from humans, monkeys, rats, mice, marmosets, and the like.
  • the serum-free medium to which visfatin is added may be any serum-free medium as long as it does not contain serum and is a practical medium for research and clinical applications. It is also acceptable to include factors such as growth factors and site power-in.
  • the visfatin of the present invention may be added to arabic bullying medium (culture medium), prepared as a culture medium for pluripotent stem cells, and then added to the cells for cell culture. Alternatively, the visfatin of the present invention may be added to the medium after contacting the serum-free medium with the cells.
  • the visfatin of the present invention may be included as one component of a pluripotent stem cell culture kit which may be packaged alone. In the case of a kit, as components in the kit other than visfatin, other factors that can be simultaneously contained in the serum-free medium, such as BMP4 and LIF, can be listed.
  • the proliferation promoter for pluripotent stem cells containing the visfatin gene of the present invention as an active ingredient is used in a form incorporated into an expression vector that is expressed in pluripotent stem cells that are mammalian cells.
  • the visfatin gene (visfatin gene expression vector) can be formulated as it is or using a commonly used stabilizer, buffer, solvent and the like.
  • the visfatin gene may be chemically modified! Examples of the chemically modified compounds include, for example, phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphotriester, alkylphosphonate, and alkylphosphoamidate, which enhance the ability to migrate into cells or stability in cells. Derivatives ("Antisense RNA and DNA" published by WILEY-LISS, 1992, pp.l-50, J. Med. Chem. 36: 1923-1937, 1993) are included. These can be synthesized according to conventional methods.
  • Transfection into cells can be performed using either a non-viral introduction method or a viral introduction method.
  • non-viral introduction method examples include a microinjection method, a calcium phosphate method, an electo-poration method, a DEAE-dextran method, and a method using a lipid for gene introduction (Lipofect amine, Lipofectin; Gibco-BRL).
  • methods using a recombinant virus include a method using a virus vector such as a retrovirus, an adenovirus, and an adeno-associated virus.
  • the amount of the visfatin gene of the present invention introduced into the cell may be an amount known to those skilled in the art used for normal transfection.
  • the pluripotent stem cells to be applied are the same as in the case of the bisfatin supplemented card.
  • ES cell RF8 undifferentiated mouse ES cell RF8 (derived from 129ZSvJae mouse), serum medium (DMEM (Nacalai), 10 7 Unit LIF (Chemicon)), 1.0% L-glutamine ( Invitorogen), 0.5% penisline streptomycin (Invitorogen), 0.2% 2-mercaptoethanol (Invitorogen), 1.0% MEM non-essential amino acid solution (Invitorogen), 14.8% FCS (Biowest)) ES cells were differentiated by culturing for 6 days. The differentiated ES cells were treated with TRIzoKGIBCO BRL), extracted with chloroform and ethanol precipitated, and suspended in L DEPC-treated water to obtain total RNA.
  • each tissue extracted from B6 strain mice was also treated with TRIzoKGIBCO BRL), and total RNA was similarly obtained according to the protocol attached to the reagent.
  • the extracted total RNA (lysate) was quantified by measuring the absorbance with a UV spectrometer (260 nm, 280 nm).
  • the reverse transcription reaction was carried out using REVERTRA ACE a (Toyobo Co., Ltd.), and the obtained cDNA was used as a saddle to reflect the expression level of the mouse Visfatin gene (SEQ ID NO: 3).
  • REVERTRA ACE a Toyobo Co., Ltd.
  • the PCR method used here was a primer GE-U8 (SEQ ID NO: 5; TTCCTACTTTGAATG CCGTGAA) and primer AntiL-15Sall (SEQ ID NO: 6; GCTGTCGACTGGAACAG AATAGCCTGGAA). The reaction was performed. The PCR is followed by DNA denaturation (94 ° C, 1 min), 30 cycles of denaturation (94 ° C, 10 sec), annealing (55 ° C, 30 sec), one extension (68 ° C, 1 min), Further, the final elongation (68 ° C, 5 minutes) was performed. As a positive control, the same reaction was performed for the NAT1 gene (Yamanak a, S. et al., Embo J., 19, 5533-5541 (2000)).
  • mice Visfatin gene was highly expressed in undifferentiated ES cells, whereas its expression was greatly reduced in the separated ES cells. In mouse tissues, high expression was observed in brown fat, mesenteric fat, peritesticular fat, kidney, and muscle.
  • a total of 3 clones of # 8—7, # 8—8, and one clone of wild-type ES cell RF8 were placed in 24 well plates (Gibco), 2.5 x 4 each, V ⁇ N2 medium without insulin (F12—GMEM (Invitrogen), N2 mixture (100 ⁇ g / ml Apo—transferin (Sigma)), 50 ⁇ g / ml BSA (G3 ⁇ 4co), 6 ng / ml Progesterone (Sigma), 16 ⁇ g / ml Putrescine (Sigma), 30 nM SodiumSelenite (Sigma)), lOng / ml humanBMP4 (R & D), 10 3 Unit LIF (Chemicon), 1.0% L-glutamine (Invitorogen), 0.5% penicillin streptomycin (Invitorogen), 0.2% 2-mercaptoethanol (Invitorogen)), N2 medium containing insulin (Insulin (Sigma) 25 ⁇ g
  • Visfatin heterozygous mutant (KO) mice are mated and blastocysts (blastocysts) 3.5 days after fertilization From the female uterus, transferred to a gelatin-coated 4-well dish (manufactured by NUNC), ES medium (DMEM (Nacalai), 10 7 Unit LIF (Chemicon), 1.0% L-glutamine (Invito rogen) ), 0.5% penisrin streptomycin (Invitorogen), 0.2% 2-mercaptoethanol (Invitorogen), 1.0% MEM non-essential amino acid solution (Invitorogen), 14.8% FCS (Biowest)) Culture was performed. The culture was performed for 6 days. The results are shown in Figure 3.
  • ES cell RF8 undifferentiated mouse ES cell RF8 (derived from 129ZSvJae mouse), serum medium (DMEM (Nacalai), 10 7 Unit LIF (Chemicon)), 1.0% L-glutamine ( Invitorogen), 0.5% penisline streptomycin (Invitorogen), 0.2% 2-mercaptoethanol (Invitorogen), 1.0% MEM non-essential amino acid solution (Invitorogen), 14.8% FCS (Biowest)) ES cells were differentiated by culturing for 6 days. ES cells lacking the Visfatin gene heterozygously (JP-A 2004-154135) were also differentiated under the same conditions.
  • Undifferentiated ES cells, differentiated ES cells, undifferentiated visfatin hetero KO ES cells, and differentiated visfatin hetero KO ES cells were collected and subjected to SDS-PAGE.
  • the protein on the SDS-PAGE gel was transferred to PVDF membrane (Millipore) by the semi-dry method.
  • the membrane thus prepared was washed with TTBS buffer (20 mM Tris—HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.05% Na3N), and then in TTBS buffer containing 3% gelatin. And kept at 37 ° C for 1 hour.
  • the membrane was treated with the rabbit anti-visfatin polyclonal antibody described in JP-A-2000-356637. 1 / 1,000 dilution with TTBS buffer containing 0 urushi serum albumin The solution was incubated at 37 ° C for 1 hour. The membrane was then washed 3 times with TTBS buffer at room temperature for 5 minutes x 3 times in a solution of horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit Ig G antibody diluted 1,000-fold with TTBS containing 1% ushi serum albumin. And kept at 37 ° C for 1 hour. Thereafter, the membrane was washed 3 times with TTBS buffer at room temperature for 5 minutes, and a signal derived from visfatin protein was detected using LAS-3000 (Fuji Film). The results are shown in Fig. 4.
  • the visfatin protein band specifically recognized by the anti-visfatin antibody was quantified using analysis software of LAS-3000 (Fuji Film). As a result, a large amount of visfatin protein was found in undifferentiated ES cells. In contrast to the expression, the amount of protein was significantly reduced after separation. Moreover, in visfatin hetero KO ES cells, the amount of visfatin protein in an undifferentiated state was significantly reduced as compared to wild type ES cells, and further decreased by sorting. Based on the above, it was confirmed that the abundance of visfatin significantly decreased even at the protein level as ES cells differentiated.
  • siRNA sequence for the Visfatin gene (GTTGTTGCTGCCTTGTCTT; SEQ ID NO: 9) was synthesized. This is a retroviral vector with a U6 promoter (PMOW3.3-PGK-
  • Serum medium (DMEM (Nacalai), 10 7 Units LIF (Chemicon), 1.0% L-glutamine (Invitrogen), 0.5% penisline streptomycin (Invitorogen), 0.2% 2-mercaptoethanol (Invitrogen) Invitorogen), 1.0% MEM non-essential amino acid solution (Invitorogen), 14.8
  • Each colony was cultured in ES medium for 3 days. After culturing, the cells were collected and subjected to SDS-PAGE. The protein on the SDS-PAGE gel was transferred to a PVDF membrane (Millipore) by the semi-dry method. The membrane thus prepared was washed with TTBS buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, 0.05% Na3N), and then in TTBS buffer containing 3% gelatin. Incubated at 37 ° C for 1 hour. Thereafter, the membrane was incubated at 37 ° C.
  • TTBS buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, 0.05% Na3N
  • the growth rate of the three types of Visfatin knockdown ES cells in the serum-containing medium was significantly lower than that of the control wild-type ES cells.
