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WO2006084998A1 - Procede de preparation de compositions hemostatiques pulverisables - Google Patents

Procede de preparation de compositions hemostatiques pulverisables Download PDF

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WO2006084998A1
WO2006084998A1 PCT/FR2006/000296 FR2006000296W WO2006084998A1 WO 2006084998 A1 WO2006084998 A1 WO 2006084998A1 FR 2006000296 W FR2006000296 W FR 2006000296W WO 2006084998 A1 WO2006084998 A1 WO 2006084998A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gelatin
gel
irradiation
kgray
pharmaceutical compositions
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2006/000296
Other languages
English (en)
Inventor
Nicole Rouquet
Patrick Frayssinet
Eliane Jean
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
URODELIA
Original Assignee
URODELIA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by URODELIA filed Critical URODELIA
Publication of WO2006084998A1 publication Critical patent/WO2006084998A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
    • A61L26/0009—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form containing macromolecular materials
    • A61L26/0028—Polypeptides; Proteins; Degradation products thereof
    • A61L26/0038—Gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A61K9/7015—Drug-containing film-forming compositions, e.g. spray-on
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
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    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/04—Materials for stopping bleeding

Definitions

  • the present invention relates to the field of the necessities of life and more particularly to the field of pharmaceutical products.
  • the present invention relates to a method of manufacturing a pharmaceutical product and the pharmaceutical product obtained by this method. It also relates to new gelatin solutions having undergone irradiation, this irradiation leading to crosslinking of these products and also conferring on them the property of being easily sprayable. These new products also have remarkable spreading properties as well as haemostatic properties.
  • Gelatin is a substance obtained by hydrolysis of collagen. It consists of fragments of collagen fibrils, which is one of the major protein constituents of animal bones, tendons, cartilage, skin, and connective tissues. Gelatin is a compound of choice for haemostatic application, that is to say it promotes haemostasis, the latter being defined by all the mechanisms that contribute to curbing or stopping haemorrhages and preventing thromboses , ie the formation of blood clots. The mode of action of gelatin is mainly mechanical by the formation of an obstacle to blood flow, thus promoting the coagulation of blood.
  • the denatured molecules that make up gelatin do not have species specificity. When they are mixed with water or with a saline solution, they rapidly form a more or less viscous gel, and thus have a more or less marked haemostatic power.
  • a gelatin gel When a gelatin gel is implanted in a tissue (at 37 ° C), it becomes liquid in a variable time according to its volume and its thermal inertia, the proteins contained in the gel being then internalized by different cells including macrophages which store in intracellular vesicles called phagosomes and lysosomes. Inside these cells, the proteins are degraded at low pH by enzymes, in this case proteinases. This Biodegradation of gelatin, in most cases, does not trigger a clinically visible inflammatory response.
  • Gelatin is already used in many biomaterials and implantable systems such as femoral plugs, sponges, hemostatic films, vascular prosthesis coatings and even in saline as a blood plasma replacement agent.
  • certain gelatin-based haemostatic products are used as percutaneous injection of osteogenic proteins to fill bone cavities ("defects") or to treat fractures.
  • Tricalcium phosphate (TCP) or other calcium salts, or phosphoric acid may be added in these cases (see WO 01/28603 A1, to Li et al.).
  • TCP Tricalcium phosphate
  • Transient transfection of plasmids bearing different genes with local action makes it possible to have a controlled synthesis of these information factors for a few weeks.
  • the most frequent blood loss is not caused by bleeding from large vessels or arterioles, which require ligation or cautery, but rather by oozing or hemorrhage into a pool, or even by evaporation when the surface of the operative field is important.
  • Bleeding occurring during surgery requires the use of cloth compresses or collagen, gelatin, or oxidized cellulose, to ensure coagulation contact on the one hand, and also for the purpose of to free the operative field of blood which obstructs the view of the surgeon on the other hand.
  • WO 03/007845 discloses dry crosslinked gelatin compositions useful as haemostatic products. It can be a gelatin gel of concentration ranging from 1% to 70% by weight, generally from 3% to 10%, and this gelatin is crosslinked by exposure to a gamma radiation of 0.3 to 3 millirads .
