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WO2006013964A1 - 糖蛋白質組成物の製造法 - Google Patents

糖蛋白質組成物の製造法 Download PDF

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WO2006013964A1
WO2006013964A1 PCT/JP2005/014408 JP2005014408W WO2006013964A1 WO 2006013964 A1 WO2006013964 A1 WO 2006013964A1 JP 2005014408 W JP2005014408 W JP 2005014408W WO 2006013964 A1 WO2006013964 A1 WO 2006013964A1
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seq
dna
gdp
protein
amino acid
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PCT/JP2005/014408
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English (en)
French (fr)
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Harue Nishiya
Mitsuo Satoh
Katsuhiro Mori
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KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a cell into which RNA that suppresses the function of an enzyme that catalyzes a reaction for converting GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy-GDP-mannose, and a glycoprotein composition using the cell
  • the present invention relates to a method for producing a product, RNA used for producing the cell, DNA corresponding to the RNA, and a vector containing the DNA and its complementary DNA.
  • the present invention also provides an RNA that suppresses the function of an enzyme involved in a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -bonded to the 6-position of N-glycidyl darcosamine at the N-glycoside-bonded complex sugar chain reducing end, and Intracellular sugar nucleotides Cells that have introduced RNA that suppresses the function of enzyme proteins involved in the synthesis of GDP-fucose or RNAs that suppress the function of proteins involved in the transport of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose to the Golgi apparatus And a method for producing a glycoprotein composition using the cells.
  • the present invention relates to a DNA corresponding to RNA that suppresses the function of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is a-linked to the 6-position of N-glycidyl darcosamine at the N-glycoside-bonded sugar chain reducing end. Suppresses the function of its complementary DNA and the enzyme protein involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose. Suppresses the function of RNA or intracellular sugar nucleotide GDP-fucose transported to the Golgi apparatus.
  • DNA containing DNA corresponding to RNA and its complementary DNA, vector containing the DNA, cell introduced with the vector, and N-glycyl-linked complex type sugar chain reducing terminal N-acetylylcosamine position 6 Suppresses the function of the enzyme involved in the sugar chain modification in which position 1 of fucose binds to a vector containing RNA corresponding to RNA and its complementary DNA, and intracellular sugar nucleotides GDP-Fuco Suppresses the function of the enzyme protein involved in the synthesis of RNA and intracellular sugar nucleotides. Suppresses the function of the protein involved in the transport of GDP-fucose to the Golgi apparatus. It contains DNA corresponding to RNA and its complementary DNA.
  • the present invention relates to a cell into which a vector has been introduced, and a method for producing a glycoprotein composition using the cell.
  • erythroboyetin A typical example of a glycoprotein pharmaceutical in which a sugar chain plays an important role in pharmacological activity is erythroboyetin. It is known that erythropoietin has a wide variety of sugar chain structures. It has an N-glycoside-bonded complex type 4-chain sugar chain and one 0-glycoside-linked sugar chain with fucose bound to three core structures.
  • Non-patent Documents 1 and 2 N -Pharmacological activity disappears when the glycosidic sugar chain is removed.
  • Non-patent Documents 4 and 6 differences in sugar chain structures such as addition of sialic acid to N-glycoside-linked sugar chains and branched structures affect pharmacological activity.
  • Non-Patent Documents 4, 5, and 6 proteins having a sugar chain structure modified with fucose generally have a short half-life in blood (Non-patent Document 7).
  • Non-Patent Document 8 There are two N-glycoside-type sugar chain binding sites in the Fc region of antibody IgG molecules.
  • serum IgG sialic acid and bisecting N-acetylyldarcosamine
  • galactose to the non-reducing end of this complex-type sugar chain
  • fucose to N-acetylyldarcosamine at the reducing end
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • CDC activity complement-dependent cytotoxic activity
  • this sugar chain structure ie, antibody
  • the fucose added to the N-glycidyl darcosamine at the N-glycoside-linked sugar chain reducing end linked to the Fc region plays an important role (Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Documents 9 and 10). ).
  • glycoproteins that are considered to be used in medicine are produced using genetic recombination technology. It is manufactured using animal cells such as CHO cells derived from Chinese hamster ovary tissue as host cells. However, the sugar chain structure of glycoproteins produced using genetic recombination technology differs depending on the host cell (Non-patent Documents 10 and 11). A sugar chain is added to a protein so that optimal pharmacological activity can be exerted.
  • Non-patent Documents 12 and 13 attempts have been made to alter the sugar chain structure of the produced glycoprotein by introducing an enzyme gene related to sugar chain modification.
  • the antibody was expressed using CHO cells into which ⁇ 1,4- ⁇ -acetylcylcosamine transferase III (GnTIII) was introduced, the ADCC activity was 16 times higher than that of the antibody expressed in the parent strain.
  • GnTIII ⁇ 1,4- ⁇ -acetylcylcosamine transferase III
  • the ADCC activity was 16 times higher than that of the antibody expressed in the parent strain.
  • Non-patent document 11 Patent document 3
  • 81,4_N-acetyldarcosamine transferase V (GnTV) has been reported to be toxic to CHO cells, such host cells are Not suitable for production.
  • Mutants with altered enzyme activity involved in sugar chain modification include, for example, WGA (T. vulgar i ⁇ -derived wheat— germ agglutinin), on onA ( ⁇ . Ensiformis 3 ⁇ 4 CO concanavalin A), RI ( R 2 communis-derived toxin), L— PHA (Leukoagglutinin from P. vulgaris), LCA (l ⁇ culina-derived lentil agglutinin), PSA (P. sativum-derived Pea lectin), etc. It has been acquired as a stock (Non-Patent Document 14).
  • glycoproteins with altered sugar chain structure can be produced by using mutants with altered enzyme activity involved in sugar chain modification as host cells.
  • an antibody having a high-mannose sugar chain structure is produced using a CHO cell mutant that lacks the activity of N-acetylylcosamine transferase I (GnTl)! (Patent Document 15) .
  • sialic acid is added to the non-reducing end of the sugar chain to express an antibody with a small saccharose chain structure. Examples of expression of antibodies without addition have been reported. Expression of antibodies with improved effector action so as to be suitable for pharmaceutical applications has not been successful (Non-patent Document 15).
  • AAL A CHO-AA L strain that exhibits metaphysis to Aleuria aumni-derived Lectin
  • LCA lentil agglutinin derived from L. culinaris
  • Lecl3 strain were used as host cells.
  • mutants such as PL R 1.3 and Lecl3 strain is obtained by introducing a random mutation by mutation agent treatment, ⁇ a suitable as strain used in pharmaceutical manufacturing.
  • Non-patent Document 4 As a simple example of an attempt to control the activity of an enzyme or protein involved in the modification of a host cell sugar chain, a method for controlling the function of a specific gene using siRNA (small interfering RNA) is known ( Patent Document 4).
  • RNA molecules designed by such methods can always effectively suppress the functions of target genes.
  • Designing RNA molecules that are not molecules (Non-patent Document 18) and that exhibit effective function-suppressing effects on specific genes involves trial and error.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is oc-bonded to the 6-position of N-acetylyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end was introduced It was shown that fucose modification to the sugar chain added to the produced glycoprotein can be controlled by using such cells (Patent Documents 2 and 4). In this report, by introducing RNA that suppresses the function of ex 1,6-fucosyltransferase into cell lines that produce antibody molecules, the proportion of sugar chains without fucose modification in the sugar chains added to the produced antibody molecules. It has been shown that
  • Patent Literature l WO00 / 61739
  • Patent Document 2 WO02 / 31140
  • Patent Document 3 W099 / 54342
  • Patent Document 4 WO03 / 85118
  • Non-Patent Document 1 Biochemistry, 31, 9872, (1992)
  • Non-Patent Document 2 Journal 'Ob' Biological 'Chemistry 0. Biol. Chem.), 267, 7
  • Non-Patent Document 3 Journal 'Ob' Biological 'Chemistry 0. Biol. Chem.), 265, 1 2127, (1990)
  • Non-Patent Document 4 Blood, 73, 84, (1989)
  • Non-Patent Document 5 Proceedings ⁇ Ob ⁇ The ⁇ National ⁇ Accademia's Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 86, 7819 (1989)
  • Non-Patent Document 6 Pretty'Journal'Ob'Cancer (British J. Cancer), 84, 3, (2001)
  • Non-Patent Document 7 Science, 295, 1898, (2002)
  • Non-Patent Document 8 Biochemistry, 36, 130, 1997
  • Non-Patent Document 9 Journal 'Ob' Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 277, 2
  • Non-Patent Document 10 Journal 'Ob' Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 278, 3466, (2003)
  • Non-Patent Document 11 Glycobiology, 5, 813, (1995)
  • Non-Patent Document 12 Journal 'Ob' Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 261,
  • Non-Patent Document 13 Science, 252, 1668 (1991)
  • Non-Patent Document 14 Somatic cell Mol. Genet., 12, 51 (1986)
  • Non-Patent Document 15 Journal 'Ob' Immunology (J. Immunol), 160, 3393 (1998)
  • Non-Patent Document 16 Journal 'Ob' Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 255,
  • Non-Patent Document 17 Nature Biotech., 22, 326 (2004)
  • Non-Patent Document 18 Current Opinion in Molecular Therapeutics, 6, 129 ( 2004)
  • An object of the present invention is to introduce a cell into which RNA that suppresses the function of an enzyme that catalyzes a reaction for converting GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy-GDP-mannose, and a sugar using the cell. It is intended to provide a method for producing a protein composition, RNA used for production of the cells, DNA corresponding to the RNA, and a vector containing the DNA and its complementary DNA.
  • an object of the present invention is to suppress the function of an enzyme involved in the sugar chain modification in which the 1-position of fucose is a-linked to the 6-position of N-glycidylcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end.
  • an object of the present invention is to suppress the function of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ex-linked to the 6-position of N-glycidylcorcamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end.
  • RNA that inhibits the function of the enzyme protein involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose and the protein involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus DNA containing a DNA corresponding to RNA that suppresses function and its complementary DNA, a vector containing the DNA, a cell in which the vector is introduced, and N-acetylyldarco at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end
  • the present invention relates to the following (1) to (71).
  • RNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 37, 57 or 58;
  • DN A that encodes a protein having a GDP-mannose 4,6-dehydratase activity that has been oridized under stringent conditions with DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 9;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and have an amino acid sequence ability and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and have the ability to align with GDP-mannose 4,6-dehydratase protein;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity.
  • RNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 37, 57 or 58;
  • RNA that inhibits the function of the enzyme involved in the sugar chain modification in which the 1-position of the fucose is ex-linked to the 6-position of N-acetylyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar reducing end and intracellular RNA that suppresses the function of enzymes involved in the synthesis of sugar nucleotide GDP-fucose or RNA that suppresses the function of proteins involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus.
  • RNA that inhibits the function of the enzyme involved in the sugar chain modification in which the 1-position of fucos is ⁇ -linked to the 6-position of N-glycidylcolacamine at the N-glycoside-bonded sugar chain reducing end And cells that have introduced RNA that suppresses the function of enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose.
  • a 1, 6-fucosyltransferase is a protein encoded by DNA selected from the following (a) to (! I) force as well as group force;
  • DNA encoding a protein having the at 1, 6-fucosyltransferase activity which is hybridized under stringent conditions with DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity.
  • (k) a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and having a 1,6-fucosyltransferase activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 and having a 1,6-fucosyltransferase activity.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar reducing end is The cell according to any one of (9) to (14), which is a double-stranded RNA composed of an RNA selected from the group consisting of (a) to (d) and a complementary RNA thereof;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by a base sequence of 10 to 40 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by a base sequence of 10 to 40 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • RNA that inhibits the function of the enzyme involved in the sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylcyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end Is a double-stranded RNA composed of RNA selected from the following groups (a) and (b) and a complementary RNA thereof: (9) to (14) Cell according to paragraph;
  • RNA comprising any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 14 to 35 or 85 to 89;
  • RNA having an activity to suppress the function of 1,6-fucosyltransferase activity (b) from any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 14 to 35 or 85 to 89, wherein one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • a RNA having an activity to suppress the function of 1,6-fucosyltransferase activity (b) from any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 14 to 35 or 85 to 89, wherein one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • DN A that encodes a protein having a base sequence ability of DNA represented by SEQ ID NO: 8 under stringent conditions and a protein having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity
  • DN A that encodes a protein that has the ability to base and hybridize under stringent conditions with DNA represented by SEQ ID NO: 9 and has GDP-mannose 4,6-dehydratase activity
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme that catalyzes the reaction to convert GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-mannose has the following (a) to (c) forces
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by a base sequence of 10 to 40 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 base sequences consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme that catalyzes the reaction to convert GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy-GDP-mannose is selected as follows (a) and (b) The cell according to any one of (11) to (19), wherein the cell is a double-stranded RNA composed of RNA and complementary RNA thereof;
  • RNA that suppresses the function of the enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ex-linked to the 6-position of N-glycidyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing terminal DNA containing its DNA and its complementary DNA, and DNA corresponding to RNA that inhibits the function of enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose and its complementary DNA.
  • N-glycoside-linked complex-type sugar chain N-acetylyldarcosamine at the 6-position of the enzyme chain involved in the sugar chain modification in which the 1-position of fucos is a-linked The DNA according to any one of (22) to (24), which is a DNAase.
  • DNA encoding a protein having the at 1, 6-fucosyltransferase activity which is hybridized under stringent conditions with DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • a 1, 6-fucosyltransferase DNA according to (25), which is a protein selected from the group consisting of the following (a) to (l);
  • a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and having ⁇ 1, 6-fucosyltransferase activity (g) a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and Z or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and having ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity.
  • (k) a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and having a 1,6-fucosyltransferase activity
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 and having a 1,6-fucosyltransferase activity.
  • RNA that suppresses the function of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylcyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end Is an RNA selected from the group consisting of the following (a) to (d): (NA) according to any one of (22) to (27);
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by a base sequence of 10 to 40 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by a base sequence of 10 to 40 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 base sequences consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 base sequences consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme involved in the sugar chain modification in which the 1-position of fucos is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylcylcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end But the following (a) and (b) are also selected for group power, (22) to (27) !, DNA according to item 1;
  • RNA comprising any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 14 to 35 or 85 to 89;
  • DN A that encodes a protein having a base sequence ability of DNA represented by SEQ ID NO: 8 under stringent conditions and a protein having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity
  • DN A that encodes a protein that has the ability to base and hybridize under stringent conditions with DNA represented by SEQ ID NO: 9 and has GDP-mannose 4,6-dehydratase activity
  • a DNA encoding a protein having a GDP-mannose 4,6-dehydratase activity that is hybridized with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 under stringent conditions.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme that catalyzes the reaction to convert GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-mannose has the following (a) to (c) forces Group force DNA selected from (24) to (32)!, Shear force DNA according to item 1;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by a base sequence of 10 to 40 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 base sequences consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 base sequences consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme that catalyzes the reaction to convert GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-mannose has the following powers (a) and (b): Group force DNA selected from (24) to (32) !, shear force DNA according to item 1; (a) an RNA consisting of any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 37, 57 or 58;
  • RNA that suppresses the function of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ex-linked to the 6-position of N-acetylyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar reducing end A vector or cell containing DNA corresponding to RNA and its complementary DNA that suppresses the function of enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose Endosaccharide nucleotide A cell into which a vector containing DNA corresponding to RNA that suppresses the function of a protein involved in the transport of GDP-fucose to the Golgi and its complementary DNA is introduced.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose ex-links to the 6-position of N-acetylcylcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end Introducing a vector containing DNA and its complementary DNA, and a vector containing DNA corresponding to RNA that suppresses the function of the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose and its complementary DNA.
  • RNA according to (41) or (42) which is an RNA that suppresses the function of an enzyme that catalyzes a reaction that converts GDP-mannose into GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-mannose.
  • DNA encoding a protein having the at 1, 6-fucosyltransferase activity which is hybridized under stringent conditions with DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity.
  • (k) a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and having a 1,6-fucosyltransferase activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 and having a 1,6-fucosyltransferase activity.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is alpha-linked to the 6-position of N-acetylyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end is The cell according to any one of (41) to (46), which is a double-stranded RNA composed of an RNA selected from the group consisting of (a) to (d) and a complementary RNA thereof;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by a base sequence of 10 to 40 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 base sequences consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • RNA that inhibits the function of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucos is ⁇ -linked to the 6-position of N-glycidylcolacamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end Is a double-stranded RNA composed of RNA selected from the following group (a) and (b) and a complementary RNA thereof: (41) to (46)! The cell of paragraph 1;
  • RNA comprising any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 14 to 35 or 85 to 89;
  • DN A that encodes a protein having a base sequence ability of DNA represented by SEQ ID NO: 8 under stringent conditions and a protein having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity
  • DN A that encodes a protein that has the ability to base and hybridize under stringent conditions with DNA represented by SEQ ID NO: 9 and has GDP-mannose 4,6-dehydratase activity
  • DNA with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 and stringers under stringent conditions DNA which encodes a protein having a GDP-mannose 4,6-dehydratase activity.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity;
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme that catalyzes the reaction to convert GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-mannose has the following (a) to (c) forces
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 base sequences consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme that catalyzes the reaction to convert GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy-GDP-mannose has the following potentials (a) and (b)
  • the cell is resistant to a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-glycidylcolcamine at the N-glycoside-linked sugar chain reducing end and the 1-position of fucose are bonded.
  • Lentil lectin LCA Lientil Agglutinin from Lens Culinaris
  • Herochawantake lectin AAL Lectin from Aleuriaaurantia
  • the cells are cells selected from the group consisting of yeast, animal cells, insect cells and plant cells (1) to (4), (8) to (21) and (40) to (55) The cell according to any one of
  • a fusion protein comprising the Fc region of (a) or (b).
  • a method for producing a glycoprotein composition comprising the steps of culturing the cell according to (58) in a medium, producing and accumulating the glycoprotein composition in the culture, and collecting and purifying the glycoprotein composition from the culture. Production method.
  • the force according to any one of (59) to (61) is cultured in a medium, the antibody composition is produced and accumulated in the culture, and the antibody composition is collected and purified from the culture. Including the step of A method for producing a body composition.
  • a medicament comprising the composition according to (69) or (70) as an active ingredient.
  • RNA that suppresses the function of an enzyme that catalyzes a reaction for converting GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy-GDP-mannose, and a sugar using the cell are introduced.
  • a method for producing a protein composition, RNA used for production of the cells, DNA corresponding to the RNA, and a vector containing the DNA and its complementary DNA are required.
  • an RNA that suppresses the function of an enzyme involved in a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is a- linked to the 6-position of N-acetylyldarcosamine at the N-glycoside-linked complex sugar reducing end And RNA that suppresses the function of the enzyme protein involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or RNA that suppresses the function of the protein involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus,
  • a method for producing a glycoprotein composition using the cells is provided.
  • an RNA that suppresses the function of an enzyme involved in a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -bonded to the 6-position of N-acetylyldarcosamine at the N-glycoside-bonded glycan reducing end.
  • FIG. 1 shows the construction of plasmid pBS-U6term.
  • FIG. 2 shows the construction of plasmid pPUR-U6term.
  • FIG. 3 shows the construction of plasmid pPUR / GMDshB.
  • FIG. 4 shows the amount of GMD mRNA in each cell line.
  • the horizontal axis shows the relative value of the ratio of GMD mRNA to 13-actin mRNA when the value of the parent strain 32-05-12 is 100, and the vertical axis shows each cell line.
  • the black bars indicate the parent cell lines that have been siRNA-introduced
  • the open bars indicate the cell lines that have been obtained by independently introducing the siRNA expression vector targeting GMD.
  • FIG. 5 shows the CHO / DG44 cell-derived anti-CCR4 antibody-producing strain 32-05-12AF and a lectin-resistant strain into which a siRNA expression plasmid targeting GMD was introduced.
  • FIG. 3 is a graph showing changes in viable cell density during serum-free fed-batch culture of GMDB-2AF strain and 12-GMDB-5AF strain. The horizontal axis represents the number of culture days, and the vertical axis represents the viable cell density.
  • ⁇ indicates 32-05-12AF
  • ⁇ indicates 12-GMDB-2AF
  • ⁇ indicates 12-GMDB-5. Show each one.
  • FIG. 6 shows the CHO / DG44 cell-derived anti-CCR4 antibody production strain 32-05-12AF, and a lectin-resistant strain into which a siRNA expression plasmid targeting GMD has been introduced 12-GMDB-2AF
  • FIG. 5 is a graph showing changes in the amount of antibody accumulated in the culture supernatant during serum-free fed-batch culture of the S. cerevisiae and 12-GMDB-5AF strains. The horizontal axis shows the number of days of culture, and the vertical axis shows the amount of antibody accumulation.
  • ⁇ indicates the 32-05-12AF strain
  • ⁇ indicates the 12-GMDB-2AF strain
  • ⁇ indicates the 12-GMDB-5 strain.
  • FIG. 7 is a diagram showing the construction of plasmids FUT8shRNA / lib2B / pPUR and FUT8shRNA / lib3 / pPUR.
  • FIG. 8 shows the construction of plasmids FT81ibB / pBS and FT81ib3 / pBS.
  • FIG. 9 shows the construction of plasmids FT81ibB / pAGE and FT81ib3 / pAGE
  • FIG. 10 shows each cell line obtained by introducing a siRNA expression vector targeting GMD and a siRNA expression vector targeting FUT8, and a siRNA expression vector targeting GMD alone.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount of GMD mRNA in each cell line or parent cell obtained.
  • the horizontal axis shows the relative value of the ratio of GMD mRNA to 13-actin mRNA when the value of the parent strain, 32-05-12, is 100, and the vertical axis shows each cell line.
  • the black bars indicate the parental cells into which siRNA has not been introduced
  • the white bars indicate the cell lines obtained by introducing the siRNA expression vector targeting GM alone.
  • FIG. 11 shows each cell line obtained by introducing an siRNA expression vector targeting GMD and an siRNA expression vector targeting FUT8, and an siRNA expression vector targeting GMD alone.
  • FIG. 4 is a view showing the amount of FUT8 mRNA in each cell line or parent cell obtained by introducing in FIG.
  • the horizontal axis shows the relative value of the ratio of FUT8 mRNA to 13-actin mRNA when the value of the parent strain 32-05-12 is 100, and the vertical axis shows each cell line.
  • the black bars indicate parent cell cells into which siRNA has not been introduced
  • the open bars indicate cell lines obtained by introducing an siRNA expression vector targeting GMD alone.
  • Figure 12 shows the introduction of the CHO / DG44 cell-derived anti-CCR4 antibody production strain 32-05-12AF, siRNA expression vector targeting GMD, and siRNA expression vector targeting FUT8. It is the figure which showed the change of the viable cell density in serum-free fuel batch culture of Wi23_5AF strain
  • the horizontal axis represents the number of culture days, and the vertical axis represents the viable cell density.
  • the dotted line indicates the 32-05-12AF strain, and the solid line indicates the W123-5AF strain.
  • FIG. 13 shows the CHO / DG44 cell-derived anti-CCR4 antibody production strain 32-05-12AF, siRNA expression vector targeting GMD, and siRNA expression vector targeting FUT8.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in the amount of antibody accumulated in the culture supernatant during serum-free fed-batch culture of Wi23_5AF strain, which is a lectin-resistant strain into which a bacterium has been introduced. The horizontal axis indicates the number of days of culture, and the vertical axis indicates the amount of antibody accumulation. In the figure, the dotted line indicates the 32-05-12AF strain, and the solid line indicates the Wi23-5AF strain.
  • FIG. 14 is a view showing the binding activity to the shFc y RIIIa of a standard sample in which fucose ( ⁇ )% of the anti-CCR4 chimeric antibody is known.
  • the horizontal axis represents fucose ( ⁇ )%, and the vertical axis represents absorbance at a wavelength of 490 nm indicating the binding activity to shFc y Rllla.
  • FIG. 15 shows the introduction of CHO / DG44 cell-derived anti-CCR4 antibody production strain 32-05-12AF, siRNA expression vector targeting GMD, and siRNA expression vector targeting FUT8
  • FIG. 4 is a graph showing fucose ( ⁇ )% calculated for the binding activity of anti-CCR4 chimeric antibody shFc y Rllla of anti-CCR4 chimera antibody contained in the culture supernatant of the lectin-resistant strain Wi23_5AF in serum-free fed-batch culture.
  • the horizontal axis represents the number of days of culture, and the vertical axis represents fucose (-)%.
  • the dotted line indicates the 32-05-12AF strain
  • the solid line indicates the Wi23-5AF strain.
  • FIG. 16 shows the construction of plasmids pCR / GMDshB and pCR / GMDmB.
  • FIG. 17 shows the construction of plasmids FT81ibB—GMDB / pAGE FT81ib3—GMDB / pAGE FT81ibB_G MDmB / pAGE and FT81ib3_GMDmB / pAGE.
  • FIG. 18 is obtained by introducing siRNA targeting GM D and siRNA co-expression vector targeting FUT8 into 32-05-12, which is a CHO / DG44 cell-derived anti-CCR4 antibody production strain. Et It is the figure which showed the relative expression level of GMD mRNA in each obtained cell line.
  • the horizontal axis shows the relative value of the ratio of GMD mRNA to 13-actin mRNA when the value of the parent strain 32-05-12 is 100, and the vertical axis shows each cell line.
  • the black bars are parent strains
  • the open bars are parent strains of cell lines obtained by introducing siRNA targeting GMD and siRNA co-expression vector targeting FUT8.
  • the relative values of GMD mRNA levels when the value of 12 strains is 100 are shown.
  • FIG. 19 shows the introduction of siRNA targeting GM D and siRNA co-expression vector targeting FUT8 into the CHO / DG44 cell-derived anti-CCR4 antibody production strain 32-05-12.
  • FIG. 3 is a graph showing the relative expression level of FUT8 mRNA in each cell line obtained in the above manner. The horizontal axis shows the relative value of the ratio of FUT8 mRNA to 13-actin mRNA when the value of the parent strain, 32-05-12, is 100, and the vertical axis shows each cell line.
  • the black bar is the parent strain
  • the open bar is the parent strain of each cell line obtained by introducing siRNA targeting GMD and siRNA co-expression vector targeting FUT8. The relative values of FUT8 mRNA when the value of 12 strains is 100 are shown.
  • FIG. 20 shows the construction of plasmid pPUR / GMDmB.
  • FIG. 21 shows that mouse GMD was transferred to KM968 strain, an anti-GM antibody-producing strain derived from SP2 / 0 cells.
  • FIG. 6 is a graph showing the relative expression level of GMD mRNA in each cell line obtained by introducing a siRNA co-expression vector targeting siRNA and FUT8.
  • the horizontal axis shows the relative value of the ratio of GM D mRNA amount to 13-actin mRNA when the value of the parent strain KM968 is 100, and the vertical axis shows each cell line.
  • the black bars indicate the parent strain
  • the open bars indicate the values of the parental KM968 strain of each cell line obtained by introducing siRNA targeting GMD and siRNA co-expressing FUT8.
  • the relative value of the amount of GMD mRNA when the value is 100 is shown.
  • FIG. 22 shows that mouse GMD was transferred to the KM968 strain, an anti-GM antibody-producing strain derived from SP2 / 0 cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the relative expression level of FUT8 mRNA in each cell line obtained by introducing a siRNA co-expression vector targeting siRNA and FUT8.
  • the horizontal axis shows the relative value of the ratio of FUT 8 mRNA to 13-actin mRNA when the value of the parent strain KM968 is 100, and the vertical axis shows each cell line.
  • Black bars in the figure Is the parental line, and the open bars are the values when the value of the parental KM968 strain is 100 for each cell line obtained by introducing siRNA targeting GMD and siRNA co-expressing FUT8.
  • the relative values of FUT8 mRNA levels are shown.
  • FIG. 23 is obtained by introducing siRNA targeting mouse GMD and siRNA co-expression vector targeting FUT8 into NS0 / 2160, an NS0 cell-derived anti-CCR4 antibody production strain. It is the figure which showed the relative expression level of GMD mRNA in each cell line.
  • the horizontal axis shows the relative value of the ratio of GMD mRNA to j8-actin mRNA when the value of the parent strain NS0 / 2160 is 100, and the vertical axis shows each cell line.
  • the black bars are parent strains
  • the open bars are NS0 / 2160, which is the parent strain of each cell line obtained by introducing siRNA targeting GMD and siRNA co-expression vector targeting FUT8.
  • the relative values of GMD mRNA levels when the strain value is 100 are shown.
  • FIG. 24 shows cells obtained by introducing siRNA targeting mouse GMD and siRNA co-expression vector targeting FUT8 into NS0 / 2160 strain, an NS0 cell-derived anti-CCR4 antibody production strain.
  • FIG. 3 is a view showing the relative expression level of FUT8 mRNA in a strain.
  • the horizontal axis shows the relative value of the ratio of FUT8 mRNA to 13-actin mRNA when the value of the parent strain NS0 / 2160 is 100, and the vertical axis shows each cell line.
  • the black bars are parent strains
  • the open bars are NS0 / 2160, which is the parent strain of each cell line obtained by introducing siRNA targeting GMD and siRNA co-expression vector targeting FUT8.
  • the relative values of FUT8 mRNA when the strain value is 100 are shown.
  • an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose is a sugar that is a supply source of fucose to sugar chains in cells. Any enzyme involved in the synthesis of nucleotide GDP-fucose is included. Further, the GDP-fucose synthase of the present invention includes an enzyme that affects the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose.
  • Intracellular GDP-fucose is supplied by the de novo or Salvage synthesis pathway. Therefore, all enzymes or proteins involved in these synthetic pathways are included in GDP-fucose synthase.
  • the GDP-fucose synthase involved in the de novo synthesis pathway is the enzyme that catalyzes the conversion of GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-mannose, GDP-4-keto, 6- Enzymes that catalyze the reaction of converting Deoxy-GDP-Mannose to GDP-Fucose.
  • GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-mannose is converted into GDP.
  • -Enzymes that catalyze the reaction to convert 4-keto, 6-deoxy-GDP-fucose enzymes that catalyze the reaction to reduce the 4-position of GDP-4-keto, 6-deoxy-GDP-fucose, etc.
  • it has an enzymatic activity that catalyzes the reaction of converting GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-fucose, and GDP -4-keto, 6-deoxy- GDP-GDP-keto-6-deoxymannose 3,5- epimerase, 4-reductase (GDP-keto-deoxy), an enzyme that catalyzes the reaction to reduce the 4-position of fucose Mannose 3,5-epimerase, 4-reductase).
  • Examples of the GDP-fucose synthase involved in the Salvage synthesis pathway include GDP-beta-L-focose pyrophosphorylase (GDP-beta-L-fucose-pyrophosphorylase) and Fucokinase (fucokinase).
  • Enzymes that affect the synthesis of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose include enzymes that affect the activity of the above-mentioned GDP-fucose synthase and the structure of the substance that is the substrate of the enzyme.
  • the protein involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus of the present invention is any protein as long as it is a protein involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus. Specifically, the GDP-fucose transporter One is given.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme that catalyzes the reaction of converting GDP-mannose of the present invention into GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-mannose is referred to as GDP-4-mannose.
  • 6-Deoxy-GDP-Mannose is a cell that has been introduced with RNA that suppresses the activity or expression of the enzyme that catalyzes the reaction to convert to mannose (hereinafter also referred to as “GDP-mannose converting enzyme”) are also included.
  • GDP-mannose 4,6-dehydratase is preferably used as the GDP-mannose converting enzyme.
  • the GDP-mannose 4,6-dehydratase includes the following (a) to (l) DNA-encoding proteins or the following (g) to ( 0 ) proteins.
  • DN A that encodes a protein that has the nucleotide sequence ability of DNA represented by SEQ ID NO: 8 and is hybridized under stringent conditions and has GDP-mannose 4,6-dehydratase activity
  • DN A encoding a protein having a GDP-mannose 4,6-dehydratase activity that is orbridized under stringent conditions with DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, and have Z or added amino acid sequence ability, and have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity protein
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity.
  • DNA encoding the amino acid sequence of GDP-mannose 4,6-dehydratase DNA having a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 8 to 10, and any of SEQ ID NOs: 8 to 10 Examples thereof include DNAs that hybridize under stringent conditions with DNAs having the nucleotide sequences shown and that encode amino acid sequences having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity.
  • the present invention provides an RNA that inhibits the function of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is oc-bonded to the 6-position of N-glycidylcolcamine at the N-glycoside-bonded complex sugar chain reducing end. Furthermore, the present invention relates to a cell into which RNA that suppresses the function of an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or RNA that suppresses the function of a protein involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus.
  • RNA that inhibits the function of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ - linked to the 6-position of N-glycidyl darcosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex sugar chain of the present invention Intracellular sugar nucleotides that inhibit the function of enzymes involved in the synthesis of GDP-fucose RNA or cells that introduce RNA that inhibits the function of proteins involved in the transport of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose to the Golgi apparatus N-glycoside-linked complex-type sugar chain N-acetylyldarcosamine at the end of the reduction is involved in sugar chain modification where the 1-position of fucose is a-linked RNA that suppresses the activity or expression of the enzyme (hereinafter also referred to as “a 1,6-fucose modifying enzyme”) and RNA that suppresses the activity or expression of the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucle
  • Examples include cells into which RNA that suppresses the activity or expression of a modifying enzyme, and RNA that suppresses the activity or expression of an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose, and more preferably ⁇ 1 RNA that suppresses the activity or expression of 1,6-fucose modifying enzyme, and an enzyme that catalyzes the reaction to convert GDP-mannose to GDP-4-keto, 6-deoxy- GDP-mannose (GDP-mannose Examples include cells into which RNA that suppresses the activity or expression of (north converting enzyme) has been introduced.
  • the a 1, 6-fucose modifying enzyme is a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -bonded to the 6-position of N-glycidyl darcosamine at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end.
  • Such enzymes are also included as long as they are related enzymes.
  • ⁇ 1, 6-fucose modifying enzyme examples include ⁇ 1, 6-fucosyltransferase and a-L-fucosidase.
  • the a 1, 6-fucosyltransferase includes a protein encoded by the following DNAs (a) to (! ⁇ ):
  • a protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 84 A protein having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 84
  • ( ⁇ ) a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and ⁇ or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and also has an ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity
  • (0) a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, or truncated or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and having ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity
  • (t) a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 84 and having a 1,6-fucosyltransferase activity.
  • DNA encoding the amino acid sequence of ⁇ 1,6-fucosyltransferase SEQ ID NOS: 1-4
  • DNA having a base sequence represented by a shift SEQ ID NOs: 1-4!
  • Examples thereof include DNA that is hybridized under stringent conditions with a DNA having a base sequence represented by any deviation and that encodes an amino acid sequence having ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity.
  • the DNA that hybridizes under stringent conditions is, for example, DNA such as DNA having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1-4 or 8-10. Or DNA obtained by using colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method, etc. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C in the presence of 0.7 to lmol / L sodium chloride using a filter on which DNA derived from colonies or plaques was immobilized, and then 0.1 to 2 The same concentration can be obtained by washing the filter at 65 ° C using a double-concentration SSC solution (composition of a single-concentration SSC solution consisting of 150 mmol / L sodium chloride and 15 mmol / L sodium citrate).
  • a double-concentration SSC solution composition of a single-concentration SSC solution consisting of 150 mmol / L sodium chloride and 15 mmol / L sodium citrate.
  • DNA capable of hybridizing is DNA having at least 60% or more homology with the base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1-4 or 8-10, preferably 70% or more, and more.
  • DNA having a homology of 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more can be mentioned.
  • the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 5 to 7 and 84 consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and Z or added, and a One or more amino acids in the protein having 1,6-fucosyltransferase activity or the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 11 to 13 are deleted, substituted, or Proteins that have both amino acid sequence ability and added amino acids, and that have GDP-mannose 4,6-dehydratase activity are molecular 'clawing second edition, current.protocolenoles'in'molecular ⁇ ⁇ biology, Nucleic 'acid' research (Nucleic Aci ds research), 10 , 6487 (1982), Proceedings' National 'academic' Saie Nsu.
  • deletion, substitution or addition can be performed by well-known techniques such as the above-mentioned site-directed mutagenesis.
  • the number is as much as possible, for example, 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5.
  • the protein having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 11 to 13 and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity is SEQ ID NO: 11 to 13, a protein having any one of the amino acid sequences described above and at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, Most preferred is a protein having a homology of 99% or more and having GDP-mannose 4,6-dehydratase activity.
  • the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 5 to 7 and 84 has a homology of 80% or more, and a 1,6-fucosyltransferase activity Is a protein having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5 to 7 and 84, and at least 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95%. As described above, it is a protein having homology of 97% or more, most preferably 99% or more, and having ⁇ 1,6-fucosyltransferase activity.
  • BLAST Journal 'Ob' Molecular ⁇ Biology (J. Mol. Biol.), 215, 403 (1 990)] for the amino acid sequence, including numerical values calculated using default parameters, BLAST2 [Nucleic Acids Res., 25, 3389 (199 7); Genomics Research (Genome Res.), 7, 649 (1997); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html] Examples include numerical values.
  • the default parameter 1 is 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is base sequence, amino acid 1 for sequence, — q (Penalty for nucleotide mismatch)- ⁇ , —r (reward for nucleotide match) is 1, -e (expect value) is 10, and 11 is for -W (wordsize) is base sequence 3 residues for amino acid sequences, 20 if -y (Dropoff (X) for blast extensions in bits) is blastn, 7 for programs other than blastn,-X (X dropoff value for gapped alignment in bit s) force Si 5 and — Z (final X dropoff value for gapped alignment in bits) 3 ⁇ 4 s 50 for blastn, 25 for programs other than blastn (http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast / html /blastcgihelp.htmD o
  • the cell used in the present invention may be any cell as long as it is a cell capable of expressing a glycoprotein such as an antibody molecule, and includes yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., preferably Animal cells.
  • animal cells include CHO cells derived from Chinese nomstar ovary tissue, rat myeloma cell line YB2 / 3HL.P2.Gll.16Ag.20 cell, mouse myeloma cell line NS0 cell, mouse myeloma cell line Examples include SP2 / 0-Agl4 cells, Syrian Nomster kidney tissue-derived BHK cells, antibody-producing hyperpridoma cells, human leukemia cell line Namalba cells, embryonic stem cells, and fertilized egg cells.
  • RNA that suppresses the function of enzymes involved in sugar chain modification where ⁇ -position of Cells introduced with RNA that suppresses the function of enzymes involved in synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or RNA that suppresses the function of proteins involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus ( Hereinafter, both are collectively referred to as cells of the present invention), which is a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the N-glycoside-linked sugar chain reducing end and the 1-position of fucose are a-linked. Tolerant. When the RNA is introduced, the parent cell is not resistant to the lectin.
  • the cell of the present invention is a cell capable of producing a glycoprotein composition such as yeast, animal cell, insect cell, plant cell, etc., and has an N-glycoside-linked complex type sugar chain at the reducing end.
  • examples include cells that are resistant to lectins that recognize a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetylyldarcosamine and the 1-position of fucose are a-linked.
  • the N-glycoside-linked glycan reducing terminal Host cells for the production of hyperidoma cells, human antibodies, and humanized antibodies that are resistant to lectins that recognize a sugar chain structure in which N-acetylcylcosamine at position 6 and position 1 of fucose are a-linked Embryonic stem cells and fertilized egg cells that produce transgenic non-human animals to produce antibodies, plant callus cells that produce transgenic plants to produce human antibodies, myeloma Cells, such as cells derived from the transgenic non-human animal, and the like.
  • Myeloma cells can be used as fusion cells when producing hyperidoma cells.
  • a transgenic non-human animal can be immunized with an antigen, and hyperprideoma cells can be produced using antibody-producing cells such as spleen cells of the animal.
  • a cell having resistance to a lectin refers to a cell whose growth is not inhibited even when cell culture is performed by applying an effective concentration of the lectin to the culture medium.
  • the effective lectin concentration at which growth is not inhibited may be appropriately determined according to the cell line used for the parent cell, but is usually 10 / zg / ml to 10 mg / ml, preferably 0.5 to 2.0 mg / ml. is there.
  • RNA that suppresses the function of GDP-mannose converting enzyme is introduced into the parent cell line, there is !!
  • the effective concentration of lectin in the case of introducing RNA that suppresses protein function is not less than the concentration at which the parent cell cannot grow normally, preferably the same concentration as the concentration at which the parent cell cannot grow normally.
  • the concentration is preferably 2 to 5 times, more preferably 10 times, and most preferably 20 times or more.
  • the parent cell is a cell before introducing RNA that suppresses the function of GDP-mannose converting enzyme, or fucose at the 6th position of N-glycyl-linked N-acetylyldarcosamine at the N-glycoside-linked glycan reducing end.
  • the parent cell line is not particularly limited, and specific examples thereof include the following cells.
  • NS0 cell parent cell lines are described in literature such as Bio / Technology (BIO / TECHNOLOGY), 10, 169 (1992), Biotechnol. Bioeng., 73, 261 (2 001), etc. NS0 cells are listed. Also included are NS0 cell line (RCB0213) registered with the RIKEN Cell Development Bank, and sub-strains that have been acclimated to various media in which these lines can grow.
  • the parental cells of SP2 / 0-Agl4 cells include Journal 'Ob' Immunology (J. Immunol.), 126, 317 (1981), Nature, 276, 269 (1978), Human 'Anti SP2 / 0-Agl4 cells described in the literature such as Ibodies' and'no, Human Antibodies and Hybridomas, 3, 129 (1992).
  • V Ru SP2 / 0-Agl4 cells (ATCC CRL-1581) registered with ATCC! /
  • And sub-strains ATCC CRL-1581.1
  • Chinese nomstar ovarian tissue-derived CHO cell parent cells include the journal 'Ob' Xperimental 'Medicine (Journal of Experimental Medicine), 108, 945 (195 8), Proceedings' National 'Academic' Science 'USA (Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA), 60, 1275 (1968), Genetics, 55, 513 (1968), Ch romosoma. 41, 129 (1973), Method' In 'Cell'Science (Methods in Cell Science), 18, 115 (1996), Radiation Research, 148, 260 (1997), Proceedings 'National' Academic 'Science' USA (Proc. Natl. Aca d. Sci.
  • CHO-K1 strain ATCC CCL-61
  • DUXB11 strain ATCC CRL-9096
  • Pro-5 strain ATCC CRL -1781 registered in ATCC
  • commercially available CHO-S strain (Lifetechnologies) Cat # 11619), or sub-strains that have been conditioned to various media in which these strains can grow.
  • the parent cell of rat myeloma cell line YB2 / 3HL.P2.G11.16Ag.20 cell includes a cell line established from Y3 / Ag 1.2.3 cell (ATCC CRL-1631). Specific examples include the journal 'Ob' Cellular 'Biology (J. Cell. Biol), 93, 576 (1982), Methods' Enzymol.', 73B, 1 (1981), etc. YB2 / 3HL.P2.G11.16Ag.20 cells described in the above literature. In addition, YB2 / 3HL.P2.G11.16Ag.20 cells (ATCC CRL-1662) registered in ATCC or substrains in which these strains are conditioned to various growth media can be mentioned.
  • parent cell lines used in the present invention include human leukemia cell line NM-F9 cell (DSM ACC2605, WO05 / 17130) or human embryonic retinal cell line PER.C6 cell (ECACC No. 96022940, US6855544), or substrains in which these strains are acclimated to various media capable of growth.
  • NM-F9 cell DSM ACC2605, WO05 / 17130
  • PER.C6 cell ECACC No. 96022940, US6855544
  • any lectin that can recognize the sugar chain structure can be used. Any lectin is included. Specific examples include lentil lectin LCA (Lentil Agglutinin derived from LensCulinaris), endumame lectin PSA (Pea Lectin derived from Pisum sativum), broad bean lectin VFA (Agglutinin derived from Vicia faba), and hirochawantake lectin AAL (Aleuriaaurantia) Lectin).
  • lentil lectin LCA Lientil Agglutinin derived from LensCulinaris
  • endumame lectin PSA Pea Lectin derived from Pisum sativum
  • broad bean lectin VFA Agglutinin derived from Vicia faba
  • hirochawantake lectin AAL Aleuriaaurantia
  • RNA that inhibits the function of enzymes involved in the synthesis of RNA and intracellular sugar nucleotides GDP-fucose or RNA that inhibits the function of proteins involved in the transport of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose to the Golgi apparatus
  • MRNA composed of RNA and its complementary RNA, which can reduce the amount of mRNA of 1,6-fucose modifying enzyme and mRNA involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose
  • Any amount of double-stranded RNA that can reduce the amount of mRNA in the protein involved in transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus, but the length of the RNA is 10 -40, preferably 10-30, more preferably 15-30 continuous RNAs.
  • RNA that suppresses the function of the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or the RNA that suppresses the function of the protein involved in the transport of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi body is preferably GDP- Examples include RNA that can reduce the amount of mannose converting enzyme mRNA.
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by a base sequence of 10 to 40 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10;
  • RNAs (a) to (c) and (1) to (6) above are hamster-derived parent cells, and (b), (3) and (4) Are preferably used as RNA that suppresses the function of GDP-mannose converting enzyme in parent cell lines derived from humans, and (c), (5) and (6) in parent cell lines derived from mice.
  • the RNA that suppresses the function of a 1,6-fucose modifying enzyme is preferably RNA that can reduce the amount of mRNA of ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme.
  • the length is 10 to 40, preferably 10 to 30, and more preferably 15 to 30.
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • RNA corresponding to DNA consisting of a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
  • RNA corresponding to DNA comprising a base sequence represented by 10 to 40 consecutive base sequences in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4;
  • RNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 35;
  • RNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 89;
  • RNAs (d) to (g) and (7) to (60) above are! /
  • the nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added is, for example, in the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 14 to 37, 57, 58 and 85 to 89 In which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • Double-stranded RNA resulting from deletion, substitution, insertion and / or addition of a base is The base may be deleted, substituted, inserted, and / or added only, that is, the double-stranded RNA is not necessarily a complete complementary strand as long as the effects of the present invention can be obtained. .
  • the present invention suppresses the function of an enzyme involved in the sugar chain modification in which the 1-position of fucose is oc-bonded to the 6-position of N-glycidylcocosamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end.
  • the present invention relates to a DNA containing a DNA corresponding to an RNA that suppresses the function of a protein involved in transport to the body and a complementary DNA thereof, and a vector containing the DNA.
  • RNA that suppresses the function of an enzyme involved in sugar chain modification in which the 1-position of fucose is a- linked to the 6-position of N-acetylyldarcosamine of the N-glycoside-bonded complex sugar chain reducing end of the present invention Responding DNA and its complementary DNA, and the function of the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose DNA corresponding to RNA and its complementary DNA or intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus
  • the DNA corresponding to RNA that suppresses the function of proteins involved in transport and its complementary DNA include DNA corresponding to RNA that suppresses the activity or expression of ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme and its complementary DNA, Inhibits the activity or expression of enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose and DNA associated with RNA and its complementary DNA or intracellular sugar nucleotides GDP-fucose involved
  • the DNA includes the corresponding DNA and its complementary DNA, and the DNA corresponding to the RNA that inhibits the activity or expression of the enzyme involved in the synthesis of the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose and its complementary DNA.
  • RNA that suppresses the activity or expression of a 1,6-fucose modifying enzyme and its complementary DNA
  • DNA corresponding to RNA that suppresses the function of GDP-mannose converting enzyme and its complementary DNA DNA.
  • the vector of the present invention is the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal N- of the present invention described above. Suppresses the function of the enzyme involved in the sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of acetylyldarcosamine. DNA corresponding to RNA that suppresses the function of the enzyme involved and its complementary DNA or intracellular sugar nucleotide GDP-DNA corresponding to RNA that suppresses the function of the protein involved in the transport of GDP-fucose to the Golgi body and its complementary DNA If it contains DNA containing DNA, it will be a great vector!
  • Examples of the vector of the present invention include, for example, a commercially available siRNA expression vector, wherein the 1-position of fucose is ⁇ -bonded to the 6-position of the N-glycidyl-linked complex sugar chain reducing end of N-acetylyldarcosamine.
  • DNA corresponding to RNA that suppresses the function of the enzyme involved in sugar chain modification and its complementary DNA and DNA corresponding to RNA that suppresses the function of the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose and its Complementary DNA or intracellular sugar nucleotides GDP-Fucose may be constructed by incorporating DNA corresponding to RNA that suppresses the function of the protein involved in transport of fucose to the Golgi body and DNA containing the complementary DNA.
  • the vector of the present invention includes an RNA that suppresses the function of an enzyme involved in a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is a-linked to the 6-position of N-glycyl-bonded glycosamine at the N-glycoside-linked complex sugar chain reducing end.
  • the DNA corresponding to the DNA and its complementary DNA are incorporated into the vector so that they are transferred by independent promoters, and the DNA corresponding to the RNA that suppresses the function of the enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose
  • the complementary DNA or intracellular sugar nucleotide GDP-Fucose is transferred to the Golgi body, and the vector corresponding to the RNA that inhibits the function of the protein that inhibits the function of the protein involved in the transport to the Golgi body and its complementary DNA are transcribed by independent promoters.
  • a a solution that inhibits the function of 1,6-fucose modifying enzyme can be used.
  • a DNA is constructed by linking the corresponding DNA to its complementary DNA with a linker, and the DNA is independently promoted. It is preferable to prepare it as a single vector by incorporating it into a vector so that it can be transcribed with a vector.
  • DNA and intracellular sugar nucleotide GDP-fucose linked to each other by a linker sequence of DNA corresponding to RNA that suppresses the function of the above ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme and its complementary DNA Suppresses the function of enzymes involved in the synthesis of DNA Suppresses the function of proteins involved in the transport of DNA corresponding to RNA and its complementary DNA linked to the Golgi body by DNA or intracellular sugar nucleotides GDP-fucose
  • the DNA corresponding to the RNA and its complementary DNA linked by a linker can be inserted into a vector so that it can be transcribed into a single continuous RNA by inserting it under a single promoter.
  • the two independent promoters may be the same type of promoter or different types of promoters.
  • the direction of two independent promoters may be the same or opposite.
  • the two independent promoters in the vector of the present invention preferably have different types of promoters arranged in the same direction.
  • any promoter can be used as long as it can function in the parent cell line.
  • U6 promoter when animal cells are used as the parent cell line, U6 promoter, HI promoter, tRNA promoter, etc.
  • a polymerase III promoter or the like is used.
  • the base sequence used for the linker may be any sequence that is used for the formation of double-stranded RNA.
  • RNA and its complementary strand RNA have a loop of about 2 to 10 bases.
  • a sequence capable of expressing a hairpin siRNA in which a double-stranded RNA is formed through linkage is preferred.
  • Specific examples of DNAs that correspond to RNA that inhibits the function of 1,6-fucose modifying enzyme and its complementary RNA and their complementary DNA linked by a linker sequence include SEQ ID NOs: 90, 91, Examples include DNAs selected by 94 and 95, respectively.
  • Intracellular sugar nucleotides GDP-mannose conversion for RNA that inhibits the function of enzymes involved in the synthesis of GDP-fucose and DNA that corresponds to its complementary RNA and its complementary DNA linked by a linker sequence RNA that inhibits enzyme function and The DNA corresponding to each of the complementary RNAs and the DNA obtained by linking the complementary DNAs with a linker sequence are preferred! Specifically, DNA that corresponds to the RNA that suppresses the function of GDP-mannose converting enzyme and its complementary RNA and its complementary DNA linked by a linker sequence are specifically represented by SEQ ID NOs: 92, 93, and 96. Examples thereof include DNA selected from the base sequences represented.
  • DNA that inhibits the function of ⁇ 1,6-fucose-modifying enzyme and DNA corresponding to the complementary RNA and its complementary DNA and DNA obtained by linking the complementary DNA with a linker sequence, and intracellular sugar nucleotides RNA that suppresses the function of enzymes involved in the synthesis of GDP-fucose and its complementary RNA or intracellular sugar nucleotides RNA that suppresses the function of proteins involved in the transport of GDP-fucose to the Golgi apparatus and its complementary RNA It is preferable to select and use an effective combination for each animal species derived from the parent cell to be introduced, in which the corresponding DNA and its complementary DNA are linked by a linker sequence.
  • a combination of the DNA represented by SEQ ID NO: 90 and the DNA represented by SEQ ID NO: 92, or the DNA represented by SEQ ID NO: 91 and SEQ ID NO: 92 is preferably used.
  • Cells into which the vector of the present invention has been introduced are also encompassed by the cells of the present invention.
  • the DNA corresponding to RNA that suppresses the function of the enzyme involved in the sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ - linked to the 6-position of the ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end of the ⁇ -glycoside bond complex type sugar chain Inhibits the function of enzymes involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose and its complementary DNA. It is involved in the transport of DNA corresponding to RNA and its complementary DNA or intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus.
  • the DNA corresponding to RNA that suppresses protein function and its complementary DNA are divided into two independent vectors. Cells into which these two types of vectors have been co-introduced after introduction are also encompassed by the cells of the present invention.
  • the cell of the present invention can produce a highly bioactive glycoprotein having a sugar chain structure without fucose modification. That is, the present invention can provide a method for producing a glycoprotein having higher physiological activity than the glycoprotein produced by the parent cell line.
  • glycoproteins As a typical glycoprotein that shows high bioactivity and has no fucose modification, it has high sucrose structure and has a sugar chain structure without fucose modification. Examples include glycoproteins, glycoproteins that improve the half-life in blood, glycoproteins that change tissue distribution after administration in blood, and glycoproteins that improve interaction with proteins necessary for the expression of pharmacological activity.
  • the glycoprotein includes a glycoprotein having a fucose modification in the sugar chain structure of the produced protein when produced in the parent cell line.
  • Specific examples include antibodies, erythropoietin, thrombopoietin, tissue-type plasminogen activator, prolokinase, thrombomodulin, antithrombin III, protein, blood coagulation factor VII, blood coagulation factor VIII, blood coagulation factor IX , Blood coagulation factor X, gonadotropin, thyroid stimulating hormone, epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor, activin, bone morphogenetic factor, stem cell factor (SCF), interferon ⁇ , Interferon 13, interferon ⁇ , interleukin 2, interleukin 6, interleukin 10, interleukin 11, soluble 'interleukin 4 receptor, tumor necrosis factor at, DNase I, galactosidase, oc
  • an antibody composition As a more specific example of a glycoprotein that has a sugar chain structure without fucose modification and whose physiological activity is significantly increased, for example, an antibody composition can be mentioned.
  • the cell of the present invention can produce an antibody composition having higher ADCC activity than the antibody composition produced by the parent cell line.
  • the cell of the present invention has N-acetylyldarcosamine at the reducing end of sugar chain and fucose bound among all N-glycoside-bound complex sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition.
  • the ratio of sugar chains is higher than that of the parent cell line, and an antibody composition can be produced.
  • the antibody composition refers to a composition containing an antibody molecule having an N-glycoside-bonded complex sugar chain in the Fc region.
