FR2976811A1 - Utilisation d'un anticorps anti-cd20 a haute adcc pour le traitement de la maladie de waldenstrom - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, ledit anticorps ayant une cytotoxicité à médiation cellulaire dépendant des anticorps (ADCC) et/ou une capacité à activer les cellules effectrices exprimant le FcγRIII accrues, et possédant une région Fc dont au moins 60% des oligosaccharides sont non fucosylés, pour son utilisation dans le traitement de la maladie de Waldenström.

Description

UTILISATION D'UN ANTICORPS ANTI-CD20 A HAUTE ADCC POUR LE TRAITEMENT DE LA MALADIE DE WALDENSTROM

Domaine technique La présente invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, pour son utilisation dans le traitement de la maladie de Waldenstrôm (également appelée « macroglobulinémie de Waldenstrôm »).

La présente invention trouve ses applications dans le domaine médical, notamment dans le domaine de l'immunothérapie. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([]) renvoient à la liste des références présentée après les exemples.

Etat de la technique La macroglobulinémie de Waldenstrbm, ou maladie de Waldenstrém, est une maladie rare, avec une incidence de 3 nouveaux cas par million d'habitants et par an. Il s'agit d'une maladie d'évolution lente (indolente) qui touche essentiellement les personnes âgées, l'âge médian étant de 63 ans (Vijay A., Gertz M.A. 2007. Waldenstrôm macroglobulinemia. Blood. 109 (12): 5096-5103, [1]). Elle est exceptionnelle avant l'âge de 40 ans. La maladie de Waldenstrôm est caractérisée comme un lymphome lymphoplasmocytaire selon l'organisation mondiale de la santé (OMS) (Harris NL, Jaffe ES et ail. J Clin Oncol 1999 ;17. 3835-49, [2]) de la moelle et la présence dans le sérum d'une immunoglobuline monoclonale de type M (IgM). Elle se définie par une infiltration médullaire par des lymphoplasmocytes et une immunoglobuline monoclonale de type IgM qu'elle qu'en soit la concentration. Cliniquement, des patients présentent souvent une asthénie généralement liée à une anémie. Le syndrome tumoral peut être présent avec polyadénopathie et splénomégalie, des signes cliniques liés à l'hyperviscosité surviennent en général lorsque le taux d'IgM est important, supérieur à 30 g/I : céphalées, troubles visuels, épistaxis, manifestations neurologiques. La paraprotéine peut aussi avoir une activité de type auto anticorps et / ou cryoglobuline, résultant d'un phénotype auto-immun avec une activité cryoglobuline mixte qui peut s'observer jusqu'à 20% des cas. Des neuropathies surviennent chez une minorité de patients et peuvent être liées à l'activité anticorps de la paraprotéine IgM dirigée contre des antigènes de la gaine de myéline soit une glycoprotéine associée à la myéline (anticorps anti-MAG). D'autres symptômes liés à des dépôts d'IgM au niveau des tissus peuvent être observés : au niveau de la peau avec présence de papules et nodules, au niveau du glomérule rénal avec une protéinurie de l'intestin avec une diarrhée. Parfois, apparaît une amylose due à des dépôts de chaines légères en particulier dans le coeur et les reins. L'origine de la cellule tumorale pourrait être un lymphocyte B arrêté dans son processus de développement après son passage dans le centre germinatif, mais avant le stade de plasmocyte. II pourrait s'agir d'une cellule mémoire IgM+ et/ou IgM+, IgD+ qui présenterait un déficit dans le processus d'initiation du switch isotypique. Le suivi de la maladie est réalisé par l'électrophorèse des protéines. Lorsque le patient ne souffre d'aucun symptôme, une simple surveillance est instaurée. A l'opposé, un traitement est proposé si le patient présente les symptômes suivants : des ganglions ou une augmentation de la taille de la rate (splénomégalie), des signes d'auto-immunité, une cryoglobuline symptomatique, des complications liées à l'hyperviscosité du sang, des neuropathies. Les analogues des purines, comme la fludarabine, ont constitué une avancée majeure dans le traitement de ces hémopathies, principalement des formes réfractaires aux chimiothérapies standards (Leblond V et al., French Cooperative Group on Chronic Lymphocytic Leukemia and Macroglobulinemia. 2001. Multicenter, randomized comparative trial of fludarabine and the combination of cyclophosphamide-doxorubicin- prednisone in 92 patients with Waldenstrôm macroglobulinemia in first relapse or with primary refractory disease. Blood. 2001 98:2640-2644, [3]; Dimopoulos MA et al., (2009A). Update on treatment recommendations from the Fourth International Workshop on Waldenstrom's Macroglobulinemia. J. Clin. Oncol. 27: 120-126, [4]; Neparidze N, Dhodapkar MV. 2009. Waldenstrom's macroglobulinemia: Recent advances in biology and therapy. Clin. Adv. Hematol. Oncol. 7: 677-681, [5]; Treon SP. 2009. How 1 treat Waldenstrdm macroglobulinemia. Blood. 114: 2375-2385, [6]). Cependant, cette pathologie reste, à ce jour, incurable en dehors des allogreffes. Actuellement, le rituximab, anticorps dirigé contre l'antigène CD20, associé à la chimiothérapie, est recommandé en première intention (Treon 2009 [6], Dimopoulos MA, Kastritis E, Roussou M, Eleutherakis-Papaiakovou E, Migkou M, Gavriatopoulou M, Tassidou A, Terpos E. (2009B). Rituximabbased treatments in Waldenstrôm's macroglobulinemia. Clin. Lymphoma Myeloma. 9: 59-61, [7]). L'antigène CD20 est une protéine transmembranaire hydrophobe d'un poids moléculaire de 35-37 kDa présente à la surface des lymphocytes B matures (Valentine et al. (1987) Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22) : 8085-9 [8]; Valentine et al. (1989) J.Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287 [9]). Il est exprimé au cours du développement des lymphocytes B dès le stade pré-B précoce et ce jusqu'à la différenciation en plasmocyte, stade où cette expression disparaît. L'antigène CD20 est présent à la fois sur les lymphocytes B normaux et sur les cellules B malignes. Plus particulièrement, l'antigène CD20 est exprimé sur la plupart des lymphomes de phénotype B (80% des lymphomes) : il est exprimé par exemple sur plus de 90% des LNH de lymphocytes B. La fonction du CD20 n'est pas encore totalement élucidée, mais il pourrait agir comme un canal calcique et intervenir dans la régulation des premières étapes de la différenciation (Golay et al. (1985) J. Immunol.; 135(6) :3795-801 [10]) et de la prolifération des lymphocytes B (Tedder et al. (1986) Sur J. Immunol . 1986 Aug;16(8) :881-7 [1 1]). Ainsi, bien qu'il subsiste des incertitudes quant à son rôle dans l'activation et la prolifération des lymphocytes B, l'antigène CD20 est, de par sa localisation, une cible importante pour le traitement des pathologies impliquant des lymphocytes B tumoraux, comme par exemple les LNH ou la LLC-B (leucémie lymphoïde chronique B) par des anticorps reconnaissant spécifiquement le CD20. De plus, cet antigène est une cible idéale en immunothérapie car il s'agit d'une protéine membranaire pour laquelle on ne connaît pas de modulation d'expression ou de polymorphisme.

