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WO2006013859A1 - 酵母プロモーター - Google Patents

酵母プロモーター Download PDF

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WO2006013859A1
WO2006013859A1 PCT/JP2005/014119 JP2005014119W WO2006013859A1 WO 2006013859 A1 WO2006013859 A1 WO 2006013859A1 JP 2005014119 W JP2005014119 W JP 2005014119W WO 2006013859 A1 WO2006013859 A1 WO 2006013859A1
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WO
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seq
dna
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dna sequence
yeast
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PCT/JP2005/014119
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French (fr)
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Akihiro Meta
Yo Nakahara
Hirofumi Higuchi
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Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Original Assignee
Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a novel yeast promoter. More specifically, it relates to a novel DNA sequence with transcription promoter activity, an expression vector containing this sequence, and its use for production of recombinant proteins, eg heterologous proteins.
  • the present invention also relates to a recombinant cell containing this DNA sequence.
  • yeast strains that produce large quantities of useful proteins such as pharmaceuticals and foods by applying genetic engineering techniques to yeast.
  • a technique for introducing a heterologous gene corresponding to a yeast of the genus Saccharomyces, particularly Saccharomyces cerevisiae (hereinafter, “3 ⁇ 4. Cerevisiaej”) to produce a heterologous protein is known.
  • heterologous genes including genomic DNA and cDNA
  • PGK1 3-phosphoglycerate kinase
  • TE F1 translation elongation factor
  • Non-Patent Document 1 Ogden et al., 1986, Mol. Cell. Biol, 6 (12), p. 4335-4343
  • Non-Patent Document 2 Cottrelle et al., 1985, J. Biological Chemistry, 260 (5), p. 3090-3096 Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a promoter that is stronger than a conventional promoter that can be used in a heterologous gene expression system using yeast as a host. Means for solving the problem
  • the present invention is a DNA fragment having a transcription promoter activity of yeast, which is the entire DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 or a partial sequence including the 3 'terminal, or a sequence A DNA sequence capable of hybridizing to the entire DNA sequence described in No. 1 or to a sequence complementary to a part of the sequence including the 3 'terminal, and retaining the transcription promoter activity of the entire or part of the sequence
  • the present invention relates to a DNA fragment having a sequence of
  • the present invention also relates to an expression plasmid comprising the DNA sequence and a foreign gene located downstream thereof. Further, the present invention relates to a transformant obtained by transformation with the expression plasmid. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a foreign protein, which comprises culturing the transformant and subsequently recovering the culture force of the foreign protein.
  • the present invention includes the following inventions A) to K).
  • a DNA fragment having transcription promoter activity of yeast which is the entire DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial sequence including the 3 ′ terminal end thereof, or a DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a DNA fragment comprising a DNA sequence capable of hybridizing to a sequence complementary to a whole sequence or a partial sequence including its 3 'terminal, and retaining the transcription promoter activity of all or a partial sequence.
  • C) Partial force of the DNA sequence At least a DNA sequence from the 3 ′ end to 820 bp of the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 5; corresponding to 581 to 1400 in the DNA sequence of SEQ ID NO: 1) A DNA fragment according to A) or B) above, which is a sequence comprising
  • the DNA fragment according to the present invention contains a sequence having a high promoter activity in yeast. Therefore, the foreign gene can be expressed at a high expression level by introducing the plasmid obtained by ligating the DNA fragment of the present invention together with the foreign gene into a host, particularly yeast.
  • FIG. 1-1 Construction diagram of plasmid pKHA030.
  • FIG. 1-2 Construction diagram of plasmid pKHA030 (continued).
  • FIG. 2 is a diagram showing each region when the NCE102 promoter is fragmented.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of rocket immunoelectrophoresis on the expression level of rHSA using the NCE102 promoter and other promoters.
  • FIG. 4 is a graph showing the ratio of the amount of HSA-mRNA between the NCE102 promoter and other promoters.
  • FIG. 5 is a graph showing the amount ratio of HSA-mRNA by NCE102 promoter fragmentation.
  • the DNA fragment having the promoter activity of the present invention is represented by the entire DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial sequence including the 3 'terminal. This DNA fragment is located upstream of the reading frame of the NCE102 gene in yeast and contains a promoter region.
  • a DNA fragment having promoter activity according to the present invention comprises, in addition to the sequence represented by SEQ ID NO: 1, at least a DNA sequence (SEQ ID NO: 6) from the 3 'end to 650 bp of the DNA sequence of SEQ ID NO: 1. It is an array containing. More preferably, the DNA fragment having promoter activity according to the present invention is a sequence comprising at least the DNA sequence (SEQ ID NO: 5) from the 3 ′ end to 820 bp of the DNA sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the DNA fragment having promoter activity according to the present invention includes a DNA sequence that can be hybridized to the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a partial sequence that includes a 3 'terminal end thereof.
  • sequences that retain the transcription promoter activity of all or part of the sequences are also included. Such sequences include the ability to have deletions, substitutions, and additions, and combinations thereof, for any of the bases in SEQ ID NO: 1 or some of the sequences, including its 3 'end. Sequences that retain activity should also be construed to include.