  • An antibody is a tetramer in which two molecules of two types of polypeptide chains, a heavy chain and a light chain (hereinafter referred to as “H chain” and “L chain”, respectively) are associated with each other. About one-quarter of the N-terminal side of the H chain and about one-half of each of the N-terminal side of the L chain (100 amino acids each) are called variable regions (hereinafter referred to as “V regions”). Rich in sex and directly involved in antigen binding. Most of the parts other than the V region are called stationary regions (hereinafter referred to as “C region”). Antibody molecules are classified into IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE classes based on C region homology.
  • the IgG class is further classified into IgGl to IgG4 subclasses based on C region homology.
  • H chain is antibody H chain V region (hereinafter referred to as VH), antibody H chain C region 1 (hereinafter referred to as CH1), antibody H chain C region 2 (hereinafter referred to as CH2) from the N-terminal side.
  • the antibody H chain C region 3 (hereinafter referred to as CH3) is divided into four immunoglobulin domains. Between CH1 and CH2, there is a highly flexible peptide region called the hinge region, and CH1 and CH2 Are separated.
  • the structural unit consisting of CH2 and CH3 after the hinge region is called Fc region, and N-glycoside-linked sugar chains are bound.
  • this region is a region where Fc receptors, complements, etc. bind (Immunology Illustrated Original Book 5th Edition, published February 10, 2000, Nanedo Edition, Introduction to Antibody Engineering, January 25, 1994) First edition, Jinjinshokan).
  • the sugar chain of a glycoprotein such as an antibody is a sugar chain that binds to asparagine (N-glycoside-linked sugar chain) and serine, threonine, etc., depending on the binding mode with the protein moiety (0-Dari).
  • N-glycoside-linked glycans have a common core structure, such as the structural formula (I) shown in the following chemical formula 1 [Biochemical Experimental Method 2 3—Glycoprotein Glycan Research Method (Academic Publishing Center) ) Takahashi Ryoko (1989)].
  • the N-glycoside-linked sugar chain may be any N-glycoside-linked sugar chain as long as it has the core structure of the above structural formula (I), but only mannose binds to the non-reducing end of the core structure.
  • the core structure has one or more galactose-N-acetylcylcosamine (hereinafter referred to as Ga ⁇ GlcNAc) branches on the non-reducing end side of the core structure, and further on the non-reducing end side of Ga ⁇ GlcNAc.
  • Ga ⁇ GlcNAc galactose-N-acetylcylcosamine
  • the Fc region of an antibody molecule has a region where N-glycoside-linked sugar chains are bonded one by one, two sugar chains are bound per antibody molecule.
  • the N-dalcoside-linked sugar chain that binds to the antibody molecule includes a number of sugar chains that contain the core structure represented by the structural formula (I), so two N-dalcoside bonds that bind to the antibody. There are many combinations of sugar chains in the sugar chain.
  • An antibody composition produced using a cell into which RNA that suppresses the function of a protein involved in the transport of RNA or intracellular sugar nucleotide GDP-fucose to the Golgi apparatus is within the range where the effects of the present invention can be obtained. If so, it may be composed of antibody molecules having a single sugar chain structure, or it may be composed of antibody molecules having a plurality of different sugar chain structures.
  • the ratio refers to the total number of all N-glycoside-bonded complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the composition.
  • the sugar chain in which fucose is not bound to N-acetylyldarcosamine at the N-glycoside-bonded complex type sugar chain reducing end means that fucose is the N-glycol at the N-glycoside-linked complex type sugar chain reducing end.
  • the ratio of the sugar chain of the present invention is preferably 20% or more, more preferably 30% or more, still more preferably 40% or more, particularly preferably 50% or more, most preferably A 100% antibody composition is preferable.
  • the present invention also relates to a method for producing an antibody composition having ADCC activity higher than that of an antibody composition produced by a parent cell line.
  • the ratio of the sugar chain of the present invention is higher than that of the antibody composition produced by the parent cell, it has higher ADCC activity than the antibody composition produced by the parent cell.
  • ADCC activity means that an antibody bound to a cell surface antigen such as a tumor cell in a living body activates an effector cell through the binding between an antibody Fc region and an Fc receptor present on the effector cell surface
  • Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley—Liss, Inc., Capter 2.1 (1995)] refers to the activity of damaging tumor cells.
  • effector cells include killer cells, natural killer cells, and activated macrophages.
  • composition containing an antibody molecule having an N-glycoside-linked complex type sugar chain in the Fc region fucose is bound to N-acetylyldarcosamine at the sugar chain reducing end, and the sugar chain
  • the ratio of glycine is released using known methods such as antibody molecular force hydrazine degradation and enzymatic digestion [Biochemistry Experimental Method 23—Glycoprotein Glycosidase Research Institute (Academic Publication Center) Takahashi Eiko (1989)].
  • the released sugar chain can be determined by fluorescent labeling or isotope labeling and separating the labeled sugar chain by a chromatographic method. It should also be determined by analyzing the released sugar chain by the HPAED-PAD method [Journal 'Ob' Liquid 'Chromatography (J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577 (1983)].
  • the antibody molecule includes any molecule as long as it contains the Fc region of an antibody.
  • Specific examples include antibodies, antibody fragments, and fusion proteins containing an Fc region.
  • antibodies produced by gene recombination technology that is, antibody genes are inserted.
  • antibodies obtained by introducing the antibody expression vector into a host cell Specifically, antibodies produced by Hypridoma, humanized antibodies, human antibodies and the like can be mentioned.
  • Hypridoma has a desired antigen specificity obtained by cell fusion of B cells obtained by immunizing mammals other than humans with myeloma cells derived from mice, rats, and the like. It refers to a cell that produces a monoclonal antibody.
  • humanized antibodies include human chimeric antibodies and human CDR-grafted antibodies.
  • Human chimeric antibodies consist of non-human animal antibody VH and antibody L chain V regions (hereinafter referred to as VL), human antibody H chain C region (hereinafter referred to as CH) and human antibody L chain.
  • VL non-human animal antibody
  • CH human antibody H chain C region
  • CL human antibody L chain
  • mice, rats, mice, musters, rabbits, and the like can be used as long as they can produce a hyperidoma.
  • a human chimeric antibody is obtained by obtaining cDNA encoding VH and VL from nobridoma, which produces monoclonal antibodies, as an expression vector for a host cell having genes encoding human antibody CH and human antibody CL. Each can be inserted to construct a human chimeric antibody expression vector and introduced into a host cell for expression and production.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as “hlg”), but the hlgG class is preferred, and hIgGl and hIgG2 belonging to the hlgG class are preferred. Any of the subclasses such as hIgG3 and hIgG4 can be used. In addition, any human chimeric antibody can be used as long as it belongs to hlg. / I can.
  • a human CDR-grafted antibody refers to an antibody obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of a non-human animal antibody into appropriate positions of the VH and VL of a human antibody.
  • the human CDR-grafted antibody is constructed by constructing cDNA encoding the V region in which the VH and VL CDR sequences of non-human animal antibodies are grafted onto the VH and VL CDR sequences of any human antibody, and the human antibody CH
  • a human CDR-grafted antibody expression vector by inserting the expression vector into a host cell expression vector having a gene encoding CL of human antibody and human antibody, and introducing the expression vector into the host cell. Can be expressed and produced
  • the CH of the human CDR-grafted antibody may be any as long as it belongs to hlg, but the hlgG class is preferable, and the subclasses such as hIgGl, hIgG2, hIgG3, hIgG4 belonging to the hlgG class. Any of these can be used.
  • the CL of the human CDR-grafted antibody any ⁇ class or e class can be used as long as it belongs to hlg.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library prepared by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques, as well as human antibody transgenes. Also included are antibodies obtained from nick animals or human antibody transgenic plants.
  • the antibody present in the human body can be obtained by, for example, isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting EB virus, etc., immortalizing and cloning, thereby culturing lymphocytes that produce the antibody,
  • the antibody can be purified from the inside.
  • the human antibody phage library 1 is a library in which antibody fragments such as Fab and single chain antibody are expressed on the phage surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into the phage genes. From the library, phages expressing antibody fragments having a desired antigen-binding activity can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule having two complete heavy chains and two complete light chain forces by genetic engineering techniques.
  • a human antibody transgenic non-human animal is an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells. Specifically, a human non-human animal that produces human antibodies is produced by introducing a human antibody gene into a mouse embryonic stem cell, transplanting the embryonic stem cell to an early embryo of another mouse, and generating it. Can do. In addition, human antibody genes are introduced into fertilized eggs of animals. It is also possible to produce a transgenic non-human animal that produces a human antibody by generating a fertilized egg. A method for producing a human antibody from a transgenic non-human animal producing a human antibody is performed in a normal non-human mammal, and a human antibody hyperidoma is obtained and cultured by a method for producing a hyperidoma. Human antibodies can accumulate in the culture.
  • transgenic non-human animals include sushi, hidge, goat, pig, horse, mouse, rat, chicken, monkey, or rabbit.
  • the antibody is an antibody recognizing a tumor-related antigen, an antibody recognizing an antigen related to allergy or inflammation, an antibody recognizing an antigen related to cardiovascular disease, or an autoimmune disease.
  • IgG is the preferred class of antibody that preferably recognizes antigens or antibodies that recognize antigens associated with viral or bacterial infections.
  • An antibody fragment is a fragment containing the Fc region of the above antibody.
  • the antibody fragment may be any fragment as long as it contains the Fc region of the antibody, and specific examples include H chain monomers and H chain dimers.
  • the fusion protein having the Fc region may be any substance as long as it is a substance obtained by fusing an antibody or antibody fragment containing the Fc region of an antibody with a protein such as an enzyme or cytodynamic force.
  • an RNAi gene construct of an appropriate length including a part of the untranslated region is designed based on the part encoding the GDP-mannose converting enzyme.
  • the prepared DNA fragment or full length A thread-replaceable vector is prepared by inserting it downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the cell of the present invention can be obtained by selecting a transformant using as an index the activity of the introduced GDP-mannose converting enzyme or the sugar chain structure of the produced antibody molecule or glycoprotein on the cell surface.
  • any strain can be used as long as it has a target GDP-mannose converting enzyme gene such as yeast, animal cell, insect cell, plant cell and the like. Specific examples include the host cell described in 2. below.
  • RNAi gene a vector that can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the designed RNAi gene can be transcribed is used.
  • examples of the expression vector that is transcribed by polymerase III include the expression vector described in 2. below.
  • Examples of methods for obtaining cDNA and genomic DNA of GDP-mannose converting enzyme include the methods described below.
  • a cDNA library is prepared from the prepared total RNA or mRNA.
  • a degenerative primer is prepared. Obtain a gene fragment encoding the enzyme.
  • a cDNA library can be screened to obtain cDNA encoding GDP-mannose converting enzyme.
  • RNA of various host cells For the mRNA of various host cells, commercially available products (for example, manufactured by Clontech) may be used. You can also prepare various host cell strengths as below. Methods for preparing total RNA from various host cells include guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)], guanidine acid thiocyanate. ⁇ Phenol ⁇ Chromatic mouth form (AGPC) method [Analytical ⁇ Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987); Experimental Medicine, 1937 (1991)].
  • AGPC Chromatic mouth form
  • examples of a method for preparing mRNA as poly (A) + RNA with total RNA strength include an oligo (dT) -fixed cellulose column method (molecular cloning second edition).
  • mRNA can be prepared by using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) or Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) or Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • a cDNA library is prepared from various prepared host cell mRNAs.
  • cDNA library preparation methods please refer to Molecura Ira 'Cloning 2nd Edition, Current Protocols' In' Molecura ⁇ Biology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989) Or a method using a commercially available kit such as Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies) or ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGE NE).
  • any phage vector or plasmid vector can be used as long as it can replicate autonomously in Escherichia coli K12.
  • ZAP Express [Strata gies, Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 ( 1989)]
  • Lambda ZAP II (manufactured by STRATAGENE)
  • ⁇ gtl0, ⁇ g ti l [DNA cloning, A Practical Approach], 1, 49 (1985 )]
  • pcD2 [Molecular ⁇ ⁇ Cellular ⁇ ⁇ Biology (Mol. Cell. Biol), 3, 280 (1983)] and pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)].
  • Escherichia coli is preferably used as a host microorganism for preparing a cDNA library. Specifically, Escherichia coli XLl-Blue MRF '[Stratagies, 5, 81 (1992)], Escherichiacoli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichia coli Y 1088 [Science, 222, 778 (1983) ⁇ , Escherichia coli Yl 090 "Science, 222, 778 (1983) 1, Escherichia coli NM522" Journal, Ob, Molecura ⁇ Nology (J. Mol.
  • the obtained gene fragment is a DNA encoding GDP-mannose converting enzyme, which means that a base sequence analysis method such as Sanger et al.'S dideoxy method [Proceedings' Ob The] Analyze using nucleotide sequence analyzers such as National 'Academia ⁇ Science' (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABI PRISM377 DNA Sequencer (PE Biosystems) This can be confirmed.
  • a base sequence analysis method such as Sanger et al.'S dideoxy method
  • Nucleotide sequence analyzers such as National 'Academia ⁇ Science' (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABI PRISM377 DNA Sequencer (PE Biosystems) This can be confirmed.
  • the base sequence of the DNA encoding the obtained GDP-mannose converting enzyme is used as a base sequence analysis method, such as Sanger et al.'S dideoxy method [Procedures' Ob 'The National' Analyze using a base sequence analyzer such as Academia Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABI PRISM 377 DNA Sequencer (PE Biosys tems) As a result, the base sequence of the DNA is determined.
  • a base sequence analysis method such as Sanger et al.'S dideoxy method [Procedures' Ob 'The National' Analyze using a base sequence analyzer such as Academia Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABI PRISM 377 DNA Sequencer (PE Biosys tems)
  • Examples of the base sequence of the gene encoding the GDP-mannose converting enzyme obtained by the above method include the base sequences set forth in any of SEQ ID NOs: 8 to L0.
  • Examples of the method for preparing GDP-mannose converting enzyme genomic DNA include the methods described below.
  • genomic DNA examples include known methods described in Molecular Cloning 2nd Edition and Current Protocols in Molecular Biology.
  • genomic DNA library screening system Genome Systems
  • Universal GenomeWalker TM Kits CLOCK TM Kits
  • Examples of a method for selecting a transformant using the activity of GDP-mannose converting enzyme as an index include the following methods.
  • any lectin may be used as long as it recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-glycidylcolcamine at the N-glycoside-linked sugar chain reducing end and the 1-position of fucose are a-linked.
  • Force that can preferably lentil lectin LCA (Lensculinaris ⁇ Lentil Agglutinin) Endomeme lectin PSA (Peaum sativum-derived Pea Lectin), Sola bean lectin VFA (Vicia-derived Agglutinin), Hirochawantake lectin AAL (Lectin from Aleu riaaurantia), etc .;
  • the cells are cultured in a medium containing the above lectin at a concentration of 10 ⁇ g / ml to 10 mg / ml, preferably 0.5 to 2 mg / ml, for 1 day to 2 weeks, preferably 3 days to 1 week.
  • the surviving cells can be subcultured or colonies collected, transferred to another incubator, and further cultured in a medium containing lectin to select the cells of the present invention.
  • RNAi gene for suppressing the mRNA level of the GDP-mannose converting enzyme gene can be prepared by a conventional method or using a DNA synthesizer.
  • RNAi gene construct is [Nature, 391, 806 (1998); Proc. Ings 'The National Academi ⁇ ⁇ Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. US A), 95, 15502 (1998); Nature, 395, 854 (1998); Proceedings of the National Sciences ( proc . Natl. Acad. Sci) USA), 96, 504 9 (1999); Cell, 95, 1017 (1998); Proceedings' Ob 'The' National 'Ability Deb''Science' (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451 (1999); Proceedings 'Ob' The National 'Academi ⁇ ⁇ Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959 (1998); ⁇ ⁇ ⁇
  • the cell can be designed according to the description of Nature Cell Biol, 2, 70 (2000)].
  • the cells of the present invention can also be obtained by directly introducing into a host cell a double-stranded RNA designed based on the base sequence of GDP-mannose converting enzyme without using an expression vector. .
  • Double-stranded RNA can be prepared by a conventional method or using an RNA synthesizer. Specifically, a sequence corresponding to 10 to 40 bases, preferably 10 to 30 bases, and more preferably 15 to 30 bases of the complementary RNA base sequence of GDP-mannose converting enzyme cDNA and genomic DNA. Based on the sequence information of the oligonucleotide possessed, it can be prepared by complementing the oligonucleotide.
  • the oligonucleotide and antisense oligonucleotide may be synthesized independently, or a spacer that does not hinder the formation of double-stranded RNA. Connected with nucleotides.
  • oligonucleotide derivatives examples include oligo RNA and derivatives of the oligonucleotide (hereinafter referred to as oligonucleotide derivatives).
  • Oligonucleotide derivatives include oligonucleotide derivatives in which phosphodiester bonds in oligonucleotides are converted to phosphorothioate bonds, and phosphodiester bonds in oligonucleotides are converted to ⁇ 3'- ⁇ 5 'phosphoramidate bonds.
  • Oligonucleotide derivatives Oligonucleotide derivatives, oligonucleotide derivatives in which the ribose and phosphodiester bonds in the oligonucleotide are converted to peptide nucleic acid bonds, oligonucleotide derivatives in which the uracil in the oligonucleotide is replaced with C-5 propylene uracil, in the oligonucleotide Oligonucleotide derivatives in which uracil is substituted with C-5 thiazoluracil, oligonucleotide derivatives in which cytosine in the oligonucleotide is substituted with C-5 propylcytosine, and cytosine in the oligonucleotide Oligonucleotide derivatives substituted with phenoxazine-modified cytosine, oligonucleotide derivatives substituted with 2 and 0-propyl ribose in the oli
  • RNA that inhibits the function of 1,6-fucose modifying enzyme, and RNA or intracellular sugar nucleotide that inhibits the function of GDP-fucose synthase GDP-fucose involved in the transport of Golgi to the Golgi apparatus Of RNA-introduced cells that suppress the function of proteins
  • RNA which suppresses the function of a 1,6-fucose modifying enzyme of the present invention and RNA which suppresses the function of GDP-fucose synthase or intracellular sugar nucleotide GDP-fucose of proteins involved in the transport to the Golgi apparatus
  • the preparation method of cells introduced with RNA that suppresses function is as follows: a RNA that suppresses the function of 1,6-fucose modifying enzyme and RNA that suppresses the function of GDP-fucose synthase Powers to explain a Cells that have introduced RNA that suppresses the function of 1,6-fucose-modifying enzyme and RNA that suppresses the function of proteins involved in the transport of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose to the Golgi apparatus Can be produced.
  • RNAi gene construct of an appropriate length including a portion encoding a 1,6-fucose modifying enzyme and GDP-fucose synthase or an untranslated region is designed.
  • a thread recombination vector is prepared by inserting the prepared DNA fragment or full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the transformant of the present invention is selected. Cells can be obtained.
  • Host cells such as yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., which have the target ex 1,6-fucose modifying enzyme gene and the GDP-fucose synthase gene, may be used. Any of them can be used. Specifically, the host cells described in 2. below can be mentioned.
  • RNAi gene a vector that can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the designed RNAi gene can be transcribed is used.
  • examples of the expression vector that is transcribed by polymerase III include the expression vector described in 2. below.
  • the cDNA and genomic DNA of ⁇ 1, 6-fucose modifying enzyme or GDP-fucose synthase can be obtained, for example, in the same manner as in the method described in this section (1).
  • Examples of a method for selecting a transformant using the activity of 1,6-fucose modifying enzyme or GDP-fucose synthase as an index include the following methods.
  • RNAi gene for suppressing the mRNA level of 1,6-fucose modifying enzyme or GDP-fucose synthase gene can be prepared by a conventional method or using a DNA synthesizer.
  • RNAi gene construct can be designed in the same manner as described in (1) above.
  • a double-stranded RNA designed based on the base sequence of a 1,6-fucose modifying enzyme and a double-stranded RNA designed based on the base sequence of GDP-fucose synthase can also be obtained by directly introducing it into a host cell.
  • Double-stranded RNA can be prepared in the same manner as described in (1) above.
  • an antibody composition As an example, a method for producing a glycoprotein using the cells of the present invention will be described.
  • the antibody composition can be found in Molecilla 1 Cloning, 2nd edition, Current Protocols' In 'Molef ⁇ ' Noiolon 1 ⁇ , Antioodies, A Laboratory manual, Cold bpnng Haroor La boratory, 1988 (Hereinafter abbreviated as anti-bodies), Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (hereinafter abbreviated as monoclonal anti-bodies), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University
  • antibody engineering Using the method described in Press, 1996 (hereinafter abbreviated as “antibody engineering”), for example, it can be expressed and obtained in the cells of the present invention as follows.
  • cDNA of the antibody molecule is prepared.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared.
  • a transformant producing an antibody molecule can be obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the host cell used in the method for producing an antibody composition is the cell of the present invention prepared in 1. above, wherein the target gene such as yeast, animal cell, insect cell, plant cell, etc. Any force that can be used as long as it can be expressed is preferably an animal cell.
  • Cells such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells into which an enzyme related to modification of the N-glycoside-linked sugar chain that binds to the Fc region of an antibody molecule has been introduced using genetic engineering techniques. It can also be used as a host cell.
  • the expression vector can be autonomously replicated in any of the above host cells! /, Or can be integrated into the chromosome and can be transferred to a position where the DNA encoding the target antibody molecule can be transcribed. A thing containing is used.
  • cDNA is prepared from a tissue or cell of a human or non-human animal using a probe primer specific for the target antibody molecule, according to the “cDNA preparation method” described in 1. above. be able to.
  • yeast When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATC C37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) and the like.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains.
  • promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, MFa 1 promoter 1, CUP 1 promoter and the like.
  • Examples of host cells include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluybe mouth genus, Trichosporon genus, and Schu-omyces genus, such as Saccharomvcescerevi siae, achizosaccharomvcespombe. Kluyveromvces lactis And raise. I can do it.
  • any method for introducing DNA into yeast can be used.
  • the electoral position method [Methods. EnzymoL, 194, 182 (1990)]
  • the spheroplast method [Proceedings 'Ob' The National 'Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 84, 1929 (1 978)]
  • Lithium Acetate Method [Journal 'Ob' Battereriology, 153, 16 3 (1983 )], Procedures of the National Academy of Science, oc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978)] .
  • expression vectors include pcDNAU pcD M8 (sold by Funakoshi), pAGE107 [JP 3-22979; Cytotechno logy, 3, 133 (1990) ], PAS3-3 [JP-A-2-227075], pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [Journal ' Biochemistry 0, Biochemistry), Breath, 1307 (1987)], pAGE210, and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrowinores examples thereof include promoters, metamouthone promoters, heat shock promoters, SRa promoters, and the like.
  • Host cells include human cells such as Namalwa cells, NM-F9 cells, PER.
  • C6 cells COS cells that are monkey cells, Chinese 'cells, CHO cells that are Muster cells, HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299), rat myeloma cells, mouse myeloma cells, Syrian nomster kidney-derived cells, embryos Examples include sex stem cells and fertilized egg cells.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells. For example, the electoral position method [Cytote chnology, 3, 133 (1990)], Calcium phosphate method [JP-A-2-27075], lipofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected into insect cells to express the protein. it can.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVLl393, pBlueBacIII (both manufactured by Invitorogen) and the like.
  • baculoviruses include the ability to use the autographa californica nu clear polyhedrosis virus virus, which is a virus that infects night stealing insects, such as Autographa californica nu clear polyhedrosis virus. .
  • Examples of a method for co-introducing the recombinant gene transfer vector and the baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-227075), the lipofusion method [Proceedings' ⁇ The 'National'Academia's Science ( proc . Natl. Acad. Sci. USA), 84, 7413 (1987)].
  • expression vectors include cocoon plasmids and tobacco mosaic virus vectors. Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and the rice 1 promoter.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • host cells include tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alfalfa, rice, wheat, barley, and other plant cells.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • Agrobacterium JP 59-140 885, JP No. 60-70080, WO94 / 00977
  • an elect mouth position method Japanese Patent Laid-Open No. 60-251887
  • a method using a particle gun (gene gun) Japanese Patent No. 25 17813
  • Japanese Patent No. 25 17813 Japanese Patent No. 25 17813
  • antibody gene expression method in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed according to the methods described in Molecular Cloning 2nd edition.
  • the antibody composition can be produced by culturing the transformant obtained as described above in a medium, allowing antibody molecules to be produced and accumulated in the culture, and collecting the culture from the culture.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing host cells.
  • the medium As a medium for culturing a transformant obtained by using a eukaryote such as yeast as a host, the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the organism, and the culture of the transformant is performed. If it is an efficient medium, use a natural / synthetic medium!
  • carbon source glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolyzate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, etc., as long as the organism can be assimilated, Alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids, and other salts.
  • Nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, strength zein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells and their consumption A compound or the like can be used.
  • inorganic salts monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, mangan sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. are used. be able to.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 15-40 ° C, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH during the culture is maintained at 3-9.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as needed during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl-j8-D-thiogalatatopyranoside or the like was transformed with a recombinant vector using the 1m promoter.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • RPMI 1640 medium commonly used as a medium for culturing transformants obtained using animal cells as a host [The Journal of the American American Medical Association (The Journal of the American Medical Association), Plastic, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biologic al Medicine], 73, 1 (1950)], Whitten medium [Genetic engineering experiment manual -How to make transgenic mice (Kodansha) edited by Motoya Katsuki (1987) Hota can use a medium in which fetal bovine serum is added to these mediums.
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and 5% CO.
  • Cultivation is usually carried out for 1 to 5 days under conditions such as pH 6 to 7, 25 to 30 ° C.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a plant cell or organ.
  • a medium for cultivating the transformant commonly used Murashige 'and' Stag (MS) medium, White medium, or a plant hormone such as auxin or cytokinin is added to these mediums. It is possible to use the prepared medium.
  • the culture is usually carried out under conditions of pH 5-9, 20-40 ° C for 3-60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a yeast, animal cell, or plant cell-derived transformant having a recombinant vector incorporating a DNA encoding an antibody molecule is cultured according to a normal culture method, and an antibody composition is obtained.
  • the antibody composition can be produced by accumulating and collecting the antibody composition from the culture.
  • a method for producing an antibody composition there are a method for producing it in a host cell, a method for producing it outside a host cell, and a method for producing it on the outer membrane of the host cell. This method can be selected by changing the structure of the antibody molecule to be produced.
  • the method of Paulson et al. Journal 'Ob' Biological ' Chemistry 0. Biol. Chem.), 264, 17619 (1989)]
  • Lowe et al. Proceedings ⁇ The ⁇ National ⁇ Academia 1 ⁇ ⁇ ⁇ Science ( proc . Natl. Acad. Sci.
  • the antibody composition can be actively secreted out of the host cell by applying the method described therein.
  • DNA encoding an antibody molecule and DNA encoding a signal peptide appropriate for expression of the antibody molecule are inserted into an expression vector, and the expression vector is inserted into a host cell.
  • the target antibody molecule By expressing the antibody molecule after the introduction, the target antibody molecule can be actively secreted outside the host cell.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • an animal individual transgenic non-human animal
  • plant individual transgenic plant
  • an antibody composition can be produced using these individuals.
  • the transformant When the transformant is an animal individual or plant individual, it is reared or cultivated according to a usual method, the antibody composition is produced and accumulated, and the antibody composition is collected from the animal individual or plant individual. Antibody compositions can be produced.
  • Examples of methods for producing antibody compositions using individual animals include known methods [American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (American Journal of Clinical Nutrition), 63, 639S ( 1996); American 'Journal' of 'Tari-Cal' Nutrition, 63, 627S (1996); Bio / Technology, 9, 830 (1991)] Similarly, there can be mentioned a method for producing a target antibody composition in an animal constructed by introducing a gene.
  • an antibody composition is produced and accumulated in the animal.
  • the antibody composition can be produced by collecting the composition.
  • Examples of the production / accumulation location in the animal include milk of the animal (Japanese Patent Laid-Open No. 63-309192) and eggs.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animals.
  • ⁇ -force which is a mammary cell specific promoter.
  • a zein promoter, j8 casein promoter, j8 lactoglobulin promoter, whey acid protein promoter, and the like are preferably used.
  • a method for producing an antibody composition using an individual plant for example, a known method of a transgenic plant into which DNA encoding an antibody molecule is introduced [tissue culture, 20 (1994); tissue culture, 21 ( 1995); cultivated according to Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], and the antibody composition is produced and accumulated in the plant, and the antibody composition is produced from the plant.
  • a method for producing an antibody composition by collecting is mentioned.
  • An antibody composition produced by a transformant into which a gene encoding an antibody molecule has been introduced for example, when the antibody composition is expressed in a dissolved state in the cell, the cell is centrifuged after culturing. After suspending in an aqueous buffer solution, crush the cells with an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, an ordinary enzyme isolation and purification method, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, and a precipitation method using an organic solvent.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, and a precipitation method using an organic solvent.
  • a purified preparation of the antibody composition can be obtained by using an electrophoresis method such as point electrophoresis alone or in combination.
  • the cell when expressed by forming an insoluble substance in the cell, the cell is similarly collected, disrupted, and centrifuged to obtain a precipitate fraction as an insoluble substance of the antibody composition. Collect.
  • the recovered insoluble body of the antibody composition is solubilized with a protein denaturant.
  • the antibody composition is returned to a normal three-dimensional structure by diluting or dialyzing the solubilized solution, and then a purified preparation of the antibody composition can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the antibody composition When the antibody composition is secreted extracellularly, the antibody composition can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture with a technique such as centrifugation as described above, and the same isolation and purification method as described above is used from the soluble fraction. Thus, a purified preparation of the antibody composition can be obtained.
  • Examples of the antibody composition thus obtained include an antibody, an antibody fragment, and a fusion protein having an antibody Fc region.
  • an antibody composition a method for producing a composition of human rabbit antibody and Fc fusion protein will be described.
  • glycoproteins such as other antibody compositions will be described. Therefore, it can also be obtained according to the above-described method and the method.
  • a humanized antibody expression vector is an expression vector for animal cells in which genes encoding CH and CL of human antibodies are incorporated, and genes encoding CH and CL of human antibodies are respectively added to the expression vectors for animal cells. It can be constructed by crawling.
  • the C region of a human antibody can be CH and CL of any human antibody.
  • the C region of the IgGl subclass of the H chain of a human antibody hereinafter referred to as "hC y 1"
  • the C region of the ⁇ class ⁇ class of human antibodies hereinafter referred to as “hC ⁇ ”.
  • chromosomal DNA having exons and introns can be used, and cDNA can also be used.
  • any expression vector can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • pAGE107 Synchronal 'Ob' Biochemistry, 101, 1307 (1987)
  • pHSG274 Gene
  • pKCR Proc. Natl. Acad. Sci. USA
  • pSGl j8 d2-4 Cytotechnology, 4, 173 (1990)
  • Promoters and enhancers used in animal cell expression vectors include SV40 early promoter and enhancer [Jannal 'Ob' Biochemistry 0.
  • the vector for humanized antibody expression may be used with either the type in which the antibody H chain and L chain are on separate vectors or the type on the same vector (hereinafter referred to as tandem type).
  • tandem-type humans also have the advantages of easy construction of humanized antibody expression vectors, ease of introduction into animal cells, and balanced expression of antibody H and L chain expression in animal cells.
  • An antibody-expressing vector is preferred [Journal 'Ob' Immunological 'Methods (J. Immunol. Methods), 167, 271 (1994)] 0
  • the constructed humanized antibody expression vector can be used for expression of human chimeric antibody and human CDR-grafted antibody in animal cells.
  • Non-human animal antibodies for example, cDNAs encoding mouse antibody VH and VL can be obtained as follows.
  • mRNA is extracted from hybridoma cells producing the desired mouse antibody, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or plasmid to prepare a cDNA library.
  • Each recombinant plasmid is isolated. Determine the VH and VL base sequences of the desired mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid, and estimate the VH and VL amino acid sequences from the base sequence.
  • any mouse, rat, wild mouse, muster, rabbit, etc. can be used as long as it is possible to produce a hyperidoma cell.
  • the method for preparing total RNA is guanidine thiocyanate cesium trifluoroacetate method [Methods in EnzymoL, 154, 3 (1987)], and mRNA from total RNA.
  • the oligo (dT) -fixed cellulose column method [Molecular & Cloning: A Laboratory Manual], old Spring Harbor Lab. Press New York (1989) I can give it.
  • kits for preparing mRNA for hyperpridoma cell force include Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) and Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • the vector into which cDNA synthesized using the mRNA extracted from the Hypridoma cell as a saddle is incorporated can be any vector that can incorporate the cDNA! / it can.
  • ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Rese arch, 17, 9494 (1989)]
  • ⁇ ZAPII (Stratagene )
  • Any Escherichia coli for introducing a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector can be used as long as it can introduce, express and maintain the cDNA library.
  • cDNA library encoding VH and VL of non-human animal antibody from cDNA library Lone selection methods include the “one-hybridization method” or the plaque “hybridization method” using isotopes or fluorescently labeled probes [Molecular “cloning: a laboratory” (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York (1989)].
  • a primer or a cDNA or cDNA library synthesized from mRNA is used as a cage, Polymerase Chain Reaction [hereinafter referred to as PCR method; Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Cloning:, ⁇ Hooftri ⁇ ⁇ 'Ma- / Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1—34]
  • PCR method Polymerase Chain Reaction
  • the cDNA selected by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method such as Sanger. (Sanger) et al. Dideoxy method [Procedinas' Ob The] National 'A Power Demi Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 74, 5463 (19 77)]
  • the base sequence of the cDNA can be determined by performing the above reaction and analyzing it using an automatic base sequence analyzer such as an ALF DNA sequencer (Pharmacia).
  • VH and VL of the antibody including the secretory signal sequence see the full sequence of VH and VL of the known antibody [Sequences of the protein of the protein Proteins oflmmunological Interest), US Dep. Health and Human Services, 1991]. And the N-terminal amino acid sequence can be deduced, and the subgroup to which they belong can be known.
  • VH and VL CDR amino acid sequences of known antibody VH and VL amino acid sequences [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Ub Dept Health and Human Services (1991)].
  • the cDNA encoding the VH and VL of the non-human animal antibody is cloned upstream of the gene encoding the human antibody CH and CL of the vector for expression of the human ⁇ antibody described in (1) of this section 2.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed.
  • the cDNA encoding the VH and VL of a non-human animal antibody is obtained by using the 3 'terminal sequence of the non-human animal antibody VH and VL and the 5' terminal sequence of the human antibody CH and CL.
  • a synthetic DNA having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at both ends, respectively, and linking each of them with the human antibody CH of the human potato antibody expression vector described in (1) of this section 2.
  • a gene encoding CL can be cloned upstream of the gene encoding CL so as to be expressed in an appropriate form to construct a human chimeric antibody expression vector.
  • CDNAs encoding human CDR-grafted antibody VH and VL can be constructed as follows. First, select the amino acid sequence of the VH and VL framework (hereinafter referred to as FR) of the human antibody to which the VH and VL CDRs of the target non-human animal antibody are grafted. Any amino acid sequence derived from a human antibody can be used as the amino acid sequence of human antibody VH and VL FR.
  • FR the amino acid sequence of the VH and VL framework
  • VH and VL FR amino acid sequences of human antibodies registered in databases such as Protein Data Bank, and the common amino acid sequences of the VH and VL FR subgroups of human antibodies [Sequences 'Ob' Indones, Ob, Imunolone Nore 'Interests (Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services (1991)].
  • VH and VL CDR amino acid sequences of the target non-human animal antibody were transplanted into the VH and VL FR amino acid sequences of the selected human antibody, and the VH and VL of the human CDR-grafted antibody were transplanted.
  • Design the amino acid sequence of VL Frequency of codon usage of designed amino acid sequence in antibody gene sequence [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Ub Dept. Health a nd Considering Human Services, 1991], the DNA sequence is converted into a DNA sequence, and a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL of the human CDR-grafted antibody is designed.
  • Human CDR-grafted antibodies can be obtained by transplanting only the VH and VL CDRs of the non-human animal antibody of interest to the VH and VL FRs of the human antibody. [BIO / TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)]. This is because, in the VH and VL of the original non-human animal antibody, several amino acid residues of FR as well as CDR are directly or indirectly involved in antigen-binding activity. It is considered that amino acid residues change to different amino acid residues of FRs of VH and VL of human antibodies with CDR grafting.
  • human CDR-grafted antibodies use amino acid residues that are directly involved in antigen binding or CDR amino acid residues in the VH and VL FR amino acid sequences of human antibodies.
  • Modification of the FR amino acid residue of VL can be achieved by performing the PCR method described in (2) of this section 2 using the synthetic DNA for modification. For amplified products after PCR, determine the nucleotide sequence by the method described in (2) of this section 2 and confirm that the target modification has been made.
  • the human CDR-grafted antibody constructed in (5) and (6) of this section 2 upstream of the gene encoding the CH and CL of the human antibody of the vector for expression of the human rabbit antibody described in (1) of this section 2 CDNA encoding VH and VL of the above can be cloned and a human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed.
  • a human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed among the synthetic DNAs used in constructing VH and VL of human CDR-grafted antibodies in (2) and (6) of this section 2, appropriate restrictions on the 5 'end of the synthetic DNA located at both ends.
  • the humanized antibody expression vector described in (1) of this section 2 is expressed in an appropriate form upstream of the gene encoding the human antibody CH and CL. It is possible to construct a human CDR-grafted antibody expression vector by cloning.
  • humanized antibody expression vector described in (4) and (7) of this section 2 into appropriate animal cells By doing so, it is possible to obtain a transformed strain that stably produces a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody (hereinafter also referred to as a humanized antibody).
  • Examples of a method for introducing a human rabbit antibody expression vector into an animal cell include the electopore position method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891; Cytotechnology, 3, 133 (1990)].
  • the animal cell into which the humanized antibody expression vector is introduced may be any cell as long as it is the cell of the present invention produced in 1. above and capable of producing a human baboon antibody. Can be used.
  • mouse myeloma cells derived from NS0 cells, SP2 / 0 cells, Chinese hamster ovary cells CHO / dhfr- cells, CHO / DG44 cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, IR 983F cells, and Syrian hamster kidneys Ability to increase certain BHK cells, Namalba cells that are human myeloma cells, etc.
  • Preferred examples include CHO / DG44 cells that are Chinese nomster ovary cells and rat myeloma YB2 / 0 cells.
  • G418 sulfate (hereinafter referred to as G418; SIGMA) according to the method disclosed in JP 2-257891A.
  • Animal cell culture media include RPMI1640 medium (Nissui Pharmaceutical), GIT medium (Nihon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (JRH), IMDM medium (GIBCO BRL), Hybridoma-SFM A medium (manufactured by GIBCO BRL) or a medium obtained by adding various additives such as fetal calf serum (hereinafter referred to as FBS) to these mediums can be used.
  • FBS fetal calf serum
  • ELISA method enzyme-linked immunosorbent assay
  • Antibodies A Laboratory Manual
  • Cold Spring Harbor Laboratory Chapter 14
  • Monoclonal Antibodies Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)
  • the transformed strain can increase the amount of humanized antibody produced using a DHFR gene amplification system or the like according to the method disclosed in JP-A-2-257891.
  • Humanized antibodies can be purified from the culture supernatant of transformants using a protein A column [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory.
  • the method can be used. For example, it can be purified by combining gel filtration, ion exchange chromatography and ultrafiltration. The molecular weight of the purified human antibody H chain, L chain or whole antibody molecule is determined by polyacrylamide gel electrophoresis [hereinafter referred to as SDS-PAGE; Nature, 227, 680 (1970)] or Western Blotting method [Antibodies: A Laboratory Manual], Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12 (1988), Monochrome Nanore Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited (1996)].
  • the Fc fusion protein expression vector is an expression vector for animal cells in which a gene encoding a protein to be fused with the Fc region of a human antibody is incorporated, and the Fc region of the human antibody is incorporated into the expression vector for animal cells. Cloning the gene that encodes the protein to be fused makes it possible to construct it.
  • the Fc region of a human antibody includes the force of the region containing the CH2 and CH3 regions, the hinge region, and those containing a part of CH1.
  • any amino acid may be used as long as at least one amino acid of CH2 or CH3 is deleted, substituted, added or inserted and has binding activity to the Fey receptor.
  • chromosomal DNA having exons and introns can be used, and cDNA can also be used.
  • cDNA can also be used.
  • each gene sequence is used as a saddle type, PCR method (Requirula ⁇ Cloning 2nd Edition; Current Protocols' in ⁇ Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biology 1, Supplement 1-34).
  • any expression vector can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • Promoters and enhancers used in animal cell expression vectors include SV40 early promoter and enhancer [Jannal 'Ob' Biochemistry 0.
  • DNA encoding a protein to be fused with the Fc region of a human antibody can be obtained as follows.
  • MRNA is extracted from cells or tissues expressing the protein to be fused with the target Fc, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or recombinant plasmid having cDNA encoding the protein of interest is isolated from the library using the gene sequence portion of the protein of interest as a probe. Determine the entire base sequence of the target protein on the recombinant phage or recombinant plasmid, and estimate the entire amino acid sequence from the base sequence.
  • any animal such as mouse, rat, wild mouse, mustard, and rabbit can be used as long as it can extract cells and tissues.
  • Cellular and tissue powers can be prepared using total guanidine thiocyanate cesium acetate method [Methods in EnzymoL, 154, 3 (1987)], and total RNA strength.
  • methods for preparing mRNA include an oligo (dT) -immobilized cellulose column method (Molecular 'Cloung 2nd Edition).
  • kits for preparing mRNA include Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) and Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • the vector into which the cDNA synthesized from the cell or tissue strength extracted as a cocoon is used as long as the vector can be incorporated into the cDNA! / be able to.
  • ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1 992)]
  • pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)]
  • ⁇ ⁇ (Stratagene )
  • Gtl0 (Stratagene )
  • I gtl l DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)]
  • ⁇ ExCell pT7T3 18U (Pharmacia)
  • pcD2 [Molequila and Cellular Biology (Mol. Cell. Biol), 3, 280 (1983)]
  • pUC18 [Gene, 33, 103 (1985) )] Etc.
  • Any Escherichia coli for introducing a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector can be used as long as it can introduce, express and maintain the cDNA library.
  • a cDNA clone encoding a protein of interest from a cDNA library can be selected by using a colony hybridization method or a plaque hybridization method using a probe labeled with an isotope or fluorescence (molecular method). It can be selected by 'Crowung 2nd edition'.
  • a primer is prepared and cDNA synthesized from mRNA or Using a cDNA library as a saddle, it is possible to prepare cDNA encoding the target protein by PCR.
  • Examples of a method for fusing the target protein with the Fc region of a human antibody include PCR.
  • any synthetic oligo DNA (primer) on the 5 'and 3' sides of the gene sequence of the target protein, and perform PCR to obtain a PCR product.
  • an arbitrary primer is set for the gene sequence in the Fc region of the human antibody to be fused to obtain a PCR product.
  • set primers so that the same restriction enzyme site or the same gene sequence exists on the 3 'side of the PCR product of the protein to be fused and the 5' side of the PCR product of the Fc region.
  • the mutation is introduced by using a primer into which the mutation has been introduced.
  • Two genes are ligated by further PCR using the two types of PCR fragments obtained. Alternatively, ligation can be performed after the same restriction enzyme treatment.
  • the gene sequence linked by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method such as Sanger (Sanger) et al. Dideoxy [Procedinas' Ob The National 'Academy ⁇ ⁇ Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5 463 (1977)] or ABI PRISM
  • the base sequence of the DNA can be determined by analysis using a base sequence analyzer such as 377 DNA Sequencer (manufactured by PE Biosystems).
  • Examples of a method for introducing an Fc fusion protein expression vector into animal cells include the electoporation method [JP-A-2-257891; Cytotechnology, 3, 133 (1990)].
  • the animal cell into which the Fc fusion protein expression vector is introduced is the cell of the present invention prepared in 1. above, and can be used as long as it is an animal cell capable of producing the Fc fusion protein. be able to.
  • BHK cells derived from kidney Namalba cells that are human myeloma cells, etc.
  • Preferred examples include CHO / DG44 cells that are Chinese nomstar ovary cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, and the like.
  • a transformed strain that stably produces the Fc fusion protein is obtained from an animal cell culture medium containing a drug such as G418 according to the method disclosed in JP-A-2-257891. You can choose.
  • Animal cell culture media include RPMI1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (manufactured by JRH), IMDM medium (manufactured by GIBCO BRL), Hybridoma-SFM medium (Manufactured by GIBCO BRL) or a medium obtained by adding various additives such as fetal calf serum to these mediums can be used.
  • RPMI1640 medium manufactured by Nissui Pharmaceutical
  • GIT medium manufactured by Nippon Pharmaceutical
  • EX-CELL302 medium manufactured by JRH
  • IMDM medium manufactured by GIBCO BRL
  • Hybridoma-SFM medium Manufactured by GIBCO BRL
  • a medium obtained by adding various additives such as fetal calf serum
  • GIBCO BRL Hybridoma-SFM medium
  • the transformed strain can increase the production amount of the Fc
  • the Fc fusion protein can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column or protein G column (Antibodies, Chapter 8, Monoclonal 'Antibodies).
  • a protein A column or protein G column Antibodies, Chapter 8, Monoclonal 'Antibodies
  • other purification methods usually used for protein purification can be used.
  • it can be purified by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography and ultrafiltration.
  • the total molecular weight of the purified Fc fusion protein molecule is measured by SDS-PAGE [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting (Antibodies, Chapter 12, Monoclonal Antibodies). It can be done.
  • glycoproteins such as antibody molecules
  • a glycoprotein can be produced by preparing a host cell using the method described in 1. above, culturing the cell, and purifying the desired glycoprotein from the culture.
  • the purified glycoprotein is labeled with a compound such as a radioisotope, and the strength of the binding reaction with the labeled glycoprotein receptor or interacting protein is quantitatively measured. How to do. It is also possible to measure protein-protein interactions using various devices such as Biacore's BIAcore series [J. Immnunol. Methods, 145, 229 (1991), experiment Biomedical Bio-Ual UP Series Protein Intermolecular Interaction Experiment, Yodosha (1996)]
  • the half-life in blood or the distribution to the tissue after blood administration can be known. And a system that combines the antibody-antigen reaction specific to the glycoprotein to be detected That's right.
  • the binding activity to the antigen and the binding activity to the antigen-positive cell line are determined by ELISA and fluorescent antibody methods [Cancer Immunology ⁇ ⁇ Immunotherapy (Cancer Immunol. Immunother.), 36, 373 (1993)]. Cytotoxic activity against antigen-positive cell lines can be evaluated by measuring CDC activity, ADCC activity, etc. [Cancer Immunology. Immunocer., 3D, 373 (1993)].
  • the safety and therapeutic effect of the antibody composition in humans can be evaluated using an appropriate model of animal species that is relatively close to humans such as force-cynomolgus monkeys.
  • the sugar chain structure of a glycoprotein expressed in various cells can be performed in accordance with the conventional glycoprotein structure.
  • a sugar chain bound to an IgG molecule is composed of a neutral sugar such as galactose, mannose, or fucose, an amino sugar such as N-acetylyldarcosamine, or an acidic sugar such as sialic acid. Therefore, it can be carried out using methods such as glycan structure analysis using saccharide composition analysis and two-dimensional glycan map method.
  • the method for analyzing the sugar chain of the antibody composition is specifically shown below, but other glycoproteins can be similarly analyzed.
  • composition analysis of the sugar chain of the antibody molecule neutral sugar or amino sugar is liberated by acid hydrolysis of the sugar chain with trifluoroacetic acid or the like, and the composition ratio can be analyzed.
  • a specific method there is a method using a sugar composition analyzer (BioLC) manufactured by Dionex. BioL and ⁇ ⁇ ⁇ — PAD (high performance anion— exchange chromatography— pulsed amperometric detection) [Jananore • Liquid Chromatography 0. iq. It is a device for analyzing the composition.
  • the composition ratio can also be analyzed by the fluorescent labeling method using 2-aminoviridine. Specifically, a sample hydrolyzed according to a known method [Agruc. Biol. Chem., 55 (1 ⁇ , 283-284 (1991)] Fluorescence labeling can be performed by crystallization, and the composition ratio can be calculated by HPLC analysis.
  • the structure analysis of the glycans of antibody molecules is based on the two-dimensional glycan mapping method [Analytical 'Biochem., 171.73 (1988), Biochemical Experimental Method 23-Glycoprotein Glycan Research Method ( It is possible to do it according to the Academic Publishing Center) Takahashi Eiko (1989)].
  • the 2D glycan mapping method for example, the retention time or elution position of reversed-phase chromatography glycans is plotted on the X axis, and the retention time or elution position of glycans by normal phase chromatography is plotted on the Y axis. It is a method for estimating the sugar chain structure by comparing with the results of known sugar chains.
  • the antibody is hydrolyzed with hydrazine to release the sugar chain from the antibody, and the fluorescent labeling of the sugar chain with 2-aminoviridine (hereinafter abbreviated as PA) [Journal 'Ob' Biochemistry ( J. Biochem.), 95, 197 (1984)], followed by gel filtration to separate the sugar chains from excess PA reagent and perform reverse phase chromatography. Next, normal phase chromatography is performed for each peak of the separated sugar chain. Based on these results, plotting on a two-dimensional sugar chain map, sugar chain standard (TaKaRa), literature [Analytical Biochemistry., M, 73 (1988)] and The sugar chain structure can be estimated from the comparison of spots. Furthermore, mass structures such as MALDI-TOF-MS of each sugar chain can be performed to confirm the structure estimated by the two-dimensional sugar chain map method.
  • PA 2-aminoviridine
  • RNA affects the expression level and translation of genes with highly homologous sequences in addition to suppressing the function of the target enzyme [Nature Biot echnol], 21, 635 (2003 ), Proceedings 'Ob The' National 'A Power Demi'Ob' Science! ⁇ . Natl. Acad. Sci. USA), 101, 1892 (2004)]
  • RNA introduction do not affect the growth of the transformed strain or the expression of the glycoprotein produced.
  • cells expressing glycoproteins such as antibody compositions are introduced into the cells of the present invention, and the parent cell and the introduced cells are cultured simultaneously to proliferate the cells. Analysis of various properties of glycoproteins produced with no change in the expression level of curves and glycoproteins reveals the biological activity resulting from the differences in the sugar chain structure and sugar chain structure of the produced glycoproteins. Confirm that there are no other errors.
  • the sugar chain structure of the produced glycoprotein can be analyzed by the method described in 5. above.
  • Various properties of glycoproteins can be analyzed by any known protein analysis method. Protein analysis methods include physicochemical analysis such as electrophoresis, gel filtration, isoelectric point or amino acid sequence analysis, and when the produced glycoprotein is an antibody, binding to the antigen, and the produced glycoprotein.
  • the enzyme is an enzyme
  • the activity of the enzyme and in the case where the glycoprotein is a ligand or a receptor, binding to each ligand or receptor can be mentioned.
  • Glycoproteins such as antibody compositions have a sugar chain structure without fucose modification, for example, improved affinity with receptors, improved blood half-life, and improved tissue distribution after administration in blood. Or, an effect such as improvement of interaction with a protein necessary for expression of pharmacological activity can be expected, and high physiological activity is exhibited.
  • the antibody composition has high effector function, ie, antibody-dependent cytotoxic activity.
  • These highly bioactive glycoproteins or antibody compositions with high ADCC activity are used in various diseases including cancer, inflammatory diseases, autoimmune diseases, immune diseases such as allergies, cardiovascular diseases, or viral or bacterial infections. It is useful for prevention and treatment.
  • an in vivo reaction in the disease is induced by the release of mediator molecules by immune cells, and thus an antibody having high ADCC activity. Allergic reactions can be suppressed by removing immune cells using
  • cardiovascular diseases examples include arteriosclerosis.
  • Atherosclerosis is currently treated with balloon catheter, but it is possible to prevent and treat cardiovascular disease by suppressing the proliferation of arterial cells in restenosis after treatment with an antibody with high ADCC activity. it can
  • Antibodies that recognize tumor-related antigens antibodies that recognize antigens related to allergy or inflammation, antibodies that recognize antigens related to cardiovascular diseases, antibodies that recognize antigens related to autoimmune diseases, or viruses
  • Specific examples of antibodies that recognize antigens associated with bacterial infection are described below.
  • Antibodies that recognize tumor-associated antigens include anti-CA125 antibody, anti-17-1A antibody, anti-integrin ⁇ 3 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD22 antibody, anti-HLA antibody, anti-HLA-DR antibody, anti-antibody CD 20 antibody, anti-CD19 antibody, anti-EGF receptor antibody [Immunology Today, 21, 403 (2000)], anti-CD10 antibody [American 'Journal' of 'Tari-Cal' Pathology (American Journal of Clinical Pathology), 113, 374 (2000); Proceedings' Ob The National Sciences ( proc . Natl. Acad. Sci. USA), 79, 438 6 ( 1982)], anti-GD antibody [anti-cancer
  • anti-HER2 antibody [Procedures of the National Academy of Sciences, Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285 (1992)], anti-CD52 antibodies [ Nature, 332, 323 (1988)], anti-MAGE antibody [British 'Journal' of Cancer], 83, 493 (2000)], anti-HM1.24 antibody [Morkyura ⁇ ⁇ Immunology (Mol ecular Immunol.), 36, 387 (1999)], anti-parathyroid hormone related protein (PTHrP) antibody [Cancer, 88, 2909 (2000)], anti-FGF8 antibody [Proceedings of the National Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Anti-IgE antibodies anti-CD23 antibodies, anti-CDlla antibodies [Immunology Today, 21, 403 (2000)] , Anti-CRTH2 antibody [J. Immunol, 162, 1278 (1999)], anti-CCR8 antibody (W099 / 25734), anti-CCR3 antibody (US6207155), anti-interleukin 6 antibody [Immunological. (Immunol. Rev.), 127, 5 (1992)], anti-interleukin 6 receptor antibody [Molecular Immunol, 31, 371 (1994)], anti-interleukin 5 antibody [immunological 'review ( Immunol.
  • Antibodies that recognize antigens related to cardiovascular diseases include anti-GpIIb / IIIa antibodies [Journal's Immunology 0. Immunol), 152, 2968 (1994)], antiplatelet-derived growth factor anti-antibody [Science, 253, 1129 (1991)], anti-platelet-derived growth factor receptor antibody [J. Biol. Chem., 272, 17400 (1997)] Another example is an anticoagulant factor antibody [Circulation, 101, 1158 (2000)].
  • Anti-self DNA antibodies [immunology ⁇ ⁇ ] are recognized as antigens associated with autoimmune diseases such as psoriasis, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, ulcerative colitis, systemic lupus erythematosus, and multiple sclerosis. Letters (Immunol. Letters), 72, 61 (2000)], anti-CD 1 la antibody, anti-ICAM3 antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD2 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-integrin ⁇ 4 j8 7 antibody Anti-CD40L antibody, anti-IL-2 receptor antibody [Immunology Today, 21, 403 (2000)] and the like.
  • an anti-gpl20 antibody As an antibody that recognizes an antigen associated with a virus or bacterial infection, an anti-gpl20 antibody
  • the above antibodies may be obtained from public institutions such as ATCC (The American Type Culture Collection), RIKEN Cell Development Bank, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biotechnology Institute, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., R & D SYSTEMS, It can be obtained from private reagent sales companies such as PharMingen, Cosmo Bio, and Funakoshi.
