ES2948239T3 - Promotor quimérico para su uso en ingeniería metabólica - Google Patents
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Abstract
La presente invención comprende un promotor quimérico que inicia la transcripción de un gen dependiendo de diferentes condiciones tales como fuentes de carbono. Además, la invención se refiere a un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico, un plásmido de expresión que comprende el fragmento de ADN recombinante y una célula huésped transformada con el fragmento de ADN recombinante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Promotor quimérico para su uso en ingeniería metabólica
La presente invención comprende un promotor quimérico que puede iniciar la transcripción de un gen en diversas condiciones, tal como fuentes de carbono variables. Además, la invención se refiere a un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico, un plásmido de expresión que comprende el fragmento de ADN recombinante y una célula huésped transformada con el fragmento de ADN recombinante.
La levadura 5. cerevisiae y la especies de S. sensu stricto se utilizan desde hace miles de años para la elaboración de pan y bebidas alcohólicas como el sake, el vino o la cerveza. Durante este largo período de uso industrial, las levaduras se adaptan a las condiciones del proceso y pueden tolerar las fuerzas mecánicas en un biorreactor, sustancias inhibidoras y productos de fermentación. Además, son resistentes a las fluctuaciones de temperatura y pueden fermentar azúcares a un valor de pH bajo, lo que minimiza el riesgo de contaminación. Aparte de esto, S. cerevisiae es un sistema de modelo de laboratorio clave y puede modificarse genéticamente fácilmente y generalmente se reconoce como seguro - estado GRAS. Se dispone de un amplio conjunto de herramientas genéticas para S. cerevisiae y están bien estudiados muchos procesos intracelulares como el metabolismo, la secreción, el transporte, la señalización y otras rutas, lo que ayuda a diseñar con éxito la levadura para una amplia variedad de aplicaciones.
Especialmente, la introducción de rutas multienzimáticas requiere la regulación y el control de la expresión génica dependiendo de diferentes condiciones, tales como fuentes de carbono variables, incluyendo proporciones variables de fuentes de carbono, en las que la enzima es heteróloga o nativa, para optimizar la utilización del sustrato y/o la formación del producto. De este modo, el control transcripcional tiene lugar en la secuencia de oligonucleótidos que se encuentra en la región anterior de un gen: el promotor. Por lo tanto, la fuerza y regulación del promotor son puntos críticos para la ingeniería metabólica.
Un factor importante en la ingeniería metabólica y la selección de promotores es la estabilidad genética. El uso múltiple de los mismos promotores a menudo da como resultado una inestabilidad genética en cepas modificadas debido a la recombinación homóloga entre tramos de secuencias idénticas.
En la técnica se conocen diferentes tipos de promotores. La presente invención se refiere a un promotor quimérico, en el que se combinan diferentes promotores o partes de diferentes promotores, es decir, un oligonucleótido que tiene actividad de promotor o partes del mismo.
A continuación, se describirán con más detalle los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos y realizaciones descritos de diversas formas no deben interpretarse como una limitación de la presente invención únicamente a las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción respalda y abarca realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos descritos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud deben considerarse reveladas por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas. Los términos "un" y "una" y "el" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o claramente contradicho por el contexto. La enumeración de intervalos de valores en la presente memoria tiene la intención de servir simplemente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, cada valor individual se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en la presente memoria. Todos los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en la presente memoria o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de uno cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como", "por ejemplo"), que se proporciona en la presente memoria tiene la intención de ilustrar mejor la invención y no representa una limitación en el alcance de la invención reivindicada de otro modo. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como una indicación de cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.
Existe una gran demanda de promotores y combinaciones de promotores, respectivamente, que regulen la transcripción y, opcionalmente, la expresión de uno o más genes dependientes de una condición específica, tal como fuentes de carbono variables que incluyen, por ejemplo, proporciones variables de fuentes de carbono. Las condiciones son, por ejemplo, condiciones intracelulares y/o extracelulares y existe la necesidad de promotores que den como resultado una adaptación optimizada de la transcripción de genes de una célula a una o más condiciones. Dichos promotores permitirán optimizar la transcripción en una célula en el sentido de que la transcripción de un gen
se activa o aumenta cuando es necesario y se detiene o disminuye/baja cuando ya no se necesita más para optimizar el uso de los recursos celulares. Por lo tanto, existe una gran demanda de promotores para optimizar la transcripción de genes en las células y, por tanto, la expresión génica, que sean adecuados para el control en condiciones específicas, tal como una fuente de carbono.
Compendio
La presente invención se refiere a un promotor quimérico caracterizado porque comprende dos o más secuencias de oligonucleótidos o partes de las mismas que regulan la transcripción de un gen de una ruta anabólica y/o catabólica tal como la glucólisis y la gluconeogénesis y aumenta el nivel de transcripción de un ARN tipificado como fragmento de ARN mensajero que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en enzimas, por ejemplo, una enzima modificadora de carbohidratos, proteínas estructurales, coenzimas, transportadores, anticuerpos, hormonas y reguladores, como fragmento de ARN regulador, como fragmento de ARN enzimáticamente activo o como fragmento de ARN de transferencia, teniendo dicho promotor quimérico identidad de secuencia con SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 o SEQ ID NO.3. La enzima modificadora de carbohidratos se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste en EC 5.1.3, EC 5.3.1, EC 2.7.1, EC 2.2.1 y EC 1.1.1. El transportador se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste en TC 2.A.1.1 y 2.A.1.2.
Un promotor quimérico de la presente invención permite un aumento en el nivel de transcripción del fragmento de ARN, por ejemplo, en una célula huésped de levadura cuando se cultiva la célula huésped transformada con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico en una fuente de carbono, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en glucosa, xilosa, etanol y una combinación de los mismos.
Un promotor quimérico de la presente invención comprende, por ejemplo, un mayor número de factores de unión de la transcripción, por ejemplo seleccionados del grupo que consiste en REB1, GCR1, GCR2, PHD1, TYE7, PHO2, PHO4, AZF1 y una combinación de los mismos.