  • the dry composition is placed in a first compartment of a "kit", the other compartment contains the aqueous rehydration medium.
  • compositions according to these various documents are considered as not optimal for the desired use, and the purpose of the present invention is to propose a process for obtaining a composition that achieves this objective.
  • the method according to the invention comprises the following steps:
  • the Applicant has found that the irradiation of a gelatin gel at an intensity necessary to sterilize it leads to crosslinking of the proteins by creating hydrogen bonds and gives it different physical properties and greater haemostatic properties. Irradiation is ionizing in nature and uses gamma or beta radiation more particularly.
  • the rheological properties of the product obtained are modified, which allows its optimal spraying.
  • the product which is the subject of the invention may, by spraying, cover an operating zone of up to a few tens of cm 2 and preferably 1 to 10 cm 2 .
  • This pharmaceutical formulation also allows it to be applied without resorting to any medical instrument as is necessary for compresses.
  • the sprayable form of this product thus confers on it a great simplicity of use and also, which constitutes an additional advantage, an ability to reach areas which are difficult to access to the compresses, such as, for example, skin folds or ducts.
  • the container is an aerosol container for spraying, and may be disposable for the sake of using a sterile preparation.
  • the valve used in the spray system avoids any contact between the product and the propellant, and also allows a given volume of the product to be administered. It is also possible to use pump vials operating under air pressure, but the volumes sprayed are then lower.
  • the invention also relates to the haemostatic pharmaceutical compositions intended to be sprayed, containing as active principle a crosslinked gelatin solution, obtained by the method according to claim 1, that is to say comprising a gelatin gel of concentration ranging from 5 to 30% and preferably from 15 to 20%, crosslinked by irradiation using ionizing radiation, in particular using gamma or beta type radiation, at a minimum dose of 25 kGray and preferably 30 kGray, and dispersed after crosslinking in a sterile aqueous vehicle.
  • a crosslinked gelatin solution obtained by the method according to claim 1, that is to say comprising a gelatin gel of concentration ranging from 5 to 30% and preferably from 15 to 20%, crosslinked by irradiation using ionizing radiation, in particular using gamma or beta type radiation, at a minimum dose of 25 kGray and preferably 30 kGray, and dispersed after crosslinking in a sterile aqueous vehicle.
  • the invention also relates to a gelatin solution, which is characterized in that it has a crosslinked gelatin concentration ranging from 5 to 30%, and preferably 15% to 20% dispersed in a sterile aqueous vehicle. It is also possible to incorporate, in the object object of the invention, medicinal substances with local or general activity, such as, for example, molecules that reinforce hemostasis, such as coagulation activators such as collagen or thrombin, as well as other molecules involved in coagulation such as fibrin, certain plasma factors or complement system proteins.
  • medicinal substances with local or general activity such as, for example, molecules that reinforce hemostasis, such as coagulation activators such as collagen or thrombin, as well as other molecules involved in coagulation such as fibrin, certain plasma factors or complement system proteins.
  • Stem cells can also be associated with the new product so that cells are attached to the deposited film on a tissue or organ to locate the cells.
  • Stem cells cultured in isotonic gelatin solutions develop in a manner comparable to their development in conventional culture media.
  • molecules with systemic action can be introduced into the product object of the invention, either during spraying or beforehand in the product according to the invention, such as antibiotics, for example neomycin or gentamycin, antifungals. for example, econazole or ciclopiroxolamine, sex hormones for example estrogens, androgens or anti-androgens, etc.
  • antibiotics for example neomycin or gentamycin
  • antifungals for example, econazole or ciclopiroxolamine
  • sex hormones for example estrogens, androgens or anti-androgens, etc.
  • the products according to the invention find multiple uses because of the ease of spraying. It may be mentioned the use as hemostatic, as vector of drugs of local or systemic action (antibiotics for example), to vector stem cells, or in plastic surgery to enhance or fill tissues.