  • fusion protein of the binding protein and antibody Fc region related to immune diseases such as inflammatory diseases, autoimmune diseases and allergies
  • etanercept USP5605690
  • a fusion protein of sTNFRII and Fc region antigen-presenting cells Fusion protein of alefacept
  • CTLA-4 cytotoxic T Lymphocyte-associated antigen 4
  • Fc region which is a poor fusion protein between LFA-3 and Fc region expressed above [Journal B'Experimental Med. 0. Exp. Med.), 181, 1869 (1995)], fusion protein of interleukin-15 and Fc region [Journal 'Ob' Immunology 0.
  • a drug containing a glycoprotein such as an antibody composition can be administered alone as a therapeutic agent. Usually mixed together with one or more pharmacologically acceptable carriers. However, it is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the technical field of pharmaceutical science.
  • the route of administration may be oral administration, where it is desirable to use the most effective treatment, or parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • parenteral administration such as buccal, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • intravenous administration is desirable.
  • Examples of administration forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules Agents and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, P-hydroxybenzoate Preservatives such as acid esters, flavors such as strobe leaf flavors and peppermint can be used as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc
  • a binder such as polybulal alcohol, hydroxypropyl cellulose, gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, a plasticizer such as glycerin, and the like can be used as additives.
  • Suitable formulations for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • An injection is prepared using a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • a powder injection can be prepared by freeze-drying glycoprotein according to a conventional method and adding sodium chloride to this.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cocoa butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the spray is prepared using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, and that facilitates absorption by dispersing the glycoprotein as fine particles.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can be added to these parenteral preparations.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc.
  • the usual adult dose is 10 g / kg to 20 mg / kg per day.
  • CDC activity assay and ADCC activity assay
  • mice in vivo experiments
  • antitumor experiments using animal tumor systems examples include antitumor experiments using animal tumor systems.
  • a human U6 promoter-cloning site-terminator sequence expression set was obtained by the following procedure (Fig. 1).
  • a forward primer (hereinafter referred to as WJ6p-F-Hind3) with a recognition sequence for restriction enzymes Hindm and E RV attached to the 5 'end of the base sequence that binds to the human U6 promoter sequence [GenBank Acc. No. M14486].
  • PCR polymerase chain reaction
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and RECOCHIP (Takara Bio Inc.) A specific amplified fragment of about 300 bp was recovered.
  • the DNA fragment was dissolved in 30 L of NEBuffer 2 (New England Biolabs), and 10 units of restriction enzyme I (New England Biolabs) and 10 units of restriction enzyme Hindlll (New England Biolabs) were collected.
  • the digestion reaction was performed at 37 ° C for 2 hours.
  • a DNA fragment digested with restriction enzymes by phenol / chloroform extraction treatment and ethanol precipitation was recovered from the reaction solution and dissolved in 20 L of sterilized water.
  • plasmid pBluescriptll KS (+) (STRATAGENE) was dissolved in 30 ⁇ L of NEBuffer2 (New England Biolabs) containing 100 ⁇ g / ml BSA (New England Biolabs). 10 units of restriction enzyme ilindm and KNew England Biolabs) were added and digestion reaction was carried out at 37 ° C for 8 hours. After digestion reaction, add 22 L of sterilized water, 6 ⁇ L of 10 X Alkaline Phosphatase Buffer and 1 unit of Alkaline Phosphatase E.coli C75 (manufactured by Takara Bio) to the reaction mixture, and dephosphorylation at 37 ° C for 1 hour Went.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a Hindm-ai fragment derived from about 2.9 Kb of plasmid pBluescriptn KS (+) was recovered using RECOCHIP (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • DNA fragment obtained above (about 300 bp) 8 ⁇ plasmid Hindlll-al fragment derived from pBluescriptll KS (+) (about 2.9 Kb) 2 ⁇ Ligation High (Toyobo Co., Ltd.) 10 ⁇ L was mixed, and 16 ° The mixture was reacted at C for 2 hours.
  • Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using the reaction solution, and a plasmid was isolated from the resulting ampicillin resistant clone using a QIAprep spin Mini prep Kit (manufactured by Qiagen). This plasmid is hereinafter referred to as pBS-U6term.
  • plasmid pPUR (Clontech) was dissolved in 20 L of NEBuffer 2 (New England Biolabs) and 10 units of restriction enzyme oilKNew England Biolabs) was added at 37 ° C for 2 A time digestion reaction was performed. After the reaction, add 5 L of sterilized water, 3 ⁇ L of 10 X Alkaline Phosph atase Buffer and 1 unit of Alkaline Phosphatase E.coli C75 (manufactured by Takara Bio Inc.) to the reaction solution, and dephosphorylate at 37 ° C for 1 hour Went. The reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and an approximately 4.3 Kb cocoon fragment derived from plasmid pPUR was collected using RECOCHIP (Takara Bio Inc.).
  • PPUR PvuII-seq-F shown in SEQ ID NO: 61
  • pPUR? ⁇ 11-369-1? Shown in SEQ ID NO: 62
  • the sequence of the human U6 promoter region of the inserted DNA was used. Matches the sequence of GenBank Acc. No. M14486, and the sequence of the primer region used to amplify the human U6 promoter-cloning site-terminator sequence expression cassette and the sequence of each junction are incorrect.
  • a plasmid having the directional force of the inserted WJ6 promoter and the same direction as the puromycin resistance gene expression unit was selected.
  • this plasmid is referred to as P PUR-U6term.
  • the following synthetic oligo DNA was prepared to form a double-stranded DNA cassette containing the siRNA target sequence for the GMD gene of CHO / DG44 cells derived from Chinese nomstar ovary.
  • GMD cDNA sequence derived from Chinese nomstar (GenBank Acc. No. AF525364
  • SEQ ID NO: 8 Shown in SEQ ID NO: 8), seven target sequences satisfying the following conditions were selected. The selected target sequences are shown in SEQ ID NOs: 36-42.
  • Condition 1 Includes a consensus sequence that also has the “NAR (N17) YNN” force.
  • N is A, G, U or C
  • R represents A or G
  • Y represents U or C, respectively.
  • Condition 2 Condition 1 is satisfied, and the same sequence of 3 or more bases is not included.
  • Condition 3 Condition 1-2 is satisfied, GC content is more preferably 35-45%, preferably 45-55
  • Condition 4 A 29-base sequence with 6 bases added before and after a 23-base sequence that satisfies conditions 1 to 3 satisfies condition 2.
  • Condition 5 Condition 4 is satisfied, and the GC content is more preferably 35 to 45%, preferably 45 to 55%.
  • the double-stranded DNA cassette has 5 ′ end force in order, 3 ′ protruding end generated by cleavage of restriction enzyme 2 ⁇ 1, sense code DNA corresponding to SEQ ID NOs: 36 to 42, human miR-23-precursor-19 micro RN A (GenBank Acc. No. AF480558), a 10-base loop sequence, an antisense-encoding DNA complementary to the DNA sequence corresponding to SEQ ID NOs: 36 to 42, and a 3 ′ protruding end generated by cleavage with the restriction enzyme Kmil.
  • the 5 ′ end of the double-stranded DNA was phosphated.
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-AF) of the synthetic oligo DNA designed in accordance with the target sequence shown in SEQ ID NO: 36 is represented by SEQ ID NO: 43, and the antisense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA).
  • the nucleotide sequence of the synthetic oligo DNA sense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-BF) designed by the target sequence shown in SEQ ID NO: 37 is referred to as SEQ ID NO: 44.
  • the base strand of the antisense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-BR) is shown in SEQ ID NO: 46, and the sense strand of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 38 (
  • the base sequence of GMD-dsRNA-CF (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-CF) was designed as SEQ ID NO: 47
  • the base sequence of the antisense strand hereinafter referred to as GM D-dsRNA-CR
  • the target sequence shown in SEQ ID NO: 39 was designed.
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-DF) of the synthetic oligo DNA is represented by SEQ ID NO: 49
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-DR) is represented by SEQ ID NO: 50
  • SEQ ID NO: 40 The base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-DR) of the synthetic oligo DNA is represented by SEQ ID NO: 49
  • the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-DR) is represented by SEQ ID NO: 50
  • SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO:
  • the base sequence of the sense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-EF) of the synthetic oligo DNA designed according to the target sequence shown in SEQ ID NO: 51 and the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-ER) Is the nucleotide sequence of the sense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-FF) of the synthetic oligo DNA designed for the target sequence shown in SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 53, and the antisense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-). (Designated FR) and the target sequence shown in SEQ ID NO: 42 and the target sequence shown in SEQ ID NO: 42.
  • the base sequence of the sense strand of oligo DNA (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-FF) is shown in SEQ ID NO: 55, and the base sequence of the antisense strand (hereinafter referred to as GMD-dsRNA-FR) is shown in SEQ ID NO: 56, respectively.
  • the designed synthetic oligo DNA was synthesized according to a standard method (Molecular Cloning 2nd edition).
  • annealing of synthetic oligo DNA was performed according to the following procedure. 200 pmol each of the synthetic oligo DNA sense strand and antisense strand was dissolved in annealing buffer [10 mmol / L Tris (pH 7.5) -50 mmol / L NaC Nalmmol / L EDTA] 10 / z L and boiled for 2 minutes. Thereafter, it was gradually cooled and cooled to room temperature over about 3 hours. Thereafter, the annealed synthetic oligo DNA was diluted 15-fold with sterile water.
  • primers include pPUR PvuII-seq-F (SEQ ID NO: 61), hU6p Tsp45I / seq-F (SEQ ID NO: 63) and Using pPUR 1 ⁇ 11-369-1? (SEQ ID NO: 62), it was confirmed that there were no mistakes in the sequence of the inserted synthetic oligo DNA and the junction.
  • plasmids in which double-stranded DNA composed of synthetic oligo DNA GMD-dsRNA-A-F and GMD-dsRNA-A-R are inserted are pPUR / GMDshA, synthetic oligo DNA GMD-dsRNA-B-F and GMD-dsRNA.
  • -P-UR / GMD shB a plasmid in which double-stranded DNA consisting of -B-R was inserted, double-stranded DNA consisting of synthetic oligo DNA GMD-dsRNA-C-F and GMD-dsRNA-CR-R was inserted Plasmid with pPUR / GMDshC, double-stranded DNA consisting of synthetic oligo DNA GMD-dsRNA-D-F and GMD-dsRNA-D-R, pPUR / GMDsh D, synthetic oligo DNA GMD-dsRNA-E -PPUR / GMDshE, a plasmid in which double-stranded DNA consisting of F and GMD-dsRNA-E-R is inserted, double-stranded DNA consisting of synthetic oligo DNA GMD-dsRNA-FF and GMD-dsRNA-F-R
  • the plasmid into which is inserted is called pPUR / GMDsh
  • LCA lentil lectin
  • cell suspension contains basic medium [10% urine fetal dialyzed serum (Invitrogen), g / mL gentamicin (Nacala Tester), and 500 nmol / L MTX (SIGMA) It was suspended in Iscove's Modified Dulbecco's Medium (hereinafter referred to as IMDM; manufactured by Invitrogen)] and seeded on four 10 cm dishes (manufactured by Falcon) for culture of adherent cells. Incubate for 24 hours under conditions of 5% CO and 37 ° C
  • the culture supernatant was removed, and a basic medium supplemented with 12 g / mL puromycin (manufactured by SIGMA) was injected, followed by further culturing for 7 days. After that, remove the culture supernatant from one dish, inject a basic medium containing puromycin (manufactured by SIGMA) at a concentration of 12 ⁇ g / mL, and further incubate for 6-8 days. Count the number of mycin resistant colonies It was.
  • the culture supernatant is removed and supplemented with a basic medium containing puromycin (SIGMA) at a concentration of 12 g / mL and LCA (VECTOR) at a concentration of 0.5 mg / mL. And further cultured for 7 days.
  • SIGMA puromycin
  • LCA LCA
  • lectin-resistant strains were obtained even when pPUR / GMDshB was introduced.
  • the lectin resistant strain obtained by introducing pPUR / GMDshB in this section (1) was expanded and cultured according to the following procedure.
  • the cells were cultured at 37 ° C for one week. After the culture, the 10 clones were expanded using a basic medium containing puromycin (manufactured by SIGMA) at a concentration of 12 / z g / mL.
  • the cell lines used for expansion culture were respectively 12-GMDB-1, 12-GMDB-2, 12-GMDB-3, 12-G MDB-4, 12-GMDB-5, 12-GMDB-6, 12-GMDB. -7, 12- GMDB-8, 12- GMDB-9, 12-Named GMDB-10 and subjected to the analysis described in 3. below.
  • 12-GMDB-5 shares were incorporated into the Patent Organism Depository Center (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (1st, Tsukuba 1-chome, 1-chome, 1-Chuo 6th, Ibaraki, Japan) on July 1, 2004. Deposited as FERM BP-10051.
  • Total RNA was prepared from the 32-05-12 strain and the lectin resistant strain obtained in 2. of this Example by the following procedure.
  • the 32-05-12 strain was basal medium, and the lectin-resistant strain was basal medium supplemented with 12 g / mL pure-mouth mycin (manufactured by SIGMA) at a cell density of 3 X 10 5 cells / mL. It became turbid and 4 mL each was seeded on a 6 cm dish (manufactured by Falcon) for adherent cells. Incubate for 3 days at 5% C0, 37 ° C, then trypsinize each cell suspension. The supernatant was removed by centrifuging the suspension at 1000 rpm and 4 ° C for 5 minutes.
  • RNA preparation was extracted. The method was according to the attached instruction, and the total RNA preparation was dissolved in 40 L of sterilized water.
  • RNA obtained in (1) in this section use SUPERSCRIPT TM Pream Plincation System for First Strand cDNA Syntnesis (Invitrogen) according to the attached instructions.
  • Single-stranded cDNA was synthesized by performing a reverse transcription reaction in a 20 L system using (dT) as a primer. After that, RNase treatment was performed to make the final reaction volume 40. Further, each of the reaction solutions was diluted 50-fold with sterilized water, and subjected to the gene transcription amount analysis described below.
  • GMD gene-derived mRNA transcription and ⁇ -actin gene-derived mRNA transcription were quantified using For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version (Takara Bio Inc.) according to the following procedure. .
  • the plasmid pAGE249GMD containing the CHO cell-derived GMD cDNA described in Example 15 of WO02 / 31140 was treated with 0.0512 fg / ⁇ L, 0.256 fg / ⁇ L, 1.28 ⁇ 3 ⁇ 4 // ⁇ L, 6.4 ⁇ 3 ⁇ 4 /
  • those diluted to concentrations of / ⁇ L, 32 ⁇ 3 ⁇ 4 / / ⁇ L, and 160 fg / L were used as the internal control for ⁇ -actin quantification.
  • the forward primer shown in SEQ ID NO: 64 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 65 are used for GMD amplification, and the forward primer shown in SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 67 are used for ⁇ -actin amplification. Each reverse primer was used.
  • the prepared reaction solution was dispensed into each well of a 96-well Polypropylene PCR reaction plate (manufactured by Falcon), and the plate was sealed using Plate Sealer (Edge Biosystems).
  • the ABI PRISM 7700 Sequence Detection System was used to measure the amount of GMD mRNA and 13-actin mRNA according to the attached manual.
  • Example 1 the anti-CCR4 chimeric antibody produced by the lectin-resistant 12-GMDB-2 and 12-GMDB-5 strains into which the siRNA expression plasmid targeting the GMD obtained in the above was introduced was obtained by the following procedure. did.
  • 32-05-12 strains were basal medium, 12-GMDB-2 strains, and 12-GMDB-5 strains were basal medium supplemented with 12 ⁇ g / mL pure mouthmycin (manufactured by SIGMA). Then, each was suspended at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / mL, and seeded at 15 mL each in a T75 flask for adherent cells (manufactured by Grainer). After culturing for 6 days at 5% CO and 37 ° C, remove the culture supernatant and add 10 mL Dulbecco.
  • the anti-CCR4 chimeric antibody was purified.
  • the anti-CCR4 chimeric antibody which has also purified the culture supernatant of various cell lines, is 10 mmol / L KH PO buffer using Econo-Pac 10DG (Bio-Rad).
  • the monosaccharide composition analysis was performed according to the following.
  • Table 1 shows the ratio of complex-type sugar chains without fucose in all complex-type sugar chains calculated from the monosaccharide composition ratio of each antibody.
  • the antibody composition produced by the introduction of the siRNA expression vector for GMD produced 3-20% of the non-fucose sugar chain in the antibody composition produced by the parent strain 32-05-12, whereas the siRNA-introduced lectin metabolite 12-
  • the percentages of sugar chains without fucose in the antibody compositions produced by GMDB-2 and 12-GMDB-5 are 78% and 79%, respectively. It has been shown that the rate has increased significantly. From the above results, it was shown that introduction of siRNA targeting GMD can control the a 1, 6-fucose content of the antibody produced by the host cell.
  • the parent strain 32-05-12 which was the parent strain before vector introduction
  • the lectin meta strains 12-GMDB-2 and 12-GMDB-5 strains into which the siRNA expression plasmid was introduced were acclimated to a serum-free medium according to the following procedure.
  • 32-05-12 strains were supplemented with basic medium, 12-GMDB-2 strains and 12-GMDB-5 strains were supplemented with puromycin (SIGMA) at a concentration of 12 ⁇ g / mL.
  • SIGMA puromycin
  • each cell suspension was suspended at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / mL, and seeded at 15 mL each in a T75 flask for adherent cells (manufactured by Grainer). Incubate for 3 days under conditions of 5% CO and 37 ° C.
  • the cell suspension was suspended at a density of cells / mL, and 15 mL of the cell suspension was seeded in a 125 mL Erlenmeyer flask (manufactured by Corning). Ventilate 5% CO, more than 4 times the volume of the culture vessel
  • Fig. 5 shows the results of viable cell density at each time point after the start of cultivation of the 32 -05-12AF strain, the 12-GMDB-2AF strain, and the 12-GMDB-5AF strain. 12-GMDB-2 stock compared to 32-05-12AF stock As a result, the cell viability remained high even on the 14th day of the culture where the growth rate was slow. On the other hand, the 12-GMDB-5AF strain had the same viable cell density as the 32-05-12 strain at each time point after the start of culture. Therefore, the target sequence of siRNA targeting GMD was shown to be a sequence that does not significantly affect cell proliferation.
  • the plate When measuring the amount of antibody, the plate was dissolved at room temperature to remove BSA-PBS in the well, and then 50 L of the culture supernatant solution diluted with BSA-PBS was added to each well. The plate was allowed to stand at room temperature for 1 to 2 hours and washed with PBS containing Tween20 TM at a concentration of 0.05% (hereinafter referred to as Tween-PBS). After removing water from the washing solution, 50 L each of Goat anti-human IgG (H & L) -HRP (American Qualex) diluted 2000 times with BSA-PBS was added as a secondary antibody. The plate was allowed to stand at room temperature for 1-2 hours, washed with Tween-PBS, and further washed with resin water.
  • ABTS substrate solution [2, 2'-Azide with 0.1% H 0 after washing]
  • the antibody concentration of each diluted sample was calculated using a linear region of a calibration curve sigmoid curve prepared using a standard antibody purified sample.
  • the antibody concentration of the culture supernatant was calculated by multiplying the antibody concentration of the obtained diluted sample by the dilution rate.
  • Fig. 6 shows the quantification results of the antibody concentration in the culture supernatant at each time point after the start of cultivation of the 32-05-12AF strain, 12-GMDB-2AF strain, and 12-GMDB-5AF strain. 32-05-12AF shares The 12-GMDB-2AF and 12-GMDB-5AF strains had similar antibody composition concentrations in the culture supernatant at each time point after the start of culture. Therefore, it was shown that the target sequence of siRNA targeting GMD is a sequence that does not affect the antibody productivity of cells.
  • the anti-CCR4 chimeric antibody composition was purified from the culture supernatants on the 12th and 14th days using MabSelect (Amersham Biosciences) force ram according to the attached instructions. Each purified anti-CCR4 chimeric antibody composition was replaced with 10 mmol / L KH PO buffer using Econo-Pac 10DG (manufactured by Biorad), and 0.22 ⁇ m pore size Millex GV (MIL
  • the fucose (-)% of the antibody composition produced by the 32-05-12AF strain was 7%, whereas the siRNA expression plasmid targeting GMD
  • the fucose (-)% of the antibody composition produced by the 12-GMDB-2AF and 12-GMDB-5AF strains on the 6th, 12th, and 14th days of culture showed almost constant values. . Therefore, the effect of suppressing a 1,6-fucose-containing calo to the complex sugar chain of the antibody composition by introducing the siRNA expression plasmid targeting GMD is stable in the course of serum-free fed-batch culture. It was shown that there is.
  • siRNA expression vector libraries targeting 1,6-fucosyltransferase (FUT8) and construction of effective siRNA expression vectors targeting FUT8 1.
  • the reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to recover about 2 Kb of a specific amplified fragment.
  • the DNA fragment was subjected to ligation reaction with plasmid PCR2.1 using TOPO TA cloning Kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached instructions, and Escherichia coli DH5a strain was transformed using the reaction solution. Plasmid DNA was isolated from each of the obtained kanamycin-resistant colonies from 8 clones into which cDNA was incorporated according to a known method.
  • a human tRNA-val promoter siRNA expression vector library targeting FUT8 was prepared based on the method described in Example 13 of WO03 / 46186. .
  • a recognition sequence of restriction enzyme SiHI was used, and pPUR (manufactured by CLONTECH) was used as the vector.
  • the prepared library is referred to as FUT8shRNAl3 ⁇ 4 / pPUR / DH10B.
  • siRNA expression vector library FUT8shRNAlib / pPUR / DH10B was amplified to prepare a plasmid vector.
  • the recovered plasmid is referred to as FUT8shRNAlib / pPUR.
  • the plasmid FUT8shRNAlib / pPUR obtained in 1. of this Example was linearized by digestion with the restriction enzyme E ⁇ I (manufactured by New England Biolabs) and linearized 10 g of the plasmid FUT8shRNAlib / pPUR Was introduced into 1.6 x 10 6 32- 05-12 strains using the elect mouth poration method [Cytot echnology, 3, 133 (1990)], and then the basic medium [10% Uvi fetal dialysis serum (Invitrog en), 50 ⁇ g / mL gentamicin (Nacalai Testa) and 500 nmol / L MTX (SIGMA) IMDM (Invitrogen)] 8 mL each was seeded on 3 sheets. At this time, gene transfer was performed 10 times under the same conditions, and the culture was performed in a total of 30 10 cm dishes for culture. 5% CO ink
  • siRNA expression cassettes were isolated from genomic DNA as follows (FIG. 7).
  • the lectin metaclone was collected into a flat bottom plate for adherent cells (Greiner) according to a known method [Gene Targeting, Oxford University Press, (1 993)], and puromycin (SIGMA) was collected at 12 ⁇ g / 5% CO incubator using basal medium containing at a concentration of mL
  • each clone on the plate was treated with trypsin and seeded in two flat-bottom 96-well plates (Greiner) for adherent cells.
  • One of these plates was used as a replica plate, while the remaining one plate was subjected to cryopreservation as a master plate.
  • the replica plate is 37 ° C in a 5% CO incubator using basal medium containing puromycin (SIGMA) at a concentration of 12 ⁇ g / mL.
  • SIGMA puromycin
  • the forward primer (SEQ ID NO: 70) that binds upstream of the tRNA-val promoter region of the siRNA expression cassette of the siRNA expression plasmid FUT8shRNAlib / pPUR targeting FUT8 and the terminator sequence of the siRNA expression cassette
  • Each binding reverse primer (SEQ ID NO: 71) was designed.
  • DNA polymerase KOD polymerase (Toyobo Co., Ltd.) was used to perform polymerase chain reaction (PCR) using the genomic DNA of each clone prepared above as a cage.
  • PCR is For the loan, 50 ⁇ L of the reaction solution containing 5 ⁇ L of the above genomic DNA solution [KOD Bufferl (Toyobo Co., Ltd.), 0.2 mmol / L dNTPs, lmmol / L MgCl, 0.4 ⁇ mol / L
  • SEQ ID NO: 70 and SEQ ID NO: 71)] were prepared, heated at 94 ° C for 1 minute, and then subjected to 25 cycles under the condition of a reaction of 97 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 30 seconds. I went there. After PCR, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and an amplified fragment of about 300 bp in the region containing the siRNA expression cassette was recovered.
  • the PCR-amplified fragment (about 300 bp) obtained above was ligated to the plasmid pPUR-derived cocoon fragment using Ligation High (Toyobo Co., Ltd.). Escherichia coli D ⁇ ⁇ 5 ⁇ strain was transformed with the reaction solution. Plasmid DNA was isolated from each of the obtained ampicillin resistant colonies according to a known method.
  • the target sequence for FUT8 contained in the siRNA expression cassette in the plasmid obtained in this section (1) was analyzed.

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Abstract

　本発明は、GDP-マンノースをGDP-4-ケト,6-デオキシ-GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制するRNAを導入した細胞および該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するRNA、および細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制するRNAまたは細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制するRNAを導入した細胞および該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法などを提供する。

Description

明 細 書
糖蛋白質組成物の製造法
技術分野
[0001] 本発明は、 GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する 反応を触媒する酵素の機能を抑制する RNAを導入した細胞および該細胞を用いる 糖蛋白質組成物の製造方法、該細胞の製造に用いる RNA、該 RNAに対応する DNA 、並びに該 DNAとその相補 DNAとを含有するベクターに関する。また、本発明は、 N- グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1 位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNA、および細胞内糖 ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制する RNAまた は細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機 能を抑制する RNAを導入した細胞、並びに該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造 方法に関する。更に、本発明は N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチル ダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を 抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フ コースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオ チド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAに 対応する DNAとその相補 DNAを含む DNA、並びに該 DNAを含有するベクターおよび 該ベクターが導入された細胞、並びに N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァ セチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素の 機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含有するベクター、および細 胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制する R NAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含有するベクターが導 入された細胞、該細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 遺伝子工学あるいは細胞工学的な技術の急速な進歩の結果、生体内に微量にし か存在しない生理活性蛋白質を安定、かつ多量に医療の現場に供給できるようにな り、多くの患者の治療が可能となった。これら蛋白質医薬品は遺伝子組換え医薬品 あるいは細胞培養医薬品として製造、販売されている。これら蛋白質医薬品は、その 薬理活性に糖鎖が関与しない単純蛋白質医薬品と、その薬理活性に糖鎖が重要な 役割を担う糖蛋白質医薬品とに分類される。
[0003] 薬理活性に、糖鎖が重要な役割を担う糖蛋白質医薬品の代表的な例としてエリス ロボイエチンがあげられる。エリスロポイエチンの糖鎖構造は実に多様である力 3本 のコア構造部分にフコースが結合した N-グリコシド結合複合型 4本鎖糖鎖および 1本 の 0-グリコシド結合糖鎖を有することが知られて 、る。エリスロポイエチンの生体内で の生理活性に糖鎖構造は深く関与しており、 0-グリコシド結合糖鎖を除いてもその 生理活性に影響を与えないが (非特許文献 1、 2)、 N-グリコシド結合糖鎖を除去する と薬理活性が消失する (非特許文献 3)。また、 N-グリコシド結合糖鎖へのシアル酸付 加や分岐構造などの糖鎖構造の違いが薬理活性に影響を与える (非特許文献 4、 5 、 6)。さらに、フコース修飾された糖鎖構造を有する蛋白質は、一般に、血中半減期 が短くなることが示されて 、る (非特許文献 7)。
[0004] 抗体に関しても、その糖鎖構造が薬理活性に大きな影響を与えることが知られてい る。
抗体 IgG分子の Fc領域には、 2個所の N-グリコシド型の糖鎖結合部位が存在してお り、血清中の IgGでは、該部位にシアル酸やバイセクティングの N-ァセチルダルコサミ ンが付加される割合が少な 、、複数の分岐鎖を持つコンプレックス型糖鎖が結合し て 、る。このコンプレックス型糖鎖の非還元末端へのガラクトースの付カ卩および還元 末端の N-ァセチルダルコサミンへのフコースの付加に関しては多様性がある（非特 許文献 8)。抗体依存性細胞傷害活性 (以下、 ADCC活性と表記する)や補体依存性 細胞傷害活性 (以下、 CDC活性と表記する）などの抗体のエフェクター機能には、こ の糖鎖構造、すなわち、抗体 Fc領域に結合している N-グリコシド結合糖鎖還元末端 の N-ァセチルダルコサミンへ付加されたフコースが重要な役割を担って 、る（特許文 献 1、 2、非特許文献 9、 10)。
[0005] 医薬への応用が考えられている糖蛋白質の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作 製され、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来 CHO細胞などを宿 主細胞として用い製造されている。し力しながら、遺伝子組換え技術を用いて作製さ れた糖蛋白質の糖鎖構造は宿主細胞によって異なるため（非特許文献 10、 11)、遺 伝子組換え技術を用いて作製された糖蛋白質には、必ずしも最適な薬理活性が発 揮できるような糖鎖が付加されて 、な 、。
[0006] 細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節し、生産される糖蛋白質の糖鎖構 造を改変する一つの方法として、糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤を応用すること が試みられている。し力しながら、これら阻害剤の特異性は低ぐまた標的とする酵素 を十分に阻害することも難しいため、生産抗体の糖鎖構造を確実に制御することは 難しい。
また、糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を導入することによって、生産される糖蛋白 質の糖鎖構造を改変することも試みられている (非特許文献 12、非特許文献 13)。 β 1、 4-Ν-ァセチルダルコサミン転移酵素 III (GnTIII)を導入した CHO細胞を用いて 抗体を発現させた場合には、親株で発現させた抗体と比べて 16倍高 ヽ ADCC活性を 示した (非特許文献 11、特許文献 3)。し力しながら、 GnTIIIあるいは |8 1、 4_N-ァセ チルダルコサミン転移酵素 V (GnTV)の過剰発現は CHO細胞に対して毒性を示すと 報告されているため、このような宿主細胞は抗体医薬の生産には適切ではない。
[0007] 糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として 用いることで、生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産例も報告されている。 糖鎖の修飾に係わる酵素の活性が変化した突然変異体は、例えば、 WGA (T. vulgar i ^由来の wheat— germ agglutinin)、 し onA (し. ensiformis由 ¾ CO concanavalin A)、 RIし (R 二 communis由来の毒素)、 L— PHA (P.vulgaris由来の leukoagglutinin)、 LCA (l^ culina 由来の lentil agglutinin) , PSA (P.sativum由来の Pea lectin)などのレクチンに而ォ性 を示す株として取得されている（非特許文献 14)。このような糖鎖の修飾に係わる酵 素の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として用いることで、生産される糖鎖構 造が変化した糖蛋白質が生産されることも報告されており、例えば、 N-ァセチルダル コサミン転移酵素 I (GnTl)の活性が欠損して!/ヽる CHO細胞変異株を用いてハイマン ノース型糖鎖構造を有する抗体が生産されることが報告されている (非特許文献 15) 。また、 CMP-シアル酸トランスポーターや UDP-ガラクトーストランスポーターの欠損 株を用いて、糖鎖非還元末端側にシアル酸が付加して ヽな ヽ糖鎖構造を有する抗 体の発現や、ガラクトースの付加のない抗体の発現例が報告されている力 医薬へ の応用に適するようにエフェクター作用を向上させた抗体の発現には成功していな い (非特許文献 15)。
[0008] このような中、最近になって、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの de novo合成経 路にお 、て、 GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換す る反応を触媒する酵素である GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ（以下、 GMDなどと も表記する）の活性が低下した株を宿主細胞として用いることで、 ADCC活性の高 ヽ 、医薬応用に適した抗体が生産できることが報告された (特許文献 1、非特許文献 9、 非特許文献 10)。これら報告では、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセ チルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が a結合した糖鎖構造を認識するレクチンに 而性を示す株、例えば、 AAL (Aleuria aumni 由来の Lectin)に而性を示す CHO-AA L株、 LCA (L.culinaris由来の lentil agglutinin)に而性を示す CHO- LCA株あるいは L ecl3株が宿主細胞として用いられた。また、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼの活 性が低下した株としては、この他にも、マウス白血病由来の細胞株 BW5147の PSA sativum由来の Pea lectin)耐性変異株として樹立された PLR1.3が知られている（非特 許文献 16)。
[0009] し力しながら、上記の株は完全な遺伝子欠損体ではな!/、ため、抗体が高 、ADCC 活性を示す原因となっている糖鎖構造、すなわち、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端 の N-ァセチルダルコサミンへのフコースの付カ卩を完全に抑制することはできな!、。ま た、 PLR1.3や Lecl3株などの変異株は、変異剤処理によりランダムに変異を導入する ことで取得されており、医薬品製造に用いる株としては適して ヽな 、。
[0010] 以上のように、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変するために、宿主細胞の糖 鎖の修飾に係わる酵素や蛋白質の活性を制御する試みがなされているが、糖鎖の 修飾機構は多様かつ複雑であり、かつ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは 言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。特に、 GDP-マンノースを G DP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素の活性が低 下した細胞株が取得され、エフェクター活性の高 、抗体組成物が作られるようになつ たとは!、え、その活性の制御は未だ不十分である。
[0011] 簡便な、宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素や蛋白質の活性を制御する試みの 一例として、 siRNA (small interfering RNA)を用いる、特定遺伝子の機能制御の方法 が知られている（特許文献 4)。また、遺伝子の機能抑制に用いる RNA分子の設計方 法が報告されているが（非特許文献 17)、このような方法で設計した RNA分子が必ず しも目的遺伝子の機能を効果的に抑制できる分子とはならず (非特許文献 18)、特 定遺伝子に対する効果的な機能抑制効果を示す RNA分子の設計は、試行錯誤を伴
[0012] また、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフ コースの 1位が oc結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAを導入し た細胞を用いることで、産生糖蛋白質に付加する糖鎖へのフコース修飾を制御でき ることが示された (特許文献 2、 4)。この報告では、抗体分子を生産する細胞株に ex 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制する RNAを導入することで、産生抗体分 子に付加する糖鎖のうちフコース修飾のない糖鎖の割合を高められることが示されて いる。
[0013] 特許文献 l : WO00/61739
特許文献 2 : WO02/31140
特許文献 3： W099/54342
特許文献 4： WO03/85118
[0014] 非特許文献 1 :バイオケミストリー (Biochemistry), 31 , 9872, (1992)
非特許文献 2 :ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー 0. Biol. Chem.), 267, 7
703, (1992)
非特許文献 3 :ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー 0. Biol. Chem.), 265, 1 2127, (1990)
非特許文献 4 :ブラッド (Blood), 73, 84, (1989)
[0015] 非特許文献 5：プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 7819 (1989) 非特許文献 6 :プリティシュ 'ジャーナル'ォブ 'キャンサー (British J. Cancer), 84, 3, ( 2001)
非特許文献 7 :サイエンス (Science), 295, 1898, (2002)
非特許文献 8 :バイオケミストリー (Biochemistry), 36, 130, 1997
非特許文献 9 :ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem.), 277, 2
6733, (2002)
[0016] 非特許文献 10 :ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem.), 278, 3466, (2003)
非特許文献 11 :グリコバイオロジー (Glycobiology), 5, 813, (1995)
非特許文献 12 :ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem.), 261,
13848 (1989)
非特許文献 13 :サイエンス (Science), 252, 1668 (1991)
[0017] 非特許文献 14 :ソマテイク'セル 'アンド'モレキユラ一'ジエネテイクス (Somatic cell Mol . Genet.), 12, 51 (1986)
非特許文献 15 :ジャーナル'ォブ 'ィムノロジー (J. Immunol), 160, 3393 (1998) 非特許文献 16 :ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem.), 255,
9900 (1980)
非特許文献 17 :ネィチヤ一'バイオテクノロジー (Nature Biotech.), 22, 326 (2004) 非特許文献 18：カレント ·オピニオン 'イン ·モルキユラ一'セラピテクス (Current Opinio n in Molecular Therapeutics), 6, 129 (2004)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0018] 本発明の目的は、 GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに 変換する反応を触媒する酵素の機能を抑制する RNAを導入した細胞および該細胞 を用いる糖蛋白質組成物の製造方法、該細胞の製造に用いる RNA、該 RNAに対応 する DNA、並びに該 DNAとその相補 DNAとを含有するベクターを提供することである 。また、本発明の目的は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダル コサミンの 6位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑 制する RNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白 質の機能を抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への 輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAを導入した細胞、並びに該細胞を用 いる糖蛋白質組成物の製造方法を提供することである。更に、本発明の目的は、 N- グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1 位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAと その相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋 白質の機能を抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体へ の輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを 含む DNA、並びに該 DNAを含有するベクターおよび該ベクターが導入された細胞、 並びに N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフ コースの 1位が oc結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応 する DNAとその相補 DNAを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フ コースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオ チド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAに 対応する DNAとその相補 DNAを含有するベクターが導入された細胞、該細胞を用い る糖蛋白質組成物の製造方法を提供することである。
課題を解決するための手段
本発明は、以下の（1)〜（71)に関する。
( 1)以下の (a)または (b)から選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RN Aを細胞内に導入した細胞；
(a)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列からなる RNA ;
(b)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が 欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列からなり、 GDP-マンノースを G DP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑 制する活性を有する RNA。
(2) GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する脱水反 応を触媒する酵素が、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼである、（1)に記載の細胞 [0020] (3) GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の（a)〜（f)力 なる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 (2)に記載の細胞；
(a)配列番号 8で表される塩基配列力 なる DNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNA;
(d)配列番号 8で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A;
(e)配列番号 9で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A;
(f)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリ ダイズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA0
[0021] (4) GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の（a)〜（i)力もなる群力も選ばれる 蛋白質である、（2)に記載の細胞；
(a)配列番号 11で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(b)配列番号 12で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(c)配列番号 13で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(d)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒ ドラターゼ活性を有する蛋白質；
(e)配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒ ドラターゼ活性を有する蛋白質；
(f)配列番号 13で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 12で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(i)配列番号 13で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
[0022] (5)以下の（a)または（b)力も選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNA0
(a)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列からなる RNA ;
(b)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が 欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列からなり、 GDP-マンノースを G DP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑 制する活性を有する RNA。
(6) (5)に記載の RNAに対応する DNAおよびその相補 DNA。
(7) (5)に記載の RNAに対応する DNAを含有するベクター。
(8) (7)に記載のベクターを細胞に導入した細胞。
(9) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコー スの 1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNA、および細胞 内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAまたは 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能 を抑制する RNAを導入した細胞。
[0023] ( 10) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNA、および細 胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAを 導入した細胞。
( 1 1 )細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素力 GDP-マンノー スを GDP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素である (9)または（10)に記載の細胞。
( 12) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素力 a 1 ,6-フコシルトランスフェラ ーゼである、（9)〜（1 1)のいずれか 1項に記載の細胞。
[0024] ( 13) a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の（a)〜(！ i)力もなる群力も選ばれる D NAがコードする蛋白質である、 ( 12)に記載の細胞；
(a)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
(1)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダィ ズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA ;
(g)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(h)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
[0025] ( 14) a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の (a)〜(l)からなる群から選ばれる蛋 白質である、（12)に記載の細胞；
(a)配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(b)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(c)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(d)配列番号 84で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(e)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ a 1 ,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 84で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラ ーゼ活性を有する蛋白質；
(0配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 84で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
(15) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)〜(d)からなる群から選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAで ある、 (9)〜（14)の!、ずれか 1項に記載の細胞；
(a)配列番号 1で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA； (d)配列番号 4で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[0027] (16) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)および (b)カゝらなる群カゝら選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RN Aである、（9)〜（14)の 、ずれか 1項に記載の細胞；
(a)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列から なる RNA ;
(b)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列に おいて、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列 からなり、 a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性の機能を抑制する活性を有する RNA
(17) GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を 触媒する酵素が、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼである、（11)〜（16)のいずれ 力 1項に記載の細胞。
[0028] (18) GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(l)からなる群力 選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 (17)に記載の細胞；
(a)配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNA;
(d)配列番号 8で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A ;
(e)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A ;
(1)配列番号 10で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A。
[0029] (19) GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(i)からなる群から選ばれる 蛋白質である、（17)に記載の細胞；
(a)配列番号 11で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b)配列番号 12で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(c)配列番号 13で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(d)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(e)配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 13で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 11で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 12で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(0配列番号 13で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
[0030] (20) GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を 触媒する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)〜(c)力 なる群力 選ばれる RNA およびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAである、 (11)〜（19)のいずれか 1項に 記載の細胞；
(a)配列番号 8で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
(21 ) GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を 触媒する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)および (b)力 なる群力 選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAである、（1 1)〜（19)のいずれか 1 項に記載の細胞；
(a)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の 、ずれかの塩基配列力 なる R NA ;
(b)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の!/、ずれかの塩基配列にお!、て、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列力もなり 、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有する RNA。
[0031] (22) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応す る DNAとその相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与す る酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAまたは細胞内糖ヌクレ ォチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNA に対応する DNAとその相補 DNAを含む DNA。
(23) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応す る DNAとその相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与す る酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含む DNA。
[0032] (24)細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素力 GDP-マンノー スを GDP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素である
(22)または（23)に記載の DNA。
(25) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素力 a 1 ,6-フコシルトランスフェラ ーゼである、（22)〜（24)のいずれか 1項に記載の DNA。 [0033] (26) a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の（a)〜(！ i)力もなる群力も選ばれる D NAがコードする蛋白質である、 (25)に記載の DNA ;
(a)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
(1)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダィ ズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA ;
(g)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(h)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
[0034] (27) a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の (a)〜(l)からなる群から選ばれる蛋 白質である、（25)に記載の DNA ;
(a)配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(b)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(c)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(d)配列番号 84で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(e)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1 ,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Ζまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1 ,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質； (g)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 84で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラ ーゼ活性を有する蛋白質；
(0配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
(1)配列番号 84で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
[0035] (28) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)〜(d)からなる群から選ばれる RNAである、 (22)〜（27)のいずれ力 1項に記載の D NA;
(a)配列番号 1で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[0036] (29) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)および (b)からなる群力も選ばれる RNAである、 (22)〜（27)の!、ずれか 1項に記載 の DNA;
(a)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列から なる RNA ;
(b)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列に おいて、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列 からなり、 a 1,6-フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制する活性を有する RNA。
(30) GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を 触媒する酵素が、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼである、（24)〜（29)のいずれ 力 1項に記載の DNA。
[0037] (31) GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(l)からなる群力 選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 (30)に記載の DNA ;
(a)配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNA;
(d)配列番号 8で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A ;
(e)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A ;
(1)配列番号 10で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A。
[0038] (32) GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(i)からなる群から選ばれる 蛋白質である、（30)に記載の DNA ;
(a)配列番号 11で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b)配列番号 12で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質； (c)配列番号 13で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(d)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(e)配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 13で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 11で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 12で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(0配列番号 13で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
[0039] (33) GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を 触媒する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)〜(c)力 なる群力 選ばれる RNA である、 (24)〜（32)の!、ずれ力 1項に記載の DNA;
(a)配列番号 8で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[0040] (34) GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を 触媒する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)および (b)力 なる群力 選ばれる RNAである、（24)〜（32)の!、ずれ力 1項に記載の DNA; (a)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の 、ずれかの塩基配列からなる R NA ;
(b)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の!/、ずれかの塩基配列にお!、て、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列力もなり 、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有する RNA。
[0041] (35) (22)〜（34)の!、ずれか 1項に記載の DNAを含有するベクター。
(36)配列番号 90で表される DNAおよび配列番号 92で表される DNAを含んでなる、 (35)に記載のベクター。
(37)配列番号 91で表される DNAおよび配列番号 92で表される DNAを含んでなる、 (35)に記載のベクター。
(38)配列番号 90で表される DNAおよび配列番号 93で表される DNAを含んでなる、 (35)に記載のベクター。
(39)配列番号 91で表される DNAおよび配列番号 93で表される DNAを含んでなる、 (35)に記載のベクター。
(40) (35)〜（39)の 、ずれか 1項に記載のベクターを導入した細胞。
[0042] (41) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応す る DNAとその相補 DNAを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコ ースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNA を含有するベクターまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送 に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含有す るベクターを導入した細胞。
(42) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応す る DNAとその相補 DNAを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコ ースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNA を含有するベクターを導入した細胞。
[0043] (43)細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑 制する RNA力 GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換す る反応を触媒する酵素の機能を抑制する RNAである（41)または (42)に記載の細胞
(44) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素力 a 1 ,6-フコシルトランスフェラ ーゼである、（41)〜（43)のいずれか 1項に記載の細胞。
[0044] (45) a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の（a)〜(！ i)力もなる群力も選ばれる D NAがコードする蛋白質である、（44)に記載の細胞；
(a)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
(1)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダィ ズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA ;
(g)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(h)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
[0045] (46) a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の (a)〜(l)からなる群から選ばれる蛋 白質である、（44)に記載の細胞；
(a)配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(b)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(c)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(d)配列番号 84で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質； (e)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Ζまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 84で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラ ーゼ活性を有する蛋白質；
(0配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 84で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
(47) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)〜(d)からなる群から選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAで ある、（41)〜（46)の!、ずれか 1項に記載の細胞；
(a)配列番号 1で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA； (c)配列番号 3で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[0047] (48) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)および (b)カゝらなる群カゝら選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RN Aである、（41)〜（46)の!、ずれ力 1項に記載の細胞；
(a)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列から なる RNA ;
(b)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列に おいて、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列 からなり、 a 1,6-フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制する活性を有する RNA。
(49) GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を 触媒する酵素が、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼである、（43)〜（48)のいずれ 力 1項に記載の細胞。
[0048] (50) GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(l)からなる群力 選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 (49)に記載の細胞；
(a)配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNA;
(d)配列番号 8で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A ;
(e)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A ;
(1)配列番号 10で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A。
[0049] (51) GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(i)からなる群から選ばれる 蛋白質である、（49)に記載の細胞；
(a)配列番号 11で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b)配列番号 12で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(c)配列番号 13で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(d)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(e)配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 13で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 11で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 12で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(0配列番号 13で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
[0050] (52) GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を 触媒する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)〜(c)力 なる群力 選ばれる RNA およびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAである、 (43)〜（51)のいずれか 1項に 記載の細胞；
(a)配列番号 8で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA； (b)配列番号 9で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[0051] (53) GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を 触媒する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)および (b)力 なる群力 選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAである、（43)〜（51)の!、ずれか 1 項に記載の細胞；
(a)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の 、ずれかの塩基配列力 なる R NA;
(b)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の!/、ずれかの塩基配列にお!、て、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列力もなり 、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有する RNA。
(54)細胞が、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、 ( 1)〜（4)、 (8)〜（21)および (40)〜（53)の!、ずれか 1項に記載の細胞。
[0052] (55)レクチン力 以下の (a)〜(d)力もなる群力も選ばれるレクチンである、 (54)に記 載の細胞；
(a)レンズマメレクチン LCA (Lens Culinaris由来の Lentil Agglutinin)；
(b)エンドゥマメレクチン PSA (Pisumsativum由来の Pea Lectin)；
(c)ソラマメレクチン VFA(yy ^^由来の Agglutinin)；
(d)ヒィロチャワンタケレクチン AAL (Aleuriaaurantia由来の Lectin)。
(56)細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細 胞である、（1)〜（4)、（8)〜（21)および (40)〜（55)のいずれか 1項に記載の細胞
[0053] (57)動物細胞が、以下の (a)〜(k)力もなる群力も選ばれる細胞である、（56)に記載 の細胞；
(a)チャイニーズノヽムスター卵巣組織由来 CHO細胞； (b)ラットミエローマ細胞株 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞；
(c)マウスミエローマ細胞株 NS0細胞；
(d)マウスミエローマ細胞株 SP2/0- Agl4細胞；
(e)シリアンノヽムスター腎臓組織由来 BHK細胞；
(D抗体を産生するハイプリドーマ細胞；
(g)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(h)ヒト白血病細胞株 NM- F9細胞；
(0ヒト胚性網膜細胞株 PER.C6細胞；
(j)胚性幹細胞；
(k)受精卵細胞。
(58)糖蛋白質をコードする遺伝子を含む、（1)〜(4)、（8)〜（21)および (40)〜（5 7)の!、ずれ力 1項に記載の細胞。
[0054] (59)糖蛋白質が抗体分子である、（58)に記載の細胞。
(60)抗体分子が、以下の (a)〜(d)力もなる群力も選ばれる分子である、（59)に記載 の細胞；
(a)ヒト抗体；
(b)ヒト化抗体；
(c) (a)または (b)の Fc領域を含む抗体断片；
(d) (a)または (b)の Fc領域を含む融合蛋白質。
(61)抗体分子のクラスが IgGである、（59)または（60)に記載の細胞。
(62) (58)に記載の細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法。
(63) (58)に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積 させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取精製する工程を含む、糖蛋白質組成物 の製造方法。
(64) (59)〜（61)のいずれか 1項に記載の細胞を用いることを特徴とする、抗体組 成物の製造方法。
[0055] (65) (59)〜（61)のいずれ力 1項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体 組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取精製する工程を含む、抗 体組成物の製造方法。
(66)抗体組成物が、親株細胞が生産する抗体組成物より抗体依存性細胞傷害活 性が高!、抗体組成物である、 (64)または（65)に記載の方法。
(67)抗体依存性細胞傷害活性が高!ヽ抗体組成物が、該抗体組成物中に含まれる F c領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合力 親株細胞が生産する抗 体組成物より高いことを特徴とする、 (66)に記載の方法。
[0056] (68)フコースが結合していない糖鎖力 該フコースの 1位が N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合して!/、な 、糖鎖である、 (6 7)に記載の方法。
(69) (62)または（63)に記載の方法を用いて製造される糖蛋白質組成物。
(70) (64)〜（68)のいずれか 1項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
(71) (69)または（70)に記載の組成物を有効成分として含有する医薬。
発明の効果
[0057] 本発明によると、 GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変 換する反応を触媒する酵素の機能を抑制する RNAを導入した細胞および該細胞を 用いる糖蛋白質組成物の製造方法、該細胞の製造に用いる RNA、該 RNAに対応す る DNA、並びに該 DNAとその相補 DNAとを含有するベクターが提要される。また、本 発明によると、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6 位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNA、 および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を 抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与 する蛋白質の機能を抑制する RNAを導入した細胞、並びに該細胞を用いる糖蛋白 質組成物の製造方法が提供される。更に、本発明によると、 N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖 修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNA、およ び細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制 する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する 蛋白質の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含む DNA、並びに 該 DNAを含有するベクターおよび該ベクターが導入された細胞、並びに N-グリコシド 結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結 合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与 する酵素蛋白質の機能を抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの ゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその 相補 DNAを含有するベクターが導入された細胞、該細胞を用いる糖蛋白質組成物 の製造方法が提供される。
[0058] 以下、本発明を詳細に説明する。本願は、 2004年 8月 5日に出願された日本国特 許出願 2004— 228928号、 2004年 8月 31曰に出願された曰本国特許出願 2004 — 252682号および 2005年 5月 9曰に出願された曰本国特許出願 2005— 13641 0号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書および図面に記載され る内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0059] [図 1]図 1は、プラスミド pBS-U6termの構築を示した図である。
[図 2]図 2は、プラスミド pPUR-U6termの構築を示した図である。
[図 3]図 3は、プラスミド pPUR/GMDshBの構築を示した図である。
[図 4]図 4は、各細胞株における GMDの mRNA量を示した図である。横軸には、 GMD mRNA量の 13 -ァクチン mRNAに対する比率について親株である 32-05-12株の値を 1 00とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株を示した。図中黒塗りのバーは、 siRNA を導入して ヽな 、親株細胞を、白抜きのバーは GMDを標的とした siRNA発現べクタ 一を単独で導入して得られた細胞株をそれぞれ示す。
[0060] [図 5]図 5は、 CHO/DG44細胞由来抗 CCR4抗体生産株である 32-05-12AF株、並び に GMDを標的とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチン耐性株である 12- GMDB -2AF株および 12- GMDB-5AF株の、無血清フエドバッチ培養中の生細胞密度の変 化を示した図である。横軸には培養日数を、縦軸には生細胞密度をそれぞれ示した 。図中▲は 32-05-12AF株を、〇は 12-GMDB-2AF株を、參は 12-GMDB-5株をそれ ぞれ示す。