  • the decrease in the growth rate was more remarkable, about half that of the control cells. From the above results, it was shown that the proliferation of ES cells was suppressed by reducing the protein amount of Visfatin, that is, Visfatin was involved in promoting the proliferation of ES cells.
  • pCX-EGFP was treated with Ndel / EcoRI, and the CAG promoter part excised was inserted into the Ndel / EcoRI site of pIRE S puro (clontech).
  • PCR was performed using a cDNA library derived from mouse liver (clontech) to amplify the sequence encoding the entire mouse Visfatin cDNA. The obtained fragment was incorporated into PCR2.1 (Invitrogen) using the TA cloning method.
  • RNA (1 ⁇ g) of RF8 ES cells was made into a saddle and an RT product amplified by Oligo dT primer was made into a saddle.
  • STMO-mou-S-ORF-1 SEQ ID NO: 7; ATGAATGCTGCGGCAGAAGCCG AGTT
  • STMO-mou-AS-770 SEQ ID NO: 8; TGGTCTTTCCCCCAAGCCGTTA TGGT
  • KOD Plus (Takara) was used for the PCR extension reaction. PCR is followed by DNA denaturation (94 ° C, 10 seconds) followed by 35 cycles of denaturation (94 ° C, 2 seconds) —annealing (55 ° C, 2 seconds) and one extension (68 ° C, 1 minute 30 seconds) Further, the final elongation (68 ° C, 5 minutes) was performed.
  • Visfatin cDNA ORF was excised from PCR2.1 using EcoRI and incorporated into pCAG-IRES-puro treated with EcoRI.
  • Example 2 spread a total of 3 clones of 1 clone of # 8-7, # 8-8, and wild-type ES cell RF8 in a 10 cm dish (Gibco).
  • the expression plasmid pCAG-Visfatin-IRES-puro prepared in 3) above was electroporated at 20 g per dish. Introduce into cells by one ration.
  • cells that have been introduced with the Visfatin expression plasmid are selected by culturing the cells in a serum medium containing puromycin at a final concentration of 2 ⁇ g / mL for 10 days.
  • a serum medium containing puromycin at a final concentration of 2 ⁇ g / mL for 10 days.
  • Visfatin hetero KO-ES cells, and wild-type ES cells in which the Visfatin heterozygous KO-ES cells were returned to Visfatin hetero KO-ES cells as described above 2.5xl0 4 Individually spread on 24 well plates (G3 ⁇ 4co). Then, the cells are cultured in N2 medium without insulin, N2 medium with insulin, and serum medium, respectively. Incubate cells for 6 days and measure growth rate every 2 days.
  • Example 2 a total of 3 clones of 1 clone of # 8-7, # 8-8, and wild type ES cell RF8 are spread on each 24 well plate (manufactured by G3 ⁇ 4co) with 2.5 x 4 4 clones.
  • Mouse Visfatin protein (SEQ ID NO: 4) prepared according to the method described in Examples 1 to 3 of WO2002 / 10772 was added to N2 medium containing no insulin and N2 medium containing insulin at final concentrations of 0.1, 1, and The cells are cultured in the same manner as described in Example 2 except that 10 g / mL is added. Incubate the cells for 6 days and measure the growth rate every 2 days.
  • the present invention provides a pluripotent stem cell proliferation promoter containing visfatin or a visfatin gene as an active ingredient.
  • a serum-free medium blood-free culture solution
  • pluripotent stem cells can be cultured even in the absence of serum. Therefore, the growth promoter of the present invention is effectively used in ES cell research and clinical application in regenerative medicine.
  • FIG. 1 shows the results of praying for the expression of visfatin gene in ES cells and mouse tissues by RT-PCR.
  • rvisfatinj indicates the analysis result of the visfatin gene
  • NATI J indicates the analysis result of NAT1, which is a positive control.
  • Each of the RT-PCR amplification cycles was repeated 30 times. From the left side of the lane, the negative transcriptase was excluded.
  • Undifferentiated ES cell Undifferentiated ES cell
  • Differentiated ES cell Differentiated ES, Ovary, Testis, Lung, Heart, Liver, Kidney (kidney), brain (brain), spleen (spleen), thymus (thymus), small intestine (intestine ⁇ skin (skin), muscle (mu SC le), mesenteric fat, brown fat, MG1.19 cells, liver (liver) and peri-testicular fat expression results are shown respectively.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of examining the proliferation rate of visfatin gene hetero knockout ES cells (# 8-7 and # 8-8). For comparison, the same experiment was performed on wild-type ES cell RF8.
  • A) is a serum medium
  • B) is an N2 medium containing no insulin
  • C) is a change in the number of cells when the cells are cultured in an N2 medium containing insulin.
  • FIG. 3 is a photomicrograph showing the culture results of blast cysts on day 3.5 after fertilization obtained by mating visfatin hetero KO mice. The results on the 1st, 3rd and 5th days of culture were shown. For comparison, the same experiment was performed on wild-type mice. Top: Results from bisphatin homo-deficient blast cysts. Bottom: Wild-type mouse results.
  • FIG. 4 Western stamp analysis showing that the amount of visfatin protein decreases with ES cell sorting.
  • “Visfatin” indicates the band of visfatin protein.
  • “ ⁇ actinj indicates the control ⁇ -actin band.
  • “ WT ” indicates the results for wild-type ES cells
  • “ Vis +/ ⁇ ” indicates the results for the visfatin gene hetero-knockout ES cells.
  • FIG. 5 Western blot analysis showing that visfatin siRNA was introduced into wild-type ES cells and the amount of visfatin protein was knocked down.
