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WO2006010838A2 - Produits contenant au moins un principe actif anticancereux peu diffusible et un principe actif immunostimulant - Google Patents

Produits contenant au moins un principe actif anticancereux peu diffusible et un principe actif immunostimulant Download PDF

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WO2006010838A2
WO2006010838A2 PCT/FR2005/001612 FR2005001612W WO2006010838A2 WO 2006010838 A2 WO2006010838 A2 WO 2006010838A2 FR 2005001612 W FR2005001612 W FR 2005001612W WO 2006010838 A2 WO2006010838 A2 WO 2006010838A2
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WO
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cpg
products according
tumor
group
odn
Prior art date
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PCT/FR2005/001612
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WO2006010838A3 (fr
Inventor
Caroline Robert
Lluis Mir
Antoine Carpentier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
OLIGOVAX
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Gustave Roussy (IGR)
Universite Paris Descartes
Original Assignee
OLIGOVAX
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Gustave Roussy (IGR)
Universite Paris Descartes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to AU2005266225A priority patent/AU2005266225A1/en
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Publication of WO2006010838A3 publication Critical patent/WO2006010838A3/fr
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to products used in combination for effective treatment of tumors and more particularly metastases.
  • Immunotherapy in the treatment of cancers aims to stimulate the immune system to destroy tumor cells.
  • Different approaches can be used: vaccination against one or more tumor antigens, amplification of a pre-existing antitumor response (such as, for example, amplification of cytotoxic lymphocytes infiltrating the tumor), use of monoclonal antibodies directed against a tumor antigen, or dendritic cells loaded with tumor extracts or antigens (reviewed by Turtle CJ et al., Dendritic cells in tumor immunology and immunotherapy, Curr Drug Targets, 2004 5: 17-39, Chaput N et al, Exosome-based immunotherapy, Cancer Immunol Immunother 2004; 53: 234-9; Parish CR et al., Cancer immunotherapy: the past, the present and the future, Immunol Cell Biol., 2003 81: 106-13).
  • amplification of a pre-existing antitumor response such as, for example, amplification of cytotoxic lymphocytes infiltrating the tumor
  • Another strategy is to activate the immune system broadly to stimulate innate immunity and to initiate or amplify a specific immune response.
  • immunostimulatory agents are, inter alia, bacterial extracts (Jaeckle KA et al (1990), J. Clin Oncol 8 (8) pp 1408-18), IL-2 (Herrlinger U. et al (1996), J. Neurooncol 27 (3) pp 193-203), IL-12 (Kishima H. et al (1998), Br J. Cancer 78 (4) pp 446-53 Jean WC et al (1998), Neurosurgery 42 (4) pp 850-6), bacterial DNA (MY-I) (Tokunaga T. et al (1984), MCI 72 pp 955-62), or poly (I, C) (Ewel, CH et al (1992), Cane Res 52: 3005).
  • Synthetic oligodeoxynucleotides containing such motifs (CpG-ODN) retain marked immunostimulatory properties, particularly phosphorothioate ODNs that are resistant to nucleases.
  • TLR9 predominates in B lymphocytes and plasmocytoid dendritic cells (pDC), whereas the expression is broader in mice including myeloid lineage and microglia [Hornung V, Rothenfusser Set al, J Immunol 2002; 168, 4531-4537].
  • B cells are activated by CpG-ODN, resulting in the secretion of cytokines such as IL-6 or IL-10, cell proliferation, inhibition of apoptosis induced by various agents and secretion immunoglobulin [reviewed by Klinman DM, Nat Rev Immunol 2004; 4: 249-59; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004; 6: 88-95; Carpentier AF et al, Front Biosci 2003; 8: El 15-27].
  • cytokines such as IL-6 or IL-10
  • cell proliferation inhibition of apoptosis induced by various agents and secretion immunoglobulin
  • pDCs Activation of human pDCs leads to their maturation, the secretion of many cytokines such as TNF ⁇ , interferon alpha or gamma, IL-6 or IL-12 and the expression of co-stimulatory molecules (CD40, CD80, CD86) and CCR7, a receptor controlling migration to ganglion T regions. While pDCs are directly activated by CpG-ODNs, activation of human myeloid dendritic cells appears indirect through cytokines [reviewed by Klinman DM, Nat Rev Immunol 2004; 4: 249-59; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004; 6: 88-95].
  • Activation of monocytes by secreted cytokines can induce, among others, the secretion of CXCL10 which promotes the antitumor immune response and which also has anti-angiogenic properties (Strieter RM et al (1995), J Biol Chem, 270; -57).
  • CpG-ODNs Activation of T-cells and NK cells by CpG-ODNs depends on cytokines secreted by DCs (dendritic cells) and B cells. Secretion of IL-12 and IFN gamma directs the response to the ThI profile , and can even transform a Th2 response into ThI. In addition, DCs can then activate CD8 lymphocytes independently of CD4 helper lymphocytes [reviewed by Klinman DM, Nat Rev Immunol 2004; 4: 249-59; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004; 6: 88-95].
  • oligonucleotide The biological activity of an oligonucleotide depends on many variables, still imperfectly known, such as, for example, the nucleotide sequences surrounding the CpG motif or the number of CpG motifs. Some oligo- immunostimulatory nucleotides without CpG motifs have even been described (for example in US Application 2004-0006032).
  • the chemical modification of the backbone naturally constituted in the DNA by the phophodiesters bonds (sensitive to nucleases), plays a key role both by improving the stability of the ODN but also by modifying its immunostimulatory properties.
  • Several types of stabilized oligonucleotides have been created (Iyer RP (1999) Curr Opinion Mol Therap 1; 344-358).
  • CpG-ODNs are phosphorothioate oligodeoxynucleotides, or mixed phosphorothioate / phosphodiester oligodeoxynucleotides (eg, phosphorothioate / phosphodiester end-points, or phosphorothioate ODNs, with the exception of cytosine-guanosine linkages which are phosphodiesters).
  • the oligodeoxynucleotides synthesized can also be purified according to their stereoisomerism to modify or improve their biological activity.
  • the priming of the immune response by the direct stimulation of the dendritic cells and the selection by the immune system of an ade ⁇ quat antigen with an ThI type immune response.
  • the efficacy of the immune response the activation of macrophages and NK cells makes it possible to increase antitumour cytotoxicity, either directly or through antibodies (antibody-dependent cell cytotoxicity or ADCC).
  • ADCC antibody-dependent cell cytotoxicity
  • the generally weak expression of MHC I by the tumor cells can be induced, making them more sensitive to the cytotoxicity of the T lymphocytes.
  • CNS 1 intracerebral glioma
  • CNS 1 intracerebral glioma
  • NK cells In vivo depletion of NK cells decreases or abolishes the anti-tumor effects of CpG-ODN [Carpentier AF, Chen L, Maltonti F, Delattre JY. Cancer Res 1999; 59, 5429-5432].
  • CD8 + lymphocytes are required in most animal models, whereas CD4 cell depletion appears to have less impact [Lanuti M, Rudginsky S, Force SD, et al. Cancer Res 2000; 60, 2955-2963; Kawarada Y, Gans R, Garbi N, et al. J Immunol 2001; 167, 5247-5253].
  • CpG-ODNs can also be used for the manufacture of vaccines, being very effective adjuvants with most antigens, unless these are purely polysaccharide in nature [Krieg AM. Annu Rev Immunol 2002; 20: 709-60; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004; 6: 88-95]. CpG-ODNs have been found to be the most effective adjuvants for the induction of cytotoxic Th1 immune responses with antigen-specific CD4 and CD8 T cells [Zwaveling S, Ferreira Mota SC, Nouta J, et al. J Immunol 2002; 169: 350-8; Miconnet I, Koenig S, Amsterdamr D, et al. J Immunol.
  • CpG-ODN The direct conjugation between the antigen and the CpG-ODN makes it possible to reduce the amount of antigen required [Tighe H, Takabayashi K, Schwartz D, et al. J Allergy Clin Immunol. 2000; 106: 124-34.].
  • the effectiveness of CpG-ODN is further enhanced by combination with other adjuvants such as aluminum hydroxide, QS21, MPL or GMCSF [Miconnet I, Koenig S, thoughr D, et al. CpG are effective adjuvants for specifying CTL induction against antigen-derived peptide tumor. J Immunol.
  • CpG-ODN monoclonal antibodies
  • ADCC antibody-mediated cytotoxicity
  • PHerceptin® in breast cancers
  • Rituxan® in non-Hodgkin lymphoma.
  • This combination can also utilize CpG-ODN as inducers at the tumor cell level of the expression of a molecule against which a monoclonal antibody exists.
  • CpG-ODN induce the expression of CD25 (IL2R) on the surface of a B lymphoma line, thus making these cells more sensitive to the action of an anti-CD25 immunotoxin [Decker T, Hipp S, Kreitman RJ, et al. Blood 2002; 99, 1320-1326].
  • CpG-ODN to stimulate in vitro or in vivo dendritic cells. This stimulation can be done in combination with other immune adjuvants or cytokines, with various antigens, or tumor extracts (Krieg AM, Annu Rev Immunol 2002; 20: 709-60; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004; 88-95).
  • TLR9 or CpG-ODN ligands for cancer immunotherapy can be combined with other therapies, including surgery, radiotherapy, chemotherapies, other immunotherapies and differentiating therapies.
  • CpG-ODN activation of non-specific immunity is local and only persists for the duration of the treatment.
  • the ability of CpG-ODN to induce a good specific immune response capable of acting at a distance and over time is therefore crucial for metastatic cancers. This is illustrated by the preliminary results of a clinical trial in melanomas where local responses were observed but without a distant response (no systemic effect) (Trefzer U. et al., 2 nd International Symposium "Activating immunity with CpG oligos", Amelia Island, Florida, October 7-10, 2001).
  • a tumor destruction by an electrochemotherapy technique associated with a suitable stimulation of the immune system leads to an antitumor therapy with a remote effect (systemic effect) that is particularly effective, particularly as regards concerns metastases.
  • the inventors have in particular found that the combination of ligands (natural or synthetic) TLR (Toll-like Receptor), in particular immunostimulatory oligodeoxynucleotides (ODN) and an optimized chemotherapy protocol makes it possible to obtain an effective action on metastases.
  • ligands natural or synthetic
  • TLR Toll-like Receptor
  • ODN immunostimulatory oligodeoxynucleotides
  • the subject of the present invention is therefore products containing at least one low-diffusible anti-cancer active ingredient and an immunostimulatory active ingredient selected from the group consisting of TLR ligands, as a combined preparation for simultaneous, separate or spread use. over time, for the treatment of benign or malignant tumors, particularly solid tumors, and more particularly metastases, in a subject suffering from a tumor and subjected to electropermeabilization at the level of said tumor.
  • the electropermeabilization is performed at a healthy tissue selected appropriately.