[図 6]図 6は、 CHO/DG44細胞由来抗 CCR4抗体生産株である 32-05-12AF株、並び に GMDを標的とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチン耐性株である 12- GMDB -2AF株および 12- GMDB-5AF株の、無血清フエドバッチ培養中の、培養上清中に蓄 積された抗体量の変化を示した図である。横軸には培養日数を、縦軸には抗体蓄積 量をそれぞれ示した。図中▲は 32-05-12AF株を、〇は 12-GMDB-2AF株を、參は 12 - GMDB-5株をそれぞれ示す。
[0061] [図 7]図 7は、プラスミド FUT8shRNA/lib2B/pPURおよび FUT8shRNA/lib3/pPURの構 築を示した図である。
[図 8]図 8は、プラスミド FT81ibB/pBSおよび FT81ib3/pBSの構築を示した図である。
[図 9]図 9は、プラスミド FT81ibB/pAGEおよび FT81ib3/pAGEの構築を示した図である
[図 10]図 10は、 GMDを標的とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRN A発現ベクターを導入して得られた各細胞株、 GMDを標的とした siRNA発現ベクター を単独で導入して得られた各細胞株または親株細胞における、 GMDの mRNA量を示 した図である。横軸には、 GMD mRNA量の 13 -ァクチン mRNAに対する比率につい て親株である 32-05-12株の値を 100とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株を示 した。図中黒塗りのバーは、 siRNAを導入していない親株細胞を、白抜きのバーは G MDを標的とした siRNA発現ベクターを単独で導入して得られた細胞株をそれぞれ示 す。
[0062] [図 11]図 11は、 GMDを標的とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRN A発現ベクターを導入して得られた各細胞株、 GMDを標的とした siRNA発現ベクター を単独で導入して得られた各細胞株または親株細胞における、 FUT8の mRNA量を 示した図である。横軸には、 FUT8 mRNA量の 13 -ァクチン mRNAに対する比率につ いて親株である 32-05-12株の値を 100とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株を 示した。図中黒塗りのバーは、 siRNAを導入していない親株細胞を、白抜きのバーは GMDを標的とした siRNA発現ベクターを単独で導入して得られた細胞株をそれぞれ 示す。 [図 12]図 12は、 CHO/DG44細胞由来抗 CCR4抗体生産株である 32-05-12AF株、並 びに GMDを標的とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRNA発現べク ターを導入したレクチン耐性株である Wi23_5AF株の、無血清フエドバッチ培養中の 生細胞密度の変化を示した図である。横軸には培養日数を、縦軸には生細胞密度 をそれぞれ示した。図中点線は 32-05-12AF株を、実線は W123-5AF株をそれぞれ示 す。
[0063] [図 13]図 13は、 CHO/DG44細胞由来抗 CCR4抗体生産株である 32-05-12AF株、並 びに GMDを標的とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRNA発現べク ターを導入したレクチン耐性株である Wi23_5AF株の、無血清フエドバッチ培養中の 、培養上清中に蓄積された抗体量の変化を示した図である。横軸には培養日数を、 縦軸には抗体蓄積量をそれぞれ示した。図中点線は 32-05-12AF株を、実線は Wi23 -5AF株をそれぞれ示す。
[図 14]図 14は、抗 CCR4キメラ抗体のフコース (-) %が分かっている標準品サンプルの s hFc y RIIIaに対する結合活性を示した図である。横軸にはフコース (-) %を、縦軸には s hFc y Rlllaに対する結合活性を示す波長 490nmにおける吸光度をそれぞれ示した。
[図 15]図 15は、 CHO/DG44細胞由来抗 CCR4抗体生産株である 32-05-12AF株、並 びに GMDを標的とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRNA発現べク ターを導入したレクチン耐性株である Wi23_5AF株の、無血清フエドバッチ培養中の 、培養上清に含まれる抗 CCR4キメラ抗体の shFc y Rlllaに対する結合活性力 算出 されるフコース (-) %をそれぞれ示した図である。横軸には培養日数を、縦軸にはフコ ース (-) %をそれぞれ示した。図中点線は 32-05-12AF株を、実線は Wi23-5AF株をそ れぞれ示す。
[0064] [図 16]図 16は、プラスミド pCR/GMDshBおよび pCR/GMDmBの構築を示した図であ る。
[図 17]図 17は、プラスミド FT81ibB— GMDB/pAGE FT81ib3— GMDB/pAGE FT81ibB_G MDmB/pAGEおよび FT81ib3_GMDmB/pAGEの構築を示した図である。
[図 18]図 18は、 CHO/DG44細胞由来抗 CCR4抗体生産株である 32-05-12株へ、 GM Dを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入して得ら れた各細胞株における、 GMD mRNAの相対的発現量を示した図である。横軸には、 GMD mRNA量の 13 -ァクチン mRNAに対する比率について親株である 32-05-12株 の値を 100とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株を示した。図中黒塗りのバーは 親株の、白抜きのバーは GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共 発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株である 32-05-12株の値を 100とし た場合の GMD mRNA量の相対値をそれぞれ示す。
[0065] [図 19]図 19は、 CHO/DG44細胞由来抗 CCR4抗体生産株である 32-05-12株へ、 GM Dを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入して得ら れた各細胞株における、 FUT8 mRNAの相対的発現量を示した図である。横軸には、 FUT8 mRNA量の 13 -ァクチン mRNAに対する比率について親株である 32-05-12株 の値を 100とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株をそれぞれ示した。図中黒塗り のバーは親株の、白抜きのバーは GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株である 32-05-12株の値 を 100とした場合の FUT8 mRNA量の相対値をそれぞれ示す。
[図 20]図 20は、プラスミド pPUR/GMDmBの構築を示した図である。
[0066] [図 21]図 21は、 SP2/0細胞由来抗 GM抗体生産株である KM968株へ、マウス GMDを
2
標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入して得られた 各細胞株における、 GMD mRNAの相対的発現量を示した図である。横軸には、 GM D mRNA量の 13 -ァクチン mRNAに対する比率について親株である KM968株の値を 1 00とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株をそれぞれ示した。図中黒塗りのバー は親株の、白抜きのバーは GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA 共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株である KM968株の値を 100とし た場合の GMD mRNA量の相対値をそれぞれ示す。
[図 22]図 22は、 SP2/0細胞由来抗 GM抗体生産株である KM968株へマウス GMDを
2
標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入して得られた 各細胞株における、 FUT8 mRNAの相対的発現量を示した図である。横軸には、 FUT 8 mRNA量の 13 -ァクチン mRNAに対する比率について親株である KM968株の値を 1 00とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株をそれぞれ示した。図中黒塗りのバー は親株の、白抜きのバーは GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA 共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株である KM968株の値を 100とし た場合の FUT8 mRNA量の相対値をそれぞれ示す。
[0067] [図 23]図 23は、 NS0細胞由来抗 CCR4抗体生産株である NS0/2160株へ、マウス GMD を標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入して得られ た各細胞株における、 GMD mRNAの相対的発現量を示した図である。横軸には、 G MD mRNA量の j8 -ァクチン mRNAに対する比率について親株である NS0/2160株の 値を 100とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株をそれぞれ示した。図中黒塗りの バーは親株の、白抜きのバーは GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした si RNA共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株である NS0/2160株の値を 100とした場合の GMD mRNA量の相対値をそれぞれ示す。
[図 24]図 24は、 NS0細胞由来抗 CCR4抗体生産株である NS0/2160株へ、マウス GMD を標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入して得られ た各細胞株における、 FUT8 mRNAの相対的発現量を示した図である。横軸には、 F UT8 mRNA量の 13 -ァクチン mRNAに対する比率について親株である NS0/2160株の 値を 100とした場合の相対値を、縦軸には各細胞株をそれぞれ示した。図中黒塗りの バーは親株の、白抜きのバーは GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした si RNA共発現ベクターを導入して得られた各細胞株の、親株である NS0/2160株の値を 100とした場合の FUT8 mRNA量の相対値をそれぞれ示す。
発明を実施するための最良の形態
[0068] 本発明において、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素（以 下、 GDP-フコース合成酵素とも標記する）としては、細胞内で糖鎖へのフコースの供 給源である糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素であればいかなる酵 素も包含する。また、本発明の GDP-フコース合成酵素には、細胞内糖ヌクレオチド G DP-フコースの合成に影響を与える酵素なども包含される。
[0069] 細胞内 GDP-フコースは、 de novoの合成経路あるいは Salvage合成経路により供給 されている。したがって、これら合成経路に関与する酵素または蛋白質はすべて、 G DP-フコース合成酵素に包含される。 de novoの合成経路に関与する GDP-フコース合成酵素としては、 GDP-マンノース を GDP-4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素、 GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースを GDP-フコースに変換する反応を触媒する酵素 などがあげられる。
[0070] 本発明の GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する 反応を触媒する酵素としては、 GDP-マンノースを GDP-4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マ ンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素が好適に用いられる。 GDP-マンノース を GDP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素と しては、具体的には、 GDP- mannose 4,6- dehydratase (GDP-マンノース 4,6-デヒドラ ターゼ)があげられる。
[0071] 本発明の GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースを GDP-フコースに変換する反 応を触媒する酵素としては、 GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースを GDP- 4-ケト , 6-デォキシ- GDP-フコースに変換する反応を触媒する酵素、 GDP- 4-ケト, 6-デォキ シ -GDP-フコースの 4位を還元する反応を触媒する酵素などがあげられ、具体的には 、 GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-フコー スに変換する反応を触媒する酵素活性を有し、かつ、 GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP -フコースの 4位を還元する反応を触媒する酵素である、 GDP-keto-6-deoxymannose 3,5- epimerase, 4- reductase (GDP-ケト-デォキシマンノース 3,5-ェピメラーゼ， 4-リ ダクターゼ）などがあげられる。
[0072] Salvage合成経路に関与する GDP-フコース合成酵素としては、 GDP- beta- L- focose pyrophosphorylase (GDP-ベータ- L-フコース-ピロホスフオリラーゼ)、 Fucokinase (フ コキナーゼ）などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に影響を与える酵素としては、上述の G DP-フコース合成酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に 影響を与える酵素も包含される。
[0073] 本発明の細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質としては、細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋 白質であればいかなる蛋白質も包含され、具体的には、 GDP-フコーストランスポータ 一などがあげられる。
本発明の GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する 反応を触媒する酵素の機能を抑制する RNAを導入した細胞とは、 GDP-マンノースを GDP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素（以下、「 GDP-マンノース変換酵素」とも表記する）の活性または発現を抑制する RNAが導入さ れた細胞であれば、 、かなる細胞も包含される。
本発明にお 、て、 GDP-マンノース変換酵素としては、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラ ターゼが好適に用いられる。
本発明において、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼとしては、下記 (a)〜(l)の DNA 力 Sコードする蛋白質、または下記 (g)〜(0)の蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA
(b)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNA
(c)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNA
(d)配列番号 8で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A
(e)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A
(1)配列番号 10で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A
(g)配列番号 11で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(h)配列番号 12で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質
(0配列番号 13で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質
(j)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質 (k)配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質
(1)配列番号 13で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質
(m)配列番号 11で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
(n)配列番号 12で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
(0)配列番号 13で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
[0075] また、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼのアミノ酸配列をコードする DNAとしては 、配列番号 8〜 10のいずれかで表される塩基配列を有する DNA、配列番号 8〜10 のいずれかで表される塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダイ ズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有するアミノ酸配列をコードす る DNAなどがあげられる。
また、本発明は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミン の 6位にフコースの 1位が oc結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RN A、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制 する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する 蛋白質の機能を抑制する RNAを導入した細胞に関する。
[0076] 本発明の N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNA、お よび細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する R NAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の機能を抑制する RNAを導入した細胞とは、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末 端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与 する酵素（以下、「 a 1 ,6-フコース修飾酵素」とも表記する）の活性または発現を抑制 する RNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の活性 または発現を抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体へ の輸送に関与する蛋白質の活性または発現を抑制する RNAが導入された細胞であ れば、いかなる細胞も包含され、好ましくは α 1 ,6-フコース修飾酵素の活性または発 現を抑制する RNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵 素の活性または発現を抑制する RNAが導入された細胞があげられ、さらに好ましくは 、 α 1 ,6-フコース修飾酵素の活性または発現を抑制する RNA、および GDP-マンノー スを GDP-4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素（GDP -マンノース変換酵素）の活性または発現を抑制する RNAが導入された細胞があげら れる。
[0077] 本発明において、 a 1 ,6-フコース修飾酵素とは、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元 末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関 与する酵素であれば 、かなる酵素も包含される。
α 1 ,6-フコース修飾酵素としては、具体的には、 α 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ や a -L-フコシダーゼなどがあげられる。
[0078] a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼとしては、下記 (a)〜(！ ι)の DNAがコードする蛋白質
、または下記 (i)〜(t)の蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA
(e)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA (1)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダィ ズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA (g)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダ ィズし、かつ α 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA (h)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA (0配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質
(1)配列番号 84で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質
(m)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラ ーゼ活性を有する蛋白質
(η)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Ζまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質
(0)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Ζまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質
(Ρ)配列番号 84で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Ζまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラ ーゼ活性を有する蛋白質
(q)配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
(r)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
(s)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
(t)配列番号 84で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
また、 α 1,6-フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする DNAとしては、 配列番号 1〜4の!、ずれかで表される塩基配列を有する DNA、配列番号 1〜4の!、 ずれかで表される塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件でノヽイブリダィズし 、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードする DNA などがあげられる。
[0080] 本発明にお!/、て、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、例えば配 列番号 1〜4のいずれかまたは 8〜10のいずれかで表れる塩基配列を有する DNAな どの DNAまたはその一部の断片をプローブとして、コロニ^ ~ ·ハイブリダィゼーシヨン 法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン 法などを用いることにより得られる DNAを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラ ーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0.7〜lmol/Lの塩化ナトリウム存 在下、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0.1〜2倍濃度の SSC溶液（1倍濃度 の SSC溶液の組成は、 150mmol/L塩化ナトリウム、 15mmol/Lクェン酸ナトリウムよりな る）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAをあげるこ とができる。ハイブリダィゼーシヨンは、モレキュラ^ ~ ·クロー-ング（Molecular Cloning ) , A Laboratory Manual, Second Edition, し old Spring Harbor Laboratory Press, 198 9 (以下、モレキュラー 'クローユング第 2版と略す）、カレント'プロトコールズ'イン'モ レキュフ ~~ 'ノィォロン1 ~~ (Current Protocols in Molecular Biology) , John Wiley & So ns, 1987-1997 (以下、カレント'プロトコールズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジーと略 す)、ディーェヌエー'クロー-ング (DNA Cloning 1) : Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)などに記載されている方法に準 じて行うことができる。ハイブリダィズ可能な DNAとして具体的には、配列番号 1〜4の いずれかまたは 8〜 10のいずれかで表される塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性 を有する DNA、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上 、特に好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上の相同性を有する DNAをあげるこ とがでさる。
[0081] 本発明において、配列番号 5〜7および 84のいずれかで表されるアミノ酸配列にお いて 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質または配列番号 11 〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換、揷 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラ ターゼ活性を有する蛋白質とは、モレキュラー 'クローユング第 2版、カレント.プロトコ ーノレズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー、ヌクレイック'アシッド'リサーチ（Nucleic Aci ds Research) , 10, 6487 (1982)、プロシーディングス'ナショナル'アカデミック 'サイェ ンス.ユーエスエー（proc. Natl. Acad. Sci.) , USA, 79, 6409 (1982)、ジーン（Gene) , 34, 315 (1985)、ヌクレイツク'アシッド'リサーチ（Nucleic Acids Research) , 13, 4431 ( 1985)、プロシーディングス'ナショナル 'アカデミック 'サイエンス 'ユーエスエー（Proc . Natl. Acad. Sci USA) , 82, 488 (1985)などに記載の部位特異的変異導入法を用い て、例えば、配列番号 5〜7および 84のいずれ力、または配列番号 11〜13のいずれ かで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAに部位特異的変異を導 入することにより取得することができる蛋白質を意味する。欠失、置換、挿入および Z または付加されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数は特に限定されないが、上記 の部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる 程度の数であり、例えば、 1〜数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さ らに好ましくは 1〜5個である。
[0082] 本発明において、配列番号 11〜13のいずれかで表されるアミノ酸配列と 80%以上 の相同性を有し、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質とは、 配列番号 11〜 13の 、ずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも 80% 以上、好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好 ましくは 97%以上、最も好ましくは 99%以上の相同性を有し、かつ GDP-マンノース 4,6- デヒドラターゼ活性を有する蛋白質である。
[0083] また、本発明にお 、て、配列番号 5〜7および 84の 、ずれかで表されるアミノ酸配 列と 80%以上の相同性を有し、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋 白質とは、配列番号 5〜7および 84のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白 質と少なくとも 80%以上、好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 97%以上、最も好ましくは 99%以上の相同性を有し、かつ α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質である。
[0084] 本発明に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の 相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってょ 、が、塩基配列にっ 、て は、 BLAST〔ジャーナル'ォブ 'モレキュラ^ ~ ·バイオロジー (J. Mol. Biol.), 215, 403 (1 990)〕においてデフォルトパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列につ いては、 BLAST2〔ヌクレイック'アシッド 'リサーチ (Nucleic Acids Res.), 25, 3389 (199 7)；ゲノム'リサーチ (Genome Res.), 7, 649 (1997) ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Ed ucation/BLASTinfo/information3.html]にお!/、てデフォルトパラメータを用いて算出さ れる数値などがあげられる。
[0085] デフォルトパラメータ一としては、 G (Cost to open gap)が塩基配列の場合は 5、アミ ノ酸配列の場合は 11、 -E (Cost to extend gap)が塩基配列の場合は 2、アミノ酸配列 の場合は 1、— q (Penalty for nucleotide mismatch) - ό、—r (reward for nucleotide ma tch)が 1、 -e (expect value)が 10、 -W (wordsize)が塩基配列の場合は 11残基、ァミノ 酸配列の場合は 3残基、 -y (Dropoff (X) for blast extensions in bits)が blastnの場合 は 20、 blastn以外のプログラムでは 7、 - X (X dropoff value for gapped alignment in bit s)力 Si 5および— Z (final X dropoff value for gapped alignment in bits) ¾sblastnの場合 は 50、 blastn以外のプログラムでは 25である（http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html /blastcgihelp.htmD oまた、アミノ酸配列の解析ソフトとしては FASTA〔メソッズ 'イン 'ェ ンザィモロジ一 (Methods in Enzymology), 183, 63 (1990)〕などもあげられる。
[0086] 本発明で用いられる細胞としては、抗体分子などの糖蛋白質を発現できる細胞で あればいかなる細胞でもよいが、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげら れ、好ましくは、動物細胞があげられる。動物細胞の好ましい具体例としては、チヤィ ニーズノヽムスター卵巣組織由来の CHO細胞、ラットミエローマ細胞株 YB2/3HL.P2.G l l.16Ag.20細胞、マウスミエローマ細胞株 NS0細胞、マウスミエローマ細胞株 SP2/0- Agl4細胞、シリアンノヽムスター腎臓組織由来 BHK細胞、抗体を産生するハイプリドー マ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などがあげられ る。
[0087] 本発明の、 GDP-マンノース変換酵素の機能を抑制する RNAを導入した細胞、ある いは N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNA、および細 胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAまた は細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機 能を抑制する RNAを導入した細胞 (以下、両者をまとめて本発明の細胞とも称す）は 、N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が a結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する。該 RNAを導入して 、な ヽ 親株細胞は該レクチンに耐性を有さな 、。
[0088] したがって、本発明の細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などの 糖蛋白質組成物を製造することができる細胞であって、 N-グリコシド結合複合型糖鎖 還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が a結合した糖鎖構造を 認識するレクチンに耐性を有する細胞があげられ、具体的には、 N-グリコシド結合複 合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が a結合した糖 鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、ハイプリドーマ細胞、ヒト抗体およびヒト 化抗体を製造するための宿主細胞、ヒト抗体を生産するためのトランスジエニック非ヒ ト動物を製造する胚性幹細胞および受精卵細胞、ヒト抗体を生産するためのトランス ジェニック植物を製造する植物カルス細胞、ミエローマ細胞、トランスジェニック非ヒト 動物由来の細胞などがあげられる。ミエローマ細胞はハイプリドーマ細胞を製造する 際に融合細胞として用いることができる。また、トランスジエニック非ヒト動物に抗原を 免疫し該動物の脾臓細胞などの抗体産生細胞を用いてハイプリドーマ細胞を製造す ることちでさる。
[0089] レクチンに耐性を有する細胞とは、培養培地にレクチンを有効濃度与えて細胞培 養を行ったときにも、生育が阻害されな 、細胞を 、う。
本発明において、生育が阻害されないレクチン有効濃度は、親株細胞に用いる細 胞株に応じて適宜定めればよいが、通常 10 /z g/ml〜10mg/ml、好ましくは 0.5〜2.0m g/mlである。親株細胞に GDP-マンノース変換酵素の機能を抑制する RNAを導入し た場合、ある!、は N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミン の 6位にフコースの 1位が oc結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RN A、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制 する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する 蛋白質の機能を抑制する RNAを導入した場合のレクチンの有効濃度とは、該親株細 胞が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは親株細胞が正常に生育できな い濃度と同濃度、より好ましくは 2〜5倍、さらに好ましくは 10倍、最も好ましくは 20倍以 上の濃度をいう。
[0090] 親株細胞とは、 GDP-マンノース変換酵素の機能を抑制する RNAを導入する前の細 胞、あるいは N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNA、お よび細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する R NAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質の機能を抑制する RNAを導入する前の細胞を 、う。
[0091] 親株細胞としては、特に限定はないが、具体例として、以下に示す細胞があげられ る。
NS0細胞の親株細胞としては、バイオ/テクノロジー (BIO/TECHNOLOGY), 10, 169 (1992)、バイオテクノロジ一'バイオエンジニアリング (Biotechnol. Bioeng.), 73, 261 (2 001)などの文献に記載されている NS0細胞があげられる。また、理化学研究所細胞 開発銀行に登録されて ヽる NS0細胞株 (RCB0213)、ある 、はこれら株を生育可能な 様々な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
[0092] SP2/0-Agl4細胞の親株細胞としては、ジャーナル'ォブ 'ィムノロジー (J. Immunol.) , 126, 317 (1981)、ネイチヤー (Nature), 276, 269 (1978)、ヒューマン 'アンチイボディ ズ'アンド'ノ、イブリドーマズ (Human Antibodies and Hybridomas), 3, 129 (1992)など の文献に記載されている SP2/0-Agl4細胞があげられる。また、 ATCCに登録されて V、る SP2/0-Agl4細胞（ATCC CRL-1581)ある!/、はこれら株を生育可能な様々な培 地に馴化させた亜株 (ATCC CRL-1581.1)などもあげられる。
[0093] チャイニーズノヽムスター卵巣組織由来 CHO細胞の親株細胞としては、ジャーナル' ォブ'ェクスペリメンタル 'メディスン (Journal of Experimental Medicine), 108, 945 (195 8)、プロシーディングス'ナショナル'アカデミック 'サイエンス 'ユーエスエー (Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA), 60, 1275 (1968)、ジェネティックス (Genetics), 55, 513 (1968)、 Ch romosoma. 41, 129 (1973)、メソッド 'イン 'セル'サイエンス (Methods in Cell Science), 18, 115 (1996)、ラジェーシヨン'リサーチ (Radiation Research), 148, 260 (1997)、プ ロシーディングス'ナショナル'アカデミック 'サイエンス 'ユーエスエー (Proc. Natl. Aca d. Sci. USA), 77, 4216 (1980)、プロシーディングス'ナショナル'アカデミック 'サイェ ンス (Proc. Natl. Acad. Sci). 60, 1275 (1968)、セル (Cell), 6, 121 (1975)、モルキユラ 一 'セル'ジェネティックス (Molecular Cell Genetics), Appendix Ι,ΙΙ (p883- 900)などの 文献に記載されている CHO細胞などがあげられる。また、 ATCCに登録されている C HO- K1株（ATCC CCL- 61)、 DUXB11株（ATCC CRL- 9096)、 Pro- 5株（ATCC CRL -1781)や、市販の CHO- S株（Lifetechnologies社 Cat#11619)、あるいはこれら株を生 育可能な様々な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
[0094] ラットミエローマ細胞株 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞の親株細胞としては、 Y3/Ag 1.2.3細胞 (ATCC CRL-1631)から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な 例としては、ジャーナル'ォブ 'セルラ一'バイオロジー (J. Cell. Biol), 93, 576 (1982) 、メソッズ 'ェンザィモロジ一 (Methods Enzymol.), 73B, 1 (1981)などの文献に記載さ れている YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞があげられる。また、 ATCCに登録されてい る YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC CRL-1662)あるいはこれら株を生育可能 な様々な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
[0095] 上記以外にも、本発明に用いられる親株細胞としては、ヒト白血病細胞株 NM- F9細 胞 (DSM ACC2605, WO05/17130)またはヒト胚性網膜細胞株 PER.C6細胞 (ECACC No. 96022940、 US6855544)、あるいはこれら株を生育可能な様々な培地に馴化させ た亜株などもあげられる。
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコース の 1位が 結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できる レクチンであれば、いずれのレクチンも包含される。その具体的な例としては、レンズ マメレクチン LCA (LensCulinaris由来の Lentil Agglutinin)、エンドゥマメレクチン PSA ( Pisum sativum由来の Pea Lectin)、ソラマメレクチン VFA (Vicia faba由来の Agglutinin )、ヒィロチャワンタケレクチン AAL (Aleuriaaurantia由来の Lectin)などがあげられる。
[0096] 本発明にお 、て、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミ ンの 6位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAおよび細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑 制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与す る蛋白質の機能を抑制する RNAとしては、 RNAおよびその相補 RNAで構成され、か つ a 1,6-フコース修飾酵素の mRNA量を減少させることが可能な 2本鎖 RNAおよび細 胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の mRNA量または細胞内糖 ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の mRNA量を減少 させることが可能な 2本鎖 RNAであればいかなるものでもよいが、 RNAの長さとしては 、 10〜40、好ましくは 10〜30、より好ましくは 15〜30の連続した RNAがあげられる。 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNA または細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の 機能を抑制する RNAとしては、好ましくは GDP-マンノース変換酵素の mRNA量を減 少させることが可能な RNAがあげられ、具体的には、
(a)配列番号 8で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩 基配列からなる DNAに対応する RNA；
があげられ、より好ましくは、
(1)配列番号 37で表される塩基配列力 なる RNA;
(2)配列番号 37で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 GDP-マンノース変換酵素の機能 を抑制する活性を有する RNA；
(3)配列番号 57で表される塩基配列力 なる RNA;
(4)配列番号 57で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 GDP-マンノース変換酵素の機能 を抑制する活性を有する RNA；
(5)配列番号 58で表される塩基配列力もなる RNA； (6)配列番号 58で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 GDP-マンノース変換酵素の機能 を抑制する活性を有する RNAがあげられる。
上記（a)〜（c)および（1)〜（6)の RNAにおいて、（a)、（1)および（2)はハムスター 由来の親株細胞において、（b)、（3)および (4)はヒト由来の親株細胞において、（c) 、（5)および (6)はマウス由来の親株細胞において、 GDP-マンノース変換酵素の機 能を抑制する RNAとして使用することが好ま 、。
本発明において、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を抑制する RNAとしては、好まし くは α 1,6-フコース修飾酵素の mRNA量を減少させることができる RNAがあげられ、 R NAの長さとしては、 10〜40、好ましくは 10〜30、より好ましくは 15〜30である。具体的 には、
(d)配列番号 1で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(e)配列番号 2で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(f)配列番号 3で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
(g)配列番号 4で表される塩基配列中の連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基 配列からなる DNAに対応する RNA；
があげられ、より好ましくは、
(7)配列番号 14で表される塩基配列力もなる RNA;
(8)配列番号 14で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(9)配列番号 15で表される塩基配列力もなる RNA；
(10)配列番号 15で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA； (11)配列番号 16で表される塩基配列力もなる RNA;
(12)配列番号 16で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(13)配列番号 17で表される塩基配列力もなる RNA;
(14)配列番号 17で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(15)配列番号 18で表される塩基配列力もなる RNA;
(16)配列番号 18で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(17)配列番号 19で表される塩基配列力もなる RNA;
(18)配列番号 19で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(19)配列番号 20で表される塩基配列力 なる RNA;
(20)配列番号 20で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素を抑制す る活性を有する RNA;
(21)配列番号 21で表される塩基配列力 なる RNA；
(22)配列番号 21で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(23)配列番号 22で表される塩基配列力 なる RNA；
(24)配列番号 22で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA； (25)配列番号 23で表される塩基配列力もなる RNA；
(26)配列番号 23で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(27)配列番号 24で表される塩基配列力 なる RNA；
(28)配列番号 24で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(29)配列番号 25で表される塩基配列力もなる RNA；
(30)配列番号 25で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(31)配列番号 26で表される塩基配列力もなる RNA;
(32)配列番号 26で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(33)配列番号 27で表される塩基配列力 なる RNA；
(34)配列番号 27で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(35)配列番号 28で表される塩基配列力もなる RNA；
(36)配列番号 28で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(37)配列番号 29で表される塩基配列力もなる RNA；
(38)配列番号 29で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA； (39)配列番号 30で表される塩基配列力 なる RNA；
(40)配列番号 30で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(41)配列番号 31で表される塩基配列力 なる RNA；
(42)配列番号 31で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(43)配列番号 32で表される塩基配列力 なる RNA;
(44)配列番号 32で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(45)配列番号 33で表される塩基配列力もなる RNA;
(46)配列番号 33で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(47)配列番号 34で表される塩基配列力 なる RNA；
(48)配列番号 34で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(49)配列番号 35で表される塩基配列からなる RNA;
(50)配列番号 35で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(51)配列番号 85で表される塩基配列力 なる RNA;
(52)配列番号 85で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA； (53)配列番号 86で表される塩基配列力 なる RNA；
(54)配列番号 86で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(55)配列番号 87で表される塩基配列力 なる RNA;
(56)配列番号 87で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(57)配列番号 88で表される塩基配列力 なる RNA；
(58)配列番号 88で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNA；
(59)配列番号 89で表される塩基配列からなる RNA;
(60)配列番号 89で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が欠失、置換、 挿入および/または付加された塩基配列力もなり、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を 抑制する活性を有する RNAがあげられる。
[0099] 上記の（d)〜（g)および（7)〜（60)の RNAにお!/、て、（d)および（7)〜（26)はハムス ター由来の親株細胞において、（e)、 （11)、 （12)、 （23)〜（28)、 (33)〜（39)、 (41)、 (42)、 （45)、 （46)、 （51)、 （52)、 （57)および（58)はマウス由来の親株細胞において 、（f)、 (7)、 (8)、 （11)、 (12)、 (19)、 (20)、 (23)〜(26)、 (33)、 （34)、 （39)〜(42)、 ( 49)、 (50)、 (55)および (56)はラット由来の親株細胞において、 (g)、（23)〜（26)、 ( 29)〜（34)、 （37)、 （38)、 （43)、 (44)、 (47)、 （48)、 （53)、 （54)、 (59)および（60)はヒ ト由来の親株細胞において、 α 1,6-フコース修飾酵素の機能を抑制する RNAとして 使用することが好ましい。
[0100] 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列とは、 例えば配列番号 14〜37、 57、 58、 85〜89のいずれかで示される塩基配列中で 1 または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列をいう。塩 基が欠失、置換、挿入および/または付加された結果生じる 2本鎖 RNAは、一方の鎖 にのみ塩基が欠失、置換、挿入および/または付加されていてもよぐ即ち、該 2本鎖 RNAは、本発明の効果が得られる範囲において、必ずしも完全な相補鎖でなくてもよ い。
[0101] また、本発明は N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミン の 6位にフコースの 1位が oc結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RN Aに対応する DNAとその相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合 成に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAまたは細 胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を 抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含む DNA、および該 DNAを含有す るベクターに関する。
[0102] 本発明の N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対 応する DNAとその相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関 与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAまたは細胞内糖 ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含む DNAとしては、 α 1 ,6-フコース修飾酵素 の活性または発現を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNA、および細胞内 糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の活性または発現を抑制する R NAに対応する DNAとその相補 DNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴ ルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性または発現を抑制する RNAに対応する DN Aとその相補 DNAを含む DNAであれば、いかなる DNAも包含され、好ましくは α 1 ,6- フコース修飾酵素の活性または発現を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DN A、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の活性または 発現を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含む、 DNAがあげられ、さら に好ましくは、 a 1 ,6-フコース修飾酵素の活性または発現を抑制する RNAに対応す る DNAとその相補 DNA、および GDP-マンノース変換酵素の機能を抑制する RNAに 対応する DNAとその相補 DNAを含む DNAがあげられる。
[0103] 本発明のベクターは、上記の本発明の N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N- ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素 の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチ ド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとそ の相補 DNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与 する蛋白質の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含む DNAを含 んで ヽれば!ヽかなるベクターでもよ!/、。
[0104] 本発明のベクターとしては、例えば、市販の siRNA発現ベクターに、上記の N-グリコ シド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその 相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機 能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含む DNAを組み込み構築してもよい。
[0105] 本発明のベクターとしては、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチル ダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を 抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAをそれぞれ独立したプロモーターで転 写されるようにベクターに組み込み、さらに細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合 成に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAまたは細 胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を 抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAをそれぞれ独立したプロモーターで転 写されるように該ベクターに組み込み、一つのベクターとしても作製してもよいが、 2 本鎖 RNAを形成させやすくするために、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を抑制する R NAに対応する DNAとその相補 DNAとをリンカ一配列で連結した DNAを構築し、該 DN Aを独立したプロモーターで転写されるようにベクターに組み込み、さらに細胞内糖ヌ クレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する D NAとその相補 DNAとをリンカ一で連結した DNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フ コースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAに対応する DN Aとその相補 DNAとをリンカ一で連結した DNAを構築し、該 DNAを独立したプロモー ターで転写されるようにベクターに組み込み、一つのベクターとして作製するのが好 ましい。
[0106] また、上記の、 α 1,6-フコース修飾酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとそ の相補 DNAとをリンカ一配列で連結した DNAおよび細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコ ースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNA とをリンカ一で連結した DNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体へ の輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAと をリンカ一で連結した DNAを一つのプロモーター下に挿入して 1本の連続した RNAに 転写されるようにベクターに組み込んでもよ 、。
[0107] 二つの独立したプロモーターは、同種のプロモーターでも異なる種類のプロモータ 一でもよぐ二つの独立したプロモーターの向きは同方向でも、逆方向でもよい。本 発明のベクターにおける二つの独立したプロモーターは、異なる種類のプロモーター が同方向に配置されるのが好ま 、。
プロモーターとしては、親株細胞で機能することができるプロモーターであれば、い 力なるものでも用いることができ、例えば、動物細胞を親株細胞として用いる場合に は、 U6プロモーター、 HIプロモーター、 tRNAプロモーターなどのポリメラーゼ III系の プロモーターなどが用いられる。
[0108] リンカ一に用いられる塩基配列としては、 2本鎖 RNAの形成に用いられる配列であ れば 、かなるものでもよぐ RNAとその相補鎖 RNAとが 2〜10塩基程度のループを介 して連結され、 2本鎖 RNAが形成される、ヘアピン型 siRNAを発現させることが可能な 配列が好ましい。
« 1,6-フコース修飾酵素の機能を抑制する RNAおよびその相補 RNAにそれぞれ対 応する DNAおよびその相補 DNAをリンカ一配列で連結した DNAとしては、具体的に は、配列番号 90、 91、 94および 95でそれぞれ表される塩基配列力 選ばれる DNA があげられる。
[0109] 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNA およびその相補 RNAにそれぞれ対応する DNAおよびその相補 DNAをリンカ一配列 で連結した DNAとしては、 GDP-マンノース変換酵素の機能を抑制する RNAおよびそ の相補 RNAにそれぞれ対応する DNAおよびその相補 DNAをリンカ一配列で連結し た DNAが好まし!/、。 GDP-マンノース変換酵素の機能を抑制する RNAおよびその相 補 RNAにそれぞれ対応する DNAおよびその相補 DNAをリンカ一配列で連結した DN Aとしては、具体的には、配列番号 92、 93および 96でそれぞれ表される塩基配列か ら選ばれる DNAがあげられる。
[0110] 本発明のベクターとしては、 α 1,6-フコース修飾酵素の機能を抑制する RNAおよび その相補 RNAにそれぞれ対応する DNAおよびその相補 DNAをリンカ一配列で連結 した DNAおよび細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を 抑制する RNAおよびその相補 RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴル ジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAおよびその相補 RNAにそれ ぞれ対応する DNAおよびその相補 DNAをリンカ一配列で連結した DNAは、導入する 親株細胞の由来の動物種ごとに有効な組み合わせを選択して用いることが好まし 、 。具体的には、親株細胞がハムスター由来である場合には、配列番号 90で表される DNAおよび配列番号 92で表される DNAの組み合わせ、または配列番号 91で表され る DNAおよび配列番号 92で表される DNAの組み合わせが好適に用いられる。
[0111] 親株細胞がマウス由来である場合には、配列番号 90で表される DNAおよび配列番 号 93で表される DNAの組み合わせ、または配列番号 91で表される DNAおよび配列 番号 93で表される DNAの組み合わせが好適に用いられる。
親株細胞がヒト由来である場合には、配列番号 94で表される DNAおよび配列番号 96で表される DNAの組み合わせ、または配列番号 95で表される DNAおよび配列番 号 96で表される DNAの組み合わせなどがあげられる。
[0112] 本発明のベクターが導入された細胞も、本発明の細胞に包含される。
また、上記の Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6 位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに 対応する DNAとその相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に 関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAまたは細胞内 糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制 する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを、それぞれ独立した 2種類のベクターに 導入した後、これら 2種類のベクターが共導入された細胞も、本発明の細胞に包含さ れる。
[0113] 本発明の細胞は、フコース修飾のない糖鎖構造を有する、生理活性の高い糖蛋白 質を製造することができる。すなわち、本発明は、親株細胞が生産する糖蛋白質より 生理活性の高い糖蛋白質の製造法を提供できる。
フコース修飾のな!ヽ糖鎖構造を有することで高!、生理活性を示す代表的な糖蛋白 質としては、フコース修飾のない糖鎖構造を有することで受容体との親和性が向上す る糖蛋白質、血中の半減期が向上する糖蛋白質、血中投与後の組織分布が変化す る糖蛋白質、薬理活性発現に必要な蛋白質との相互作用が向上する糖蛋白質など があげられる。
[0114] したがって、本発明において糖蛋白質としては、親株細胞で生産した場合、その産 生蛋白質の糖鎖構造にフコースの修飾がある糖蛋白質であれば 、かなる糖蛋白質 も含有される。その具体的な例としては、抗体、エリスロポイエチン、トロンボポイエチ ン、組織型プラスミノーゲンァクチベータ、プロゥロキナーゼ、トロンボモジュリン、アン チトロンビン III、プロテイン 、血液凝固因子 VII、血液凝固因子 VIII、血液凝固因子 I X、血液凝固因子 X、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子 (EGF )、肝細胞増殖因子 (HGF)、ケラチノサイト増殖因子、ァクチビン、骨形成因子、幹細 胞因子 (SCF)、インターフェロン α、インターフェロン 13、インターフェロン γ、インタ 一ロイキン 2、インターロイキン 6、インターロイキン 10、インターロイキン 11、可溶'性イン ターロイキン 4受容体、腫瘍壊死因子 at、 DNaseI、ガラクトシダーゼ、 ocダルコシダー ゼ、ダルコセレブロシダーゼなどがあげられる。
[0115] フコース修飾のない糖鎖構造を有することで、その生理活性が大幅に上昇する糖 蛋白質のより具体的な例としては、例えば、抗体組成物があげられる。
すなわち、本発明の細胞は、親株細胞が生産する抗体組成物より、高い ADCC活 性を有する抗体組成物を生産することができる。
また、本発明の細胞は、抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシ ド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンとフコースが結合 して!/、な 、糖鎖の割合が、親株細胞よりも高!、抗体組成物を生産することができる。 [0116] 本発明において、抗体組成物とは、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有す る抗体分子を含有する組成物を ヽぅ。
抗体は、重鎖および軽鎖（以下、それぞれ「H鎖」および「L鎖」と表記する）の 2種類 のポリペプチド鎖がそれぞれ 2分子ずつ会合した 4量体である。 H鎖の N末端側の約 4 分の 1と L鎖の N末端側の約 2分の 1 (それぞれ 100余アミノ酸）は可変領域 (以下、「V 領域」と表記する)と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。 V領域 以外の部分の大半は定常領域 (以下、「C領域」と表記する）と呼ばれる。抗体分子は C領域の相同性により IgG、 IgM、 IgA、 IgD、 IgEの各クラスに分類される。
[0117] また IgGクラスは C領域の相同性により、さらに IgGl〜IgG4のサブクラスに分類される
H鎖は N末端側より抗体 H鎖 V領域 (以下、 VHと表記する）、抗体 H鎖 C領域 1 (以下 、 CH1と表記する）、抗体 H鎖 C領域 2 (以下、 CH2と表記する）、抗体 H鎖 C領域 3 (以 下、 CH3と表記する）の 4つのィムノグロブリンドメインに分かれ、 CH1と CH2の間には ヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、 CH1と CH2とが区切られる。 ヒンジ領域以降の CH2と CH3からなる構造単位は Fc領域と呼ばれ、 N-グリコシド結合 型糖鎖が結合している。また、この領域は、 Fcレセプター、補体などが結合する領域 である (免疫学イラストレイテッド原書第 5版、 2000年 2月 10日発行、南江堂版、抗体 工学入門、 1994年 1月 25日初版、地人書館)。
[0118] 抗体などの糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、ァスパラギンと結 合する糖鎖 (N-グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（0-ダリ コシル結合糖鎖）の 2種類に大別される。 N-グリコシド結合糖鎖は、以下の化学式 1 に示される構造式 (I)のような基本となる共通のコア構造を有する [生物化学実験法 2 3—糖蛋白質糖鎖研究法 (学会出版センター)高橋禮子編 (1989年) ]。
[0119] [化 1]
°3 Man β 1 *-4GlcNAc β 1 ·- 4GicNAc
Figure imgf000055_0001
Man a 1 構造式 （ 1 ) [0120] 上記構造式 (I)にお 、て、ァスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側 を非還元末端という。
N-グリコシド結合糖鎖としては、上記構造式 (I)のコア構造を有するものであれば 、 かなるものでもよ 、が、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するノ、ィマン ノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース -N-ァセチルダルコサミン (以下、 Ga卜 GlcNAcと表記する）の枝を並行して 1ないしは複数本有し、更に Ga卜 GlcNAcの 非還元末端側にシアル酸、バイセクティングの N-ァセチルダルコサミンなどの構造を 有するコンプレックス型 (複合型）、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコ ンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
[0121] 抗体分子の Fc領域には、 N-グリコシド結合糖鎖が 1ケ所ずつ結合する領域を有して いるので、抗体 1分子あたり 2本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合する N-ダル コシド結合糖鎖としては、前記構造式 (I)で示されるコア構造を含む ヽかなる糖鎖も 包含されるので、抗体に結合する 2本の N-ダルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組 み合わせが存在することになる。
[0122] したがって、本発明にお 、て、 GDP-マンノース変換酵素の機能を抑制する RNAを 導入した細胞を用いて製造した抗体組成物、または N-グリコシド結合複合型糖鎖還 元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に 関与する酵素の機能を抑制する RNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの 合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコ ースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAを導入した細胞 を用いて製造した抗体組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖 鎖構造を有する抗体分子から構成されて!ヽてもよ!ヽし、複数の異なる糖鎖構造を有 する抗体分子から構成されて!ヽてもよ ヽ。
[0123] 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち 、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合して ヽな 、糖鎖の割合（ 以下、「本発明の糖鎖の割合」と表記する）とは、該組成物中に含まれる Fc領域に結 合する全ての N-グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端の N-ァ セチルダルコサミンにフコースが結合して ヽな 、糖鎖の数が占める割合を!、う。 [0124] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結 合していない糖鎖とは、フコースが、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセ チルダルコサミンに α結合していない糖鎖をいう。具体的には、フコースの 1位力 - グリコシド結合複合型糖鎖の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位に a結合して ヽな ヽ糖鎖 があげられる。
本発明の糖鎖の割合が高いほど、抗体組成物の ADCC活性が高くなる。 ADCC活 性が高い抗体組成物としては、本発明の糖鎖の割合が、好ましくは 20%以上、より好 ましくは 30%以上、さらに好ましくは 40%以上、特に好ましくは 50%以上、最も好ましくは 100%の抗体組成物があげられる。
[0125] また、本発明は、親株細胞が生産する抗体組成物より ADCC活性が高い抗体組成 物の製造方法に関する。
本発明の糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高い場合、親株細 胞が生産する抗体組成物より高 ヽ ADCC活性を有する。
ADCC活性とは、生体内で、腫瘍細胞などの細胞表面抗原などに結合した抗体が 、抗体 Fc領域とエフェクター細胞表面上に存在する Fcレセプターとの結合を介して エフェクター細胞を活性ィ匕し、腫瘍細胞などを傷害する活性をいう [モノクローナル' アンティボディズ：プリンシプルズ*アンド ·アプリケーションズ (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley— Liss, Inc., Capter 2.1 (1995)]。エフェクター細胞 としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性ィ匕されたマクロファージなどがあ げられる。
[0126] N-グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子を含有する組成物中に 含まれる、糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合して 、な 、糖 鎖の割合は、抗体分子力 ヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法 [生物化学 実験法 23—糖タンパク質糖鎖研究法 (学会出版センター)高橋禮子編 (1989) ]を用 い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、標識した 糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊 離させた糖鎖を HPAED- PAD法 [ジャーナル'ォブ'リキッド'クロマトグラフィー（J. Liq . Chromatogr.) , 6, 1577 (1983) ]によって分析することによつても決定することができ る。
[0127] 抗体分子としては、抗体の Fc領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。
具体的には、抗体、抗体の断片、 Fc領域を含む融合蛋白質などがあげられる。
抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリド 一マ細胞が分泌する抗体のほかにも、遺伝子組換え技術により作製された抗体、す なわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより 取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイプリドーマが生産する抗体、ヒト 化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
[0128] ハイプリドーマは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得された B細胞と、マウ ス、ラットなどに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特 異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型 CDR移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体 VHおよび抗体 L鎖 V領域 (以下、 VLと表 記する）とヒト抗体の H鎖 C領域 (以下、 CHと表記する）およびヒト抗体の L鎖 C領域 (以 下、 CLと表記する）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット 、ノ、ムスター、ラビットなど、ハイプリドーマを作製することが可能であれば、いかなるも のも用いることができる。
[0129] ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するノ、イブリドーマより、 VHおよび V Lをコードする cDNAを取得し、ヒト抗体 CHおよびヒト抗体 CLをコードする遺伝子を有 する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構 築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体の CHとしては、ヒトイムノグロブリン (以下、「hlg」と表記する）に属す ればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、更に hlgGクラスに属す る hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。ま た、ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよぐ κクラスある いはえクラスのものを用！/、ることができる。
[0130] ヒト型 CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配 列をヒト抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいう。 ヒト型 CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR配列を任意の ヒト抗体の VHおよび VLの CDR配列に移植した V領域をコードする cDNAを構築し、ヒ ト抗体の CHおよびヒト抗体の CLをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現べクタ 一にそれぞれ挿入してヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを 宿主細胞へ導入することによりヒト型 CDR移植抗体を発現させ、製造することができる
[0131] ヒト型 CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよいが、 hlgGク ラスのものが好適であり、更に hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といつ たサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型 CDR移植抗体の CLとしては 、 hlgに属すればいかなるものでもよぐ κクラスあるいはえクラスのものを用いることが できる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、 細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリ 一ならびにヒト抗体トランスジエニック動物あるいはヒト抗体トランスジエニック植物から 得られる抗体なども含まれる。
[0132] ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EBウィルスなど を感染させ不死化、クローユングすることにより、該抗体を生産するリンパ球を培養で き、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリ一は、ヒト B細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝 子に挿入することにより Fab、一本鎖抗体などの抗体断片をファージ表面に発現させ たライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性 を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収 することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、 2本の完全な H鎖 および 2本の完全な L鎖力もなるヒト抗体分子へも変換することができる。
[0133] ヒト抗体トランスジヱニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物 をいう。具体的には、マウス胚性幹細胞ヘヒト抗体遺伝子を導入し、該胚性幹細胞を 他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体を産生するトランスジェ ニック非ヒト動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導 入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体を産生するトランスジエニック非ヒト動物を 作製することもできる。ヒト抗体を産生するトランスジヱニック非ヒト動物からのヒト抗体 の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われて 、るハイプリドーマ作製方法 によりヒト抗体ハイプリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を蓄積させるこ とがでさる。
[0134] トランスジエニック非ヒト動物は、ゥシ、ヒッジ、ャギ、ブタ、ゥマ、マウス、ラット、ニヮト リ、サルまたはゥサギなどがあげられる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるい は炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗 体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウィルスあるいは細菌感 染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましぐ抗体のクラスは IgGが好まし い。
[0135] 抗体の断片は、上記抗体の Fc領域を含んだ断片 ヽぅ。抗体の断片としては、上記 抗体の Fc領域を含んだ断片であればいかなるものでもよいが、具体的には、 H鎖の 単量体、 H鎖の 2量体などがあげられる。
Fc領域を有する融合蛋白質としては、抗体の Fc領域を含んだ抗体あるいは抗体断 片と、酵素、サイト力インなどの蛋白質とを融合させた物質であればいかなるものでも よい。
[0136] 以下、本発明を詳細に説明する。
1.本発明の細胞の作製
(l) GDP-マンノース変換酵素の機能を抑制する RNAを導入した細胞の作製 本発明の GDP-マンノース変換酵素の機能を抑制する RNAを導入した細胞は、例 えば、以下のようにして作製することができる。
[0137] GDP-マンノース変換酵素の cDNAあるいはゲノム DNAを調製する。
調製した cDNAあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。
決定した DNAの配列に基づき、 GDP-マンノース変換酵素をコードする部分ある ヽ は非翻訳領域の部分を含む適当な長さの RNAi遺伝子のコンストラクトを設計する。 該 RNAi遺伝子を細胞内で発現させるために、調製した DNAの断片、または全長を 適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、糸且換えベクターを 作製する。
[0138] 該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより形 質転換体を得る。
導入した GDP-マンノース変換酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表 面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞 を得ることができる。
[0139] 宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とする GDP- マンノース変換酵素の遺伝子を有して 、るものであれば 、ずれも用いることができる 。具体的には、後述の 2.に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組み込みが可能で、設計した RNAi遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含 有しているものが用いられる。具体的には、ポリメラーゼ IIIにより転写が行われるタイ プの発現ベクターある 、は後述の 2.に記載の発現ベクターがあげられる。
[0140] 各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の 2.に記載の各種宿主細胞に適した 組換えベクターの導入方法を用いることができる。
GDP-マンノース変換酵素の cDNAおよびゲノム DNAを取得する方法としては、例え ば、以下に記載の方法があげられる。
[0141] cDNAの調製方法
各種宿主細胞力ゝら全 RNAまたは mRNAを調製する。
調製した全 RNAまたは mRNAから cDNAライブラリーを作製する。
GDP-マンノース変換酵素の既知アミノ酸配列、例えばヒトの該酵素のアミノ酸配列 、に基づいて、デジエネレイティブプライマーを作製し、作製した cDNAライブラリーを 铸型として PCR法にて、 GDP-マンノース変換酵素をコードする遺伝子断片を取得す る。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、 cDNAライブラリーをスクリーニングし、 GDP-マンノース変換酵素をコードする cDNAを取得することができる。
[0142] 各種宿主細胞の mRNAは、市販の製品 (例えば Clontech社製)を用いてもょ 、し、以 下のごとく各種宿主細胞力も調製してもよ 、。各種宿主細胞から全 RNAを調製する 方法としては、チォシアン酸グァ-ジン―トリフルォロ酢酸セシウム法 [メソッズ 'イン' ェンザィモロジ一 (Methods in Enzymology), 154, 3 (1987) ]、酸性チォシアン酸グァ 二ジン ·フエノール ·クロ口ホルム (AGPC)法 [アナリティカル ·バイオケミストリー (Analyt ical Biochemistry), 162, 156 (1987) ;実験医学、 1937 (1991) ]などがあげられる。
[0143] また、全 RNA力も poly(A)+ RNAとして mRNAを調製する方法としては、オリゴ（dT)固 定ィ匕セルロースカラム法 (モレキュラー ·クロー-ング第 2版)などがあげられる。
さらに、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製）、 Quick Prep mRNA Purifi cation Kit (Pharmacia社製）などのキットを用いることにより mRNAを調製することがで きる。
[0144] 調製した各種宿主細胞 mRNAから cDNAライブラリーを作製する。 cDNAライブラリー 作製法としては、モレキユラ一'クロー-ング第 2版、カレント 'プロトコールズ 'イン'モ レキユラ^ ~ ·バイオロジー、 A Laboratory Manual, 2 nd Ed. (1989)などに記載された方 法、あるいは市販のキット、例えば Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis a nd Plasmid Cloning (Life Technologies社製）、 ZAP- cDNA Synthesis Kit (STRATAGE NE社製)を用いる方法などがあげられる。
[0145] cDNAライブラリーを作製するためのクローユングベクターとしては、大腸菌 K12株中 で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクターなどいずれで も使用できる。具体的には、 ZAP Express [STRATAGENE社製、ストラテジーズ (Strate gies), 5, 58 (1992) ]、 pBluescript II SK(+) [ヌクレイツク'アシッド 'リサーチ (Nucleic Aci ds Research), 17, 9494 (1989) ]、 Lambda ZAP II (STRATAGENE社製）、 λ gtl0、 λ g ti l [ディーェヌエ^ ~ ·クロー-ング 'ァ 'プラクティカル 'アプローチ (DNA cloning, A Pr actical Approach), 1, 49 (1985)]、 L TriplEx (Clontech社製）、 L ExC ell (Pharmacia社 製）、 PT7T318U (Pharmacia社製）、 pcD2 [モレキュラ^ ~ ·セルラ^ ~ ·バイオロジー (Mol. Cell. Biol), 3, 280 (1983) ]および pUC18 [ジーン (Gene), 33, 103 (1985) ]などをあげ ることがでさる。
[0146] cDNAライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれ でも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、 Escherichia coli XLl-Blue MRF' [STRATAGENE社製、ストラテジーズ (Strategies), 5, 81 (1992)] 、 Escherichiacoli C600 [ジヱネテイクス (Genetics), 39, 440 (1954) ]、 Escherichia coliY 1088 [サイエンス (Science), 222, 778 (1983) Ί、 Escherichia coliYl 090「サイエンス (Scie nce), 222, 778 (1983) 1、 Escherichia coliNM522「ジャーナル，ォブ，モレキユラ ~ ·ノ ィォロジー (J. Mol. Biol), 166, 1 (1983) Ί、 Escherichia coli K802 [ジャーナル'ォブ' モレキュラ^ ~ ·バイオロジー (J. Mol. Biol), 16, 118 (1966) Ίおよび Escherichia coli TM 105 [ジーン (Gene), 38, 275 (1985) ]などが用いられる。
[0147] この cDNAライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもょ 、が、不完全長 cDNA の割合を下げ、なるべく完全長 cDNAを効率よく取得するために、菅野らが開発した オリゴキャップ法 [ジーン (Gene), 138, 171 (1994)；ジーン (Gene), 200, 149 (1997) ; 蛋白質核酸酵素， 41, 603 (1996) ;実験医学， U, 2491 (1993)； cDNAクローニング（ 羊土社) (1996)；遺伝子ライブラリーの作製法 (羊土社)（1994) ]を用いて調製した cD NAライブラリーを以下の解析に用いてもょ 、。
[0148] GDP-マンノース変換酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードする ことが予測される塩基配列の 5'端および 3'端の塩基配列に特異的なデジエネレイティ ブプライマーを作製し、作製した cDNAライブラリーを铸型として PCR法 [ピーシーア一 ル.プロトコールズ (PCR Protocols), Academic Press (1990)]を用いて DNAの増幅を 行うことにより、 GDP-マンノース変換酵素をコードする遺伝子断片を取得することが できる。
[0149] 取得した遺伝子断片が GDP-マンノース変換酵素をコードする DNAであることは、通 常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー (Sanger)らのジデォキシ法 [プロ シーディングス 'ォブ ·ザ'ナショナル 'アカデミ^ ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977) ]あるいは ABI PRISM377 DNAシークェンサ一（PE Bios ystems社製)などの塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することが できる。
[0150] 該遺伝子断片を DNAプローブとして、各種宿主細胞に含まれる mRNAから合成した cDNAある!/、は cDNAライブラリ一対してコ口-一ハイブリダィゼーションゃプラークハ イブリダィゼーシヨン（モレキユラ一'クロー-ング第 2版）を行うことにより、 GDP-マンノ ース変換酵素の cDNAを取得することができる。
また、 GDP-マンノース変換酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いた プライマーを用い、各種宿主細胞に含まれる mRNAから合成した cDNAあるいは cDN Aライブラリーを铸型として、 PCR法を用いてスクリーニングを行うことにより、 GDP-マ ンノース変換酵素の cDNAを取得することもできる。
[0151] 取得した GDP-マンノース変換酵素をコードする DNAの塩基配列を末端から、通常 用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー (Sanger)らのジデォキシ法 [プロシ 一ディングス 'ォブ 'ザ ·ナショナル 'アカデミ^ ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sc i. U.S.A.), 74, 5463 (1977) ]あるいは ABI PRISM 377DNAシークェンサ一（PE Biosys tems社製)などの塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該 DNAの塩基配 列を決定する。
[0152] 決定した cDNAの塩基配列をもとに、 BLASTなどの相同性検索プログラムを用いて 、 GenBank、 EMBLおよび DDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、 データベース中の遺伝子の中で GDP-マンノース変換酵素をコードしている遺伝子を 決定することちできる。
また、上記の方法で得られる GDP-マンノース変換酵素をコードして 、る遺伝子の 塩基配列としては、例えば、配列番号 8〜： L0のいずれかに記載の塩基配列があげら れる。
[0153] 決定された DNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン •エルマ一社の DNA合成機 model 392などの DNA合成機で化学合成することにより、 GDP-マンノース変換酵素の cDNAを取得することもできる。
GDP-マンノース変換酵素のゲノム DNAを調製する方法としては、例えば、以下に 記載の方法があげられる。
[0154] ゲノム DNAの調製方法
ゲノム DNAを調製する方法としては、モレキュラー ·クローユング第 2版やカレント · プロトコールズ.イン.モレキユラ一.バイオロジーなどに記載された公知の方法があげ られる。また、ゲノム DNAライブラリースクリーニングシステム（Genome Systems社製） や Universal GenomeWalker™Kits (CLONTECH社製）などを用いることにより、 GDP— マンノース変換酵素のゲノム DNAを単離することもできる。
GDP-マンノース変換酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては 、例えば、以下の方法があげられる。
[0155] 形 転椽体を撰 する 法
GDP-マンノース変換酵素の活性が低下した細胞を選択する方法としては、文献 [ 新生化学実験講座 3—糖質 I,糖タンパク質 (東京化学同人)日本生化学会編 (1988)] 、文献 [細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ,グライコバイオロジー実験プロトコ ール,糖タンパク質 ·糖脂質 ·プロテオダリカン (秀潤社製)谷口直之 ·鈴木明美 ·古川 清.菅原一幸監修（1996) ]、モレキュラー 'クローユング第 2版、カレント.プロトコール ズ'イン'モレキュラー 'バイオロジーなどに記載された生化学的な方法あるいは遺伝 子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的 な基質を用いて酵素活性を測定する方法があげられる。遺伝子工学的な方法として は、例えば、 GDP-マンノース変換酵素の遺伝子の mRNA量を測定するノーザン解析 や RT- PCR法などがあげられる。
[0156] また、 GDP-マンノース変換酵素の活性が低下した結果生じる形質の変化を指標に 細胞を選択する方法としては、例えば、産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として 形質転換体を選択する方法や、細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形 質転換体を選択する方法などがあげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標と して形質転換体を選択する方法としては、後述の 5.に記載の方法があげられる。細 胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が ひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法をあげること ができる。その具体的な例としては、ソマテイク'セル 'アンド'モレキュラー'ジエネティ タス (Somatic Cell Mol. Genet.), 12, 51 (1986)などに記載のレクチンを用いた方法が あげられる。
[0157] レクチンとしては、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N—ァセチルダルコサミンの 6 位とフコースの 1位が a結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレク チンでも用いることができる力 好ましくはレンズマメレクチン LCA (Lensculinaris 来 の Lentil Agglutinin)エンドゥマメレクチン PSA (Pisum sativum由来の Pea Lectin)、ソラ マメレクチン VFA (Vicia 由来の Agglutinin)、ヒィロチャワンタケレクチン AAL (Aleu riaaurantia由来の Lectin)など; ^あげられる。
[0158] 具体的には、 10 μ g/ml〜10mg/ml、好ましくは 0.5〜2mg/mlの濃度の上述のレクチ ンを含む培地に 1日〜2週間、好ましくは 3日〜1週間培養し、生存している細胞を継 代培養あるいはコロニーを採取後、別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含 む培地で培養を続けることで、本発明の細胞を選択することができる。
GDP-マンノース変換酵素の遺伝子の mRNA量を抑制するための RNAi遺伝子は、 常法または DNA合成機を用いることにより調製することができる。
[0159] RNAi遺伝子のコンストラクトは、 [ネイチヤー (Nature), 391, 806 (1998)；プロシーデ イングス'ォブ 'ザ ·ナショナル ·アカデミ^ ~ ·ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. US A), 95, 15502 (1998) ;ネイチヤー (Nature), 395, 854 (1998) ;プロシーディングス 'ォ ブ ·ザ.ナショナル .ァ力デミ一 ·ォブ.サイエンス (proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 504 9 (1999) ;セル (Cell), 95, 1017 (1998)；プロシーディングス 'ォブ 'ザ'ナショナル'ァ 力デミ一'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451 (1999)；プロシー ディングス 'ォブ 'ザ ·ナショナル 'アカデミ^ ~ ·ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959 (1998) ;ネイチヤ^ ~ ·セル'バイオォロジ一 (Nature Cell Biol), 2, 70 (2000) ]などの記載に従って設計することができる。
[0160] また、発現ベクターを用いず、 GDP-マンノース変換酵素の塩基配列に基づいて設 計した 2本鎖 RNAを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を得ることもで きる。
2本鎖 RNAは、常法または RNA合成機を用いることにより調製することができる。具 体的には、 GDP-マンノース変換酵素の cDNAおよびゲノム DNAの相補 RNA塩基配 列のうち、 10〜40塩基、好ましくは 10〜30塩基、より好ましくは 15〜30塩基に相当す る配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補 ことで調製することができる。該オリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは 、それぞれ独立に合成してもよいし、 2本鎖 RNA形成に支障のないようなスぺーサー ヌクレオチドでつながれて 、てもよ 、。
[0161] オリゴヌクレオチドとしては、オリゴ RNAおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体 (以下、 オリゴヌクレオチド誘導体と ヽぅ）などがあげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が ホスフォロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド 中のリン酸ジエステル結合が Ν3'-Ρ5'ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌク レオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド 核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C-5プロピ-ルゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中 のゥラシルが C-5チアゾールゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴ ヌクレオチド中のシトシンが C-5プロピ-ルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘 導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-mo dified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボ ースが 2し0-プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ある 、はオリゴ ヌクレオチド中のリボースが 2しメトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチ ド誘導体などがあげられる [細胞工学， 16, 1463 (1997) ]0
[0162] (2) a 1,6-フコース修飾酵素の機能を抑制する RNA、および GDP-フコース合成酵素 の機能を抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸 送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAを導入した細胞の作製
本発明の a 1,6-フコース修飾酵素の機能を抑制する RNA、および GDP-フコース合 成酵素の機能を抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体 への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAを導入した細胞の作製方法を、 a 1,6-フコース修飾酵素の機能を抑制する RNA、および GDP-フコース合成酵素の 機能を抑制する RNAを導入した細胞を例として以下に説明する力 a 1,6-フコース 修飾酵素の機能を抑制する RNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴル ジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAを導入した細胞も同様にし て作製することができる。
[0163] a 1,6-フコース修飾酵素および GDP-フコース合成酵素の cDNAあるいはゲノム DN Aを調製する。
調製した cDNAあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。
決定した DNAの配列に基づき、 a 1 ,6-フコース修飾酵素および GDP-フコース合成 酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さの RNAi遺伝子 のコンストラクトを設計する。
[0164] 該 RNAi遺伝子を細胞内で発現させるために、調製した DNAの断片、または全長を 適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、糸且換えベクターを 作製する。
該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより形 質転換体を得る。
導入した α 1 ,6-フコース修飾酵素または GDP-フコース合成酵素の活性、あるいは 産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選 択することで、本発明の細胞を得ることができる。
[0165] 宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とする ex 1 ,6- フコース修飾酵素の遺伝子と GDP-フコース合成酵素の遺伝子とを有しているもので あればいずれも用いることができる。具体的には、後述の 2.に記載の宿主細胞があ げられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組み込みが可能で、設計した RNAi遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含 有しているものが用いられる。具体的には、ポリメラーゼ IIIにより転写が行われるタイ プの発現ベクターある 、は後述の 2.に記載の発現ベクターがあげられる。
[0166] 各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の 2.に記載の各種宿主細胞に適した 組換えベクターの導入方法を用いることができる。
α 1 ,6-フコース修飾酵素または GDP-フコース合成酵素の cDNAおよびゲノム DNA は、例えば、本項（1)に記載の方法と同様にして取得することができる。
« 1 ,6-フコース修飾酵素または GDP-フコース合成酵素の活性を指標として形質転 換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
[0167] 形 転椽体を撰 する 法 a 1,6-フコース修飾酵素または GDP-フコース合成酵素の活性が低下した細胞を 選択する方法としては、上記（1)に記載の生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な 方法などが用いられる。
また、 a 1,6-フコース修飾酵素または GDP-フコース合成酵素の活性が低下した結 果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、上記（1)に記載の方法 などが用いられる。
[0168] a 1,6-フコース修飾酵素または GDP-フコース合成酵素の遺伝子の mRNA量を抑制 するための RNAi遺伝子は、常法または DNA合成機を用いることにより調製することが できる。
RNAi遺伝子のコンストラクトは、上記（1)の記載の方法と同様にして設計することが できる。
また、発現ベクターを用いず、 a 1,6-フコース修飾酵素の塩基配列に基づいて設 計した 2本鎖 RNAおよび GDP-フコース合成酵素の塩基配列に基づ 、て設計した 2本 鎖 RNAを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を得ることもできる。
2本鎖 RNAは、上記（1)に記載の方法と同様にして調製することができる。
[0169] 2.抗体組成物を例とした糖蛋白質の製造方法
抗体組成物の製造を例に、本発明の細胞を用いた糖蛋白質の製造方法を示す。 抗体組成物は、モレキユラ一'クロー-ング第 2版、カレント'プロトコールズ 'イン'モ レゃュフ ~~ 'ノヽィォロン1 ~~、 Antioodies, A Laboratory manual, Cold bpnng Haroor La boratory, 1988 (以下、アンチボディズと略す）、 Monoclonal Antibodies: principles an d practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (以下、モノクローナルアンチボディズと 略す)、 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University
Press, 1996 (以下、アンチボディエンジニアリングと略す)などに記載された方法を用 い、例えば、以下のように本発明の細胞中で発現させて取得することができる。
[0170] 抗体分子の cDNAを調製する。
調製した抗体分子の全長 cDNAをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする 部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。
該 DNA断片、または全長 cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷 入することにより、組換えベクターを作製する。
[0171] 該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより、 抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
本発明において、抗体組成物の製造方法に用いられる宿主細胞としては、上記 1. で作製した本発明の細胞であって、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、目 的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる力 好ましくは 動物細胞があげられる。
[0172] 抗体分子の Fc領域に結合する N-グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を遺伝 子工学的な手法を用いて導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などの細 胞を宿主細胞として用いることもできる。
発現ベクターとしては、上記各種宿主細胞にお!、て自立複製可能な!/、しは染色体 中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードする DNAを転写できる位置にプ 口モーターを含有して 、るものが用いられる。
[0173] cDNAは、上記 1.に記載の「cDNAの調製方法」に従 、、ヒトまたは非ヒト動物の組 織または細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマーを用いて調製 することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEP13 (ATC C37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)などをあげることができる。
[0174] プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用い てもよく、例えば、へキソースキナーゼなどの解糖系の遺伝子のプロモーター、 PH05 プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 gal 1プロ モーター、 gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、 MF a 1プロモータ 一、 CUP 1プロモーターなどをあげることができる。
[0175] 宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイべ口ミセス属、ト リコスポロン属、シュヮ-ォミセス属などに属する酵母、例えば、 Saccharomvcescerevi siae、 achizosaccharomvcespombe. Kluyveromvces lactis. nchosporonpullulans、 acn wanniomvcesalluviusなと あげ。こと力できる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であれば 、ずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [メソッズ 'ェンザィモロジ一 (Me thods. EnzymoL), 194, 182 (1990) ]、スフエロプラスト法 [プロシーディングス'ォブ'ザ •ナショナル 'ァ力デミ一'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 84, 1929 (1 978) ]、酢酸リチウム法 [ジャーナル'ォブ 'バタテリォロジ一 (J. Bacteriology) ,153, 16 3 (1983) ]、プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイエンスの oc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 75, 1929 (1978) ]に記載の方法などをあげることができ る。
[0176] 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pcD M8 (フナコシ社より巿販）、 pAGE107 [特開平 3- 22979 ;サイトテクノロジー (Cytotechno logy), 3, 133 (1990) ]、 pAS3- 3 [特開平 2- 227075]、 pCDM8 [ネイチヤー (Nature), 329 , 840 (1987) ]、 pcDNAI/Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pAGE103 [ ジャーナル'ォブ 'バイオケミストリー 0. Biochemistry),息， 1307 (1987) ]、 pAGE210 などをあげることができる。
[0177] プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、メタ口チォネインプロモ 一ター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーターなどをあげることができる。また 、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ!、。
[0178] 宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、 NM- F9細胞、 PER.