  • “Visfatin” indicates the band of bisfatin protein
  • “13 actinj indicates the band of 13 actin as a control.
  • “ WT ” indicates the result of wild-type ES cells
  • Knock down (l, 2,3) indicates The results of three types of knockdown ES cells are shown.
  • FIG. 6 is a graph showing that the growth rate of Visfatin knockdown cells was suppressed.
  • the vertical axis indicates the number of cells, and the horizontal axis indicates the number of culture days.
  • the left figure shows the experimental results in the presence of serum, and the right figure shows the experimental results in N2B27 serum-free medium (Ying et al. Cell 115: 281-292, 2003).
  • WT white bar
  • KD color bar
  • the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is an oligonucleotide primer designed for gene amplification.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 is an oligonucleotide primer designed for gene amplification.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 is an oligonucleotide primer designed for gene amplification.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is an oligonucleotide primer designed for gene amplification.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 is an oligonucleotide designed for siRNA.

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Abstract

　ビスファチンまたはビスファチン遺伝子を有効成分として含有する多能性幹細胞の増殖促進剤、ビスファチンを成分として含有する多能性幹細胞用培養液または培養キット、ならびに前記培養液または培養キットを用いることを特徴とする多能性幹細胞の培養方法に関する。

Description

明 細 書
多能性幹細胞増殖促進剤
技術分野
[0001] 本発明は、多能性幹細胞の増殖促進剤に関する。
背景技術
[0002] 胚性幹細胞 (ES細胞)は着床前の胚盤胞内に存在する内部細胞塊 (inner cell mass) に由来する多能性幹細胞であり、 1981年にマウスにおいて初めて榭立された (非特 許文献 1を参照)。 ES細胞は培養下で多分ィ匕能および正常染色体型を保持したまま 無限に増殖することができる。胚盤胞の中に注入することによって、胚発生に加わり キメラ動物を作ることができる。 1987年に初めてノックアウトマウスが作成されて以来（ 非特許文献 2を参照）、現在までに数多くのノックアウトマウスが作製され、その遺伝 子産物の機能が詳細に解析されている。
これまでにマウス ES細胞は発生工学的な道具として利用されてきた力 1998年にヒ ト ES細胞の榭立が報告されたことにより（非特許文献 3を参照）、再生医学的な応用 が期待され始めた。将来的にヒト ES細胞力 血液細胞、神経細胞、心筋細胞などへ の分化が可能になれば、細胞移植治療により、現在治療法の無い疾患治療が可能 になると考えられる。このような期待は ES細胞の持つあらゆる体細胞に分化する能力 (分化全能性)および未分化状態を維持したまま無限に増殖する能力（自己複製能） によるものである。
[0003] このように再生医療の研究および臨床応用にお 、て ES細胞の重要性はますます大 きくなりつつあるが、現在のところその培養には、血清もしくはフィーダ一細胞の存在 が必須である。すなわちマウス ES細胞は、細胞数が多いときは LIFを添加した無血清 培地によりフィーダ一細胞を用いずに維持することができる。しかし低密度では血清 もしくはフィーダ一細胞が必須である。またヒト ES細胞の培養にぉ 、ても血清および フィーダ一細胞が必須である。さらにマウス ES細胞と異なりヒト ES細胞では LIFは無効 である。ヒト ES細胞を臨床応用する場合、安全性等の観点から、動物血清やフィーダ 一細胞を用いずに培養することが不可欠である。そのため、無血清培地において ES 細胞の増殖を維持する因子の同定が望まれている状況にある。
[0004] ビスファチン (Visfatin)は別名 PBEF(Pre- B cell colony-enhancing factor)とも呼ばれ るタンパク質であり、これまでの研究において、 B細胞前駆細胞の分化'増殖刺激因 子であることが報告されている（特許文献 1および非特許文献 4を参照)。また最近に なって、ビスファチンはインスリンレセプターに結合して血中グノレコース濃度を下げる という、インスリンミミックな作用を有することが明らかとなった (非特許文献 5を参照)。 しかしながら、 ES細胞ゃ胚発生との関連性については何ら明らかにされていない。
[0005] 特許文献 1：特表平 8-505373号公報
非特許文献 1 : Evans, M. J. and Kauftnan, M. H. Nature, 292 (5819): pl54- 156 (198 1)
非特許文献 2 : Hooper, M. et al, Nature, 326 (6110): p292- 295(1987)
非特許文献 3 : Thomson, J. A. et al., Science, 282 (5391): pi 145-1147(1998) 非特許文献 4 : Samal, B. et al., Mol. Cell. Biol, Feb;14(2):pl431- 1437(1994) 非特許文献 5 : Fukuhara A. et al., Science, vol.307,p426- 430(2005)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、ビスファチンまたはビスファチン遺伝子を有効成分として含有す る多能性幹細胞の増殖促進剤を提供することにある。また本発明の別の目的は、ビ スファチンを含有する多能性幹細胞用の培養液や培養キット、またはこれらを用いた 多能性幹細胞の培養方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは ES細胞におけるビスファチン遺伝子の発現を解析したところ、ビスフ ァチン遺伝子は未分化 ES細胞において高発現しているのに対して、分化すること〖こ よりその発現が大幅に減少することが明ら力となった。またタンパクレベルでも、同様 に ES細胞の分ィ匕に伴ってビスファチンの存在量が大幅に減少することが明ら力とな つた o
[0008] 次に本発明者らはビスファチンの生体内での機能を解析するため、そのノックアウト マウスを作製した。ヘテロ変異マウスは正常に発生し、生殖能力も有していたが、糖 代謝能に異常が見られた。一方、ヘテロ変異マウス同士の交配からはホモ変異マウ スは誕生しな力つた。胎児解析の結果、ホモ変異マウスは着床直後に致死となること がわかった。ビスファチンをホモ欠損した胚盤胞を培養したところ、通常であれば内 部細胞塊が形成され、この内部細胞塊力 ES細胞コロニーが形成されるところ、ビス ファチン欠損胚盤胞は in vitroで培養しても内部細胞塊及びそれに続く ES細胞が増 殖できなかった。この結果より、多能性幹細胞の増殖にはビスファチンが必須である ことが明ら力となった。
[0009] また本発明者らは、インスリンを含まな!/ヽ無血清培地、インスリンを含む無血清培地 、および血清培地を用いて、ビスファチン遺伝子へテロノックアウト ES細胞 (ビスファチ ンヘテロ KO- ES細胞)を培養した。その結果、血清培地中では野生型 ES細胞とビスフ ァチンへテロ KO-ES細胞の増殖速度に差は認められな力つた力 インスリンを含む無 血清培地およびインスリンを含まな ヽ無血清培地にお！ヽては、野生型 ES細胞と比較 してビスファチンへテロ KO-ES細胞の増殖速度が低下しており、その低下の程度は、 インスリンを含まない無血清培地において顕著であることが分力つた。以上の結果よ りビスファチンは ES細胞の増殖を維持する因子であることが明ら力となった。
[0010] さらに本発明者らは、ビスファチンの siRNAを ES細胞に導入してタンパク量をノック ダウンし、増殖速度を検討した結果、野生型 ES細胞に比べて増殖速度が顕著に低 下していたことから、前記と同様にビスファチンは ES細胞の増殖を維持する因子であ ることが確認された。
本発明のビスファチンは、 ES細胞等の多能性幹細胞の増殖促進剤として用いること ができる。ビスファチンは多能性幹細胞自身が発現 (産生)している因子あるため、特 に有用である。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
[0011] すなわち本発明は、
(1) ビスファチンまたはビスファチン遺伝子を有効成分として含有する多能性幹細 胞の増殖促進剤、
(2) 多能性幹細胞が胚性幹細胞である、前記 (1)記載の増殖促進剤、
(3) ビスファチンを成分として含有する多能性幹細胞用培養液または培養キット、 (4) 多能性幹細胞が胚性幹細胞である、前記（3)記載の培養液または培養キット、
(5) 前記（3)または (4)記載の培養液または培養キットを用いることを特徴とする、 多能性幹細胞の培養方法、
(6) ビスファチンまたはビスファチン遺伝子の、多能性幹細胞の増殖促進剤として の使用、および
(7) 多能性幹細胞が胚性幹細胞である、前記（6)記載の使用、に関する。
発明の効果
[0012] 本発明のビスファチンおよびビスファチン遺伝子は、 ES細胞等の多能性幹細胞の 増殖促進剤として有用である。とりわけ本発明の増殖促進剤を無血清培地 (無血清 培養液)に添加することにより、血清非存在下でも多能性幹細胞の培養が可能となる ため、再生医療における ES細胞の研究および臨床応用において有効に用いられる。 発明を実施するための最良の形態
[0013] 以下、本明細書にぉ 、て、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号 による表示は、 IUPAC— IUBの規定〔IUPAC- IUB Communication on Biological No menclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明 細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における 慣用記号に従う。
[0014] 本発明にお 、て「ビスファチン (ビスファチンタンパク質)」とは、多能性幹細胞増殖 促進活性が保持される限り、特に限定されないが、具体的には以下の (a)〜①：
(a) 配列番号 2または配列番号 4で示されるアミノ酸配列、