  • DNA sequence capable of hybridizing means a DNA sequence capable of hybridizing under stringent conditions.
  • promoter refers to transcription, translation, or stabilization of mRNA in the absence of the promoter when the structural gene is linked to a structural gene in a host cell.
  • Exogenous gene means any gene that does not functionally coexist with a specific promoter in nature, regardless of whether or not the gene is derived from a specific organism.
  • DNA DNA
  • gene and “genetic DNA” are used interchangeably.
  • the DNA fragment containing the yeast promoter of the present invention can be totally synthesized by a conventional nucleic acid synthesis method.
  • a foreign gene ligated downstream of a DNA fragment containing a promoter according to the present invention (hereinafter referred to as By introducing a “promoter-linked foreign gene”) into yeast, yeast in which the expression of the foreign gene is controlled by the promoter according to the present invention can be obtained.
  • an expression plasmid in which a DNA comprising a DNA fragment comprising a DNA fragment comprising a promoter gene and an exogenous gene located downstream thereof is linked to a vector.
  • Examples of vectors used for constructing expression plasmids include vectors based on yeast 2m DNA described in Hinnen et al., And the YRp system, which is a vector for general yeasts.
  • YRp system which is a vector for general yeasts.
  • YEp system multi-copy vector having a 2 ⁇ m DNA replication origin of yeast
  • YCp system the origin of replication of the ARS sequence of the yeast chromosome
  • Yip system V without yeast replication origin, vector for yeast chromosome integration
  • the foreign gene to be linked is not particularly limited, and for example, a human serum albumin (hereinafter sometimes abbreviated as "rHSA") gene or the like can be used.
  • the foreign gene to be ligated is not limited to the purpose of expression of the gene product encoded therein, and the expression control by antisense RNA is also included in the purpose.
  • a marker gene for selecting a transformant for example, LEU2 gene
  • a terminator according to the type of host to be transformed for example, a terminator for the ADH1 gene
  • Examples of methods for transforming host yeast with expression plasmids include, but are not limited to, electroporation.
  • the host yeast transformed with the expression plasmid is not limited to, for example, S. cerevisiae.
  • the foreign protein can be expressed and the foreign protein can be produced.
  • the foreign protein that can be expressed includes, but is not limited to, for example, a substance useful in the medical field such as human serum albumin and immunoglobulin.
  • CTCCTCTGCTTACTCTA SEQ ID NO: 13
  • synthetic DNA HA006: GATCTAGAGTA column No. 14
  • RNA linker HA005 / HA006 and the 1st PCR product were ligated with blunt ends, and this ligation reaction solution was then sagged to form a synthetic DNA (HA030): ATCCAAAGATCTAGAGTAAGCAGAGGAGAACAAGAAC (SEQ ID NO: 15) and And synthetic DNA (HA039): PCR (2nd PCR) using AAGGAAAAAAGCGGCCGCAGAATGCAATGCGGCTTTT GTTTG (SEQ ID NO: 16) as a primer was performed.
  • the 2nd PCR was performed under the conditions of 30 cycles of 3-step force of 94 ° C for 15 seconds, 53 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 45 seconds, and finally keeping the temperature at 72 ° C for 2 minutes. .
  • a 2nd PCR product confirmed at a position considered to be about 0.83 kbp in size was extracted from the DNA.
  • the purified 2nd PCR product was digested with restriction enzymes Notl and Bglll, and a digestion reaction product confirmed at a position considered to be about 0.90 kbp in size on agarose gel electrophoresis was excised.
  • FIG. 1 shows the above-described cloning of the promoter of the present invention and the construction of the rHSA expression plasmid.
  • the base sequence of the region cloned in Example 1 was obtained by performing PCR using pKHA030 cage type, CEQ DTCS-Quick Start Kit (Beckman Coulter), and using a CEQ2000XL base sequence reader (Beckman Coulter), It was determined according to the Sanger method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977).
  • the present inventors took a range from the promoter region (820 bp) of the present invention in the yeast S. cerevisiae S288C strain genomic DNA to the 5 'upstream, which was further 580 bp, and fragmented this 1400 bp from the 5' upstream side. Tried to do.
  • the point at which translation of the gene product of the promoter of the present invention on genomic DNA begins (AUG codon A) is defined as the zero point
  • the promoter region (820 bp) located upstream from this is defined as -820 bp (SEQ ID NO: 5 ; Corresponding to the 581st to 1400th positions in the DNA sequence of SEQ ID NO: 1.
