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WO2005113743A2 - Vorrichtung zur durchführung einer liquid-air-kultur von epithel - Google Patents

Vorrichtung zur durchführung einer liquid-air-kultur von epithel Download PDF

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WO2005113743A2
WO2005113743A2 PCT/EP2005/005446 EP2005005446W WO2005113743A2 WO 2005113743 A2 WO2005113743 A2 WO 2005113743A2 EP 2005005446 W EP2005005446 W EP 2005005446W WO 2005113743 A2 WO2005113743 A2 WO 2005113743A2
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WO
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matrix
culture
medium
vessel
epithelium
Prior art date
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PCT/EP2005/005446
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Jürgen OSTWALD
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Universitaet Rostock
Original Assignee
Universitaet Rostock
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Publication date
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a device and a kit for carrying out a liquid air culture of epithelium. Furthermore, the invention relates to a method for producing a matrix coated with collagen, which is part of the device, the use of said device for liquid-air culture of epithelium and a method for liquid-air culture of epithelium.
  • the fabric produced in this way has many areas of application, e.g. B. in cell biological research on the structure and function of weave, as a test system for medication and for transplantation.
  • the prosthetic restoration of the defects described could take place if it is possible to locate epithelial cells on artificial, biocompatible matrices and to differentiate them into functional epithelium, which after implantation alone or possibly in combination with other materials that could contribute to the shaping and ensuring mechanical properties, be adapted by the organism.
  • autologous equivalents of the epithelium would be particularly useful, so that problems with rejection of the grafts that arise when using non-autologous tissue are avoided.
  • Artificial autologous tissue can then be used to replace structures with defective or no longer existing epithelium in certain anatomical regions. It is essential that the new fabric has approximately the same specific functions as the original fabric. The tissue must therefore be finally differentiated and must not be in the dedifferentiated phase that is essential for proliferation and growth.
  • One way of generating epithelium is to culture adherent epithelial cells with a covering medium, that is to say in a submerged culture. For example, it has been proposed to cultivate bone marrow cells, but also skin cells, on a sterile nylon mesh which has been precoated with collagen or incubated with fibroblasts which produce collagen (DE 37 515 19 / WO 87/06120).
  • the liquid-air culture differs from the submerged culture in that the cells are cultivated here at the interface between medium and air, so that a supply of medium is possible from below and there is contact with air from above.
  • the in vitro generation of skin equivalents generally takes place in the liquid-air culture on a collagen gel in which fibroblasts are embedded.
  • the collagen gel is e.g. cast on the polycarbonate membrane of a tissue culture insert.
  • the collagen gel intended for transplantation is not very stable because it does not comprise a foreign, stable matrix that would give it additional stability and tear resistance. Therefore, the generated tissue is often damaged during the transplant. Attempts have been made to solve these problems by attaching the collagen gel to an additionally generated collagen network (Yang et al., Tissue engineered artificial skin composed of dermis and epidermis, Artificial Organs, 2000, 24, 7-17).
  • Epithelium which was generated according to methods known in the prior art, is only suitable for transplantation to a limited extent, since on the one hand problems with the stability of pure collagen gels occur, and on the other hand the previously known matrices which are used for the liquid-air culture of Epithelial cells are used, there are severe restrictions on the size and nature of the matrix.
  • the object of the present invention is therefore to provide alternative devices for carrying out a liquid-air culture of
  • the functions' not only for the analysis of Zeil- or tissue, but can also be used for transplantation.
  • a device which is suitable for carrying out a liquid-air culture of epithelium. It comprises a culture vessel and a collagen-coated, biocompatible matrix which is permeable to culture medium, the device being designed in such a way that the matrix is oriented horizontally and does not lie on the bottom of the culture vessel and the surface of the matrix is below the upper edge of the culture vessel is located, wherein the matrix either a) rests on a medium-permeable holder and is not firmly connected to it, or
  • epithelium is the epithelial tissue of mammals, preferably humans or frequently used experimental animals such as mice, rats or pigs, which has contact with air in its physiological environment. This is the case, for example, with the skin or cornea, but also with the respiratory epithelium. Respiratory epithelium is particularly preferred.
  • epithelium includes both tissue and isolated epithelial cells.
  • the liquid air culture is particularly suitable for the culture (cultivation) and differentiation of epithelial cells which are also in contact with air in their physiological environment.
  • these are respiratory epithelial cells.
  • the matrix coated with collagen must be aligned horizontally.
  • the matrix In order to ensure access to the culture medium from the underside, the matrix must not lie on the bottom of the culture vessel, on the one hand, and on the other hand it must be permeable to the culture medium. It is therefore necessary to align the matrix above the bottom of the culture vessel.
  • the surface of the matrix (ie its upper side) must be below the upper edge of the culture vessel so that a supply with culture medium which is located in the culture vessel when the device is used is possible.
  • the fill level of the medium in the liquid-air culture should preferably be approximately +1 to -1 millimeter (mm), preferably +0.2 to -0.2 mm, based on the surface of the matrix.
  • the surface of the matrix (ie its top) should therefore lie in the interface between air and culture medium in liquid-air culture, as described above.
  • the holder on which the matrix rests is on the bottom of the culture vessel or is attached to the bottom thereof.
  • the holder it is also conceivable for the holder to be supported on the edge of the culture vessel or to be suspended on the upper edge.
  • the clip 4 has two arms, one of which engages around the frame 5 from the outside and one of the base vessel 1, e.g. through an opening 3 made therein. Bends at the ends of the arms towards the outside are particularly advantageous, as a result of which the pushing of the clip into the opening 3 of the base vessel and onto the frame 5 is facilitated.
  • the clip 4 preferably consists of elastic stainless steel, it can itself be rotated therefrom in accordance with FIG. 1.
  • the base vessel 1 and frame 5 can be clamped together by manipulating the clamp (s) with a pair of tweezers.
  • frame presupposes that the frame 5 - in contrast to a lid - does not cover the entire area (ie in its center), since otherwise the accessibility for air to the surface of the matrix is necessary for the liquid-air culture is disturbed.
  • a large central opening 8 is preferably located in the center of the frame 5.
  • Other geometric and in particular asymmetrical shapes with any position of the opening 8 are expressly included.
  • the frame 5 - preferably in the case of a round base vessel 1 - is a flat ring, in the form resembling a large washer.
  • the culture vessel Under the conditions of the liquid-air culture, there should be medium in the culture vessel, the level of which corresponds to the height of the matrix in the device. Since, when the frame 5 is placed on the base vessel 1 and the matrix, air bubbles are easily caught under the frame 5 under these conditions, it is preferred that at least one opening 6 in the frame 5 enables such air bubbles to be aspirated through the matrix with a syringe, this Culture vessel and device can be held slightly oblique to move air bubbles under the opening 6.