(b) 配列番号 2または配列番号 4で示されるアミノ酸配列において、 1もしくは複数 のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
(c) 配列番号 2または配列番号 4で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端 力も 26個のアミノ酸を欠失したアミノ酸配列、
(d) 前記 (c)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたアミ ノ酸配列、
(e) 配列番号 2または配列番号 4で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性 を有するアミノ酸配列、 (f) 配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸 配列、
(g) 配列番号 3で示される塩基配列における第 96番目のヌクレオチドから第 1571 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有する DNAによりコードされるアミノ酸 配列、
(h) 前記 (f)または (g)に記載の DNAと 80%以上の配列同一性を有する塩基配列 を有する DNAによりコードされるアミノ酸配列、
(i) 前記 (f)または (g)に記載の DNAに対し相補性を有する DNAと、ストリンジェン トな条件下でノヽイブリダィズする DNAによりコードされるアミノ酸配列、および
(j) 前記 (a)〜 (i)の 、ずれかのアミノ酸配列の部分アミノ酸配列、
の!、ずれかのアミノ酸配列からなり、かつ多能性幹細胞の増殖促進活性を有するタ ンパク質が例示される。
[0015] ここで配列番号： 2で示されるアミノ酸配列は、ヒト ·ビスファチンのアミノ酸配列であ り、文献（Mol. Cell. Biol, Feb;14(2):pl431- 1437(1994))や GenBanc Acc.No.U02020 において公知の配列である。また配列番号: 4で示されるアミノ酸配列は、マウス'ビ スファチンのアミノ酸配列であり、 GenBank Acc.No. AF234625において公知の配列 である。
[0016] 前記 (b)における「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」や前記 (e)及び (h)にある「8 0%以上の配列同一性」には、例えば、配列番号 2または 4で示されるアミノ酸配列を 有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシング、該タンパク質が由来する生物の種 差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等 が含まれる。
[0017] 前記 (b)における「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変 と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号 2または 4 で示されるアミノ酸配列をコードする DNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施 し、その後この DNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変 異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法 (ギャップド'デュプレックス 法、 Nucleic Acids Res., 12,9441- 9456(1984))、変異導入用プライマーを用いた PCR による方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも 1残基、具体的には 1若しくは 数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、当該タンパク質の多能性幹細胞増 殖促進活性を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。 当該置換は、疎水性、電荷、 pK、立体構造上における特徴等の類似した性質を有 するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、（1)グリシン、 ァラニン；（2)パリン、イソロイシン、ロイシン；（3)ァスパラギン酸、グルタミン酸、ァス ノ ラギン、グルタミン、 （4)セリン、スレオニン；（5)リジン、アルギニン；（6)フエ-ルァ ラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
[0018] 前記（e)及び (h)において「配列同一性」とは、 2つの DNA又は 2つのタンパク質間 の配列同一性または相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域 にわたつて、最適な状態にアラインメントされた 2つの配列を比較することにより決定さ れる。ここで、比較対象の DNA又はタンパク質は、 2つの配列の最適なアラインメント において、付加又は欠失 (例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同 一性に関しては、例えば、 Vector NTIを用いて、 ClustalWアルゴリズム (Nucleic Acid Res.,22(22):4673_4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出する ことができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的には Vector NTI、 GENETY X-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記 公共データベースは、例えば、ホームページアドレス http://www.ddbj.nig.ac.jpにお いて、一般的に利用可能である。
前記配列同一性は、 80%以上であればよいが、好ましくは 90%以上、より好ましく は 95%以上である。
[0019] 前記 (i)における「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする」に関して、ここで実 施されるハイブリダィゼーシヨンは、例えば、 Sambrook J., Frisch E. F.， Maniatis T.著 、モレキュラークロー-ング第 2版（Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリン グハーバー.ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press)等に記載される 通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、
6 X SSC (1. 5M NaCl、 0. 15Mクェン酸三ナトリウムを含む溶液を 10 X SSCとする）、 50%フオルムアミドを含む溶液中で 45°Cにてハイブリッドを形成させた後、 2 X SSCで 50°Cにて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6)等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、 2 X S SC、 50°Cの条件（低ストリンジヱンシ一な条件）〜 0.2 X SSC、 50°Cの条件（高ストリン ジエンシーな条件)から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば 、室温 (低ストリンジエンシーな条件）〜65°C (高ストリンジエンシーな条件)から選択 することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
[0020] 前記 (j)における「部分アミノ酸配列」とは、前記 (a)〜 (i)の 、ずれかのアミノ酸配列 、好ましくは前記 (a)のアミノ酸配列における 15〜： L00残基、好ましくは 15〜50残基 の部分アミノ酸配列を示し、当該アミノ酸配列力 なるペプチドフラグメントが多能性 幹細胞の増殖促進活性を有する限り、特に限定されない。
以上に示された本発明のビスファチンは、ヒト、マウスのみならず、如何なる種由来 であっても良く、具体的にはヒト、マウス、ラット、サル、マーモセット、ゥシ、ゥマ等の哺 乳動物由来のビスファチンが例示される。
[0021] 本発明にお 、て「ビスファチン遺伝子」とは、ビスファチンをコードする遺伝子を指 す。具体的には前記 (a)〜(j)のいずれかのアミノ酸配列力もなり、かつ多能性幹細 胞の増殖促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が示される。
より具体的には以下の (A)〜 (K)：
(A) 配列番号 2または配列番号 4で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(B) 配列番号 2または配列番号 4で示されるアミノ酸配列にお 、て、 1もしくは複数 のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(C) 配列番号 2または配列番号 4で示されるアミノ酸配列にお ヽて、そのアミノ末端 力も 26個のアミノ酸を欠失したアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(D) 前記 (C)のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチォニンが付加されたァ ミノ酸配列をコードする塩基配列、
(E) 配列番号 2または配列番号 4で示されるアミノ酸配列と 80%以上の配列同一性 を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(F) 配列番号 1または配列番号 3で示される塩基配列、
(G) 配列番号 1で示される塩基配列における第 18番目のヌクレオチドから第 1493 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(H) 配列番号 3で示される塩基配列における第 96番目のヌクレオチドから第 1571 番目までのヌクレオチドで示される塩基配列、
(I) 前記 (G)または (H)に記載の塩基配列を有する DNAと 80%以上の配列同一 性を有する塩基配列、
C 前記 (G)または (Η)に記載の塩基配列を有する DNAに対し相補性を有する D ΝΑと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAの塩基配列、および (Κ) 前記 (Α)〜 ωの 、ずれかの塩基配列の部分塩基配列、
のいずれかの塩基配列力 なり、かつ当該塩基配列によりコードされるタンパク質が 多能性幹細胞の増殖促進活性を有するタンパク質である、そのようなタンパク質をコ ードする遺伝子が例示される。
[0022] 以下、本発明のビスファチン遺伝子およびビスファチンの調製方法について説明 する。
ビスファチン遺伝子は、通常の遺伝子工学的方法（例えば、 Sambrook J., Frisch E. F.， Maniatis T.著、モレキュラークロー-ング第 2版（Molecular Cloning 2nd edition) 、 コーノレドスプリングノヽーノ 一'ラボラトリー発行 (Cold Spring Harbor Laboratory pres s)等に記載されている方法）に準じて取得する。具体的には、配列番号 1に示される ヒト'ビスファチン遺伝子の場合、例えばヒト腹腔内脂肪組織由来の cDNAライブラリー を铸型とし、配列番号 1記載の塩基配列の適当な部分をプライマーに用いた PCRを 行うことによりクローユングすることができる。また配列番号 3に示されるマウス'ビスフ ァチン遺伝子の場合、例えばマウス肝臓由来の cDNAライブラリーを铸型とし、配列番 号 3記載の塩基配列の適当な部分をプライマーに用いた PCRを行うことによりクロー ニングすることができる。