  • Example 1 Method of manufacturing the new product
  • gelatin gels at 8, 10, 12, 15 and 30% were prepared and poured into hemolysis tubes and then irradiated with gamma rays at a dose of 25 kGy minimum and two doses of 25 kGy maximum. Their rheology, that is to say the study of their flow, was then evaluated at 20 ° C by independent evaluators who classified them into two categories: sprayable and non-sprayable. It was determined that the viscosity of the product obtained after irradiation was a function of the irradiation dose and the percentage of gelatin that the product contains. Only 8, 10, 12 and 15% gels irradiated at 25 kGy minimum allow spraying of the new product. The higher concentrations of gelatin and the higher irradiations do not allow spraying, the solution being too viscous.
  • Example 2 Spraying tests of the new products according to different concentration of gelatin
  • the products obtained are pulverized and placed at 37 ° C. These products form a much more adherent film than unirradiated samples and allow to cover a surface unit in a more homogeneous manner than previously.
  • the viscosity of the products is measured using a Brookfield viscometer equipped with a Helipath needle.
  • the 15% gelatin gel before sterilization has a viscosity of 4000 cps at a speed of 3 rpm (12% Torque) at 21 ° C.
  • the pH of the solution is measured at 5.24.
  • the product obtained after sterilization has a viscosity of 830,000 to 930,000 cps at a speed of 3 rpm (60% Torque) at 21 ° C.
  • the pH of the solution is measured at 5.58 .
  • Example 4 Use of the new product in abdominal surgery. Dogs under general anesthesia are placed supine, a median abdominal opening on the white line is performed for various surgical procedures: occlusions, intestinal perforation. The arterioles visible in the abdominal opening are sutured and the section surface is wiped with a compress on both sides and half of the abdominal section is sprayed with the product according to the invention. Different concentrations of the new product were used (one per dog). The bleeding is compared visually in the bare part and the covered part. A significant decrease in bleeding time is found in the part that is covered by the film formed by the new product.
  • Example 5 Spraying the new product on the surface of a stem cell culture.
  • Human mesenchymal stem cells were cultured in monolayer on the surface of polystyrene Petri dishes.
  • the cells are obtained according to the following method: Fragments of 2-3 mm of cancellous bone tissue were removed during surgical procedures for scoliosis correction. They are washed in physiological saline and placed on the surface of the Petri dishes in culture medium composed of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) supplemented with 10% fetal calf serum and glutamine.
  • the dishes are incubated for two to three weeks at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
  • the cells in the bone fragments have migrated to the surface of the dish and are almost confluent, they are resuspended with a trypsin solution and transferred to another petri dish.
  • the culture medium is removed.
  • the product prepared with a concentration of 15% crosslinked gelatin in DMEM culture medium is deposited on the surface of the cell monolayer for 72 hours.
  • the cross-linked gelatin product is removed and a trypan blue test is performed to detect the dead cells. Their proportion is not significantly different from that of a control culture in the culture medium alone. This shows that the new cross-linked gelatin product can serve as a vector for mesenchymal cells.

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Abstract

Ce procédé consiste en ce qu'on réalise un gel de gélatine de concentration allant de 5 à 30 % et de préférence de 15 à 20 %, en ce qu'on soumet ce gel de gélatine à une irradiation au moyen d'un rayonnement ionisant mettant en oeuvre notamment des rayonnements du type gamma ou béta, à une dose minimale de 25 Kgray, en ce qu'on disperse ce gel de gélatine réticulée dans un véhicule aqueux stérile et en ce qu'on introduit ledit gel dans un récipient sous pression équipé de moyens de pulvérisation sous pression.

Description

PROCÉDÉ DE PRÉPARATION DE COMPOSITIONS HÉMOSTATIQUES PUL VËRI SABLES
La présente invention se rapporte au domaine des nécessités de la vie et plus particulièrement au domaine des produits pharmaceutiques.