  • -1400 bp DNA sequence of SEQ ID NO: 1) -1258bp (SEQ ID NO: 2; in the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, corresponding to 143 to 1400); -1100bp (SEQ ID NO: 3; in the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, -950bp (SEQ ID NO: 4; corresponding to 451 to 1400 in the DNA sequence of SEQ ID NO: 1); -650bp (SEQ ID NO: 6; in the DNA sequence of SEQ ID NO: 1) 751 -500bp (SEQ ID NO: 7; corresponding to 901th to 1400th in the DNA sequence of SEQ ID NO: 1); -350bp (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: -200bp (SEQ ID NO: 9; corresponding to positions 1201 to 1400 in the DNA sequence of SEQ ID NO:
  • Plasmid pKHA030 and the rHSA expression plasmid constructed in Example 3 were prepared by the method described in Hinnen et al. In the S. cerevisiae strain (cir ° a, leu2-3, leu2-112, canl, pr al, yap3 , hspl50). Transformants were transformed into buffered minimum agar medium lacking leucine (amino acid 'ammonium sulfate free 0.15% (w / v) yeast-trogen base, 0.5% (w / v) ammonium sulfate, 36 mM. (Chenic acid, 126 mM disodium hydrogen phosphate, pH 6.5, 2% (w / v) sucrose, and l% ( w / v) batathagar)).
  • the rHSA expression level of the yeast introduced with the plasmid pKHA030 containing the NCE102 promoter (-820 bp) is clearly higher than the rHSA expression level of the yeast introduced with the plasmids containing the PGK1 promoter and TEF1 promoter. I helped.
  • the transformant obtained in Example 4 was added to a buffered minimum liquid medium (amino acid 'ammonium sulfate-free 0.15% (w / v) yeast-trogen base, 0.5% (w / v) ammonium sulfate. 36 mM citrate, 126 mM disodium hydrogen phosphate, pH 6.5, 2% (w / v) sucrose) Incubate at 50 rpm flask at 30 ° C and 200 rpm and collect yeast cells after 72 hours did. Total RNA was extracted from the collected cells using the RNeasy Mini Kit (Qiagen), and simultaneously DNase treatment was performed.
  • a buffered minimum liquid medium amino acid 'ammonium sulfate-free 0.15% (w / v) yeast-trogen base, 0.5% (w / v) ammonium sulfate. 36 mM citrate, 126 mM disodium hydrogen phosphate, pH 6.5, 2% (w
  • Synthetic DNA for detection of HSA gene (HA045): GTCCGA AGTCGCTCACAGATTCAA (SEQ ID NO: 17) and synthetic DNA (HA046): GCAGATTCGT CAGCAACACAAGTC (SEQ ID NO: 18) or PGK1 gene detection
  • Synthetic DNA (HA0 62): GCGTGTCTTCATCAGAGTTGACTTC (SEQ ID NO: 19) and synthetic DNA (HA063): CCAAGTGAGAAGCCAAGACAACGTA (SEQ ID NO: 20), QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen), light cycler system (Roche) The transcriptional activity of each plug motor was compared.
  • the reverse transcription reaction was performed by incubating at 50 ° C for 20 minutes, and heat denaturation was performed at 96 ° C for 15 minutes.
  • repeat the cycle consisting of 3 steps of 94 ° C for 15 seconds, 53 ° C for 20 seconds, 72 ° C for 10 seconds, 40 times, HSA gene fragment amplified by HA045 / HA046, and HA062 / HA063
  • the amount of amplification of the PGK1 gene fragment to be amplified was measured.
  • the absolute values of the HSA-cDNA amount and the PGKl-cDNA amount in each sample were assumed to be equal to the respective mRNA amounts.
  • the transcriptional activity of each promoter was quantified by taking the ratio of HS A-mRNA amount / PGKl-mRNA amount (hereinafter abbreviated as “HSA-mRNA amount ratio”).
  • the ratio of HSA-mRNA in yeast introduced with plasmid pKHA030 containing NCE102 promoter is clearly higher than that of yeast containing plasmids containing PGK1 and TEF1 promoters. (Fig. 4).
  • the HSA_mRNA ratio changes as shown in Fig. 5 and is longer than -650 bp (SEQ ID NO: 6; corresponding to 751 to 1400 in the DNA sequence of SEQ ID NO: 1) The ratio of HSA-mRNA was high when using.