C6細胞、サルの細胞である COS細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO 細胞、 HBT5637 (特開昭 63- 299)、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリ アンノヽムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などをあげることができる。 組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytote chnology), 3, 133 (1990) ]、リン酸カルシウム法 [特開平 2-227075]、リポフエクシヨン 法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイエンス (Proc. Natl . Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987) ]、インジェクション法 [Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pres s (1994) (以下、マ-ピュレーティング'マウス'ェンブリオ第 2版と略す) ]、パーテイク ルガン (遺伝子銃）を用いる方法 [特許第 2606856、特許第 2517813]、 DEAE-デキス トラン法 [バイオマ-ユアルシリーズ 4一遺伝子導入と発現 ·解析法 (羊土社)横田崇' 新井賢一編（1994) ]、ウィルスベクター法 [マ-ピュレーティング 'マウス'ェンブリオ 第 2版]などをあげることができる。
[0179] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント 'プロトコールズ'イン'モレ =Τュフ ~~ 'ノヽィォロン ~~ Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、 ノィ才/了ゥ, 、ノ. ~~ (Bio/ Technology) , 6, 47 (1988)などに記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して 昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィルスを昆虫細胞 に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
[0180] 該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、例えば、 pVL1392、 pVLl 393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogen社製）などをあげることができる。
バキュロウィルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるアウトグ ラファ 'カリフオル-力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウィルス (Autographa californica nu clear polyhedrosis virusノなどを用 ヽること力 Sでさ 。
[0181] 昆虫細朐 しては、 Spodoptera fruriDerdaの卵巢細朐である S19、 Sf21 [カレント 'プロ トコ ~~ノレズ ·イン'モレ = ュフ ~~ 'ノ ィォロン ~~ Baculovirus Expression Vectors, A Laoo ratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992) ]、 Trichoplusianiの 卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社製)などを用いることができる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法 (特開平 2 -227075)、リポフエクシヨン法 [プロシーディングス 'ォブ ·ザ'ナショナル'ァカデミ一' ォブ ·サイエンス (proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987) ]などをあげることが できる。
[0182] 植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 Ήプラス ミド、タバコモザイクウィルスベクターなどをあげることができる。 プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用い てもよく、例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV)の 35Sプロモーター、イネァク チン 1プロモーターなどをあげることができる。
[0183] 宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファ ルファ、イネ、コムギ、ォォムギなどの植物細胞などをあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム (Agrobacterium) [特開昭 59-140 885、特開昭 60-70080、 WO94/00977] ,エレクト口ポレーシヨン法 [特開昭 60-251887 ]、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法 [日本特許第 2606856、 日本特許第 25 17813]などをあげることができる。
[0184] 抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー ·クローユング第 2 版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現などを行うことができ る。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生 成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。 形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に 従って行うことができる。
[0185] 酵母などの真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該 生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効 率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の!/ヽずれを用いてもょ ヽ。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース、 スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物などの炭 水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコー ル類などを用いることができる。
[0186] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含 窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、力 ゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消 化物などを用いることができる。
[0187] 無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫 酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム などを用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養 温度は 15〜40°Cがよぐ培養時間は、通常 16時間〜 7日間である。培養中の pHは 3 〜9に保持する。 pHの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カル シゥム、アンモニアなどを用いて行う。
[0188] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地 に添カ卩してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた糸且換えベクターで形質転換した 酵母を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例 えば、 k£プロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するとき にはイソプロピル- j8 -D-チォガラタトピラノシドなどを、 1mプロモーターを用いた組換 えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはインドールアクリル酸などを培地 に添カ卩してもよい。
[0189] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れて 、る RPMI 1640培地 [ザ ·ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン'メディカル ·ァソシエイ シヨン (The Journal of the American Medical Association),塑， 519 (1967) ]、 Eagleの MEM培地 [サイエンス (Science) 501 (1952) ]、ダルベッコ改変 MEM培地邊 [ヴュ ゥロロジー (Virology), 8, 396 (1959) ]、 199培地 [プロシーデイング'ォブ ·ザ'ソサイエ ティ 'フォア'ザ 'バイオロジカノレ'メディスン (Proceeding of the Society for the Biologic al Medicine), 73, 1 (1950) ]、 Whitten培地 [発生工学実験マニュアル-トランスジェ-ッ ク ·マウスの作り方 (講談社)勝木元也編（1987)ほたはこれら培地に牛胎児血清など を添加した培地などを用いることができる。
[0190] 培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%CO存在下などの条件下で 1〜7日間行う。フ
2
エドバッチ培養、ホロファイバー培養などの培養法を用いて 1日〜数ケ月培養を行うこ とちでさる。 また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添 カロしてちょい。
[0191] 昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM- FH培地（Pharmingen社製）、 Sf- 900 II SFM培地（Life Technologies社 製）、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製）、 Grace's Insect Medium [ネイチヤー (Nature), 195, 788 (1962) ]などを用いることができる。
培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°Cなどの条件下で、 1〜5日間行う。
[0192] また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシンなどの抗生物質を培地に添加してもよ い。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているムラシゲ'アンド'スターグ (MS)培地、ホワイト (White)培地、またはこ れら培地にオーキシン、サイトカイニンなど、植物ホルモンを添カ卩した培地などを用い ることがでさる。
[0193] 培養は、通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシンなどの抗生物質を培地 に添カ卩してもよい。
上記のとおり、抗体分子をコードする DNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有す る酵母、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従つ て培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することによ り、抗体組成物を製造することができる。
[0194] 抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分 泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細 胞ゃ、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる 抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソン らの方法 [ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー 0. Biol. Chem.), 264, 17619 (1989)]、ロウらの方法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ · サイエンス (proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 8227 (1989) ;ジーン'デベロップメント (Genes Develop.), 4, 1288 (1990) ]、または特開平 05-336963、特開平 06-823021な どに記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌 させることがでさる。
[0195] すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードする DNA、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードする DNAを挿入し 、該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させることにより、目的 とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子などを用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0196] さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分ィ匕させることにより、遺伝子 が導入された動物個体 (トランスジエニック非ヒト動物)または植物個体 (トランスジェ- ック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育また は栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成 物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
[0197] 動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法 [ァメリ カン'ジャーナノレ'ォブ 'クリニ力ノレ'二ユートリシヨン (American Journal of Clinical Nutri tion), 63, 639S (1996) ;アメリカン 'ジャーナル'ォブ 'タリ-カル'ニュートリシヨン (Ame rican Journal of Clinical Nutrition), 63, 627S (1996) ;バイオ/テクノロジー (Bio/Tec hnology), 9, 830 (1991) ]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗 体組成物を生産する方法があげられる。
[0198] 動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードする DNAを導入したトランスジェ-ッ ク非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成 ·蓄積させ、該動物中より抗体 組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成' 蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭 63-309192)、卵などをあげること ができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであれば いずれも用いることができる力 例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターである α力 ゼインプロモーター、 j8カゼインプロモーター、 j8ラクトグロブリンプロモーター、ホェ 一酸性プロテインプロモーターなどが好適に用いられる。
[0199] 植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコード する DNAを導入したトランスジエニック植物を公知の方法 [組織培養， 20(1994);組織 培養， 21 (1995) ;トレンド'イン'バイオテクノロジー (Trends in Biotechnology), 15, 45 (1997) ]に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成 ·蓄積させ、該植物中より該 抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
[0200] 抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物 は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、 細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプ レス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミルなどにより細胞を破砕し、無細胞抽 出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵 素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒に よる沈殿法、ジェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA-75 (三菱 化学 (株）製）などレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF (Pharmacia社）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセフ ァロース、フエ-ルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分 子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシン グ法、など電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独あるいは組み合わせ て用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
[0201] また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回 収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収 する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を 希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と 同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
[0202] 抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物を回収す ることができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離などの手法により処理する ことにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用い ることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体の Fc 領域を有する融合蛋白質などをあげることができる。
[0203] 以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒトイ匕抗体および Fc融合蛋白 質の組成物の製造方法につ!、て記すが、他の抗体組成物などの糖蛋白質にっ 、て も上述の方法および当該方法に準じて取得することもできる。
[0204] A.ヒト化抗体組成物の製造
(1)ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子が組み 込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体の CH および CLをコードする遺伝子をそれぞれクローユングすることにより構築することがで きる。
[0205] ヒト抗体の C領域としては、任意のヒト抗体の CHおよび CLであることができ、例えば 、ヒト抗体の H鎖の IgGlサブクラスの C領域（以下、「hC y 1」と表記する）およびヒト抗 体の L鎖の κクラスの C領域 (以下、「hC κ」と表記する）などがあげられる。
ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子としてはェキソンとイントロン力も成る染 色体 DNAを用いることができ、また、 cDNAを用いることもできる。
[0206] 動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組込み 発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、 pAGE107 [サ イトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990) ]、 pAGE103 [ジャーナル'ォブ 'バイ オケミストリー (J. Biochem.), 101, 1307 (1987) ]、 pHSG274 [ジーン (Gene), 27, 223 (19 84) ]、 pKCR [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイエンス（ Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 78, 1527 (1981) ]、 pSGl j8 d2- 4 [サイトテクノロジー (C ytotechnology), 4, 173 (1990) ]などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いる プロモーターとェンハンサ一としては、 SV40の初期プロモーターとェンハンサー [ジャ 一ナル'ォブ'バイオケミストリー 0. Biochem.),皿， 1307 (1987) ]、モロ-一マウス白 血病ウィルスの LTR [バイオケミカル ·アンド ·バイオフィジカル ·リサーチ ·コミュニケ一 シヨンズ (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960 (1987) ]、免疫グロブリン H鎖 のプロモーター [セル (Cell), 41, 479 (1985) ]とェンハンサー [セル (Cell), 33, 717 (19 83) ]などがあげられる。
[0207] ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体 H鎖および L鎖が別々のベクター上に存在する タイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ (以下、タンデム型と表記する）の どちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞 への導入の容易さ、動物細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現量のバランスが均衡 するなどの点力もタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい [ジャーナ ル'ォブ'ィムノロジカル'メソッズ (J. Immunol. Methods), 167, 271 (1994) ]0
[0208] 構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR移植抗体 の動物細胞での発現に使用できる。
(2)ヒト以外の動物の抗体の V領域をコードする cDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは以 下のようにして取得することができる。
[0209] 目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞より mRNAを抽出し、 cDNAを合成 する。合成した cDNAをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローユングして cD NAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体の C領域部分或い は V領域部分をプローブとして用い、 VHをコードする cDNAを有する組換えファージ 或いは組換えプラスミドおよび VLをコードする cDNAを有する組換えファージ或いは 組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目 的のマウス抗体の VHおよび VLの全塩基配列を決定し、塩基配列より VHおよび VLの 全アミノ酸配列を推定する。
[0210] ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ノ、ムスター、ゥサギなど、ハイプリドーマ細胞 を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ノ、イブリドーマ細胞力も全 RNAを調製する方法としては、チォシアン酸グァ-ジン一 トリフルォロ酢酸セシウム法 [メソッズ'イン'ェンザィモロジ一 (Methods in EnzymoL), 154, 3 (1987) ]、また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、オリゴ (dT)固定ィ匕セ ルロースカラム法 [モレキュラ^ ~ ·クロー-ング：ァ ·ラボラトリ^ ~ ·マニュアル (Molecular し loning: A Laboratory Manual), し old Spring Harbor Lab. Press New York (1989) ]な どがあげられる。また、ハイプリドーマ細胞力も mRNAを調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pha rmacia社製)などがあげられる。
[0211] cDNAの合成および cDNAライブラリ一作製法としては、常法 [モレキユラ一'クロー- ング：ァ'ラボラトリー 'マ-ユアノレ (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Sp ring Harbor Lab. Press New York (1989)；カレント 'プロトコールズ 'イン'モレキュラー 'ノィ才ロン ~~ (Current Protocols in MolecularBiology) , Supplement 1—34]、或 ヽ【ま 巿販のキット、 f列えば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmi d Cloning (GIBCO BRL社製）や ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製）を用いる 方法などがあげられる。
[0212] cDNAライブラリーの作製の際、ハイプリドーマ細胞カゝら抽出した mRNAを铸型として 合成した cDNAを組み込むベクターは、該 cDNAを組み込めるベクターであれば!/、か なるものでも用いることができる。例えば、 ZAP Express [ストラテジーズ (Strategies), 5, 58 (1992)]、 pBluescript II SK(+) [ヌクレイツク'ァシッズ 'リサーチ (Nucleic Acids Rese arch), 17, 9494 (1989) ]、 λ ZAPII (Stratagene社製）、 gtl0、え gtl l [ディーェヌェ 一.クロー-ング：ァ 'プラクティカル.アプローチ (DNA Cloning: A Practical Approach ), I, 49 (1985) ]、 Lambda BlueMid (Clontech社製）、 λ ExCell, pT7T3 18U (Pharmaci a社製）、 pcD2 [モレキユラ一'アンド'セルラ一'バイオロジー (Mol. Cell. Biol), 3, 280 (1983) ]および pUC18 [ジーン (Gene), 33, 103 (1985) ]などが用いられる。
[0213] ファージ或いはプラスミドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入する大 腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、発現および維持できるものであれば 、かな るものでも用いることができる。例えば、 XL1- Blue MRF' [ストラテジーズ (Strategies), 5, 81 (1992) ]、 C600 [ジェネティックス (Genetics), 39, 440 (1954) ]、 Y1088、 Y1090 [サ ィエンス (Science), 222, 778 (1983) ]、 NM522 [ジャーナル'ォブ 'モレキュラ^ ~ ·バイオ ロジー 0. Mol. Biol), 166, 1 (1983) ]、 K802 [ジャーナル'ォブ 'モレキユラ一'バイオ ロジー 0. Mol. Biol), 16, 118 (1966) ]および JM105 [ジーン (Gene), 38, 275 (1985) ] などが用いられる。
[0214] cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAク ローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコ口- 一'ハイブリダィゼーシヨン法またはプラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法 [モレキュラー 'クロー-ング：ァ 'ラボラトリー 'マ-ユアノレ (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Lab. Press NewYork (1989) ]により選択することができる。また 、プライマーを調製し、 mRNAから合成した cDNA或いは cDNAライブラリーを铸型とし て、 Polymerase Chain Reaction [以下、 PCR法と表記する；モレキュラ^ ~ ·クロー-ング ： , ·フホフトリ ~~ 'マ-ュ /ノレ (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989 ;カレント'プロトコールズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイ ォロジ一 (Current Protocols in Molecular Biology), Supplement 1—34]により VHおよ び VLをコードする cDNAを調製することもできる。
[0215] 上記方法により選択された cDNAを、適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript S K (-) (Stratagene社製)などのプラスミドにクローユングし、通常用いられる塩基配列解 析方法、例えば、サンガー（Sanger)らのジデォキシ法 [プロシーディンダス 'ォブ ·ザ' ナショナル 'ァ力デミ一 ·ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.), 74, 5463 (19 77) ]などの反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、 A. L. F. DNAシークェン サー（Pharmacia社製)などを用いて解析することで該 cDNAの塩基配列を決定するこ とがでさる。
[0216] 決定した塩基配列から VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体の VH および VLの全アミノ酸配列 [シーケンシズ ·ォブ ·プロテインズ ·ォブ ·ィムノロジカル · インタレスト (Sequences of Proteins of Immunologicallnterest), Ub Dept. Health ana Human Services (1991) ]と比較することにより、取得した cDNAが分泌シグナル配列を 含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することが できる。
[0217] (3)ヒト以外の動物の抗体の V領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列に関しては、既 知の抗体の VHおよび VLの全アミノ酸配列 [シーケンシズ ·ォブ ·プロテインズ ·ォブ · ィムノロン力ノレ 'インタレスト (Sequences of Proteins oflmmunological Interest), US Dep t. Health and Human Services, 1991]と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ および N末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知るこ とができる。また、 VHおよび VLの各 CDRのアミノ酸配列についても、既知の抗体の V Hおよび VLのアミノ酸配列 [シーケンシズ ·ォブ ·プロテインズ ·ォブ ·ィムノロジカル · インタレスト (Sequences of Proteins of Immunological Interest), Ub Dept. Health and Human Services (1991) ]と比較することによって見出すことができる。
[0218] (4)ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項 2の（1)に記載のヒトイ匕抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコード する遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAをクロ 一ユングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外 の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを、ヒト以外の動物の抗体 VHおよび VLの 3'末端側の塩基配列とヒト抗体の CHおよび CLの 5'末端側の塩基配列とから成 り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成 DNAとそれぞれ連結し、そ れぞれを本項 2の（1)に記載のヒトイ匕抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CL をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクロー-ングし、ヒト 型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
[0219] (5)ヒト型 CDR移植抗体の V領域をコードする cDNAの構築
ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは、以下のようにして構築す ることができる。まず、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRを移植する ヒト抗体の VHおよび VLのフレームワーク（以下、 FRと表記する）のアミノ酸配列を選 択する。ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のもので あれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、 Protein Data Bankなどのデー タベースに登録されて 、るヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列、ヒト抗体の V Hおよび VLの FRの各サブグループの共通アミノ酸配列 [シーケンシズ 'ォブ 'プロティ ンズ，ォブ，ィムノロン ノレ'インタレスト (Sequences of Proteins of Immunological Inter est), US Dept. Health and Human Services (1991) ]などがあげられるが、その中でも 、十分な活性を有するヒト型 CDR移植抗体を作製するためには、 目的のヒト以外の動 物の抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性 (少なくとも 60% 以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ま 、。 [0220] 次に、選択したヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物 の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列を移植し、ヒト型 CDR移植抗体の VHお よび VLのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配 列に見られるコドンの使用頻度 [シーケンシズ'ォブ'プロテインズ'ォブ'ィムノロジカ ル'インタレスト (Sequences of Proteins of Immunological Interest), Ub Dept. Health a nd Human Services, 1991]を考慮して DNA配列に変換し、ヒト型 CDR移植抗体の VH および VLのアミノ酸配列をコードする DNA配列を設計する。設計した DNA配列に基 づき、 100塩基前後の長さから成る数本の合成 DNAを合成し、それらを用いて PCR法 を行う。この場合、 PCRでの反応効率および合成可能な DNAの長さから、 H鎖、 L鎖と も 6本の合成 DNAを設計することが好ま 、。
[0221] また、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入す ることで、本項 2の（1)で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローユングす ることができる。 PCR後、増幅産物を pBluescript SK(-) (Stratagene社製）などのプラス ミドにクロー-ングし、本項 2の（2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒ ト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列をコードする DNA配列を有するプラ スミドを取得する。
[0222] (6)ヒト型 CDR移植抗体の V領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型 CDR移植抗体は、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのみを ヒト抗体の VHおよび VLの FRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外 の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られて 、る [バイオ/テクノロジー (BIO/ TECHNOLOGY), 9, 266 (1991) ]。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体の V Hおよび VLでは、 CDRのみならず、 FRのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間 接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基が CDRの移植に伴い、ヒト 抗体の VHおよび VLの FRの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられてい る。この問題を解決するため、ヒト型 CDR移植抗体では、ヒト抗体の VHおよび VLの FR のアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基や CDRのアミ ノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関 与して 、るアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるァ ミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われて！/ヽる [バイ ォ /テクノロジー (BIO/TECHNOLOGY), 9, 266 (1991) ]。
[0223] ヒト型 CDR移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わる FRのァミノ 酸残基を如何に効率よく同定するか力 最も重要な点であり、そのために X線結晶解 析 [ジャーナル'ォブ 'モレキュラ^ ~ ·バイオロジーお. Mol. Biol), 112, 535 (1977) ]或 いはコンピューターモデリング [プロテイン'エンジニアリング (Protein Engineering), 7, 1501 (1994) ]などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら 抗体の立体構造の情報は、ヒト型 CDR移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたら して来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型 CDR移植抗体の作製法は 未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体につ!、て数種の改変体を作製し、 それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸残基の改変は、改変用合成 DNAを用いて本 項 2の（5)に記載の PCR法を行うことにより、達成できる。 PCR後の増幅産物について 本項 2の（2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、 目的の改変が施されたことを 確認する。
[0224] (7)ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターの構築
本項 2の（1)に記載のヒトイ匕抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコード する遺伝子の上流に、本項 2の（5)および (6)で構築したヒト型 CDR移植抗体の VH および VLをコードする cDNAをクローユングし、ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構 築することができる。例えば、本項 2の（5)および (6)でヒト型 CDR移植抗体の VHおよ び VLを構築する際に用いる合成 DNAのうち、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に 適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項 2の（1)に記載のヒト化抗体発現 用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形 で発現するようにクロー-ングし、ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築することが できる。
[0225] (8)ヒト化抗体の安定的生産
本項 2の (4)および（7)に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入 することによりヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR移植抗体 (以下、併せてヒト化抗体と 称す)を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒトイ匕抗体発現ベクターの導入法としては、エレクト口ポレーシヨン法 [ 特開平 2- 257891;サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3 ,133 (1990) ]などがあげら れる。
[0226] ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、上記 1.で作製した、本発明 の細胞であって、ヒトイヒ抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細 胞でち用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞である NS0細胞、 SP2/0細胞、チャイニーズハム スター卵巣細胞 CHO/dhfr-細胞、 CHO/DG44細胞、ラットミエローマ YB2/0細胞、 IR 983F細胞、シリアンハムスター腎臓由来である BHK細胞、ヒトミエローマ細胞であるナ マルバ細胞などがあげられる力 好ましくは、チャイニーズノヽムスター卵巣細胞である CHO/DG44細胞、ラットミエローマ YB2/0細胞などがあげられる。
[0227] ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転 ·は、特 開平 2-257891に開示されている方法に従い、 G418 sulfate (以下、 G418と表記する； SIGMA社製)などの薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培 養用培地としては、 RPMI1640培地（日水製薬社製)、 GIT培地（日本製薬社製)、 EX - CELL302培地（JRH社製）、 IMDM培地（GIBCO BRL社製）、 Hybridoma- SFM培地（ GIBCO BRL社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、 FBSと表記する）などの 各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転 を培地 中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上 清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法 [以下、 ELISA法 と表記する；アンティボディズ：ァ 'ラボラトリ一'マニュアル (Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1998)、モノクローナル 'アンテ イボディズ：プリンシプルズ'アンド ·プラクティス (Monoclonal Antibodies: Principles an d Practice), Academic Press Limited (1996) ]などにより測定できる。また、形質転換 株は、特開平 2-257891に開示されている方法に従い、 DHFR遺伝子増幅系などを利 用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。 [0228] ヒト化抗体は、形質転 ·の培養上清よりプロテイン Aカラムを用いて精製すること ができる [アンティボディズ：ァ 'ラボラトリ^ マニュアル (Antibodies: A Laboratory Ma nual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8 (1988)、モノクローナル 'アンティポ ディズ：プリンシプルズ'アンド'プラクティス (Monoclonal Antibodies: Principles and Pr actice), Academic Press Limited (1996) ]0また、その他に通常、蛋白質の精製で用 いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグ ラフィーおよび限外濾過などを組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒ ト化抗体の H鎖、 L鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳 動 [以下、 SDS- PAGEと表記する；ネイチヤー (Nature), 227, 680 (1970) ]やウェスタン ブロッテイング法 [アンティボディズ：ァ.ラボラトリ一.マニュアル (Antibodies: A Labora tory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12 (1988)、モノクローナノレ' アンティボディズ：プリンシプルズ'アンド ·プラクティス (Monoclonal Antibodies: Princip les and Practice), Academic Press Limited (1996) ]などで測定することができる。
[0229] B. Fc融合蛋白質の製造
(1) Fc融合蛋白質発現用ベクターの構築
Fc融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコー ドする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現べク ターにヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローユングする こと〖こより構築することができる。
[0230] ヒト抗体の Fc領域としては、 CH2と CH3領域を含む領域のほ力、ヒンジ領域、 CH1の 一部が含まれるものも包含される。また CH2または CH3の少なくとも 1つのアミノ酸が 欠失、置換、付加または挿入され、 Fe y受容体への結合活性を有するものであれば いかなるものでもよい。
ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはェキソンとイント ロン力も成る染色体 DNAを用いることができ、また、 cDNAを用いることもできる。それ ら遺伝子と Fc領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を铸型として、 PCR法（レ キユラ ~ ·クロー-ング第 2版；カレント ·プロトコールズ 'イン ·モレキュラ^ ~ ·バイオロジ 一， Supplement 1-34)を行うことがあげられる。 [0231] 動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組込み 発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、 pAGE107 [サ イトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990) ]、 pAGE103 [ジャーナル'ォブ 'バイ オケミストリー (J. Biochem.), 101, 1307 (1987) ]、 pHSG274 [ジーン (Gene), 27, 223 (19 84) ]、 pKCR [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイエンス ( Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 78, 1527 (1981)]、 pSGl β d2- 4 [サイトテクノロジー (C ytotechnology), 4, 173 (1990)]などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いる プロモーターとェンハンサ一としては、 SV40の初期プロモーターとェンハンサー [ジャ 一ナル'ォブ'バイオケミストリー 0. Biochem.), 101, 1307 (1987) ]、モロ-一マウス白 血病ウィルスの LTR [バイオケミカル ·アンド ·バイオフィジカル ·リサーチ ·コミュニケ一 シヨンズ (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960 (1987)]、免疫グロブリン H鎖の プロモーター [セル (Cell), 41, 479 (1985) ]とェンハンサー [セル (Cell), 33, 717 (1983 ) ]などがあげられる。
[0232] (2)ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする DNAの取得
ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする DNAは以下のようにして取得 することができる。
目的の Fcと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織より mRNAを抽出し、 cDN Aを合成する。合成した cDNAをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローニン グして cDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、 目的の蛋白質の遺伝子配 列部分をプローブとして用い、 目的の蛋白質をコードする cDNAを有する組換えファ 一ジ或 、は組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の 目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
[0233] ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ノ、ムスター、ゥサギなど、細胞や組織を摘出 することが可能であれば、 、かなるものも用いることができる。
細胞や組織力も全 RNAを調製する方法としては、チォシアン酸グァ-ジン-トリフル ォロ酢酸セシウム法 [メソッズ.イン.ェンザィモロジ一 (Methods in EnzymoL), 154, 3 ( 1987)]、また全 RNA力 mRNAを調製する方法としては、オリゴ (dT)固定化セルロース カラム法（モレキュラー 'クローユング第 2版）などがあげられる。また、細胞や組織か ら mRNAを調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製）、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製）などがあげられる。
[0234] cDNAの合成および cDNAライブラリ一作製法としては、常法（モレキユラ一'クロー ユング第 2版；カレント'プロトコールズ ·イン ·モレキュラ^ ~ ·バイオロジー， Supplement 1-34)、或いは市販のキット、例えば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synth esis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製）や ZAP— cDNA Synthesis Kit (Stratagene 社製)を用いる方法などがあげられる。
[0235] cDNAライブラリーの作製の際、細胞や組織力ゝら抽出した mRNAを铸型として合成し た cDNAを組み込むベクターは、該 cDNAを組み込めるベクターであれば!/、かなるも のでも用いることができる。例えば、 ZAP Express [ストラテジーズ (Strategies), 5, 58 (1 992) ]、 pBluescript II SK(+) [ヌクレイツク'ァシッズ 'リサーチ (Nucleic Acids Research), 17, 9494 (1989) ]、 λ ΖΑΡΠ (Stratagene社製）、 gtl0、 I gtl l [ディーェヌェ一'クロ 一-ング：ァ'プラクティカル ·アプローチ (DNA Cloning: A Practical Approach), I, 49 (1985) ]、 Lambda BlueMid (Clontech社製)、 λ ExCell, pT7T3 18U(Pharmacia社製)、 pcD2 [モレキユラ一'アンド'セルラ一'バイオロジー (Mol. Cell. Biol), 3, 280 (1983) ] および pUC18 [ジーン (Gene), 33, 103 (1985) ]などが用いられる。
[0236] ファージ或いはプラスミドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入する大 腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、発現および維持できるものであれば 、かな るものでも用いることができる。例えば、 XL1- Blue MRF' [ストラテジーズ (Strategies), 5, 81 (1992) ]、 C600 [ジェネティックス (Genetics), 39, 440 (1954) ]、 Y1088、 Y1090 [サ ィエンス（Science), 222, 778 (1983) ]、 NM522 [ジャーナル'ォブ 'モレキュラ^ ~ ·バイ ォロジ一 (J. Mol. Biol), 166, 1 (1983) ]、 K802 [ジャーナル'ォブ 'モレキユラ一'バイ ォロジ一 (J. Mol. Biol), 16, 118 (1966) ]および JM105 [ジーン (Gene), 38, 275 (1985) ]などが用いられる。
[0237] cDNAライブラリーからの目的の蛋白質をコードする cDNAクローンの選択法としては 、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー 'ハイブリダィゼーシヨン 法或いはプラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法（モレキュラー 'クローユング第 2版）によ り選択することができる。また、プライマーを調製し、 mRNAから合成した cDNA或いは cDNAライブラリーを铸型として、 PCR法により目的の蛋白質をコードする cDNAを調製 することちでさる。
[0238] 目的の蛋白質をヒト抗体の Fc領域と融合させる方法としては、 PCR法があげられる。
例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の 5'側と 3'側に任意の合成オリゴ DNA (プライマ 一)を設定し、 PCR法を行い PCR産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体の Fc領 域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、 PCR産物を得る。このとき、 融合させる蛋白質の PCR産物の 3'側と Fc領域の PCR産物の 5'側には同じ制限酵素 部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分 周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いる ことで変異を導入する。得られた 2種類の PCR断片を用いてさらに PCRを行うことで、 両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーシヨンするこ とでち連結することがでさる。
[0239] 上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、 pBluesc ript SK (-) (Stratagene社製）などのプラスミドにクローユングし、通常用いられる塩基 配列解析方法、例えばサンガー (Sanger)らのジデォキシ法 [プロシーディンダス 'ォ ブ ·ザ'ナショナル ·アカデミ^ ~·ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5 463 (1977) ]あるいは ABI PRISM 377DNAシークェンサ一（PE Biosystems社製）など の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該 DNAの塩基配列を決定するこ とがでさる。
決定した塩基配列力 Fc融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配 列と比較することにより、取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む Fc融合蛋白質の 完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
[0240] (3) Fc融合蛋白質の安定的生産
本項 2の Bの（1)項に記載の Fc融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入 することにより Fc融合蛋白質を安定に生産する形質転 ·を得ることができる。
[0241] 動物細胞への Fc融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクト口ポレーショ ン法 [特開平 2- 257891;サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990) ]などがあ げられる。 Fc融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、上記 1.で作製した、本 発明の細胞であって、 Fc融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、 V、かなる細胞でも用いることができる。
[0242] 具体的には、マウスミエローマ細胞である NS0細胞、 SP2/0細胞、チャイニーズハム スター卵巣細胞 CHO/dhfr-細胞、 CHO/DG44細胞、ラットミエローマ YB2/0細胞、 IR 983F細胞、シリアンハムスター腎臓由来である BHK細胞、ヒトミエローマ細胞であるナ マルバ細胞などがあげられる力 好ましくは、チャイニーズノヽムスター卵巣細胞である CHO/DG44細胞、ラットミエローマ YB2/0細胞などがあげられる。
[0243] Fc融合蛋白質発現ベクターの導入後、 Fc融合蛋白質を安定に生産する形質転換 株は、特開平 2-257891に開示されている方法に従い、 G418などの薬剤を含む動物 細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地（ 日水製薬社製)、 GIT培地（日本製薬社製)、 EX- CELL302培地 (JRH社製)、 IMDM 培地（GIBCO BRL社製）、 Hybridoma- SFM培地（GIBCO BRL社製）、またはこれら培 地に牛胎児血清などの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られ た形質転 ·を培地中で培養することで培養上清中に Fc融合蛋白質を生産蓄積さ せることができる。培養上清中の Fc融合蛋白質の生産量および抗原結合活性は ELI SA法などにより測定できる。また、形質転換株は、特開平 2-257891に開示されている 方法に従い、 dhfr遺伝子増幅系などを利用して Fc融合蛋白質の生産量を上昇させる ことができる。
[0244] Fc融合蛋白質は、形質転 ·の培養上清よりプロテイン Aカラムやプロテイン Gカラ ムを用いて精製することができる（アンチボディズ， Chapter 8、モノクローナル 'アンテ イボディズ)。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用する ことができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などを 組み合わせて行い、精製することができる。精製した Fc融合蛋白質分子全体の分子 量は、 SDS- PAGE [ネイチヤー (Nature), 227, 680 (1970) ]やウェスタンブロッテイング 法（アンチボディズ， Chapter 12、モノクローナル 'アンティボディズ）などで測定するこ とがでさる。
[0245] 以上、動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、上述したように、酵母、 昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造することがで きる。
既に、宿主細胞が抗体分子などの糖蛋白質を発現する能力を有している場合には
、前記 1.に記載の方法を用いて宿主細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培 養物から目的とする糖蛋白質を精製することにより、糖蛋白質を製造することができる
[0246] 3.糖蛋白質の活性評価
精製した糖蛋白質の蛋白量、受容体との親和性、血液中での半減期、血液投与後 の組織への分布、あるいは薬理活性発現に必要な蛋白質相互作用の変化を測定す る方法としては、カレント'プロトコールズ'イン'プロテイン 'サイエンス (Current Protoc ols In Protein Science), John Wiley & Sons Inc., (1995)、日本生化学会編新生化学 実験講座 19動物実験法,東京化学同人（1991)、日本生化学会編新生化学実験講 座 8細胞内情報と細胞応答，東京化学同人（1990)、日本生化学会編新生化学実 験講座 9ホルモン Iペプチドホルモン，東京化学同人（1991)、実験生物学講座 3アイ ソトープ実験法，丸善株式会社（1982)、モノクローナル 'アンチボディーズ (Monoclon al Antibodies), Principles and Applications, Wiley— Liss, Inc., (1995)、酵素免投 SU定 法第 3版，医学書院（1987)、改訂版酵素抗体法，学際企画（1985)などに記載の公 知の方法を用いることができる。
[0247] その具体的な例としては、精製した糖蛋白質をラジオアイソトープなどの化合物で 標識し、標識した糖蛋白質の受容体あるいは相互作用をする蛋白質との結合反応の 強さを定量的に測定する方法があげられる。また、 Biacore社の BIAcoreシリーズなど の各種装置を用いて、蛋白質蛋白質相互作用を測定することもできる [ジャーナル- ォブ'ィムノロジカル.メソッド (J. Immnunol. Methods), 145, 229 (1991)、実験医学別 冊バイオマ-ユアル UPシリーズ蛋白質の分子間相互作用実験法，羊土社（1996) ]
[0248] 標識した糖蛋白質を体内に投与することで、血液中での半減期あるいは血液投与 後の組織への分布を知ることができるが、標識体の検出には、標識物質を検出する 方法と検出の対象となる糖蛋白質特異的な抗体抗原反応を組み合わせた系が好ま しい。
4.抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合性あるいはエフェクター機能を測定 する方法としては、モノクローナルアンチボディズあるいはアンチボディエンジニアリ ングなどに記載の公知の方法を用いることができる。
[0249] その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗 原陽性培養細胞株に対する結合活性は ELISA法および蛍光抗体法 [キャンサー'ィ ムノロジ^ ~ ·ィムノセラピー (Cancer Immunol. Immunother.), 36, 373 (1993) ]などによ り測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、 CDC活性、 ADCC活 性などを測定することにより、評価することができる [キャンサー'ィムノロジー 'ィムノセ フピ ~~ (し ancer Immunol. Immunother.), 3D, 373 (1993) ]。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、力-クイザルなどのヒトに比較的 近 、動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
[0250] 5.糖蛋白質の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた糖蛋白質の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解 祈に準じて行うことができる。例えば、抗体組成物の場合、 IgG分子に結合している糖 鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、 N-ァセチルダルコサミンなど のァミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖 鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析などの手法を用いて行うことができる。
以下に、抗体組成物の糖鎖の分析方法を具体的に示すが、他の糖蛋白質も同様 に分析することができる。
[0251] (1)中性糖'アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルォロ酢酸などで、糖鎖の酸加水分解を行う ことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。 具体的な方法として、 Dionex社製糖組成分析装置 (BioLC)を用いる方法があげら れる。 BioLし ί^ΗΡΑΕし— PAD (high performance anion— exchange chromatography— pul sed amperometric detection)法 [ジャーナノレ ·ォブ ·リキッド ·クロマトグラフィー 0丄 iq.C hromatogr.), 6. 1577 (1983) ]によって糖組成を分析する装置である。 また、 2-アミノビリジンによる蛍光標識ィ匕法でも組成比を分析することができる。具体 的には、公知の方法 [ァグリカルチュラル 'アンド'バイオロジカル ·ケミストリー (Agruc. Biol.Chem.), 55(1},283-284 (1991) ]に従って酸加水分解した試料を 2-アミノビリジル 化で蛍光ラベルイ匕し、 HPLC分析して組成比を算出することができる。
[0252] (2)糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、 2次元糖鎖マップ法 [アナリティカル 'バイオケミスト リー (Anal.Biochem.) , 171 .73 (1988)、生物化学実験法 23—糖蛋白質糖鎖研究法（ 学会出版センター）高橋禮子編（1989年) ]により行うことができる。 2次元糖鎖マップ 法は、例えば、 X軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、 Y 軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプ ロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法で ある。
[0253] 具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、 2-アミノビリジン（ 以下、 PAと略記する）による糖鎖の蛍光標識 [ジャーナル'ォブ 'バイオケミストリー (J. Biochem.), 95, 197 (1984) ]を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰の PAィ匕試薬など と分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて 順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、 2次元糖鎖マップ上にプロットし 、糖鎖スタンダード (TaKaRa社製）、文献 [アナリティカル 'バイオケミストリー (Anal. Bi ochem.) , m, 73 (1988) ]とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。 さらに各糖鎖の MALDI-TOF-MSなどの質量分析を行 ヽ、 2次元糖鎖マップ法によ り推定される構造を確認することができる。
[0254] 6.導入した RNAの副作用の解析
導入した RNAは、 目的とした酵素の機能を抑制する以外に相同性の高い配列を有 する遺伝子の発現量や翻訳などの影響 [ネーチヤ一'バイオテクノロジー (Nature Biot echnol), 21, 635 (2003)、プロシーデイングス'ォブ ·ザ'ナショナル 'ァ力デミ一'ォブ 'サイエンス !^. Natl. Acad. Sci. USA), 101, 1892 (2004)]が考えられるので、抗体 組成物などの糖蛋白質を製造する場合には、 RNAの導入による副作用で形質転換 株の生育または製造する糖蛋白質の発現に影響しないことを解析する必要がある。 [0255] 具体的には、抗体組成物などの糖蛋白質の発現細胞にお!、て、本発明の RNAの 導入して!/ヽな 、親株細胞と導入細胞を同時に培養し、細胞の増殖曲線および糖蛋 白質の発現量に変化が無ぐ製造された糖蛋白質の種々の性質を解析することによ つて、製造された糖蛋白質の糖鎖構造および糖鎖構造の違いに起因する生物活性 以外に違 ヽが無 ヽことを確認する。
[0256] 製造された糖蛋白質の糖鎖構造は上記 5.の方法で解析することができる。糖蛋白 質の種々の性質は、任意の公知の蛋白質の解析方法で解析することができる。蛋白 質の解析方法としては、電気泳動、ゲル濾過、等電点またはアミノ酸配列解析などの 物理化学的解析、製造された糖蛋白質が抗体の場合には抗原に対する結合性、製 造された糖蛋白質が酵素の場合には酵素活性、並びに糖蛋白質がリガンドまたは受 容体である場合にはそれぞれのリガンドまたは受容体に対する結合性などがあげら れる。
[0257] 7.糖蛋白質の利用
抗体組成物などの糖蛋白質は、フコース修飾のない糖鎖構造を有しており、例え ば、受容体との親和性の向上、血中半減期の向上、血中投与後の組織分布の改善 、または薬理活性発現に必要な蛋白質との相互作用の向上などの効果が期待でき 高い生理活性を示す。特に、抗体組成物は、高いエフェクター機能、すなわち抗体 依存性細胞障害活性を有している。これら生理活性の高い糖蛋白質、あるいは高い ADCC活性を有する抗体組成物は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなど の免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾 患の予防および治療にぉ 、て有用である。
[0258] 癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖して!/、る。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖 を抑制することを特徴とする。しかし、高い ADCC活性を有する抗体は、殺細胞効果 により癌細胞を傷害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤より も治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗 腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われているが [サイェン ス (Science),靈， 1197, (1998) ]、抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認め られれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもつながる。 [0259] 炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患にぉ 、て、それら疾患にお ける生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、 高 、ADCC活性を有する抗体を用 、て免疫細胞を除去することにより、アレルギー反 応を抑えることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテ 一テルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高い ADCC活性 を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる
[0260] ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、高 ヽ ADCC活性を有する抗体を用 いて抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防および 、治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識す る抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗 原を認識する抗体、またはウィルスある 、は細菌感染に関連する抗原を認識する抗 体の具体例を以下に述べる。
[0261] 腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗 CA125抗体、抗 17-1A抗体、抗インテグ リン α ν 3抗体、抗 CD33抗体、抗 CD22抗体、抗 HLA抗体、抗 HLA-DR抗体、抗 CD 20抗体、抗 CD19抗体、抗 EGF受容体抗体 [ィムノロジ一 ·トウディ (Immunology Today ), 21, 403 (2000) ]、抗 CD10抗体 [アメリカン 'ジャーナル'ォブ 'タリ-カル'パソロジ 一 (American Journal of Clinical Pathology), 113, 374 (2000)；プロシーディングス 'ォ ブ ·ザ.ナショナル .ァ力デミ一 ·ォブ.サイエンス (proc. Natl. Acad. Sci. USA), 79, 438 6 (1982) ]、抗 GD抗体 [アンチキャンサ ·リ
2 一 サーチ (Anticancer Res.), 13, 331 (1993 ―
) ]、抗 GD抗体 [キャンサ^ ~ ·ィムノロジ^ ~ ·ィムノセラピー (Cancer Immunol. Immunoth
3
er.)， 36, 260 (1993) ]、抗 GM抗体 [キャンサ一'リサーチ (Cancer Res.), 54, 1511 (19
― 2 ―
94) ]、抗 HER2抗体 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一'ォブ ·サイ エンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285 (1992) ]、抗 CD52抗体 [ネイチヤー (Nat ure), 332, 323 (1988) ]、抗 MAGE抗体 [ブリティッシュ 'ジャーナル'ォブ 'キャンサー（ British J. Cancer), 83, 493 (2000) ]、抗 HM1.24抗体 [モルキユラ^ ~ ·ィムノロジー (Mol ecular Immunol.), 36, 387 (1999) ]、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（PTHrP)抗体 [キ ヤンサー (Cancer), 88, 2909 (2000) ]、抗 FGF8抗体 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナ ショナル'ァ力デミ一 ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 86, 9911 (1989) ]、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗 FGF8受容体抗体 [ジャーナル，ォブ，バ ィォロジカル 'ケミストリー 0. Biol. Chem.), 265, 16455 (1990) ]、抗塩基性繊維芽細 胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体、抗インスリン様増殖因子受 容体抗体 [ジャーナル'ォブ 'ニューロサイエンス ·リサーチ (J. Neurosci. Res.), 40, 64 7 (1995) ]、抗 PMSA抗体 [ジャーナル'ォブ 'ゥロロジー (J. Urology), 160, 2396 (1998 ) ]、抗血管内皮細胞増殖因子抗体 [キャンサー 'リサーチ (Cancer Res.), 57, 4593 (1 997) ]または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体 [オンコジーン (Oncogene), 19, 2 138 (2000) ]などがあげられる。
[0262] アレルギーある 、は炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗 IgE抗体）、抗 CD23抗体、抗 CDl la抗体 [ィムノロジ^ ~ ·トウディ (Immunology Today), 21 , 403 (2000) ]、抗 CRTH2抗体 [ジャーナル.ォブ.ィムノロジー (J. Immunol), 162, 1278 (1999) ]、 抗 CCR8抗体 (W099/25734)、抗 CCR3抗体（US6207155)、抗インターロイキン 6抗体 [ィムノロジカル.レビュー (Immunol. Rev.), 127, 5 (1992) ]、抗インターロイキン 6受容 体抗体 [モルキユラ^ ィムノロジー (Molecular Immunol), 31, 371 (1994) ]、抗インタ 一ロイキン 5抗体 [ィムノロジカル 'レビュー (Immunol. Rev.), 127, 5 (1992) ]、抗インタ 一ロイキン 5受容体抗体、抗インターロイキン 4抗体 [サイト力イン (Cytokine), 3, 562 (1 991) ] ,抗インターロイキン 4受容体抗体 [ジャーナル ·ォブ ·ィムノロジカル ·メソッド 0. Immunol. Meth.), 217, 41 (1998) ]、抗腫瘍壊死因子抗体 [ハイブリドーマ (Hybridom a), 13, 183 (1994) ]、抗腫瘍壊死因子受容体抗体 [モルキユラ一'ファーマコロジー（ Molecular Pharmacol), 58, 237 (2000) ]、抗 CCR4抗体 [ネイチヤー (Nature), 400, 77 6 (1999) ]、抗ケモカイン抗体 [ジャーナル'ォブ'ィムノロジカル 'メソッド (J. Immunol. Meth.), 174, 249 (1994) ]または抗ケモカイン受容体抗体 [ジャーナル'ォブ'ェクス ペリメンタル'メデシン (J. Exp. Med.), 186, 1373 (1997) ]などがあげられる。
[0263] 循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗 GpIIb/IIIa抗体 [ジャーナ ル'ォブ 'ィムノロジー 0. Immunol), 152, 2968 (1994) ]、抗血小板由来増殖因子抗 体 [サイエンス (Science), 253, 1129 ( 1991) ]、抗血小板由来増殖因子受容体抗体 [ジ ヤーナル.ォブ.バイオロジカル.ケミストリー (j. Biol. Chem.), 272, 17400 ( 1997) ]また は抗血液凝固因子抗体 [サーキュレーション (Circulation), 101 , 1158 (2000) ]などが あげられる。
[0264] 自己免疫疾患、例えば、乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性 エリテマトーデス、多発性硬化症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己 D NA抗体 [ィムノロジ^ ~ ·レターズ (Immunol. Letters), 72, 61 (2000) ]、抗 CD 1 la抗体、 抗 ICAM3抗体、抗 CD80抗体、抗 CD2抗体、抗 CD3抗体、抗 CD4抗体、抗インテグリ ン α 4 j8 7抗体、抗 CD40L抗体、抗 IL- 2受容体抗体 [ィムノロジ一 ·トウディ (Immunolog y Today), 21 , 403 (2000) ]などがあげられる。
[0265] ウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗 gpl20抗体
[ストラクチャー (Structure), 8, 385 (2000) ]、抗 CD4抗体 [ジャーナル'ォブ 'リウマト口 ジー (J. Rheumatology), 25, 2065 ( 1998) ]、抗 CCR5抗体または抗ベロ毒素抗体 [ジャ ーナル ·ォブ 'タリ-カル 'ミクロバイオロジー 0. Clin. Microbiol), 37, 396 ( 1999) ]な どがあげられる。
[0266] 上記抗体は、 ATCC (The American Type Culture Collection)、理化学研究所細胞 開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所などの公的な機関、あるいは大日本製 薬株式会社、 R&D SYSTEMS社、 PharMingen社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社 などの民間試薬販売会社から入手することができる。
[0267] 以下に、本発明の Fc領域融合蛋白質の具体例を述べる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患に関連する結合性蛋白質と 抗体 Fc領域の融合蛋白質の具体例としては、 sTNFRIIと Fc領域との融合蛋白質であ る etanercept (USP5605690)、抗原提示細胞上に発現している LFA-3と Fc領域との融 合蛋白貧である alefacept(USP5914111)、 cytotoxic T Lymphocyte-associated antige n-4 (CTLA-4)と Fc領域との融合蛋白質 [ジャーナル'ォブ'ェクスペリメンタル'メヂス ン 0. Exp. Med.), 181 , 1869 ( 1995) ]、インターロイキン- 15と Fc領域との融合蛋白質 [ ジャーナル'ォブ 'ィムノロジー 0. Immunol), 160, 5742 ( 1998) ]、ファクター VIIと Fc領 域との融合蛋白質 [プロシーディンダス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイ エンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 98, 12180 (2001) ]、インターロイキン 10と Fc領域 との融合蛋白質 [J. Immunol, 154, 5590 (1995) ]、インターロイキン 2と Fc領域との融 合蛋白質 [ジャーナル'ォブ 'ィムノロジー (J. Immunol), 146, 915 (1991) ]、 CD40と Fc 領域との融合蛋白質 [サーグレイ (Surgery), 132, 149 (2002) ]、 Fit— 3(ftns- like tyrosin e kinase)と抗体 Fc領域との融合蛋白質 [ァクタ ·へマトロジー (Acta. Haemato.), 95, 2 18 (1996) ]および OX40と抗体 Fc領域との融合蛋白質 [ジャーナル ·ォブ ·ルーケミア •バイオロジー (J. Leu. Biol), 72, 522 (2002) ]などがあげられる。これらの他にも、各 種ヒト CD分子 [CD2、 CD30 (TNFRSF8)、 CD95 (Fas)ゝ CD106(VCAM- 1)、 CD137]や 接着分子 [ALCAM(Activated leukocyte cell adhesion molecule)^ Cadherins、 ICAM (I ntercellular adhesion molecule) - 1、 ICAM- 2、 ICAM- 3]、サイト力イン受容体 (以下、 受容体を Rと表記する）（インターロイキン- 4R、インターロイキン- 5R、インターロイキン -6R、インターロイキン- 9R、インターロイキン- 10R、インターロイキン- 12R、インター口 ィキン- 13R a 1、インターロイキン- 13R a 2、インターロイキン- 15R、インターロイキン- 21R)、ケモカイン、細胞死誘導シグナル分子 [B7- HI、 DR6(Death receptor 6)、 PD- 1 (Programmed death- 1)、 TRAIL Rl]、共刺激分子 [B7- 1、 B7- 2、 B7- H2、 ICOS(Induci ble costimulator)]、増殖因子（ErbB2、 ErbB3、 ErbB4、 HGFR)あるいは分化誘導因子 (B7-H3)、活性化因子 (NKG2D)、シグナル伝達分子 (gpl30)および該結合蛋白質 の受容体やリガンドなどと抗体 Fc領域との融合蛋白質は多数報告されている。
[0268] 抗体組成物などの糖蛋白質を含有する医薬は、治療薬として単独で投与すること も可能ではある力 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一 緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医 薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口投与、 または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあ げることができ、糖蛋白質製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
[0269] 投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、 注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒 剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖など の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、 ォリーブ油、大豆油などの油類、 P—ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ス トロべリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製 造できる。
[0270] カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マン-トールなど の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、 タルクなどの滑沢剤、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン などの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添 加剤として用いて製造できる。
[0271] 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物カゝらなる担体などを用い て調製される。または、糖蛋白質を常法に従って凍結乾燥し、これに塩ィ匕ナトリウムを 加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。
[0272] また、噴霧剤は該糖蛋白質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺 激せず、かつ該糖蛋白質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体など を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該糖蛋白質および用いる 担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これら の非経口剤にぉ 、ても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
[0273] 投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体 重などにより異なる力 通常成人 1日当たり 10 g/kg〜20mg/kgである。
また、抗体組成物の場合、各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、 インビトロ実験としては、 CDC活性測定法、 ADCC活性測定法などがあげられ、インビ ボ実験としては、マウスなどの実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験などがあげ られる。 [0274] CDC活性、 ADCC活性、抗腫瘍実験は、文献 [キャンサー'ィムノロジ一'ィムノセラ ピ ~~ (Cancer Immunology Immunotherapy;, 3b, 373 (1993) ;= ヤンサ ~~ 'リサ ~~テ (し an cer Research), 54, 1511 (1994) ]などに記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる 例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例 1
[0275] GMDを標的とした small interfering RNA (siRNA)発現プラスミド導入によるレクチン耐 性 CHO/DG44細胞の作製
1. GMDを標的とした siRNA発現ベクターの構築
(1)ヒト U6プロモータ^ クロー-ングサイト-ターミネータ一配列発現カセットのクロー ユング
以下の手順で、ヒト U6プロモータ一-クロー-ングサイト-ターミネータ一配列発現力 セットを取得した (図 1)。
[0276] まず、ヒト U6プロモーター配列 [GenBank Acc. No. M14486]に結合する塩基配列の 5'末端に制限酵素 Hindmおよび E RVの認識配列を付カ卩したフォワードプライマー（ 以下 WJ6p-F-Hind3/EcoRVと称し、配列番号 59に示す）および、ヒト U6プロモーター 配列に結合する塩基配列の 5 '末端に、制限酵素 1および E RVの認識配列、タ ーミネーター配列に相当する連続した 6塩基のアデニン、さらに別の合成オリゴ DNA 挿入のための制限酵素 Kmiiおよび lの認識配列を付加したリバースプライマー (以 下 hU6p- R- term- Xbal/EcoRVと称し、配列番号 60に示す)をそれぞれ設計した。
[0277] 次に、 DNAポリメラーゼ KOD polymerase (東洋紡績社製）を用いて、铸型として WO 03/085118実施例12記載のプラスミドU6_FUT8_B_puroを40ng含む50 μ Lの反応液 [ KOD buffer#l (東洋紡績社製）、 0.1mmol/L dNTPs、 lmmol/L MgCl
2、 0.4 μ mol/Lプ ライマー hU6p— F— Hind3/EcoRV、 0.4 μ mol/Lプライマー hU6p—R— term— Xbal/EcoRV ]を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応 (以下、 PCRと記す)を行った。 PCRは、 94°Cで 2分 間の加熱の後、 94°Cで 15秒間、 65°Cで 5秒間、 74°Cで 30秒間からなる反応を 1サイク ルとした 30サイクルの条件で行った。
[0278] PCR後、該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社 製）を用いて約 300bpの特異的増幅断片を回収した。該 DNA断片を NEBuffer 2 (New England Biolabs社製）30 Lに溶解し、 10単位の制限酵素 I (New England Biolabs 社製）および 10単位の制限酵素 Hindlll (New England Biolabs社製）をカ卩えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。該反応液に対し、フ ノール/クロ口ホルム抽出処理および エタノール沈澱により制限酵素消化した DNA断片を回収し、滅菌水 20 Lに溶解し た。
[0279] 一方、プラスミド pBluescriptll KS (+) (STRATAGENE社製） 1 μ gを 100 μ g/ml BSA (N ew England Biolabs社製）を含む NEBuffer2 (New England Biolabs社製） 30 μ Lに溶解 し、 10単位の制限酵素 ilindmおよび KNew England Biolabs社製）をカ卩えて 37°C で 8時間消化反応を行った。消化反応後、該反応液に滅菌水 22 L、 10 X Alkaline P hosphatase Buffer 6 μ Lおよび Alkaline Phosphatase E.coli C75(タカラバィォ社製） 1 単位を添加し、 37°Cで 1時間脱リン酸化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電 気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社製）を用いて約 2.9Kbのプラスミド pBluesc riptn KS(+)由来の Hindm- ai断片を回収した。
[0280] 上記で得た DNA断片 (約 300bp) 8 μ プラスミド pBluescriptll KS (+)由来の Hindlll- al断片 (約 2.9Kb) 2 μ Ligation High (東洋紡社製） 10 μ Lを混合し、 16°Cで 2時間 反応させた。該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換し、得 られたアンピシリン耐性クローンより QIAprep spin Mini prep Kit (キアゲン社製）を用 V、てプラスミドを単離した。該プラスミドを以下 pBS-U6termと称す。
[0281] (2)ヒト U6プロモータ一-クローユングサイト-ターミネータ一配列発現カセットの pPUR への連結
以下の手順で、本項（1)にて得たプラスミド pBS-U6termに含まれるヒト U6プロモー タ一—クロー-ングサイト-ターミネータ一配列発現カセットを切り出し、発現ベクター p
PUR (Clontech社製）へ連結した（図 2)。
[0282] まず、上記（1)で作製したプラスミド pBS-U6term 1 μ gを 100 μ g/mL BSA (New Engl and Biolabs社製）を含む NEBuffer 2 (New England Biolabs社製） 20 μ Lに溶解し、 10 単位の制限酵素 E£2RV (New England Biolabs社製）を加えて 37°Cで 2時間消化反応 を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社 製）を用いて約 350bpのヒト U6プロモータ^ クロー-ングサイト-ターミネータ一配列 発現カセットを含む DNA断片を回収した。
[0283] 一方、プラスミド pPUR (Clontech社製） 6 μ gを NEBuffer 2 (New England Biolabs社製 ) 20 Lに溶解し、 10単位の制限酵素 oilKNew England Biolabs社製）を加えて 37°C で 2時間消化反応を行った。反応後、該反応液に滅菌水 5 L、 10 X Alkaline Phosph atase Buffer 3 μ Lおよび Alkaline Phosphatase E.coli C75 (タカラバイオ社製） 1単位を 添加し、 37°Cで 1時間脱リン酸化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動 に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社製）を用いて約 4.3Kbのプラスミド pPUR由来の Ε ϋΠ断片を回収した。
[0284] 上記で得たヒト U6プロモータ一-クロー-ングサイト-ターミネータ一配列発現カセッ トを含む約 350bpの DNA断片 8 L、プラスミド pPUR由来の約 4.3kbの ΒαιΙΙ断片 2 μ L、 Ligation High (東洋紡社製） 10 Lを混合し、 16°Cで 3時間反応させた。該反応液 を用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換し、得られたアンピシリン耐性 クローンより QIAprep spin Mini prep Kit (キアゲン社製）を用いてプラスミド DNAを単 離した。該プラスミド DNA約 0.5 μ gを NEBuffer 2 (New England Biolabs社製） 10 μしに 溶解し、 10単位の制限酵素 Sadおよび HindIII (New England Biolabs社製）をカ卩えて 37 °Cで 2時間消化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 目的と する挿入断片の有無および挿入方向を確認した。さらに、各プラスミドに挿入された DNAの塩基配列を、 DNAシークェンサ一 377 (Parkin Elmer社製）および BigDye Term inator v3.0 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosytems社製）を用いて、添付マ-ユア ルに従い決定した。シークェンス解析のプライマーには、 pPUR PvuII-seq-F (配列番 号 61に示す)および pPUR ?^11-369-1? (配列番号62に示す）を用い、挿入 DNAのヒト U6プロモーター領域の配列が GenBank Acc. No. M14486の配列と一致し、ヒト U6プ 口モータ一—クロー-ングサイト-ターミネータ一配列発現カセットの増幅に用いたプラ イマ一領域の配列および各連結部の配列に間違 、が無 、ことを確認し、得られたプ ラスミドのうち、挿入した WJ6プロモーターの方向力 ピューロマイシン耐性遺伝子発 現ユニットと同方向であるプラスミドを選択した。以下、該プラスミドを PPUR-U6termと 称す。 [0285] (3)標的配列の選定および合成オリゴ DNAの設計
以下のような、チャイニーズノヽムスター卵巣由来 CHO/DG44細胞の GMD遺伝子に 対する siRNAの標的配列を含む二本鎖 DNAカセットを形成する合成オリゴ DNAを作 製した。
まず、チャイニーズノヽムスター由来 GMD cDNA配列 (GenBank Acc. No. AF525364
；配列番号 8に示す)から、以下の条件を満たす標的配列を 7箇所選定した。選定し た標的配列を配列番号 36〜42に示した。
[0286] 条件 1 「NAR(N17)YNN」力もなるコンセンサス配列を含む。 Nは A、 G、 Uまたは Cを
、 Rは Aまたは G、 Yは Uまたは Cをそれぞれ表す。
条件 2 条件 1を満たし、 3塩基以上の同一塩基の連続した配列を含まない。 条件 3 条件 1〜2を満たし、 GC含量がより好ましくは 35〜45%、好ましくは 45〜55
%である。
条件 4 条件 1〜3を満たした 23塩基の配列の前後に 6塩基追加した 29塩基の配列 が条件 2を満たす。
条件 5 条件 4を満たし、 GC含量がより好ましくは 35〜45%、好ましくは 45〜55%で ある。
[0287] さらに、選定した標的配列について以下の手順で二本鎖 DNAカセットを設計した。
二本鎖 DNAカセットは 5'末端力も順に、制限酵素 2^1切断により生じる 3'突出末端、 配列番号 36〜42に対応するセンスコード DNA、ヒト miR- 23- precursor- 19 micro RN A (GenBank Acc. No. AF480558)の 10塩基のループ配列、配列番号 36〜42に対応 する DNA配列に相補的なアンチセンスコード DNAおよび制限酵素 Kmil切断により生 じる 3'突出末端を有する。該ニ本鎖 DNAの 5'末端はリン酸ィ匕した。
[0288] 配列番号 36に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖 (以下 G MD- dsRNA-A-Fと称す)の塩基配列を配列番号 43、アンチセンス鎖 (以下 GMD-dsR NA-A-Rと称す)の塩基配列を配列番号 44に、配列番号 37に示す標的配列にっ 、 て設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖 (以下 GMD- dsRNA-B-Fと称す)の塩基配列を 配列番号 45、アンチセンス鎖 (以下 GMD-dsRNA-B-Rと称す)の塩基配列を配列番 号 46に、配列番号 38に示す標的配列について設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖 ( 以下 GMD- dsRNA-C-Fと称す)の塩基配列を配列番号 47、アンチセンス鎖 (以下 GM D- dsRNA-C-Rと称す)の塩基配列を配列番号 48に、配列番号 39に示す標的配列 について設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖 (以下 GMD- dsRNA-D-Fと称す)の塩基 配列を配列番号 49、アンチセンス鎖 (以下 GMD- dsRNA-D-Rと称す)の塩基配列を 配列番号 50に、配列番号 40に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ DNAのセ ンス鎖 (以下 GMD- dsRNA-E-Fと称す)の塩基配列を配列番号 51、アンチセンス鎖（ 以下 GMD- dsRNA-E-Rと称す)の塩基配列を配列番号 52に、配列番号 41に示す標 的配列について設計した合成オリゴ DNAのセンス鎖 (以下 GMD- dsRNA-F-Fと称す） の塩基配列を配列番号 53、アンチセンス鎖 (以下 GMD- dsRNA-F-Rと称す)の塩基 配列を配列番号 54に、配列番号 42に示す標的配列にっ 、て設計した合成オリゴ D NAのセンス鎖 (以下 GMD- dsRNA- F-Fと称す)の塩基配列を配列番号 55、アンチセ ンス鎖 (以下 GMD- dsRNA-F-Rと称す)の塩基配列を配列番号 56にそれぞれ示した。 設計した合成オリゴ DNAの合成は定法 (モレキュラー ·クロー-ング第 2版）に従って 行った。
[0289] (4)合成オリゴ DNAのプラスミド pPUR- U6termへの挿入
本項（2)にて取得した pPUR-U6termのクロー-ングサイトへ、本項（3)にて合成し た合成オリゴ DNAの挿入を行った (図 3)。
まず、合成オリゴ DNAのアニーリングを以下の手順で行った。合成オリゴ DNAセンス 鎖およびアンチセンス鎖各 200pmolを、アニーリングバッファー [10mmol/L Tris(pH7. 5)- 50mmol/L NaC卜 lmmol/L EDTA] 10 /z Lに溶解し、 2分間煮沸した。その後、徐冷 し約 3時間かけて室温まで冷却した。その後、アニーリングした合成オリゴ DNAを滅菌 水で 15倍希釈した。
[0290] 一方、プラスミド pPUR—U6term 3 μ gを 100 μ g/mL BSA (New England Biolabs社製） を含む NEBufferl (New England Biolabs社製） 40 μ Lに溶解し、 20単位の制限酵素 Hiおよび I (New England Biolabs社製）をカ卩えて 37°Cで 4時間消化反応を行った。 消化反応後、該反応液に滅菌水 12 μ L 10 X Alkaline Phosphatase Buffer 6 μ Lおよ び Alkaline Phosphatase E.coli C75 (タカラバィォ社製） 1単位を添カ卩し、 37°Cで 1時間 脱リン酸ィ匕反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 RECOCHIP( タカラバィォ社製）を用いて約 4.5 Kbのプラスミド pPUR-U6term由来の K l-^I断片 を回収した。
[0291] 上記で得た二本鎖合成オリゴ溶液 1 μ L、プラスミド pPUR-U6term由来の KMI-^I 断片 1 μ L、および滅菌水 8 L、 Ligation High (東洋紡社製） 10 Lを混合し、 16°C で一晩反応させた。該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換 し、得られたアンピシリン而性クローンについて、 QIAprep spin Mini prep Kit (キアゲ ン社製)を用いてプラスミド DNAを単離した。
[0292] 各プラスミドに挿入された DNAの塩基配列を、 DNAシークェンサ一 377 (Parkin Elme r社:^)および BigDye Terminator νό.Ο し ycle Sequencing Kit (Applied Biosytems社製 )を用いて、添付マニュアルに従い決定した。シークェンス解析の铸型には、約 1分間 煮沸した後、急冷したプラスミド DNAを、プライマーには、 pPUR PvuII-seq-F (配列番 号 61)、 hU6p Tsp45I/seq- F (配列番号 63)および pPUR 1^ 11-369-1?(配列番号62)を 用い、挿入された合成オリゴ DNAの配列および連結部に間違 、が無 、ことを確認し た。以下、合成オリゴ DNA GMD- dsRNA- A- Fおよび GMD- dsRNA- A- Rからなる二本 鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pPUR/GMDshA、合成オリゴ DNA GMD- dsRNA- B- Fおよび GMD-dsRNA-B- Rからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pPUR/GMD shB、合成オリゴ DNA GMD- dsRNA- C- Fおよび GMD- dsRNA- C- Rからなる二本鎖 D NAが挿入されたプラスミドを pPUR/GMDshC、合成オリゴ DNA GMD- dsRNA- D- Fお よび GMD- dsRNA-D- Rからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pPUR/GMDsh D、合成オリゴ DNA GMD- dsRNA- E- Fおよび GMD- dsRNA- E- Rからなる二本鎖 DNA が挿入されたプラスミドを pPUR/GMDshE、合成オリゴ DNA GMD- dsRNA- F- Fおよび GMD- dsRNA-F- Rからなる二本鎖 DNAが挿入されたプラスミドを pPUR/GMDshF、合 成オリゴ DNA GMD- dsRNA- G- Fおよび GMD- dsRNA- G- Rからなる二本鎖 DNAが揷 入されたプラスミドを pPUR/GMDshGと称す。
[0293] 2. GMDを標的とした siRNA発現ベクターの導入によるレクチン耐性株の取得および 口
( 1) GMDを標的とした siRNA発現ベクターの導入によるレクチン耐性株の取得 WO03/85118の参考例 1に記載の方法と同様にして取得した CHO/DG44細胞由来 抗 CCR4キメラ抗体生産株 32-05-12株（以下、 32-05-12株と記す)へ、本実施例の 1 . において構築したプラスミド pPUR/GMDshA 、 pPUR/GMDshB, pPUR/GMDshC, p PUR/GMDshD, pPUR/GMDshE, pPUR/GMDshFあるいは pPUR/GMDshGをそれぞ れ導入し、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコー スの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンであるレンズマメレクチン (以下、 L CAと記す)耐性株を以下のようにして取得した。
[0294] 各種 siRNA発現ベクタープラスミドの 32-05-12株への遺伝子導入はエレクトロボレ ーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990)]に準じて以下の手順 で行った。まず、各種 siRNA発現ベクタープラスミド 10 μ gを、 NEBuffer4 (New England Biolabs社製） 30 μ Lに溶解し、 10単位の制限酵素 Ε≤βΙ (New England Biolabs社製）を 加えて 37°Cで一晩消化反応させて線状化した。該反応液の一部をァガロースゲル電 気泳動により、該プラスミドが線状ィ匕されていることを確認した後、残りの反応液に対 し、フエノール/クロ口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状ィ匕 プラスミドを滅菌水 10 Lに溶解した。
[0295] 一方、 32— 05— 12株を K— PBS緩衝液 [137mmol/L KC1、 2.7mmol/L NaCl、 8.1mmol/L
Na HP04、 1.5mmol/L KH PO 、 4.0mmol/L MgCl ]に懸濁して 8 X 106個/ mLとした。
2 2 4 2
細胞懸濁液 200 μ L (1.6 X 106個）を上記線状ィ匕プラスミド溶液 10 μ Lと混和した後、 細胞 DNA混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BIO- RAD社製 )へ移し、細胞融合装置 Gene Pulser(BIO- RAD社製）を用いてパルス電圧 350V、電 気容量 250 Fの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入した後、細胞懸濁液を基 本培地 [10%ゥシ胎児透析血清（Invitrogen社製）、 g/mLゲンタマイシン（ナカラ ィテスタ社製）、および 500nmol/L MTX (SIGMA社製）を含む Iscove's Modified Dulbe cco's Medium (以下、 IMDMと称す； Invitrogen社製）]に懸濁し、接着細胞培養用 10c mディッシュ（ファルコン社製) 4枚へ播種した。 5% CO 、 37°Cの条件下で 24時間培養
2
した後、培養上清を除去し、 12 g/mLピューロマイシン (SIGMA社製)を添加した基 本培地を注入し、さらに 7日間培養した。その後、ディッシュ 1枚について、培養上清 を除去し、 12 μ g/mLの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製）を含む基本培地を注入 し、さらに 6〜8日間の培養した後、出現したピューロマイシン耐性コロニー数を計数し た。一方、残りのディッシュについて、培養上清を除去し、 12 g/mLの濃度でピュー ロマイシン（SIGMA社製）および 0.5mg/mLの濃度で LCA(VECTOR社製）を含む基本 培地を添カ卩し、さらに 7日間培養した。その結果、 pPUR/GMDshBを導入した場合に お ヽてレクチン耐性株が取得された。
[0296] (2)レクチン耐性株の拡大培養
本項（1)で pPUR/GMDshB導入により得られたレクチン耐性株を以下の手順で拡 大培養した。
まず、各ディッシュに出現したコロニー数の計数を行った。その後、レクチン耐性コ 口-一を、実体顕微鏡観察下にてピペットマン (GILSON社製)を用いて搔き取って吸 い込み、接着細胞用 U底 96穴プレート (旭テクノグラス社製)へ採取した。トリプシン処 理を行った後、接着細胞用平底 96穴プレート (Greiner社製)へ各クローンを播種し、 1 2 μ g/mLの濃度でピューロマイシン（SIGMA社製）を含む基本培地を用いて 5%CO
2
、 37°Cの条件下で一週間培養した。培養後、 10クローンについて、 12 /z g/mLの濃度 でピューロマイシン (SIGMA社製)を含む基本培地を用いて拡大培養を行った。拡大 培養に供した細胞株を、それぞれ 12- GMDB- 1、 12- GMDB- 2、 12- GMDB- 3、 12- G MDB- 4、 12- GMDB- 5、 12- GMDB- 6、 12- GMDB- 7、 12- GMDB- 8、 12- GMDB- 9、 12 - GMDB-10と命名し、以下の 3. に記載する解析に供した。尚、 12-GMDB-5株は、平 成 16年 7月 1日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター ( 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に FERM BP-10051として寄託され ている。
[0297] 3. GMDを標的とした siRNA発現ベクターを導入したレクチン耐性株における GMD m RNA量の定量
( 1) total RNAの調製
32-05-12株および本実施例の 2.で取得したレクチン耐性株からの total RNA調製 は以下の手順で行った。 32-05-12株は基本培地、レクチン耐性株は 12 g/mLピュ 一口マイシン (SIGMA社製）を添カ卩した基本培地を用いて、それぞれ 3 X 105cells/mL の細胞密度で懸濁し、接着細胞用 6cmディッシュ (ファルコン社製）に 4mLずつ播種し た。 5%C0、 37°Cの条件下で 3日間静置培養し、トリプシン処理により各細胞懸濁液 を回収し、懸濁液に対し 1000rpm、 4°Cの条件で 5分間の遠心分離を行って上清を除 去した。細胞をダルベッコ PBS緩衝液（Invitrogen社製）に懸濁し、再度 1000rpm、 4°C の条件で 5分間の遠心分離を行って上清を除去した後、 RNeasy (QIAGEN社製)を使 用し total RNA調製を抽出した。方法は添付の説明書に従い、 total RNA調製を 40 Lの滅菌水に溶解した。
[0298] (2) single strand cDNA合成
本項（1)にお!/、て得られた各々の total RNA 3 μ gに対し、 SUPERSCRIPT™ Pream plincation system for First Strand cDNA Syntnesis (Invitrogen社製)を用 ヽて添付の 説明書に従い、オリゴ (dT)をプライマーとした 20 Lの系で逆転写反応を行うことによ り、一本鎖 cDNAを合成した。その後、 RNase処理を行い、最終反応液量を 40 しとし た。さらに、該反応液を各々、滅菌水を用いて 50倍希釈し、以下に記載する遺伝子 転写量の解析に供した。
[0299] (3) SYBR-PCRによる遺伝子転写量の定量
GMD遺伝子由来の mRNA転写量の定量および β -ァクチン遺伝子由来の mRNA転 写量の定量は、 For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version (タカラバイオ社 製)を用いて以下の手順で行った。
なお、 GMD定量の内部コントロールとしては、 WO02/31140実施例 15記載の CHO 細胞由来 GMD cDNAを含むプラスミド pAGE249GMDを 0.0512fg/ μ L、 0.256fg/ μ L、 1.28ί¾/ /ζ L、 6.4ί¾/ /ζ L、 32ί¾/ /ζ L、 160fg/ Lの濃度にそれぞれ希釈したものを、 β -ァクチン定量の内部コントロールとしては、 WO02/31140実施例 9記載の 13 -了クチ ンスタンダードプラスミドを 1.28fg/ μ L、 6.4fg/ μ L、 32fg/ μ L、 160fg/ μ L、 800fg/ μ L 、 4000fg/ Lの濃度にそれぞれ希釈したものを使用した。また、 PCRプライマーとして は、 GMDの増幅には配列番号 64に示すフォワードプライマーおよび配列番号 65に 示すリバースプライマーを、 β -ァクチンの増幅には配列番号 66に示すフォワードプ ライマーおよび配列番号 67に示すリバースプライマーをそれぞれ使用した。
[0300] For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R— PCR Version (タカラバイオ社製）を用いて、 本項（2)において調製した single strand cDNA溶液あるいは各濃度の内部コントロー ルプラスミド溶液を各々 5 μ L含む 20 μ Lの反応液 [R- PCR buffer (タカラバイオ社製） 、 2.5mmol/L Mg Solution for R— PCR (タカラバイオ社製）、 0.3mmol/L dNTPmixture (タカラバイオ社製）、 0.3 μ mol/Lフォワードプライマー、 0.3 μ mol/Lリバースプライマ 一、 2 X 10— 5希釈 SYBR Greenl、 1単位 TaKaRa Ex Taq R- PCR]を調製した。調製した 反応液を 96- well Polypropylene PCR reaction Plate (ファルコン社製）の各ゥエルへ 分注し、 Plate Sealer (Edge Biosystems)を用いてプレートをシールした。 PCR反応お よび解析には、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection Systemを用い、添付マ-ユア ルに従って GMD mRNA量および 13 -ァクチン mRNA量の測定を行った。
[0301] 内部コントロールプラスミドでの測定結果力 検量線を作成し、 GMD mRNA量およ び β -ァクチン mRNA量を数値ィ匕した。さら〖こ、細胞株間での β -ァクチン遺伝子由来 の mRNA転写量は均一であると考え、 j8 -ァクチン mRNA量に対する GMD mRNA量の 相対値を算出し、その値を比較した結果を図 4に示した。
GMDを標的とした siRNA発現プラスミド導入により得られた細胞株では ヽずれも、親 株の 8%力 50%まで GMD mRNA量が低下して!/、ることが示された。
実施例 2
[0302] GMDを標的とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチン耐性 CHO/DG44細胞を用 いた抗体組成物の生産
1. GMDを標的とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチン耐性株が生産する抗体 組成物の取得
実施例 1にお 、て取得した GMDを標的とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチ ン耐株 12-GMDB-2株、 12-GMDB-5株が生産する抗 CCR4キメラ抗体を以下の手順 で取得した。
[0303] 32- 05- 12株は基本培地、 12- GMDB- 2株、および 12- GMDB- 5株は 12 μ g/mLピュ 一口マイシン (SIGMA社製）を添カ卩した基本培地を用いて、それぞれ 3 X 105cells/mL の細胞密度で懸濁し、接着細胞用 T75フラスコ（グライナ一社製）に 15mLずつ播種し た。 5%CO、 37°Cの条件下で 6日間培養後、培養上清を除去し、 10mLのダルベッコ
2
PBS (インビトロジェン社製）にて 2回洗浄を行なった後、 EXCELL301培地 (JRH Biosci ence社製)を 20mL注入した。 5%CO
2、 37°Cの条件下で 7日間培養後、培養上清を回 収し、 MabSelect (アマシャムバイオサイエンス社製)カラムを用いて、添付の説明書に 従い、抗 CCR4キメラ抗体を精製した。各種細胞株の培養上清力も精製した抗 CCR4 キメラ抗体は、 Econo- Pac 10DG (バイオラッド社製）を用いて 10mmol/L KH POバッ
2 4 ファーに置換し、 0.22 μ m孔径 Millex GV(MILLIPORE社製）を用いてろ過滅菌した。
[0304] 2. GMDを標的とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチン耐性株が生産する抗体 組成物の単糖組成分析
本実施例第 1項で取得した、抗 CCR4キメラ抗体に対し、公知の方法 [ジャーナル · ォブ ·リキッド.クロマトグラフィー (journal of liquid Chromatography), 6, 1577, (1983)
]に従って単糖組成分析を行なった。
[0305] [表 1] 細胞株名 フコースを持たない糖鎖の割合
32-05-12 3¾
12-G DB-2 78%
12-GMDB-5 79% 表 1に各抗体の単糖組成比より計算される、全複合型糖鎖に占めるフコースを持た な 、複合型糖鎖の割合を示した。 GMDに対する siRNA発現ベクターの導入に供した 親株 32-05-12株の生産する抗体組成物のフコースを持たない糖鎖の割合が 3%で あつたのに対し、 siRNA導入レクチン而性株 12- GMDB- 2株、 12- GMDB- 5株が生産 する抗体組成物のフコースを持たない糖鎖の割合はそれぞれ 78%、 79%であり、親 株と比較してフコースを持たな 、糖鎖の割合が大幅に上昇して 、ることが示された。 以上の結果より、 GMDを標的とした siRNAの導入により、宿主細胞の生産する抗体 の a 1 ,6-フコースの含量を制御できることが示された。
実施例 3
[0306] GMDを標的とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチン耐性 CHO/DG44細胞の無 血清フエドバッチ培養
1. GMDを標的とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチン耐性 CHO/DG44細胞 の無血清培地への馴化
ベクター導入前の親株である 32-05-12株、実施例 1にお!/、て取得した GMDを標的 とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチン而株 12- GMDB- 2株および 12- GMDB- 5株の無血清培地への馴化を、以下の手順で行った。
[0307] 32- 05- 12株は基本培地を、 12- GMDB- 2株および 12- GMDB- 5株は 12 μ g/mLの濃 度でピューロマイシン (SIGMA社製)を添カ卩した基本培地を用いて、それぞれ 3 X 105ce lls/mLの細胞密度で懸濁し、接着細胞用 T75フラスコ（グライナ一社製）に 15mLずつ 播種した。 5%CO、 37°Cの条件下で 3日間培養し、トリプシン処理により各細胞懸濁
2
液を回収し、 lOOOrpm, 5分間の遠心分離を行って細胞を回収した。 32-05-12株は、 MTX (SIGMA社製）を 500nmol/Lの濃度で、 L-グルタミン (インビトロジェン社製)を 6m mol/Lの濃度で、ゲンタマイシン (ナカライテスタ社製)を 50 g/mLの濃度で、 3,3,5-T riiodo-L- thyronine (SIGMA社製）を 100nmol/Lの濃度で含む EX- CELL302培地（JR H社製）（以下、無血清培地と称す）を、 12-GMDB-2株および 12- GMDB-5株は 12 g/mLの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製)を添加した無血清培地を用いて、それ ぞれ回収した細胞を 5 X 105cells /mLの密度で懸濁し、該細胞懸濁液 15mLを 125mL 三角フラスコ（コ一-ング社製）に播種した。培養容器の 4倍量以上の 5%COを通気
2 してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、 35°C、 90〜100rpmにて浮遊旋回培養 を行った。 3〜4日間隔で継代を繰り返し、最終的には無血清培地で増殖可能な細胞 株を取得した。以下、無血清培地へ馴化した 32-05-12株を 32-05-12AF、無血清培 地へ馴化した 12-GMDB-2株を 12-GMDB-2AF、無血清培地へ馴化した 12-GMDB- 5株を 12-GMDB-5AFとそれぞれ称す。
[0308] 2.無血清培地に馴化した GMDを標的とした siRNA発現プラスミド導入レクチン耐性 C HO/DG44細胞を用いた無血清フ ドバツチ培養
(1)三角フラスコ無血清フエドバッチ培養
本実施例の 1.で無血清培地に馴化した 32-05-12AF株、 12-GMDB-2AF株および 12-GMDB-5AF株を用いて、以下の手順で無血清フエドバッチ培養を行った。
[0309] フエドバッチ培養には、 MTX (SIGMA社製）を 500nmol/Lの濃度で、 L-グルタミン (ィ ンビトロジェン社製）を 6mmol/Lの濃度で、 3,3,5- Triiodo-L- thyronine (SIGMA社製） を 100nmol/Lの濃度で、 Pluronic F-68 (インビトロジェン社製）を 0.1%の濃度で、 D(+) -グルコース（ナカライテスタ社製）を 5000mg/Lの濃度で含む EX- CELL302培地（JRH 社製）（以下、無血清フエドバッチ培養培地と称す)を、フィード用の培地としては、通 常の添加濃度よりも高濃度に調製したアミノ酸 (L-ァラニン 0.177g/L、 L-アルギニン 一塩酸 0.593g/L、 L-ァスパラギン一水和物 0.177g/L、 L-ァスパラギン酸 0.212g/L、 L -シスチン二塩酸 0.646g/L、 L-グルタミン酸 0.530g/L、 L-グルタミン 5.84g/L、グリシン 0.212g/L、 L-ヒスチジン一塩酸二水和物 0.297g/L、 L-イソロイシン 0.742g/L、 L-ロイ シン 0.742g/L、 L-リジン一塩酸 1.031g/L、 L-メチォニン 0.212g/L、 L-フエ-ルァラ- ン 0.466g/L、 L-プロリン 0.283g/L、 L-セリン 0.297g/L、 L-スレオ-ン 0.671g/L、 L-トリ プトファン 0.113g/L、 L-チロシンニナトリウム二水和物 0.735g/L、 L-パリン 0.664g/L) 、ビタミン（d -ピオチン 0.0918mg/L、 D-パントテン酸カルシウム 0.0283g/L、塩化コリン 0.0283g/L、葉酸 0.0283g/L、 myo-イノシトール 0.0509g/L、ナイァシンアミド 0.0283g/ L、ピリドキサール塩酸 0.0283g/L、リボフラビン 0.00283g/L、チアミン塩酸 0.0283g/L 、シァノコバラミン 0.0918mg/L)、インシュリン 0.314g/Lから構成された培地（以下、フ イード培地と称す)を用いた。
[0310] 32- 05- 12AF株、 12- GMDB- 2AF株および 12- GMDB- 5AF株を、 3 X 105cells/mLの 密度で無血清フエドバッチ培養培地に懸濁し、該細胞懸濁液を 250mL三角フラスコ（ コーユング社製）に 40mLずつ播種した。培養容器の 4倍量以上の 5%COを通気して
2 フラスコ内の空気を置換した後に密栓し、 35°C、 90〜100rpmにて浮遊旋回培養を行 つた。培養開始後 3日目、 6日目、 9日目、 12日目に、アミノ酸等の消費量を補う目的 でフィード培地を 3.3mL添カ卩し、グルコース濃度を制御する目的で 20% (w/v)ダルコ ース溶液を終濃度 5000mg/Lとなるように添加した。培養開始後 0日目、 3日目、 6日 目、 9日目、 12日目、 14日目に培養液を 2〜4mLずつ採取し、本項（2)〜 (4)に記載 の解析に用いた。また、培養開始後 14日目にフヱドバッチ培養を終了し、培養液を全 量回収し、本項 (4)に記載の解析に用いた。
[0311] (2)生細胞密度の測定
本項（1)で採取した培養開始後 0日目、 3日目、 6日目、 9日目、 12日目、 14日目の 培養液について、生細胞密度と細胞生存率をトリパンブルー染色により測定した。 32 -05-12AF株、 12-GMDB-2AF株および 12-GMDB-5AF株の培養開始後の各時点に おける生細胞密度の結果を図 5に示した。 12-GMDB-2株は、 32-05-12AF株と比較 して増殖速度が遅ぐ培養 14日目においても細胞生存率が高い状態が維持されてい た。一方、 12-GMDB-5AF株は、培養開始後の各時点における生細胞密度は 32-05 -12株と同等であった。従って、 GMDを標的とした siRNAの標的配列は、細胞の増殖 性には大きな影響を及ぼさない配列であることが示された。
(3)抗体濃度の定量
本項（1)で採取した培養開始後 0日目、 3日目、 6日目、 9日目、 12日目、 14日目の 培養液の上清中に含まれる抗体濃度の定量を以下の手順で行った。
lmLの抗ヒト IgG(H+L)抗体（American Qualex社製）をダルベッコ PBS (インビトロジェ ン社製） 750mLに溶解し、 50 Lずつ ELISAプレートの各ゥエルに分注した。 4°Cにて ー晚放置した後、溶液を除去し、 1% BSA (Bovine Serum Albumin)を含む PBS (以下、 BSA- PBSと記す）を 100 Lずつ各ゥエルへカ卩え、室温に約一時間放置した後、 -20 °Cにて保存した。抗体量測定時にプレートを室温で溶解しゥエル中の BSA-PBSを除 去した後に、 BSA-PBSを用いて希釈した培養上清溶液を 50 Lずつ各ゥエルに添カロ した。室温にて 1〜2時間放置し、 0.05%の濃度で Tween20™を含む PBS (以下、 Twee n-PBSと記す)で洗浄した。洗浄液の水分を除去した後、 BSA-PBSを用いて 2000倍 希釈した Goat anti-humanIgG(H&L)-HRP (American Qualex社製）を二次抗体として 5 0 Lずつ各ゥエル〖こ添加した。室温にて 1〜2時間放置し、 Tween-PBSで洗浄した後 、さらにレジン水により洗浄した。洗浄後 0.1% H 0をカ卩えた ABTS基質液 [2, 2'-アジ
2 2
ノ-ビス（3-ェチルベンゾチアゾリン- 6-スルホン酸）アンモ-ゥムの 0.55gを 1Lの O.lmol /Lクェン酸緩衝液 (pH4.2)に溶解し、使用直前に過酸化水素水を 1 μ L/mLで添加し た溶液]を 50 Lずつ各ゥエルに添加し発色させた。室温で約 15分間放置し、適当な 発色が得られた時点で 5% SDS溶液を 50 Lずつ各ゥエルに添加し反応を停止させた 。マイクロプレートリーダーを用いて波長 415應における吸光度を対照として、波長 49 0應における吸光度を測定した。各希釈試料の抗体濃度の算出は、標準抗体精製 標品を用いて作製した検量線シグモイドカーブの直線領域を使用して行った。得ら れた希釈試料の抗体濃度に希釈率を乗じて、培養上清の抗体濃度をそれぞれ算出 した。 32- 05- 12AF株、 12- GMDB- 2AF株および 12- GMDB- 5AF株の培養開始後の 各時点における培養上清中の抗体濃度の定量結果を図 6に示した。 32-05-12AF株 と 12- GMDB-2AF株および 12-GMDB-5AF株は、培養開始後の各時点における培養 上清中の抗体組成物濃度は同等であった。従って、 GMDを標的とした siRNAの標的 配列は、細胞の抗体生産性には影響を及ぼさな 、配列であることが示された。
[0313] (4)抗体組成物の糖鎖構造解析
本項（1)で採取した 32- 05- 12AF株の無血清フエドバッチ培養 14日目の培養上清、 および、 12- GMDB- 2AF株および 12- GMDB- 5AF株の無血清フエドバッチ培養 6日目 、 12日目、 14日目の培養上清から、 MabSelect (アマシャムバイオサイエンス社製)力 ラムを用いて、添付の説明書に従い、抗 CCR4キメラ抗体組成物をそれぞれ精製した 。精製した各抗 CCR4キメラ抗体組成物は、それぞれ Econo- Pac 10DG (バイオラッド 社製）を用いて 10mmol/L KH POバッファーに置換し、 0.22 μ m孔径 Millex GV(MIL
2 4
LIPORE社製)を用いてろ過滅菌した。それぞれの無血清馴化株の培養上清から得 られた各抗 CCR4キメラ抗体組成物に対し、公知の方法 [ジャーナル ·ォブ ·リキッド · クロマトグラフィー (Journal of liquid Chromatography), 6, 1577 (1983) ]に従ってそれ ぞれ単糖組成分析を行った。各抗体組成物の単糖組成比より計算される、全複合糖 鎖に占めるフコースを持たない複合型糖鎖の割合 (以下、フコース (-) %などと称す)を
^： ^した o
[0314] [表 2]
細胞株名 培養日数 フコース（- ) %
32-05-12AF 14 7%
6 88%
12-GMDB-2AF 12 87%
14 85%
6 84%
12-GMDB-5AF 12 82%
14 81% 培養終了時である培養 14日目において、 32-05-12AF株の生産する抗体組成物の フコース (-) %が 7%であったのに対し、 GMDを標的とした siRNA発現プラスミドを導入し たレクチン耐性株である 12- GMDB-2AF株および 12-GMDB-5AF株が生産する抗体 糸且成物のフコース (-) %は 81〜85%であった。従って、 GMDを標的とした siRNA発現プラ スミドを導入したレクチン耐性株は、無血清フエドバッチ培養においても、親株と比較 してフコース (-) %の高い抗体組成物の生産が可能であることが示された。また、培養 6 日目、 12日目、 14日目における 12- GMDB- 2AF株および 12- GMDB- 5AF株が生産す る抗体組成物のフコース (-) %は、ほぼ一定の値を示した。従って、 GMDを標的とした s iRNA発現プラスミドの導入による抗体組成物の複合型糖鎖への a 1,6-フコース付カロ を抑制する効果は、無血清フエドバッチ培養の過程にぉ 、て安定であることが示され た。
実施例 4
a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8)を標的とした siRNA発現ベクターライブラ リーを用いたレクチン耐性株取得に有効な siRNA標的配列の探索および FUT8を標 的とした有効 siRNA発現ベクターの構築 1. a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8)を標的とした siRNA発現ベクターライブ ラリー FUT8shRNAl¾/pPURの作製
( l) CHO細胞由来 α 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8) cDNA配列の取得 WO00/61739の記載に従って、チャイニーズノ、ムスター卵巣由来 CHO/DG44細胞 より調製した一本鎖 cDNAより、以下の手順でチャイニーズノヽムスター由来ひ 1 ,6-フコ シルトランスフェラーゼ（FUT8)をコードする cDNAをクローユングした。
[0316] まず、マウス FUT8の cDNA塩基配列 [GenBank Acc. No. AB025198]より、 5，側非翻 訳領域に特異的なフォワードプライマー (配列番号 68に示す)および 3 '側非翻訳領 域に特異的なリバースプライマー (配列番号 69に示す)を設計した。
次に DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製）を用いて、 CHO/DG44細胞由来の一本 鎖 cDNAl μ Lを含む 25 μ Lの反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製）、 0.2mmol/L dNTPs 、 4% DMSO、 0.5 μ mol/L上記特異的プライマー（配列番号 68および配列番号 69) ] を調製し、 PCRを行った。 PCRは、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 2分間力 なる反応を 1サイクルとして 30サイクルを行った後、さらに 72 °Cで 10分間反応させた。
[0317] PCR後、該反応液を 0.8%ァガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約 2Kb を回収した。該 DNA断片を、 TOPO TA cloning Kit (Invitrogen社製）用いて、添付の 説明書に従ってプラスミド PCR2.1と連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性コロニーのうち cDNAが組み込まれ た 8クローンから、公知の方法に従って各々プラスミド DNAを単離した。
[0318] 各プラスミドに挿入された cDNAの塩基配列は、 BigDye Terminator Cycle Sequenci ng FS Ready Reaction Kit (Applied Biosytems社製）を用いて添付の説明書に従って 、反応後、同社の DNAシーケンサー ABI PRISM 377を用いて解析した。本法により、 全てのプラスミドに挿入されて 、た cDNAが、チャイニーズノヽムスターの FUT8の ORF 全長をコードする cDNAであることを確認した。配列を決定したプラスミド DNAの挿入 c DNAうち、 PCRに伴う塩基の読み誤りを含まないプラスミド DNAを選択した。以下、本 プラスミドを CH1FUT8- pCR2.1と称す。このようにして決定したチャイニーズノヽムスター の FUT8 cDNAの塩基配列を配列番号 1に示した。 [0319] (2) FUT8を標的とした siRNA発現ベクターライブラリーの調製
本項（ 1 )で取得した CH!FUT8-pCR2.1を用いて、 WO03/46186実施例 13に記載の 方法に基づき、 FUT8を標的としたヒト tRNA-valプロモーター型 siRNA発現ベクターラ イブラリーを作製した。尚、アンチセンスコード DNAとセンスコード DNAとの間の Loop 配列としては制限酵素 S iHIの認識配列を用い、 pPUR(CLONTECH社製）をべクタ 一として用いた。以下、作製したライブラリーを FUT8shRNAl¾/pPUR/DH10Bと称す
[0320] siRNA発現ベクターライブラリー FUT8shRNAlib/pPUR/DH10Bを増幅し、プラスミド ベクターを調製した。滅菌シャーレ [243mm X 243mm X 18mm (Nalgenunc社製）]を用 いて 100 g/mLアンピシリンを含む LB寒天培地を作製し、そこに、シャーレ 1枚当たり 50 Lの FUT8shRNAlib/pPUR/DH10Bのグリセロールストックを播種した。 37°Cにて 一晚静置培養した後、プレート上の菌体を滅菌水に懸濁して回収し、公知の方法に 従ってプラスミド DNAを回収した。以下、回収したプラスミドを FUT8shRNAlib/pPURと 称す。
[0321] 2. α 1,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8)を標的とした siRNA発現ライブラリーを導 入したレクチン耐性株の取得
本実施例の 1.で得た FUT8を標的とした siRNA発現ライブラリープラスミド FUT8shR NAlib/pPURを、 32-05-12株へ導入し、 α 1,6-フコースを特異的に認識するレクチン である LCAに耐性を有する株を、以下のようにして取得した。
[0322] 本実施例の 1.で得たプラスミド FUT8shRNAlib/pPURを制限酵素 E^I (New Englan d Biolabs社製）で消化して線状化し、線状化した 10 gのプラスミド FUT8shRNAlib/p PURを 1.6 X 106個の 32- 05- 12株へエレクト口ポレーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytot echnology), 3, 133 (1990)]で導入した後、基本培地 [10%ゥシ胎児透析血清（Invitrog en社製）、 50 μ g/mLゲンタマイシン（ナカライテスタ社製）、および 500nmol/L MTX ( SIGMA社製）を含む IMDM (Invitrogen社製)]に懸濁し、接着細胞培養用 10cmデイツ シュ（Falcon社製） 3枚へ 8mLずつ播種した。この時、同一の条件で 10回の遺伝子導 入を行い、合計 30枚の培養用 10cmディッシュにおいて培養を行った。 5%COインキ
2 ュベータ一内で 37。C、 24時間培養後、ピューロマイシン（SIGMA社製）を 12 g/mLの 濃度で含む基本培地 8mLに培地交換した。 5%COインキュベーター内で 37°C
2 、 7日 間培養した後、ピューロマイシン（SIGMA社製）を 12 μ g/mLの濃度で、および LCA (V ECTOR社製）を 0.5mg/mLの濃度で含む基本培地 8mLに培地交換し、さらに 6〜8日 間の培養を行 ヽ、レクチン耐性クローンを取得した。
[0323] 3. α 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8)を標的とした siRNA発現プラスミドの標 的配列の解析
( 1)レクチン而性株ゲノム DNA上の siRNA発現カセットの単離
本実施例の 2.で得られたレクチン耐性株に対し、以下のようにしてゲノム DNAより si RNA発現カセットの単離を行った (図 7)。
レクチン而性クローンを、公知の方法 [Gene Targeting, Oxford University Press, (1 993)]に従って接着細胞用平底プレート（Greiner社製)へ採取し、ピューロマイシン (S IGMA社製）を 12 μ g/mLの濃度で含む基本培地を用いて 5%COインキュベーター
2
内で 37°C、 1週間培養した。
[0324] 培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 2枚の接着細胞用 平底 96穴プレート（Greiner社製）へ播種した。このうち 1枚のプレートをレプリカプレー トとする一方、残りの 1枚のプレートをマスタープレートとして凍結保存に供した。レプ リカプレートは、ピューロマイシン（SIGMA社製）を 12 μ g/mLの濃度で含む基本培地 を用いて 5%COインキュベーター内で 37°C
2 、 1週間培養した後、公知の方法 [アナリ ティカル 'バイオケミストリー (Analytical Biochemistry), 201 , 331 (1992)]に従って各ク ローンのゲノム DNAを調製し、各々 30 μ Lの TE- RNase緩衝液 (pH8.0) [10mmol/L Tr is— HC1、 lmmol/L EDTA、 200 μ g/mL RNase A]にー晚溶解した後、 0.05 μ g/ μ Lの 濃度となるように滅菌水で希釈した。
[0325] また、 FUT8を標的とした siRNA発現プラスミド FUT8shRNAlib/pPURの、 siRNA発現 カセットの tRNA-valプロモーター領域の上流に結合するフォワードプライマー（配列 番号 70)および siRNA発現カセットのターミネータ一配列の下流に結合するリバース プライマー (配列番号 71)を各々設計した。
DNAポリメラーゼ KOD polymerase (東洋紡績社製)を用いて、上記で調製した各ク ローンのゲノム DNAを铸型としたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を行った。 PCRは、各ク ローンについて、上記のゲノム DNA溶液を 5 μ L含む 50 μ Lの反応液 [KOD Bufferl ( 東洋紡績社製）、 0.2mmol/L dNTPs、 lmmol/L MgCl、 0.4 μ mol/L上記プライマー（
2
配列番号 70および配列番号 71) ]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 97°Cで 10秒 間、 68°Cで 30秒間力 なる反応を 1サイクルとした 25サイクルの条件で行った。 PCR後 、該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 siRNA発現カセットを含む領域の増幅 断片約 300bpを回収した。
[0326] 一方、プラスミド pPUR (CLONTECH社製） 2 μ gを制限酵素 Ε^Π (New England Biol abs社製)を加えて 37°Cで一晩消化反応を行った。消化反応後、該反応液をァガロー スゲル電気泳動に供し、約 4.3Kbの DNA消化断片を回収した。
上記で得られた PCR増幅断片 (約 300bp)を Ligation High (東洋紡績社製)を用いて プラスミド pPUR由来の Ε ϋΠ断片と、連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌 D Η5 α株を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に 従って各々プラスミド DNAを単離した。
[0327] (2) siRNA発現ユニットに含まれる標的配列の解析
本項（1)で得られたプラスミド中の siRNA発現カセットに含まれる FUT8に対する標 的配列の解析を行った。
[0328] まず、本項（1)で得た各プラスミド DNAに挿入された siRNA発現カセットの塩基配列 、 BigDye Terminator v3.0 Cycle sequencing Kit ^Applied Biosytems千土:^) 用いて 添付の説明書に従って、反応後、同社の DNAシーケンサー ABI PRISM 377を用いて 解析した。決定した 159クローンの塩基配列のうち、 FUT8に対する標的配列につい て、 CHO細胞 FUT8 cDNA配列 (配列番号 1)との相同性を比較し、各標的配列の配列 番号 1に対応する開始点および終止点を表 3に示した。
[0329] [表 3] クローン 標的配列 標的配列 標的配列 クロ一ン 標的配列 標的配列 標的配列 番号 開始点 終止点 長さ (bp) 番号 開始点 終止点 長さ (bp)
1 1 19 19 41 539 565 27
2 1 20 20 42 543 567 25
3 1 22 22 43 543 570 28
4 2 31 30 44 545 569 25
5 5 30 26 45 561 589 29
6 29 53 25 46 567 589 23
7 35 60 26 47 603 629 27
8 35 62 28 48 608 640 33
9 76 103 28 49 642 660 19
10 78 105 28 50 642 663 22
1 1 83 1 12 30 51 642 670 29
12 87 1 12 26 52 650 679 30
13 95 120 26 53 663 689 27
14 96 120 25 54 682 708 27
15 97 121 25 55 710 736 27
16 109 133 25 56 71 1 741 31
17 1 21 146 26 57 713 740 28
18 144 170 27 58 774 801 28
19 148 1 74 27 59 789 816 28
20 1 50 1 74 25 60 802 836 35
21 175 200 26 61 824 850 27
22 216 242 27 62 824 852 29
23 221 260 40 63 824 854 31
24 230 256 27 64 824 857 34
25 245 267 23 65 827 858 32
26 268 296 29 66 828 853 26
27 275 300 26 67 834 858 25
28 276 306 31 68 834 858 25
29 278 308 31 69 834 860 27
30 279 306 28 70 880 906 2フ
31 283 309 27 71 886 913 28
32 301 326 26 72 898 926 29
33 302 328 27 73 900 922 23
34 330 361 32 74 905 930 26
35 334 359 26 75 907 934 28
36 372 398 27 76 91 2 937 26
37 401 428 28 77 917 946 30
38 534 563 30 78 932 952 21
39 534 566 33 79 950 968 19
40 536 563 28 80 986 1013 28
クロ一ン 標的配列 標的配列 標的配列 クローン 標的配列 標的配列 標的配列
xp.口
番号 開始点 終止点 長さ (bp) 開始点 終止点 長さ (bp)
81 990 1019 30 121 1555 1578 24
82 1015 1042 28 122 1584 1612 29
83 1022 1049 28 123 1588 1615 28
84 1046 1071 26 124 1591 1615 25
85 1062 1089 28 125 1591 1619 29
86 1073 1102 30 126 1602 1626 25
87 1095 1124 30 127 1602 1629 28
88 1112 1137 26 128 1610 1637 28
89 1122 1145 24 129 1613 1637 25
90 1138 1169 32 130 1619 1645 27
91 1149 1174 26 131 1622 1647 26
92 1149 1182 34 132 1680 1707 28
93 1150 1181 32 133 1687 1713 27
94 1157 1181 25 134 1729 1746 18
95 1166 1191 26 135 1730 1746 17
96 1180 1207 28 136 1730 1746 17
97 1211 1237 27 137 1744 1758 15