El promotor quimérico de SEQ ID NO.1 (pCHI3) comprende, por ejemplo, SEQ ID NO.10 y SEQ ID NO.6, el promotor quimérico de SEQ ID NO.2 (pCHI4) comprende, por ejemplo, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.7 y SEQ ID NO.11, y el promotor quimérico de SEQ ID NO.3 (pCHI5) comprende, por ejemplo, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5 y SEQ ID NO.9.
La presente invención se refiere además a un fragmento de ADN recombinante que comprende un promotor quimérico de la presente invención, a un plásmido de expresión que comprende al menos un fragmento de ADN recombinante y a una célula huésped transformada con al menos un fragmento de ADN recombinante o transformada con al menos un plásmido de expresión.
Descripción detallada
Por lo tanto, los inventores de la presente invención se han fijado la tarea de desarrollar un promotor quimérico novedoso y mejorado que permita un control transcripcional confiable y altamente específico de uno o más genes de la célula en respuesta a condiciones intracelulares y/o extracelulares variables, tales como fuentes de carbono variables incluyendo proporciones variables de fuentes de carbono, en las que los promotores quiméricos son altamente viables para aplicaciones industriales.
Además, los promotores quiméricos de la presente invención amplían la colección de promotores para la ingeniería genética en un microorganismo tal como por ejemplo la levadura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiaé) incluyendo, por ejemplo, una mayor diversidad de los niveles de expresión. Los promotores de la presente invención comprenden o consisten en oligonucleótidos heterólogos que forman promotores heterólogos. Dado que se expresan numerosos genes, es ventajoso tener varios promotores heterólogos, incluso si pueden dar como resultado un nivel de transcripción similar y pueden tener una tasa de expresión similar, respectivamente, para aumentar la estabilidad genética del microorganismo modificado caracterizado por una pérdida escasa o nula de elementos genéticos introducidos por recombinación homóloga.
Los inventores de la presente invención encontraron sorprendentemente que esta tarea se puede resolver mediante un promotor quimérico que comprende dos o más secuencias de oligonucleótidos o partes de las mismas que regulan la transcripción de un gen de una ruta anabólica y/o una ruta catabólica, donde la ruta catabólica corresponde a la ruta anabólica, tal como los genes de la glucólisis y de la gluconeogénesis, respectivamente, que por ejemplo aumenta el nivel de transcripción de un ARN (basado en la tasa de transcripción y la estabilidad del ARN) tal como un fragmento de ARN mensajero que codifica para una proteína seleccionada del grupo que consiste en enzimas, proteínas estructurales, coenzimas, transportadores, anticuerpos, hormonas y reguladores, como un fragmento de ARN regulador, como un fragmento de ARN enzimáticamente activo o como un fragmento de ARN de transferencia, teniendo dicho promotor quimérico identidad de secuencia con SEQ ID NO.1 (pCHI3), SEQ ID NO.2 (pCHI4) o SEQ ID NO.3 (pCHI5).
La nomenclatura de aminoácidos, péptidos, nucleótidos y ácidos nucleicos dentro de la presente solicitud sigue las sugerencias de la IUPAC. En general, los aminoácidos se nombran en este documento según el código de una letra.
El "promotor quimérico" es un oligonucleótido que tiene actividad promotora. Un "oligonucleótido" según la presente invención debe entenderse como una molécula de ADN o ARN monocatenario o bicatenario que comprende de 2 a 1000 ácidos nucleicos, preferiblemente de 10 a 900 ácidos nucleicos, más preferiblemente de 50 a 850 ácidos nucleicos y lo más preferido de 100 a 820 ácidos nucleicos.
Los términos "ADN" y "ARN" son bien conocidos por un experto en la materia. Mientras que el ADN contiene desoxirribosa, el ARN contiene ribosa (en la desoxirribosa no hay un grupo hidroxilo unido al anillo de pentosa en la posición 2'). La base complementaria de la adenina no es la timina, como lo es en el ADN, sino el uracilo, que es una forma no metilada de la timina.
El promotor quimérico de la presente invención comprende o consiste en dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) secuencia(s) de oligonucleótidos o partes de las mismas (por ejemplo, un promotor o parte del mismo) que regulan la transcripción de uno o más genes de la ruta anabólica y catabólica, es decir, genes de rutas metabólicas opuestas, por ejemplo, la glicólisis (degradación de glucosa) y la gluconeogénesis (síntesis de glucosa) (por ejemplo, Figura 1). Los genes no se clasifican según la ruta a la que pertenecen, sino según su activación bajo las condiciones específicas de la ruta, por ejemplo, la presencia de un nivel alto o bajo de glucosa, por ejemplo en 5. cerevisiae. Según esta clasificación, los genes de la glicólisis son, por ejemplo, PGK1, ENO1 o PFK2, y los genes de la gluconeogénesis son, por ejemplo, PGI1, TPI1 o FBA1.
Los promotores quiméricos pCHI3, pCHI4 y pCHI5 tienen las siguientes secuencias:
Los promotores quiméricos de la presente invención comprenden o consisten en oligonucleótidos (por ejemplo, partes de promotores) seleccionados del grupo que consiste en pK1a (SEQ ID NO.4), pK2a (SEQ ID n O.5), pK2b (SEQ I NO.6 ), pK3b (SEQ ID NO. 7), pK4a (SEQ ID NO. 8), pK4c (SEQ ID NO. 9), pK5a (SEQ ID NO. 10), pK5b (SEQ I NO. 11), pK6a (SEQ ID NO.12), y combinaciones de los mismos.
Las secuencias de estas partes se muestran a continuación:
El promotor quimérico pCHI3 (SEQ ID NO.1) comprende o consiste en los oligonucleótidos (por ejemplo, partes de los promotores) pK5a (SEQ ID NO.10) y pK2b (SEQ ID NO.6). El promotor quimérico pCHI4 (SeQ ID NO.2) comprende o consiste en los oligonucleótidos (por ejemplo, partes de los promotores) pK4a (SEQ ID NO.8), pK3b (SEQ ID NO.7) y pK5b (SEQ ID NO.11). El promotor quimérico pCHI5 (SEQ ID NO.3) comprende o consiste en los oligonucleótidos (por ejemplo, partes de los promotores) pK6a (SeQ ID NO.12), pK1a (SeQ ID NO.4), pK2a (SEQ ID NO.5) y pK4c (SEQ ID NO.9). Los promotores quiméricos y sus partes (oligonucleótidos) se muestran en la Figura 1.