La présente invention a pour objet un procédé de fabrication d'un produit pharmaceutique et le produit pharmaceutique obtenu par ce procédé. Elle concerne également de nouvelles solutions de gélatine ayant subi une irradiation, cette irradiation conduisant à une réticulation de ces produits et leur conférant en outre la propriété d'être facilement pulvérisables. Ces nouveaux produits possèdent également des propriétés d'étalement remarquables ainsi que des propriétés hémostatiques.
La gélatine est une substance obtenue par hydrolyse du collagène. Elle est constituée de fragments de fibrilles de collagène, qui est un des constituants protéiques majeurs des os, des tendons, des cartilages, de la peau, et des tissus conjonctifs animaux. La gélatine constitue un composé de choix pour une application hémostatique, c'est-à-dire qu'elle favorise l'hémostase, cette dernière se définissant par l'ensemble des mécanismes qui concourent à freiner ou à arrêter les hémorragies et empêcher les thromboses, c'est à dire la formation de caillots de sang. Le mode d'action de la gélatine est principalement mécanique par la formation d'un obstacle à l'écoulement sanguin, favorisant ainsi la coagulation du sang.
Les molécules dénaturées qui constituent la gélatine ne présentent pas de spécificité d'espèce. Lorsqu'elles sont mélangées à de l'eau ou à une solution saline, elles forment rapidement un gel plus ou moins visqueux, et présentent ainsi un pouvoir hémostatique plus ou moins marqué.
Lorsqu'un gel de gélatine est implanté dans un tissu (à 37°C), il devient liquide en un temps variable suivant son volume et son inertie thermique, les protéines contenues dans le gel étant ensuite internalisées par différentes cellules dont des macrophages qui les stockent dans des vésicules intracellulaire appelées phagosomes et lysosomes. A l'intérieur de ces cellules, les protéines sont dégradées à bas pH par des enzymes, en l'occurrence des protéinases. Cette biodégradation de la gélatine, dans la plupart des cas, ne déclenche pas de réaction inflammatoire cliniquement visible.
La gélatine est déjà utilisée dans de nombreux biomatériaux et systèmes implantables comme des obturateurs fémoraux, des éponges, des films hémostatiques, des revêtements de prothèses vasculaires et même en solution saline comme agent de substitution du plasma sanguin.
Par ailleurs, certains produits hémostatiques à base de gélatine sont utilisés comme vecteurs de protéines ostéogéniques en injection percutanée pour combler des cavités osseuses ("défects") ou traiter des fractures. Du phosphate tricalcique (TCP) ou d'autres sels de calcium, ou bien de l'acide phosphorique, peuvent être ajoutés dans ces cas (cf. WO 01/28603 A1 , aux noms de Li et al.). Il est également envisageable d'utiliser des gels de gélatine pour assurer une transfection transitoire par des plasmides. La possibilité de transfection par des éponges de collagène ou de gélatine a déjà été soulignée dans quelques publications (Truong- Le.V.L, Leong K.W. : Controlled gène delivery by DNA-gelatin nanospheres. Hum Gène Ther,9, 1709-1717 (1998), Lauffenburger D.A., Schaffer D.V., The matrix delivers, Nature Medicine, 5, 7 : 733-734 -1999)).
La transfection transitoire de plasmides portant différents gènes à action locale (facteurs de croissance ou morphogéniques) permet d'avoir une synthèse régulée de ces facteurs d'information durant quelques semaines.
En ce qui concerne l'hémostase, la nécessité de freiner ou d'interrompre un saignement apparaît de façon cruciale particulièrement lors d'opérations chirurgicales. En particulier, les interventions chirurgicales en chirurgie abdominale, thoracique ou même orthopédique s'accompagnent toujours de saignements pouvant être très importants qui peuvent amener à une chute du volume sanguin. Ces pertes sanguines peuvent conduire à une anémie postopératoire nécessitant des transfusions sanguines. Or il existe un risque médical important lors d'une transfusion sanguine pratiquée dans Ie cadre de la compensation des pertes sanguines lors d'interventions chirurgicales banales, du fait de l'éventuelle transmission de maladies virales ou à agents infectieux non conventionnels du type prion présents dans le sang transfusé. Lors d'interventions chirurgicales, les pertes sanguines les plus fréquentes ne se font pas du fait de saignements de gros vaisseaux ou d'artérioles, qui nécessitent une ligature ou bien une cautérisation, mais plutôt par suintement ou bien par hémorragie en nappe, ou même par évaporation lorsque la surface du champ opératoire est importante.