Dans le cadre du traitement de la maladie de Waldenstrdm, l'utilisation de rituximab en monothérapie donne une réponse insuffisante (environ 35% de réponse, Gertz MA et al. Multicenter phase 2 trial of rituximab for Waldenstrdm macroglobulinemia (WM): an Eastern Cooperative Oncology Group Study (E3A98). Leuk Lymphoma. 45(10):2047-55, [12]). 1 o Par ailleurs, il est à noter que très peu d'études ont été réalisées sur les cellules NK (natural killer) de patients atteints de la maladie de Waldenstrdm. Jusqu'à présent, les 3 études publiées montrent des résultats contradictoires. Dans un cas de macroglobulinémie familiale, les cellules NK ont été trouvées fonctionnellement normales (Ogmundsdottir HM et al., 1995. Familial 15 macroglobulinaemia: hyperactive B-cells but normal natural killer function. Scand. J. Immunol. 40: 195-200, [13]), alors que chez d'autres patients atteints de gammapathies monoclonales associées à des polyneuropathies, la proportion de cellules NK est fortement diminuée (Vrethem M, Dahle C, Ekerfeldt C, Nilsson J, Ekstedt B, Ernerudh J. 1994. Abnormalities in T- 20 lymphocyte populations in blood from patients with demyelinating polyneuropathy associated with monoclonal gammopathy. J. Neurol. Sci. 122: 171-178, [14]). Une étude plus récente a montré une expansion et une activation des cellules NK chez des patients atteints de la maladie de Waldenstrdm après traitement par la thalidomide (Zeldis JB et al., 2003. 25 Potential new therapeutics for Waldenstrom's macroglobulinemia. Semin. Oncol. 30: 275-281, [15]). Cependant ces différentes études ne rendent pas compte de l'ensemble des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des cellules NK au cours de cette maladie, ni de leurs impacts dans une immunothérapie par anticorps monoclonaux. 30 Il existe donc un réel besoin d'un outil thérapeutique palliant ces inconvénients et obstacles quant au traitement de la maladie de Waldenstrôm (appelée ci-après « MW »).

Description de l'invention D'importantes recherches effectuées par la Demanderesse lui permettent maintenant de fournir des outils de traitement d'immunothérapie par anticorps dirigé contre l'antigène CD20 optimisé pour les patients atteints de la maladie de Waldenstrém.

Avantageusement, les outils de traitement de l'invention peuvent présenter une plus faible myélotoxicité que les chimiothérapies standards. Un premier objet de l'invention se rapporte ainsi à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, cet anticorps ayant une cytotoxicité à médiation cellulaire dépendant des anticorps (ADCC) et/ou une capacité à activer les cellules effectrices exprimant le FcyRlll accrues, et possédant une région Fc dont au moins 60% des oligosaccharides sont non fucosylés, pour son utilisation dans le traitement de la maladie de Waldenstn5m. L'anticorps peut par exemple posséder au moins 70%, ou au moins 80%, ou au moins 90%, ou même 100% d'oligosaccharides non fucosylés. Alternativement, la teneur en fucose peut être comprise entre 20% et 45% ou encore entre 25% et 40%. Aux fins de l'invention, les expressions " anticorps monoclonal " ou " composition d'anticorps monoclonal " sont équivalentes et se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique. On entend par « anticorps », au sens de la présente invention, toute immunoglobuline constituée d'au moins une chaîne lourde et d'au moins une chaîne légère, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N- terminale, d'une région (ou domaine) variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour les chaînes légères et V-D- J pour les chaînes lourdes) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C- terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour les chaînes légères ou de plusieurs domaines pour les chaînes lourdes. L'anticorps selon l'invention peut être un anticorps chimérique, c'est-à- dire un anticorps dont les régions variables des chaînes légères et lourdes appartiennent à une espèce différente des régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes. Alternativement, l'anticorps selon l'invention peut être un anticorps humanisé, c'est-à-dire un anticorps humain ayant des parties hypervariables d'un anticorps d'une autre espèce, et présentant une meilleure tolérance par l'organisme humain et une demi-vie plus longue. Alternativement, l'anticorps selon l'invention peut être un anticorps humain. L'anticorps utilisé dans l'invention peut donc posséder en outre des régions constantes de ses chaînes légères et lourdes appartenant à une espèce non-murine. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux. Les anticorps utilisés dans l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps " chimériques " décrites par exemple dans Morrison et al., Proc. Natl . Acad. Sci . U.S.A., 81, pp. 6851-55 (1984) [30], où la technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine. Un mode de réalisation particulier sera illustré plus loin. On entend par « dirigé contre l'antigène CD20 », au sens de la présente invention, la capacité de l'anticorps monoclonal à lier tout ou partie de l'antigène CD20. On entend par « accrue », au sens de la présente invention, une cytotoxicité à médiation cellulaire dépendant des anticorps (ADCC) et/ou une capacité à activer les cellules effectrices exprimant le FcyRlll, supérieure(s) à celle du même anticorps possédant une région Fc dont moins de 60% (non inclus) des oligosaccharides sont non fucosylés, ou supérieure(s) à celle du rituximab. L'ADCC et/ou la capacité à activer les cellules effectrices exprimant le FcyRlll peu(ven)t être supérieure(s) à au moins 50%, ou supérieure(s) à au moins 60%, ou à au moins 70%, ou 80%, ou 90% par rapport à celle du même anticorps ne possédant une région Fc dont moins de 60% (non inclus) des oligosaccharides sont non fucosylés ou à celle du rituximab.

On entend par « même anticorps », au sens de la présente invention, un anticorps dont les séquences primaires sont identiques à celles de l'anticorps de l'invention. Par exemple, l'ADCC peut être quantifiée sur la base de l'EC50 (demi de concentration efficace maximale) de l'anticorps. Par exemple, l'EC50 peut être telle que la quantité du même anticorps possédant une région Fc dont moins de 60% des oligosaccharides sont non fucosylés, ou de rituximab, requise pour atteindre 50% de la lyse maximale observée avec l'anticorps de l'invention est au moins 2 fois supérieure, ou au moins 5 fois supérieure, ou au moins 10 fois supérieure, à celle de l'anticorps de l'invention.