  • the combined preparation of said products further comprises antigens, for example in the form of purified antigens specific for tumor, tumor extracts, irradiated or modified tumor cells, said antigens preferably being administered locally.
  • the electropermeabilization effec ⁇ killed on a healthy tissue has the advantage of locally promoting the recruitment of immune cells.
  • Electrochemotherapy (Mir et al., 1991a, Belehradek et al., 1991) combines the in situ administration of non-permeant (or non-diffusible) or poorly permeable (or poorly diffusible) anti-cancer molecules and the application of impulses. permeabilizing electric.
  • bleomycin a non-permeating molecule, that does not diffuse through the cell membrane, already used in conventional chemotherapy.
  • ECT has been used to enhance the transfection of antisense oligonucleotides or plasmids (Ivanov MA et al., J. Mede Gene, 2003, 5, 893-899, US Patent Nos. 5,547,467, 5,749,847 and 6,763,264) or the immunostimulatory molecules such as interleukin 12 (Kishida T et al., Mol Ther, 2003, 8, 738-745),
  • the electropermeabilization of cells exposed to electrical impulses is a phenomenon known for thirty years. It results from the transmembrane potential difference generated by an external electric field on the surface of the cells exposed to this field. When this transmembrane potential difference exceeds a certain threshold value (Teissié et al., 1993), for a sufficiently long time (Kotnik et al., 2003), the transient and reversible permeabilization of the cells can be obtained without causing tissue lesions. .
  • the intensity of the applied electric field depends on the voltage and the distance between the electrodes. It can vary from 20 to 2000 V / cm. Electrical pulses can range from 3 to 8; they generally have a duration of 100 ⁇ s and are delivered at a frequency of 1 to 5000 Hz.
  • the electropermeabilization of the cells of a tumor can be obtained, for example, by the exposure of this tumor to 3-8 electrical pulses of 100 microseconds and 1300 V / cm delivered at the repetition rate of 1 Hz per hour. intermediate of two electrodes placed on the skin on either side of the tumor nodule to be treated. Obviously, it is a local treatment, restricted to the volume between the electrodes and subjected to an electric field intensity higher than the threshold value which allows to permeabilize the cells included in this volume: bleomycin, previously administered , will only penetrate the electropermeabilized cells and only the latter will actually be killed.
  • the TLR ligands are immunostimulatory oligodeoxynucleotides (ODNs), whether their structure is natural, synthetic or chimeric.
  • the TLR ligands are more specifically TLR9 ligands and more particularly immunostimulatory CpG-ODNs.
  • said immunostimulatory CpG-ODNs are selected from the group consisting of a stabilized oligodeoxynucleotide which comprises at least one quadrameric unit of formula X 1 -C 2 -X 2 , in which X 1 and X 2 are identical or different and represent T or A.
  • said immunostimulatory CpG-ODNs are selected from the group consisting of a stabilized oligodeoxynucleotide which comprises at least one quadrameric unit of formula X 1 -C 2 -X 2 , in which X 1 and X 2 are identical or different and represent T or A.
  • CpG-ODN is preferably selected from the group consisting of an oligodeoxynucleotide which comprises at least one quadrameric sequence selected from the group consisting of: TCGA, ACGT, ACGA and TCGT.
  • said CpG-ODN is preferably selected from the group consisting of an oligodeoxynucleotide which comprises at least one hexameric sequence selected from the group consisting of: AACGTT, GACGTC, GACGTT, GTCGTT, TTCGAA, TACGTA , ATCGAT, TTCGTT and ATCGTT.
  • said CpG-ODN is preferably selected from the group consisting of an oligonucleotide which comprises at least the following octameric sequence: AACGTT-X 3 X 4, wherein X 3 X 4 is AT, AA, CT or TT and preferably the octameric sequence AACGTTAT.
  • said CpG-ODN is CpG-ODN of sequence SEQ ID NO: 1.
  • the immunostimulatory active ingredient is a CpG-ODN selected from the group consisting of by a stabilized oligonucleotide which comprises at least one octameric unit of the type: 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-XiX 2 -3 ', in which the XiX 2 pair is AT, AA, CT or TT.
  • the said CpG-ODN selected from the group consisting of by a stabilized oligonucleotide which comprises at least one octameric unit of the type: 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-XiX 2 -3 ', in which the XiX 2 pair is AT, AA, CT or TT.
  • ODN is preferably selected from the group consisting of an oligonucleotide which comprises at least one octameric sequence selected from the group consisting of: GACGTT-X 1 X 2 , AGCGTT-X, X 2 , GGCGTT-XiX 2 , AACGTC-X 1 X 2 , GACGTC-X 1 X 2 , AGCGTC-X 1 X 2 and GGCGTC-XiX 2 , wherein X 1 -X 2 is AT, AA, CT or TT.
  • said CpG-ODN is chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 41.
  • the immunostimulatory oligonucleotides can be used in the form of single-strand or double-strand, can include several immunostimulatory sequences adjacent or not. They may also include other biologically active sequences, such as antisense sequences or aptamers.
  • the stabilized oligonucleotides can be coupled by covalent, ionic or weak bonds to one or more other molecules that can increase their tumor affinity, modify their biological activity or increase their immunostimulatory activity.
  • the anti-cancer active principle is a substance usually used in chemotherapy; Cancer chemotherapy is based on the use of cytotoxic substances belonging to two categories of substances: antimetabolites which interferes in particular with the synthesis of nucleic acids (fluorouracil, methotrexate, doxorubicin), proteins (topoisomerase inhibitors) or other essential metabolic processes such as mitosis (vincristine) and genotoxic substances that modify the structure of DNA as scribing agents (bleomycin) or intercalating agents, in particular alkylating agents (cyclophosphamide, lomustine, temozolomide, platinum derivatives (cisplatin or cis-diaminedichloroplatinum, cDDP or DDP), nitrosourea derivatives (fotemustine or [[(2-chloroethyl) 3-nitro-3-uretido] -1-ethyl-diethyl phosphonate (RS).
  • the anti-cancer active ingredient is selected from the group consisting of cytotoxic substances (antimetabolites and genotoxic substances).
  • the anti-cancer active principle is preferably a genotoxic substance and even more preferably bleomycin.
  • the cells of the tumor are electropermeabilized by exposing said tumor cells to electrical pulses of sufficient strength or intensity and duration to allow the electroporation of said cancer cells; they are preferably electropermeabilized subsequently to the administration of said products; said cells can also be electropermeabilized prior to the administration of said products.
  • the intensity of the applied electric field varies between 20 and 2000 V / cm. According to an advantageous arrangement of this embodiment, the intensity of the applied electric field preferably varies between 500 and 1500 V / cm and preferably between 800 and 1300 V / cm. According to yet another advantageous embodiment of said products, the frequency of the pulses varies from 0.01 to 10,000 Hz.
  • the frequency of the pulses preferably varies from 1 to 5,000 Hz.
  • the duration of the pulses varies from 10 ⁇ s to 10 s.
  • the duration of the pulses preferably varies from 50 ⁇ s to 500 ms, and preferably from 100 ⁇ s to 1 ms.
  • the anti-cancer active principle is administered intratumorally, locally or systemically.
  • the immunostimulatory active ingredient is administered intratumorally, locally or systemically.
  • said products are administered in one or more times or in continuous release, in particular by means of osmotic micropumps, or associated with any physical or chemical means, in particular with encapsulating agents such as colloidal dispersion systems and polymers.
  • said products are furthermore associated with another treatment, such as radiotherapy, another cytotoxic substance, a cytolytic substance, an antiangiogenic substance, a differentiating substance, an immunostimulatory substance other than an ODN or products derived from cell therapy, such as dendritic cells.
  • the products according to the invention can be used in the treatment of cancers, whatever their nature and degree of anaplasia, and they make it possible to obtain, surprisingly, a systematic curative effect, particularly on metastases
  • CpG-ODN CpG-ODN
  • ECT ECT
  • OJ OJ
  • SEQ ID NO: 1 administered intratumorally (J1, 8, 15, 22) on two opposing LPB tumors (Mean ⁇ EC).
  • FIG. 2 is a detailed mouse-by-mouse representation of the effect of electrochemotherapy (OJ) and CpG-ODN (SEQ ID NO: 1) treatment (J1,
  • FIG. 3 illustrates the effect of the ECT + CpG-ODN combination (SEQ ID NO: 1) in the B16OVA tumor model (7 mice per group).
  • FIG. 4 illustrates the effect of electroporation of a CpG-ODN
  • FIG. 5 is a mouse representation of the effect of electroporation of a CpG-ODN (SEQ ID NO: 1) at J1, 8, 15, 22 intratumorally on two opposing LPB tumors.
  • A evolution of the left tumor (treated).
  • B evolution of the right tumor (untreated).
  • S mouse
  • FIG. 6 represents the monitoring of the TCD8 response in the homolateral inguinal ganglion of immunized, treated and untreated mice.
  • A visualization of lymphocytes.
  • B isolation of TCD8.
  • C isolation of specific TCDS from SIINFEKL. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they in no way constitute a limitation.
  • EXAMPLE 1 MATERIALS AND METHODS
  • mice Female C57BL / 6H- 2b mice of 8-20 weeks were used for the establishment of tumor models. These mice from the January Breeding Center (Le Genest, St IsIe, France) were all raised in the service of the small animal of the Gustave Roussy Institute in accordance with the guide of the Ethical Committee of Animal Experimentation. The mice were all humanly sacrificed by inhalation of CO 2 .
  • Tumor cell lines The LPB and B 160VA lines were cultured in vitro at 37 ° C under 5% CO 2 . LPB cells are derived from methylcholanthrene-induced sarcoma in C57BL / 6 mice.
  • the stable Bl 6OVA line generously provided by Dr. KL Rock (UMass Medical School, Worcester, MA, USA) is derived from a murine melanoma transfected with the gene encoding ovalbumin chicken protein (OVA).
  • mice were anesthetized with 150 ⁇ l of a mixture of xylazine (Bayer Pharma, Puteaux, France) at 12.5 mg / kg and ketamine (Parke Davis, Courbevoie, France) at 125 mg / kg injected intraperitoneally before being treated by electroporation or electrochemotherapy.
  • Poligodeoxinucleotide containing multiple unmethylated CpG motifs (5'-TAAACGTTATAACGTTATGACGTCAT-3 ') (SEQ ID NO: 1). Fifty micrograms of CpG oligodeoxinucleotides diluted in 100 .mu.l of 0.9% NaCl were injected intratumorally the day after ECT, once a week for four weeks.
  • the cells were harvested to resuspend at a concentration of 2.2 ⁇ 10 7 / ml in MEM-S (MEM without calcium, Gibco).
  • Aliquots of 10 6 cells / 45 ⁇ l were mixed with 5 ⁇ l of 0.9% NaCl or 5 ⁇ l of CpG varying from a concentration of 5 to 60 ⁇ M.