Además, en los promotores quiméricos de la presente invención se enriquecen los sitios de unión del factor de transcripción que, por ejemplo, se seleccionan del grupo que consiste en REB1 (por ejemplo, que tiene la secuencia RTTACCCK), GCR1 (por ejemplo, que tiene la secuencia CTTCC), GCR2 (por ejemplo, que tiene la secuencia GCTTCCA), PHD1 (por ejemplo, que tiene la secuencia SMTGCA), TYE7 (por ejemplo, que tiene la secuencia
CACGTGA), PHO2 (por ejemplo, que tiene la secuencia ATAWTW), PHO4 (por ejemplo, que tiene la secuencia GCRCGYG), AZF1 (por ejemplo, que tiene la secuencia AAAMRGMAA) y combinaciones de los mismos (Figuras 2 y 3), en donde R, K, W, M, Y, etc. se especifican según la IUPAC, por ejemplo R = A o G, K = G o T, W = A o T, M = A o C e Y = C o T. El promotor quimérico de la presente invención comprende una "región central" que comprende al menos 210 pb en el extremo 5' del promotor quimérico que está localizado cerca del punto de inicio de la traducción y sin modificar, es decir, la región central corresponde a la secuencia de un oligonucleótido nativo. El oligonucleótido nativo según la presente invención es una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a una secuencia que se encuentra en el microorganismo del que se origina. Por ejemplo, un oligonucleótido procedente de K. lactis que se transfiere a un microorganismo huésped tal como S. cerevisiae comprende o consiste en una región central que corresponde a una secuencia de K. lactis. Los oligonucleótidos o partes de los mismos que forman el promotor quimérico de la presente invención están, por ejemplo, orientados en la misma dirección y están localizados en la misma posición que en el oligonucleótido del que se originan.
Un promotor quimérico de la presente invención, es decir, un oligonucleótido que tiene actividad promotora, se transfiere a una célula huésped que es un microorganismo diferente al microorganismo, de donde se originan los oligonucleótidos del promotor o es el mismo microorganismo, donde se originan los oligonucleótidos del promotor.
El promotor quimérico según la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene identidad de secuencia con SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 o SEQ ID NO.3.
En otro ejemplo, la secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 o SEQ ID NO.3.
El promotor quimérico según la presente invención aumenta el nivel de transcripción de ciertos fragmentos de ARN que están, por ejemplo, unidos funcionalmente al promotor quimérico, es decir, controlados por el promotor quimérico, por ejemplo, dependiendo de condiciones cambiantes tales como diferentes fuentes de carbono, incluyendo proporciones variables de fuentes de carbono. Un promotor quimérico de la presente invención tiene una característica funcional específica, es decir, conduce a un aumento del nivel de transcripción de un determinado ARN cuando el huésped se cultiva y el promotor se expone a una fuente de carbono específica, respectivamente, y un nivel de transcripción inalterado o reducido de un determinado ARN cuando el huésped se cultiva y el promotor se expone a otra fuente de carbono específica, respectivamente, en comparación con el nivel de transcripción respectivo, por ejemplo, resultante de un promotor del estado de la técnica. Los oligonucleótidos que forman el promotor quimérico se seleccionan y combinan para regular (específicamente) los niveles de transcripción. Un oligonucleótido del promotor quimérico solo puede mostrar un nivel de transcripción diferente al de la combinación de oligonucleótidos que forman el promotor quimérico. La gran ventaja de la presente invención es la combinación de oligonucleótidos que dan como resultado que el promotor quimérico regule específicamente uno o más niveles de transcripción, por ejemplo, dependiendo de la fuente de carbono.
El término "aumento" o "disminución del nivel de transcripción" debe entenderse así, por ejemplo, como un aumento o disminución en comparación con el nivel de transcripción resultante de un oligonucleótido del estado de la técnica que es un oligonucleótido conocido en el estado de la técnica de forma nativa o recombinante presente en un microorganismo. Por ejemplo, si el oligonucleótido que tiene actividad promotora se origina a partir de K. lactis y se transfiere a 5. cerevisiae, la referencia para determinar el aumento o disminución de un nivel de transcripción es un oligonucleótido que tiene actividad promotora en K. lactis o 5. cerevisiae que está presente, por ejemplo, de forma nativa o recombinante en este microorganismo. Por ejemplo, el nivel de transcripción de un ARN basado en la actividad de un promotor quimérico de la presente invención, tal como pCHI3, pCHI4 o pCHI5, se determina en comparación con un promotor nativo de 5. cerevisiae, por ejemplo, pPKG1_Sce que representa en este caso el oligonucleótido del estado de la técnica. El "aumento o disminución del nivel de transcripción" generalmente se determina de la siguiente manera:
RTLi - nivel de transcripción relativo de un sistema informador (por ejemplo, XylA, SEQ ID NO.13) controlado por un promotor quimérico según la invención
RTLs - nivel de transcripción relativo de un sistema informador (por ejemplo, XylA, SEQ ID NO.13) controlado por un oligonucleótido según el estado de la técnica
De ese modo, el nivel de transcripción relativo se mide como la concentración de ARN del sistema informador en un extracto celular en relación con la concentración de ARN de un gen constitutivo (por ejemplo, ACT1) en el mismo extracto celular.
Mientras que RTLi y los RTLs se determinan mediante el uso del mismo tipo de célula huésped, mientras que la célula huésped se transforma con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico respectivo y la célula huésped se cultiva en condiciones idénticas al estado de la técnica, mientras que la célula huésped se recolecta dentro de la fase de crecimiento exponencial.