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Abstract

　酵母において強力なプロモーター活性を有するＤＮＡ断片を提供する。酵母の転写プロモーター活性を有するＤＮＡ断片であって、配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の全部またはその３’側末を含む一部の配列、または配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の全部またはその３’側末を含む一部の配列と相補的な配列にハイブリダイズしうるＤＮＡ配列であって当該全部または一部の配列の転写プロモーター活性を保持する配列を有する、ＤＮＡ断片；前記ＤＮＡ断片と、その下流に外来タンパク質をコードする遺伝子とを含んでなる組換えＤＮＡ断片より構成される発現プラスミド；前記組換えＤＮＡ断片または前記発現プラスミドにより形質転換された酵母等の宿主細胞；及び前記宿主細胞を培養し、培養物から外来タンパク質を得ることを特徴とする外来タンパク質の生産方法に関する。本発明によれば、酵母を宿主とする異種遺伝子発現系において利用できる、強力なプロモーターが提供される。

Description

明 細 書
酵母プロモーター
技術分野
[0001] 本発明は新規な酵母プロモーターに関する。より具体的には、転写プロモーター活 性をもつ新規な DNA配列、この配列を含む発現ベクター、および組換えタンパク質 、例えば異種タンパク質生産のためのその使用に関する。また、本発明は、この DN A配列を含む組換え細胞にも関する。
背景技術
[0002] 近年、遺伝子工学の技術を酵母に応用することにより、医薬品や食品などの有用タ ンパク質を大量に生産する酵母株の作出が試みられている。異種タンパク質を生産 するため、それに対応する異種遺伝子をサッカロミセス属の酵母、特にサッカロマイ セス ·セレヒンェ (¾accharomyces cerevisiae、以「、「¾. cerevisiaejと略己す )に ¾ 入する技術は知られている。 S. cerevisiae細胞内で異種遺伝子（ゲノム DNA、 cDN Aを含む）を発現させる時、その上流に酵母内で発現可能な「プロモーター」を連結さ せることが必要である。
[0003] プロモーターとしては目的とするタンパク質を酵母内で大量に発現させることが望ま れており、現在までいくつかの強力なプロモーターが見出されている。例えば、 S. cer evisiaeのプロモーターとして、強い発現量を示すことが知られている 3—ホスホグリセ レートキナーゼ (PGK1)遺伝子のプロモーター（非特許文献 1)や翻訳伸長因子 (TE F1)のプロモーター (非特許文献 2)などが、酵母での異種遺伝子の発現に使用され ている。
[0004] 非特許文献 1 : Ogdenら、 1986, Mol. Cell. Biol, 6(12)、 p. 4335-4343
非特許文献 2 : Cottrelleら、 1985, J. Biological Chemistry, 260(5), p. 3090-3096 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、酵母を宿主とする異種遺伝子発現系において利用可能な従来 のプロモーターよりさらに強力なプロモーターを提供することにある。 課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記課題を解決すべく、 S. cerevisiaeの遺伝子発現状況にっ 、て 鋭意検討をした結果、 S. cerevisiae染色体から強力なプロモーターを含む DNA断片 を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
[0007] すなわち、本発明は、酵母の転写プロモーター活性を有する DNA断片であって、 配列番号 1に記載される DNA配列の全部またはその 3 '側末を含む一部の配列、ま たは配列番号 1に記載される DNA配列の全部またはその 3 '側末を含む一部の配列 と相補的な配列にハイブリダィズしうる DNA配列であって当該全部または一部の配 列の転写プロモーター活性を保持する配列を有する、 DNA断片に関する。本発明 はまた、前記 DNA配列と、その下流に位置する外来遺伝子とを含んで構成される発 現プラスミドに関する。さら〖こ、本発明は、前記発現プラスミドによる形質転換により取 得された形質転換体に関する。さらにまた、本発明は、前記形質転換体を培養し、つ いで培養物力 外来タンパク質を回収することを特徴とする外来タンパク質の生産方 法に関する。
[0008] すなわち、本発明は、下記の A)〜K)の発明を含むものである。
Α)酵母の転写プロモーター活性を有する DNA断片であって、配列番号 1に記載 される DNA配列の全部またはその 3 '側末を含む一部の配列、または配列番号 1に 記載される DNA配列の全部またはその 3 '側末を含む一部の配列と相補的な配列 にハイブリダィズしうる DNA配列であって当該全部または一部の配列の転写プロモ 一ター活性を保持する配列を有する、 DNA断片。
[0009] Β)当該 DNA配列の一部力 少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から 650bp までの DNA配列（配列番号 6；配列番号 1の DNA配列中、 751番目から 1400番目に 相当）を含む配列である、上記 A)に記載の DNA断片。
[0010] C)当該 DNA配列の一部力 少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から 820bp までの DNA配列（配列番号 5；配列番号 1の DNA配列中、 581番目から 1400番目に 相当）を含む配列である、上記 A)または B)に記載の DNA断片。
[0011] D)当該 DNA配列の一部力 少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から 950bp までの DNA配列（配列番号 4 ;配列番号 1の DNA配列中、 451番目から 1400番目に 相当）を含む配列である、上記 A)〜C)のいずれか〖こ記載の DNA断片。