  • the 50 ⁇ l mixture was then placed between 2 electrodes spaced 2 mm apart and immediately the electric shock was delivered (8 pulses of 100 ⁇ s for an electric field of 1000 V / cm and a frequency of 1 Hz).
  • the cells were diluted in complete MEM and cultured in triplicate in petri dishes 6 cm in diameter (500 cells / ml). Cell proliferation was estimated after 5 days of culture. For this, the cells were first fixed with formaldehyde for 20 minutes and then stained with crystal violet for 15 minutes.
  • a tumor model was created by injecting 5 ⁇ 10 5 B16OVA cells into 50 ⁇ l of RPMI1640 in the right thigh of the mice. After 14 days, the tumor was approximately 5 mm and was treated with ECT (OJ) followed by CpG immunotherapy at J1. In addition, 3 mice were immunized by peptide injection directly into the plantar pad at Jl: 45 ⁇ g of peptide SIINFEKL (Eurogentec) derived from ovalbumin mixed in 50 ⁇ g of ODN-CpG. Seven days after this treatment, all the mice were sacrificed to remove inguinal ganglia. The ganglia were mechanically crushed in 100 ⁇ m filters and the ganglion cells were harvested in RPMI 1640.
  • Part of the cells (1-2.10 6) was labeled with tetrameric H-2 b / SIINFEKL coupled to PE (Beckman Coulter, Fullerton, CA) diluted l / 100th for half an hour at room temperature and tempé ⁇ the dark and then with an anti-CD3-FITC and anti-CD8-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA) diluted l / 100th during the same period of incubation.
  • the cells were then washed once in IX PBS and fixed in 200 .mu.l of 1% paraformaldehyde before being analyzed with the FACScalibur cytofiuimeter using the CellquestPro software.
  • Fig. IB The remote antitumor effect was assessed by measuring contralateral tumors.
  • simple treatments did not allow stabilization but were associated with a slowdown in tumor proliferation compared with the control group (Fig IB).
  • the fibrosarcoma model was reproduced by also implanting 10 6 160VA B cells on the left and right flanks of the mice and respecting the 3-day interval between the two injections. Tumors were treated as described previously 9 days after cell implantation. Only one experiment currently in progress is described from the day of the beginning of the OJ treatment (Fig. 3). The survival rates at the 18 th day of treatment are 28.6%, 71.4%, 14.3% and 85.7% for the EP + NaCl, EP + CpG, ECT + NaCl and ECT + CpG groups respectively. .
  • TLR9 The innate immune system detects unmethylated CpG motifs by TLR9 in mice (26). TLR9 are expressed intracellularly precisely at the level of the endoplasmic reticulum (30). Increasing the intracellular concentration of CpG-ODN increases their stimulatory activity (31). The hypothesis of a better efficiency of CpG-ODN when electroporated in vivo in our double LPB tumor model was tested.
  • a tumor model was created by injecting 500,000 Bl 6 OVA cells into the cell. leg of animals. This model made it possible to easily treat animals with ECT at OJ and intratumoral CpG at J1. Five groups of 3 mice were created: a group whose tumor-free mice were immunized with the peptide SIINFEKL mixed in CpG on day 1 immunotherapy, three groups treated with ECT + CpG or ECT + NaCl or CpG alone and one untreated group.
  • the animals were sacrificed to collect the ipsilateral and contralateral inguinal ganglion from each mouse.
  • the possible presence of specific cytotoxic T lymphocytes in the ipsilateral ganglion was investigated ex vivo by labeling with soluble tetramers recognizing H- 2b / SIINFEKL.
  • the contralateral inginal ganglions served us as a negative internal control. Only one experiment of this type has been conducted to date, but another is underway.
  • FIG. 6 A flow cytometric analysis representative of all of the groups is shown in Figure 6.
  • the viable cell population we selected CD3 / CD8 T cells (G2 window) in which the percentage of lymphocytes recognized by the tetramer was determined. This type of analysis was performed for all the groups of the experiment, however no positive labeling was detected including in the control group immunized by the peptide (Fig. 6C). Interferon ⁇ secretion was not found in the supernatant of cultures stimulated in vitro by the peptide. All these results show that the ECT combination associated with CpGs has both local and remote effects.
  • the combination according to the invention which targets the immune response more generally and upstream by involving both innate immunity via stimulation of NK and macrophages and the innate hinge acquired by activating the CD makes it possible to obtain an effective antitumor response.
  • the Bl 6 OVA melanoma model made it possible to test the effectiveness of the combination according to the invention on another type of tumor other than fibrosarcoma allowing the analysis of the immune response by the expression of the SIINFEKL peptide by the tumor.
  • this tumor line proved to be very aggressive and resulted in deaths rapidly not allowing to evaluate the evolution of the tumors, in the double tumor model, and thus to conclude as to the local and distant effects of the treatment.
  • this first experience showing a survival rate higher than other groups to ECT + CpG combination in the 18th day of treatment, encouraged to develop a more appropriate model to analyze local and systemic therapeutic effect.
  • TLR9 signed after translocating from the ER to CpG DNA in the lysosome. Nat Immunol 5: 190.
  • Electrochemotherapy a new antitumor treatment: first clinical trial - Electrochemotherapy, a novel antitumor treatment: first clinical trial. Proceedings of the Academy of Sciences, ser. III, 313, 613-618 (1991b).

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Abstract

Produits utilisés en combinaison, en vue d'un traitement efficace des tumeurs et plus particulièrement des métastases. Lesdits produits contiennent au moins un principe actif anticancéreux peu diffusible et un principe actif immunostimulant sélectionné dans le groupe constitué par des ligands de TLR en tant que préparation combinée pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement des tumeurs bénignes ou malignes et plus particulièrement des métastases, chez un sujet atteint d'une tumeur et soumis à une électroperméabilisation au niveau de ladite tumeur ou au niveau d'un tissu sain approprié.

Description

PRODUITS CONTENANT AU MOINS UN PRINCIPE ACTIF ANTICANCEREUX PEU DIFFUSIBLE ET UN PRINCIPE ACTIF
IMMUNOSTIMULANT
La présente invention est relative à des produits utilisés en combi- naison, en vue d'un traitement efficace des tumeurs et plus particulièrement des métastases.
Les trois principaux traitements anticancéreux sont la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. Cependant, l'efficacité de ces thérapies est souvent insuffisante dans le cas des cancers métastatiques en raison de la taille et du nombre des tumeurs. Il est donc nécessaire de disposer de nouvelles approches thérapeutiques.
Ainsi, l'efficacité des thérapeutiques conventionnelles chirurgicales ou à visée cytolytique (chimiothérapie et radiothérapie) reste très limitée dans de nombreux cancers. Pour les glioblastomes par exemple, dont le traitement repose principalement sur l'exérèse chirurgicale et l'irradiation cérébrale locale, la médiane de survie est de l'ordre de 12 mois. Une chimiothérapie complémentaire allonge la survie chez les patients de moins de 60 ans, mais de façon très modeste, de moins de 3 mois. Sous ce triple traitement, la médiane de survie reste inférieure à 15 mois (Behin et al, Lancet 2003).
L'immunothérapie dans le traitement des cancers vise à stimuler le système immunitaire afin de détruire les cellules tumorales. Différentes approches peuvent être utilisées : vaccination contre un ou plusieurs antigènes tumoraux, amplification d'une réponse antitumorale préexistante (comme par exemple amplifi¬ cation de lymphocytes cytotoxiques infiltrant la tumeur), utilisation d'anticorps mono- clonaux dirigés contre un antigène tumoral ou de cellules dendritiques chargées avec des extraits ou des antigènes tumoraux (revue par Turtle CJ et al. Dendritic cells in tumor immunology and immunotherapy. Curr Drug Targets. 2004 5: 17-39 ; Chaput N et al, Exosome-based immunotherapy. Cancer Immunol Immunother. 2004 ; 53:234- 9 ; Parish CR. et al. Cancer immunotherapy: the past, the présent and the future. Immunol CeIl Biol. 2003 81 :106-13). Malheureusement, alors que les modèles animaux sont souvent convaincants, les essais cliniques d'immunothérapie chez l'homme n'ont pas encore trouvé leur place dans l'arsenal thérapeutique et les incertitudes concernant l'optimisation de ces paramètres sont encore très nombreuses. En particulier, le type d'antigène tumoral ainsi que sa voie d'administration sont encore des paramètres en cours d'évaluation.
Une autre stratégie consiste à activer le système immunitaire de façon large afin de stimuler l'immunité innée et d'amorcer ou d'amplifier une réponse immunitaire spécifique. Parmi ces agents immunostimulants, on peut citer, entre autres, les extraits bactériens (Jaeckle K. A. et al. (1990), J. Clin. Oncol. 8(8) pp 1408-18), l'IL-2 (Herrlinger U. et al. (1996), J. Neurooncol. 27(3) pp 193-203), l'IL- 12 (Kishima H. et al. (1998), Br. J. Cancer 78(4) pp 446-53 ; Jean W. C. et al. (1998), Neurosurgery 42(4) pp 850-6), l'ADN bactérien (MY-I) (Tokunaga T. et al. (1984), MCI 72 pp 955-62), ou le poly (I,C) (Ewel, C. H. et al (1992). Cane. Res. 52:3005).
Les propriétés immunostimulantes de l'ADN ont été découvertes en 1984, lorsqu'il a été observé que l'ADN de Mycobacterium tuberculosis activait in vitro et in vivo les cellules NK [Tokunaga T, et al. J Natl Cancer Inst 1984; 72: 955- 962]. Plusieurs études ont ensuite montré que ces propriétés immunostimulantes étaient généralement en rapport avec des motifs 5'-CG non méthylés, motifs sous- représentés dans l'ADN des vertébrés [Krieg AM et al. Nature 1995; 374: 546-549 ; Yamamoto S et al J Immunol 1992; 148: 4072-4076 ; Demandes US 2004-0006034 ; 2003-0212029 ; Brevets US 6,653,292 ; U.S. 6,239,116 ; U.S. 6,207,646 ; U.S 6,194,388 ; US 6,429,199, US 6,406,705, US 6,218,371, US 6,214,806, US 6,218,371, 6,727,230, Demandes Internationales PCT WO 01/51500, WO 03/035695, Demande de Brevet Européen n° 1 162 982]. Les oligodésoxynucléotides synthétiques (ODN) contenant de tels motifs (CpG-ODN) gardent des propriétés immunostimulantes marquées, particulièrement les ODN phosphorothioates qui sont résistants aux nucléases.