[0023] ビスファチンタンパク質は、前記ビスファチン遺伝子を用いることにより、通常の遺伝 子工学的方法に準じて製造'取得する。 例えば、ビスファチン遺伝子が宿主細胞中で発現できるような発現ベクターを作製 し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞 (形質転 換体)を培養することで得られる培養物カゝらビスファチンタンパク質を取得することが できる。上記ビスファチン遺伝子発現ベクターとしては、例えば、宿主細胞中で複製 可能な遺伝情報を含み、 自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離- 精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマー カーをもつ発現ベクターに、本発明のビスファチンをコードする遺伝子が挿入された ものを挙げることができる。発現ベクターは用いる宿主や目的等に応じて適宜選択す ることができ、プラスミド、ファージベクター、ウィルスベクター等が挙げられる。
[0024] 例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、 pUC118、 pUC119、 pBR322、 pC R3、 pETl la等のプラスミドベクター、 λ ΖΑΡΠ、 λ gtllなどのファージベクターが挙げ られる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、 pYES2、 pYEUra3などが挙げられる。 宿主が昆虫細胞の場合には、 pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の 場合には、 pCEP4、 pKCR、 pCDM8、 pGL2、 pcDNA3.1、 pRc/RSV、 pRc/CMV、 pcDL -SR a 296などのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクタ 一、アデノ関連ウィルスベクターなどのウィルスベクターが挙げられる。これらは当業 者に入手可能なベクターである。
[0025] 前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子 、選択用マーカー遺伝子、ターミネータ一などの因子を適宜有していても良い。 また、単離精製が容易になるように、チォレドキシン、 Hisタグ、あるいは GST (ダルタ チオン S-トランスフェラーゼ)等との融合タンパク質として発現する配列が付加されて いても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、 tac、 trc、 tr p、 CMV、 SV40初期プロモーターなど）を有する GST融合タンパクベクター（pGEX4T など）や、 Myc、 Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さら にはチォレドキシンおよび Hisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a) などを用いることができる。
[0026] 前記で作製されたビスファチン遺伝子発現ベクターで宿主を形質転換することによ り、当該発現ベクターを含有する形質転換体 (形質転換細胞)を作製することができる ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げら れる。大腸菌としては、 E.coli K- 12系統の HB101株、 C600株、 JM109株、 DH5 α株、 AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス'セルビジェなど が挙げられる。動物細胞としては、 L929細胞、 BALB/c3T3細胞、 C127細胞、 CHO細 胞、 COS細胞、 Vero細胞、 Hela細胞、 293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞と しては sl9などが挙げられる。
[0027] 宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の 導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、 エレクト口ポレーシヨン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、 Lipofectin; Gibco- B RL社)を用いる方法、ウィルスベクターを用いる方法などが挙げられる。導入後、選 択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細 胞中に導入された形質転換体を選択することができる。
[0028] 形質転換体の培養は、微生物培養、酵母、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養 に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭 素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養 方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよぐ好ましくは、通気撹拌 培養法等の液体培養を挙げることができる。
前記形質転換体を好適な条件下で培養し続けることにより、ビスファチンタンパクを 製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学的精製手段により、さ らに単離 '精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマト グラフィー、吸着クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマ トグラフィ一等が挙げられる。またビスファチンタンパク質を、前述のチォレドキシンや Hisタグ、 GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質 やタグの性質を利用した精製法により単離'精製することができる。
以下に代表例として、ヒトビスファチンの発現及び精製の具体例を示す。
[0029] 1)哺乳動物細胞での発現及び精製
前記のように作製したヒト ·ビスファチンタンパク (配列番号 2)を発現する発現べクタ 一で、 COS-1等の哺乳動物細胞を形質転換する。この形質転換体を、抗生物質含 有 OPTI-MEM培地（GIBCO製）等で培養することにより培地中にヒト ·ビスファチンを 分泌させる。形質転換後 2日目〜 8日目程度の細胞培養上清を集める。培養上清を 限外ろ過膜にてろ過し、順次 DEAEsepharose、 ANX- Sepharose、 Octy卜 Sepharose、 Mono-Qカラム (すべてアマシャムフアルマシア製）に供することにより、ヒトビスファチ ンタンパクの精製を行う。
[0030] 2)大腸菌での発現及び精製
ヒト ·ビスファチンタンパク（配列番号 2)のアミノ酸番号 27番から 491番で示されるァ ミノ酸配列のァミノ末端にメチォニンが付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を 産生させるために、この部分をコードする遺伝子を pETl la (ノバジェン製)等の大腸 菌用発現ベクターにクローユングする。次に、該発現プラスミドで大腸菌（DE3株:ノ バジェン社等）を形質転換する。得られた形質転換体を、 37°Cで O. D. 600が 0. 6 になるまで培養し、終濃度 ImMのイソプロピル一 β—D—チォガラタトピラノシド（以 下、 IPTGと記す。）を添加し、さらに一晩培養する。次いで、遠心分離操作により集 菌し、菌体を lOOmMトリス—塩酸（ρΗ7. 6)、 5mMエチレンジァミン四酢酸ニナトリ ゥム（以下、 EDTA' 2Naと記す。）、 5mMジチオスレィトール（以下、 DTTと記す。 ) および ImMフエ-ルメチルスルホ -ルフルオライド（以下、 PMSFと記す。）を含むバ ッファー（以下、バッファー Aと記す。）に懸濁して、超音波処理 (氷冷下、 5分間 X 3 回）により菌体を破砕し、この破砕液を 12, 000 X g、 15分間、 4°Cで遠心分離し、沈 殿 (以下、封入体画分と記す。）を回収する。
[0031] 該封入体画分に、 2M尿素を含むバッファー Aを添加し、懸濁して、超音波処理（ 氷冷下、 5分間 X I回）を行う。前記の超音波処理後の溶液を 12, 000 X g、 15分間 、 4°Cで遠心分離し、得られた沈殿に、 4M尿素を含むバッファー Aを添加して懸濁、 超音波処理、遠心分離するという操作を前記と同様に行う。さらに、得られた沈殿に、 6M尿素を含むバッファー Aを添加して懸濁、超音波処理、遠心分離するという操作 を前記と同様に行う。得られた沈殿を 20mMトリス—塩酸 (pH8. 5)、 2mM DTTお よび 8M尿素を含むバッファーに懸濁し、該懸濁液を 12, 000 X g、 15分間、 4°Cで 遠心分離し、上清を分取する。得られた上清を、 HiLoad Superdex 200pg (ファ ルマシア製)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーに供する（流速； 1. OmlZ分、検出 波長； 280nm)。 45分から 55分の間に溶出されるピーク画分を集めてセントリコン（ グレースジャパン製、分画分子量 30, 000)で濃縮し、次に、モノ Q HR10/10ィォ ン交換カラム（フアルマシア製）を用いたクロマトグラフィー（流速 1. OmlZ分、 0〜1 M NaClグラディエント、検出波長； 280nm)に供する。約 100〜約 200mM NaCl で溶出される画分を集めて、セントリコン (グレースジャパン製、分画分子量 30, 000 )で lmg蛋白質 Zmlになるように濃縮する。
[0032] 得られた蛋白質画分に、該画分の容量の 1Z3量の lOOmMトリスー塩酸（pH8. 5 )をゆるやかに攪拌しながら添加する。さらに、室温で一晩、緩やかに攪拌を続けた。 次いで、 18, 000 X g、 20分間、 4°Cで遠心分離して上清を回収し、該上清に、その 容量の 7倍量の 2M尿素、 20mMトリスー塩酸（pH8. 5)、 4mM還元型グルタチオン および 0. 4mM酸ィ匕型ダルタチオンを含むバッファーを加えて緩やかに攪拌する。 得られた溶液を分画分子量が 25, 000の透析チューブに入れ、該溶液量の 1000倍 量の 2M尿素、 20mMトリスー塩酸（pH8. 5)、 4mM還元型グルタチオンおよび 0. 4mM酸化型ダルタチオンを含むバッファーに対して、 4°Cで 8〜16時間透析する。 次に、透析チューブ内液量の 1000倍量の 20mMトリス—塩酸（pH8. 5)、 4mM還 元型グルタチオンおよび 0. 4mM酸化型グルタチオンを含むバッファーに対して、 4 °Cで 8〜16時間透析する。さらに、透析チューブ内液量の 1000倍量の 20mMトリス 一塩酸（PH8. 5)、 ImM還元型グルタチオンおよび 0. ImM酸化型グルタチオンを 含むバッファーに対して、 4°Cで 8〜16時間透析する。このようにしてヒト 'ビスファチ ンを大腸菌から得ることができる。
以上に示したビスファチン遺伝子のクローユング、発現ベクター調製、形質転換体 の作製およびビスファチンタンパクの発現'精製の詳細については WO02/010772号 公報等を参照されたい。