  • the frame 5 can also be shaped in such a way that it fixes the matrix exclusively or mainly by resting on the outside of the base vessel 1 on the matrix. In this case, slipping of the frame 5 can be prevented, for example, either by an inwardly directed edge attached to the upper edge of the frame 5 which, after the frame 5 has been placed on the edge of the base vessel 1, rests on the matrix or by projections which are attached to the side of the base vessel 1 and prevent the frame 5 from sliding further down.
  • the frame 5, if it is in contact with the outside of the base vessel 1, can also rest on the bottom of the culture vessel, provided the matrix is sufficiently large that it can be held between the base vessel 1 and the frame 5.
  • the shape of the base vessel 1 which can taper upwards on its outside, for example, can also prevent the frame from sliding further down, the shape of the frame 5 having to be adapted to the shape of the base vessel 1, so that the frame 5 can rest on the base vessel 1.
  • the wall of the base vessel 1 has at least one opening 3. This opening preferably does not break through the upper edge of the base vessel 1.
  • the openings 3 are c furthermore suitable for anchoring the clamp (s) 4, the base vessel 1 and the frame. If the base vessel 1 is sufficiently stable, it is not necessary for the base vessel 1 to have a bottom.
  • a holder comprises a support surface for the matrix, which is a network.
  • This contact surface ensures that the epithelium to be cultured is supplied with medium from the underside of the matrix.
  • the network of the contact surface is preferably coarse-meshed, that is to say has a mesh size of at least 50-500 ⁇ m.
  • This holder also preferably stands on the bottom of the culture vessel or is attached to the bottom thereof.
  • a central support or at least three supports attached to the edge of the support surface at a suitable location connect the support surface and the bottom of the culture vessel.
  • the matrix for liquid-air culture is introduced into the interface between air and culture medium in that the matrix is buoyant.
  • the matrix can be buoyant because it is partially coated with a hydrophobic layer.
  • the arrangement and size of the parts or of the part of the matrix which must be coated with the hydrophobic layer in order to allow the matrix to float horizontally on the medium depends on the shape, size and other configuration of the matrix. Basically, it is e.g. possible to coat a central part in the center of gravity of the matrix or several parts at the edge of the matrix, which are arranged uniformly around the center of gravity of the matrix, with the hydrophobic layer. It is also possible to cover the entire edge of the matrix. Other possibilities can easily be determined by a specialist.
  • Such a hydrophobic layer can be applied by immersing the matrix or the mesh in a solution of wax and / or fat in a hydrophobic volatile solvent so that the wax and / or fat evaporates the threads but not the threads after the solvent has evaporated Interstices of the network cover.
  • the solvent is preferably gasoline or hexane.
  • a concentration of wax and / or fat in the solvent of 0.1-20% is particularly suitable.
  • Particularly suitable fats are e.g. Paraffins with a melting temperature of 50-70 ° C.
  • Resistant materials can also be suitable for the matrix, e.g. Polyethylene, polyamide, polyester, polyurethane, polypropylene or a mixture thereof.
  • the material of the matrix is preferably not immunogenic, so that there is neither a risk of rejection during transplantation nor does immunosuppression need to be carried out. It is crucial, however, that the material is biocompatible, e.g. not cytotoxic.
  • a test for the biocompatibility of matrix materials is in Ostwald et al. (see above). For matrices made of materials other than those mentioned, biocompatibility e.g. with the test described there.
  • the matrix used in the device is a network or network, the mesh size of the network preferably being approximately 50-500 ⁇ m. In principle, however, is also a smaller mesh size Network, up to about 0.2 or 0.4 ⁇ m possible, but this is less expedient because of an unfavorable ratio of permeable area to non-permeable area of the network.
  • the stitches can be regular or irregular in shape.
  • the permeability of the matrix for the culture medium could also be ensured in that the matrix is porous.
  • a porous matrix made of PLLA could be used (Lo et al., J Biomed Mater Res 1996, 30, 475-484). This material is particularly interesting because it has been successfully tested as a carrier with slow release of active substances (Zilberman et al., J Biomater Sei Polym Ed, 2002, 13, 1221-1240). Through targeted drug delivery in vivo after a transplant, this material could therefore be used to control specific processes, e.g. to promote vascularization.
  • the device can - with a new matrix - be reusable. Therefore, the holder used in the device preferably consists of a sterilizable (eg autoclavable material) such as stainless steel, Teflon or glass. Has glass, as well as plastic, the advantage that microscopic inspection is possible when cells are being cultivated, provided that the culture vessel also consists of one of these transparent materials.
  • the culture vessel can be any vessel that is suitable for cell culture and is adapted in shape and size to the holder, that is to say is larger than the holder. A cell culture coating of the wall of the culture vessel is not necessary, since the cells are grown on the matrix.
  • the present invention also relates to a method for producing the matrix coated with collagen for carrying out a liquid-air culture, which is part of the described device. This method is characterized in that one
  • the crosslinking in step c is preferably a chemical crosslinking.
  • This crosslinking can be done with mono- or dialdehyde perform, for example with glutaraldehyde. Alternatively, however, crosslinking using physical methods, for example by radiation or dehydration, is also possible.
  • An enzymatic crosslinking of the collagen or a copolymerization with acrylic derivatives can also be carried out (DE 693 15 483).
  • the cross-linking of the collagen increases the mechanical strength, therefore the collagen-coated matrices used in the context of this invention are preferably cross-linked.
  • the cross-linking of the collagen can lead to the formation of reactive groups.
  • treatment with an amino acid or protein solution to saturate or neutralize these reactive groups should therefore be carried out in step d.
  • the washing step e serves to remove unbound amino acids or proteins and can be carried out with distilled water, but also with culture medium or another non-toxic solution, e.g. PBS. Several washing steps are preferably carried out.
  • the hydrophobic base is preferably obtained by applying a film of wax, oil or paraffin to a base. Paraffin with a melting temperature of 50-70 ° C is preferably used for this. After the paraffin has been liquefied by heat, a thin layer (sterile) is poured into a suitably sized vessel, eg plastic petri dishes Cell culture, and let it cool. After a single use for coating a network with collagen, the hydrophobic substrate is preferably discarded, on the one hand for reasons of sterility, on the other hand because of possible contamination in the following coatings by residues from the previous coatings. Storage on the hydrophobic support during collagenization has no harmful or cytotoxic effects on the subsequent cell culture.
  • the present invention furthermore relates to a method for liquid-air culture of epithelium, in which an apparatus described above is used.
  • the method for liquid-air culture of epithelium is preferably carried out until the epithelium differentiates, so that functional epithelium is present which is suitable for a transplant.
  • respiratory epithelium for example, when a layer of rounded, cobblestone-like epithelial cells has formed on at least 75% of the surface, which to a large extent demonstrate microvilli, but preferably shows moving cilia.
  • the invention further relates to a method for producing functional autologous artificial epithelium, in which
  • An apparatus for automatically regulating the fill level of the culture medium in the culture vessel can include electronically regulating the fill level with medium (cf. e.g. DE 198 01 763). However, it is simpler to use an apparatus for regulating the height of the surface of medium in a culture vessel, in which medium is fed into a culture vessel through at least one inflow and through at least one outflow, the opening of which is at the desired height of the surface of the medium, Medium is removed (see US 5,565,353).