Dentro de una realización preferida, el nivel de transcripción de un gen específico aumenta cuando se cultiva una célula huésped de levadura, preferiblemente 5. cerevisiae, transformada con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende un promotor quimérico según la presente invención en una fuente de carbono que incluye proporciones variables de fuentes de carbono seleccionadas, por ejemplo, del grupo que consiste en glucosa, manosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, trehalosa, rafinosa, glicerol, etanol, acetato y lactato, en particular glucosa, xilosa y/o etanol. El aumento se determinó de la siguiente manera:
RTLIe - nivel de transcripción relativo del ARN mensajero que codifica para SEQ ID NO.15 controlado por el promotor quimérico de SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 o SEQ ID NO.3.
RTLSe - nivel de transcripción relativo del ARN mensajero que codifica para SEQ ID NO.15 controlado por el oligonucleótido SEQ ID NO.14
De ese modo, el nivel de transcripción relativo se mide como la concentración de ARN mensajero que codifica para SEQ ID NO.15 en un extracto celular de levadura (S. cerevisiae) en relación con la concentración del ARN mensajero del gen constitutivo que codifica la actina en el mismo extracto celular de levadura.
Mientras que RTLIe y RTLSe se determinan mediante el uso del mismo tipo de célula huésped de levadura (S. cerevisiae) mientras que la célula huésped de levadura se transforma con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico respectivo y la célula huésped de levadura se cultiva en condiciones idénticas al estado de la técnica, mientras que la célula huésped de levadura se cultiva dentro de la fase de crecimiento exponencial.
Dentro de una realización particularmente preferida de la presente invención, el nivel de transcripción del gen en una célula huésped de levadura transformada con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico según la presente invención aumenta dependiendo de diferentes condiciones tales como diferentes fuentes de carbono que incluyen proporciones variables de fuentes de carbono, por ejemplo, en un intervalo de 1,1 veces a 10 veces, de 1,2 veces a 9 veces, de 1,3 veces a 8 veces, de 1,4 veces a 7 veces, de 1,5 veces a 6 veces , de 1,4 veces a 5 veces, de 1,5 veces a 4 veces, de 1,6 veces a 3 veces, de 1,7 veces a 2,5 veces, de 1,8 veces a 2,4 veces, de 1,9 veces a 2,3 veces, o al menos 1, 1 veces, al menos 1,2 veces, al menos 1,3 veces, al menos 1,4 veces al menos 1,5 veces, al menos 1,6 veces, al menos 1,7 veces, al menos 1,8 veces, al menos al menos 1,9 veces, al menos 2 veces, al menos 2,5 veces, al menos 3 veces, al menos 3,5 veces, al menos 4 veces, al menos 4,5 veces, al menos 5 veces o más, o por 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 2,1 veces, 2,2 veces, 2,3 veces, 2,4 veces, 2,5 veces, 2,6 veces, 2,7 veces, 2,8 veces, 2,9 veces, 3 veces, 3,1 veces, 3,2 veces, 3,3 veces, 3,4 veces o 3,5 veces cuando se cultiva la célula huésped tal como levadura en una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, manosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, trehalosa, rafinosa, glicerol, etanol, acetato, lactato y combinaciones de los mismos; o seleccionado del grupo que consiste en glucosa, manosa, fructosa, xilosa, sacarosa, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos; o seleccionado del grupo que consiste en glucosa, manosa, glicerol, etanol, xilosa y combinaciones de los mismos; o seleccionado del grupo que consiste en glucosa, xilosa, etanol y combinaciones de los mismos.
Opcionalmente, además, el promotor quimérico según la presente invención aumenta la actividad enzimática de una enzima codificada por un ARN controlado por el oligonucleótido dependiendo de diferentes condiciones tales como una fuente de carbono diferente que incluye proporciones variables de fuentes de carbono. Por lo tanto, el término "xveces de actividad enzimática" debe entenderse como un aumento o disminución de la actividad enzimática en comparación con la actividad enzimática de un oligonucleótido con actividad promotora del estado de la técnica. La "x-veces de actividad enzimática" generalmente se determina de la siguiente manera:
EAi - actividad enzimática de un sistema informador (por ejemplo, XI, SEQ ID NO.15) controlado por un promotor quimérico según la invención
EAs - actividad enzimática de un sistema informador (por ejemplo, XI, SEQ ID NO.15) controlado por un oligonucleótido según el estado de la técnica
De ese modo, la actividad enzimática se mide como la cantidad de un sustrato convertida por minuto por una cantidad definida de un extracto celular, excluyendo la actividad de fondo del sistema informador.
Mientras que EAi y EAs se determinan mediante el uso del mismo tipo de célula huésped, mientras que la célula huésped se transforma con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico respectivo y la célula huésped se cultiva en condiciones idénticas del estado de la técnica, mientras que la célula huésped se recolecta dentro del fase de crecimiento exponencial.
Dentro de una realización preferida, la actividad enzimática aumenta dependiendo de diferentes condiciones, tales como diferentes fuentes de carbono, que incluyen proporciones variables de fuentes de carbono, por ejemplo, en un intervalo de 1,1 veces a 10 veces, de 1,2 veces a 9 veces, de 1,3 veces a 8 veces, de 1,4 veces a 7 veces, de 1,5 veces a 6 veces, de 1,4 veces a 5 veces, de 1,5 veces a 4 veces, de 1,6 veces a 3 veces, de 1,7 veces a 2,5 veces, de 1,8 veces a 2,4 veces, de 1,9 veces a 2,3 veces, o por lo menos 1,5 veces o al menos 2 veces o de 1,1 veces a 5 veces, de 1,2 veces a 4 veces, de 1,3 veces a 3,5 veces, de 1,4 veces a 3 veces, de 1,5 veces a 2,9 veces, de 1,6 veces a 2,8 veces, de 1,7 veces a 2,7 veces, de 1,8 veces a 2,6 veces, de 1,9 veces a 2,5 veces o 2 veces cuando se cultiva una célula huésped, tal como la levadura, por ejemplo 5. cerevisiae, transformada con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende un promotor quimérico según la presente invención en una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, manosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, trehalosa, rafinosa, glicerol, etanol, acetato, lactato y combinaciones de los mismos; o seleccionado del grupo que consiste en glucosa, xilosa, etanol y combinaciones de los mismos.