La stimulation du système immunitaire par des CpG-ODN ou de l'ADN bactérien requiert leur pénétration intracellulaire, probablement par endocy- tose. Après dégradation dans le milieu acide des endosomes, les motifs CpG sont reconnus de façon spécifique par un membre de la famille des Toll-like receptors, le TLR9, exprimé au sein des endosomes. L'activation intracellulaire après liaison au TLR9 dépend des protéines MyD88, IRAK et TRAF6, qui à leur tour activent les voies des MAP kinases et du NFKB [Hacker H, Curr Top Microbiol Immunol 2000 ; 247: 77-92 ; Hemmi H, et al. Nature 2000; 408, 740-745 ; Takeshita Fet al, J Immunol 2001; 167, 3555-8]. Chez l'homme l'expression de TLR9 prédomine au niveau des lymphocytes B et des cellules dendritiques plasmocytoïdes (pDC), alors que l'expression est plus large chez la souris incluant la lignée myéloïde et la microglie [Hornung V, Rothenfusser Set al, J Immunol 2002; 168, 4531-4537].
Les lymphocytes B sont activés par les CpG-ODN, résultant dans la sécrétion de cytokines comme par exemple l'IL-6 ou l'IL-10, la prolifération cellulaire, l'inhibition de l'apoptose induite par divers agents et la sécrétion d'immunoglobulines [revue par Klinman DM, Nat Rev Immunol 2004 ; 4: 249-59 ; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004 ; 6: 88-95 ; Carpentier AF et al, Front Biosci 2003 ; 8: El 15-27].
L'activation des pDC humaines entraîne leur maturation, la sécrétion de nombreuses cytokines comme le TNFα, l'interféron alpha ou gamma, PIL-6 ou l'IL-12 et l'expression de molécules de co-stimulation (CD40, CD80, CD86) et de CCR7, un récepteur contrôlant la migration vers les zones T ganglionnaires. Alors que les pDC sont directement activées par les CpG-ODN, l'activation des cellules dendri¬ tiques myéloïdes humaines semble indirecte par le biais de cytokines [revue par Klinman DM, Nat Rev Immunol 2004 ; 4: 249-59 ; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004 ; 6: 88-95]. L'activation des monocytes par les cytokines sécrétées peut induire, entre autres, la sécrétion de CXCL10 qui favorise la réponse immunitaire antitumorale et qui possède également des propriétés anti-angiogéniques (Strieter RM et al (1995), J Biol Chem, 270 ; 27348-57).
L'activation des lymphocytes T et des cellules NK par les CpG- ODN dépend des cytokines sécrétées par les DCs (cellules dendritiques) et les lymphocytes B. La sécrétion d'IL-12 et d'IFN gamma oriente la réponse vers le profil ThI, et peut même transformer une réponse Th2 en ThI. De plus, les DCs peuvent alors activer les lymphocytes CD8, indépendamment des lymphocytes CD4 helper [revue par Klinman DM, Nat Rev Immunol 2004 ; 4: 249-59 ; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004; 6: 88-95]. L'activité biologique d'un oligonucléotide dépend de nombreuses variables, encore imparfaitement connues, comme par exemple les séquences des nucléotides entourant le motif CpG ou le nombre de motifs CpG. Quelques oligo- nucléotides immunostimulants sans motifs CpG ont même été décrits (par exemple dans la Demande US 2004-0006032). La modification chimique du squelette naturellement constitué dans l'ADN par les liaisons phophodiesters (sensibles aux nucléases), joue un rôle primordial à la fois en améliorant la stabilité de l'ODN mais aussi en modifiant ses propriétés immunostimulantes. Plusieurs types d'oligo- nucléotides stabilisés ont ainsi été créés (Iyer RP (1999) Curr Opinion Mol Therap 1 ; 344-358). Les CpG-ODN les plus fréquemment utilisés sont les oligodésoxy- nucléotides phosphorothioates, ou des oligodésoxynucléotides mixtes phosphoro- thioates/phosphodiesters (par exemple extrémités phosphorothioates/centre phospho- diester ; ou des ODN phosphorothioates, à l'exception des liaisons cytosine-guanosine qui sont phosphodiesters). Les oligodésoxynucléotides synthétisés peuvent également être purifiés en fonction de leur stéréoisomérie pour modifier ou améliorer leur activité biologique.
L'activité immunostimulante d'oligonucléotides synthétiques très modifiés, en raison de la présence de bases purines ou pyrimidines non naturelles (Kandimalla ER et al, Nucleic acids Research, 2003, 31 ; 2393-2400 ; Demandes US 2003-0181406 ; 2002-0137714 ; Brevet US 6,562,798 ; Demande US 2003-0186912), de molécules chimériques ADN/ARN ou d'ODN-linker-ODN (Demande US 2004- 0052763 ; Bhagat L et al, BBRC, 2003, 300 ; 853-861 ; Demandes US 2003- 0225016 ; 2003-0199466 ; 2003-0175731) ou l'adjonction de ligands non oligonucléotidiques a également été rapportée (revue par Uhlmann E. et Vollmer J., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 2003, 6, 204-217).
Les activités biologiques précises de chacun de ces oligonucléotides ne sont pas encore parfaitement connues. Trois familles de CpG-ODN ont déjà été caractérisées [revue par Klinman DM, Nat Rev Immunol 2004; 4: 249-59 ; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004; 6: 88-95]. La plus classique, dénommée " type B " (ou " K "), se caractérise par une forte activation des lymphocytes B et des cellules dendritiques, mais une faible sécrétion d'interféron alpha par les pDC. Les ODN de " type A " (ou " D ") se caractérisent par une faible activation des lymphocytes B mais une forte activation des NK et une sécrétion d'interféron alpha par les pDC. Les ODN de type C, les plus récemment décrits, combinent les propriétés des 2 types précédents [revue par Klinman DM, Nat Rev Immunol 2004; 4: 249-59 ; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004; 6: 88-95].
Le fort pouvoir immunostimulant des CpG-ODN (et par extension des ligands de TLR et plus particulièrement les ligands de TLR9) ouvre plusieurs stratégies thérapeutiques dans les cancers. Leur utilisation permet en effet d'activer les deux composantes de la réponse immune :
L'amorçage de la réponse immune : par la stimulation directe des cellules dendritiques et la sélection par le système immunitaire d'un antigène adé¬ quat avec une réponse immune de type ThI.
L'efficacité de la réponse immune : l'activation des macro- phages et des cellules NK permet d'accroître la cytotoxicité anti-tumorale, soit directe, soit par le biais des anticorps (antibody-dependant cell cytotoxicity ou ADCC). De plus, grâce à la sécrétion locale d'IFN gamma, l'expression généralement faible du CMH I par les cellules tumorales peut être induite, les rendant plus sensibles à la cytotoxicité des lymphocytes T. Ces activités biologiques multiples ont ainsi permis le développe¬ ment de plusieurs stratégies dans les cancers :
1. Les CpG-ODN utilisés en monothérapie par voie locale (intra ou péri-tumorale) ou générale (= systémique) peuvent induire le rejet de tumeurs dans presque tous les modèles de tumeurs [Carpentier AF, Auf G, Delattre JY. CpG- oligonucleotides for cancer immunotherapy: review of the literature and potential applications in malignant glioma. Front Biosci 2003; 8: El 15-27]. Par exemple, dans un modèle de gliome intracérébral (CNS 1), plus de 85 % des rats furent guéris par une seule injection locale de CpG-ODN [Carpentier AF, Xie J, Mokhtari K , Delattre JY, Clin Cancer Res 2000; 6, 2469-2473]. La plupart des études ont souligné le rôle conjoint du système immunitaire inné non spécifique et du système immunitaire spéci¬ fique dans le rejet tumoral. La déplétion in vivo des cellules NK diminue ou abolit les effets anti-tumoraux des CpG-ODN [Carpentier AF, Chen L, Maltonti F, Delattre JY. Cancer Res 1999; 59, 5429-5432]. Les lymphocytes CD8+ sont nécessaires dans la plupart des modèles animaux, alors que la déplétion en cellules CD4 semble avoir moins d'impact [Lanuti M, Rudginsky S, Force SD, et al. Cancer Res 2000; 60, 2955- 2963 ; Kawarada Y, Ganss R, Garbi N, et al. J Immunol 2001; 167, 5247-5253]. Quoi qu'il en soit, l'existence d'une mémoire immunitaire à long terme, rapportée par l'ensemble des modèles suggère un rôle pour les lymphocytes CD4 mémoire. De façon intéressante, il a été rapporté que les pDC infiltrant des tumeurs ORL chez l'homme étaient moins sensibles aux CpG-ODN de type A que les pDC sanguines du même patient. Cette résistance s'expliquerait en partie par la sécrétion locale d'IL-10 par les cellules tumorale [Hartmann E, Wollenberg B, Rothenfusser S, et al. Cancer Res. 2003; 63: 6478-87]. Dans un modèle animal, la combinaison de CpG et d'anticorps anti-IL-10 s'est d'ailleurs révélée synergique [Vicari AP, Chiodoni C, Vaure C, et al. J Exp Med 2002; 196, 541-9].
2. Les CpG-ODN peuvent également être utilisés pour la fabrica- tion de vaccins, étant des adjuvants très efficaces avec la plupart des antigènes, sauf si ceux-ci sont de nature purement polysaccharidique [Krieg AM. Annu Rev Immunol 2002; 20:709-60 ; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004; 6: 88-95]. Les CpG-ODN se sont révélés être les adjuvants les plus efficaces pour l'induction des réponses immunitaires ThI cytotoxiques avec lymphocytes T CD4 et CD8 spécifiques de l'antigène [Zwaveling S, Ferreira Mota SC, Nouta J, et al. J Immunol 2002; 169 : 350-8 ; Miconnet I, Koenig S, Speiser D, et al. J Immunol. 2002; 68, 1212-1218]. La conju¬ gaison directe entre l'antigène et les CpG-ODN permet de réduire la quantité d'antigène nécessaire [Tighe H, Takabayashi K, Schwartz D, et al. J Allergy Clin Immunol. 2000; 106: 124-34.]. L'efficacité des CpG-ODN est encore améliorée par la combinaison avec d'autres adjuvants comme par exemple l'hydroxyde d'aluminium, le QS21, le MPL ou le GMCSF [Miconnet I, Koenig S, Speiser D, et al. CpG are effi¬ cient adjuvants for spécifie CTL induction against tumor antigen-derived peptide. J Immunol. 2002; 68, 1212-1218 ; Kim SK, Ragupathi G, Cappello S, et al. Effect of immunological adjuvant combinations on the antibody and T-cell response to vacci- nation with MUCl-KLH and GD3-KLH conjugates. Vaccine. 2000; 19: 530-7 ; Liu HM, Newbrough SE, Bhatia SK, et al. Immunostimulatory CpG oligodeoxynucleo- tides enhance the immune response to vaccine stratégies involving granulocyte- macrophage colony-stimulating factor. Blood 1998; 92, 3730-3736]. Malheureuse¬ ment, les cibles antigéniques sont rarement déterminées dans les cancers, limitant l'intérêt pratique de telles stratégies thérapeutiques. De plus la sélection spontanée d'un clone n'exprimant pas l'antigène permettrait à la tumeur d'échapper à un tel traitement. 3. La combinaison de CpG-ODN et d'anticorps monoclonaux est également intéressante. Elle augmente la cytotoxicité médiée par les anticorps (ADCC) grâce à la stimulation des macrophages et des cellules NK ; plusieurs essais cliniques utilisant cette association ont débuté récemment, avec de PHerceptin® dans les cancers du sein ou du Rituxan® dans les lymphomes non-hodgkiniens. Cette combinaison peut aussi utiliser les CpG-ODN comme inducteurs au niveau de la cellule tumorale de l'expression d'une molécule contre laquelle un anticorps mono- clonal existe. Les CpG-ODN induisent l'expression du CD25 (IL2R) à la surface d'une lignée lymphomateuse B, rendant ainsi ces cellules plus sensibles à l'action d'une immunotoxine anti-CD25 [Decker T, Hipp S, Kreitman RJ, et al. Blood 2002; 99, 1320-1326].