  • culture vessel for cell and tissue culture means any vessel that is suitable for the culture of cells or tissues, preferably eukaryotic cells or tissues.
  • the culture vessel preferably consists of a material that is suitable for the Culture of cells is suitable, in particular from a plastic or glass coated for cell culture.
  • the culture vessel preferably has the basic shape of a Petri dish, but other shapes are also possible, for example a rectangular outline or the shape of cell culture bottles.
  • the culture vessel should be designed such that a sterile culture of the cells is possible. there should be sterile closed in.
  • a simple form of such a seal is elastic and therefore bears against both the drain pipe and the culture vessel.
  • Rubber or silicone seals are well known to those skilled in the art.
  • a possibly greased glass cut or the like may be suitable, however, insofar as a tight seal against the medium is not required.
  • the seal is of a suitable size so that the drain port is movable in it.
  • sterile tweezers can be used to ensure the sterility of the inside of the vessel. If the vessel has a removable lid, this can be removed for adjustment, but such adjustment is also possible, for example, by opening a cell culture bottle.
  • plugging into a connected part is a plug ken equivalent to a connected part, whereby a flow of the medium must be ensured.
  • the compartmentalization allows the comparative cultivation of, for example, cells that adhere to matrices made of different materials or of different tissue samples under otherwise identical conditions and allows the samples to be assigned reliably.
  • Different samples can also be cultivated with the aid of several devices for introducing matrices for the liquid-air culture in a culture vessel, the level of which is controlled by the medium using the control apparatus described.
  • a base e.g. a petri dish
  • a thin film of paraffin (melting point 50-70 ° C).
  • a new petri dish (diameter 80-100 mm) was poured thinly with heated paraffin, which solidifies under the laminar box.
  • a network of polyamide was immersed in a solution of paraffin in hexane, various concentrations being tested. The solvent was allowed to evaporate (at least approx. 30 minutes at RT) before use.
  • the pad was able to float on culture medium at all concentrations tested. At concentrations of 0.2-20% wax in solvent, the threads of the network were enclosed in wax, but the spaces were free. A matrix stored on the net was in contact with medium and air, and cultured respiratory epithelial cells proliferated.
  • films made of PLLA (poly-L-lactide) or PHB (poly-hydroxybutyric acid) with or without prior amino functionalization of the films or collagenisation with respiratory epithelial cells were produced using the methods described under 3. won, settled.
  • the culture took place under standard cell culture conditions (37 ° C, 5% CO 2 ) with SFM or DMEM 10% FCS. The medium was changed discontinuously after visual inspection.
  • the collagenized matrices had previously been populated with fibroblasts.
  • the culture took place under standard cell culture conditions (37 ° C, 5% CO 2 ) with SFM or DMEM 10% FCS.
  • the medium was changed discontinuously after visual inspection.
  • a submerged culture was carried out for about 14-21 days. The matrix was then clamped between the base vessel 1 and the frame 5 of a device already described and the height of the medium was adjusted so that the surface of the matrix was only minimally covered with medium.
  • Tissue fragments can be removed from the nasal septum of rabbits under anesthesia.
  • both fibroblasts and epithelial cells are obtained therefrom and sequentially settled on a reticulated collagen-coated polyamide matrix.
  • a liquid-air culture is carried out, in which the matrix is clamped between the base vessel 1 and the frame 5 of a device already described and the height of the medium is adjusted so that the surface of the The matrix is only minimally covered with medium until microvilli and mobile cilia appear in the epithelial cells.
  • This autologous graft can be easily detached from the liquid air culture device and used to cover a defect in the rabbit's nasal septum, again under anesthesia.
  • the graft can be fixed with fibrin glue and / or suture.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Kit zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur von Epithel. Wei­terhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer mit Kollagen beschichteten Matrix, die Teil der Vorrich­tung ist, die Verwendung der genannten Vorrichtung zur Liquid­-Air-Kultur von Epithel und ein Verfahren zur Liquid-Air-Kultur von Epithel.

Description

Vorrichtung zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur von Epithel
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Kit zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur von Epithel. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer mit Kollagen beschichteten Matrix, die Teil der Vorrichtung ist, die Verwendung der genannten Vorrichtung zur Liquid- Air-Kultur von Epithel und ein Verfahren zur Liquid-Air-Kultur von Epithel.
Die biotechnologische Herstellung von fun tionellem Gewebe in vi tro wird im allgemeinen als „tissue engineering" bezeichnet.
So hergestelltes Gewebe hat viele Anwendungsgebiete, z. B. in der zellbiologischen Forschung zu Aufbau und Funktion von Ge- weben, als Testsystem für Medikamente und für die Transplantation .
Die biotechnologische Herstellung von epithelialem Gewebe ist in Ihrer Anwendbarkeit unterschiedlich fortgeschritten. Die Herstellung von Hautersatz, der z. B. bei großflächigen Verbrennungswunden eine wichtige Anwendung findet, wird intensiv erforscht. Die in vi tro Generierung von Cornea-Gewebe ist attraktiv, jedoch noch wenig anwendungsbereit. Auch der für die Herstellung von respiratorischem Epithel bestehende Bedarf kann noch nicht gedeckt werden.
In einigen anatomischen Regionen des respiratorischen Traktes besteht Bedarf nach Ersatz von defekter oder nicht mehr vorhandener respiratorischer Schleimhaut bzw. von respiratorischem Epithel. So existieren derzeit keine befriedigenden therapeutischen Möglichkeiten zur Versorgung langstreckiger Trachealstenosen . Die schnelle Obstruktion des Prothesenlumens durch einwachsendes Bindegewebe unter Ausbildung neuer Stenosen, die mangelhafte Gewebeintegration und die Abstoßungsge- fahr limitieren einen langfristigen Einsatz der gegenwärtig eingesetzten alloplastischen Materialien. Voraussetzung für einen erfolgreichen Trachealersatz ist die Realisierung einer Auskleidung mit funktionsfähigem respiratorischen Epithel.
Eine weitere Indikation für den Einsatz des tissue engineering für die Herstellung von respiratorischem Epithel besteht im Verschluß von Septumperforationen. Die Behandlung von Septumperforationen ist problematisch. Dabei ist die Operation ge¬ genwartig die Methode der Wahl, allerdings mit relativ schlechten Erfolgsaussichten. Prothetische Verschlüsse mit Si- likonobturatoren können die perforationsspezifischen Symptome kaum beeinflussen. Weiterhin erscheint auch der Ersatz ausgeräumter Schleimhaut in Nasennebenhöhlen therapeutisch sinnvoll. Eine weitere Indikation für einen möglichen klinischen Einsatz von in vi tro hergestelltem respiratorischen Epithel im HNO-Fachbereich liegt im Bereich der rekonstruktiven Chirurgie des Larynx.