Les saignements survenant dans le cadre d'interventions chirurgicales nécessitent l'utilisation de compresses en tissu ou bien en collagène, en gélatine, ou en cellulose oxydée, afin d'assurer une coagulation de contact d'une part, et aussi dans le but de libérer le champ opératoire du sang qui obstrue la vue du chirurgien d'autre part.
Il s'avère cependant que l'utilisation de compresses à ces fins présente des inconvénients importants, car la compresse n'assure d'une part qu'un contact ponctuel avec la zone qui saigne et d'autre part n'assure aucune étanchéité lors de son contact avec la zone de saignement. De plus sa surface est limitée à quelques cm2, ce qui est très souvent inférieur à la surface des zones de saignement à traiter.
Par ailleurs, une des complications classiques liées à l'utilisation des compresses en tissu, c'est à dire non biodégradables, est le risque d'oubli dans la zone opératoire par le chirurgien lors de la fermeture de cette dernière. La réduction de ce risque passe obligatoirement par une procédure de comptage long et fastidieux des compresses en fin d'opération, ce qui réduit certes le risque, mais sans pour autant le supprimer, puisque les exemples de ré-intervention afin de récupérer dans l'abdomen une compresse oubliée ne manquent pas.
Les compresses en cellulose oxydée, quant à elles, bien qu'elles soient biodégradables, peuvent présenter des problèmes de migration aboutissant dans certains cas à de graves lésions nerveuses. Cela conduit certains utilisateurs à opérer leur retrait malgré leur biodégradabilité, avant fermeture du site opératoire.
Il existe donc un besoin de disposer d'un produit présentant les propriétés fonctionnelles de la gélatine, les avantages d'une compresse et s'affranchissant de ses inconvénients, et dont les propriétés essentielles soient donc les suivantes :
• biocompatible,
• biodégradable, • stérile,
• permettant de couvrir une grande surface,
• pouvant recouvrir de manière étanche la zone de saignement,
• assurant une hémostase locale par contact, • n'obstruant pas la vue du chirurgien,
• simple d'utilisation.
Le document N0 WO 03/055531 décrit un agent hémostatique sous forme de poudre de gélatine.
Le document N° WO 03/007845 décrit des compositions de gélatine réticulées sèches, utilisables comme produits à action hémostatique. Il peut s'agir d'un gel de gélatine de concentration pouvant aller de 1 % à 70 % en poids, généralement de 3 % à 10 %, et cette gélatine est réticulée par exposition à une radiation gamma de 0,3 à 3 millirads. La composition sèche est placée dans un premier compartiment d'un "kit" dont l'autre compartiment contient le milieu aqueux de réhydratation.
Le document N0 WO 2005/072700 décrit des compositions hémostatiques pulvérisables à base de collagène prêtes à l'emploi.
Les compositions selon ces différents documents sont estimées comme non optimales pour l'utilisation recherchée, et la présente invention a pour but de proposer un procédé d'obtention d'une composition atteignant cet objectif.