4. L'utilisation des CpG-ODN pour stimuler in vitro ou in vivo les cellules dendritiques a été décrite. Cette stimulation peut se faire en association avec d'autres adjuvants immunitaires ou cytokines, avec divers antigènes, ou extraits tumo- raux (Krieg AM. Annu Rev Immunol 2002; 20:709-60 ; Krieg AM, Curr Oncol Rep 2004; 6: 88-95).
5. Enfin l'utilisation des ligands de TLR9 ou des CpG-ODN pour l'immunothérapie des cancers peut être combinée avec d'autres thérapies, notamment la chirurgie, la radiothérapie, les chimiothérapies, d'autres immunothérapies et des thérapies différenciantes.
A notamment été décrite une utilisation combinée de la chimio¬ thérapie par voie systémique et des CpG-ODN (par voie locale ou systémique). Cette combinaison permet, en théorie, de diminuer la masse tumorale à éliminer par le système immunitaire et d'induire le relargage d'un grand nombre d'antigènes tumo- raux qui serviront à amorcer le système immunitaire. Des résultats positifs de telles approches ont été rapportés par plusieurs auteurs dans quelques modèles tumoraux et avec quelques chimiothérapies comme le cyclophosphamide et le topotecan (Carpentier 2003 précité ; Weigel BJ, et al., Clin. Cancer Res., 2003, 9, 8, 3105-14 ; Balsari A. et al., Eur. J. Cancer, 2004, 40, 8, 1275-81). Cette combinaison n'est cependant pas efficace dans tous les modèles tumoraux. En particulier, certaines tumeurs sont peu ou pas sensibles aux chimiothérapies, limitant ainsi l'utilité clinique d'une combinaison CpG-ODN et chimiothérapie conventionnelle.
L'un des obstacles à surmonter pour obtenir une bonne efficacité des CpG-ODN dans les cancers, est l'induction d'une immunité spécifique. En effet l'activation par les CpG-ODN de l'immunité non-spécifique est locale et ne persiste que pendant la durée du traitement. La capacité des CpG-ODN à induire une bonne réponse immunitaire spécifique capable d'agir à distance et dans la durée est donc déterminante pour les cancers métastatiques. Ceci est illustré par les résultats prélimi¬ naires d'un essai clinique dans les mélanomes ou des réponses locales furent obser- vées, mais sans réponse à distance (pas d'effet systémique) (Trefzer U. et al., 2nd International Symposium « Activating immuni ty with CpG oligos », Amelia Island, Florida, October 7-10, 2001).
De manière surprenante, les Inventeurs ont trouvé qu'une destruc¬ tion tumorale par une technique d'électrochimiothérapie associée à une stimulation adaptée du système immunitaire, conduit à une thérapie antitumorale avec effet à distance (effet systémique) particulièrement efficace, notamment en ce qui concerne les métastases.
Les Inventeurs ont en particulier trouvé que la combinaison de ligands (naturels ou synthétiques) de TLR (Toll-like Receptor), en particulier des oligodésoxynucléotides (ODN) immunostimulants et d'un protocole de chimio¬ thérapie optimisé permet d'obtenir une action efficace sur les métastases.
La présente invention a, en conséquence, pour objet des produits contenant au moins un principe actif anticancéreux peu diffusible et un principe actif immunostimulant sélectionné dans le groupe constitué par des ligands de TLR, en tant que préparation combinée pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement des tumeurs bénignes ou malignes, notamment les tumeurs solides, et plus particulièrement des métastases, chez un sujet atteint d'une tumeur et soumis à une électroperméabilisation au niveau de ladite tumeur.
En variante, l'électroperméabilisation est réalisée au niveau d'un tissu sain sélectionné de manière appropriée.
Dans un tel cas, la préparation combinée desdits produits comprend en outre des antigènes par exemple sous forme d'antigènes purifiés spécifiques d'une tumeur, d'extraits tumoraux, de cellules tumorales irradiées ou modifiées, lesdits antigènes étant de préférence administrés localement.
Selon cette variante de l'invention, Pélectroperméabilisation effec¬ tuée sur un tissu sain, a l'avantage de promouvoir localement le recrutement de cellules immunitaires.
L'électrochimiothérapie (ECT) (Mir et al, 1991a, Belehradek et al, 1991) combine l'administration in situ de molécules anticancéreuses non perméantes (ou non diffusibles) ou peu perméantes (ou peu diffusibles) et l'application d'impulsions électriques perméabilisantes. Parmi les molécules anticancéreuses, qui ont été mises en œuvre dans le cadre d'une ECT, on peut citer la bléomycine, une molécule non perméante, qui ne diffuse pas à travers la membrane de la cellule, déjà utilisée en chimiothérapie classique (Orlowski et al, 1988; Poddevin et al, 1991; Gehl et al, 1999) et le cisplatine et les autres sels du platine ayant des propriétés cyto- toxiques (Sersa et al, 1995; Gehl et al, 1999; Sersa et al, 2003). D'autres molécules peuvent également être mises en œuvre dans le cadre d'une ECT, telles que des substances pro-apoptotiques, anti-angiogéniques, différenciantes ou immuno- stimulantes ; ainsi l'ECT a été utilisée pour améliorer la transfection d'oligonucléotides antisens ou de plasmides (Ivanov MA et al., J. Gène Mede, 2003, 5, 893-899, Brevets US 5,547,467, 5,749,847 et 6,763,264) ou l'administration de molécules immunostimulantes comme Pinterleukine 12 (Kishida T et al., Mol. Ther., 2003, 8, 738-745),
L'électroperméabilisation des cellules exposées à des impulsions électriques est un phénomène connu depuis une trentaine d'années. Il résulte de la différence de potentiel transmembranaire générée par un champ électrique externe à la surface des cellules exposées à ce champ. Lorsque cette différence de potentiel trans¬ membranaire dépasse une certaine valeur seuil (Teissié et al, 1993), pendant un temps suffisamment long (Kotnik et al, 2003), la perméabilisation transitoire et réversible des cellules peut être obtenue, sans entraîner de lésions tissulaires. L'intensité du champ électrique appliqué dépend du voltage et de la distance entre les électrodes. Il peut varier de 20 à 2000 V/cm. Les impulsions électriques peuvent varier de 3 à 8 ; elles ont généralement une durée de 100 μs et sont délivrées à une fréquence de 1 à 5000 Hz. L'électroperméabilisation des cellules d'une tumeur peut être obte¬ nue, par exemple, par l'exposition de cette tumeur à 3-8 impulsions électriques de 100 microsecondes et 1300 V/cm délivrées à la fréquence de répétition de 1 Hz par l'intermédiaire de deux électrodes posées sur la peau de part et d'autre du nodule tumoral à traiter. De toute évidence, il s'agit d'un traitement local, restreint au volume compris entre les électrodes et soumis à une intensité de champ électrique supérieure à la valeur seuil qui permet de perméabiliser les cellules comprises dans ce volume : la bléomycine, administrée préalablement, va pénétrer uniquement dans les cellules électroperméabilisées et seules ces dernières seront effectivement tuées. Selon un mode de réalisation avantageux desdits produits, les ligands de TLR sont des oligodésoxynucléotides (ODN) immunostimulants, que leur structure soit naturelle, synthétique ou chimérique.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les ligands de TLR sont plus précisément des ligands de TLR9 et plus particulièrement des CpG-ODN immunostimulants.
Conformément à l'invention, lesdits CpG-ODN immunostimulants sont sélectionnés dans le groupe constitué par un oligodésoxynucléotide stabilisé qui comprend au moins un motif quadramérique de formule Xi-CG-X2, dans lequel Xi et X2 sont identiques ou différents et représentent T ou A. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit
CpG-ODN est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par un oligodésoxy¬ nucléotide qui comprend au moins une séquence quadramérique sélectionnée dans le groupe constitué par : TCGA, ACGT, ACGA et TCGT.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit CpG- ODN est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par un oligodésoxy¬ nucléotide qui comprend au moins une séquence hexamérique sélectionnée dans le groupe constitué par : AACGTT, GACGTC, GACGTT, GTCGTT, TTCGAA, TACGTA, ATCGAT, TTCGTT et ATCGTT.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit CpG-ODN est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par un oligonu- cléotide qui comprend au moins la séquence octamérique suivante : AACGTT-X3X4, dans laquelle X3X4 est AT, AA, CT ou TT et de préférence la séquence octamérique AACGTTAT.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit CpG- ODN est le CpG-ODN de séquence SEQ ID NO: 1. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le principe actif immunostimulant est un CpG-ODN sélectionné dans le groupe constitué par un oligonucléotide stabilisé qui comprend au moins un motif octamérique du type : 5'-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-XiX2-3', dans lequel la paire XiX2 est AT, AA, CT ou TT. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ledit CpG-
ODN est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par un oligonucléotide qui comprend au moins une séquence octamérique sélectionnée dans le groupe constitué par : GACGTT-X1X2, AGCGTT-X,X2, GGCGTT-XiX2, AACGTC-X1X2, GACGTC- X1X2, AGCGTC-X1X2 et GGCGTC-XiX2, dans laquelle X1-X2 est AT, AA, CT ou TT.
Conformément à cette modalité, ledit CpG-ODN est choisi dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:2 à SEQ ID NO:41.
De tels CpG-ODN stabilisés ainsi que leur procédé de préparation sont notamment décrits dans les Demandes française n° 99 03432 et Internationale PCT n° WO 00/56342.
Conformément à l'invention, les oligonucléotides immunostimulants peuvent être utilisés sous forme de simple-brin ou de double-brin, peuvent comprendre plusieurs séquences immunostimulantes adjacentes ou non. Ils peuvent comprendre également d'autres séquences biologiquement actives, comme des séquences anti-sens ou des aptamères. Les oligonucléotides stabilisés peuvent être couplés par des liaisons covalentes, ioniques ou faibles, à une ou plusieurs autres molécules susceptibles d'augmenter leur affinité tumorale, de modifier leur activité biologique ou d'augmenter leur activité immunostimulante.