Die prothetische Versorgung der geschilderten Defekte könnte erfolgen, wenn es gelingt, Epithelzellen auf artifiziellen, biokompatiblen Matrizes anzusiedeln und zu funktionsfähigem Epithel auszudifferenzieren, die nach Implantation allein oder möglicherweise in Kombination mit anderen Materialien, die zur Formgebung und Gewährleistung mechanischer Eigenschaften bei- tragen könnten, vom Organismus adaptiert werden.
Besonders sinnvoll wäre die Generierung und der Einsatz von autologen Äquivalenten des Epithels, so dass Probleme mit Abstoßung der Transplantate vermieden werden, die bei Verwendung von nicht autologem Gewebe entstehen. Artifizielles autologes Gewebe kann dann dazu dienen, in bestimmten anatomischen Regionen Strukturen mit defektem oder nicht mehr vorhandenem Epithel zu ersetzen. Dabei ist es essentiell, dass das neue Gewebe annähernd die gleichen spezifischen Funktionen erfüllt wie das ursprünglich vorhandene Gewebe. Das Gewebe muss also final differenziert sein und darf sich nicht in der für Proliferation und Wachstum wesentlichen dedifferenzierten Phase befinden.
Eine Möglichkeit der Generierung von Epithel liegt in der Kultur von adhärenten Epithelzellen mit bedeckendem Medium, also in einer submersen Kultur. Beispielsweise wurde vorgeschlagen, Knochenmarkzellen, aber auch Hautzellen, auf einem sterilen Nylonnetz zu kultivieren, das mit Kollagen vorbeschichtet oder mit Fibroblasten inkubiert wurde, die Kollagen produzieren (DE 37 515 19/WO 87/06120) .
Auch Zellen aus der respiratorischen Schleimhaut wurden bereits auf Kollagen-beschichteten Matrizes kultiviert, wobei es jedoch nicht zur Entwicklung final differenzierter Epithelzellen kam (Ostwald et al., Laryngo-Rhino-Otologie 2003, 82, 693- 699) .
Von der submersen Kultur unterscheidet sich die Liquid-Air- Kultur dadurch, dass die Zellen hier an der Grenzfläche zwischen Medium und Luft kultiviert werden, so dass von unten eine Versorgung mit Medium möglich ist und von oben Kontakt zu Luft besteht.
Die in vi tro Generation von Hautäquivalenten erfolgt im allge- meinen in der Liquid-Air-Kultur auf einem Kollagengel, in das Fibroblasten eingelagert sind. Dazu wird das Kollagengel z.B. auf der Polycarbonat-Membran eines Gewebekultureinsatzes gegossen. Das für die Transplantation bestimmte Kollagengel ist nicht sehr stabil, da es keine körperfremde, stabile Matrix umfaßt, die ihm eine zusätzliche Stabilität und Reißfestigkeit verleihen würde. Daher kommt es häufig zur Beschädigungen des generierten Gewebes bei der Transplantation. Es wurde versucht, diese Probleme durch die Anheftung des Kollagengels an ein zusatzlich generiertes Kollagennetz zu lösen (Yang et al., Tissue engineered artificial skin composed of dermis and epi- dermis, Artificial Organs, 2000, 24, 7-17) .
Auch für die Kultur von Cornea wurde gezeigt, dass die Liquid- Air-Kultur dieses Gewebes im Vergleich zur submersen Kultur eine dichtere Packung der Zellen und eine stärkere zelluläre Differenzierung verursacht, so dass die Morphologie der Cornea verbessert ist (Richard et al., Curr Eye Res 1991, 10, 739- 749) .
Die Erzeugung von weitgehend differenziertem respiratorischen
Epithel gelang bisher nur bei Liquid-Air-Kultur in Zusammen- hang mit der Ansiedlung von Fibroblasten (Rhee et al . , Ann
Otol Rhinol Laryngol 2001, 110, 1011-1016; Yamaguchi, Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1996, 122, 649-654) . Hier wird beispielsweise die PTFE-Membran eines kommerziell erhältlichen Zellkulturinserts (Millicell®-CM, Millipore, Bedford, Massachusetts) mit Kollagen beschichtet und mit Epithelzellen be- siedelt, wobei die Cokultur mit Fibroblasten untersucht wird. Diese Kulturmethode geht auf Elsdale und Bard zurück (J Cell Biol 1972, 54, 626-637). Statt der MillicelKD-Einsätze werden oft auch so genannte Transwell-Einsätze (erhältlich von Corning Costar, High-Wycombe, UK) verwendet (z.B. Davidson et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2000, 279, L766- L778). Diese Transwells bestehen aus Polyester oder Polycarbo- nat, sie sind jedoch auch bereits mit Kollagen beschichtet erhältlich .
Die bisher erfolgten Versuche zur Generierung von funktionel- lem respiratorischen Epithel hatten vor allem das Ziel, final differenzierte respiratorische Epithelzellen zu generieren, um analytische Fragestellungen hinsichtlich der Funktion differenzierter Zellen (Zilienschlag, Mucin-Produktion etc.) zu klären. Die Menge des produzierten Epithels ist dafür nicht entscheidend, so dass die kommerziell erhältlichen Systeme zur Liquid-Air-Kultur ausreichend waren.
Epithel, das nach im Stand der Technik bekannten Verfahren generiert wurde, eignet sich nur begrenzt zur Transplantation, da zum einen Probleme mit der Stabilität von reinen Kollagen- gelen auftreten, und zum anderen die bisher bekannten Matrizes, die zur Liquid-Air-Kultur von Epithelzellen verwendet werden, starken Beschränkungen hinsichtlich der Größe und Beschaffenheit der Matrix unterworfen sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, alternative Vorrichtungen zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur von
Epithel bereit zu stellen, die eine erhöhte Flexibilität bei der Ausgestaltung der Matrix erlauben, so dass Epithel gene- riert werden kann, das nicht nur zur Analyse von Zeil- oder Gewebe'funktionen, sondern auch zur Transplantation verwendet werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung einer Vorrichtung gelöst, die zur Durchführung einer Liquid- Air-Kultur von Epithel geeignet ist. Sie umfasst ein Kulturgefäß und eine mit Kollagen beschichtete, für Kulturmedium per- meable biokompatible Matrix, wobei die Vorrichtung so ausgebildet ist, dass die Matrix horizontal ausgerichtet ist und nicht auf dem Boden des Kulturgefäßes aufliegt und die Oberflache der Matrix sich unter der Oberkante des Kulturgefäßes befindet, wobei die Matrix entweder a) auf einer für Medium permeablen Halterung aufliegt und mit dieser nicht fest verbunden ist oder
b) schwimmfähig ist.