On entend par « EC50 », au sens de la présente invention, la quantité d'anticorps requise pour atteindre 50% de la lyse maximale. La mesure de l'EC50 peut être réalisée au moyen de toute technique connue de l'homme du métier, par exemple (Shi J, Orth JD, Mitchison T, Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5 Cancer Res. 2008 May 1;68(9):3269-76 [29]) Le même anticorps dont moins de 60% des oligosaccharides sont non fucosylés peut être produit par une lignée CHO, par exemple la lignée CHO DG44. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps utilisé dans l'invention peut comprendre en outre une quantité d'oligosaccharides complexes présentant une bissection augmentée par modification de la glycosylation.

On entend par « bissection », au sens de la présente invention, tout résidu N-acétylglucosamine intercalaire greffé en [31,4, notamment par action de la GNTIII. Dans ce mode de réalisation, l'anticorps peut comprendre en outre au moins 20%, par exemple au moins 30%, ou au moins 40%, ou encore au moins 500/0, 60%, 70% d'oligosaccharides présentant une bissection et non fucosylés. Dans ce mode de réalisation, des méthodes pour produire l'anticorps connues de l'homme du métier peuvent être utilisées, comme par exemples les méthodes décrites dans les documents WO9954342, EP1692182, WO2004065540, US6602684, cette liste n'étant pas limitative, des méthodes pour produire des anticorps comprenant au moins un domaine Fc d'une immunoglobuline et ayant des résidus N-acétylglycosamine intercalaires (GlcNac intercalaire) comme par exemple les méthodes décrites dans les documents EP 1 071 700 et US 2005/123546, cette liste n'étant pas limitative. Par exemple, l'anticorps peut être produit dans une cellule hôte exprimant au moins un acide nucléique codant pour un polypeptide ayant une activité de R-(1,4)-N-acétylglucosaminyltransférase 111 en une quantité suffisante pour modifier la glycosylation de la région Fc dudit anticorps.

Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps utilisé dans l'invention peut présenter une faible fucosylation, c'est-à-dire des structures glycanniques ayant une teneur en fucose inférieure à 65%. Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps utilisé dans l'invention peut présenter une faible fucosylation, c'est-à-dire des structures glycanniques ayant une teneur inférieure à 500/0 de formes GOF+G1 F. Par exemple, l'anticorps peut comprendre en outre une teneur supérieure à 60% pour les formes GO+G1+GOF+G1 F, les formes GOF +G1 F étant inférieures à 50%. Dans un autre mode de réalisation particulier, les anticorps peuvent comprendre une teneur supérieure à 60% pour les formes GO+G1+GOF+G1F, la teneur en fucose étant inférieures à 65%.Ces formes sont plus particulièrement sélectionnés parmi les formes : GO, GOF et 017, GIi Ac Dans cet autre mode de réalisation, l'anticorps peut comprendre en outre, sur un site de glycosylation Asn297, une structure glycannique présentant des mannoses terminaux et/ou des N-acétylglucosamines terminaux non intercalaires. L'anticorps peut comprendre, sur le site de glycosylation Asn297, une structure glycannique de type biantenné, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, et une teneur supérieure à 60% pour les formes GO+G1 +GOF+G1 F, les formes GOF +G1 F étant inférieures à 50%. Par exemple, la composition d'anticorps peut posséder une teneur en acide sialique inférieure à 25%, 20%, 15%, ou 10%, de préférence 5%, 4% 3% ou 2%. La composition d'anticorps peut comprendre une teneur supérieure à 60%, de préférence supérieure à 80% pour les formes GO + G1 + GOF + G1 F étant entendu que les formes GOF + G1 F sont inférieure à 50%, de préférence inférieure à 30%. La composition d'anticorps peut comprendre des structures glycanniques de type biantennées, avec des chaînes courtes, une faible sialylation, des mannoses et des N-acétylglucosamines du point d'attache terminaux non intercalaires, les structures glycanniques ayant une teneur supérieure à 60% pour les formes GO + G1 + GOF + G1 F, et une faible fucocylation, les structures glycanniques ayant une teneur inférieure à 50% de formes GOF + G1 F.

Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps utilisé dans l'invention peut présenter des structures glycaniques telles que décrites dans le document WO 01/77181. L'anticorps monoclonal peut être préparé comme cela est décrit dans le document WO 2006/064121 (LFB), ou dans le document WO 01/77181 (LFB), par sélection de lignées cellulaires permettant de produire des anticorps présentant une forte activité ADCC du type FcyRlll (CD 16), c'est-à-dire une forte affinité pour le récepteur CD16 des cellules effectrices du système immunitaire. Par exemple, l'anticorps peut être produit dans un hybridome, notamment un hétérohybridome obtenu avec le partenaire de fusion K6H6-B5 (ATCC CRL 1823) ou dans une cellule animale ou humaine transfectée à l'aide d'un vecteur comportant le gène codant pour ledit anticorps, notamment une cellule dérivée des lignées Vero (ATCC CCL-81), une lignée cellulaire d'hybridome de rat, comme par exemple la lignée d'hybridome de rat YB2/0 (ATCC CRL-1662, cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection) ou encore la lignée CHO Lec-1 (ATCC CRL-1735), CHO-Lec10, CHO dhfr- (par exemple CHO DX BII, CHO DG44) , CHO Lec13 , SP2/0, NSO, 293, BHK, COS, IR983F, un myélome humain comme Namalwa ou toute autre cellule d'origine humaine comme PERCE, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX BII, CHO DG44), Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293- HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653. Avantageusement, l'anticorps peut être produit dans une lignée cellulaire choisie parmi YB2/0, Vero, CHO-Iec10, CHO-1ec13, CHO-lec1, CHOK1SV Potelligent® (Lonza, Suisse), CHOGnTIII (Glycart, Suisse). L'anticorps peut être également produit dans une lignée cellulaire EB66 (Vivalis) De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps utilisé dans l'invention est produit par une lignée cellulaire d'hybridome de rat. La lignée productrice de l'anticorps est une caractéristique importante puisqu'elle confère à l'anticorps certaines de ses propriétés particulières. En effet, le moyen d'expression des anticorps est à l'origine des modifications post- traductionnelles, notamment des modifications de la glycosylation, qui peuvent varier d'une lignée cellulaire à l'autre, et ainsi conférer des propriétés fonctionnelles différentes à des anticorps ayant pourtant des structures primaires identiques.

Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps est produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB213HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662). Cette lignée a été choisie en raison de sa capacité à produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de l0 même structure primaire produits par exemple dans CHO. D'autres méthodes sont connues de l'homme du métier pour produire des anticorps faiblement fucosylés, et peuvent être utilisées pour la préparation de l'anticorps de l'invention. Il peut s'agir par exemple de méthodes de préparation d'anticorps dans des cellules cultivées en présence 15 de kifunensine, comme cela est décrit par exemple dans le document US7700321. Des analogues de fucose peuvent également être introduits dans le milieu de culture de cellules productrices d'anticorps comme décrit dans le document US 20090317869. 20 Un autre moyen de produire des anticorps, peut être l'utilisation, par exemple de cellules pour lesquelles la voie de production des GDP-fucose est inhibée, par exemple par inhibition de l'une au moins des enzymes du cycle de production fucose, telle que décrit par exemple dans le document US 2010291628 ou US 20090228994, le document EP 1 500 698, le 25 document EP 1 792 987 ou encore le document US 7 846 725, cette liste n'étant pas limitative. Il est également possible d'utiliser des ARN interférent (ARNi) inhibant la 1,6-fucosyltransférase comme décrit dans le document US 7 393 683 ou le document WO2006133148. II peut également s'agir de méthodes de préparation d'anticorps dans 30 des animaux transgéniques, comme cela est décrit dans le document WO200748077. Il peut également s'agir de méthodes de préparation d'anticorps dans des levures, comme cela est décrit par exemple dans le document WO 0200879 . Dans le cas où la région Fc de l'anticorps possède 100% d'oligosaccharides non fucosylés, c'est-à-dire quand la région Fc de l'anticorps est totalement dépourvue de fucose, il est possible d'utiliser des méthodes de préparation connues de l'homme du métier, comme par exemple celles décrites dans les documents EP1176195, US 7 214 775, US 6 994 292 , US 7 425 449, US2010223686, WO2007099988, EP 1 705 251, cette liste n'étant pas limitative. II peut s'agir par exemple d'une méthode utilisant une cellule hôte exprimant au moins un acide nucléique codant pour l'anticorps de l'invention, et dont la glycosylation est modifiée par délétion du gène codant pour l'a1,6- fucosyltransférase ou par addition d'une mutation de ce gène pour éliminer l'activité a1,6- fucosyltransférase, et exprimant à ce titre un anticorps dépourvu de fucose. Il peut également s'agir d'une méthode comprenant la mutation des acides aminés de la partie Fc. L'anticorps peut être un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1, dont la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2, et dont les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine. Les séquences d'acide nucléique murines SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 codent pour le domaine variable de chacune des chaînes légères et le domaine variable de chacune des chaînes lourdes respectivement de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT-13.6E12, disponible à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) sous le numéro ACC 474. Cet hybridome produit un anticorps monoclonal murin de type IgG2a,x dirigé contre le CD20.

La séquence SEQ ID NO. 1 comporte néanmoins un acide nucléique qui diffère par rapport à la séquence codant pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT-13.6E12.

Ces séquences murines ont été choisies pour dériver les séquences des régions variables des anticorps selon l'invention en raison de la spécificité de l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour l'antigène CD20. Les régions variables des anticorps selon l'invention comportent au moins 70% d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 cette identité de séquences conférant une identité de spécificité des anticorps selon l'invention avec l'anticorps murin CAT-13.6E12. De préférence, cette identité de séquences confère également une identité d'affinité pour la cible entre l'anticorps selon l'invention et l'anticorps murin CAT-13.6E12.

De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention est codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO . 2. La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisés dans l'invention peut être codée par une séquence possédant au moins 95% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 950/0 d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisées dans l'invention est codée par une séquence possédant au moins 99% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 99% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. Avantageusement, tout anticorps possédant des régions variables de leur chaînes lourdes et légères présentant une ou plusieurs substitution(s), insertion(s) ou délétion(s) d'un ou plusieurs acides nucléiques, ces modifications de séquences répondant aux pourcentages d'identités de séquences tels que définis ci-dessus, et n'altérant ni la spécificité de l'anticorps pour sa cible, ni son affinité pour sa cible, peut être utilisé aux fins de l'invention. Les anticorps utilisés dans l'invention s'entendent aussi de tout anticorps possédant les régions CDR (Complementary Determining Région) de l'anticorps CAT-13.6E12, associées à des régions FR (framework, régions très conservées des régions variables, nommées aussi "charpente"). De tels anticorps possèdent une affinité et une spécificité très comparables, de préférence identiques, à l'anticorps murin CAT-13.6E12. La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps utilisé dans l'invention peut être codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2. Un anticorps utilisé, notamment comme médicament, dans l'invention peut donc être un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1, la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2, et les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine. Ainsi, par « dirigé contre l'antigène CD20 », on entend désigner la capacité de l'anticorps monoclonal à lier tout ou partie de l'antigène CD20, et notamment l'épitope reconnu par l'anticorps EMAB603, également appelé R603.

Les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention peuvent être des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(1), Km(1, 2), Km(1, 2, 3) ou Km(3) mais l'allotype préféré est Km(3) .

Alternativement, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type a,. Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps utilisés dans l'invention sont des régions humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être de type y1, de type y2, de type y3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type y4. Les anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type y appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type G (IgG), sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CHI, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CHI et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps, reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcyR et le Cl q. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires CH2 et CH3, est glycosylée au niveau du domaine CH2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné de type lactosaminique, lié à l'Asn 297. De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y1, car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC chez le plus grand nombre d'individus (humains). A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple G1m(3), G1m (1, 2, 17), G1m(1, 17) ou Glm(1, 3) . De manière préférentielle, l'allotype est G1m(1, 17) . Dans un aspect particulier de l'invention, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y1, et elle est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3, la région constante de chacune de ses chaînes légères étant codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4. Ainsi, un tel anticorps possède une région variable murine et une région constante humaine, avec des chaînes lourdes de type y1. Cet anticorps appartient donc à la sous-classe des IgG1. Selon le mode de réalisation de l'anticorps utilisé dans l'invention, l'anticorps possède deux chaînes légères dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 et la région constante humaine est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 4, et deux chaînes lourdes dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 et la région constante est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3. De manière préférentielle, chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 1 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 4 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps. La séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6 codant pour chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 2 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps. Dans un aspect particulier de l'invention, lorsque chacune des chaînes légères de l'anticorps est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et que chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murinehumaine SEQ ID NO : 6, la séquence peptidique de chacune des chaînes légères, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5, est la séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence peptidique de chacune des chaînes lourdes, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6, est la séquence SEQ ID NO : 8. L'acide aminé situé en position 106 est une lysine (K) dans la séquence SEQ ID NO : 7. L'invention s'entend aussi de l'utilisation des anticorps dont chacune des chaînes légères codées par une séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine possède au moins 70% d'homologie ou d'identité avec la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 7 et chacune des chaînes lourdes codées par une séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine possède au moins 70% d'homologie ou d'identité avec la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 8, ces modifications n'altérant ni la spécificité de l'anticorps ni ses activités effectrices, comme l'activité ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) .