[0012] E)当該 DNA配列の一部力 少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から llOObp までの DNA配列（配列番号 3；配列番号 1の DNA配列中、 301番目から 1400番目に 相当）を含む配列である、上記 A)〜D)のいずれか〖こ記載の DNA断片。
[0013] F)当該 DNA配列の一部力 少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から 1258bp までの DNA配列（配列番号 2 ;配列番号 1の DNA配列中、 143番目から 1400番目に 相当）を含む配列である、上記 A)〜E)のいずれか〖こ記載の DNA断片。
[0014] G)上記 A)〜F)の 、ずれかに記載の DNA断片と、その下流に外来タンパク質をコ ードする遺伝子とを含んでなる組換え DNA断片。
[0015] H)上記 G)に記載の組換え DNA断片を含む発現プラスミド。
[0016] I)上記 G)に記載の組換え DNA断片または上記 H)に記載の発現プラスミドによつ て形質転換された宿主細胞。
[0017] J)宿主細胞が酵母である、上記 I)に記載の宿主細胞。
[0018] K)上記 I)また〖お）に記載の宿主細胞を培養し、っ ヽで培養物から外来タンパク質 を回収することを含む、外来タンパク質の生産方法。
発明の効果
[0019] 本発明による DNA断片は酵母内での高いプロモーター活性を有する配列を含ん でいる。従って、本発明による DNA断片を外来遺伝子とともに連結したプラスミドを 宿主、とりわけ酵母に導入することによって、外来遺伝子を高発現レベルで発現させ ることがでさる。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1- 1]プラスミド pKHA030の構築図。
[図 1- 2]プラスミド pKHA030の構築図（続き)。
[0021] [図 2]NCE102プロモーターを断片化した際の各領域を示す図。
[0022] [図 3]NCE102プロモーターと他のプロモーターを用いた rHSA発現量に関するロケット 免疫電気泳動の結果を示す図。
[0023] [図 4]NCE102プロモーターと他のプロモーターの HSA-mRNA量比を示す図。
[0024] [図 5]NCE102プロモーター断片化による HSA-mRNA量比を示す図。 発明を実施するための最良の形態
[0025] 本発明のプロモーター活性を有する DNA断片は配列番号 1に示した DNA配列の 全部またはその 3'側末を含む一部の配列で表される。この DNA断片は酵母におい て NCE102遺伝子の読み枠の上流に位置し、プロモーター領域を含むものである。
[0026] 本発明によるプロモーター活性を有する DNA断片は、配列番号 1で表される配列 に加えて、少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から 650bpまでの DNA配列（配 列番号 6)を含む配列である。さらに好ましくは、本発明によるプロモーター活性を有 する DNA断片は、少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から 820bpまでの DNA 配列（配列番号 5)を含む配列である。
[0027] さらに、本発明によるプロモーター活性を有する DNA断片としては、配列番号 1に 記載される DNA配列またはその 3 '側末を含む一部の配列と相補的な配列にハイブ リダィズしうる DNA配列であって当該全部または一部の配列の転写プロモーター活 性を保持する配列も含まれる。このような配列には、配列番号 1の全部またはその 3' 側末を含む一部の配列中の塩基のいずれかについて欠失、置換、および付加、並 びにこれらの組み合わせが存在する力 そのプロモーター活性を保持する配列も包 含される意味に解釈されるべきである。
[0028] 本明細書にぉ 、て「ハイブリダィズしうる DNA配列」とはストリンジヱントな条件下に おいてハイブリダィズしうる DNA配列を意味する。
[0029] なお、本明細書において「プロモーター」とは、宿主細胞中で構造遺伝子に連結し たとき、その構造遺伝子に関して、そのプロモーターが存在しない条件下の転写、翻 訳、もしくは、 mRNAの安定性を増大させる任意の DNA配列を意味する。また、「外 来遺伝子」とは、その遺伝子が特定生物に由来するか否力を問わず、自然界では特 定のプロモーターと機能的に共存していない任意の遺伝子を意味する。さらに、本明 細書では、「DNA」、「遺伝子」、および「遺伝子 DNA」という用語を実質的に同義の ちのとして用いることとする。
[0030] 本発明の上記酵母プロモーターを含む DNA断片は慣用されている核酸合成の手 法により全合成することができる。
[0031] 本発明によるプロモーターを含む DNA断片の下流に連結した外来遺伝子（以下、 「プロモーター連結外来遺伝子」ということがある）を酵母に導入することにより、外来 遺伝子の発現が本発明によるプロモーターによって制御されている酵母を取得する ことができる。
[0032] このプロモーター連結外来遺伝子を酵母に導入する方法としては、例えば Hinnen ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933, 1978)の文献に記載された方法を用 いることができる。具体的には、プロモーター連結外来遺伝子をベクターに組み込ん でこれを酵母に導入する方法、直接酵母に導入する方法等が挙げられる。
[0033] 本発明によれば、プロモーター遺伝子を含む DNA断片と、その下流に位置する外 来遺伝子とを連結してなる DNA断片を含む DNAがベクターに連結された発現ブラ スミドが提供される。
[0034] 発現プラスミド構築のために用いられるベクターとしては、例えば Hinnenらの文献に 記載されている酵母の 2 m DNAを基本としたベクター、また一般的な酵母用のベ クタ一である YRp系（酵母染色体の ARS配列を複製起点とする酵母用マルチコピーべ クタ一）、 YEp系（酵母の 2 μ m DNAの複製起点を持つマルチコピーベクター）、 YCp 系（酵母染色体の ARS配列を複製起点として持ち、かつ酵母染色体のセントロメァの DNA配列を持つ酵母用シングルコピーベクター）、 Yip系（酵母の複製起点を持たな V、酵母染色体組み込み用ベクター）などを挙げることができる。