Le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes :
- réalisation d'un gel de gélatine de concentration allant de 5 à 30 %, et de préférence 15 % à 20% ;
- irradiation de ce gel de gélatine au moyen d'un rayonnement ionisant mettant en oeuvre notamment des rayonnements de type gamma ou béta, à une dose minimale de 25 kGray et de préférence de 30 kGray ;
- dispersion du gel de gélatine réticulée dans un véhicule aqueux stérile, et
- introduction dudit gel dans un récipient sous pression équipé de moyens de pulvérisation sous pression. La demanderesse a constaté que l'irradiation d'un gel de gélatine à une intensité nécessaire pour le stériliser entraîne une réticulation des protéines par création de liaisons hydrogène et lui donne des propriétés physiques différentes et des propriétés hémostatiques plus importantes. L'irradiation est de nature ionisante et met en œuvre plus particulièrement des rayonnements gamma ou béta. En outre les propriétés rhéologiques du produit obtenu sont modifiées, ce qui permet sa pulvérisation optimale. Ainsi le produit objet de l'invention peut, par pulvérisation, couvrir une zone opératoire allant jusqu'à quelques dizaines de cm2 et de préférence 1 à 10 cm2. Cette formulation pharmaceutique lui permet en outre d'être appliquée sans recours à quelque instrument médical comme cela est nécessaire pour des compresses. La forme pulvérisable de ce produit lui confère donc une grande simplicité d'utilisation et aussi, ce qui constitue un avantage supplémentaire, une aptitude à atteindre des zones difficilement accessibles aux compresses, comme par exemple, des plis cutanés ou des conduits.
Le récipient est un récipient aérosol pour pulvérisation, et peut être à usage unique par souci d'utiliser une préparation stérile. La valve utilisée dans le système pulvérisateur évite tout contact entre le produit et le gaz propulseur, et permet aussi d'administrer un volume déterminé du produit. On peut également utiliser des flacons à pompes opérant sous pression d'air, mais les volumes pulvérisés sont alors plus faibles.
L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques à action hémostatique destinées à être pulvérisées, contenant à titre de principe actif une solution de gélatine réticulée, obtenues par le procédé selon la revendication 1, c'est-à-dire comprenant un gel de gélatine de concentration allant de 5 à 30 % et de préférence de 15 à 20 %, réticulé par une irradiation au moyen d'un rayonnement ionisant mettant en œuvre notamment des rayonnements du type gamma ou béta, à une dose minimale de 25 kGray et de préférence de 30 kGray, et dispersé après réticulation dans un véhicule aqueux stérile.
L'invention concerne également une solution de gélatine, qui est caractérisée en ce qu'elle présente une concentration en gélatine réticulée allant de 5 à 30 %, et de préférence 15 % à 20% dispersée dans un véhicule aqueux stérile. On peut en outre incorporer au produit objet de l'invention, des substances médicamenteuses à activité locale ou générale, comme par exemple des molécules venant renforcer l'hémostase telles que des activateurs de la coagulation comme le collagène ou bien la thrombine ainsi que d'autres molécules impliquées dans la coagulation comme la fibrine, certains facteurs plasmatiques ou encore des protéines du système du complément. D'autres molécules à actions locales ou générales peuvent être associées au produit objet de l'invention, comme par exemple des anti-inflammatoires, des eicosanoides ou des dérivés de l'acide phenylacétique, des facteurs de croissance ou bien des protéines morphogéniques qui ont une action sur la cicatrisation des tissus conjonctifs. On peut également associer des cellules souches au nouveau produit afin que des cellules soient fixées dans le film déposé sur un tissu ou un organe pour localiser les cellules. Les cellules souches cultivées dans des solutions isotoniques de gélatine se développent d'une manière comparable à leur développement dans des milieux de culture classiques.
Enfin, des molécules à action systémique peuvent être introduites dans le produit objet de l'invention, soit lors de la pulvérisation, soit au préalable dans le produit selon l'invention, comme des antibiotiques, par exemple la néomycine ou la gentamycine, des antifongiques par exemple l'éconazole ou la ciclopiroxolamine, des hormones sexuelles par exemple des oestrogènes, androgènes ou anti-androgènes,...
Les produits selon l'invention trouvent des utilisations multiples en raison de la facilité de pulvérisation. On pourra citer l'emploi comme hémostatique, comme vecteur de médicaments d'action locale ou systémique (antibiotiques par exemple), pour vectoriser des cellules souches, ou encore en chirurgie plastique pour rehausser ou combler des tissus.
Les exemples ci-dessous ont pour objet d'illustrer l'invention en ce qui caractérise son mode de fabrication, ses propriétés et son utilisation, sans toutefois limiter la portée de l'invention.