Au sens de la présente invention, le principe actif anticancéreux est une substance habituellement utilisée en chimiothérapie ; la chimiothérapie anti¬ cancéreuse repose sur l'utilisation de substances cytotoxiques appartenant à deux catégories de substances : des antimétabolites qui interfèrent notamment avec la synthèse des acides nucléiques (fluoro-uracile, méthotrexate, doxorubicine), des protéines (inhibiteurs de la topo-isomérase) ou bien d'autres processus métaboliques essentiels comme la mitose (vincristine) et des substances génotoxiques qui modifient la structure de l'ADN comme des agents scindants (bléomycine) ou intercalants, notamment des agents alkylants (cyclophosphamide, lomustine, témozolomide, dérivés du platine (cisplatine ou cis-diaminedichloroplatine, cDDP ou DDP], dérivés de nitrosourée (fotémustine ou [[(chloro-2-éthyl)-nitroso-3 uréido]-l éthyl] phospho- nate de diéthyle-(RS)). L'efficacité de cette thérapie peut varier de façon importante d'un type de tumeur à l'autre et d'un individu à l'autre, en raison de différences dans la sensibilité des cellules tumorales à ces agents.
D'autres substances sont également utilisées en chimiothérapie anti¬ cancéreuse ; il s'agit de substances capables d'agir sur d'autres facteurs que ceux précisés ci-dessus et qui interviennent dans les cancers : substances cytolytiques (ou pro-apoptotiques), substances anti-angiogéniques et substances différenciantes. Selon un mode de réalisation avantageux desdits produits, le principe actif anticancéreux est sélectionné dans le groupe constitué par les substances cytotoxiques (les antimétabolites et les substances génotoxiques).
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le principe actif anticancéreux est de préférence une substance génotoxique et de manière encore plus préférée de la bléomycine.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux desdits produits, les cellules de la tumeur sont électroperméabilisées par exposition desdites cellules tumorales à des impulsions électriques de force ou d'intensité et de durée suffisantes pour permettre l'électroporation desdites cellules cancéreuses ; elles sont de préférence électroperméabilisées ultérieurement à l'administration desdits produits ; lesdites cellules peuvent également être électroperméabilisées préalablement à l'administration desdits produits.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits produits, l'intensité du champ électrique appliqué varie entre 20 et 2 000 V/cm. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, l'intensité du champ électrique appliqué varie de préférence entre 500 et 1 500 V/cm et de préférence entre 800 et 1 300 V/cm. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux desdits produits, la fréquence des impulsions varie de 0,01 à 10 000 Hz.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la fréquence des impulsions varie de préférence, de 1 à 5 000 Hz. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux desdits produits, la durée des impulsions varie de 10 μs à 10 s.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la durée des impulsions varie de préférence de 50 μs à 500 ms, et de préférence de 100 μs à 1 ms. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits produits, le principe actif anticancéreux est administré par voie intratumorale, locale ou systémique.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits produits, le principe actif immunostimulant est administré par voie intratumorale, locale ou systémique.
Conformément à l'invention, lesdits produits sont administrés en une ou plusieurs fois ou en libération continue, notamment au moyen de micropompes osmotiques, ou associés à tout moyen physique ou chimique, notamment à des agents encapsulants comme les systèmes de dispersion colloïdaux et les polymères. Également conformément à l'invention, lesdits produits sont en outre associés à un autre traitement, tel que la radiothérapie, une autre substance cytotoxique, une substance cytolytique, une substance anti-angiogénique, une substance différenciante, une substance immunostimulante autre qu'un ODN ou des produits issus de la thérapie cellulaire, comme des cellules dendritiques. De manière avantageuse, les produits selon l'invention peuvent être utilisés dans le traitement des cancers, quels que soient leur nature et leur degré d'anaplasie et ils permettent d'obtenir, de manière surprenante, un effet curatif systé¬ mique, notamment sur les métastases
Ainsi, l'injection d'une simple dose hebdomadaire de CpG-ODN (CpG) dans le volume tumoral traité par électrochimiothérapie (la première injection étant effectuée le lendemain de F électrochimiothérapie) a permis non seulement d'améliorer les résultats locaux de l'électrochimiothérapie mais encore, de manière surprenante, d'obtenir des effets à distance. La démonstration de ces effets systémiques, obtenus par la combinaison de deux traitements locaux (l'électrochimiothérapie et l'injection locale de CpG), a été faite chez la souris et le rat inoculés avec deux tumeurs transplantées dans les deux flancs des animaux à trois jours d'intervalle. La plus grande des tumeurs (la première à avoir été transplantée) est ensuite traitée par électrochimiothérapie et reçoit l'injection de CpG, et l'évolution des deux tumeurs est ensuite poursuivie dans les jours qui suivent. Comme le montrent les tableaux et graphiques rapportés, avec la combinaison de l'électrochimiothérapie et des CpG, des effets antitumoraux importants (régression complète) ont été obtenus au niveau de la tumeur traitée et de la tumeur contralatérale.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre l'effet du traitement par électrochimiothérapie
(ECT) (JO) associé à un CpG-ODN (SEQ ID NO: 1) administré par voie intratumorale (Jl, 8, 15, 22) sur deux tumeurs LPB opposées (Moyenne±EC). A : évolution de la tumeur gauche (traitée). B : évolution de la tumeur droite (non traitée).
- la figure 2 est une représentation détaillée souris par souris de l'effet du traitement par électrochimiothérapie (JO) et CpG-ODN (SEQ ID NO: 1) (Jl,
8, 15, 22) intratumoral sur deux tumeurs LPB opposées. A : évolution de la tumeur gauche (traitée). B : évolution de la tumeur droite (non traitée ). (S : souris).
- la figure 3 illustre l'effet de la combinaison ECT+CpG-ODN (SEQ ID NO: 1) dans le modèle de tumeur B16OVA (7 souris par groupe). - la figure 4 illustre l'effet de l'électroporation d'un CpG-ODN
(SEQ ID NO: 1) à Jl, 8, 15, 22 en intratumoral sur deux tumeurs LPB opposées (Moyenne±EC). A : évolution de la tumeur gauche (traitée). B : évolution de la tumeur droite (non traitée).
- la figure 5 est une représentation par souris de l'effet de l'électroporation d'un CpG-ODN (SEQ ID NO: 1) à Jl, 8, 15, 22 en intratumoral sur deux tumeurs LPB opposées. A : évolution de la tumeur gauche (traitée). B : évolution de la tumeur droite (non traitée). (S : souris). - la figure 6 représente le monitoring de la réponse TCD8 dans le ganglion inguinal homolatéral des souris immunisées, traitées et non traitées. A : visualisation des lymphocytes. B : isolement des TCD8. C : isolement des TCDS spécifiques de SIINFEKL. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : MATERIELS ET METHODES.
Animaux : des souris femelles C57BL/6 H-2b de 8-20 semaines ont été utilisées pour l'établissement des modèles tumoraux. Ces souris provenant du Centre d'Elevage Janvier (Le Genest, St IsIe, France) ont toutes été élevées dans le service du petit animal de l'Institut Gustave Roussy conformément au guide du Comité d'Ethique d'Expérimentation Animal. Les souris ont toutes été sacrifiées humainement par inhalation de CO2. Lignées cellulaires tumorales : les lignées LPB et B 160VA ont été cultivées in vitro à 37°C sous 5% de CO2. Les cellules LPB sont dérivées d'un sarcome induit par le méthylcholanthrène chez la souris C57BL/6. Elles ont été main¬ tenues dans du milieu essentiel minimum (Gibco, Cergy-Pontoise, France) supplé- menté avec 8% de sérum de veau fœtal (Gibco) inactivé par la chaleur (une demi heure à 56°C) et lOOU/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (Gibco). La lignée stable Bl 6OVA fournie généreusement par le Dr K.L. Rock (UMass Médical School, Worcester, MA, USA), dérive d'un mélanome murin transfecté avec le gène codant pour la protéine de poulet ovalbumine (OVA). Ces cellules ont été maintenues in vitro dans du milieu RPMI 1640 (Gibco) supplémenté avec 8% de sérum de veau fœtal (SVF), 5% de L-glutamine (Gibco), 5% de pyruvate de sodium (Gibco), 5% d'acides aminés non essentiels (Gibco) et 5% de pénicilline et streptomycine.
Modèles tumoraux : après la trypsination des cellules et l'inactivation de la trypsine (Gibco) avec du milieu complet, les cellules ont été récoltées dans du milieu essentiel minimum (MEM) pour les LPB et dans du RPMI 1640 pour les B 160VA. Les cellules LPB et B 160VA (106) ont été injectées en sous-cutanée dans le flanc gauche des souris. Trois jours plus tard à nouveau 106 cellules ont été injectées dans le flanc droit des mêmes animaux. Puis les souris ont été réparties pour chaque expérience avant d'être traitées 8 jours ou 9 jours après la première injection, respectivement pour les tumeurs LPB et Bl 6OVA. La taille des tumeurs a été mesurée 3 fois par semaine à l'aide un pied à coulisse. Le volume tumo¬ ral a été déterminé selon la formule d'une ellipse V=a2bπl6 dans laquelle a représente la largeur et b la longueur perpendiculaire.
Ancsthésie : les souris ont été anesthésiées avec 150 μl d'un mélange de xylazine (Bayer Pharma, Puteaux, France) à 12,5 mg/Kg et de kétamine (Parke Davis, Courbevoie, France) à 125 mg/Kg injecté en intrapéritonéal avant d'être traitées par électroporation ou électrochimiothérapie. Electrochimiothérapie (ECT) : 10 μg de bléomycine (Roger
Bellon, Neuilly, France) dans 100 μl de NaCl 0,9% ont été injectés en iv dans le sinus rétro orbitaire des souris. Quatre minutes après l'injection, les impulsions électriques ont été délivrées sur la masse tumorale à l'aide d'un générateur relié à une console informatique (prototype). L 'électroporation a été réalisée au moyen de deux électrodes espacées de 5 mm placées de part et d'autre de la tumeur, et délivrant 8 impulsions électriques de 100 μs à 1300 V/cm et 5000 Hz de fréquence. L'application systé¬ matique d'un gel sur la tumeur avant l' électroporation et le contrôle graphique de chaque électroporation permettaient de s'assurer de la bonne distribution du courant dans la tumeur. Immunothérapie : la séquence simple brin de
Poligodéoxinucléotide contenant plusieurs motifs CpG non méthylés (5'- TAAACGTTATAACGTTATGACGTCAT-3') (SEQ ID NO :1). Cinquante micro¬ grammes d'oligodéoxinucléotides CpG dilués dans 100 μl de NaCl 0,9% ont été injectés en intratumoral le lendemain de l'ECT, une fois par semaine pendant quatre semaines.