Als Epithel wird im Rahmen dieser Erfindung epitheliales Gewebe von Säugetieren, bevorzugt von Menschen oder häufig verwendeten Versuchstieren wie Maus, Ratte oder Schwein, bezeichnet, das in seiner physiologischen Umgebung Kontakt zu Luft hat. Das ist beispielsweise bei Haut oder Cornea, aber auch bei respiratorischem Epithel der Fall. Respiratorisches Epithel ist besonders bevorzugt. Der Begriff Epithel schließt dabei sowohl Gewebe als auch vereinzelte Epithelzellen mit ein.
Die Liquid-Air-Kultur ist besonders zur Kultur (Kultivierung) und Differenzierung von Epithelzellen geeignet, die auch in ihrer physiologischen Umgebung in Kontakt mit Luft stehen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform handelt es sich dabei um respiratorische Epithelzellen. Für die Versorgung der Zellen mit Medium auf der basalen Seite ist Kontakt mit Medium not- wendig, so dass die Unterlage, auf der die Epithelzellen adhä- rent wachsen, in diesem Fall also die mit Kollagen beschichtete Matrix, horizontal ausgerichtet sein muß. Um die Zugänglichkeit für Kulturmedium von der Unterseite zu gewährleisten, darf die Matrix zum einen nicht auf dem Boden des Kulturgefä- ßes aufliegen, zum anderen muss sie für Kulturmedium permeabel sein. Es ist also eine Ausrichtung der Matrix über dem Boden des Kulturgefäßes notwendig. Genauso muss sich die Oberfläche der Matrix (d.h. ihre Oberseite) unter der Oberkante des Kulturgefäßes befinden, damit eine Versorgung mit Kulturmedium, das sich bei Verwendung der Vorrichtung in dem Kulturgefäß befindet, möglich ist. Die Füllhöhe des Mediums bei der Liquid- Air-Kultur sollte vorzugsweise ca. +1 bis -1 Millimeter (mm), bevorzugt +0,2 bis -0,2 mm, bezogen auf die Oberfläche der Matrix, betragen. Die Oberfläche der Matrix (d.h. ihre Obersei- te) soll bei der Liquid-Air-Kultur also in der Grenzfläche zwischen Luft und Kulturmedium liegen, wie oben beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht die Halterung, auf der die Matrix aufliegt, auf dem Boden des Kulturgefäßes oder ist auf dessen Boden angebracht. Alternativ ist auch denkbar, dass die Halterung an dem Rand des Kulturgefäßes abgestützt oder an der Oberkante eingehängt ist.
Die Halterung ist in einer bevorzugten Ausführungsform (siehe Fig.l) ein nach oben offenes Basisgefäß 1 mit einem ebenen Rand, auf dessen Rand die Matrix 10 aufliegt. Das Basisgefäß 1 ist in einer bevorzugten Ausführungsform mit einer Petrischale vergleichbar. Neben einer runden Form der Grundfläche kann jedoch auch eine beliebige andere Form, z.B. quadratisch oder rechteckig, gewählt werden. Der ebene Rand gewährleistet die horizontale Ausrichtung der Matrix, die für die Liquid-Air- Kultur notwendig ist. Bei einer ausreichenden Steife der Matrix kann es genügen, dass die Matrix an mindestens drei Auflagepunkten auf dem Rand des Basisgefäßes aufliegt. Vorzugsweise liegt die Matrix jedoch auf dem gesamten Rand des Basisgefäßes 1 auf.
Dabei ist es bevorzugt, dass über dem gesamten Rand des Basisgefäßes 1 ein Rahmen 5 auf der Matrix aufliegt. Alternativ kann ein Rahmen 5 auch nur an einigen Punkten, z. B. 3, 4 oder mehr Auflagepunkten, auf der Matrix aufliegen. Der Rahmen 5 halt die Matrix auf dem Basisgefäß 1 fest, wobei die Matrix vorzugsweise so zwischen Basisgefäß 1 und Rahmen 5 eingebracht wird, dass sie straff liegt. Das Gewicht des Rahmens 5 kann ausreichen, um die Matrix auf dem Basisgefäß 1 straff zu halten. Vorzugsweise verbindet jedoch mindestens eine Klammer 4 den Rahmen 5 und das Basisgefäß 1 auf der Außenseite von Rahmen 5 und Basisgefäß 1, so dass die Integrität der Matrix nicht durch die Klammer 4 gestört wird.
Die Klammer 4 hat zwei Arme, von denen einer von außen den Rahmen 5 umgreift und einer das Basisgefäß 1, z.B. durch eine darin angebrachte Öffnung 3. Von besonderem Vorteil sind Biegungen an den Enden der Arme nach außen, durch die das Schieben der Klammer in die Öffnung 3 des Basisgefäßes und auf den Rahmen 5 erleichtert wird. Bevorzugt besteht die Klammer 4 aus elastischem Niro-Stahl, sie kann daraus gemäß Fig. 1 selbst gedreht werden. Das Verklammern von Basisgefäß 1 und Rahmen 5 kann durch Handhabung der Klammer (n) mit einer stärkeren Pinzette erfolgen.
Die Bezeichnung Rahmen setzt voraus, dass der Rahmen 5 - im Gegensatz zu einem Deckel - nicht die gesamte Fläche (d.h. in seinem Zentrum) bedeckt, da ansonsten die Zugänglichkeit für Luft an die Oberfläche der Matrix, die für die Liquid-Air- Kultur notig ist, gestört wäre. Bevorzugt befindet sich eine große zentrale Öffnung 8 in der Mitte des Rahmens 5. Andere geometrische und insbesondere asymmetrische Formen mit beliebiger Lage der Öffnung 8 sind ausdrücklich eingeschlossen. Es gibt mehrere Möglichkeiten zur Ausgestaltung des Rahmens 5, der die Matrix auf dem Basisgefäß 1 reversibel fixieren soll.
In seiner einfachsten Form ist der Rahmen 5 - vorzugsweise bei einem runden Basisgefäß 1 - ein flacher Ring, in der Form ähn- lieh einer großen Unterlegscheibe.
Eine bevorzugte Möglichkeit ist jedoch, dass der Rahmen 5, der, wie beschrieben, über dem gesamten Rand des Basisgefäßes 1 auf der Matrix aufliegt, an seiner äußeren Seite einen nach unten abgewinkelten Rand 9 umfaßt, der nach dem Aufsetzen des Rahmens 5 auf das Basisgefäß 1 an der Außenseite des Basisgefäßes anliegt. Dieser Rand 9 hindert den Rahmen 5 am Verrutschen. Der Rand 9 muß dabei nicht an dem gesamten Rand des Basisgefaßes 1 anliegen, eine Gestaltung des Randes 9 ist auch so möglich, dass nur einzelne Anschläge an geeigneten Stellen angebracht sind und ein Verrutschen verhindern.