98 1254 1278 25 138 1744 1768 25
99 1340 1365 26 139 1744 1773 30
100 1340 1370 31 140 1765 1796 32
101 1416 1445 30 141 1786 1811 26
102 1422 1448 27 142 1821 1839 19
103 1425 1453 29 143 1821 1842 22
104 1428 1460 33 144 1821 1844 24
105 1441 1468 28 145 1863 1890 28
106 1451 1480 30 146 1927 1951 25
107 1463 1491 29 147 1940 1965 26
108 1464 1489 26 148 1948 1984 37
109 1465 1490 26 149 1949 1976 28
110 1498 1517 20 150 1951 1979 29
111 1498 1517 20 151 1957 1982 26
112 1499 1526 28 152 1957 1982 26
113 1501 1534 34 153 1963 1987 25
114 1502 1529 28 154 1963 1989 2フ
115 1504 1529 26 155 1963 1990 28
116 1504 1530 27 156 1964 1987 24
11フ 1504 1534 31 157 1965 1990 26
118 1508 1526 19 158 1974 2000 27
119 1532 1557 26 159 1978 2008 31
120 1535 1563 29
159クローンの標的配列のうち、代表的であった標的部位に対応する RNA配列を配 列番号 14〜23に示した。
[0330] (3) siRNA発現ユニットに含まれる標的配列のマウス、ラットおよびヒトのホモログ配列 の検索
本項（2)で得られた配列番号 14〜23で示される標的配列に相当する配列をマウ ス、ラットおよびヒトの FUT8の配列中から、以下のようにして検索した。
[0331] 配列番号 2はマウスの FUT8を、配列番号 3はラットの FUT8を、配列番号 4はヒトの F UT8の配列をそれぞれ示す。該配列中より、本項（2)で得られた配列番号 14〜23で 示される標的配列に相当する配列を検索した。このとき、完全に一致する配列を除外 した。
以下に、選択した配列の配列番号をそれぞれ示す。配列番号 14に対応するマウス FUT8の配列は配列番号 85、配列番号 14に対応するヒト FUT8の配列は配列番号 8 6、配列番号 15に対応するマウス FUT8の配列は配列番号 24、配列番号 15に対応 するヒト FUT8の配列は配列番号 25、配列番号 15に対応するラット FUT8の配列は配 列番号 87、配列番号 16に対応するヒト FUT8の配列は配列番号 26、配列番号 17に 対応するヒト、マウスおよびラット FUT8の配列は配列番号 27、配列番号 18に対応す るマウス FUT8の配列は配列番号 28、配列番号 18に対応するヒト FUT8の配列は配 列番号 29、配列番号 18に対応するラット FUT8の配列は配列番号 30、配列番号 19 に対応するマウスおよびラット FUT8の配列は配列番号 31、配列番号 19に対応する ヒト FUT8の配列は配列番号 32、配列番号 20に対応するマウス FUT8の配列は配列 番号 33、配列番号 20に対応するヒト FUT8の配列は配列番号 34、配列番号 21に対 応するマウス FUT8の配列は配列番号 88、配列番号 21に対応するヒト FUT8の配列 は配列番号 89、配列番号 22に対応するラット FUT8の配列は配列番号 35にそれぞ れ示した。
[0332] 4. α 1,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8)を標的とした有効 siRNA発現ベクターの 構築
本実施例の 3.で得られた FUT8を標的とした siRNAの標的部位のうち、配列番号 1 5あるいは配列番号 16に含まれる配列を標的配列とする siRNA発現ベクターを以下 の手順で構築した（図 7、図 8および図 9)。
[0333] 本実施例の 3. (1)で得た siRNA発現カセットを含むプラスミドのうち、表 1に示すク ローン番号 31に相当する配列番号 15に含まれる標的配列である配列番号 72で示 される DNA配列をセンスコード DNAとして、配列番号 72で示される DNA配列に相補 的な塩基配列をアンチセンスコード DNAとして含むプラスミド (以下 FUT8shRNA/lib2 B/pPURと称す)、および、表 3に示すクローン番号 72に相当する配列番号 16に対応 する DNA配列をセンスコード DNAとして、配列番号 16に対応する DNA配列に相補的 な塩基配列をアンチセンスコード DNAとして含むプラスミド (以下 FUT8shRNA/lib3/pP URと称す)を選択した (図 7)。
[0334] まず、プラスミド FUT8shRNA/lib2B/pPURあるいは FUT8shRNA/lib3/pPUR 1 μ gを NEBuffer for EcoRI(New England Biolabs社製） 30 μ Lに溶解し、 10単位の制限酵素 E£2RIおよび ii2l(New England Biolabs社製）をカ卩えて 37°Cで 3時間消化反応を行つ た後、該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラノィォ社製)を 用いて約 250bpのヒト tRNA-valプロモータ^ ショートヘアピン型 RNA-ターミネータ一 配列発現カセットを含む DNA断片を回収した。
[0335] 一方、プラスミド pBluescriptll KS (+) 1.0 μ gを NEBuffer for EcoRI (New England Biol abs社製） 30 Lに溶解し、 10単位の制限酵素 EmRIおよび 20 KNew England Biolab s社製)を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。反応後、該反応液に滅菌水 13 L 、 10 X Alkaline Pnospnatase Buffer 5 μ Lおよび Alkaline Phosphatase E.coli C75 (タカ ラバイオ社製） 1単位を添加し、 37°Cで 1時間脱リン酸化反応を行った後、該反応液を ァガロースゲル電気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社製）を用いて約 2.9Kbの プラスミド pBluescriptll KS(+)由来の E RI-Xi l断片を回収した。
[0336] 上記で得た DNA EmRI- 22^1断片 (約 250bp) 8 μ プラスミド pBluescriptll KS (+)由 来の E RI- 0 l断片 (約 2.9Kb) 2 レ Ligation High (東洋紡社製） 10 μ Lを混合し、 16°Cで 2時間反応した。該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株 (インビトロジェン社製)を 形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンより QIAprep spin Mini prep Kit (キア ゲン社製）を用いてプラスミド DNAを単離した。本プラスミドのうち、プラスミド FT81ibB/ pPUR由来の約 250bpの DNA断片が挿入されたプラスミドを以下 FT81ibB/pBS、プラス ミド FT81ib3/pPUR由来の約 250bpの DNA断片が挿入されたプラスミドを以下 FT81ib3 /pBSとそれぞれ称す。
[0337] プラスミド FT81ibB/pBSあるいは FT81ib3/pBS 1 μ gを NEBuffer4 (New England Biolab s社製） 20 μ Lに溶解し、 10単位の制限酵素 I (New England Biolabs社製）をカロえ て 25°Cで 5時間消化反応を行った後、 65°C、 20分間の加熱による制限酵素^ mlの不 活化処理を行った。該反応液に滅菌水 14.6 L、 10 X NEBuffer2 (New England Biola bs社製）4 /z L、 100 X BSA(New England Biolabs社製） 0.4 Lゝ 10単位の制限酵素 Xh ol (New England Biolabs社製）をそれぞれ加えて 37°Cでー晚消化反応を行った後、 該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社製)を用い て約 250bpのヒ RNA-valプロモータ^ ショートヘアピン型 RNA-ターミネータ一配列 発現カセットを含む DNA断片を回収した。
[0338] 一方、プラスミド pAGE249 1 μ gを NEBufferl (New England Biolabs社製） 30 μ Lに溶 解し、 10単位の制限酵素 1および0i2l (New England Biolabs社製）を加えて 37°C で 6時間消化反応を行った。消化反応後、該反応液に滅菌水 22 L、 10 X Alkaline P hosphatase Buffer 6 μ Lおよび Alkaline Phosphatase E.coli C75 (タカラバイオ社製） 1 単位を添加し、 37°Cで 1時間脱リン酸化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電 気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社製）を用いて約 4.4Kbのプラスミド pAGE24 9由来の Na§I-20 I断片を回収した。尚、 PAGE249は、 pAGE248 [ジャーナル 'ォブ' バイオロジカル.ケミストリー（J. Biol. Chem., 269, 14730 (1994)]の誘導体であり、 pA
GE248よりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 (dhfr)発現ユニットを含む、制限酵素 ilで 切り出される、 2.7Kbの断片を除去したベクターである。
[0339] 上記で得た約 250bpの DNA断片 10 μ L、プラスミド pAGE249由来の約 4.4Kbの Hagl- XhoIir -5 μ Lおよび Ligation High (東洋紡社製） 15 μ Lを混合し、 16°Cでー晚反応 した。該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株 (インビトロジェン社製)を形質転換し、得ら れたアンピシリン而性クローンより QIAprep spin Mini prep Kit (キアゲン社製）を用い てプラスミド DNAを単離した。各プラスミドに挿入された DNAの塩基配列を、 DNAシー クェンサ1 ~" 377 (Parkin Elmer社製)および BigDye Terminator v3.0し ycle Sequencing Kit (Applied Biosytems社製）を用いて、添付マニュアルに従い決定した。シークェン ス解析のプライマーには、 pAGE249-seq FW (配列番号 73)および pAGE249-seq RV( 配列番号 74)を用い、挿入 DNAの配列力 プラスミド FUT8shRNA/lib2B/pPURある いはプラスミド FUT8shRNA/lib3/pPURに含まれるヒト tRNA-valプロモータ^ ショート ヘアピン RNA発現ユニットである EmRi-20mi断片に相当する配列と矛盾しないことを 確認した。本プラスミドのうち、プラスミド FUT8shRNA/lib2B/pPUR由来の約 250bpの DNA断片が挿入されたプラスミドを以下 FT81ibB/pAGE、プラスミド FUT8shRNA/lib3/ pPUR由来の約 250bpの DNA断片が挿入されたプラスミドを以下 FT81ib3/pAGEとそ れぞれ称す。
実施例 5
[0340] GMDを標的とした siRNA発現プラスミド導入レクチン耐性株への FUT8を標的とした si RNA発現プラスミド共導入による L-フコース存在条件下レクチン耐性 CHO/DG44細 胞の作製
1. GMDを標的とした siRNA発現ベクターを導入したレクチン耐性株への FUT8を標 的とした siRNA発現ベクターの導入による L-フコース存在下におけるレクチン耐性株 の取得および培養
(D FUT8を標的とした siRNA発現ベクターの導入による L-フコース存在下における レクチン耐性株の取得
実施例 1にお 、て取得した GMDを標的とした siRNA発現ベクター導入レクチン耐性 株 12- GMDB-2株または 12- GMDB-5株へ、実施例 2にお!/、て構築した FUT8を標的 とした siRNA発現ベクター FT81ibB/pAGEあるいは FT81ib3/pAGEを導入し、 L-フコー ス添加培養条件におけるレクチン耐性株を取得した。
[0341] プラスミド FT81ibB/pAGEあるいは FT81ib3/pAGEの 12- GMDB- 2株あるいは 12- GM DB-5株への遺伝子導入は上記実施例 1の 2. (1)と同様に行った。
遺伝子導入後、細胞懸濁液を 12 g/mLの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製)を 含む基本培地に懸濁し、接着細胞培養用 10cmディッシュ (ファルコン社製) 4枚へ播 種した。 37°C、 5%COの存在下で 24時間培養した後、培養上清を除去し、 400 μ g/m
2
Lの濃度でハイグロマイシン (和光純薬社製)および 3 μ g/mLの濃度でピューロマイシ ン (SIGMA社製)をそれぞれ含む基本培地を注入し、さら〖こ 8日間培養した。その後、 ディッシュ 1枚について、培養上清を除去し、 400 g/mLハイグロマイシン (和光純薬 社製)および 3 μ g/mLの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製)を含む基本培地を注 入し、さらに 6〜8日間の培養した後、出現したノヽィグロマイシン耐性コロニー数を計 数した。一方、残りのディッシュについて、培養上清を除去し、 400 g/mLハイグロマ イシン (和光純薬社製)、 3 μ g/mLピューロマイシン (SIGMA社製）、 100 μ mol/Lの濃 度で L-フコース (ナカライテスタ社製)および 0.5mg/mLの濃度で LCA(VECTOR社製） をそれぞれ含む基本培地を注入し、さら〖こ 9日間培養し、 100 μ mol/Lの L-フコース存 在下でのレクチン耐性クローン、即ち FUT8を標的とした siRNA発現ベクターおよび G MDを標的とした siRNA発現ベクター共導入レクチン耐性株を取得した。
(2)レクチン耐性株の拡大培養
本項（1)で取得した FUT8を標的とした siRNA発現ベクターおよび GMDを標的とした siRNA発現ベクター共導入レクチン耐性株を、以下の手順で拡大培養した。
まず、各ディッシュに出現したコロニー数の計数を行った。その後、レクチン耐性コロ ニーを、実体顕微鏡観察下にてピペットマン (GILSON社製)を用いて搔き取って吸 い込み、接着細胞用 U底 96穴プレート (旭テクノグラス社製)へ採取した。トリプシン処 理を行った後、接着細胞用平底 96穴プレート（Greiner社製)へ各クローンを播種し、 400 μ g/mLの濃度でノヽィグロマイシン (和光純薬社製)および 3 μ g/mLの濃度でピュ 一口マイシン（SIGMA社製）を含む基本培地を用いて 5%CO、 37°Cの条件下でー晚
2
培養した。培養後、培養上清を除去し、 400 g/mLの濃度でハイグロマイシン (和光 純薬社製）、 3 g/mLの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製)、 100 mol/Lの濃度で L-フコース（ナカライテスタ社)および 0.5mg/mlの濃度で LCA(VECTOR社製）を含む 基本培地を用いて、さら〖こ 6日間培養した。培養後、上記プレートの各クローンにつ V、て、 400 μ g/mLの濃度でハイグロマイシン（和光純薬社製）および 3 μ g/mLの濃度 でピューロマイシン (SIGMA社製)を含む基本培地を用いて拡大培養を行った。以下 、拡大培養を行った細胞株のうち、 12-GMDB-2株へ FT81ibB/pAGEを導入して得ら れたレクチン而性株を 12- GB2/FB- 1、 12- GB2/FB- 2、 12- GB2/FB- 3、 12- GB2/FB- 4、 12- GB2/FB- 5と、 12- GMDB- 2株へ FT81ib3/pAGEを導入して得られたレクチン耐 性株を 12- GB2/F3- 1、 12- GB2/F3- 2、 12- GB2/F3- 3、 12- GB2/F3- 4、 12- GB2/F3- 5と、 12- GMDB- 5株へ FT81ibB/pAGEを導入して得られたレクチン而性株を 12- GB5/ FB- 1、 12- GB5/FB- 2、 12- GB5/FB- 3、 12- GB5/FB- 4、 12- GB5/FB- 5と、 12- GMDB - 5株へ FT81ib3/pAGEを導入して得られたレクチン而性株を 12- GB5/F3- 1、 12- GB5 /F3- 2、 12- GB5/F3- 3、 12- GB5/F3- 4、 12- GB5/F3- 5とそれぞれ称す。尚、 12- GB5 /FB-1株および 12-GB5/F3-2株は、平成 16年 7月 1日付けで独立行政法人産業技 術総合研究所 特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中 央第 6)に 12- GB5/FB- 1株は FERM BP- 10049として、 12- GB5/F3- 2株は FERM BP- 10050として、それぞれ寄託されている。
[0343] 2. GMDを標的とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRNA発現べクタ 一を導入した L-フコース存在下レクチン耐性株における GMDおよび FUT8 mRNA量 の定量
(1) total RNAの調製
ベクター導入前の親株である 32-05-12株、実施例 1で取得した GMDを標的とした s iRNA発現ベクターを導入したレクチン耐性株である 12- GMDB- 2株および 12- GMDB -5株、並びに本実施例の 1.で取得した FUT8を標的とした siRNA発現ベクターおよ び GMDを標的とした siRNA発現ベクターを共導入したレクチン耐性株からの total RN A調製は以下の手順で行った。
[0344] 32- 05- 12株は基本培地を、 12- GMDB- 2株および 12- GMDB- 5株は 12 μ g/mLの濃 度でピューロマイシン（SIGMA社製）を含む基本培地を、 GMDおよび FUT8を標的と した siRNA発現ベクターを導入したレクチン耐性株は 400 μ g/mLの濃度でノヽィグロマ イシン (和光純薬社製)および 3 μ g/mLの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製)を含 む基本培地を用いて、それぞれ 3 X 105cells/mLの細胞密度で懸濁し、接着細胞用 6c mディッシュ（ファルコン社製）に 4mLずつ播種した。 5%CO
2、 37°Cの条件下で 3日間 培養し、トリプシン処理により各細胞懸濁液を回収し、 lOOOrpm, 4°Cで 5分間の遠心 分離を行って細胞を回収した。回収した細胞をダルベッコ PBS緩衝液（Invitrogen社 製）に懸濁し、再度 1000rpm、 4°Cで 5分間の遠心分離を行って細胞を回収した後、 R Neasy(QIAGEN社製)を使用し total RNAを抽出した。方法は添付の説明書に従い、 調製した total RNAを 40 Lの滅菌水に溶解した。
[0345] (2) single strand cDNA合成
本項（1)にお!/、て得られた各々の total RNA 3 μ gに対し、 SUPERSCRIPT™ Preampl ification System for First Strand cDNA Synthesis (Invitrogen社製）を用いて添付の説 明書に従い、オリゴ (dT)をプライマーとした 20 Lの系で逆転写反応を行うことにより 、一本鎖 cDNAを合成した。その後、 RNase処理を行い、最終反応液量を 40 しとした 。さらに、該反応液を各々、滅菌水を用いて 50倍に希釈し、以下に記載する遺伝子 転写量の解析に供した。 [0346] (3) SYBR-PCRによる GMD遺伝子転写量の定量
GMD遺伝子由来の mRNA転写量の定量および β -ァクチン遺伝子由来の mRNA転 写量の定量は、以下の手順で行った。なお、 GMD定量の内部コントロールとしては、 WO02/31140実施例 15記載の CHO細胞由来 GMD cDNAを含むプラスミド pAGE249 GMDを 0.0512fg/ μ L、 0.256fg/ μ L、 1.28fg/ μ L、 6.4fg/ μ L、 32fg/ μ L、 160fg/ μ L< 濃度にそれぞれ希釈したものを、 j8 -ァクチン定量の内部コントロールとしては、 WO0 2/31140実施例 9記載の β -ァクチンスタンダードプラスミドを 1.28ί¾/ /ζ L、 6.41¾/ L、 32fg/ μ L、 160fg/ μ L、 800fg/ μ L、 4000fg/ μ Lの濃度にそれぞれ希釈したものをそ れぞれ使用した。また、 PCRプライマーとしては、 GMDの増幅には配列番号 64に示 すフォワードプライマーおよび配列番号 65に示すリバースプライマーを、 β -ァクチン の増幅には配列番号 66に示すフォワードプライマーおよび配列番号 67に示すリバ ースプライマーをそれぞれ使用した。
[0347] For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R- PCR Version (タカラバイオ社製）を用いて、 本項（2)において調製した single strand cDNA溶液あるいは各濃度の内部コントロー ルプラスミド溶液を各々 5 μ L含む 20 μ Lの反応液 [R- PCR buffer (タカラバイオ社製） 、 2.5mmol/L Mg2+ Solution for R— PCR (タカラバイオ社製）、 0.3mmol/L dNTPmixture (タカラバイオ社製）、 0.3 μ mol/Lフォワードプライマー、 0.3 μ mol/Lリバースプライマ 一、 2 X 10— 5希釈 SYBR Greenl、 1単位 TaKaRa Ex Taq R- PCR]を調製した。調製した 反応液を 96- well Polypropylene PCR reaction Plate (ファルコン社製）の各ゥエルへ 分注し、 Plate Sealer (Edge Biosystems)を用いてプレートをシールした。 PCR反応お よび解析には、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection Systemを用い、添付マ-ユア ルに従って GMD mRNA量および 13 -ァクチン mRNA量の測定を行った。
[0348] 内部コントロールプラスミドでの測定結果力 検量線を作成し、 GMD mRNA量およ び β -ァクチン mRNA量を数値ィ匕した。さら〖こ、細胞株間での β -ァクチン遺伝子由来 の mRNA転写量は均一であると考え、 j8 -ァクチン mRNA量に対する GMD mRNA量の 相対値を算出し、その値を比較した結果を図 10に示した。親株である 32-05-12株の GMD mRNA量と比較して、 FUT8を標的とした siRNA発現ベクターおよび GMDを標的 とした siRNA発現ベクターの共導入により得られた細胞株ではいずれも、 GMD mRNA 量が約 10%に低下していた。
[0349] (4) SYBR- PCRによる FUT8遺伝子転写量の定量
FUT8遺伝子由来の mRNA転写量の定量および β -ァクチン遺伝子由来の mRNA転 写量の定量は、以下の手順で行った。なお、 FUT8定量の内部コントロールとしては、 WO02/31140実施例 9記載の FUT8スタンダードプラスミドを 0.05121¾/ L、 0.256fg/ μ L、 1.28fg/ レ 6.4fg/ レ 32fg / レ 160fg/ Lの濃度にそれぞれ希釈したもの を、 13 -ァクチン定量の内部コントロールとしては、 WO02/31140実施例 9記載の 13 - ァクチンスタンダードプラスミドを 1.28fg/ μ L、 6.4fg/ μ L、 32fg/ μ L、 160fg/ μ L、 800f g/ レ 400(¾/ /ζ Lの濃度にそれぞれ希釈したものそれぞれを使用した。また、 PCR プライマーとしては、 FUT8の増幅には配列番号 75に示すフォワードプライマーおよ び配列番号 76に示すリバースプライマーを、 13 -ァクチンの増幅には配列番号 66に 示すフォワードプライマーおよび配列番号 67に示すリバースプライマーをそれぞれ 使用した。
[0350] For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R— PCR Version (タカラバイオ社製）を用いて、 本項（2)において調製した single strand cDNA溶液あるいは各濃度の内部コントロー ルプラスミド溶液を各々 5 μ L含む 20 μ Lの反応液 [R- PCR buffer (タカラバイオ社製） 、 2.5mmol/L Mg2+ Solution for R— PCR (タカラバイオ社製）、 0.3mmol/L dNTPmixture (タカラバイオ社製）、 0.3 μ mol/Lフォワードプライマー、 0.3 μ mol/Lリバースプライマ 一、 2 X 10— 5希釈 SYBR Greenl、 1単位 TaKaRa Ex Taq R- PCR]を調製した。調製した 反応液を 96- well Polypropylene PCR reaction Plate (ファルコン社製）の各ゥエルへ 分注し、 Plate Sealer (Edge Biosystems)を用いてプレートをシールした。 PCR反応お よび解析には、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection Systemを用い、添付マ-ユア ルに従って GMD mRNA量および 13 -ァクチン mRNA量の測定を行った。
[0351] 内部コントロールプラスミドでの測定結果力も検量線を作成し、 FUT8 mRNA量およ び β -ァクチン mRNA量を数値ィ匕した。さら〖こ、細胞株間での β -ァクチン遺伝子由来 の mRNA転写量は均一であると考え、 j8 -ァクチン mRNA量に対する FUT8 mRNA量 の相対値を算出し、その値を比較した結果を図 1 1に示した。親株である 32-05-12株 の FUT8 mRNA量と比較して、 FUT8を標的とした siRNA発現ベクターおよび GMDを標 的とした siRNA発現ベクターの共導入により得られた細胞株ではいずれも、 FUT8 mR NA量が約 10%低下していた。
実施例 6
[0352] GMDを標的とした siRNA発現プラスミドおよび FUT8を標的とした siRNA発現プラスミド を導入した CHO/DG44細胞を用いた抗体組成物の生産
1. L-フコース非添加培養下での抗体組成物の取得
ベクター導入前の親株である 32-05-12株、実施例 1にお!/、て取得した GMDを標的 とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチン而株 12-GMDB-2株、 12-GMDB-5株、 並びに実施例 3において取得した FUT8を標的とした siRNA発現ベクターおよび GMD を標的とした siRNA発現ベクターを共導入したレクチン耐株 12- GB2/FB- 1株、 12-GB 2/FB- 3株、 12- GB2/F3- 3株、 12- GB2/F3- 5株、 12- GB5/FB- 1株、 12- GB5/FB- 2株 、 12-GB5/F3-2株、 12-GB5/F3-4株が生産する抗 CCR4キメラ抗体組成物を以下の 手順で取得した。
[0353] 32- 05- 12株は基本培地を、 12- GMDB- 2株および 12- GMDB- 5株は 12 μ g/mLの濃 度でピューロマイシン (SIGMA社製）を含む基本培地を、 12- GB2/FB- 1株、 12-GB2/ FB- 3株、 12- GB2/F3- 3株、 12- GB2/F3- 5株、 12- GB5/FB- 1株、 12- GB5/FB- 2株、 12- GB5/F3- 2株および 12- GB5/F3- 4株は 400 μ g/mLの濃度でハイグロマイシン（和 光純薬社製)および 3 μ g/mLの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製)を含む基本培 地を用いて、それぞれ 3 X 105cells/mLの細胞密度で懸濁し、接着細胞用 T75フラスコ (グライナ一社製）に 15mLずつ播種した。 5%CO、 37°Cの条件下で 6日間培養後、培
2
養上清を除去し、 10mLのダルベッコ PBS (インビトロジェン社製)で洗浄を行った後、 E XCELL301培地（JRH Bioscience社製）を 20mL注入した。 5%CO、 37°Cの条件下で 7
2
日間培養後、培養上清を回収し、 MabSelect (アマシャムバイオサイエンス社製)カラ ムを用いて、添付の説明書に従い、抗 CCR4キメラ抗体組成物を精製した。精製した 各抗 CCR4キメラ抗体組成物は、それぞれ Econo- Pac 10DG (バイオラッド社製)を用 いて 10mmol/L KH POバッファーに置換し、 0.22 μ m孔径 Millex GV (MILLIPORE社
2 4
製)を用いてろ過滅菌した。
[0354] 2. L-フコース添加培養下での抗体組成物の取得 ベクター導入前の親株である 32-05-12株、実施例 1にお!/、て取得した GMDを標的 とした siRNA発現プラスミドを導入したレクチン而株 12- GMDB- 2株および 12- GMDB- 5株、並びに実施例 3にお!/、て取得した GMDおよび FUT8を標的とした siRNA発現プ ラスミドを導入したレクチン而す株 12- GB2/FB- 1株、 12- GB2/FB- 3株、 12- GB2/F3- 3 株、 12- GB2/F3- 5株、 12- GB5/FB- 1株、 12- GB5/FB- 2株、 12- GB5/F3- 2株および 1 2-GB5/F3-4株力 L-フコース添加培養条件にぉ 、て生産する抗 CCR4キメラ抗体 組成物を以下の手順で取得した。
32- 05- 12株は基本培地を、 12- GMDB- 2株および 12- GMDB- 5株は 12 μ g/mLの濃 度でピューロマイシン (SIGMA社製）を添カ卩した基本培地を、 12-GB2/FB-1株、 12-G B2/FB- 3株、 12- GB2/F3- 3株、 12- GB2/F3- 5株、 12- GB5/FB- 1株、 12- GB5/FB- 2 株、 12- GB5/F3- 2株および 12- GB5/F3- 4株は 400 μ g/mLの濃度でハイグロマイシン (和光純薬社製)および 3 μ g/mLの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製)を添加した 基本培地を用いて、それぞれ 3 X 105cells/mLの細胞密度で懸濁し、接着細胞用 T75 フラスコ（グライナ一社製）に 15mLずつ播種した。 5%CO、 37°Cの条件下で 3日間培
2
養後、培養上清を除去し、 32-05-12株は 500 μ mol/L L-フコース (ナカライテスタ社 製）を添カ卩した基本培地に、 12- GMDB- 2株、および 12- GMDB- 5株は 500 mol/L L -フコース (ナカライテスタ社製）および 12 μ g/mLピューロマイシン (SIGMA社製）を添 加した基本培地に、 12- GB2/FB- 1株、 12- GB2/FB- 3株、 12- GB2/F3- 3株、 12- GB2 /F3- 5株、 12- GB5/FB- 1株、 12- GB5/FB- 2株、 12- GB5/F3- 2株、 12- GB5/F3- 4株 は 500 μ mol/Lの濃度で L-フコース (ナカライテスタ社製）、 400 μ g/mLの濃度でハイ グロマイシン (和光純薬社製)および 3 μ g/mLの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製） を添加した基本培地にそれぞれ交換した。さらに 5%CO、 37°Cの条件下で 3日間培
2
養後、培養上清を除去し、 10mLのダルベッコ PBS (インビトロジェン社製)で洗浄を行 つた後、 500 μ mol/Lの濃度で L-フコース (ナカライテスタ社製）を添加した EXCELL30 1培地 ORH Bioscience社製）を 20mL注入した。 5%CO、 37°Cの条件下で 3日間培養
2
後、各フラスコに 10mmol/L L-フコース (ナカライテスタ社製）を lmL添カ卩し、さらに 4日 間培養した。培養後、培養上清を回収し、 MabSelect (アマシャムバイオサイエンス社 製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗 CCR4キメラ抗体をそれぞれ精製した。 精製した各抗 CCR4キメラ抗体組成物は、それぞれ Econo-Pac 10DG (バイオラッド社 製）を用いて 10mmol/L KH POバッファーに置換し、 0.22 μ m孔径 Millex GV(MILLIP
2 4
ORE社製)を用いてろ過滅菌した。
[0356] 3.抗体組成物の単糖組成分析
本実施例の 1.および 2.で取得した、各抗 CCR4キメラ抗体組成物に対し、公知の 方法 [ジャーナル ·ォブ ·リキッド ·クロマトグラフィー (Journal of liquid Chromatography) , 6, 1577, (1983) ]に従ってそれぞれ単糖組成分析を行った。
各抗体組成物の単糖組成比より計算される、フコース (-) %を表 4に示した。
[0357] [表 4]
Figure imgf000132_0001
L-フコース非添加培養下では、 GMDに対する siRNA発現ベクターの導入に供した 親株 32-05-12株の生産する抗体組成物のフコース (-) %が 3%であったのに対し、 GM Dを標的とした siRNA導入レクチン耐性株 12-GMDB-2株、 12-GMDB-5株が生産す る抗体組成物のフコース (-) %はそれぞれ 78%、 79%であり、 GMDを標的とした siRNA を導入することにより、親株細胞が生産する抗体組成物のフコース (-) %と比較してフコ ース (-) %が上昇している。さらに、 GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした si RNAの共導入レクチン而性株 12- GB2/FB- 1株、 12- GB2/FB- 3株、 12- GB2/F3- 3株 、 12- GB2/F3- 5株、 12- GB5/FB- 1株、 12- GB5/FB- 2株、 12- GB5/F3- 2株および 12- GB5/F3-4株では、これらの細胞が生産する抗体組成物のフコース (-) %はそれぞれ 9 1%カゝら 98%であり、 GMDを標的とした siRNAを単独で導入したレクチン耐性株が生 産する抗体組成物のフコース (-) %と比較して、フコース (-) %はさらに上昇して 、た。
[0358] また、 L-フコース添加培養下では、 GMDに対する siRNA発現ベクターの導入に供し た親株 32-05-12株の生産する抗体組成物のフコース (-) %が 6%であったのに対して、 GMDを標的とした siRNA導入レクチン而性株 12- GMDB- 2株および 12- GMDB- 5株が 生産する抗体組成物のフコース (-) %はそれぞれ 6%、 8%であった。一方、 GMDを標 的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNAの共導入レクチン耐性株 12-GB2/FB- 1株、 12- GB2/FB- 3株、 12- GB2/F3- 3株、 12- GB2/F3- 5株、 12- GB5/FB- 1株、 12- GB5/FB- 2株、 12-GB5/F3-2株および 12-GB5/F3-4株では、これらの細胞が生産す る抗体組成物のフコース (-) %はそれぞれ 66%力 81%の間の値であり、 GMDを標的 とした siRNAを単独で導入したレクチン耐性株が生産する抗体組成物のフコース (-) % と比較して、フコース (-) %は大幅に上昇していた。
[0359] 従って、 L-フコース非添カ卩あるいは添加培養下のいずれの場合においても、 GMD を標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNAを共導入したレクチン耐性株が生 産する抗体組成物のフコース (-) %は、 GMDを標的とした siRNAを単独で導入したレク チン耐性株が生産する抗体組成物のフコース (-) %よりも高力つたことから、 L-フコース の存在有無に因らず、 GMDを標的とした siRNA単独の導入による細胞の生産する抗 体の複合型糖鎖への a 1,6-フコース付加を抑制する効果よりも、 GMDを標的とした si RNAおよび FUT8を標的とした siRNAの共導入による細胞の生産する抗体組成物の 複合型糖鎖への (X 1,6-フコース付加を抑制する効果の方が高いことが示された。
[0360] また、 GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNAを共導入したレクチ ン耐性株が生産する抗体組成物のフコース (-) %力 GMDを標的とした siRNAによるフ コース (-) %の上昇効果が消失する L-フコース添加培養下より、 L-フコース非添加培 養下の方が高かったことから、 FUT8を標的とした siRNA単独の導入による細胞の生 産する抗体の複合型糖鎖への α 1 ,6-フコース付加を抑制する効果よりも、 GMDを標 的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNAの共導入による細胞の生産する抗体 組成物の複合型糖鎖への ex 1 ,6-フコース付加を抑制する効果の方が高いことが示さ れた。
実施例 7
[0361] GMDを標的とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRNA発現ベクター を導入した CHO/DG44細胞の無血清フヱドバッチ培養
1. GMDを標的とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRNA発現べクタ 一を導入した CHO/DG44細胞の無血清培地への馴化
ベクター導入前の親株である 32-05-12株、実施例 3にお 、て取得した GMDを標的 とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRNA発現ベクターを導入したレ クチン而株 12- GB2/FB- 1株、 12- GB2/FB- 3株、 12- GB2/F3- 3株、 12- GB2/F3- 5株 、 12- GB5/FB- 1株、 12- GB5/FB- 2株、 12- GB5/F3- 2株、 12- GB5/F3- 4株の無血清 培地への馴化を、以下の手順で行った。
[0362] 32- 05- 12株は基本培地を、 12- GB2/FB- 1株、 12- GB2/FB- 3株、 12- GB2/F3- 3株 、 12- GB2/F3- 5株、 12- GB5/FB- 1株、 12- GB5/FB- 2株、 12- GB5/F3- 2株および 12- GB5/F3- 4株は 400 μ g/mLの濃度でハイグロマイシン (和光純薬社製)および 3 μ g/m Lの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製)を添カ卩した基本培地を用いて、それぞれ 3 X 105 cells/mLの細胞密度で懸濁し、接着細胞用 T75フラスコ（グライナ一社製）に 15 mLずつ播種した。 5%CO
2、 37°Cの条件下で 3日間培養し、トリプシン処理により各細 胞懸濁液を回収し、 lOOOrpm, 5分間の遠心分離を行って細胞を回収した。 32-05-12 株は、 MTX (SIGMA社製）を 500nmol/Lの濃度で、 L-グルタミン (インビトロジェン社製) を 6mmol/Lの濃度で、ゲンタマイシン (ナカライテスタ社製)を 50 g/mLの濃度で、 3, 3,5- Triiodo- L- thyronine (SIGMA社製）を 100nmol/Lの濃度で含む EX- CELL302培 地 (JRH社製）（以下、無血清培地と称す）を、 12- GB2/FB- 1株、 12- GB2/FB- 3株、 1
2- GB2/F3- 3株、 12- GB2/F3- 5株、 12- GB5/FB- 1株、 12- GB5/FB- 2株、 12- GB5/F
3- 2株および 12- GB5/F3- 4株は 400 μ g/mLの濃度でハイグロマイシン (和光純薬社 製)および 3 μ g/mLの濃度でピューロマイシン (SIGMA社製)を添加した無血清培地を 用いて、それぞれ回収した細胞を 5 X 105cells /mLの密度で懸濁し、該細胞懸濁液 15 mLを 125mL三角フラスコ（コ一-ング社製）に播種した。培養容器の 4倍量以上の 5% COを通気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、 35°C
2 、 90〜100rpmにて浮 遊旋回培養を行った。 3〜4日間隔で継代を繰り返し、最終的には無血清培地で増 殖可能な細胞株を取得した。以下、無血清培地へ馴化した 32-05-12株を 32-05-12 AF、無血清培地へ馴化した 12-GB2/FB-1株を Wi2B-lAF、無血清培地へ馴化した 1 2-GB2/FB-3株を Wi2B-3AF、無血清培地へ馴化した 12-GB2/F3-3株を Wi23-3AF 、無血清培地へ馴化した 12-GB2/F3-5株を Wi23-5AF、無血清培地へ馴化した 12- GB5/FB- 1株を Wi5B- 1AF、無血清培地へ馴化した 12- GB5/FB- 2株を Wi5B- 2AF、 無血清培地へ馴化した 12- GB5/F3- 2株を Wi53- 2AF、 12- GB5/F3- 4株を Wi53- 4AF とそれぞれ称す。
[0363] 2.無血清培地に馴化した GMDを標的とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的 とした siRNA発現ベクターを導入した CHO/DG44細胞を用いた無血清フエドバッチ培 養
本実施例の 1.で無血清培地に馴化した 32-05-12AF株、 Wi23-3AF株、 Wi23-5AF 株、および Wi5B- 1AF株を用いて、以下の手順で無血清フエドバッチ培養を行った。
[0364] フエドバツチ培養には、無血清フエドバッチ培養培地およびフィード培地を用いた。
32- 05- 12AF株、 Wi23- 3AF株、 Wi23- 5AF株、および Wi5B- 1AF株を、 3 X 105cells/ mLの密度で無血清フ ドバツチ培養培地に懸濁し、該細胞懸濁液を 250mL三角フラ スコ（コ一-ング社製）に 40mLずつ播種した。培養容器の 4倍量以上の 5%COを通
2 気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、 35°C、 90〜100rpmにて浮遊旋回培 養を行った。培養開始後 3日目、 6日目、 9日目、 12日目に、アミノ酸等の消費量を補 う目的でフィード培地を 3.3mL添加し、グルコース濃度を制御する目的で 20% (w/v) グルコース溶液を終濃度 5000mg/Lとなるように添加した。培養開始後 0日目、 3日目 、6日目、 9日目、 12日目、 14日目に培養液を 2〜4mL採取し、生細胞密度と細胞生 存率をトリパンブルー染色により、各培養上清中に含まれる抗体濃度を本実施例の 3 . (1)に記載の ELISAによる抗体濃度の定量法によりそれぞれ測定した。 32-05-12AF 株および Wi23-5AF株についての培養開始後の各時点における生細胞密度および 培養上清中の抗体組成物濃度の結果を図 12および図 13にそれぞれ示した。 32-05 -12AF株と Wi23-5AF株は、培養開始後の各時点の生細胞密度、および培養上清中 の抗体組成物濃度はそれぞれ同等であった。従って、 GMDを標的とした siRNAおよ び FUT8を標的とした siRNAの標的配列は、細胞の増殖性や抗体の生産性には大き な影響を及ぼさな 、配列であることが示された。
[0365] 3.可溶性ヒト Fc y RIIIaに対する結合活性を指標とした、還元末端の N-ァセチルダル コサミンの 6位にフコースの 1位が a結合して 、な 、糖鎖を持つ抗体の定量
本実施例の 2.で取得した 32- 05- 12AF株、 Wi23- 3AF株、 Wi23- 5AF株および Wi5B -1AF株の無血清フエドバッチ培養上清中に含まれる抗 CCR4キメラ抗体組成物のフ コース (-)％を、 WO03/85119の実施例 10に記載の可溶性ヒト Fc y RIIIa (以下、 shFc y Rlllaと表記）に対する結合活性を指標として、以下の手順で測定した。
[0366] ( l) ELISAによる抗体濃度の定量
培養上清中の抗体濃度の定量は、上記実施例 3の 2. (3)と同様にして行った。 各希釈試料の抗体濃度の算出は、標準抗体精製標品を用いて作製した検量線シ グモイドカーブの直線領域を使用して行 ヽ、得られた希釈試料の抗体濃度に希釈率 を乗じて、培養上清の抗体濃度をそれぞれ算出した。
[0367] (2)フコース (-) %の異なる標準品の調製
WO03/85119の実施例 4に記載の、 YB2/0細胞由来の抗 CCR4キメラ抗体 KM2760- 1および CHO/DG44細胞由来の KM3060を用い、フコース (-) %が異なる標準品を調製 した。 KM2760-1 , KM3060,並びに KM2760-1と KM3060を混合して調製した 9サンプ ルの標準品の計 11サンプルの標準品につ 、て、実施例 4の 3.に記載の単糖組成分 析によりフコース (-) %を測定したところ、 KM2760-1は 90%、 KM3060は 10%であり、並び に調製した 9サンプルの標準品はそれぞれ 82%、 74%、 66%、 58%、 50%、 42%、 34%、 26%、 18%であった。
[0368] (3)抗体の shFc y Rlllaに対する結合活性の評価
抗 CCR4キメラ抗体が反応する配列番号 77で示されるアミノ酸配列を有するヒト CC R4細胞外領域ペプチドの BSAコンジュゲートは WO03/85119の実施例 4の 2. に記載 の方法と同様にして作製した。 作製したヒト CCR4細胞外領域ペプチドの BSAコンジュゲートを、 1 μ g/mLの濃度で 96ゥエル ELISA用プレート（グライナ一社製）に 50 μ L/ゥエルで分注し、 4°Cでー晚放 置して吸着させた。 PBSで洗浄後、 BSA-PBSを 100 L/ゥヱル添カ卩し、室温で 1時間 反応させて残存する活性基をブロックした。各ゥエルを Tween-PBSで洗浄後、本項（1 )に記載の ELISAで測定した抗体濃度をもとに 2.5 μ g/mLとなるように BSA-PBSで希 釈した各抗 CCR4キメラ抗体サンプルを 50 μ L/ゥエルでそれぞれ添カ卩し、室温で 1時 間反応させた。各ゥエルを Tween-PBSで洗浄後、 BSA-PBSで 5 μ g/mLに希釈した sh Fc γ Rllla溶液を 50 μ L/ゥエルで添カ卩し、室温で 1時間反応させた。 Tween- PBSで洗 浄後、 BSA- PBSを用いて 0.1 μ g/mLに調製した HRP標識マウス抗体 Penta- His HRP Conjugate (QIAGEN社製）を L/ゥエルで添カ卩し、室温で 1時間反応させた。 Twee n-PBSで洗浄後、本項（2)と同様にして ABTS基質液を 50 L/ゥエルで分注、発色さ せ、マイクロプレートリーダーを用いて波長 415應における吸光度を対照として、波長 490nmにおける吸光度を測定した。
[0369] 図 14に、本項（2)で調製した、フコース (-) %が分力つている各抗 CCR4キメラ抗体の 標準品の shFc y Rlllaに対する結合活性をそれぞれ示した。フコース (-) %に比例して s hFc y Rlllaに対する結合活性は上昇しており、これに基づいて検量線が得られた。 尚、各測定に際し、検量線は 96ゥエル ELISAプレートごとに作製した。
本実施例の 2.で採取した無血清フヱドバッチ培養上清中に含まれる各抗 CCR4キ メラ抗体組成物の shFc y Rlllaに対する結合活性を示す波長 490nmにおける吸光度 から、各培養上清中に含まれる抗 CCR4キメラ抗体組成物のフコース (-) %を、検量線 を用いて求めた。 32-05-12AF株および Wi23-5AF株についての結果を図 15に示し た。
[0370] 32-05-12AF株の培養上清中に含まれる抗体組成物は、培養期間を通じて shFc y Rlllaへの結合活性は低ぐそのフコース (-) %は約 10%であった。一方、 Wi23-3AF株、 Wi23-5AF株および W15B-1AF株の培養上清中に含まれる抗体組成物は、培養期間 を通じて shFc γ Rlllaへの強い結合活性を示し、そのフコース (-) %は 75〜90%以上であ つた。従って、 GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNAの標的配列は 、細胞の増殖性や抗体の生産性には影響を及ぼすことなぐ安定してフコース (-) %の 高い抗体組成物の生産が可能な配列であることが示された。
[0371] 4.無血清フエドバッチ培養終了時の産生抗体組成物の糖鎖構造解析
( 1)無血清フ ドバツチ培養終了時の精製抗体の取得
本実施例の 2.で採取した 32- 05- 12AF株、 Wi23- 3AF株、 Wi23- 5AF株および Wi5B -1AF株の無血清フエドバッチ培養 14日目の培養上清から、 MabSelect (アマシャムバ ィォサイエンス社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗 CCR4キメラ抗体組成 物をそれぞれ精製した。精製した各抗 CCR4キメラ抗体組成物は、それぞれ Econo-P ac 10DG (バイオラッド社製）を用いて 10mmol/L KH POバッファーに置換し、 0.22 μ
2 4
m孔径 Millex GV (MILLIPORE社製）を用いてろ過滅菌した。
[0372] (2)抗体組成物の単糖組成分析
本項（1)で取得した、それぞれの無血清馴化株の培養上清から得られた各抗 CCR 4キメラ抗体組成物に対し、公知の方法 [ジャーナル ·ォブ ·リキッド ·クロマトグラフィー (Journal of liquid Chromatography), 6, 1577, ( 1983) ]に従ってそれぞれ単糖組成分 析を行った。
各抗体組成物の単糖組成比より計算される、フコース (-) %を表 5に示した。
[0373] [表 5]
Figure imgf000138_0001
32-05-12AF株の生産する抗体組成物のフコース (-) %が 7%であったのに対し、 GMD を標的とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRNA発現ベクターを共導 入したレクチン而性株である Wi23-3AF株、 Wi23-5AF株および Wi5B-lAF株が生産 する抗体組成物のフコース (-) %は 80〜90%程度であり、親株と比較して、 GMDを標的 とした siRNA発現ベクターおよび FUT8を標的とした siRNA発現ベクターを共導入した レクチン耐性株では、抗体組成物の複合型糖鎖への ex 1 ,6-フコース付加を抑制する 状態が培養終了時にも維持されていることが示された。
実施例 8
[0374] GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入した C HO/DG44細胞を用いた抗体組成物の生産
1. GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターの構築 ( 1)ヒト U6プロモーター下 GMDに対する siRNA発現ユニットの取得
実施例 1の 1.において構築した pPUR/GMDshBを用いて、以下の手順で、ヒト U6プ 口モーター下 GMDに対する siRNA発現カセットを取得した（図 16)。
[0375] まず、 pPUR/GMDshBのヒト U6プロモーター配列の上流に結合する配列に制限酵 素 Xholの認識配列を付カ卩させたフォワードプライマー PUR-FW-XhoI (配列番号 78) および siRNA発現カセットのターミネータ一配列の下流に結合するリバースプライマ 一 PUR-RV-XhoI (配列番号 79)を各々設計した。
DNAポリメラーゼ KOD polymerase (東洋紡績社製)を用いて、 pPUR/GMDshBを铸 型とした PCRを行った。 PCRは、 pPUR/GMDshBを 10ng含む 20 μ Lの反応液 [KOD Bu fferl (東洋紡績社製)、 0.2mmol/L dNTPs、 lmmol/L MgCl、 0.4 μ mol/L上記プライ
2
マー（配列番号 78および配列番号 79)、 1U KOD polymerase]を調製し、 98°Cで 1分 間の加熱の後、 98°Cで 15秒間、 65°Cで 5秒間、 74°Cで 30秒間からなる反応を 1サイク ルとした 25サイクルの条件で行った。 PCR後、該反応液をァガロースゲル電気泳動に 供し、ヒト U6プロモーター下 GMDに対する siRNA発現カセットを含む領域の増幅断片 約 600bpを回収した。
[0376] 上記で得られた PCR増幅断片 (約 600bp)を Ligation High (東洋紡績社製)を用いて pCR-Bluntll-TOPO (インビトロジヱン社製)と、連結反応を行った。該反応液を用いて 大腸菌 DH5ひ株を形質転換した。得られた複数のカナマイシン耐性コロニーより QIA prep spin Mini prep Kit (キアゲン社製）を用いてプラスミド DNAを単離した。以下、本 プラスミドを pCR/GMDshBと称す。 [0377] (2) GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターの構築 本項（1)で構築したプラスミド pCR/GMDshBおよび実施例 4の 4.において構築した プラスミド FT81ibB/pAGEあるいは FT81ib3/pAGEを用いて、以下の手順で、 GMDを標 的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを構築した（図 17)。
[0378] まず、プラスミド pCR/GMDshBを 100 μ g/mL BSA(New England Biolabs社製)を含む NEBuffer 2(New England Biolabs社製) 40 μ Lに溶解し、 10単位の制限酵素 22mI(New England Biolabs社製)を加えて 37°Cでー晚消化反応を行った。該反応液をァガロー スゲル電気泳動に供し、 RECOCHIP (タカラバイオ社製)を用いて約 600bpのヒト U6プ 口モーター下 GMDに対する siRNA発現カセットを含む DNA断片を回収した。
[0379] 一方、プラスミド FT81ibB/pAGEあるいは FT81ib3/pAGE 1 μ gを 100 μ g/mL BSA(Ne w England Biolabs社製)を含む NEBuffer 2(New England Biolabs社製) 40 μ Lに溶解し 、 10単位の制限酵素0 I(New England Biolabs社製)をカ卩えて 37°Cでー晚消化反応 を行った。反応後、該反応液 20 μ Lに滅菌水 15 μ L、 10 X Alkaline Phosphatase Buffe r 4 Lおよび Alkaline Phosphatase E.coli C75(タカラバィォ社製) 1単位を添カ卩し、 37 °Cで 1時間脱リン酸化反応を行った。該反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 R ECOCHIP (タカラバイオ社製)を用いて約 4.7Kbのプラスミド FT81ibB/pAGEある!/、は F
T81ib3/pAGE由来の 20 l断片を回収した。
[0380] 上記で得たヒト U6プロモーター下 GMDに対する siRNA発現カセットを含む約 600bp の DNA断片 5 /z L、プラスミド FT81ibB/pAGEあるいは FT81ib3/pAGE由来の約 4.7kb の Xhol断片 5 Lおよび Ligation High (東洋紡社製） 10 Lを混合し、 16°Cでー晚反 応させた。該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株 (東洋紡績社製)を形質転換し、得られ たアンピシリン耐性クローンより QIAprep spin Mini prep Kit (キアゲン社製）を用いて プラスミド DNAを単離した。各プラスミドについて、 DNAシークェンサ一 377 (Parkin El mer干土製)および BigDye Terminator v3.0 Cycle sequencing Kit (Applied Biosytems 社製)を用いて、添付マニュアルに従い塩基配列の確認を行った。シークェンス解析 のプライマーには、 pPUR PvuII- seq- F (配列番号 61に示す)、 pPUR PvuII- seq- R (配 列番号 62に示す）、 WJ6pTsp45I/seq-F (配列番号 63)、 pAGE249-seqFW (配列番号 73)および pAGE249-seqRV (配列番号 74)を用いた。配列解析の結果、 siRNA発現力 セットの配列に間違いが無ぐヒト U6プロモーター下 GMDに対する siRNA発現カセット とヒト tRNA-valプロモーター下 FUT8に対する siRNA発現カセットが同方向のクローン を選択した。以下、 FT81ibB/pAGEヘヒト U6プロモーター下 GMDに対する siRNA発現 カセットが挿入されたプラスミドを FT81ibB_GMDB/pAGEおよび FT81ib3/pAGEヘヒト U 6プロモーター下 GMDに対する siRNA発現カセットが挿入されたプラスミドを FT81ib3— GMDB/pAGEとそれぞれ称す。
2. GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターの導入 によるレクチン耐性 CHO/DG44細胞株の取得および培養
[0381] (1) GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターの導入 によるレクチン耐性株の取得
32-05-12株へ、本実施例の 1.にお 、て構築した GMDを標的とした siRNAおよび FU
T8を標的とした siRNA共発現ベクター FT81ibB_GMDB/pAGEあるいは FT81ib3_GMDB
/pAGEを導入し、以下の手順で、レクチン耐性株を取得した。
[0382] プラスミド FT81ibB— GMDB/pAGEあるいは FT81ib3— GMDB/pAGEの 32- 05- 12株への 遺伝子導入は実施例 1の 2. (1)と同様に行った。
遺伝子導入後、細胞懸濁液を基本培地に懸濁し、接着細胞培養用 10cmディッシュ
(ファルコン社製） 10枚へ播種した。 37°C、 5%COの存在下で 24時間培養した後、培
2
養上清を除去し、 500 g/mLの濃度でハイグロマイシン (和光純薬社製)を含む基本 培地（以下、 Hyg500-IMDM培地と称す）を注入し、さらに 8日間培養し、出現したノヽィ グロマイシン耐性コロニー数を計数した。さら〖こ、一部のディッシュについて、培養上 製を除去し、 LCA-IMDM培地 [5%ゥシ胎仔透析血清 (Invitrogen社製)、 50 μ g/mL ゲンタマイシン（ナカライテスタ社製）、 500nmol/L MTX(SIGMA社製)、 lmmol/L L- Fu cose (ナカライテスタ社製)、および 500 μ g/mL LCA(VECTOR社製)を含む IMDM培地 (Invitrogen社製)]を注入し、さらに 7日間培養した。その結果、プラスミド FT81ibB_GMD B/pAGEあるいは FT81ib3_GMDB/pAGEの!ヽずれを遺伝子導入した場合にも、高 ヽ 頻度でレクチン耐性株が取得された。
[0383] (2) レクチン耐性株の拡大培養
本項（1)で取得した GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現 ベクター導入レクチン耐性株を、以下の手順で拡大培養した。
[0384] まず、各ディッシュに出現したコロニー数の計数を行った。その後、レクチン耐性コ 口-一を、実体顕微鏡観察下にてピペットマン (GILSON社製)を用いて搔き取って吸 い込み、接着細胞用 U底 96穴プレート (旭テクノグラス社製)へ採取した。トリプシン処 理を行った後、接着細胞用平底 96穴プレート（Greiner社製)へ各クローンを播種し、 LCA-IMDM培地を用いて 5%CO
2、 37°Cの条件下でー晚培養した。培養後、培養上 清を除去し、新たに Hyg500-IMDM培地を注入し、さら〖こ 9日間培養した。培養後、上 記プレートの各クローンについて、 Hyg500-IMDM培地を用いて拡大培養を行った。 以下、拡大培養を行った細胞株のうち、 32-05-12株へ FT81ibB_GMDB/pAGEを導入 して得られたレクチン而性株を iBcho-Hl株、 iBcho-H2株、 iBcho-H3株、 iBcho-H4株 、 iBcho-H5株と、 32-05-12株へ FT81ib3_GMDB/pAGEを導入して得られたレクチン 而性株を i3cho- HI株、 i3cho- H2株、 i3cho- H3株、 i3cho- H4株、 i3cho- H5株、 i3cho- H6株、 i3cho-H7株および i3cho-H8株とそれぞれ称す。
3. GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入し たレクチン而性 CHO/DG44細胞株における GMD mRNA量および FUT8 mRNA量の 定量
[0385] (l)total RNAの調製
32-05-12株、並びに本実施例の 2.において取得した GMDを標的とした siRNAおよ び FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入レクチン耐性株である iBcho-Hl株、 i Bcho- H2株、 iBcho- H3株、 iBcho- H4株、 iBcho- H5株、 i3cho- HI株、 i3cho- H2株、 i3 cho- H3株、 i3cho- H4株、 i3cho- H5株、 i3cho- H6株、 i3cho- H7株および i3cho- H8株 力もの total RNA調製は以下の手順で行った。
[0386] 32-05-12株は基本培地を、 iBcho-Hl株、 iBcho-H2株、 iBcho-H3株、 iBcho-H4株 、 iBcho- H5株、 i3cho- HI株、 i3cho- H2株、 i3cho- H3株、 i3cho- H4株、 i3cho- H5株、 i 3cho-H6株、 i3cho-H7株および i3cho-H8株は Hyg500-IMDM培地を用いて、それぞ れ 3 X 105cellS/mLの細胞密度で懸濁し、接着細胞用 6穴プレート (グライナ一社製）に 2mLずつ播種した。 5%CO、 37°Cの条件下で 3日間培養し、トリプシン処理により各
2
細胞懸濁液を回収し、懸濁液に対し 1000rpm、 4°Cで 5分間の遠心分離を行って細胞 を回収した。細胞をダルベッコ PBS緩衝液（Invitrogen社製）に懸濁し、再度 1000rpm、 4°Cで 5分間の遠心分離を行って細胞を回収した後、回収した細胞から RNeasy Mini Kit (QIAGEN社製)を使用し添付の説明書に従って、それぞれ total RNAを抽出した 。調製した total RNAは 40 μ Lの滅菌水に溶解した。
[0387] (2) single strand cDNAの合成
本項（1)において得られたそれぞれの total RNA 3 μ gに対し、 SuperScriptlll First- strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen社製）を用いて添付の説明書に従 い、オリゴ (dT)をプライマーとした 20 Lの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖 c DNAをそれぞれ合成した。合成した一本鎖 cDNAはそれぞれ RNase処理を行い、最 終反応液量を 40 しとした。さらに、該反応液はそれぞれ滅菌水を用いて 50倍に希 釈し、以下に記載する遺伝子転写量の解析に供した。
[0388] (3) SYBR-PCRによる GMD遺伝子転写量の定量
GMD遺伝子由来の mRNA転写量の定量および β -ァクチン遺伝子由来の mRNA転 写量の定量は、実施例 5の 2. (3)に記載の手順で行った。なお、 PCRプライマーとし ては、 GMDの増幅には配列番号 80に示すフォワードプライマーおよび配列番号 81 に示すリバースプライマーを、 j8 -ァクチンの増幅には配列番号 66に示すフォワード プライマーおよび配列番号 67に示すリバースプライマーをそれぞれ使用した。内部 コントロールプラスミドでの測定結果力 検量線を作成し、 GMD mRNA量および j8 - ァクチン mRNA量を数値化した。 32-05-12株についての 13 -ァクチン mRNA量に対す る GMD mRNA量の相対値を 100として、 13 -ァクチン mRNA量に対する GMD mRNA量 の相対値とを比較した結果を図 18に示した。親株である 32-05-12株の GMD mRNA 量と比較して、 GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現べクタ 一導入により得られた細胞株ではいずれも、 GMD mRNA量が約 10%に低下していた
[0389] (4) SYBR-PCRによる FUT8遺伝子転写量の定量
FUT8遺伝子由来の mRNA転写量の定量および β -ァクチン遺伝子由来の mRNA転 写量の定量は、実施例 5の 2. (4)に記載の手順で行った。なお、 PCRプライマーとし ては、 FUT8の増幅には配列番号 75に示すフォワードプライマーおよび配列番号 76 に示すリバースプライマーを、 j8 -ァクチンの増幅には配列番号 66に示すフォワード プライマーおよび配列番号 67に示すリバースプライマーをそれぞれ使用した。内部 コントロールプラスミドでの測定結果力も検量線を作成し、 FUT8 mRNA量および j8 - ァクチン mRNA量を数値化した。
[0390] 32-05-12株につ!、ての 13 -ァクチン mRNA量に対する GMD mRNA量の相対値を 10 0として、 β -ァクチン mRNA量に対する FUT8 mRNA量の相対値とを比較した結果を 図 19に示した。親株である 32-05-12株の FUT8 mRNA量と比較して、 GMDを標的と した siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入により得られた細胞株 ではいずれも、 FUT8 mRNA量が約 5%に低下していた。
[0391] 4. GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入し たレクチン耐性 CHO/DG44細胞株を用いた抗体組成物の生産と解析
(1) GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入 したレクチン耐性 CHO/DG44細胞株の産生抗体組成物の生産
32-05-12株、並びに本実施例の 2.において取得した GMDを標的とした siRNAおよ び FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入レクチン耐性株である iBcho_H2株、 i Bcho- H3株、 i3cho- HI株、 i3cho- H2株、 i3cho- H3株、 i3cho- H4株、 i3cho- H5株、 i3c ho-H6株、 i3cho-H7株および i3cho-H8株が生産する抗 CCR4キメラ抗体組成物を以 下の手順で取得した。
[0392] 32- 05- 12株は基本培地を、 iBcho- H2株、 iBcho- H3株、 i3cho- HI株、 i3cho- H2株、 i3cho- H3株、 i3cho- H4株、 i3cho- H5株、 i3cho- H6株、 i3cho- H7株および i3cho- H8 株は Hyg500-IMDM培地を用いて、それぞれ 3 X 105cells/mLの細胞密度で懸濁し、 接着細胞用 T75フラスコ（グライナ一社製）に 10mLずつ播種した。 5%CO、 37°Cの条
2
件下で 5日間培養後、培養上清を除去し、 10mLのダルベッコ PBS (インビトロジェン社 製）で 2回洗浄を行った後、 EXCELL301培地（JRH Bioscience社製）を 24mL注入した 。 5%CO、 37°Cの条件下で 7日間培養後、培養上清をそれぞれ回収し、 MabSelect (
2
アマシャムバイオサイエンス社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗 CCR4キ メラ抗体組成物をそれぞれ精製した。各種細胞株の培養上清カゝら精製した抗 CCR4 キメラ抗体組成物は、それぞれ Econo-Pac 10DG (バイオラッド社製）を用いて lOmmol /L KH POバッファーに置換し、 0.22 μ m孔径 Millex GV (MILLIPORE社製）を用いて
2 4
ろ過滅菌した。
[0393] (2)抗体組成物の単糖組成分析
本実施例の 4. (1)で取得した、抗 CCR4キメラ抗体組成物に対し、公知の方法 [ジ ヤーナノレ'ォブ'リキッド'クロマトグラフィー (Journal of liquid Chromatography), 6, 157 7, (1983) ]に従ってそれぞれ単糖組成分析を行った。
各抗体の単糖組成比より計算される、フコース (-) %を表 6に示した。なお、フコース 由来のピークが検出されなかった場合には、フコース (-) %を 100%として示した。
[0394] [表 6]
細胞株名 フコース（-）0 /o
32-05-12 4%
iBcho-H2 100%
iBcho-H3 99%
i 3cho-Hl 100%
i 3cho-H2 100%
i 3cho-H3 100%
i 3cho-H4 98%
i 3cho-H5 100%
i 3cho-H6 98%
i 3cho-H7 100%
i 3cho-H8 100% ベクターを導入する前の親株細胞である 32-05-12株の生産する抗体組成物のフコ ース (-) %が 4%であったのに対し、 32-05-12株を親株として GMDを標的とした siRNAお よび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入したレクチン耐性株が生産する 抗体組成物のフコース (-) %は 98〜100%であり、親株と比較して顕著に上昇して!/、た。 この結果から、 CHO/DG44細胞へ GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入することで、フコース含量の少な ヽ抗体組成物を生産す る細胞へと変換できることが示された。
実施例 9
[0395] マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べクタ 一を導入した SP2/0細胞を用いた抗体組成物の生産
1.マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べク ターの構築
( 1)ヒト U6プロモーター下マウス GMDに対する siRNA発現ベクターの構築
以下の手順で、マウス GMD遺伝子に対する siRNA発現ベクターを構築した（図 20)
[0396] まず、チャイニーズノヽムスター卵巣由来 CHO/DG44細胞において有効であった GM Dに対する siRNA発現ベクター pPUR/GMDshBの標的配列である配列番号 37に対応 するマウス配列 (配列番号 58に示す)を標的配列として選定した。さらに、選定した標 的配列について、実施例 1の 1. (3)と同様に二本鎖 DNAカセットを設計した。設計し た合成オリゴ DNAのセンス鎖 (以下 mGMD-B-Fと称す)の塩基配列を配列番号 82、ァ ンチセンス鎖 (以下 mGMD-B-Rと称す)の塩基配列を配列番号 83にそれぞれ示した
[0397] さらに、実施例 1の 1. (4)と同様に、実施例 1の 1. (2)において取得した pPUR-U6t ermへ、上記の合成オリゴ DNAをアニーリングさせて得られた二本鎖 DNAを挿入して 得られたプラスミド DNAの塩基配列を、 DNAシークェンサ一 377 (Parkin Elmer社製） および BigDye Terminator νό.Ο し ycle Sequencing Kit (Applied Biosytems社製)を用 いて、添付マニュアルに従い決定した。シークェンス解析のプライマーには、 pPUR P vull- seq- F (配列番号 61)および pPUR PvuII- seq- R (配列番号 62)を用い、挿入された 合成オリゴ DNAの配列および連結部に間違いが無いことを確認した。以下、合成オリ ゴ DNA mGMD- B- Fおよび mGMD- B- Rをアニーリングさせて得られた二本鎖 DNAが 挿入されたプラスミドを pPUR/GMDmBと称す。
[0398] (2)ヒト U6プロモーター下マウス GMDに対する siRNA発現ユニットの取得
本項（1)において構築した pPUR/GMDmBを用いて、実施例 6の 1. ( 1)と同様の手 順で、ヒト U6プロモーター下マウス GMDに対する siRNA発現カセットを取得した（図 1 6)。
得られた複数のカナマイシン而性コロニーより QIAprep spin Mini prep Kit (キアゲン 社製)を用いてプラスミド DNAを単離した。以下、本プラスミドを pCR/GMDmBと称す。
[0399] (3)マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べク ターの構築
本項（2)で構築したプラスミド pCR/GMDmBおよび実施例 2の 4.にお 、て構築した プラスミド FT81ibB/pAGEあるいは FT81ib3/pAGEを用いて、実施例 6の 1. (2)と同様 の手順で、マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発 現ベクターを構築した（図 17)。
[0400] 得られたアンピシリン而性クローンより QIAprep spin Mini prep Kit (キアゲン社製）を 用いてプラスミド DNAを単離した。各プラスミドについて、 DNAシークェンサ一 377 (Pa rkin Elmer社:^)および BigDye Terminator νό.Ο Cycle Sequencing Kit (Applied Biosy tems社製）を用いて、添付マニュアルに従い塩基配列の確認を行った。シークェンス 解析のプライマーには、 pPUR PvuII- seq- F (配列番号 61に示す）、 pPUR PvuII- seq- R (配列番号62に示す）、hU6pTsp45I/seq-F(配列番号63)、pAGE249-seqFW(配 列番号 73)および pAGE249-seqRV (配列番号 74)を用いた。
配列解析の結果、 siRNA発現カセットの配列に間違いが無ぐヒト U6プロモーター下 のマウス GMDに対する siRNA発現カセットとヒ RNA- valプロモーター下の FUT8に対 する siRNA発現カセットが同方向に挿入されたクローンを選択した。以下、 FT81ibB/p AGEヘヒト U6プロモーター下マウス GMDに対する siRNA発現カセットが挿入されたプ ラスミドを FT81ibB— GMDmB/pAGEゝ FT81ib3/pAGEヘヒト U6プロモーター下マウス GM Dに対する siRNA発現カセットが挿入されたプラスミドを FT81ib3_GMDmB/pAGEとそ れぞれ称す。
[0401] 2.マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べク ターの導入によるレクチン耐性 SP2/0細胞株の取得および培養
特開平 6-205694の実施例 1に記載の抗 GMキメラ抗体を生産するマウスミエローマ
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SP2/0細胞（ATCC CRL-1581)の形質転換細胞株 KM968株（以下、 KM968株と記す )へ、本実施例の 1.において構築したマウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス F UT8を標的とした siRNA共発現ベクター FT81ibB_GMDmB/pAGEあるいは FT81ib3_GM DmB/pAGEを導入し、以下の手順で、レクチン耐性株を取得した。
[0402] 各種 siRNA発現ベクタープラスミドの KM968株への遺伝子導入はエレクト口ポレー シヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990)]に準じて以下の手順で 行った。