Essai de cytotoxicité in vitro : une lignée fibroblastique de poumon de hamster chinois, DC3F, a été maintenue in vitro comme décrit précédemment pour la lignée LPB. Les cellules ont été récoltées afin de les re-suspendre à une concentra¬ tion de 2,2.107/ml dans du MEM-S (MEM sans calcium, Gibco). Des aliquotes de 106 cellules/45 μl ont été mélangés à 5 μl de NaCl 0,9% ou 5 μl de CpG variant d'une concentration de 5 à 60 μM. Le mélange de 50 μl a ensuite été placé entre 2 électrodes espacées de 2 mm et aussitôt le choc électrique a été délivré (8 impulsions de 100 μs pour un champ électrique de 1000 V/cm et une fréquence de 1 Hz). Après 5 minutes de repos, les cellules ont été diluées dans du MEM complet et mises en culture en triple dans des boîtes de pétri de 6cm de diamètre (500 cellules/ml). La prolifération cellulaire a été estimée après 5 jours de culture. Pour cela les cellules ont d'abord été fixées avec du formaldéhyde pendant 20 minutes puis colorées avec du cristal violet pendant 15 minutes.
Analyse de Ia réponse immunitaire : Un modèle de tumeur a été créé en injectant 5.1O5 cellules B16OVA pour 50 μl de RPMI1640 dans la cuisse droite des souris. Au bout de 14 jours, la tumeur mesurait 5 mm environ et était traitée par ECT (JO) suivi de l'immunothérapie par CpG à Jl. Par ailleurs 3 souris ont été immunisées par injection de peptide directement dans le coussinet plantaire à Jl : 45 μg de peptide SIINFEKL (Eurogentec) dérivé de Povalbumine mixé dans 50 μg d'ODN-CpG. Sept jours après ce traitement toutes les souris ont été sacrifiées afin de prélever les ganglions inguinaux. Les ganglions ont été écrasés mécaniquement dans des filtres de 100 μm et les cellules ganglionnaires ont été récoltées dans du RPMI 1640. Dix mille cellules/puits ont été incubées dans une plaque de 96 puits avec du RPMI 1640 supplémenté avec 1% de sérum murin, en présence ou en absence de peptide OVA, afin de réaliser une stimulation in vitro. Après 72 heures de culture à 37°C sous 5% de CO2 le surnageant a été prélevé afin d'évaluer la sécrétion d'interféron γ par un test ELISA (kit OptEIA™ de BD Pharmingen). Une partie des cellules (1-2.106) a été marquées avec le tétramère H-2b/SIINFEKL couplé au PE (Beckman Coulter, Fullerton, CA) dilué au l/100ème pendant une demi heure à tempé¬ rature ambiante et à l'obscurité, puis avec un anti-CD3-FITC et un anti-CD8-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA) dilués au l/100ème pendant le même temps d'incubation. Les cellules ont ensuite été lavées une fois dans du PBS IX et fixées dans 200 μl de paraformaldéhyde 1% avant d'être analysées au cytofiuorimètre FACScalibur avec le logiciel CellquestPro.
Statistiques : une analyse de variance avec une comparaison multiple selon le test de Kruskal-Wallis a été réalisée pour les expériences in vivo et in vitro. Les moyennes avec les écart-types unilatéraux diffèrent significativement pour une valeur z supérieur à 1 ,96. Chaque test avait un p global inférieur à 0,05 permettant de comparer les groupes entre eux. EXEMPLE 2 : RESULTATS
Activité antitumorale de la combinaison ECT et CpG-ODN
(CpG) :
• Modèle de fibrosarcome LPB - Analyse par groupe :
Pour tester l'hypothèse d'un effet thérapeutique systémique de la combinaison ECT-CpG, nous nous sommes placés dans un modèle de double tumeur.
106 cellules LPB ont été implantées en sous-cutané dans le flanc gauche d'abord, puis
3 jours après à nouveau 106 cellules dans le flanc droit des mêmes souris. Seule la tumeur de gauche a été traitée à JO par EP ou ECT et à Jl, J8, Jl 5 et J22 par NaCl
0,9% ou CpG en intratumoral comme décrit dans la section matériels et méthodes.
L'effet du traitement a été observé sur les 2 tumeurs.
En premier lieu des effets locaux du traitement (tumeurs gauches) sont traités, puis dans un second lieu des effets à distance (tumeurs droites) : Les animaux ont été suivis pendant 30 jours après le traitement. Le groupe ayant reçu le traitement combiné ECT+CpG présentait 100% de régression complète des tumeurs traitées à J28 (Fig. IA). En revanche lorsqu'un seul traitement était appliqué à savoir ECT seule ou CpG seuls, la croissance des tumeurs traitées a seulement été ralentie par rapport au groupe contrôle EP+NaCl (Fig. IA). L'évolution des tumeurs est statistiquement différente entre le groupe ECT+CpG et les autres groupes (z=4, 18 ; z=2,62 ; z=2,46 avec les groupes respectifs EP+NaCl, EP+CpG et
ECT+NaCl à J28).
L'effet antitumoral à distance a été évalué par la mesure des tumeurs controlatérales (Fig. IB). Une stabilisation tumorale globale a été obtenue pendant 20 jours avec la combinaison ECT+CpG de façon tout à fait significative avec le groupe témoin (z=2,47). Par contre les traitements simples n'ont pas permis de stabilisation mais ont été associés à une prolifération tumorale ralentie par rapport au groupe contrôle (Fig IB).
- Analyse par souris : La représentation de la croissance des tumeurs, animal par animal, permet de suivre l'évolution des tumeurs gauche et droite chez une même souris (Fig.
2). L'évolution de la tumeur controlatérale semble être corrélée à l'évolution de la tumeur traitée sans que ce résultat soit généralisable à l'ensemble des souris. Par exemple, dans le groupe EP+CpG, la souris S 1 ayant été stabilisée à gauche a aussi été stabilisée à droite alors que la souris S3 qui a évolué rapidement à gauche a progressé fortement à droite. • Modèle de mélanome B 160VA
Le modèle de fibrosarcome a été reproduit en implantant également 106 cellules B 160VA sur les flancs gauche et droit des souris et en respectant l'intervalle de 3 jours entre les deux injections. Les tumeurs ont été traitées comme décrit précédemment 9 jours après l'implantation des cellules. Une seule expérience actuellement en cours est décrite à partir du jour du début du traitement JO (Fig. 3). Les taux de survie au 18ème jour de traitement sont respectivement de 28,6 %, 71,4 %, 14,3 % et 85,7 % pour les groupes EP+NaCl, EP+CpG, ECT+NaCl et ECT+CpG.
Analyse de l'effet de l'électroporation des CpG, dans le cadre d'une ECT : Le système immunitaire inné détecte les motifs CpG non méthylés par les TLR9 chez la souris (26). Les TLR9 sont exprimés intracellulairement précisé¬ ment au niveau du réticulum endoplasmique (30). L'élévation de la concentration intracellulaire des CpG-ODN permet d'augmenter leur activité stimulatrice (31). L'hypothèse d'une meilleure efficacité des CpG-ODN lorsqu'ils sont électroporés in vivo dans notre modèle de double tumeur LPB a été testée.
Deux groupes supplémentaires dans lesquels les CpG étaient élec¬ troporés dans la tumeur immédiatement après leur injection ont été menés. Les CpG étaient injectés en intratumoral puis électroporés à Jl, J8, Jl 5 et J22 comme précé¬ demment. Le groupe des CpG électroporés combiné à l'ECT [ECT
+(CpG+EP)] a montré une guérison des tumeurs traitées dans 100% des cas (Fig. 4A, 5A). Il n'y avait donc pas de différence d'effet antitumoral avec le groupe ECT+CpG qui, lui aussi, avait entraîné les mêmes résultats. Au contraire lorsqu'il n'y avait pas d'ECT, l'effet direct des CpG électroporés a montré une meilleure efficacité (sans différence significative) par rapport aux CpG non électroporés: 4 tumeurs sur 5 ont été stabilisées contre seulement 1 sur 5 (Fig. 4A, 5A). Dans le groupe ECT+(CpG+EP) toutes les tumeurs controlatérales non traitées ont été stabilisées pendant 20 jours après l'ECT comme pour le groupe ECT+CpG (Fig. 4B, 5B). La croissance des tumeurs droites des groupes EP+(CpG+EP) et EP+CpG étaient sensiblement identiques. Au niveau statistique le groupe ECT+(CpG+EP) était significative- ment différent à gauche avec les groupes EP+NaCl et EP+CpG. A droite ce groupe présentait une différence significative avec les groupes EP+NaCl et ECT+NaCl.
Etude de l'induction de lymphocytes T cytotoxiques avec la combinaison ECT et CpG : Pour tester la capacité de l'association thérapeutique à induire des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques du peptide SIINFEKL, un modèle tumoral a été créé en injectant 500000 cellules Bl 6OVA dans la cuisse des animaux. Ce modèle permettait de traiter facilement les animaux par ECT à JO et CpG intratumoral à Jl. Cinq groupes de 3 souris ont été créés : un groupe dont les souris sans tumeur ont été immunisées avec le peptide SIINFEKL mixé dans du CpG le jour de l'immunothérapie, trois groupes traités par ECT+CpG ou ECT+NaCl ou CpG seuls et un groupe non traité. Sept jours après l'injection des CpG les animaux ont été sacrifiés afin de prélever le ganglion inguinal homolatéral et controlatéral de chaque souris. La présence éventuelle de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques dans le ganglion homolatéral a été recherchée ex vivo à l'aide d'un marquage par des tétramères solubles reconnaissant H-2b/SIINFEKL. Les ganglions inguinaux controlatéraux nous servaient de contrôle interne négatif. Une seule expérience de ce type a été menée jusqu'à aujourd'hui mais une autre est en cours.
Une analyse en cytométrie de flux représentative de l'ensemble de tous les groupes est montrée dans la figure 6. Dans la population de cellules viables (fenêtre Gl) nous avons sélectionné les lymphocytes T CD3/CD8 (fenêtre G2) dans lesquels le pourcentage de lymphocytes reconnus par le tétramère a été déterminé. Ce type d'analyse a été effectué pour tous les groupes de l'expérience, cependant aucun marquage positif n'a été détecté y compris dans le groupe contrôle immunisé par le peptide (Fig. 6C). On n'a pas retrouvé de sécrétion d'interféron γ dans le surnageant des cultures stimulées in vitro par le peptide. II ressort de l'ensemble de ces résultats que la combinaison ECT associée aux CpG a entraîné à la fois des effets locaux et à distance.