Dans un autre mode de réalisation particulier, un autre anticorps selon l'invention est l'anticorps EMAB603 (également appelé LFB-R603) produit par le clone cellulaire R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). Chacune des chaînes légères de l'anticorps LFB-R603 est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO: 5, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 6. Cet anticorps l0 chimérique entre en compétition avec l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour la fixation du CD20 et possède une activité cytotoxique très supérieure à celle du rituximab, qui peut être attribuée pour partie à la glycosylation particulière du N-glycanne de la chaîne lourde de ces anticorps. En effet, le clone R603 a pour particularité de produire une composition d'anticorps LFB-R603 15 possédant un ratio taux de fucose/taux de galactose inférieur à 0,6, pour lequel il a été démontré dans la demande de brevet FR 03 12229 qu'il est optimal pour conférer une forte activité ADCC aux anticorps. Un exemple de vecteur d'expression d'un anticorps selon l'invention, est le vecteur de séquence SEQ ID NO : 17. Ce vecteur est un vecteur 20 permettant l'expression d'un anticorps selon l'invention dont la chaîne légère est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 5, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 7, et dont la chaîne lourde est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 6, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 8. Ce 25 vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 5 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps et la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 6 codant chacune des chaînes lourdes de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de 30 ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier, et peuvent être un adénovirus, un rétrovirus, un plasmide ou un bactériophage, cette liste n'étant pas limitative. Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps de l'invention peut être produit par co-expression dans une cellule de deux vecteurs d'expression, l'un permettant l'expression de la chaîne légère, et l'autre celle de la chaîne lourde de l'anticorps.Tout comme indiqué précédemment, ces vecteurs possèdent des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. Les milieux de culture adaptés à ces cellules sont bien connus de l0 l'homme du métier, et on peut citer de manière non exhaustives les milieux de culture RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) [16]), Eagle's MEM (Science, 122, 501 (1952) [17]), Dulbecco's modified MEM (Virology, 8, 396 (1959) [18]), F12 Medium (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965) [19]), IMDM (J. Experimental Medicine, 15 147, 923 (1978) [20]), ou encore ceux décrits dans le document EP1229125. Avantageusement, l'anticorps utilisé dans l'invention peut permettre la formation de lymphocytes T mémoires. Ces lymphocytes T mémoires peuvent posséder la capacité de proliférer, et de se réactiver de manière rapide lors d'une deuxième exposition aux cellules prolifératives. 20 L'anticorps peut permettre une déplétion des cellules B périphériques d'au moins 20%, ou au moins 30 %, ou encore au moins 50%, et de préférence d'au moins 60%, ou 70% chez le sujet auquel il est administré. L'anticorps utilisé dans l'invention peut être administré avec un support pharmaceutiquement acceptable, approprié pour l'effet thérapeutique 25 attendu. A cet égard, l'anticorps peut être utilisé en monothérapie. En d'autres termes, l'anticorps peut être utilisé sans autre principe actif, pendant tout la durée du traitement au moyen de l'anticorps. Alternativement, l'anticorps utilisé dans l'invention peut être utilisé en 30 combinaison avec un ou plusieurs autre(s) principe actif, par exemple un anticorps monoclonal, dirigé contre un ou plusieurs autre(s) antigène(s) exprimé(s) sur les cellules lymphoïdes, comme par exemple, de façon non limitative, les antigènes CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11, CD16, CD18, CD19, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD29, CD30, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD49, CD50, CD52, CD53, CD54, CD55, CD58, CD59, CD69, CD70, CD71, CD80, CD81, CD82, CD86, CD95, CD103, CD118, CD119, CD120, CD132, CD210, CD217. L'anticorps selon l'invention peut être utilisé en association avec des cellules exprimant des FcyR telles que les cellules NK, les cellules NKT (Natural Killers T) , les lymphocytes Tyb, les macrophages, les monocytes ou les cellules dendritiques, c'est-à-dire en association avec une thérapie cellulaire (Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78:1569 ([21]) ; Kimby E et al. 1989 Leukemia 3 (7) :501-504 ([22]); Soorskaar D et al. 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87(2) ;159-164 ([23]) ; Ziegler HW et al. 1981 Int J Cancer 27(3) ;321-327 ([24]) ; Chaperot L et al. 2000 Leukemia 14 (9) :1667-77 ([25]) ; Vuillier F, Dighiero G 2003 Bull Cancer. 90 (8-9) :744-50 ([26])). La dose d'anticorps administrée aux patients peut être comprise entre 0,5 mg/m2 et 1000 mg/m2, par exemple entre 50 mg/m2 et 700 mg/m2, ou encore entre 100 mg/m2 et 500 mg/m2, ou encore entre 200 mg/m2 et 400 mg/m2 . La dose d'anticorps peut être inférieure à 375 mg/m2, ou à 187,5 mg/m2, à 75 mg/m2, à 37,5 mg/m2, 15 mg/m2, 7,5 mg/m2 ou de manière particulièrement avantageuse inférieure à 3,75 mg/m2 ou encore à 1 mg/m2 ou à 0,5 mg/m2. La dose administrée est avantageusement comprise entre 187,5 mg/m2 et 75 mg/m2, ou entre 75 mg/m2 et 37,5 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 15 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 7,5 mg/m2 ou encore entre 75 mg/m2 et 3,75 mg/m2. De préférence, la dose administrée est comprise entre 3,75 mg/m2 et 0,5 mg/m2, plus particulièrement comprise entre 2 mg/m2 et 1 mg/m2. Ces doses peuvent être administrées par voie intraveineuse. Avantageusement, l'administration de l'anticorps peut se faire près du site de la prolifération, ou dans le site de la prolifération.

L'administration peut se faire soit à dose unique (c'est-à-dire administration unique), soit en injections répétées. Si les injections sont répétées, chaque administration peut être suffisamment espacée de la précédente pour que chaque administration soit considérée comme une administration en dose unique. Par exemple, chaque administration peut être espacée d'au moins une semaine, ou d'au moins 2 semaines, d'au ou moins 3 semaines, ou d'au mois 4 semaines, ou d'au moins 6 semaines, ou d'au moins 10 semaines, ou d'au moins 6 mois de l'administration précédente. L'anticorps peut être utilisé chez des patients candidats à une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques. L'anticorps peut être utilisé chez des patients très cytopéniques.

L'invention peut être définie comme l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la maladie de Waldenstrêm. Dans ce cas, toutes les caractéristiques techniques, variantes et modes de réalisation mentionnées ci-avant, et leur combinaison, sont applicables.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la maladie de Waldenstrêm. Dans ce cas, toutes les caractéristiques techniques, variantes et modes de réalisation mentionnées ci-avant, et leur combinaison, sont applicables. L'excipient peut être tout excipient connu de l'homme du métier, comme les excipient utilisés avec les produits Rituxan®, Herceptin®, Synagis®, Campath®, Zevalin®, Avastin®, cette liste n'étant pas limitative. En d'autres termes, cet autre objet de l'invention peut être défini comme une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation dans le traitement de la maladie de Waldenstrêm. Par ailleurs, un autre objet de l'invention est un procédé de préparation d'un médicament destiné au traitement de la maladie de Waldenstrêm, consistant à mélanger l'anticorps monoclonal utilisé dans l'invention avec un support pharmaceutiquement acceptable, puis à obtenir le médicament.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps tel que défini ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la maladie de Waldenstrdm. Un autre objet de l'invention est une méthode de traitement thérapeutique de la maladie de Waldenstrôm, comprenant l'administration, à un patient en présentant le besoin, d'un anticorps ou d'un médicament tel que décrit ci-avant, éventuellement accompagné d'un excipient pharmaceutiquement acceptable. Avantageusement, la méthode de traitement comprend l'étape d'administration des anticorps à un patient atteint de MW. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.