Unter den Bedingungen der Liquid-Air-Kultur soll sich Medium in dem Kulturgefäß befinden, dessen Füllhöhe der Höhe der Matrix in der Vorrichtung entspricht. Da beim Aufsetzen des Rahmens 5 auf Basisgefäß 1 und Matrix unter diesen Bedingungen leicht Luftblasen unter dem Rahmen 5 gefangen werden, ist es bevorzugt, dass mindestens eine Öffnung 6 in dem Rahmen 5 ein Absaugen solcher Luftblasen mit einer Spritze durch die Matrix ermöglicht, wobei das Kulturgefäß samt Vorrichtung leicht schräg gehalten werden kann, um Luftblasen unter die Öffnung 6 zu bewegen.
Alternativ kann der Rahmen 5 auch derartig ausgeprägt sein, dass er die Matrix ausschließlich oder hauptsächlich dadurch fixiert, dass er an der Außenseite des Basisgefaßes 1 auf der Matrix aufliegt. In diesem Fall kann ein Verrutschen des Rah- mens 5 zum Beispiel entweder durch einen am oberen Rand des Rahmens 5 angebrachten, nach innen gerichteten Rand verhindert werden, der nach dem Aufsetzen des Rahmens 5 auf dem Rand des Basisgefäßes 1 auf der Matrix aufliegt oder durch Ansätze, die seitlich am Basisgefäß 1 angebracht sind und ein weiteres Heruntergleiten des Rahmens 5 verhindern. Auch kann der Rahmen 5, wenn er an der Außenseite des Basisgefäßes 1 anliegt, auf dem Boden des Kulturgefäßes aufliegen, sofern die Matrix ausreichend groß ist, dass sie zwischen Basisgefäß 1 und Rahmen 5 festgehalten werden kann. Selbstverständlich kann der Rahmen auch durch die Form des Basisgefäßes 1, das sich z.B. an seiner Außenseite nach oben hin verjüngen kann, am weiteren Heruntergleiten gehindert sein, wobei die Form des Rahmens 5 der Form des Basisgefäßes 1 angepaßt sein muß, so dass der Rahmen 5 am Basisgefäß 1 anliegen kann.
Um einen Austausch zwischen dem Medium in Basisgefäß 1 und Kulturgefäß zu ermöglichen, ist es bevorzugt, dass die Wand des Basisgefäßes 1 mindestens eine Öffnung 3 aufweist. Diese Öffnung durchbricht vorzugsweise nicht den oberen Rand des Basisgefäßes 1. Die Öffnungen 3 sindc weiterhin dazu geeignet, die Klammer (n) 4, die Basisgefäß 1 und Rahmen verbin- det/verbinden, zu verankern. Bei einer ausreichenden Stabilität des Basisgefäßes 1 ist es nicht notwendig, dass das Basisgefäß 1 einen Boden aufweist.
Eine andere Vorrichtung, die es ermöglicht, eine Matrix für die Liquid-Air-Kultur horizontal über dem Boden und unter der Oberkante des Kulturgefäßes zu halten, ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Halterung eine Auflagefläche für die Matrix umfaßt, die ein Netz ist. Diese Auflagefläche gewährleistet die Versorgung des zu kultivierenden Epithels mit Medium von der Unterseite der Matrix. Bevorzugt ist das Netz der Auflagefläche grobmaschig, hat also eine Maschenweite von mindestens 50-500 μm. Auch diese Halterung steht bevorzugt auf dem Boden des Kultur- gefaßes oder ist auf dessen Boden angebracht. Bevorzugt verbinden eine zentrale oder mindestens drei am Rand der Auflagefläche an geeigneter Stelle angebrachte Stützen die Auflagefläche und den Boden des Kulturgefäßes. Vorzugsweise liegt über dem Rand der Matrix ein Rahmen auf, der diese straff auf der Auflagefläche festhält. Der Rahmen kann dies durch sein Gewicht bewirken, er kann jedoch auch durch Klammern oder Haken mit der Auflagefläche oder den Stützen der Halterung verbunden sein. Auch diese Befestigung ist reversibel.
In einer anderen Ausführungsform der Vorrichtung wird die Matrix zur Liquid-Air-Kultur in die Grenzfläche zwischen Luft und Kulturmedium eingebracht, indem die Matrix schwimmfähig ist.
Die Matrix kann deshalb schwimmfähig sein, weil sie teilweise mit einer hydrophoben Schicht überzogen ist. Die Anordnung und Größe der Teile oder des Teils der Matrix, der mit der hydrophoben Schicht überzogen sein muß, um die Matrix horizontal auf dem Medium schwimmen zu lassen, ist von der Form, Größe und sonstigen Ausgestaltung der Matrix abhängig. Grundsätzlich ist es aber z.B. möglich, einen zentralen Teil im Schwerpunkt der Matrix oder mehrere Teile am Rand der Matrix, die gleichmäßig um den Schwerpunkt der Matrix angeordnet sind, mit der hydrophoben Schicht zu überziehen. Genauso ist es möglich, den gesamten Rand der Matrix zu überziehen. Weitere Möglichkeiten lassen sich leicht durch den Fachmann bestimmen.
Die Matrix kann aber auch dadurch schwimmfähig sein, dass sie mit mindestens einem schwimmfähigen Körper verbunden ist oder auf ihm aufliegt, wobei die Matrix mit dem schwimmfähigen Körper so verbunden sein muß oder so auf ihm aufgelagert sein muß, dass ihre Oberseite bei Schwimmen in Kulturmedium in der Grenzfläche zwischen Luft und Kulturmedium ausgerichtet ist.
Beispielsweise kann die Matrix reversibel mit Klammern oder Haken innerhalb eines Rahmens aus Styropor, Schaumstoff oder einem anderen schwimmfähigen Material aufgespannt sein, auch einzelne schwimmfähige Körper sind jedoch zur Befestigung geeignet, da die Matrix sich auf der Oberfläche des Mediums von sich aus ausbreitet.
Wenn die Matrix auf einem schwimmfähigen Körper aufliegt, so muß dieser für Medium permeabel sein. Dies kann dadurch gewährleistet sein, dass der schwimmfähige Körper ein Netz ist. Bevorzugt ist dieses Netz grobmaschig, hat also eine Maschenweite von mindestens 50-500 μm. Das Netz kann dadurch schwimm- fahig sein, dass es, zumindest teilweise, bevorzugt aber vollständig, mit einer hydrophoben Schicht überzogen ist. Die hydrophobe Schicht, welche die Matrix oder das Netz überzieht, ist bevorzugt ein Wachs oder Fett.
Eine solche hydrophobe Schicht kann aufgebracht werden, indem man die Matrix oder das Netz in eine Lösung aus Wachs und/oder Fett in einem hydrophoben flüchtigen Lösungsmittel taucht, so dass das Wachs und/oder Fett nach dem Verdunsten des Lösungsmittels die Fäden, nicht jedoch die Zwischenräume des Netzes überzieht. Das Lösungsmittel ist dabei bevorzugt Benzin oder Hexan. Eine Konzentration von Wachs und/oder Fett in dem Lö- sungsmittel von 0,1-20 % ist besonders geeignet. Besonders geeignete Fette sind z.B. Paraffine mit einer Schmelztemperatur von 50-70°C.