D'une part, on a constaté des régressions locales complètes dans presque 100% des cas (8 cas sur 9 dans l'ensemble des expériences) dans le modèle de fibrosarcome murin. Cette efficacité locale est supérieure à l'effet de chacun des deux traitements effectués séparément. La réduction tumorale importante induite par l'ECT semble donc être complétée par un effet antitumoral indirect dû à l'activation du système immunitaire par les CpG (action synergique), alors que l'électroporation seule et la bléomycine seule à des doses sub-thérapeutiques ne possèdent pas d'activité antitumorale propre (3).
D'autre part, concernant l'effet à distance de la combinaison ECT+CpG dans le modèle de fibrosarcome, 5 stabilisations de 20 jours et 3 régres¬ sions complètes sur 9 animaux dans l'ensemble des expériences ont été obtenues. Cette association met donc très probablement en jeu des mécanismes immunitaires responsables d'un effet systémique dans ce modèle. La mort cellulaire induite par l'ECT seule, même si elle semble s'associer à quelques effets immunologiques, n'est pas suffisamment immunogène pour entraîner un effet antitumoral à distance. Plusieurs hypothèses ont été faites pour expliquer pourquoi la mort cellulaire induite par l'ECT devenait immunogène lorsqu'elle était associée à l'administration de CpG, comme en témoignent les résultats.
L'observation détaillée des résultats animal par animal (Fig. 2) suggère une relation étroite entre l'effet antitumoral direct et l'effet à distance avec la nécessité, semble-t-il, pour obtenir un effet controlatéral d'avoir obtenu une activité locale et une fonte tumorale substantielle localement. Ainsi l'effet systémique du traitement paraît lié à sa capacité à induire une bonne réponse immunitaire locale. Comme suggéré précédemment concernant l'effet antitumoral local, la réponse immu¬ nitaire lymphocytaire T mise en place à gauche (tumeur traitée) pourrait être respon¬ sable de l'effet observé à distance.
La combinaison selon l'invention, qui cible la réponse immunitaire plus globalement et en amont en mettant en jeu à la fois l'immunité innée via la stimulation des NK et des macrophages et la charnière innée acquise en activant les CD permet d'aboutir à une réponse antitumorale efficace. Le modèle de mélanome Bl 6OVA a permis de tester l'efficacité de la combinaison selon l'invention sur un autre type de tumeur que le fïbrosarcome permettant l'analyse de la réponse immunitaire grâce à l'expression du peptide SIINFEKL par la tumeur. Toutefois cette lignée tumorale s'est révélée très agressive et a entraîné des décès rapidement ne permettant pas d'évaluer l'évolution des tumeurs, dans le modèle de double tumeur, et donc de conclure quant aux effets locaux et distants du traitement. Néanmoins cette première expérience montrant un taux de survie supérieur aux autres groupes pour l'association ECT+CpG au 18ème jour de traitement, encourage à mettre au point un modèle plus adapté pour analyser un effet thérapeutique local et systémique.
Par ailleurs, lorsque les CpG ont été électroporés (EP) afin de voir si l'accès des CpG à des compartiments intracellulaires différents avait un effet théra¬ peutique additionnel, des résultats comparables aux autres groupes sont apparus que ce soit au niveau local ou controlatéral. Dans l'ensemble des expériences sur le fibro- sarcome LPB toutes les souris (n=9) du groupe ECT+(CpG+EP) ont régressé locale¬ ment et ont répondu à distance (7 stabilisations et 2 régressions complètes). L'association ECT+CpG ayant montré aussi de très bons résultats localement (8 guérisons sur 9) et à distance (5 stabilisations et 3 guérisons, n=9), l'électropo ration des CpG n'apporte pas plus d'efficacité. Le seul bénéfice notable a été observé dans le groupe où les CpG seuls ont été électroporés (EP+(CpG+EP)) dans lequel 4 stabilisa¬ tions des tumeurs traitées sur 5 ont été observées, contre 1 sur 5 dans le groupe traité par CpG seul (EP+CpG). In vitro, l'électroporation des CpG entraîne 20 à 30% de mortalité sur les cellules tumorales sans effet dose. Cela est peut-être dû à un phéno¬ mène de saturation de la cytotoxicité cellulaire ou de pénétration limitée dans les cellules. In vivo le retentissement de la cytotoxicité directe des CpG électroporés est difficilement appréciable. De plus dans ces expériences la tumeur était électroporée 4 fois de suite sans que l'on sache exactement quelles conséquences cela entraîne sur la croissance. BIBLIOGRAPHIE 1. Orlowski, S., and L. M. Mir. 1993. CeIl electropermeabilization: a new tool for biochemical and pharmacological studies. Biochim Biophys Acta 1154:51. 2. Mir, L. M., H. Banoun, and C. Paoletti. 1988. Introduction of definite amounts of nonpermeant molécules into living cells after electropermeabilization: direct access to the cytosol. Exp CeIl Res 175:15-25.
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Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1 °) Produits contenant au moins un principe actif anticancéreux peu diffusible et un principe actif immunostimulant sélectionné dans le groupe constitué par des ligands de TLR en tant que préparation combinée pour une utilisation simulta- née, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement des tumeurs bénignes ou malignes et plus particulièrement des métastases, chez un sujet atteint d'une tumeur et soumis à une électroperméabilisation au niveau de ladite tumeur.
2°) Produits contenant au moins un principe actif anticancéreux peu diffusible et un principe actif immunostimulant sélectionné dans le groupe constitué par des ligands de TLR en tant que préparation combinée pour une utilisation simulta¬ née, séparée ou étalée dans le temps, pour le traitement des tumeurs bénignes ou malignes et plus particulièrement des métastases, chez un sujet atteint d'une tumeur et soumis à une électroperméabilisation au niveau d'un tissu sain sélectionné de manière appropriée. 3°) Produits selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractéri¬ sés en ce que les ligands de TLR sont des oligodésoxynucléotides (ODN) immuno- stimulants.
4°) Produits selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, carac¬ térisés en ce que les ligands de TLR sont des ligands de TLR9. 5°) Produits selon la revendication 4, caractérisés en ce que les ligands de TLR9 sont des CpG-ODN immunostimulants.
6°) Produits selon la revendication 5, caractérisés en ce que le CpG- ODN immunostimulant est sélectionné dans le groupe constitué par un oligodésoxy- nucléotide stabilisé qui comprend au moins un motif quadramérique de formule Xi- CG-X2, dans laquelle Xi et X2 sont identiques ou différents et représentent T ou A.
7°) Produits selon la revendication 6, caractérisés en ce que ledit CpG-ODN est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par un oligodésoxy- nucléotide qui comprend au moins une séquence quadramérique sélectionnée dans le groupe constitué par : TCGA, ACGT, ACGA et TCGT. 8°) Produits selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractéri¬ sés en ce que ledit CpG-ODN est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par un oligodésoxynucléotide qui comprend au moins une séquence hexamérique sélectionnée dans le groupe constitué par : AACGTT, GACGTC, GACGTT, GTCGTT, TTCGAA, TACGTA et ATCGAT.
9°) Produits selon la revendication 8, caractérisés en ce que ledit
CpG-ODN est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par un oligo- nucléotide qui comprend au moins la séquence octamérique suivante : AACGTT-
X3X4, dans laquelle X3X4 est AT, AA, CT ou TT et de préférence la séquence octamérique AACGTTAT.
10°) Produits selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisés en ce que ledit CpG-ODN est le CpG-ODN de séquence SEQ ID NO: 1. 1 1°) Produits selon la revendication 5, caractérisés en ce que le principe actif immunostimulant est un CpG-ODN sélectionné dans le groupe constitué par un oligonucléotide stabilisé qui comprend au moins un motif octamérique du type : 5'-purine-purine-CG-pyrirnidine-pyrimidine-XiX2-3', dans lequel la paire XiX2 est AT, AA, CT ou TT. 12°) Produits selon la revendication 11, caractérisés en ce que ledit
CpG-ODN est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par un oligonucléo¬ tide qui comprend au moins une séquence octamérique sélectionnée dans le groupe constitué par : GACGTT-X1X2, AGCGTT-X1X2, GGCGTT-X,X2, AACGTC-X1X2, GACGTC-X1X2, AGCGTC-X1X2 et GGCGTC-X1X2, dans laquelle XpX2 est AT, AA, CT ou TT.
13°) Produits selon la revendication 1 1 ou la revendication 12, caractérisés en ce que ledit CpG-ODN est choisi dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:2 à SEQ ID NO:41.
14°) Produits selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisés en ce que le principe actif anticancéreux est sélectionné dans le groupe constitué par les substances cytotoxiques sélectionnées dans le groupe constitué par les antimétabolites et les substances génotoxiques.
15°) Produits selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisés en ce que le principe actif anticancéreux est de préférence une substance génotoxique et de manière encore plus préférée de la bléomycine. 16°) Produits selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisés en ce que le principe actif anticancéreux est administré par voie intra- tumorale, locale ou systémique.
17°) Produits selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisés en ce que le principe actif immunostimulant est administré par voie intra- tumorale, locale ou systémique.
18°) Produits selon l'une quelconque des revendications 1 et 3 à 17, caractérisés en ce que les cellules de la tumeur sont électroperméabilisées par exposi¬ tion desdites cellules tumorales à des impulsions électriques de force ou d'intensité et de durée suffisantes pour permettre l'électroporation desdites cellules cancéreuses.
19°) Produits selon la revendication 18, caractérisés en ce que les cellules de la tumeur sont électroperméabilisées ultérieurement à l'administration desdits produits par exposition desdites cellules tumorales à des impulsions électriques de force ou d'intensité et de durée suffisantes pour permettre l'électroporation desdites cellules cancéreuses.
20°) Produits selon la revendication 18, caractérisés en ce que les cellules de la tumeur sont préalablement électroperméabilisées par exposition desdites cellules tumorales à des impulsions électriques de force ou d'intensité et de durée suffisantes pour permettre l'électroporation desdites cellules cancéreuses. 21°) Produits selon la revendication 18, caractérisés en ce que l'intensité du champ électrique appliqué varie entre 20 et 2 000 V/cm.
22°) Produits selon la revendication 21, caractérisés en ce que l'intensité du champ électrique appliqué varie entre 500 et 1 500 V/cm.
23°) Produits selon la revendication 18, caractérisés en ce que la fréquence des impulsions varie de 0,01 à 10 000 Hz.
24°) Produits selon la revendication 23, caractérisés en ce que la fréquence des impulsions varie de 1 à 5 000 Hz.
25°) Produits selon la revendication 18, caractérisés en ce que la durée des impulsions varie de 10 μs à 10 s. 26°) Produits selon la revendication 25, caractérisés en ce que la durée des impulsions varie de 50 μs à 500 ms. 27°) Produits selon la revendication 2, caractérisés en ce que ledit antigène est sélectionné dans le groupe constitué par les antigènes purifiés spécifiques de tumeurs, des extraits tumoraux, des cellules tumorales irradiées ou modifiées.
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