[0035] 連結される外来遺伝子は特に限定されるものではな!/、が、例えば、ヒト血清アルブミ ン（以下、「rHSA」と略記することがある）遺伝子などを用いることができる。連結され る外来遺伝子はそれにコードされている遺伝子産物の発現を目的とすることに限定さ れず、アンチセンス RNAによる発現制御もその目的に含まれる。
[0036] 発現プラスミドには、形質転換体選択のためのマーカー遺伝子 (例えば、 LEU2遺 伝子）、形質転換する宿主の種類に応じたターミネータ一（例えば、 ADH1遺伝子の ターミネータ一）などを連結することができる。
[0037] 発現プラスミドによる宿主酵母の形質転換法としては、例えば電気穿孔法が挙げら れるが、これに限定されるものではない。
[0038] 発現プラスミドによって形質転換される宿主酵母としては、例えば S. cerevisiaeが挙 げられる力 これに限定されるものではない。 [0039] また、本発明による形質転換体を培養することによって、外来タンパク質を発現させ 、当該外来タンパク質を製造することができる。発現することができる外来タンパク質 としては、例えばヒト血清アルブミン、免疫グロブリンなどの医療分野で有用な物質な どが挙げられる力 これらに限定されるものではない。
[0040] 以下、実施例により本発明を詳細に説明する力 本発明はそれらの実施例によつ て何ら限定されるものではな 、。
実施例
[0041] 《実施例 1：プロモーターのクローユングと rHSA発現プラスミドの構築》
S. cerevisiae S288C株ゲノム DNAを铸型、合成 DNA (HA023)： ATAGCGGCCGC AGAATGCAATGCGGCTTTTGTTTG (配列番号 11)および合成 DNA (HA024)： T ATGGGATTATATTGTTATTAGGTATGCTTTGAGA (配列番号 12)をプライマーと して、 Pwo DNAポリメラーゼ（ロッシュ社）を用いた PCR (1st PCR)を行った。 1st PCR は、 94°Cで 15秒間、 47°Cで 30秒間、 72°Cで 45秒間の 3ステップからなるサイクルを 30 回繰り返し、最後に 72°Cで 5分間保温する条件で行った。この 1st PCRにより、ァガロ ースゲル電気泳動上約 0.83kbpの大きさと考えられる位置に確認される 1st PCR産物 を切り出した。
CTCCTCTGCTTACTCTA (配列番号 13)と合成 DNA (HA006)： GATCTAGAGTA 列番号 14)を混合し、 96°Cで 10分間保温した後、室温まで冷却しアニーリングを行つ た。
[0043] アニーリングを行った合成 DNAリンカ一 HA005/HA006と 1st PCR産物を平滑末端 にてライゲーシヨンし、次いで、このライゲーシヨン反応液を铸型、合成 DNA(HA030 )： ATCCAAAGATCTAGAGTAAGCAGAGGAGAACAAGAAC (配列番号 15)およ び合成 DNA (HA039)： AAGGAAAAAAGCGGCCGCAGAATGCAATGCGGCTTTT GTTTG (配列番号 16)をプライマーとする PCR(2nd PCR)を行った。 2nd PCRは、 94 °Cで 15秒間、 53°Cで 30秒間、 72°Cで 45秒間の 3ステップ力 なるサイクルを 30回繰り 返し、最後に 72°Cで 2分間保温する条件で行った。この 2nd PCRにより、ァガロースゲ ル電気泳動上約 0.83kbpの大きさと考えられる位置に確認される 2nd PCR産物を切り 出した。
[0044] 精製 2nd PCR産物を制限酵素 Notlおよび Bglllで消化し、ァガロースゲル電気泳動 上約 0.90kbpの大きさと考えられる位置に確認される消化反応産物を切り出した。
[0045] この消化反応産物を、 rHSA発現プラスミド pDB2244 (WO00Z44772号公報）から 誘導された rHSA発現プラスミド pDB2305の PRB1プロモーターを含む Notl- Bglll領域 と置換することで、新規 rHSA発現プラスミド pKHA030を得た。
[0046] 上述した本発明のプロモーターのクローユングと rHSA発現プラスミドの構築につ!ヽ て図 1に示した。
[0047] 《実施例 2：プロモーターの塩基配列の決定》
実施例 1でクローユングした領域の塩基配列は、 pKHA030を铸型、 CEQ DTCS-Qu ick Start Kit (ベックマンコールター社）を用いた PCRを行い、 CEQ2000XL塩基配列 読み取り装置（ベックマンコールター社）を用いて、サンガーの方法（Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977)に従って決定した。
[0048] 《実施例 3：プロモーター領域の改変》
本発明者らは、酵母 S. cerevisiae S288C株ゲノム DNAにおける本発明のプロモー ター領域（820bp)よりさらに 580bpをカ卩えた 5'上流まで範囲を取り、この 1400bpを 5'上 流側から断片化することを試みた。ここで、ゲノム DNA上での本発明プロモーターの 遺伝子産物翻訳が始まる地点 (AUGコドンの A)をゼロ点とし、これより上流に位置す るプロモーター領域（820bp)を- 820bpとする（配列番号 5 ;配列番号 1の DNA配列中 、 581番目から 1400番目に相当）。以下の各 DNA断片の調製を実施例 1及び実施例 2に示した方法と同様に行 、（図 2)、 rHSA発現プラスミド (表 1)をそれぞれ構築した： -1400bp (配列番号 1の DNA配列； 1番目から 1400番目〖こ相当） ;-1258bp (配列番号 2 ;配列番号 1の DNA配列中、 143番目から 1400番目に相当）；-1100bp (配列番号 3 ；配列番号 1の DNA配列中、 301番目から 1400番目に相当）；-950bp (配列番号 4 ; 配列番号 1の DNA配列中、 451番目から 1400番目に相当）；-650bp (配列番号 6 ;配 列番号 1の DNA配列中、 751番目から 1400番目に相当）；-500bp (配列番号 7 ;配列 番号 1の DNA配列中、 901番目から 1400番目に相当）；-350bp (配列番号 8 ;配列番 号 1の DNA配列中、 1051番目から 1400番目に相当）；-200bp (配列番号 9 ;配列番 号 1の DNA配列中、 1201番目から 1400番目に相当）；-50bp (配列番号 10 ;配列番 号 1の DNA配列中、 1351番目から 1400番目に相当）及び- 0bp。