Ein Vorteil der Vorrichtung, deren Matrix schwimmfähig ist, ist, dass für die Liquid-Air-Kultur keine genaue Einstellung der Füllhöhe des Kulturmediums notwendig ist. Die in der Vorrichtung verwendete Matrix kann aus biodegra- dierbarem oder nicht biodegradierbaren, beständigem Material oder einem Gemisch daruas bestehen. Bevorzugt besteht die Matrix aus biodegradierbare Material. Dieses biodegradierbare Material kann Poly-L-Laktid (PLLA) , Polyhydroxybuttersäure (PHB), Polygycolsäure, Hyaluronsäure, Goretex oder ein Gemisch der selben sein. Für einige dieser Materialien wurde bereits gezeigt, dass sie für die Kultivierung von Zellen der respiratorischen Schleimhaut geeignet sind (Ostwald et al., Laryngo- Rhino-Otologie 2003, 82, 693-699) .
Die Biobeständigkeit der synthetischen Polymere PHB und PLLA ist größer als die von Kollagenen, was für bestimmte Anwendungen von Vorteil sein kann. PLLA hat eine Degradationszeit von ca. zwei Jahren, die Degradation von PHB im Organismus dauert noch länger.
Auch beständige Materialien können für die Matrix geeignet sein, z.B. Polyethylen, Polyamid, Polyester, Polyurethan, Polypropylen oder ein Gemisch derselben.
Bevorzugt ist das Material der Matrix nicht immunogen, so dass bei einer Transplantation weder die Gefahr einer Abstoßung besteht noch eine Immunsupression vorgenommen werden muss. Entscheidend ist jedoch, dass das Material biokompatibel ist, also z.B. nicht zytotoxisch. Ein Test zur Biokompatibilität von Matrixmaterialien ist in Ostwald et al. (s. o.) beschrie- ben. Für Matrizes aus anderen als den genannten Materialien kann eine Biokompatibilität z.B. mit dem dort beschriebenen Test festgestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die in der Vorrichtung verwendete Matrix ein Netz oder Netzwerk, wobei die Ma- schenweite des Netzes vorzugsweise etwa 50-500 μm beträgt. Grundsätzlich ist jedoch auch eine geringere Maschenweite des Netzes, bis hin zu ca. 0,2 oder 0,4 μm möglich, dies ist jedoch wegen eines ungünstigen Verhältnisses von permeabler Fläche zu nicht permeabler Fläche des Netzes weniger zweckmäßig. Die Maschen können regelmäßig oder unregelmäßig geformt sein.
Alternativ könnte die Permeabilität der Matrix für das Kulturmedium auch dadurch gewährleistet werden, dass die Matrix porös ist. Beispielsweise könnte eine poröse Matrix aus PLLA verwendet werden (Lo et al., J Biomed Mater Res 1996, 30, 475- 484). Dieses Material ist dadurch besonders interessant, dass es erfolgreich als Träger mit langsamer Freisetzung von Wirkstoffen getestet wurde (Zilberman et al., J Biomater Sei Polym Ed, 2002, 13, 1221-1240) . Durch gezielte Wirkstoffabgäbe in vivo nach einer Transplantation könnte dieses Material sich daher zur Steuerung spezifischer Vorgänge, z.B. zur Förderung der Gefaßbildung, eignen.
Die beschriebenen Vorrichtungen ermöglichen es, eine Matrix für die Liquid-Air-Kultur zu verwenden, bei der Größe und Form der Flache grundsätzlich beliebig sind. Es kann - neben einer runden oder rechteckigen Matrix - also auch beispielsweise ei- ne Form der Matrix gewählt werden, die der Form eines benötigten Transplantates bereits entspricht. Die Fläche der Matrix ist bevorzugt großer als ca. 1 cm2. Beispielsweise ist für die Versorgung von Septumperforationen eine Fläche von etwa 4 cm im allgemeinen ausreichend. Die Fläche kann aber auch z.B. größer als etwa 500 mm2 oder größer als etwas 710 mm2 sein. Auch Matrizes, deren Fläche größer als etwa 10000 mm2 ist, sind mit den beschriebenen Vorrichtungen für die Liquid-Air-Kultur verwendbar .
Die Vorrichtung kann - mit einer neuen Matrix - wiederverwend- bar sein. Daher besteht die in der Vorrichtung verwendete Halterung bevorzugt aus einem sterilisierbaren, (z.B. autoklavier- baren Material) etwa Niro-Stahl, Teflon oder Glas. Glas hat, wie auch Plastik, den Vorteil, dass bei der Kultur von Zellen eine mikroskopische Überprüfung möglich ist, sofern auch das Kulturgefaß aus einem dieser transparenten Materialien besteht . Das Kulturgefäß kann prinzipiell jedes Gefäß sein, das für die Zellkultur geeignet und in Form und Größe an die Halterung angepaßt ist, also größer ist als die Halterung. Eine Zellkultur-Beschichtung der Wand des Kulturgefäßes ist nicht notwendig, da die Kultur der Zellen auf der Matrix erfolgt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der mit Kollagen beschichteten Matrix zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur, die Teil der beschriebenen Vorrichtung ist. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man
a) die Matrix mit einer Kollagenlösung in Kontakt bringt,
b) die Kollagenlösung antrocknen läßt,
c) das Kollagen vernetzt,
d) eine Behandlung mit einer Aminosäure- oder Proteinlόsung durchfuhrt und
e) man die Matrix mit destilliertem Wasser wäscht.
Die Kollagenlösung hat dabei bevorzugt eine Konzentration von 1-10 mg/ml. Zum Beispiel können Kollagen G-Lösung oder Kollagen A-Lösung (z.B. Fa. Biochrom-Berlin) verwendet werden, Kollagen G ist jedoch bevorzugt.
Die Vernetzung in Schritt c ist vorzugsweise eine chemische Vernetzung. Diese Vernetzung kann man mit Mono- oder Dialdehy- den, beispielsweise mit Glutaraldehyd, durchführen. Alternativ ist jedoch auch eine Vernetzung mit physikalischen Methoden, z.B. durch Bestrahlung oder Dehydratisierung möglich. Ferner kann eine enzymatische Vernetzung des Kollagens oder eine Co- polymerisation mit Acrylderivaten vorgenommen werden (DE 693 15 483) . Die Vernetzung des Kollagens erhöht die mechanische Festigkeit, daher sind die im Rahmen dieser Erfindung verwendeten Kollagen-beschichteten Matrizes vorzugsweise vernetzt.