El aumento se determinó de la siguiente manera:
EAIe - actividad enzimática de la proteína SEQ ID NO.15 controlada por el promotor quimérico SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 o SEQ ID NO.3.
EASe - actividad enzimática de la proteína SEQ ID NO.15 controlada por un oligonucleótido SEQ ID NO.14.
De este modo, la actividad enzimática se mide como la cantidad de xilosa convertida por minuto por una cantidad definida de un extracto celular, excluyendo la actividad de fondo del sistema informador.
Mientras que EAIe y EASe se determinan por el uso del mismo tipo de célula huésped (S. cerevisiae) mientras que la célula huésped se transforma con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende el respectivo promotor quimérico y la célula huésped se cultiva en condiciones idénticas al estado de la técnica, mientras que la célula huésped se recolecta dentro de la fase de crecimiento exponencial.
Dentro de una realización de la presente invención, se aumenta una o más actividades enzimáticas en una célula huésped de levadura transformada con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico según la presente invención y una o más actividades enzimáticas diferentes permanecen sin cambios o disminuyen dependiendo de diferentes condiciones, tales como diferentes fuentes de carbono, que incluyen proporciones variables de fuentes de carbono. El aumento o disminución del nivel de transcripción está, por ejemplo, en un intervalo de 1,1 veces a 10 veces, de 1,2 veces a 9 veces, de 1,3 veces a 8 veces, de 1,4 veces a 7 veces, de 1,5 veces a 6 veces, de 1,4 veces a 5 veces, de 1,5 veces a 4 veces, de 1,6 veces a 3 veces, de 1,7 veces a 2,5 veces, de 1,8 veces a 2,4 veces, de 1,9 veces a 2,3 -veces, o por al menos 1,1 veces, al menos 1,2 veces, al menos 1,3 veces, al menos 1,4 veces, por al menos 1,5 veces, al menos 1,6 veces, al menos 1,7 veces, al menos 1,8 -veces, al menos 1,9 veces, al menos 2 veces, al menos 2,5 veces, al menos 3 veces, al menos 3,5 veces, al menos 4 veces, al menos 4,5 veces, al menos 5 veces o más o por 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1.7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 2,1 veces, 2,2 veces, 2,3 veces, 2,4 veces, 2,5 veces, 2,6 veces, 2,7 veces, 2.8 veces, 2,9 veces, 3 veces, 3,1 veces, 3,2 veces, 3,3 veces, 3,4 veces o 3,5 veces cuando se cultiva la célula huésped tal como levadura en una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, manosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, trehalosa, rafinosa, glicerol, etanol, acetato, lactato y combinaciones de los mismos; o seleccionada del grupo que consiste en glucosa, manosa, fructosa, xilosa, sacarosa, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos; o seleccionada del grupo que consiste en glucosa, manosa, glicerol, etanol, xilosa y combinaciones de los mismos; o seleccionada del grupo que consiste en glucosa, xilosa, etanol y combinaciones de los mismos.
Dentro de la presente invención, el término "fragmento de ARN regulador" debe entenderse como una cadena de ARN que tiene la capacidad de regular posteriormente la expresión de un gen al ser complementario a una parte de un mARN o del ADN de un gen. Ejemplos de "fragmentos de ARN reguladores" son los microARNs (miARN) que actúan a través de la interferencia de ARN (ARNi), donde un complejo efector de miARN y enzimas puede escindir el mARN complementario, bloquear la traducción del mARN o acelerar su degradación. Un mARN puede contener elementos reguladores en sí mismo, tal como riboconmutadores, en la región no traducida 5' o en la región no traducida 3'; estos elementos reguladores en cis regulan la actividad de ese mARN.
Las regiones no traducidas también pueden contener elementos que regulan otros genes.
Dentro de la presente invención, el término "fragmento de ARN enzimáticamente activo" debe entenderse como ARN que forma parte de un complejo de proteínas que puede catalizar reacciones enzimáticas dentro de la célula como ARN ribosómico o ARN que forma un complejo catalíticamente activo en sí mismo tal como ribozima (enzimas del ácido ribonucleico).
Dentro de la presente invención, el término "fragmento de ARN enzimáticamente activo" debe entenderse como ARN
que forma parte de un complejo de proteínas que puede catalizar reacciones enzimáticas dentro de la célula como ARN ribosómico o ARN que forma un complejo catalíticamente activo en sí mismo tal como ribozima (enzimas del ácido ribonucleico).
Dentro de la presente invención, el término "fragmento de ARN de transferencia" (fragmento de tARN) debe entenderse como una pequeña cadena de ARN de aproximadamente 80 nucleótidos que tiene la capacidad de transferir un aminoácido específico a una cadena polipeptídica en crecimiento en el sitio ribosomal de la síntesis de proteína durante la traducción. Tiene sitios para la unión de aminoácidos y una región de anticodón para el reconocimiento de codones que se une a una secuencia específica en la cadena de ARN mensajero a través de enlaces de hidrógeno.
Dentro de la presente invención, el término "fragmento de ARN mensajero" (fragmento de mARN) debe entenderse como una pequeña cadena de ARN que tiene la capacidad de transportar información sobre una secuencia de proteína a los ribosomas. Cada tres nucleótidos (un codón) corresponde a un aminoácido. En las células eucariotas, una vez que el mARN precursor (pre-mARN) se ha transcrito a partir del ADN, se procesa para convertirlo en mARN maduro. Esto elimina sus secciones no codificantes de intrones del pre-mARN. Después, el mARN se exporta desde el núcleo al citoplasma, donde se une a los ribosomas y se traduce a su forma de proteína correspondiente con la ayuda del tARN. En las células procarióticas, que no tienen un núcleo ni compartimentos en el citoplasma, el mARN puede unirse a los ribosomas mientras se transcribe a partir del ADN. Después de un cierto período de tiempo, el ARN mensajero se degrada en los nucleótidos que lo componen con la ayuda de las ribonucleasas.