[0033] 本発明にお ヽて「多能性幹細胞」とは、 ES細胞に代表される未分化 ·多能性を維 持する細胞を指す。本 ES細胞は体細胞から核初期化されて生じた ES様細胞であつ ても良い。また ES細胞以外では、始原生殖細胞に由来する Embryonic Germ Cell (E G cell)、精巣から単離された mutipotent germline stem cell (mGS cell),骨髄から単 離される Multipotent adult progenitor cell (MAPC)などが挙げられる。これら多能性 幹細胞の由来は、ヒト、サル、ラット、マウス、マーモセット等の如何なる由来であって も良い。
[0034] 本発明にお 、てビスファチンまたはビスファチン遺伝子が有する「多能性幹細胞の 増殖促進活性」とは、ビスファチン非存在下、またはビスファチン遺伝子非導入下で の多能性幹細胞の増殖に比して、ビスファチンを培地へ添加した場合、またはビスフ ァチン遺伝子を細胞へトランスフエクシヨンした場合に当該増殖が促進される、そのよ うな活性を意味する。
[0035] 本発明にお 、てビスファチンまたはビスファチン遺伝子が有する多能性幹細胞の 増殖促進活性は、例えば以下のようにして測定することができる。
まずビスファチンほたはその候補物質)の場合は、ビスファチン (またはその候補物 質)を lng/ml〜10 μ g/ml程度の濃度で添加した無血清培地にお 、て多能性幹細胞 を培養し、細胞増殖促進活性を測定することにより調べることができる。その際、コント ロールとしてビスファチン無添加の無血清培地においても同様の多能性幹細胞の培 養を行い（陰性コントロール細胞）、この陰性コントロール細胞との比較を行うことが好 まし 、。陰性コントロール細胞に比してビスファチンほたはその候補物質)を添加した 場合に細胞増殖が促進された場合、用いたビスファチン (またはその候補物質)は細 胞増殖促進活性を有すると判断する。
[0036] さらに好ましくは、血清培地を用いて同様の多能性幹細胞の培養を行い（陽性コン トロール細胞）、この陽性コントロール細胞との比較を行う。ビスファチン添加無血清 培地で培養した細胞において、陽性コントロール細胞に比して、その 10%程度以上の 増殖が維持され、かつ細胞が多能性を維持していた場合、用いたビスファチン (また はその候補物質)は細胞増殖促進活性を有すると判断する。ここで多能性維持の評 価は、 Oct3/4や ECAT遺伝子群などのマーカー遺伝子の発現をノザンブロット、 RT- PCR、ウェスタンプロット、免疫染色で解析することに簡易的に評価できる。また細胞 をブラストシストに微少注入しキメラマウスが誕生するかを検討することにより確定する ことができる。
[0037] 前記測定にお!、て用いる無血清培地としては、血清を含まな 、培地であれば、如 何なる無血清培地であっても良 、。また成長因子やサイト力インなどを含んで ヽても 良い。当該無血清培地は、ビスファチン非存在下では多能性幹細胞 (測定に用いる 多能性幹細胞)の増殖が正常に維持されないような無血清培地である。
[0038] 測定に用いる多能性幹細胞としては ES細胞が好まし 、。具体的には RF8細胞 (Mei ner'V. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93: 14041- 14046(1996))、 JI細胞（Li,E. et al.， Cell,69:915- 926(1992))、 CGR8細胞 (NicholsJ. et al, Development, 110: 1341- 1348( 1990》、 MG1.19細胞（Gassmann,M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,92:1292-1296(l 995))や、市販されているマウス ES細胞 129SV(No.R-CMTI-l-15, R- CMTI- 1A)、マ ウス ES細胞 C57/BL6 (No.R- CMTI- 2A)、マウス ES細胞 DBA- l (No.R- CMTI- 3A) ( 以上大日本製薬)等の ES細胞が挙げられる。またヒト ES細胞としては、 KhES-l、 KhE S-2あるいは KhES-3 (以上、京大再生研付属幹細胞医学研究センター）などが挙げ られ、またサル ES細胞としては力-クイザル ES細胞 (旭テクノグラス）が挙げられる。
[0039] 次にビスファチン遺伝子 (またはその候補遺伝子)の場合は、発現ベクターに組み込 んだビスファチン遺伝子ほたはその候補遺伝子)を多能性幹細胞にトランスフエタトし て作製した形質転換体を無血清培地にお！ヽて培養し、細胞増殖が促進されるか否 かを測定することにより行うことができる。
その際、コントロールとしてビスファチン遺伝子非導入の細胞を無血清培地にぉ ヽ て培養し (陰性コントロール細胞）、この陰性コントロール細胞との比較を行うことが好 まし 、。陰性コントロール細胞に比してビスファチン遺伝子ほたはその候補物質)をト ランスフエタトした場合に細胞増殖が促進された場合、用いたビスファチン遺伝子 (ま たはその候補物質)は細胞増殖促進活性を有すると判断する。
[0040] さらに好ましくは、血清培地を用いて多能性幹細胞の培養を行い（陽性コントロー ル細胞）、この陽性コントロール細胞との比較を行う。ビスファチン遺伝子導入細胞に おいて、陽性コントロール細胞に比して、その 10%程度以上の増殖が維持され、かつ 細胞が多能性を維持して 、た場合、用いたビスファチン遺伝子 (またはその候補物質 )は細胞増殖促進活性を有すると判断する。ここで多能性維持の評価は、 Oct3/4や E CAT遺伝子群などのマーカー遺伝子の発現をノザンブロット、 RT- PCR、ウェスタンブ ロット、免疫染色で解析することに簡易的に評価できる。また細胞をブラストシストに 微少注入しキメラマウスが誕生するかを検討することにより確定することができる。
[0041] 多能性幹細胞への遺伝子トランスフエクシヨンは通常知られた手法にて行うことがで きる。具体的には、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクト口 ポレーシヨン法、 DEAE-デキストラン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、 Lipofe ctin; G¾co- BRL社）を用いる方法、またはウィルスベクターを用いる方法（ウィルスべ クタ一を感染させる方法)などである。
測定に用いる ES細胞や無血清培地については、前記ビスファチンの場合と同じで ある。
[0042] 以上に挙げた測定法の他、実施例 6及び 7に記載したようなビスファチン遺伝子へ テロノックアウト ES細胞を用いた手法によっても、細胞増殖促進活性を測定することが できる。
[0043] 本発明のビスファチンを有効成分とする多能性幹細胞の増殖促進剤は、そのまま、 もしくは公知の薬学的に許容される担体 (賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤 、流動助剤、崩壊剤、界面活性剤等などが含まれる)や慣用の添加剤、安定化剤な どと混合して試薬組成物または医薬組成物として調製することができる。当該組成物 は、許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤、緩衝剤等に有効成 分であるビスファチンを配合、溶解等することにより製造することができる。
[0044] 本発明のビスファチンの培地（培養液）への添加量は、 lng/ml〜10 μ g/ml程度の 濃度が挙げられる。好ましくは 0.1 μ g/ml〜10 g/ml程度の濃度が挙げられる。
[0045] 本発明のビスファチンの適用対象である多能性幹細胞は、具体的には ES細胞が 挙げられる。本 ES細胞は体細胞力 核初期化されて生じた ES細胞であっても良 、。 また ES細胞以外では、始原生殖細胞に由来する Embryonic Germ Cell (EG cell) , 精巣から単離された mutipotent germline stem cell (mGS cell),骨髄から単離される M ultipotent adult progenitor cell (MAPC)などが挙げられる。これら多能性幹細胞の由 来は、ヒト、サル、ラット、マウス、マーモセット等の如何なる由来であっても良い。
[0046] ビスファチンを添加する無血清培地としては、血清を含まずかつ研究や臨床応用 において実用的な培地であれば、如何なる無血清培地であっても良い。また成長因 子やサイト力インなどを含んで ヽても良 ヽ。 [0047] 本発明のビスファチンは、あらカゝじめ培地 (培養液)に添加し、多能性幹細胞の培養 液として調整した後に、これを細胞に添加して細胞培養を行っても良ぐまた無血清 培地と細胞とを接触させた後に、本発明のビスファチンを培地に添加しても良い。 本発明のビスファチンは、単独で包装されていても良ぐ多能性幹細胞培養用キッ トの 1成分として包含されていれも良い。キットの場合、ビスファチン以外のキット中の 成分としては、無血清培地に同時にカ卩えられる他の因子一例えば BMP4や LIF等を ί列示することができる。
[0048] 本発明のビスファチン遺伝子を有効成分とする多能性幹細胞の増殖促進剤は、哺 乳動物細胞である多能性幹細胞で発現するような発現ベクターに組み込んだ形態 で用いられる。当該ビスファチン遺伝子 (ビスファチン遺伝子発現ベクター）はそのま ま、もしくは通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化され得る。 前記ビスファチン遺伝子は化学的に修飾されて!ヽても良 ヽ。当該化学修飾体として は、例えばホスホロチォエート、ホスホロジチォエート、アルキルホスホトリエステル、 アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデートなどの、細胞内への移行性または細 胞内での安定性を高め得る誘導体（"Antisense RNA and DNA" WILEY-LISS刊、 19 92年、 pp.l-50、 J. Med. Chem. 36:1923-1937, 1993)が含まれる。これらは常法に従 い合成することができる。
[0049] 細胞へのトランスフエクシヨンは、非ウィルス的導入法とウィルス的導入法のいずれ ち用いることがでさる。
非ウィルス的導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム 法、エレクト口ポレーシヨン法、 DEAE-デキストラン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofect amine, Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。組換えウィルスを 用いる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルスなど のウィルスベクターを用いた方法が挙げられる。
[0050] 本発明のビスファチン遺伝子の細胞へ導入量は、通常のトランスフエクシヨンに用い られる当業者に知られた量を用いることができる。また適用対象である多能性幹細胞 は、前記ビスファチン添カ卩の場合と同じである。
[0051] 以下、実施例により本発明を具体的に説明する力 本発明はこれらの実施例により なんら限定されるものではな 、。
実施例 1
[0052] ES細胞およびマウス各 織における Visfatin遣伝早の 現解析
未分化マウス ES細胞 RF8 (129ZSvJae系マウス由来）に 90 ng/mlのレチノイン酸を添 加し、血清培地（DMEM (ナカライ）、 107 Unitの LIF (ケミコン社）、 1.0%の L-グルタミン (Invitorogen社）、 0.5 %のペニスリンストレプトマイシン（Invitorogen社）、 0.2 %の 2-メル カプトエタノール（Invitorogen社）、 1.0 %の MEM非必須アミノ酸溶液（Invitorogen社）、 14.8 %の FCS (Biowest社)）で 6日間培養することにより ES細胞を分化させた。この分 化 ES細胞を TRIzoKGIBCO BRL)で処理し、クロ口ホルム抽出、エタノール沈殿を行 い、 Lの DEPC処理水に懸濁して totalRNAを取得した。また、 B6系統マウスから 摘出した各組織も TRIzoKGIBCO BRL)処理を行い、同様に試薬に添付のプロトコ一 ルに従って totalRNAを取得した。抽出された全 RNA (溶解物）を UVスぺクトロメータ（ 260nm、 280nm)で吸光度測定することにより定量した。