Brève description des figures - La figure 1 est la représentation schématique du vecteur CKHu utilisé pour la chimérisation de la chaîne légère kappa des anticorps EMAB603. - La figure 2 est la représentation schématique du vecteur G1 Hu utilisé pour la chimérisation de la chaîne lourde des anticorps EMAB603. - La figure 3 est la représentation schématique du vecteur d'expression des chaînes lourdes et légères utilisé pour la production de l'anticorps R603.

EXEMPLES Exemple 1 : Construction des vecteurs d'expression de l'anticorps chimériques anti-CD20 EMAB603

A. Détermination de la séquence des régions variables de l'anticorps murin CAT-13.6E12 L'ARN total de l'hybridome murin CAT-13.6E12 (fournisseur : DSMZ, réf. ACC 474) produisant une immunoglobuline de type IgG2a,K a été isolé30 (kit RNAeasy, Qiagen réf. 74104). Après transcription inverse, les domaines variables des chaînes légères (VK) et lourdes (VH) de l'anticorps CAT-13.6E12 ont été amplifiées par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (kit GeneRacer, Invitrogen réf. L1500-01). Les amorces utilisées pour ces deux étapes sont les suivantes :

1. amorces de transcription inverse a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 9) 5' - ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 10) 5'- CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG -3'

2. amorces de PCR 5'RACE a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 11) 5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 12) 5'- GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG -3'

Les produits de PCR VH et VK ainsi obtenus ont été clonés dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO (Zéro blunt TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, réf. K2875-20) puis séquencés. La séquence nucléotidique de la région VK de l'anticorps murin CAT-13.6E12 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO : 1, hormis le dernier nucléotide qui est remplacé par A (AAA au lieu de AAC) . Le gène VK appartient à la famille Vx4 (Kabat et al., "Séquences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991) [27]). La séquence nucléotidique de la région VH de CAT-13.6E12 est la séquence SEQ ID NO : 2. Le gène VH appartient à la famille VH1.

B. Construction des vecteurs d'expression des chaînes lourdes et des chaînes légères des anticorps chimériques EMAB603 1. Vecteur chaîne légère Kappa de l'anticorps EMAB603 La séquence VK clonée dans le vecteur de séquençage pCR4Blunt-TOPO a été amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : a) amorce sens VK (SEQ ID NO : 13) 5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACCA TGGATTTTCAAGTGCAGATTTTC AG -3' La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italiques.

b) amorce antisens VK: (SEQ ID NO : 14) 5'- TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCG©TTTATTTCCAGCCTGGT - 3' Cette amorce réalise la jonction des séquences VK murine (en italique) et région constante (CK) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III. Cette amorce réalise la jonction des séquences VK murine (en italique) et région constante (CK) humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III.

Le produit de PCR VK ainsi obtenu contient la séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12, avec la mutation AAC -> AAA (nucléotide encadré dans la séquence de l'amorce antisens SEQ ID NO : 14) qui correspond à la mutation N106K par rapport à la séquence naturelle VK de CAT-13.6E12.

La séquence de la chaîne légère de l'anticorps chimérique EMAB603 codée par ce vecteur est présentée en SEQ ID NO : 5 pour la séquence nucléotidique et correspond à la séquence peptidique déduite SEQ ID NO : 7. Cette PCR VK a été ensuite clonée entre les sites Spe 1 et Dra III du vecteur de chimérisation chaîne légère (Fig. 1) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 1, en 5' de la région constante Cx humaine, dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 4. La séquence CK humaine de ce vecteur de chimérisation avait été préalablement modifiée par mutagénèse silencieuse afin de créer un site de restriction Dra III pour permettre le clonage de séquences VK murines. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection dhfr (dihydrofolate reductase) .

2. Vecteur chaîne lourde Une démarche similaire a été appliquée pour la chimérisation de la chaîne lourde de l'anticorps EMAB603.

La séquence VH clonée dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO a été tout d'abord amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : a) amorce sens VH (SEQ ID NO :15) 5'- CTCAGTACTAGTGCCGCCACCATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTC -3' La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italique. b) amorce antisens VH (SEQ ID NO :16) 5'- GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTC C -3'30 Cette amorce réalise la jonction des séquences VH murine (en italique) et région constante GI humaine (en gras). La séquence soulignée correspond au site de restriction Apa 1 . Le fragment VH amplifié contient la séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12. Cette PCR VH a été ensuite clonée entre les sites Spe 1 et Apa 1 du vecteur de chimérisation chaîne lourde (Fig. 2) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 2, en 5' de la région constante yl humaine dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 3. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection néo. La séquence de la chaîne lourde de l'anticorps chimérique EMAB603 codée par ce vecteur est présenté en SEQ ID NO : 6 pour la séquence nucléotidique et en séquence SEQ ID NO : 8 pour la séquence peptidique déduite.

3. Vecteurs d'expression finaux

Vecteur d'expression de l'anticorps EMAB603 Un vecteur d'expression unique contenant les deux unités de transcription chaîne lourde et chaîne légère de l'anticorps anti-CD20 EMAB-603 a été construit à partir des deux vecteurs de chimérisation de la chaîne légère et de la chaîne Ce vecteur d'expression HK463-25(FDA) présente deux gènes de sélection, néo (neo-phosphotransphérase II) et dhfr (dihydrofolate reductase) ainsi que deux unités de transcription chaîne lourde et chaîne légère sous le contrôle d'un promoteur RSV (Figure 3).

Exemple 2 : Création de lignées cellulaires dérivées de la lignée YB210 productrices de l'anticorps chimérique anti-CD20 EMAB603 La lignée de rat YB2/0 (ATCC # CRL-1662) a été cultivée en milieu EMS (Invitrogen, réf. 041-95181M) contenant 5% de sérum de veau foetal30 (JRH Biosciences, réf. 12107). Pour la transfection, 5 millions de cellules ont été électroporées (électroporateur Biorad, modèle 1652077) en milieu Optimix (Equibio, réf. EKITE 1) avec 25 µg de vecteur chaîne légère, pRSVHL-EMAB-603 pour l'expression de l'anticorps EMAB603. Les conditions d'électroporation appliquées étaient de 230 volts et 960 microfarads pour une cuvette de 0,5 ml. Chaque cuvette d'électroporation a été ensuite répartie sur 5 plaques P96 avec une densité de 5000 cellules/puits. La mise en milieu sélectif RPMI (Invitrogen, ref 21875- 034) contenant 5% de sérum dialyse (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 µg/ml de G418 (Invitrogen, réf. 10131- 027) et 25 nM de methotrexate (Sigma, réf. M8407), a été réalisée 3 jours après la transfection. Les surnageants des puits de transfection résistants ont été criblés pour la présence d'immunoglobulines (Ig) chimériques par dosage ELISA spécifique des séquences Ig humaines.