Exemple 1 : Procédé de fabrication du nouveau produit
Différentes concentration de gélatine : des gels de gélatine à 8, 10, 12, 15 et 30% ont été préparés et coulés dans des tubes à hémolyse, puis irradiés par rayons gamma à une dose de 25 kGy minimum et deux doses de 25 kGy maximum. Leur rhéologie, c'est-à-dire l'étude de leur écoulement, a ensuite été évaluée à 2O0C par des évaluateurs indépendants qui les ont classés en deux catégories : pulvérisables et non pulvérisables. Il a été déterminé que la viscosité du produit obtenu après irradiation était fonction de la dose d'irradiation et du pourcentage de gélatine que le produit contient. Seuls les gels à 8, 10, 12 et 15% irradiés à 25 kGy minimum permettent une pulvérisation du nouveau produit. Les concentrations supérieures en gélatine ainsi que les irradiations supérieures ne permettent pas de pulvérisation, la solution étant trop visqueuse.
Exemple 2 : Essais de pulvérisation des nouveaux produits en fonction de différentes concentration de gélatine
Des gels de différentes concentrations en gélatine (8, 12, 15 %) ont été conditionnés dans des containers pour aérosol équipés de valves à poche et de différents types de diffuseur spray ou gel. Avant stérilisation, la pulvérisation des produits à 12 et 15 %, sur des plaques de verre à 370C, est la plus couvrante.
Après stérilisation à 25 kGy ou 30 kGy minimum, les produits obtenus sont pulvérisés et placés à 37°C. Ces produits forment un film beaucoup plus adhérent que les échantillons non irradiés et permettent de recouvrir une unité de surface d'une manière plus homogène que précédemment.
Exemple 3 : Influence de la stérilisation sur la viscosité des produits
La viscosité des produits est mesurée grâce à un viscosimètre Brookfield équipé d'une aiguille Helipath.
Le gel de gélatine à 15 % avant stérilisation manifeste une viscosité de 4000 cps à la vitesse de 3 tpm (12% Torque) à 210C. Le pH de la solution est mesuré à 5,24.
Le produit obtenu après stérilisation (vidange d'un spray stérilisé) manifeste une viscosité de 830 000 à 930 000 cps à la vitesse de 3 tpm (60% Torque) à 210C. Le pH de la solution est mesuré à 5,58.
Exemple 4: Utilisation du nouveau produit en chirurgie abdominale. Des chiens sous anesthésie générale sont placés en décubitus dorsal, une ouverture abdominale médiane sur la ligne blanche est effectuée pour des interventions chirurgicales variées : occlusions, perforation intestinale. Les artérioles visibles dans l'ouverture abdominale sont suturées et la surface de section est essuyée avec une compresse des deux cotés et la moitié de la section abdominale subit une pulvérisation par le produit selon l'invention. Différentes concentrations du nouveau produit ont été utilisées (une par chien). Le saignement est comparé visuellement dans la partie nue et la partie recouverte. Une diminution significative du temps de saignement est constaté dans la partie qui est couverte par le film formé par le nouveau produit.
Exemple 5 : Pulvérisation du nouveau produit à la surface d'une culture de cellules souches.
Des cellules souche mésenchymateuses humaines ont été cultivées en monocouche à la surface de boîtes de Pétri en polystyrène. Les cellules sont obtenues suivant la méthode suivante : Des fragments de 2-3 mm de côté de tissu osseux spongieux ont été prélevés lors d'interventions chirurgicales pour correction de scoliose. Ils sont lavés dans du sérum physiologique et placés à la surface des boîtes de Pétri dans du milieu de culture composé de DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal et de glutamine.
Les boites sont incubées deux à trois semaines à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2. Lorsque les cellules contenues dans les fragments osseux ont migré à la surface de la boîte et sont quasiment à confluence, celles-ci sont remises en suspension par une solution de trypsine et transférées dans une autre boîte de Pétri.