[0053] 逆転写反応は REVERTRA ACE a (東洋紡社製)を使用して実施し、得られた cDN Aを铸型として、マウス Visfatin遺伝子 (配列番号 3)の発現量を反映して DNA断片の 増幅が認められる条件で、 RT—PCRを行うことにより、各々の ES細胞および組織に おけるマウス Visfatin遺伝子の発現の有無及びその発現量を確認した。
この際に用いた PCR法は、プライマー GE- U8 (配列番号 5 ;TTCCTACTTTGAATG CCGTGAA)及びプライマー AntiL- 15Sall (配列番号 6 ; GCTGTCGACTGGAACAG AATAGCCTGGAA)の一対のプライマーを用い、 ExTaq (Takara社製， Japan)で反応 を行った。当該 PCRは、 DNA変性 (94°C、 1分間）に続き、 30サイクルの変性 (94°C、 1 0秒間） アニーリング (55°C、 30秒間）一伸長（68°C、 1分間）、さらに最終伸長（68°C 、 5分間）の条件で行った。なおポジティブコントロールとして NAT1遺伝子（Yamanak a, S. et al.， Embo J., 19, 5533-5541(2000))についても同様の反応を行った。
[0054] 結果を図 1に示す。マウス Visfatin遺伝子は、未分化 ES細胞において高発現してい るのに対して、分ィ匕させた ES細胞ではその発現が大幅に減少していた。また、マウス 組織においては、褐色脂肪、腸間膜脂肪、精巣周囲脂肪、腎臓、筋肉において高い 発現が認められた。 実施例 2
[0055] Visfatinヘテロ KO ES細胞の增殖谏度
特開 2004- 154135の実施例 1から 4に記載の方法に従って、マウス Visfatin遺伝子（ 配列番号 3)のアミノ酸配列をコードするゲノム遺伝子の一部を欠失する相同的糸且換 え ES細胞 (Visfatin遺伝子へテロノックアウト ES細胞） # 8— 7及び # 8— 8を取得した
[0056] # 8— 7、 # 8— 8、および野生型 ES細胞 RF8の 1クローンの合計 3クローンを、それ ぞれ 2. 5xl04個づっ 24ゥエルプレート（Gibco社製）にまきこんで、インスリンを含まな Vヽ N2培地（F12— GMEM (Invitrogen)、 N2 mixture (100 μ g/mlの Apo— transferin (Sigm a社）、 50 μ g/mlの BSA(G¾co社）、 6 ng/mlの Progesterone (Sigma社）、 16 μ g/mlの Putrescine (Sigma社）、 30nMの SodiumSelenite (Sigma社） )、 lOng/mlの humanBMP4 ( R&D社）、 103 Unitの LIF (ケミコン社）、 1.0 %の L-グルタミン（Invitorogen社）、 0.5%の ペニスリンストレプトマイシン（Invitorogen社）、 0.2 %の 2-メルカプトエタノール（Invitor ogen社） )、インスリンを含む N2培地（上記培地に Insulin (Sigma社）を 25 μ g/ml加えた 培地）、または血清培地（DMEM (ナカライ）、 107 Unitの LIF (ケミコン社）、 1.0%の L-グ ルタミン（Invitorogen社）、 0.5 %のペニスリンストレプトマイシン（Invitorogen社）、 0.2 % の 2-メルカプトエタノール（Invitorogen社）、 1.0 %の MEM非必須アミノ酸溶液（Invitoro gen社）、 14.8 %の FCS (Biowest社)）を用いて 6日間培養し、 2日おきに増殖速度を測 し 7こ。
[0057] その結果、図 2に示すように、血清培地中では、野生型 ES細胞と # 8— 7、 # 8— 8E S細胞の増殖速度に差は認められなかった力 インスリンを含む N2培地およびインス リンを含まない N2培地中においては、野生型 ES細胞と比較して # 8— 7、 # 8— 8ES 細胞の増殖速度が低下しており、その低下の程度は、インスリンを含まない N2培地に ぉ 、て顕著であった。以上の結果より Visfatinは ES細胞の増殖促進に関与して 、るこ とが示された。
実施例 3
[0058] Visfatin KOマウスの胚解析
Visfatinヘテロ変異 (KO)マウスを交配させて、受精後 3.5日目の胚盤胞 (ブラストシ スト）をメス子宮より取り出し、ゲラチンコートを施した 4 well Dish (NUNC社製）に移し 、 ES培地（DMEM (ナカライ）、 107 Unitの LIF (ケミコン社）、 1.0%の L-グルタミン（Invito rogen社）、 0.5 %のペニスリンスストレプトマイシン（Invitorogen社）、 0.2 %の 2-メルカプ トエタノール（Invitorogen社）、 1.0 %の MEM非必須アミノ酸溶液（Invitorogen社）、 14.8 %の FCS (Biowest社)）で培養を行った。培養は 6日間行った。結果を図 3に示す。
[0059] 野生型マウスの場合、培養を開始して 2日目位に内部細胞塊が Dishの底に接着し た。培養開始後 3日目くらいから、顕微鏡下でブラストシスト由来の細胞の増殖が認 められ、その 2日目には内部細胞塊の増殖が中央部分に観察された。内部細胞塊を 囲む様に栄養外胚葉の増殖が観察された。一方、 Visfatinをホモ欠損したブラストシ ストを同様の条件で培養しても、内部細胞塊も栄養外胚葉も共に増殖が認められな かった。この結果より、胚 (多能性幹細胞）の増殖にはビスファチンが必須であること が明らかとなった。
実施例 4
[0060] ES細胞分化に伴う Visfatin蛋白量の変化
未分化マウス ES細胞 RF8 (129ZSvJae系マウス由来）に 90 ng/mlのレチノイン酸を添 加し、血清培地（DMEM (ナカライ）、 107 Unitの LIF (ケミコン社）、 1.0%の L-グルタミン (Invitorogen社）、 0.5 %のペニスリンストレプトマイシン（Invitorogen社）、 0.2 %の 2-メル カプトエタノール（Invitorogen社）、 1.0 %の MEM非必須アミノ酸溶液（Invitorogen社）、 14.8 %の FCS (Biowest社)）で 6日間培養することにより ES細胞を分化させた。 Visfati n遺伝子をへテロに欠損する ES細胞（特開 2004-154135)についても、同様の条件で 分化させた。
[0061] 未分化 ES細胞、分化 ES細胞、未分化 visfatinヘテロ KO ES細胞、および分化 visfati nヘテロ KO ES細胞を回収し、 SDS-PAGEに供した。 SDS-PAGEゲル上蛋白をセミドラ ィ法で PVDFメンブラン (ミリポア社製）にトランスファーした。このようにして調製された メンブランを、 TTBSバッファー（20mM Tris— HCl (pH7.4)、 150mM NaCl、 0.05% Twee n20、 0.05% Na3N)で洗浄した後、 3%ゼラチンを含む TTBSバッファ一中で、 37°C、 1 時間保温した。その後、該メンブランを、特開 2000-356637に記載のゥサギ抗 visfatin ポリクローナル抗体を 1。/0ゥシ血清アルブミンを含む TTBSバッファーで 1,000倍希釈 した溶液中で、 37°C、 1時間保温した。次いで、該メンブランを TTBSバッファーで室 温、 5分間 X 3回洗浄し、ホースラディッシュペルォキシダーゼ標識された抗ゥサギ Ig G抗体を 1%ゥシ血清アルブミンを含む TTBSで 1,000倍希釈した溶液中で、 37°C、 1 時間保温した。その後、該メンブランを TTBSバッファーで、室温にて、 5分間、 3回洗 浄して、 LAS-3000 (Fuji Film社）を用いて visfatin蛋白に由来するシグナルを検出した 。結果を図 4に示す。
[0062] 抗 visfatin抗体によって特異的に認識された visfatin蛋白のバンドを LAS-3000(Fuji Film社)の解析ソフトを用いて定量した結果、未分化 ES細胞にぉ 、ては visfatin蛋白 は大量に発現していたのに対して、分ィ匕後には蛋白量が顕著に減少していた。また 、 visfatinヘテロ KO ES細胞においては、未分化の状態における visfatin蛋白量が野 生型 ES細胞と比較して顕著に減少しており、さらに分ィ匕により低下した。以上により、 ES細胞の分化に伴って、 visfatinはタンパクレベルでも存在量が顕著に減少すること が確認された。
実施例 5
[0063] Visfatinノックダウン ES細胞の增殖谏度
l)visfatin-RNAiレトロウイルスの ES細胞への導入
Visfatin遺伝子に対する siRNA配列（GTTGTTGCTGCCTTGTCTT；配列番号： 9) を合成した。これを U6プロモーターを有するレトロウイルスベクター（PMOW3.3-PGK-
EGFP) (Gene Ther. 2002 Apr;9(8):477-87)に挿入した。
[0064] 8 X 106個の Plat- E細胞を 10cmディッシュにまき、 FuGENE6試薬（Roche社製）を用 いて、メーカーのプロトコールに準じて、上記で調製したレトロウイルスを感染させた。 感染 24時間後に上清を回収した。
血清培地（DMEM (ナカライ）、 107 Unitの LIF (ケミコン社）、 1.0%の L-グルタミン（Inv itorogen社）、 0.5 %のペニスリンストレプトマイシン（Invitorogen社）、 0.2 %の 2-メルカプ トエタノール（Invitorogen社）、 1.0 %の MEM非必須アミノ酸溶液（Invitorogen社）、 14.8
%の FCS (Biowest社） )で培養したマウス ES細胞 MG1.19に、前記で回収した上清中 のレトロウイルスを感染させ、 ES細胞をさらに 20時間培養した。
[0065] 2)Visfatin-RNAi導入 ES細胞における visfatin蛋白量確認 20時間後、トリプシン処理により細胞を回収し、回収した細胞を ES培地 (Meiner,V丄. et al.， Proc.Natl.Acad.Sci. USA,93(24):pl4041- 14046(1996》に懸濁し、 1,000個の 細胞を 10cm dishのゲラチンコート済みのディッシュにまいて、 7日間培養した。 7日後 にディッシュ上に生育したシングルコロニーを拾った。
[0066] 各コロニーを ES培地で 3日間培養した。培養後、細胞を回収し、 SDS-PAGEに供し た。 SDS-PAGEゲル上蛋白をセミドライ法で PVDFメンブラン (ミリポア社製）にトランス ファーした。このようにして調製されたメンブランを、 TTBSバッファー（20mM Tris-H Cl (pH7.4)、 150mM NaCl、 0.05% Tween20、 0.05% Na3N)で洗浄した後、 3%ゼラチン を含む TTBSバッファ一中で、 37°C、 1時間保温した。その後、該メンブランを、特開 2 000-356637に記載のゥサギ抗 visfatinポリクローナル抗体を 1%ゥシ血清アルブミンを 含む TTBSバッファーで 1,000倍希釈した溶液中で、 37°C、 1時間保温した。次いで、 該メンブランを TTBSバッファーで室温、 5分間 X 3回洗浄し、ホースラディッシュペル ォキシダーゼで標識された抗ゥサギ IgG抗体を 1%ゥシ血清アルブミンを含む TTBS で 1,000倍希釈した溶液中で、 37°C、 1時間保温した。その後、該メンブランを TTBS バッファーで、室温にて、 5分間、 3回洗浄して、 LAS-3000 (Fuji Film社)を用いて visfa tin蛋白に由来するシグナルを検出した。結果を図 5に示す。