Les 10 transfectants produisant le plus d'anticorps ont été amplifiés en plaques P24 et leur surnageant redosé par ELISA afin d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules/plaque) . A l'issue du clonage, le clone R603 a été sélectionné pour la production de l'anticorps chimérique EMAB603 et adaptés progressivement au milieu de production CD Hybridoma (Invitrogen, réf. 11279-023). La production des anticorps chimériques EMAB603 a été réalisée par expansion de la culture adaptée en milieu CD Hybridoma, obtenue par dilution à 3x105 cellules/ml en flacons de 75 cm2 et 175 cm2 puis par dilution à 4,5x105 cellules/ml en flacon de type roller. Après avoir atteint le volume maximal, la culture a été poursuivie jusqu'à ce que la viabilité cellulaire ne soit plus que de 20%. Après production, les anticorps chimériques EMAB603 ont été purifiés par chromatographie d'affinité sur protéine A (pureté estimée par HPLC < 95 %) et contrôlés par électrophorèse en gel de polyacrylamide.

Exemple 3 : Etude phénotypique et fonctionnelle des cellules NK 28 de patients atteints de macroglobulinémie de Waldenstrôm 1) Détermination de l'efficacité de l'anticorps anti-CD20 optimisé LFBR603 sur les cellules de maladie de Waldenstrôm (MW) Le phénotype et les capacités fonctionnelles des cellules NK de patients atteints MW sont étudiés et comparés à ceux de cellules NK de donneurs sains du même âge et de patients atteints de LLC. Le but est de déterminer le rôle des cellules NK dans le contrôle et/ou le traitement de la MW, et plus particulièrement le rôle de l'ADCC, médiée par les cellules NK, lors d'un traitement par anti-CD20. L'efficacité in vitro de l'anticorps anti CD20 optimisé LFB-R603 est déterminée en la comparant à celle du rituximab. Le choix des patients à traiter par immunothérapie, et plus particulièrement avec l'anti-CD20 optimisé du LFB, est ainsi orienté en fonction des résultats. 2) Population étudiée et matériel utilisé Les cellules de 20 patients atteints de MW, proviennent de patients suivis à la consultation d'Hématologie Clinique de l'Hôpital Pitié-Salpêtrière à Paris. Cette cohorte d'une centaine de patients est la plus importante cohorte de patients MW suivis en France, et permet d'avoir un recrutement de choix de patients (en moyenne 2 patients par semaine) explorés pour l'ensemble des marqueurs diagnostiques et pronostiques actuellement utilisés dans les différents protocoles cliniques.

L'étude est effectuée sur des patients non traités ou à distance de plus de 6 mois du dernier traitement (exclusion des patients préalablement traités par anti CD20 ou anti CD52). Les prélèvements proviennent tous d'échantillons récupérés lors de bilans biologiques prescrits par le clinicien. Les résultats obtenus sont comparés à ceux préalablement obtenus lors des deux études précédentes : d'une part un groupe de 57 patients atteints de LLC de stades A et B/C (Le Garff-Tavernier et al., Leukemia) et un groupe de patients LLC délétés p53, qui sont étudiés selon les mêmes critères et dans le même laboratoire. Les résultats sont également comparés à ceux d'un groupe, correspondant en âge, d'échantillons de sang des témoins sains (n=25) (Le Garff Tavernier M, et al., 2010. Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span. Aging CeIL 9: 527-535, [28]). 3) Phénotype des cellules NK circulantes Cette étude est effectuée à partir de prélèvements sanguins (sur sang frais) par cytométrie de flux. Les marqueurs qui ont été étudiés lors des deux études précédentes sont analysés sur la population NK définie phénotypiquement comme étant CD3-CD56+ : a) L'expression faible (dim) ou forte (bright) du CD56; b) Les récepteurs activateurs de la cytotoxicité NK, comprenant les 15 NCR (NKp30, NKp44, NKp46), NKp80, 2B4, NKG2C et NKG2D; c) Les récepteurs inhibiteurs de la cytotoxicité NK : KIR (p58a, p58b, p70), NKG2A, ILT-2 et LAIR-1; d) Les récepteurs impliqués dans l'activation cellulaire (CD69, HLA-DR) et dans l'ADCC (CD16). 20 Les résultats sont comparés aux résultats obtenus avec des échantillons de donneurs sains du même âge (Le Garff-Tavernier et al., [28]) et des patients atteints de LLC (données non montrées).

4) Production de cytokines et de composants cytotoxiques intra- 25 cytoplasmiques par les cellules NK de patients atteints de MW

Cette étude est réalisée à partir des PBMC (Cellule mononucléaire de sang périphérique) obtenus après purification au moyen de ficoll. Les PBMC sont alors non activés ou activés par 10 ng/ml IL-12 et 100 ng/ml IL-18 30 pendant 17 heures (pour un marquage de l'IFN-y). Un marquage de surface des cellules NK par un anti-CD3 et un anti-CD56 est alors effectué avant de fixer et de perméabiliser les PBMC à l'aide d'un kit cytofix/cytoperm (BD Biosciences). Enfin, un marquage intra-cytoplasmique de l'IFN-y, de la perforine et des granzymes A/B sera réalisé avant d'être analysé par cytométrie de flux. Les résultats sont comparés aux résultats obtenus d'une part avec des échantillons de donneurs sains du même âge (Le Garff-Tavernier et al., [28]) et d'autre part, avec les patients atteints de LLC (données non montrées). 5) Test de cytotoxixité directe La capacité cytotoxique des cellules NK des patients atteints de MW est examinée en utilisant le test de lyse directe. Ce test est réalisé à partir de lymphocytes isolés après purification au moyen de ficoll et/ou à partir de cellules NK purifiées par tri-cellulaire sur la plate-forme ce cytométrie inter-IFR, cultivés en présence d'IL-2 pendant 72 heures, vis-à-vis des cellules cibles K562 (lignée cellulaire CMH classe-I négative, (ATCC CCL 243).

L'activité lytique est comparée à celle obtenue avec des PBMC provenant de donneurs sains. Ceci est réalisé en absence et en présence de 1000 unités de proleukin-2, pendant 48 heures. 6) Détermination de l'ADCC La capacité des cellules NK à faire de l'ADCC est examinée en utilisant 2 types de tests différents. Ces tests sont réalisés à partir des PBMC des patients MW en présence de l'anti-CD20 LFB-R603 vis-à-vis des cellules de MW autologues. Les 2 approches utilisées sont : - L'ADCC par relargage de 51 Cr par les cellules MW.