Dentro de la presente invención, el término "proteínas estructurales" se refiere a proteínas que confieren dureza y rigidez a componentes biológicos que de otro modo serían fluidos. Las proteínas estructurales preferidas se seleccionan del grupo que consiste en proteínas fibrosas tales como colágeno, elastina y queratina; y proteínas globulares tales como actina y tubulina. Otras proteínas que cumplen funciones estructurales y que deben entenderse como "proteínas estructurales" dentro de la presente invención son proteínas motoras tales como miosina, cinesina y dineína, que son capaces de generar fuerzas mecánicas.
Los fragmentos de ARN preferidos que codifican una proteína estructural se seleccionan del grupo que consiste en actina, elastina, filamina, colágeno, miosina, lamina.
Los fragmentos de ARN preferidos que codifican una coenzima se seleccionan del grupo de fragmentos de ARN que codifican polipéptidos que se modifican después de la traducción.
Los ejemplos son triptófano triptofilquinona (TTQ) y 4-metiliden-imidazol-5-ona (MIO).
Los fragmentos de ARN preferidos que codifican un anticuerpo se seleccionan del grupo de fragmentos de ARN que codifican IgA, IgD, IgE, EgG, IgM, IgY e IgW.
Los fragmentos de ARN preferidos que codifican una hormona se seleccionan del grupo de fragmentos de ARN que codifican hormonas peptídicas pequeñas tales como TRH y vasopresina; insulina; hormona del crecimiento; hormonas glicoproteicas tales como la hormona luteinizante, la hormona foliculoestimulante y la hormona estimulante de la tiroides.
Los fragmentos de ARN preferidos que codifican un regulador se seleccionan del grupo de fragmentos de ARN que codifican receptores, factores de transcripción, sensores metabólicos, sensores de luz, electrosensores, sensores mecánicos y transductores de señales.
Los fragmentos de ARN preferidos que codifican una enzima se seleccionan del grupo de fragmentos de ARN que codifican enzimas modificadoras de carbohidratos. Dentro de la presente invención, el término "enzima modificadora de carbohidratos" debe entenderse que comprende cualquier enzima capaz de modificar cualquier tipo de carbohidrato tal como (pero sin limitarse a) enzimas de escisión de carbohidratos, de oxidación de carbohidratos, de reducción de carbohidratos, de descarboxilación de carbohidratos, de desacetilación de carbohidratos, de acetilación de carbohidratos, de metilación de carbohidratos, de desmetilación de carbohidratos, de aminación de carbohidratos, de fosforilación de carbohidratos, de desfosforilación de carbohidratos, de isomerización de carbohidratos, de epimerización de carbohidratos y de desaminación de carbohidratos.
Dentro de una realización particularmente preferida de la presente invención, la enzima modificadora de carbohidratos se selecciona del grupo que consiste en las clases EC 5.1.3, EC 5.3.1, EC 2.7.1, EC 2.2.1 y EC 1.1.1., preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en EC 5.1.3.3, EC 5.3.1.5, EC 2.7.1.17, EC 2.2.1.2, EC 2.2.1.1, EC 1.1.1.1, EC 5.3.1.4, EC 2.7.1.16 y EC 5.1.3.4 así como enzimas mutadas (por ejemplo, que comprenden sustitución, deleción y/o inserciones) o fragmentos de las mismas.
Según la presente invención, por ejemplo, de 1 a 80 nucleótidos del oligonucleótido de la presente invención están "mutados". Dentro de la presente invención, el término "mutado" debe entenderse como "sustituido", "suprimido" o "insertado". El término "mutación" debe entenderse como "sustitución", "deleción" o "inserción". Las sustituciones se clasifican como transiciones donde una purina se intercambia por una purina (A <-> G) o una pirimidina por una pirimidina (C <->T) o transversiones donde una purina se intercambia por una piridina y viceversa (C/T <-> NG). Las inserciones añaden uno o más nucleótidos adicionales (A, C, T o G) en un oligonucleótido. La eliminación de uno o
más nucleótidos del ADN se denomina deleción.
Dentro de otra realización, la presente invención proporciona un fragmento de ADN recombinante que comprende el oligonucleótido según la presente invención.
Los fragmentos de ADN recombinante particularmente preferidos según la presente invención comprenden un promotor quimérico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y un fragmento de ADN que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en enzimas, proteínas estructurales, coenzimas, transportadores, anticuerpos, hormonas y reguladores. Es además particularmente preferido que la proteína sea una enzima y que la enzima se seleccione del grupo que consiste en las clases EC 5.1.3, EC 5.3.1, EC 2.7.1, EC 2.2.1 y EC 1.1.1, preferiblemente se seleccione del grupo que consiste en EC 5.1.3.3, EC 5.3.1.5, EC 2.7.1.17, EC 2.2.1.2, EC 2.2.1.1, EC 1.1.1.1, EC 5.3.1.4, EC 2.7.1.16 y EC 5.1.3.4. Dentro de una realización adicional particularmente preferida, la proteína se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs 22 a 138.
Dentro de una realización adicional, la presente invención proporciona un plásmido de expresión que comprende al menos un fragmento de ADN recombinante según la presente invención.
La presente invención proporciona además una célula huésped transformada con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico según la presente invención. La célula huésped según la presente invención se usa preferiblemente para la ingeniería metabólica o para la transformación metabólica de sustratos que contienen xilosa en metabolitos preferidos.
La célula huésped recombinante según la presente invención se selecciona preferiblemente de bacterias, levaduras o células fúngicas. En una realización particularmente preferida, la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Lactobacillus, Bacillus, Streptomyces; Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Candida, Yarrowia, Komagataella, Pichia, Hansenula, Penicillium, Trichoderma, Hypocrea, Aspergillus, Cantharellu, Agraicus, Boletos, Pleurotus, Trametes, Phanerochaete, Myceliophthora, Chaetomium, Humicola, Chrysosporium, Talaromyces y Neurospora.
Se prefiere particularmente seleccionar la célula huésped del grupo que consiste en Lactococcus lactis, Lactobacillus brevis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Pseudomonas fluorescence, Klebsiella planticola, Escherichia coli, Streptomyces lividans, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces uravum, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces marxianus, Yarrowina lipolytica, Hansenula polymorpha, Pichia angusta, Komagataella pastoris, Pichia pastoris, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei y Myceliophthora thermophila.