抗 visfatin抗体によって特異的に認識された visfatin蛋白のバンドを LAS-3000(Fuji Film社)の解析ソフトを用いて定量した結果、 No.1,2,3の 3種類のノックダウン細胞の vi sfatin蛋白量は、コントロールの野生型 ES細胞 (WT)の 10%に低下していた。
[0067] 3)Visfatinノックダウン ES細胞の増殖速度の測定
レトロウイルス感染により visfatinに対する siRNA配列が挿入され、 visfatin蛋白発現 量が約 90%低下した 3種類のノックダウン ES細胞とコントロールの野生型 ES細胞を、 それぞれ血清入り培地 (DMEM (ナカライ）、 107 Unitの LIF (ケミコン社）、 1.0%の L-グ ルタミン（Invitorogen社）、 0.5 %のペニスリンストレプトマイシン（Invitorogen社）、 0.2 % の 2-メルカプトエタノール（Invitorogen社）、 1.0 %の MEM非必須アミノ酸溶液（Invitoro gen社）、 14.8 %の FCS (Biowest社))、および ES細胞培養用無血清培地 N2B27(Ying et al. Cell 115: 281-292, 2003)(SCS社）を用いて 4日間培養した。結果を図 6に示す その結果、血清入り培地において、 3種類の Visfatinノックダウン ES細胞の増殖速度 は、コントロールの野生型 ES細胞より有意に低下していた。また無血清培地において は、さらに増殖速度の低下は顕著であり、コントロール細胞の約 1/2であった。以上の 結果より Visfatinのタンパク量低下により ES細胞の増殖が抑制されること、すなわち Vi sfatinは ES細胞の増殖促進に関与していることが示された。
実施例 6
[0068] Visfatin遣伝早 人による RS細胞谐 谏度の冋復
1) pCAG- IRES- puroの作製
pCX- EGFPを Ndel/EcoRIで処理し、 CAGプロモーター部分を切り出したものを pIRE S puro (clontech社）の Ndel/EcoRIサイトに挿入して作製した。
[0069] 2)マウス VisfatinORFを含むプラスミドの作製
マウス Visfatin cDNA全長をコードする配列を増幅するためにマウス肝臓由来の cD NAライブラリー（clontech社）を用いて PCRを行った。得られた断片を、 PCR2.1 (Invitr ogen社）に TA cloning法を用いて組み込んだ。 PCR条件は、 RF8 ES細胞の RNA (1 μ g)を铸型にして Oligo dT primerによって増幅させた RT産物を铸型にした。プライマー としては、 STMO- mou- S- ORF- 1 (配列番号 7 ;ATGAATGCTGCGGCAGAAGCCG AGTT)および STMO- mou- AS- 770 (配列番号 8 ;TGGTCTTTCCCCCAAGCCGTTA TGGT)を使用した。 PCRの伸張反応には KODプラス (Takara)を使用した。 PCRは、 DNA変性 (94°C、 10秒間）に続き、 35サイクルの変性 (94°C、 2秒間）—アニーリング（ 55°C、 2秒間）一伸長 (68°C、 1分 30秒間）、さらに最終伸長 (68°C、 5分間）の条件で 行った。
[0070] 3) pCAG- visfatin- IRES- puroの作製
前記 PCR2.1から EcoRIを用いて Visfatin cDNA ORFを切り出して、 pCAG- IRES- pur oを EcoRIで処理したものに組み込んだ。
[0071] 4) pCAG- visfatin- IRES- puroの ES細胞への導入
実施例 2に準じて # 8— 7、 # 8— 8、および野生型 ES細胞 RF8の 1クローンの合計 3 クローンをそれぞれ 2000個づっ 10cm dish (Gibco社製）にまく。次に前記 3)で作製し た発現プラスミド pCAG- Visfatin- IRES- puroを、 1 dish当たり 20 gづっ、エレクトロポ 一レーシヨンにより細胞へ導入する。
具体的には細胞をトリプシンで処理した後、 ES培地で中和し、シングルセルになる までよくピペッティングする。これを 800 rpmで 5分間、室温で遠心した後、上清を捨 てて 800 μ 1の PBSを加える。この細胞懸濁液に 20 μ gの DNA(pCAG- Visfatin- IRES- puro)をよく混合し、すぐにキュベットにサンプルをうつし、 Bio Rad社の装置ジーンパ ルサー II型番 1052105を用いて、 Volts;;0.25kV, CAP;0.5,uF xlOOOの条件でエレク トロポレーシヨンを行う。
[0072] エレクト口ポーレーシヨン後、 2日目から細胞を最終濃度 2 μ g/mLのピューロマイシ ンを含む血清培地で 10日間培養することで、 Visfatin発現プラスミドが導入された細 胞を選択する。このようにして取得した Visfatinヘテロ KO-ES細胞に Visfatin発現プラ スミドを戻しいれた ES細胞、 Visfatinヘテロ KO-ES細胞、および野生型 ES細胞につい て、実施例 2に準じてそれぞれ 2. 5xl04個づっ 24ゥエルプレート（G¾co社製）にまく。 その後インスリンを含まない N2培地、インスリンを含む N2培地、および血清培地でぞ れぞれ細胞の培養を行う。 6日間細胞を培養し、 2日おきに増殖速度を測定する。
[0073] その結果、血清培地中においてはいずれの細胞の増殖速度にも差はないが、イン スリンを含む N2培地およびインスリンを含まな!/ヽ N2培地にお!、ては、 Visfatinヘテロ K 0-ES細胞に Visfatin発現プラスミドを戻し!/、れた ES細胞の増殖速度は、 Visfatinへテ 口 KO-ES細胞の増殖速度よりも有意に増加し、野生型 ES細胞の増殖速度に近づく。 実施例 7
[0074] Visfatin添加による ES細胞增殖谏度の回復
実施例 2に準じて # 8— 7、 # 8— 8、および野生型 ES細胞 RF8の 1クローンの合計 3 クローンをそれぞれ 2. 5xl04個づっ 24ゥエルプレート（G¾co社製）にまきこむ。インス リンを含まない N2培地およびインスリンを含む N2培地に、 WO2002/10772号公報の 実施例 1から 3に記載の方法に従って調製したマウス Visfatinタンパク質 (配列番号 4) を、終濃度 0.1、 1、および 10 g/mLで添加すること以外は実施例 2に記載した方法と 同様にして、細胞の培養を行う。 6日間細胞を培養し、 2日おきに増殖速度を測定す る。
インスリンを含む N2培地、インスリンを含まな!/ヽ N2培地の!/、ずれの培地にマウス Visf atinを添加した場合にも、マウス Visfatinを添加しな ヽ場合と比較して細胞増殖速度が 増加し、野生型 ES細胞の増殖速度に近づく。
産業上の利用可能性
[0075] 本発明により、ビスファチンまたはビスファチン遺伝子を有効成分として含有する多 能性幹細胞の増殖促進剤が提供される。本発明の増殖促進剤を無血清培地 (無血 清培養液)に添加することにより、血清非存在下でも多能性幹細胞の培養が可能とな る。よって本発明の増殖促進剤は再生医療における ES細胞の研究および臨床応用 において有効に用いられる。
図面の簡単な説明
[0076] [図 1]ES細胞およびマウス各組織におけるビスファチン遺伝子の発現を RT-PCRで解 祈した結果を示す図である。 rvisfatinjはビスファチン遺伝子の解析結果を示し、「N ATI Jはポジティブコントロールである NAT1の解析結果を示す。各々 RT-PCRによる 増幅サイクルを 30回繰り返した。レーン左から、逆転写酵素を除いたネガティブコント ロール (RT -)、未分化 ES細胞 (Undifferentiated ES)、分化 ES細胞 (differentiated ES)、 卵巣 (ovary)、精巣 (Testis),肺 (lung)、心臓 (heart)、肝臓 (liver)、腎臓 (kidney)、脳 (brai n)、脾臓 (spleen),胸腺 (thymus)、小腸 (intestine^皮膚 (skin)、筋肉 (muSCle)、腸間膜 脂肪、褐色脂肪、 MG1.19細胞、肝臓 (liver)、及び精巣周囲脂肪での発現結果を、そ れぞれ示す。
[図 2]ビスファチン遺伝子へテロノックアウト ES細胞（ # 8-7および # 8-8)の増殖速度を 調べた結果を示すグラフである。比較のため野生型 ES細胞 RF8についても同様の実 験を行った。図中、 A)は血清培地、 B)はインスリンを含まない N2培地、 C)はインスリン を含む N2培地で細胞を培養した時の細胞数の変化を示している。
[図 3]ビスファチンへテロ KOマウスを交配させて得られた受精後 3.5日目のブラストシ ストの培養結果を示す顕微鏡写真である。培養 1日目、 3日目及び 5日目の結果を示 した。比較のために野生型マウスについても同様の実験を行った。上図：ビスファチ ンホモ欠損ブラストシストの結果。下図：野生型マウスの結果。
[図 4]ES細胞の分ィ匕に伴ってビスファチンのタンパク量が減少することを示した、ゥェ スタンプロット解析の図である。図中「Visfatin」はビスファチンタンパクのバンドを示し 、「 β actinjはコントロールである βァクチンのバンドを示す。「WT」は野生型 ES細胞 の結果を、また「Vis+/-」はビスファチン遺伝子へテロノックアウト ES細胞の結果を示 す。
[図 5]野生型 ES細胞にビスファチンの siRNAを導入し、ビスファチンのタンパク量がノッ クダウンされたことを示すウェスタンブロット解析の図である。図中「Visfatin」はビスフ ァチンタンパクのバンドを示し、「 13 actinjはコントロールである 13ァクチンのバンドを 示す。「WT」は野生型 ES細胞の結果を、また Knock down(l,2,3)は 3種類のノックダウ ン ES細胞の結果を示す。
[図 6]Visfatinノックダウン細胞の増殖速度が抑制されたことを示すグラフである。図中 、縦軸は細胞数を示し、横軸は培養日数を示す。左図は血清存在下での実験結果 を示し、右図は N2B27無血清培地（Ying et al. Cell 115: 281-292, 2003)での実験結 果を示す。 WT (白棒）は野生型 ES細胞の結果を、また KD( 色棒)はノックダウン細胞 の結果を示す。
配列表フリーテキスト
配列番号： 5に記載の塩基配列は遺伝子増幅のために設計されたオリゴヌクレオチ ドプライマ一である。
配列番号: 6に記載の塩基配列は遺伝子増幅のために設計されたオリゴヌクレオチ ドプライマ一である。
配列番号： 7に記載の塩基配列は遺伝子増幅のために設計されたオリゴヌクレオチ ドプライマ一である。
配列番号: 8に記載の塩基配列は遺伝子増幅のために設計されたオリゴヌクレオチ ドプライマ一である。
配列番号： 9に記載の塩基配列は siRNAのために設計されたオリゴヌクレオチドであ る。

Claims

請求の範囲
[1] ビスファチンまたはビスファチン遺伝子を有効成分として含有する多能性幹細胞の 増殖促進剤。
[2] 多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項 1記載の増殖促進剤。
[3] ビスファチンを成分として含有する多能性幹細胞用培養液または培養キット。
[4] 多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項 3記載の培養液または培養キット。
[5] 請求項 3または 4記載の培養液または培養キットを用いることを特徴とする、多能性 幹細胞の培養方法。
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