[表 1]
Figure imgf000009_0001
[0050] 《実施例 4 :酵母形質転換体の取得》
プラスミド pKHA030、および、実施例 3にて構築した rHSA発現プラスミドを、 Hinnen らの文献に記載の方法によって、 S. cerevisiae株（cir° a, leu2-3, leu2-112, canl, pr al, yap3, hspl50)に導入した。形質転換体を、ロイシンを欠いている緩衝最小寒天 培地（アミノ酸 '硫酸アンモ-ゥム不含 0.15%(w/v)酵母-トロゲンベース、 0.5%(w/v) 硫酸アンモ-ゥム、 36mMクェン酸、 126mMリン酸水素ニナトリウム、 pH6.5、 2%(w/v) スクロース、および l%(w/v)バタトァガー）上で選択した。
[0051] 《実施例 5： rHSA分泌発現量の評価》
得られた形質転換体を緩衝最小液体培地 (アミノ酸 ·硫酸アンモ-ゥム不含 0.15%( w/v)酵母-トロゲンベース、 0.5%(w/v)硫酸アンモ-ゥム、 36mMクェン酸、 126mMリ ン酸水素ニナトリウム、 pH6.5、 2%(w/v)スクロース） 10mLを含む 50mLフラスコで 30°C 、 200rpmで 96時間培養し、 rHSA発現量をロケット免疫電気泳動にて評価した。まず、 培養液 (N=5)の遠心分離を行い、それぞれ上清を回収した。これらの上清 4 Lを抗ヒ トアルブミン抗体 (シグマ社)を含む 1.0% (w/v)ァガロースゲルに供給し、電気泳動を 行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー (R- 250)で染色し、得られた口 ケット様のピークの高さから各培養上清中の rHSA濃度を比較した。
[0052] 図 3に示すように、 NCE102プロモーター（- 820bp)を含むプラスミド pKHA030を導入 した酵母の rHSA発現量は、 PGK1プロモーター、 TEF1プロモーターを含むプラスミド を導入した酵母の rHSA発現量より明らかに多力つた。
[0053] 《実施例 6： HSA-mRNA転写量の評価》
実施例 4にて得られた形質転換体を緩衝最小液体培地 (アミノ酸'硫酸アンモ-ゥ ム不含 0.15%(w/v)酵母-トロゲンベース、 0.5%(w/v)硫酸アンモ-ゥム、 36mMクェン 酸、 126mMリン酸水素ニナトリウム、 pH6.5、 2%(w/v)スクロース） 10mLを含む 50mLフ ラスコで 30°C、 200rpmで培養し、 72時間後の酵母菌体を回収した。回収した菌体か ら RNeasy Mini Kit (キアゲン社）を用いて全 RN Aを抽出し、同時に DNase処理も行つ た。
[0054] 抽出した全 RNAを铸型とし、 HSA遺伝子検出用の合成 DNA(HA045)： GTCCGA AGTCGCTCACAGATTCAA (配列番号 17)と合成 DNA (HA046)： GCAGATTCGT CAGCAACACAAGTC (配列番号 18)または PGK1遺伝子検出用の合成 DNA(HA0 62)： GCGTGTCTTCATCAGAGTTGACTTC (配列番号 19)と合成 DNA(HA063)： CCAAGTGAGAAGCCAAGACAACGTA (配列番号 20)、 QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (キアゲン社)を用いて、ライトサイクラ一システム（ロッシュ社）による各プ 口モーターの転写活性を比較した。まず、 50°Cで 20分間保温することで逆転写反応 を行い、 96°Cで 15分間の熱変性を行った。続けて、 94°Cで 15秒間、 53°Cで 20秒間、 7 2°Cで 10秒間の 3ステップからなるサイクルを 40回繰り返し、 HA045/HA046により増幅 する HSA遺伝子断片と、 HA062/HA063により増幅する PGK1遺伝子断片の増幅量を 測定した。ここで、各サンプルにおける HSA-cDNA量および PGKl-cDNA量の絶対値 は両者それぞれの mRNA量に等しいと仮定した。各プロモーターの転写活性は、 HS A-mRNA量/ PGKl-mRNA量の比（以下、「HSA-mRNA量比」と略記する）をとることで 数値化した。
[0055] NCE102プロモーター（- 820bp)を含むプラスミド pKHA030を導入した酵母の HSA- m RNA量比は、 PGK1プロモーター、 TEF1プロモーターを含むプラスミドを導入した酵 母の HSA-mRNA量比より、明らかに高かった（図 4)。 また、 NCE102プロモーターを断片化した場合は、図 5に示すように HSA_mRNA量 比が変化し、 - 650bp (配列番号 6 ;配列番号 1の DNA配列中、 751番目から 1400番目 に相当）より長い領域を用いた時に HSA-mRNA量比が高力つた。

Claims

請求の範囲
[I] 酵母の転写プロモーター活性を有する DNA断片であって、配列番号 1に記載され る DNA配列の全部またはその 3 '側末を含む一部の配列、または配列番号 1に記載 される DNA配列の全部またはその 3'側末を含む一部の配列と相補的な配列にノ、ィ ブリダィズしうる DNA配列であって当該全部または一部の配列の転写プロモーター 活性を保持する配列を有する、 DNA断片。
[2] 当該 DNA配列の一部力 少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から 650bpまで の DNA配列（配列番号 6)を含む配列である、請求項 1に記載の DNA断片。
[3] 当該 DNA配列の一部力 少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から 820bpまで の DNA配列（配列番号 5)を含む配列である、請求項 1または 2に記載の DNA断片
[4] 当該 DNA配列の一部力 少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から 950bpまで の DNA配列（配列番号 4)を含む配列である、請求項 1から 3のいずれかに記載の D NA断片。
[5] 当該 DNA配列の一部力 少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から llOObpま での DNA配列（配列番号 3)を含む配列である、請求項 1から 4の 、ずれかに記載の DNA断片。