Deux jours après leur transfert, le milieu de culture est enlevé. Le produit préparé avec une concentration de 15% de gélatine réticulée dans du milieu de culture DMEM, est déposé à la surface de la monocouche cellulaire pour 72 heures. Au terme de cette période, le produit à base de gélatine réticulée est enlevé et un test au bleu trypan est effectué afin de détecter les cellules mortes. Leur proportion n'est pas significativement différente de celle d'une culture témoin dans le milieu de culture seul. Ceci montre que le nouveau produit à base de gélatine réticulée peut servir de vecteur aux cellules mésenchymateuses.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé de préparation de compositions hémostatiques pulvérisables, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- réalisation d'un gel de gélatine de concentration allant de 5 à 30 % ;
- irradiation de ce gel de gélatine au moyen d'an rayonnement ionisant mettant en oeuvre notamment des rayonnements de type gamma ou béta, à une dose minimale de 25 kGray ;
- dispersion du gel de gélatine réticulée dans un véhicule aqueux stérile, et
- introduction dudit gel dans un récipient sous pression équipé de moyens de pulvérisation sous pression.
2 - Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la concentration du gel de gélatine va de 15 à 20 %.
3 - Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que l'irradiation du gel de gélatine se fait selon une dose minimale de 30 kGray.
4 - Compositions pharmaceutiques à action hémostatique destinées à être pulvérisées, contenant à titre de principe actif une solution de gélatine réticulée, obtenues par le procédé selon l'une des revendications 1 à 3, c'est-à-dire comprenant un gel de gélatine de concentration allant de 5 à 30 %, réticulé par une irradiation au moyen d'un rayonnement ionisant mettant en œuvre notamment des rayonnements du type gamma ou béta, à une dose minimale de 25 kGray, et dispersé après réticulation dans un véhicule aqueux stérile.
5 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 4, caractérisées en ce que la concentration du gel de gélatine va de 15 à 20 %.
6 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisées en ce que l'irradiation du gel de gélatine se fait selon une dose minimale de 30 kGray. 7 - Compositions pharmaceutiques selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisées en ce que la solution de gélatine réticulée par irradiation est répartie dans des récipients sous pression à usage unique.
8 - Solution de gélatine selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle présente une concentration en gélatine allant de 5 à 30 %, et de préférence 15 % à
20%, la gélatine ayant été réticulée par une irradiation au moyen d'un rayonnement ionisant mettant en œuvre notamment des rayonnements du type gamma ou béta, à une dose minimale de 25 Kgray, et de préférence de 30 Kgray, et en ce qu'elle est dispersée après réticulation dans un véhicule aqueux stérile.
9 - Solution de gélatine selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle contient un sel de calcium ou bien un sel de l'acide orthophosphorique.
10 - Solution de gélatine selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle contient un ou plusieurs composés d'action complémentaire ou synergique choisis parmi les antibiotiques, antifongiques, anti- inflammatoires, hormones, eicosanoides, facteurs de croissance, facteurs morphogéniques, collagène, thrombine, fibrine ou facteurs de coagulation.
11 - Solution de gélatine selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle contient des plasmides destinés à transfecter les cellules au contact du film obtenu par pulvérisation.
12 - Solution de gélatine selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle contient des cellules vivantes ou inoculées par des cellules vivantes lors de l'émission du produit.
13 - Utilisation de la solution de gélatine selon l'une des revendications 8 à 12, comme préparation hémostatique par contact.
14 - Utilisation de la solution de gélatine selon l'une des revendications 8 à
12 en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques dans lesquelles la solution sert de vecteur pour des médicaments d'action locale ou systémique. 15 - Utilisation de la solution de gélatine selon l'une des revendications 8 à 12 en vue de la réalisation de compositions pharmaceutiques dans lesquelles la solution sert à vectoriser des cellules souche, en particulier dans les défects cartilagineux.
16 - Utilisation de la solution de gélatine selon l'une des revendications 8 à 12 en vue de Ia réalisation de compositions pharmaceutiques dans lesquelles la solution sert, en chirurgie plastique, au rehaussement ou au comblement de tissus.
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