La célula huésped recombinante según la presente invención puede comprender uno o más plásmidos según la presente invención. Además o alteARNtivamente, el fragmento de ADN recombinante que codifica el promotor quimérico se integra en el genoma de la célula huésped.
Ejemplos y Figuras
A continuación, la presente invención se describe mediante ejemplos y figuras. Los ejemplos y las figuras se consideran únicamente con fines ilustrativos y no limitan el alcance de la presente invención y las reivindicaciones en ningún aspecto.
Ejemplo 1: Clonación del plásmido
El plásmido se construyó mediante clonación por recombinación en 5. cerevisiae: Se transformó una célula de levadura con un vector que ha sido linealizado por la enzima de restricción NotI y los productos de PCR que tienen un solapamiento homólogo de 45 pb entre sí y con el vector. El vector consiste en un marcador de levadura (pUG6 de 87 a 1559 pb), un marcador y origen de E. coli (pUG19 754 a 2534 pb) y un origen de levadura (S. cerevisiae S288C cromosoma IV 44978 a 449831 y S. cerevisiae S288C cromosoma II 63156 a 63454 pb). Estas partes están flanqueadas por los sitios de restricción SapI, Sbfl, StuI y Notí, respectivamente. Los fragmentos de PCR contenían las partes funcionales (SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20 o SEQ ID NO.21, respectivamente, SEQ ID NO.13 y S. cerevisiae S288C cromosoma XI 326407 a 326108 pb).
Los fragmentos se ensamblan por recombinación homóloga en la célula de levadura formando un plásmido circular.
A continuación, se aisló el ADN de la célula de levadura y se transformó en E. coli para singularizar y producir el plásmido en mayores cantidades. Después de la verificación del plásmido, la cepa de levadura Simi White™ (Lote: 02905340230601V, Lallemand, Canadá) se transformó con el plásmido reaislado con el método LiAc de alta eficiencia según Gietz y Schiestl (High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS Carrier ADN/PEG method. Not Protocols 2(1), 2007: 31-34).
Ejemplo 2: nivel de transcripción: comparación de diferentes plásmidos que contienen diferentes
oligonucleótidos
Las cepas de levadura que albergaban los diferentes plásmidos se cultivaron en 20 ml de sustrato que contenía glucosa, etanol o xilosa (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, 20 g/l de fuente de carbono, 200 mg/l de G418) en un matraz de agitación de 100 ml a 30°C y 250 rpm. Las células se recogieron por centrifugación a una densidad de cultivo de aproximadamente OD600 2 y se lavaron con agua dos veces. Después de eso, las células se volvieron a suspender en agua y la OD600 se ajustó a 6. Se centrifugaron alícuotas de 600 μL de la suspensión celular y los sedimentos celulares se almacenaron a -80°C.
El ARN total se extrajo de los sedimentos celulares utilizando el kit RNeasy MiniKit™ (Qiagen Alemania) según el manual del fabricante. Después, se usaron 500 ng de ARN en una reacción de transcripción inversa para generar cADN usando iScript Reverse Transcription Supermix para RT-qPCR (BIO RAD Alemania) según el manual del fabricante. Los niveles de transcripción se determinaron utilizando el iQTM SYBR® Green Supermix y el iQ™ iCycler (BIO RAD Alemania) siguiendo la información del fabricante. ACT1 sirvió como un gen de referencia para el cálculo de los niveles de mARN de XylA. En la qPCR, se amplificaron productos de PCR altos de 225 y 236 pb a partir de mARN de ACT1 y XylA, respectivamente. Los niveles de transcripción de XylA bajo el control de diferentes promotores se calcularon en relación con el nivel de transcripción de XylA bajo el control del promotor pPGK1 de 5. cerevisiae mediante el uso del método 2(-ññ Ct).
Se determinaron los niveles de transcripción para pCHI3, pCHI4 y pCHI5 y se muestran en las Figuras 4A a 4C. pCHI3 da como resultado un aumento de la transcripción de XylA, si 5. cerevisiae se cultiva en xilosa; cuando se cultiva en glucosa o etanol, la transcripción de XylA es detectable en una cantidad menor. pCHI4 también da como resultado un aumento de la transcripción de XylA, si 5. cerevisiae se cultiva en xilosa; cuando se cultiva en glucosa o etanol, la transcripción de XylA es detectable en una cantidad menor. pCHI5 representa un aumento en la transcripción de XylA, si 5. cerevisiae se cultiva en glucosa; cuando se cultiva en xilosa o etanol, la transcripción de XylA es baja (Figuras 4A a 4C).
En la Figura 5, se comparan los niveles de transcripción de XylA dependientes de los promotores quiméricos pCHI3, pCHI4 y pCHI5, lo que confirma un aumento en el nivel de transcripción de XylA a través de pCHI3 y pCHI4 cultivados en xilosa y un aumento en el nivel de transcripción de XylA a través de pCHI5 cultivado en glucosa.
Ejemplo 3: Actividad enzimática - comparación de diferentes plásmidos que contienen diferentes oligonucleótidos
Las cepas de levadura que albergaban los diferentes plásmidos se cultivaron en un volumen de cultivo de 50 ml en matraces de agitación de 250 ml como se define en el ejemplo 2 y se recolectaron a aproximadamente OD600 2. Después, el sedimento del cultivo se almacenó a -80°C.
Los sedimentos descongelados se suspendieron en 400 μl de tampón (Tris 100 mM pH 7,5, MgCl210 mM) y se homogeneizaron. Después de la lisis celular, los extractos brutos se diluyeron hasta una concentración de proteína total de 2 μg/μl (medida mediante el ensayo de Bradford). Los ensayos de actividad de xilosa isomerasa se realizaron en 100 μl con 10 % de los extractos crudos diluidos, NADh 0,25 mM, sorbitol deshidrogenasa 3 U/ml y xilosa 500 mM. La cinética de la reacción se siguió fotométricamente a 340 nm.