まず、各種 siRNA発現ベクタープラスミド 10 μ gを、 NEBuffer4 (New England Biolabs 社製） 30 μ Lに溶解し、 10単位の制限酵素 Eml (New England Biolabs社製）を加えて 3 7°Cで一晩消化反応させて線状化した。該反応液の一部をァガロースゲル電気泳動 により、該プラスミドが線状ィ匕されていることを確認した後、残りの反応液に対し、フエ ノール/クロ口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行 、、回収した線状ィ匕プラスミ ドを滅菌水 10 μ Lに溶解した。
[0403] 一方、 ΚΜ968株を K-PBS緩衝液に懸濁して 1.6 X 107cells /mLとした。細胞懸濁液 2 00 L (3.2 X 106 cells)を上記線状化プラスミド溶液 10 μ Lと混和した後、細胞 DN Α混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BIO- RAD社製）へ移し、 細胞融合装置 Gene Pulser(BIO- RAD社製)を用いてパルス電圧 200V、電気容量 250 μ Fの条件で遺伝子導入を行った。
[0404] 遺伝子導入後、細胞懸濁液を RPMI-FBS(10)-MTX(500)培地 [ゥシ胎児血清（Invitr ogen社製）を 10%、 MTX(SIGMA社製)を 500nmol/Lで含む RPMI1640培地（Invitrogen 社製)]に懸濁し、浮遊培養用 T75フラスコ（旭テクノグラス社製） 1本へ播種した。 37°C 、 5%COの存在下で 24時間培養した後、ハイグロマイシン (和光純薬社製)を終濃度が
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500 g/mLとなるように添カ卩し、さらに 3日間培養した。培養後、 800rpm、 5分間の遠 心分離により細胞を回収し、生細胞数力 S0.5〜l X 104cells /mLとなるようにハイグロマ イシン（和光純薬社製）を 500 μ g/mLで含む RPMI-FBS(10)-MTX(500)培地（以下、 R PMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培地と称す）に懸濁し、 96ゥエル培養用プレート（ グライナ一社製）に 100 Lずつ播種した。その後、 2〜3日に一度、培養上清の半量 を新鮮な RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培地へ交換する操作を繰り返しながら 、 2週間培養した。
[0405] 培養後、 96ゥエル培養用プレートの各ゥエルの細胞を、 2枚の 96ゥエル培養用プレ ートに分割し、 1枚をマスタープレート、もう 1枚をレプリカプレートとした。マスタープレ ートは RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培地にて、レプリカプレートは、 L-フコース (ナカライテスタ社製）を lmmol/Lで、 LCA(VECTOR社製)を 500 μ g/mLで含む RPMI- FBS(IO)- MTX(500)- Hyg(500)培地にて、それぞれ 3日間培養した。その結果、マスタ 一プレートにおいて良好な増殖が認められたゥエルに対応するレプリカプレートのゥ エルの約 3割にお 、て、 LCA存在下でも良好な増殖が認められた。
[0406] レプリカプレートにおいて良好な増殖が認められたゥエルに対応するマスタープレ ートの細胞にっ 、て、 RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培地を用いて拡大培養を 行った。以下、拡大培養に供した細胞株のうち、 FT81ibB_GMDmB/pAGEを導入して 得られた細胞株を 968iB-l株、 968iB-2株、 968iB-3株、 968iB-4株、 968iB-5株、 968i B- 6株、 968iB- 7株と、 FT81ib3_GMDmB/pAGEを導入して得られた細胞株を 968i3- 1 株、 968Ϊ3-2株、 968Ϊ3-3株、 968Ϊ3-4株、 968Ϊ3-5株、 968Ϊ3-6株、 968Ϊ3-7株、 968Ϊ3-8 株、 968Ϊ3-9株、 968Ϊ3-10株とそれぞれ称す。
[0407] 3.マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べク ターを導入したレクチン而す性 SP2/0細胞株における GMD mRNA量および FUT8 mRN A量の定量
(1) total RNAの調製
KM968株、並びに本実施例の 2.において取得したマウス GMDを標的とした siRNA およびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入レクチン耐性 SP2/0細胞 株である 968iB-l株、 968iB-2株、 968iB-3株、 968iB-4株、 968iB-5株、 968iB-6株、 96 8iB- 7株、 968i3- 1株、 968i3- 2株、 968i3- 3株、 968i3- 4株、 968i3- 5株、 968i3- 6株、 96 8i3-7株、 968i3-8株、 968i3-9株および 968i3-10株からの total RNA調製は以下の手 順で行った。
[0408] KM968株は RPMI- FBS(IO)- MTX(500)培地を、マウス GMDを標的とした siRNAおよ びマウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入レクチン耐性 SP2/0細胞株は R PMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培地を用いて、それぞれ 1 X 105cells/mLの細胞 密度で懸濁し、浮遊培養用 T75フラスコ（旭テクノグラス社製）に播種した。 5%C02、 37°Cの条件下で 3日間培養し、細胞数を計数後、各 5 X 105 Cells相当量を分取した。 8 00rpm、 5分間の遠心分離を行って細胞を回収した。回収した細胞をダルベッコ PBS 緩衝液 (Invitrogen社製）に懸濁し、再度 800rpm、 5分間の遠心分離を行って細胞を 回収した後、 RNeasy Micro Kit (QIAGEN社製）を使用し方法は添付の説明書に従 つて、 total RNAをそれぞれ抽出した。調製した total RNAは 14 Lの滅菌水にそれぞ れ溶解した。
[0409] (2) single strand cDNAの合成
本項（1)において得られたそれぞれの total RNA 3 μ gに対し、 SuperScriptlll First- strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen社製）を用いて添付の説明書に従 い、オリゴ (dT)をプライマーとした 20 Lの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖 c DNAをそれぞれ合成した。合成した一本鎖 cDNAはそれぞれ RNase処理を行い、最 終反応液量を 40 しとした。さらに、該反応液はそれぞれ滅菌水を用いて 50倍に希 釈し、以下に記載する遺伝子転写量の解析に供した。
[0410] (3) SYBR- PCRによる GMD遺伝子転写量の定量
GMD遺伝子由来の mRNA転写量の定量および β -ァクチン遺伝子由来の mRNA転 写量の定量は、実施例 8の 3. (3)に記載の方法で行った。内部コントロールプラスミ ドでの測定結果力 検量線を作成し、 GMD mRNA量および β -ァクチン mRNA量を 数値化した。
KM968株についての 13 -ァクチン mRNA量に対する GMD mRNA量の相対値を 100と して、 j8 -ァクチン mRNA量に対する GMD mRNA量の相対値とを比較した結果を図 2 1に示した。親株である KM968株の GMD mRNA量と比較して、マウス GMDを標的とし た siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入により得られた細 胞株ではいずれも、 GMD mRNA量が約 10%に低下していた。 [0411] (4) SYBR-PCRによる FUT8遺伝子転写量の定量
FUT8遺伝子由来の mRNA転写量の定量および β -ァクチン遺伝子由来の mRNA転 写量の定量は、実施例 8の 3. (4)に記載の方法で行った。内部コントロールプラスミ ドでの測定結果力 検量線を作成し、 FUT8 mRNA量および j8 -ァクチン mRNA量を 数値化した。
KM968株についての 13 -ァクチン mRNA量に対する FUT8 mRNA量の相対値を 100 として、 β -ァクチン mRNA量に対する FUT8 mRNA量の相対値とを比較した結果を図 22に示した。親株である KM968の FUT8 mRNA量と比較して、マウス GMDを標的とし た siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入により得られた細 胞株ではいずれも、 FUT8 mRNA量が約 10%に低下していた。
[0412] 4.マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べク ターを導入したレクチン耐性 SP2/0細胞株を用いた抗体組成物の生産と解析
(1)マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べク ターを導入したレクチン耐性 SP2/0細胞株の抗体組成物の生産
KM968株、および本実施例の 2.において取得したマウス GMDを標的とした siRNA およびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入レクチン耐性 SP2/0細胞 株である 968i3-2株および 968i3-3株が生産する抗 GMキメラ抗体組成物を、以下の
2
手順でそれぞれ取得した。
[0413] KM968株は、 SP- HSFM培地 [UltraLow- IgG FBS (Invitrogen社製）を 5%、 MTX (SIG MA社製）を 500nmol/Lの濃度で含む Hybridoma- SFM培地 (Invitrogen社製） ]を、 968i 3-2株および 968i3-3株は、ハイグロマイシン（和光純薬社製）を 500 g/mLの濃度で 含む SP-HSFM培地を用いて、それぞれ 1 X 105cells/mLの細胞密度で懸濁し、浮遊 培養用 T225フラスコ（旭テクノグラス社製）に 50mLずつ播種した。 5%CO、 37°Cの条
2
件下で 7日間培養後、培養上清をそれぞれ回収し、 MabSelect (アマシャムバイオサイ エンス社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、各抗 GMキメラ抗体組成物を精
2
製した。精製した各抗 GMキメラ抗体は、それぞれ Econo-Pac 10DG (バイオラッド社
2
製）を用いて 10mmol/L KH POバッファーに置換し、 0.22 m孔径 Millex GV(MILLI
2 4
PORE社製)を用いてろ過滅菌した。 [0414] (2)抗体組成物の単糖組成分析
本実施例の 4. (1)で取得した、各抗 GMキメラ抗体組成物に対し、公知の方法 [ジ
2
ヤーナノレ'ォブ'リキッド'クロマトグラフィー (Journal of liquid Chromatography), 6, 157 7, (1983) ]に従って単糖組成分析を行った。
各抗体の単糖組成比より計算される、フコース (-) %を表 7に示した。
[0415] [表 7]
Figure imgf000152_0001
KM968株の生産する抗体組成物のフコース (-) %が 3%であったのに対し、 KM968株 を親株としてマウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共 発現ベクターを導入したレクチン耐性株である 968i3-2株および 968i3-3株が生産す る抗体組成物のフコース (-) %は 60%程度であり、親株である KM968の生産する抗体組 成物のフコース (-) %と比較して顕著に上昇していた。この結果から、 SP2/0細胞へ GM Dを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入すること で、フコース含量の少な 、抗体を生産する細胞へと変換できることが示された。
実施例 10
[0416] マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べクタ 一を導入した NS0細胞を用いた抗体組成物の生産
1. マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べク ターを導入した NS0細胞株の取得および培養
WO03/85118の実施例 1の（2)に記載の方法と同様にして取得したマウスミエロー マ NS0細胞 (RCB0213)由来抗 CCR4キメラ抗体生産株 NS0/2160株 (以下、 NS0/2160 株と記す)へ、実施例 7の 1.において構築したマウス GMDを標的とした siRNAおよび マウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター FT81ibB_GMDmB/pAGEあるいは FT8 lib3_GMDmB/pAGEを導入し、以下の手順で、形質転換細胞を取得した。
[0417] 各種 siRNA発現ベクタープラスミドの NS0/2160株への遺伝子導入はエレクトロボレ ーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990)]に準じて以下の手順 で行った。
まず、各種 siRNA発現ベクタープラスミド 10 μ gを、 NEBuffer4 (New England Biolabs 社製） 30 μ Lに溶解し、 10単位の制限酵素 E^I (New England Biolabs社製）を加えて 3 7°Cで一晩消化反応させて線状化した。該反応液の一部をァガロースゲル電気泳動 により、該プラスミドが線状ィ匕されていることを確認した後、残りの反応液に対し、フエ ノール/クロ口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行 、、回収した線状ィ匕プラスミ ドを滅菌水 10 μ Lに溶解した。
[0418] 一方、 NS0/2160株を K-PBS緩衝液に懸濁して 1.0 X 107cells /mLとした。細胞懸濁 液 200 μ L (2.0 X 106 cells)を上記線状化プラスミド溶液 10 μ Lと混和した後、細胞 DNA混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BIO- RAD社製）へ移 し、細胞融合装置 Gene Pulser (BIO- RAD社製）を用いてパルス電圧 200V、電気容量 250 Fの条件で遺伝子導入を行った。
[0419] 遺伝子導入後、細胞懸濁液を RPMI-FBS(10)-MTX(500)培地に懸濁し、浮遊培養 用 T75フラスコ（旭テクノグラス社製） 1本へ播種した。 37°C、 5%COの存在下で 24時間
2
培養した後、ノ、イダロマイシン (和光純薬社製)を終濃度が 500 μ g/mLとなるように添 加し、さらに 2日間培養した。培養後、 800rpm、 5分間の遠心分離により細胞を回収し た後、生細胞の密度が 0.5〜1 X 104cells/mLとなるように RPMI-FBS(10)-MTX(500)-H yg(500)培地に懸濁し、 96ゥエル培養用プレート（グライナ一社製）に 100 Lずつ播種 した。その後、 2〜3日毎に、培養上清の半量を新鮮な RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hy g(500)培地へ交換する操作を繰り返しながら、 2〜3週間培養した。
[0420] 培養後、 96ゥエル培養用プレートの各ゥエルの培養上清をそれぞれ回収し、実施例 7の 3.に記載の方法で、それぞれの培養上清中に含まれる抗 CCR4キメラ抗体組成 物の shFc y Rlllaに対する結合活性を評価した。ベクター毎に 80ゥヱルについて解析 した結果、 9割以上のゥエルの培養上清に含まれる抗体組成物において、親株であ る NS0/2160株が産生する抗体組成物と比較して shFc γ Rlllaに対する結合活性の上 昇が認められ、各ゥエルの細胞が遺伝子導入の結果、フコース含量の少ない抗体組 成物の生産細胞へと変換されて!ヽた。
[0421] shFc y Rlllaに対する結合活性の上昇が認められたゥ ルのうち各 5ゥエルの細胞に ついて、 RPMI-FBS(10)-MTX(500)-Hyg(500)培地を用いて拡大培養を行った。以下 、拡大培養に供した細胞株のうち、 FT81ibB_GMDmB/pAGEを導入して得られた細胞 株を NS0/2160iB- 1株、 NS0/2160iB- 2株、 NS0/2160iB- 3株、 NS0/2160iB- 4株および NS0/2160iB- 5株と、 FT81ib3_GMDmB/pAGEを導入して得られた細胞株を NS0/2160i 3-1株、 NS0/2160i3- 2株、 NS0/2160i3- 3株、 NS0/2160i3- 4株および NS0/2160i3- 5株 とそれぞれ称す。
[0422] 2.マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べク ターを導入した NS0細胞株における GMD mRNA量および FUT8 mRNA量の定量 (1) total RNAの調製
NS0/2160株、並びに本実施例の 1.において取得したマウス GMDを標的とした siR NAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入 NS0細胞株である NS0/ 2160iB- 1株、 NS0/2160iB- 2株、 NS0/2160iB- 3株、 NS0/2160iB- 4株、 NS0/2160iB- 5 株、 NS0/2160i3- 1株、 NS0/2160i3- 2株、 NS0/2160i3- 3株、 NS0/2160i3- 4株、および NS0/2160i3-5株からの total RNAの調製は、以下の手順で行った。
[0423] NS0/2160株は RPMI-FBS(10)-MTX(500)培地を、マウス GMDを標的とした siRNAお よびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入 NS0細胞株は RPMト FBS(IO) - MTX(500)-Hyg(500)培地を用いて、それぞれ 1 X 105cells/mLの細胞密度で懸濁し、 浮遊培養用 T75フラスコ（旭テクノグラス社製）に播種した。 5%CO、 37°Cの条件下で
2
3日間培養し、細胞数を計数後、各 5 X 105cells相当量を分取した。 800rpm、 5分間の 遠心分離を行って上清を除去した。細胞をダルベッコ PBS緩衝液 (Invitrogen社製）に 懸濁し、再度 800rpm、 5分間の遠心分離を行って細胞を回収した後、 RNeasy Micro Kit (QIAGEN社製)を使用し方法は添付の説明書に従って、 total RNAをそれぞれ抽 出した。調製した total RNAは 14 Lの滅菌水に溶解した。 [0424] (2) single strand cDNAの合成
本項（1)において得られたそれぞれの total RNA 3 μ gに対し、 SuperScriptlll First- strand Synthesis System for RT- PCR (Invitrogen社製）を用いて添付の説明書に従 い、オリゴ (dT)をプライマーとした 20 Lの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖 c DNAをそれぞれ合成した。合成した一本鎖 cDNAはそれぞれ RNase処理を行い、最 終反応液量を 40 しとした。さらに、該反応液はそれぞれ滅菌水を用いて 50倍に希 釈し、以下に記載する遺伝子転写量の解析に供した。
[0425] (3) SYBR-PCRによる GMD遺伝子転写量の定量
GMD遺伝子由来の mRNA転写量の定量および β -ァクチン遺伝子由来の mRNA転 写量の定量は、実施例 8の 3. (3)に記載の方法で行った。内部コントロールプラスミ ドでの測定結果力 検量線を作成し、 GMD mRNA量および β -ァクチン mRNA量を 数値化した。
NS0/2160株についての j8 -ァクチン mRNA量に対する GMD mRNA量の相対値を 100 として、 j8 -ァクチン mRNA量に対する GMD mRNA量の相対値とを比較した結果を図 23に示した。親株である NS0/2160株の GMD mRNA量と比較して、マウス GMDを標 的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入により得ら れた細胞ではいずれも、 GMD mRNA量が約 20%に低下していた。
[0426] (4) SYBR-PCRによる FUT8遺伝子転写量の定量
FUT8遺伝子由来の mRNA転写量の定量および β -ァクチン遺伝子由来の mRNA転 写量の定量は、実施例 8の 3. (4)に記載の方法で行った。内部コントロールプラスミ ドでの測定結果力 検量線を作成し、 FUT8 mRNA量および j8 -ァクチン mRNA量を 数値化した。
NS0/2160株についての 13 -ァクチン mRNA量に対する FUT8 mRNA量の相対値を 1 00として β -ァクチン mRNA量に対する FUT8 mRNA量の相対値とを比較した結果を 図 24に示した。親株である KM968株の FUT8 mRNA量と比較して、マウス GMDを標 的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入により得ら れた細胞ではいずれも、 FUT8 mRNA量が約 10%に低下していた。
[0427] 3.マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べク ターを導入した NSO細胞株を用いた抗体組成物の生産と解析
(1)マウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現べク ターを導入した低フコース抗体産生 NS0細胞株の抗体組成物の生産
NS0/2160株、並びに本実施例の 1.において取得したマウス GMDを標的とした siR NAおよびマウス FUT8を標的とした siRNA共発現ベクター導入 NS0細胞株である NS0/ 2160ΪΒ- 3株、 NS0/2160iB- 5株、 NS0/2160i3- 1株、 NS0/2160i3- 4株、および NS0/216 0i3-5株が生産する抗 CCR4キメラ抗体組成物を、以下の手順で取得した。
[0428] NS0/2160株は、 NS-HSFM培地 [Bovine Serum Albumin (Invitrogen社製)を 0.2%、 MTX(SIGMA社製)を 500nmol/Lの濃度で含む Hybridoma-SFM培地 (Invitrogen社製） ]、 NS0/2160iB- 3株、 NS0/2160iB- 5株、 NS0/2160i3- 1株、 NS0/2160i3- 4株および NS 0/2160i3-5株は、ハイグロマイシン (和光純薬社製)を 500 μ g/mLの濃度で含む NS-H SFM培地を用いて、それぞれ 2 X 105cells/mLの細胞密度で懸濁し、浮遊培養用 T22 5フラスコ (旭テクノグラス社製)に 40mLずつ播種した。 5%CO、 37°Cの条件下で 7日
2
間培養後、培養上清をそれぞれ回収し、 MabSelect (アマシャムバイオサイエンス社 製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、各抗 CCR4キメラ抗体組成物を精製した。 精製した各抗 CCR4キメラ抗体組成物は、それぞれ Econo-Pac 10DG (バイオラッド社 製）を用いて 10mmol/L KH POバッファーに置換し、 0.22 μ m孔径 Millex GV(MILLI
2 4
PORE社製)を用いてろ過滅菌した。
[0429] (2)抗体組成物の単糖組成分析
本実施例の 3. (1)で取得した、各抗 CCR4キメラ抗体組成物に対し、公知の方法 [ ジャーナノレ'ォブ'リキッド 'クロマトグラフィー (Journal of liquid Chromatography), 6, 1 577, (1983) ]に従って単糖組成分析を行った。
各抗体組成物の単糖組成比より計算される、フコース (-) %を表 8に示した。
[0430] [表 8] 細胞株名 フコース（- ) %
NS0/2160 28%
NS0/2160iB-3 93%
NS0/2160iB-5 92%
NS0/2160 i 3-l 93 %
NS0/2160i3-4 93%
NS0/2160i 3-5 92%
NS0/2160株の生産する抗体組成物のフコース (-) %が 28%であったのに対し、 NS0/2 160株を親株としてマウス GMDを標的とした siRNAおよびマウス FUT8を標的とした siR NA共発現ベクターを導入した NS0/2160iB- 3株、 NS0/2160iB- 5株、 NS0/2160i3- 1株 、 NS0/2160i3-4株、および NS0/2160i3-5株が生産する抗体組成物のフコース (-) %は 90%程度であり、親株が生産する抗体組成物のフコース (-) %と比較して顕著に上昇し ていた。この結果から、 NS0細胞へ GMDを標的とした siRNAおよび FUT8を標的とした siRNA共発現ベクターを導入することで、フコース含量の少な ヽ抗体を生産する細胞 へと変換できることが示された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変 換する反応を触媒する酵素の機能を抑制する RNAを導入した細胞および該細胞を 用いる糖蛋白質組成物の製造方法、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァ セチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素の 機能を抑制する RNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する 酵素蛋白質の機能を抑制する RNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴル ジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAを導入した細胞および該細 胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法などを提供される。本発明の方法により製造 される抗体組成物は高 、エフェクター活性を有しており、医薬品として有用である。 配列表フリーテキスト 配列番号 14- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 15- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 16- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 17- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 18- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 19- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 20- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 21- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 22- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 23- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 24- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 25- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 26- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 27- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 28- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 29- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 30- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 31- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 32- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 33- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 34- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 35- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 36- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 37- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 38- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 39- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 40- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 41 人工配列の説明：合成 RNA 配列番号 42 人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 43 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 44 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 45 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 46 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 47 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 48 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 49 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 50 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 51 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 52 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 53 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 54 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 55 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 56 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 57 人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 58 人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 59 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 60 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 61 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 62 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 63 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 64 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 65 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 66 人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 67 人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 68 人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 69- -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 70- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 71- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 72- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 73- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 74- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 75- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 76- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 77- -人工配列の説明 ：合成ペプチド 配列番号 78- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 79- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 80- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 81- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 82- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 83- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 85- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 86- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 87- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 88- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 89- -人工配列の説明 ：合成 RNA 配列番号 90- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 91- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 92- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 93- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 94- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 95- -人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 96- -人工配列の説明 ：合成 DNA

Claims

請求の範囲
[1] 以下の (a)または (b)から選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAを 細胞内に導入した細胞；
(a)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列からなる RNA;
(b)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が 欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列からなり、 GDP-マンノースを G DP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑 制する活性を有する RNA。
[2] GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する脱水反応を 触媒する酵素が、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼである、請求項 1に記載の細胞
[3] GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の（a)〜（f)力もなる群から選ばれる DN Aがコードする蛋白質である、請求項 2に記載の細胞；
(a)配列番号 8で表される塩基配列力 なる DNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNA;
(d)配列番号 8で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A;
(e)配列番号 9で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A;
(f)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリ ダイズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA0
[4] GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の（a)〜（i)力 なる群力 選ばれる蛋 白質である、請求項 2に記載の細胞；
(a)配列番号 11で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質； (b)配列番号 12で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(c)配列番号 13で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(d)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒ ドラターゼ活性を有する蛋白質；
(e)配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、 挿入および/または付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒ ドラターゼ活性を有する蛋白質；
(f)配列番号 13で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 11で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 12で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(i)配列番号 13で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
[5] 以下の（a)または（b)力も選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNA
(a)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列からなる RNA;
(b)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列において、 1または数個の塩基が 欠失、置換、挿入および Zまたは付加された塩基配列からなり、 GDP-マンノースを G DP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素の機能を抑 制する活性を有する RNA。
[6] 請求項 5に記載の RNAに対応する DNAおよびその相補 DNA。
[7] 請求項 5に記載の RNAに対応する DNAを含有するベクター。
[8] 請求項 7に記載のベクターを細胞に導入した細胞。
[9] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNA、および細胞内 糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAまたは細 胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を 抑制する RNAを導入した細胞。
[10] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNA、および細胞内 糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAを導入し た細胞。
[11] 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素力 GDP-マンノースを G
DP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素である請求 項 9または 10に記載の細胞。
[12] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの
1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素力 a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼで ある、請求項 9〜： L 1のいずれ力 1項に記載の細胞。
[13] a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の（a)〜(！ 1)力 なる群力 選ばれる DNAが コードする蛋白質である、請求項 12に記載の細胞；
(a)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
(1)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダィ ズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA ;
(g)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(h)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA a 1,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の (a)〜(l)力 なる群力 選ばれる蛋白質 である、請求項 12に記載の細胞；
(a)配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(b)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(c)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(d)配列番号 84で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(e)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Ζまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 84で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラ ーゼ活性を有する蛋白質；
(0配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 84で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。 [15] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)〜（ d)力 なる群力 選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAである、 請求項 9〜 14の!、ずれか 1項に記載の細胞；
(a)配列番号 1で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[16] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)お よび (b)からなる群から選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAで ある、請求項 9〜 14の!、ずれか 1項に記載の細胞；
(a)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列から なる RNA ;
(b)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列に おいて、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列 からなり、 a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性の機能を抑制する活性を有する RNA
[17] GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒 する酵素が、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼである、請求項 11〜16のいずれか 1項に記載の細胞。
[18] GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(l)からなる群力 選ばれる DNA 力 Sコードする蛋白質である、請求項 17に記載の細胞；
(a)配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA； (b)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNA;
(d)配列番号 8で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A;
(e)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A;
(1)配列番号 10で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A。
GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(i)からなる群から選ばれる蛋白 質である、請求項 17に記載の細胞；
(a)配列番号 11で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b)配列番号 12で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(c)配列番号 13で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(d)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(e)配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 13で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 11で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 12で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質； (0配列番号 13で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
[20] GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒 する酵素の機能を抑制する RNA力 以下の (a)〜(c)力 なる群力 選ばれる RNAおよ びその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAである、請求項 1 1〜 19の!ヽずれか 1項に 記載の細胞；
(a)配列番号 8で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[21] GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒 する酵素の機能を抑制する RNA力 以下の (a)および (b)力 なる群力 選ばれる RNA およびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAである、請求項 1 1〜 19の!、ずれか 1項 に記載の細胞；
(a)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の 、ずれかの塩基配列力 なる R NA ;
(b)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の!/、ずれかの塩基配列にお!、て、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列力もなり 、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有する RNA。
[22] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNA とその相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素 の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の機能を抑制する RNAに対応 する DNAとその相補 DNAを含む DNA。 [23] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNA とその相補 DNA、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素 の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含む DNA。
[24] 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素力 GDP-マンノースを G DP-4-ケト, 6-デォキシ -GDP-マンノースに変換する反応を触媒する酵素である請求 項 22または 23に記載の DNA。
[25] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素力 a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼで ある、請求項 22〜24の!、ずれか 1項に記載の DNA。
[26] a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の（a)〜(！ 1)力 なる群力 選ばれる DNAが コードする蛋白質である、請求項 25に記載の DNA ;
(a)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
(1)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダィ ズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA ;
(g)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA;
(h)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
[27] a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の (a)〜(l)力 なる群力 選ばれる蛋白質 である、請求項 25に記載の DNA ; (a)配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(b)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(c)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(d)配列番号 84で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(e)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Ζまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 84で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラ ーゼ活性を有する蛋白質；
(0配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
(1)配列番号 84で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの
1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)〜（ d)からなる群から選ばれる RNAである、請求項 22〜27のいずれ力 1項に記載の DNA (a)配列番号 1で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[29] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)お よび (b)からなる群から選ばれる RNAである、請求項 22〜27の!、ずれ力 1項に記載の DNA;
(a)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列から なる RNA ;
(b)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列に おいて、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列 からなり、 a 1,6-フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制する活性を有する RNA。
[30] GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒 する酵素が、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼである、請求項 24〜29のいずれか 1項に記載の DNA。
[31] GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(l)からなる群力 選ばれる DNA 力 Sコードする蛋白質である、請求項 30に記載の DNA ;
(a)配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNA;
(d)配列番号 8で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A ; (e)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A;
(1)配列番号 10で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A。
[32] GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(i)からなる群から選ばれる蛋白 質である、請求項 30に記載の DNA;
(a)配列番号 11で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b)配列番号 12で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(c)配列番号 13で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(d)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(e)配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 13で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 11で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 12で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(0配列番号 13で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
[33] GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒 する酵素の機能を抑制する RNA力 以下の (a)〜(c)からなる群から選ばれる RNAであ る、請求項 24〜32のいずれ力 1項に記載の DNA ;
(a)配列番号 8で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[34] GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒 する酵素の機能を抑制する RNA力 以下の (a)および (b)力 なる群力 選ばれる RNA である、請求項 24〜32のいずれ力 1項に記載の DNA ;
(a)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の 、ずれかの塩基配列力 なる R NA ;
(b)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の!/、ずれかの塩基配列にお!、て、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列力もなり 、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有する RNA。
[35] 請求項 22〜34の!、ずれか 1項に記載の DNAを含有するベクター。
[36] 配列番号 90で表される DNAおよび配列番号 92で表される DNAを含んでなる、請求 項 35に記載のベクター。
[37] 配列番号 91で表される DNAおよび配列番号 92で表される DNAを含んでなる、請求 項 35に記載のベクター。
[38] 配列番号 90で表される DNAおよび配列番号 93で表される DNAを含んでなる、請求 項 35に記載のベクター。
[39] 配列番号 91で表される DNAおよび配列番号 93で表される DNAを含んでなる、請求 項 35に記載のベクター。
[40] 請求項 35〜39の 、ずれか 1項に記載のベクターを導入した細胞。
[41] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの
1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNA とその相補 DNAを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの 合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含有 するベクターまたは細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与 する蛋白質の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含有するべクタ 一を導入した細胞。
[42] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が ex結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNA とその相補 DNAを含有するベクター、および細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの 合成に関与する酵素の機能を抑制する RNAに対応する DNAとその相補 DNAを含有 するベクターを導入した細胞。
[43] 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質の機能を抑制す る RNA力 マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反 応を触媒する酵素の機能を抑制する RNAである請求項 41または 42に記載の細胞。
[44] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素力 a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼで ある、請求項 41〜43のいずれ力 1項に記載の細胞。
[45] a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の（a)〜(！ 1)力 なる群力 選ばれる DNAが コードする蛋白質である、請求項 44に記載の細胞；
(a)配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNA；
(e)配列番号 1で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA
(1)配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダィ ズし、かつ at 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA ; (g)配列番号 3で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダ ィズし、かつ α 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA; (h)配列番号 4で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA a 1,6-フコシルトランスフェラーゼカ 以下の (a)〜(l)力 なる群力 選ばれる蛋白質 である、請求項 44に記載の細胞；
(a)配列番号 5で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(b)配列番号 6で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(c)配列番号 7で表されるアミノ酸配列力 なる蛋白質；
(d)配列番号 84で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(e)配列番号 5で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Ζまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 7で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入 および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラー ゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 84で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ α 1,6-フコシルトランスフェラ ーゼ活性を有する蛋白質；
(0配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(j)配列番号 6で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(k)配列番号 7で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列から なり、かつ a 1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 84で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ oc 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
[47] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)〜（ d)力 なる群力 選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAである、 請求項 41〜46の!、ずれか 1項に記載の細胞；
(a)配列番号 1で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 2で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 3で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(d)配列番号 4で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[48] N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する RNAが、以下の (a)お よび (b)からなる群から選ばれる RNAおよびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAで ある、請求項 41〜46の!、ずれか 1項に記載の細胞；
(a)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列から なる RNA ;
(b)配列番号 14〜35または 85〜89で表される塩基配列のいずれかの塩基配列に おいて、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列 からなり、 a 1 ,6-フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制する活性を有する RNA。
[49] GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒 する酵素が、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼである、請求項 43〜48のいずれか 1項に記載の細胞。
[50] GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(l)からなる群力 選ばれる DNA 力 Sコードする蛋白質である、請求項 49に記載の細胞；
(a)配列番号 8で表される塩基配列からなる DNA； (b)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列力もなる DNA;
(d)配列番号 8で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A;
(e)配列番号 9で表される塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A;
(1)配列番号 10で表される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダ ィズし、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする DN A。
GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼカ 以下の (a)〜(i)からなる群から選ばれる蛋白 質である、請求項 49に記載の細胞；
(a)配列番号 11で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b)配列番号 12で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(c)配列番号 13で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質；
(d)配列番号 11で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(e)配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(1)配列番号 13で表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿 入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒド ラターゼ活性を有する蛋白質；
(g)配列番号 11で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質；
(h)配列番号 12で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質； (0配列番号 13で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列か らなり、かつ GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
[52] GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒 する酵素の機能を抑制する RNA力 以下の (a)〜(c)力 なる群力 選ばれる RNAおよ びその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAである、請求項 43〜51のいずれか 1項に 記載の細胞；
(a)配列番号 8で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(b)配列番号 9で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA；
(c)配列番号 10で表される塩基配列中連続した 10〜40の塩基配列で表される塩基配 列からなる DNAに対応する RNA。
[53] GDP-マンノースを GDP- 4-ケト, 6-デォキシ- GDP-マンノースに変換する反応を触媒 する酵素の機能を抑制する RNA力 以下の (a)および (b)力 なる群力 選ばれる RNA およびその相補 RNAで構成される 2本鎖 RNAである、請求項 43〜51の!、ずれか 1項 に記載の細胞；
(a)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の 、ずれかの塩基配列力 なる R NA;
(b)配列番号 37、 57または 58で表される塩基配列の!/、ずれかの塩基配列にお!、て、 1または数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列力もなり 、 GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼの機能を抑制する活性を有する RNA。
[54] 細胞が、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコース の 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、請求 項 1〜4、 8〜21および 40〜53のいずれ力 1項に記載の細胞。
[55] レクチンが、以下の (a)〜(d)力もなる群力 選ばれるレクチンである、請求項 54に記載 の細胞；
(a)レンズマメレクチン LCA (Lens Culinaris由来の Lentil Agglutinin)； (b)エンドゥマメレクチン PSA (Pisumsativum由来の Pea Lectin)；
(c)ソラマメレクチン VFA(yy ^^由来の Agglutinin)；
(d)ヒィロチャワンタケレクチン AAL (Aleuriaaurantia由来の Lectin)。
[56] 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞力 なる群力 選ばれる細胞で ある、請求項 1〜4、 8〜21および 40〜55のいずれ力 1項に記載の細胞。
[57] 動物細胞が、以下の (a)〜(k)力もなる群力も選ばれる細胞である、請求項 56に記載 の細胞；
(a)チャイニーズノヽムスター卵巣組織由来 CHO細胞；
(b)ラットミエローマ細胞株 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞；
(c)マウスミエローマ細胞株 NS0細胞；
(d)マウスミエローマ細胞株 SP2/0- Agl4細胞；
(e)シリアンノヽムスター腎臓組織由来 BHK細胞；
(D抗体を産生するハイプリドーマ細胞；
(g)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(h)ヒト白血病細胞株 NM- F9細胞；
(0ヒト胚性網膜細胞株 PER.C6細胞；
(j)胚性幹細胞；
(k)受精卵細胞。
[58] 糖蛋白質をコードする遺伝子を含む、請求項 1〜4、 8〜21および 40〜57のいずれ 力 1項に記載の細胞。
[59] 糖蛋白質が抗体分子である、請求項 58に記載の細胞。
[60] 抗体分子が、以下の (a)〜(d)力もなる群力も選ばれる分子である、請求項 59に記載 の細胞；
(a)ヒト抗体；
(b)ヒト化抗体；
(c) (a)または (b)の Fc領域を含む抗体断片；
(d) (a)または (b)の Fc領域を含む融合蛋白質。
[61] 抗体分子のクラスが IgGである、請求項 59または 60に記載の細胞。 [62] 請求項 58に記載の細胞を用いる糖蛋白質組成物の製造方法。
[63] 請求項 58に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積さ せ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取精製する工程を含む、糖蛋白質組成物の 製造方法。
[64] 請求項 59〜61のいずれか 1項に記載の細胞を用いることを特徴とする、抗体組成物 の製造方法。
[65] 請求項 59〜61のいずれか 1項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に抗体組成 物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取精製する工程を含む、抗体組 成物の製造方法。
[66] 抗体組成物が、親株細胞が生産する抗体組成物より抗体依存性細胞傷害活性が高
V、抗体組成物である、請求項 64または 65に記載の方法。
[67] 抗体依存性細胞傷害活性が高!ヽ抗体組成物が、該抗体組成物中に含まれる Fc領 域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端の N-ァセチルダ ルコサミンにフコースが結合して 、な 、糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組 成物より高 、ことを特徴とする、請求項 66に記載の方法。
[68] フコースが結合していない糖鎖力 該フコースの 1位が N-グリコシド結合複合型糖鎖 還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合して!/ヽな 、糖鎖である、請求項 6
7に記載の方法。
[69] 請求項 62または 63に記載の方法を用いて製造される糖蛋白質組成物。
[70] 請求項 64〜68の 、ずれか 1項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
[71] 請求項 69または 70に記載の組成物を有効成分として含有する医薬。
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