Cette technique a pour but de déterminer la proportion de cellules MW lysées par les cellules NK. Elle est étudiée en utilisant des NK purifiés par tri-cellulaire, sur la plate-forme de cytométrie inter-IFR, vis-à-vis des cellules Raji (lignée cellulaire expirmant le FcyR, ou FcyR+) ou de cellules B autologues de patients MW (patients avec clone circulant), préalablement chromées. Ces études sont réalisées en présence de l'anticorps LFB-R603 en comparaison avec le rituximab, en absence d'activation. - Le test de dégranulation.

Cette technique a pour but de déterminer, sans purification préalable, le taux de cellules NK sensibilisées par les cellules de MW. Elle est réalisée à partir des PBMC totaux provenant des patients MW en présence de différentes concentrations de LFB-R603, comprises entre 0 et 10 000 ng/ml, du marqueur de dégranulation CD107a/LAMP1 et de monensin. Le pourcentage de dégranulation est déterminé par le niveau d'expression du CD107a à la surface des cellules NK (CD3-CD56+). Ces différentes stratégies sont utilisées en absence et/ou en présence d'anti-CD20 LFB-R603 ou rituximab. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus à part avec des échantillons de donneurs sains du même âge (Le Garff-Tavernier et al., [27]) et les patients atteints de LLC (données non montrées). 7) Détermination de l'apoptose Des tests d'apoptose classiques en cytométrie de flux utilisant l'iodure de propidium et l'Annexine V sont effectués en présence de l'anticorps LFBR603 et les résultats obtenus sont comparés au rituximab et aux molécules de référence (par exemple fludarabine, théophylline).20 Listes des références [1] Vijay A., Gertz M.A. 2007. Waldenstrém macroglobulinemia. Blood. 109 (12): 5096-5103. [2] Harris NL, Jaffe ES et ail. World Health Organization classification of neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues: report of the Clinical Advisory Committee meeting-Airlie House, Virginia, November 1997.J Clin Oncol 1999 ;17.3835-49 [3] Leblond V et al., French Cooperative Group on Chronic Lymphocytic Leukemia and Macroglobulinemia. 2001. Multicenter randomized 1 o comparative trial of fludarabine and the combination of cyclophosphamide-doxorubicin-prednisone in 92 patients with Waldenstrém macroglobulinemia in first relapse or with primary refractory disease. Blood. 2001 98:2640-2644. [4] Dimopoulos MA et al., (2009A). Update on treatment recommendations 15 from the Fourth International Workshop on Waldenstrom's Macroglobulinemia. J. Clin. Oncol. 27: 120-126. [5] Neparidze N, Dhodapkar MV. 2009. Waldenstrom's macroglobulinemia: Recent advances in biology and therapy. Clin. Adv. Hematol. Oncol. 7: 677-681. 20 [6] Treon SP. 2009. How 1 treat Waldenstrém macroglobulinemia. Blood. 114: 2375-2385. [7] Dimopoulos MA, Kastritis E, Roussou M, Eleutherakis-Papaiakovou E, Migkou M, Gavriatopoulou M, Tassidou A, Terpos E. (2009B). Rituximab-based treatments in Waldenstrom's macroglobulinemia. Clin.

25 Lymphoma Myeloma. 9: 59-61. [8] Valentine et al. (1987) ; Expression of the human B-cell surface protein CD20: alteration by phorbol 12-myristate 13-acetate Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22) : 8085-9. [9] Valentine et al. 1989, Phosphorylation of the CD20 phosphoprotein in resting B lymphocytes. Regulation by protein kinase C., J.Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287. [10] Golay et al. (1985), The CD20 (Bp35) antigen is involved in activation of B cells from the GO to the G1 phase of the cell cycle. J. Immunol., 135(6) :3795-801. [11] Tedder et al. (1986), Antibodies reactive with the B1 molecule inhibit cell cycle progression but not activation of human B Iymphocytes.J. Immunol .

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Claims (18)

1. REVENDICATIONS1. Anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, ledit anticorps ayant une cytotoxicité à médiation cellulaire dépendant des anticorps (ADCC) et/ou une capacité à activer les cellules effectrices exprimant le FcyRlll accrues, et possédant une région Fc dont au moins 60% des oligosaccharides sont non fucosylés, pour son utilisation dans le traitement de la maladie de Waldenstrôm.
2. 2. Anticorps selon la revendication 1, comprenant en outre une quantité d'oligosaccharides complexes présentant une bissection augmentée par modification de la glycosylation.
3. 3. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, comprenant en outre au moins 20% d'oligosaccharides présentant une bissection et non fucosylés.
4. 4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, susceptible d'être produit dans une cellule hôte exprimant au moins un acide nucléique codant pour un polypeptide ayant une activité de [3-(1,4)-N-acéty1glucosaminyltransférase III en une quantité suffisante pour modifier la glycosylation de la région Fc dudit anticorps.
5. 5. Anticorps selon la revendication 1, comprenant en outre une teneur supérieure à 60% pour les formes GO+G1+GOF+G1F, les formes GOF +G1 F étant inférieures à 500/0.
6. 6. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 5, comprenant en outre, sur un site de glycosylation Asn297, une structure glycannique présentant des mannoses terminaux et/ou des N-acétylglucosamines terminaux non intercalaires. w 2976811 36
7. 7. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 et 5 à 6, comprenant en outre, sur un site de glycosylation Asn297, une structure glycannique de type biantenné, avec des chaînes courtes, une faible 5 sialylation.
8. 8. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, ledit anticorps possédant une région Fc dont 100% des oligosaccharides sont non fucosylés.
9. 9. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662).
10. 10. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, produit par le clone R603 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM). 20
11. 11.Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, dont une région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 1, dont une région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques murine SEQ ID NO : 2, et dont des régions 25 constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes proviennent d'une espèce non murine.
12. 12.Anticorps selon la revendication 11, dont les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes sont 30 des régions constantes humaines. 10 15 w 2976811 37
13. 13.Anticorps selon la revendication 11 ou 12, dont la région constante de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 3 et dont la région constante de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques 5 humaine SEQ ID NO : 4.
14. 14.Anticorps selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, dont chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine-humaine SEQ ID NO : 5, et dont chacune 10 des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acides nucléiques chimérique murine- humaine SEQ ID NO : 6.
15. 15.Anticorps selon la revendication 14, dont chacune des chaînes légères est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 7 et dont 15 chacune des chaînes lourdes est constituée de la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 8.
16. 16. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation en monothérapie dans le traitement de la maladie de 20 Waldenstrém.
17. 17.Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation chez des patients candidats à une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques.
18. 18. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation chez des patients cytopéniques. 25