Se determinó la actividad de la xilosa isomerasa (XI) codificada por XylA y expresada bajo el control de pCHI3, pCHI4 o pCHI5 para un microorganismo tal como 5. cerevisiae cultivado en glucosa, xilosa o etanol y se muestra en las Figuras 6A a 6C.
En la Figura 7 se muestra una comparación del nivel de transcripción frente a la actividad enzimática. Se muestra un aumento en el nivel de transcripción a través de pCHI3 y pCHI4 cuando se cultiva en xilosa y a través de pCHI5 cuando se cultiva en glucosa. La Figura 7 muestra que la actividad enzimática de correlación para pCHI3 y pCHI4 es más fuerte cuando el microorganismo se cultiva en xilosa en comparación con cuando el microorganismo se cultiva en glucosa o etanol. La actividad enzimática de correlación para pCHI5 es más fuerte cuando el microorganismo se cultiva en glucosa en comparación con cuando el microorganismo se cultiva en xilosa o etanol. Esto confirma que los promotores quiméricos de la presente invención permiten, mediante la elección del promotor, lograr una transcripción aumentada o disminuida selectivamente y correlacionar la actividad enzimática y, por lo tanto, la adaptación de ambos a condiciones específicas tales como fuentes de carbono.
Breve descripción de las Figuras.
Figura 1: muestra oligonucleótidos y partes de los mismos que forman un promotor quimérico de la presente invención tal como un promotor quimérico de SEQ ID NO.1 (pCHI3), SEQ ID NO.2 (pCHI4) o SEQ ID NO.3 (pCHI5), y oligonucleótidos tales como promotores y partes de los mismos que regulan los genes de la glicólisis y la gluconeogénesis nativos, es decir, que se originan a partir de Kluyveromyces lactis.
Figuras 2A a 2C: muestran el enriquecimiento del sitio de unión del factor de transcripción en los promotores quiméricos de SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 o SEQ ID NO.3 de la presente invención en comparación con los sitios de unión del factor de transcripción en los respectivos promotores nativos (de tipo nativo).
Figuras 3A a 3C: muestran los sitios de unión del factor de transcripción con más detalle, es decir, basándose en la secuencia del promotor quimérico de SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 o SEQ ID NO.3, se indican la localización y las secuencias de los sitios de unión a la transcripción.
Figuras 4A a 4C: muestran los niveles de transcripción de XylA en un microorganismo tal como 5. cerevisiae dependiendo de la fuente de carbono para el cultivo y el promotor que controla la transcripción de XylA. Los gráficos muestran los niveles de transcripción de XlyA para pCHI3, pCHI4 y pCHI5, respectivamente, en comparación con los niveles de transcripción de XylA para los promotores nativos, cuyas partes (oligonucleótidos) forman el respectivo promotor quimérico y el nivel de transcripción de XylA para un promotor del estado de la técnica, por ejemplo, el promotor nativo de PGK1 de 5. cerevisiae.
Figura 5: muestra una comparación de los niveles de transcripción de XylA en células cultivadas en glucosa, xilosa o etanol, donde la transcripción controlada por pCHI3 y pCHI4 muestran un aumento cuando las células se cultivaron en xilosa y la transcripción controlada por pCHI5 muestra un aumento cuando las células se cultivaron en glucosa.
Figuras 6A a 6C: muestran los niveles de actividad de la xilosa isomerasa (XI) en un microorganismo tal como 5. cerevisiae dependiendo de la fuente de carbono para el cultivo y el promotor que controla la transcripción de XylA. Los gráficos muestran los niveles de actividad de XI para pCHI3, pCHI4 y pCHI5, respectivamente, en comparación con los niveles de actividad de XI para los promotores nativos, cuyas partes forman el promotor quimérico respectivo y los niveles de actividad de XI para un promotor del estado de la técnica, por ejemplo, el promotor nativo de PGK1 de 5. cerevisiae.
Figura 7: representa una comparación de la correlación de los niveles de transcripción frente a la actividad enzimática para pCHI3, pCHI4 y pCHI5, respectivamente, para células cultivadas en glucosa, xilosa o etanol.
Claims (8)
1. Un promotor quimérico caracterizado por que comprende dos o más secuencias de oligonucleótidos o partes de las mismas que regulan la transcripción de un gen de una ruta anabólica y/o catabólica y aumentan el nivel de transcripción de un ARN tipificado como un fragmento de ARN mensajero que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en enzimas, proteínas estructurales, coenzimas, transportadores, anticuerpos, hormonas y reguladores, como el fragmento de ARN regulador, como el fragmento de ARN enzimáticamente activo o como el fragmento de ARN de transferencia, dicho promotor quimérico se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 o SEQ ID NO.1.
2. Un promotor quimérico según la reivindicación 1, en el que el nivel de transcripción del fragmento de ARN en una célula huésped de levadura aumenta cuando se cultiva la célula huésped de levadura transformada con al menos un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico en una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, xilosa, etanol y combinaciones de los mismos.
3. Un promotor quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enzima es una enzima modificadora de carbohidratos o un transportador.
4. Un promotor quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enzima es una enzima modificadora de carbohidratos seleccionada del grupo que consiste en EC 5.1.3, EC 5.3.1, EC 2.7.1, EC 2.2.1, EC 1.1.1, EC 5.3.1.4, EC 2.7.1.16, EC 5.1.3.4 y una combinación de los mismos, o un transportador seleccionado de TC 2.A.1.1, TC 2.A.1.2 y una combinación de los mismos.
5. Un promotor quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el promotor comprende factores de unión a la transcripción seleccionados del grupo que consiste en REB1, GCR1, GCR2, PHD1, TYE7, PHO2, PHO4, AZF1 y una combinación de los mismos.
6. Un fragmento de ADN recombinante que comprende el promotor quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Un plásmido de expresión que comprende al menos un fragmento de ADN recombinante según la reivindicación 6.
8. Una célula huésped transformada con al menos un fragmento de ADN recombinante según la reivindicación 6 o transformada con al menos un plásmido de expresión según la reivindicación 7.
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