[6] 当該 DNA配列の一部力 少なくとも配列番号 1の DNA配列の 3'末から 1258bpま での DNA配列（配列番号 2)を含む配列である、請求項 1から 5の 、ずれかに記載の DNA断片。
[7] 請求項 1から 6のいずれかに記載の DNA断片と、その下流に外来タンパク質をコ ードする遺伝子とを含んでなる組換え DNA断片。
[8] 請求項 7に記載の組換え DNA断片を含む発現プラスミド。
[9] 請求項 7に記載の組換え DNA断片または請求項 8に記載の発現プラスミドによつ て形質転換された宿主細胞。
[10] 宿主細胞が酵母である、請求項 9に記載の宿主細胞。
[II] 請求項 9または 10に記載の宿主細胞を培養し、ついで培養物から外来タンパク質 を回収することを含む、外来タンパク質の生産方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008154552A (ja) * 2006-12-26 2008-07-10 Mitsubishi Rayon Co Ltd ロドコッカス属細菌用発現ベクター
WO2010092135A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Novozymes Biopharma Uk Ltd. Albumin variants and conjugates
WO2011124718A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Novozymes A/S Albumin derivatives and variants
JP2018510620A (ja) * 2015-02-09 2018-04-19 ユーシーエル ビジネス ピーエルシー 最適化されたｒｐｅ６５プロモーター及びコード配列

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102741280B (zh) 2009-10-30 2015-12-02 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003018792A1 (en) * 2001-08-24 2003-03-06 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Method of detecting toxic substance
JP2003265177A (ja) * 2002-03-13 2003-09-24 Gekkeikan Sake Co Ltd タンパク質の高発現システム

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050112523A1 (en) * 2003-11-24 2005-05-26 Massad Joseph J. Method for developing balanced occlusion in dentistry

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003018792A1 (en) * 2001-08-24 2003-03-06 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Method of detecting toxic substance
JP2003265177A (ja) * 2002-03-13 2003-09-24 Gekkeikan Sake Co Ltd タンパク質の高発現システム

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLEVES AE ET AL: "A new pathway for protein export in Saccharomyces cerevisiae.", J CELL BIOL., vol. 133, no. 5, September 1996 (1996-09-01), pages 1017 - 1026, XP002928969 *
DATABASE GENE [online] 18 October 2005 (2005-10-18), "NCE102 Protein of unknown function; contains transmembrane domains; involved in secretion of proteins that lack classical secretory signal sequences; component of the detergent-insoluble glycolipid-enriched complexes (DIGs) [Saccharomyces cerevisiae]", XP002993032, accession no. ncbi *
See also references of EP1788084A4 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008154552A (ja) * 2006-12-26 2008-07-10 Mitsubishi Rayon Co Ltd ロドコッカス属細菌用発現ベクター
WO2010092135A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Novozymes Biopharma Uk Ltd. Albumin variants and conjugates
EP3243835A1 (en) 2009-02-11 2017-11-15 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
WO2011124718A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Novozymes A/S Albumin derivatives and variants
JP2018510620A (ja) * 2015-02-09 2018-04-19 ユーシーエル ビジネス ピーエルシー 最適化されたｒｐｅ６５プロモーター及びコード配列

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