Die Vernetzung des Kollagens kann dazu führen, dass reaktive Gruppen entstehen. Bevor die Matrizes zur Zellkultur verwendet werden, sollte daher in Schritt d eine Behandlung mit einer Aminosäure- oder Proteinlösung zur Absättigung oder Neutralisation dieser reaktiven Gruppen durchgeführt werden. Der Waschschritt e dient zur Entfernung von nicht gebundenen Ami- nosäuren oder Proteinen und kann mit destilliertem Wasser, aber auch mit Kulturmedium oder einer anderen nichttoxischen Lösung, z.B. PBS, durchgeführt werden. Bevorzugt werden mehrere Waschschritte durchgeführt.
Besonders vorteilhaft ist ein Verfahren, bei dem die Beschich- tung der Matrix mit Kollagen auf einer hydrophoben Unterlage durchgeführt wird. Dies vereinfacht das anschließende Ablösen der beschichteten Matrix, verglichen mit dem Ablösen von dem Boden einer Zellkulturschale oder eines ähnlichen Gefäßes erheblich und ermöglicht es somit, reproduzierbar ohne Beschädi- gung der Kollagen-Beschichtung der Matrix auch größere beschichtete Matrizes herzustellen und zu verwenden.
Die hydrophobe Unterlage erhält man bevorzugt dadurch, dass man auf eine Unterlage einen Film von Wachs, Öl oder Paraffin aufträgt. Dazu verwendet man vorzugsweise Paraffin mit einer Schmelztemperatur von 50-70°C. Nachdem das Paraffin durch Hitze verflüssigt wird, gießt man eine dünne Schicht (steril) in ein Gefäß geeigneter Größe, z.B. Plastik-Petrischalen für die Zellkultur, und läßt sie erkalten. Nach einmaliger Verwendung zur Beschichtung eines Netzwerkes mit Kollagen wird die hydrophobe Unterlage bevorzugt verworfen, einerseits aus Gründen der Sterilität, andererseits wegen möglicher Verunreinigung in folgenden Beschichtungen durch Rückstände der vorangegangenen Beschichtungen. Die Lagerung auf der hydrophoben Unterlage während der Kollagenisierung wirkt sich nicht schädlich oder zytotoxisch auf die anschließende Zellkultur aus.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der be- schriebenen Vorrichtung zur Liquid-Air-Kultur von Epithel. Wie bereits beschrieben, setzt die Liquid-Air-Kultur voraus, dass Kulturmedium bis zu einem Füllstand in das Kulturgefäß eingebracht wird, bei dem die Oberfläche der Matrix in der Grenzfläche zwischen Kulturmedium und Luft liegt.
Weiterhin ist ein Verfahren zur Liquid-Air-Kultur von Epithel Gegenstand der vorliegenden Erfindung, bei dem eine oben beschriebene Vorrichtung verwendet wird.
Die Matrix der Vorrichtung wird in diesem Verfahren mit Epithelzellen besiedelt. Epithelzellen können nach bekannten Ver- fahren gewonnen werden (Ross, et al., Eur Arch Otorhinolaryn- gol 1997, 254 (Suppl. 1), 12-17; Risbud et al., J Biomed Mater Res 2001, 56, 120-127; Ziegelaar et al., Biomaterials 2002, 23, 1425-1438), beispielsweise durch „Auswachsen" oder Dissoziieren von Zellen aus Material, das z.B. aus Septumkorrekturen oder Conchotomien stammen kann oder speziell zu diesem Zweck entnommen wurde (z.B. „Skinsnips" ) . Beim „Auswachsen" der Zellen werden Gewebestücke auf der zum Bewuchs vorgesehenen Matrix fixiert, proliferierende Zellen besiedeln die benachbarte Matrix. Eine Dissoziation von Zellen kann z.B. mit Protease XIV oder Trypsin/EDTA-Lösung erfolgen, alternativ mit 0,1% Collagenase oder 0,1% Dispase oder Kombinationen der Enzyme. In einer Ausführungsform wird die Matrix vor der Besiedlung mit Epithelzellen mit Fibroblasten besiedelt. Für die Zwecke einer späteren Transplantation ist es von Vorteil, Fibroblasten des Transplantationsempfängers zu verwenden, d.h. autologe Fibroblasten, um Abstoßungsreaktionen zu vermeiden. Vorzugsweise stammen sowohl Fibroblasten als auch Epithelzellen von dem Transplantationsempfänger. Prinzipiell ist es aber auch möglich, nicht autologe Fibroblasten zu verwenden. Fibroblasten lassen sich aus einem Stück Gewebe, welches auch zur Gewinnung von Epithelzellen verwendet wird, nach enzymatischer Dissoziation mit 0,1% Collagenase und anschließender Kultivierung in serumhaltigem Medium (z.B. DMEM) in üblichen Zellkulturgefäßen einfach kultivieren (z.B. nach dem Verfahren nach Gray et al., Am J Med Genet . 1987, 8, 521-526) .
Im Gegensatz zu früheren Verfahren der Liquid-Air-Kultur von Epithel (z.B. Yamaguchi et al . , s.o.) ist es für eine Differenzierung des Epithels bei der im Verfahren verwendeten, mit Kollagen beschichteten Matrix nicht notwendig, dass die Matrix zunächst mit Fibroblasten besiedelt wird. Die Besiedlung mit Fibroblasten ist daher optional.
Bevorzugt wird die Kultur von Epithel durchgeführt, indem man nach dem Besiedeln der Matrix zunächst eine submerse Kultur und dann eine Liquid-Air-Kultur durchführt. Die submerse Kultur verstärkt die anfängliche Proliferation der Epithelzellen. Nachdem die Matrix mit einer ausreichenden Anzahl an Epithelzellen besiedelt ist, je nach Kulturbedingungen und Zahl der ausgesäten Zellen nach ca. 2-4 Wochen, führt man eine Liquid- Air-Kultur durch, in der die Differenzierung des Epithels erfolgt . Ein besonderer Vorteil der beschriebenen Vorrichtungen ist, dass sie für diesen Wechsel von submerser Kultur zu Liquid- Air-Kultur geeignet sind. Die einfachste Möglichkeit ist, die Matrix zunächst ohne die Halterung auf den Boden eines Kultur- gefäßes zu legen und nach der submersen Kultur die Matrix in die Vorrichtung einzufügen. Diese Möglichkeit besteht, da die Matrix nicht irreversibel in der Vorrichtung befestigt ist.
Bei Verwendung der beschriebenen Halterungen, auf denen die Matrix aufgelegt wird, kann eine submerse Kultur auch erfol- gen, wenn so viel Medium in das Kulturgefäß eingefüllt wird, dass die Oberfläche des Mediums über der Oberfläche der Matrix liegt. Diese Methode hat den Vorteil, dass Manipulationen der Matrix, die zu Beschädigung der Kollagen- und/oder Zellschicht führen können, weitgehend vermieden werden können.
Alternativ könnte auch - bei konstanter Höhe des Mediums - die Halterung für die Matrix so ausgebildet sein, dass die Höhe der Matrix verstellbar ist, beispielsweise mit Stützen, die in zwei Höheneinstellungen arretierbar sind.
Bei Verwendung der schwimmfähigen Matrix gibt es mehrere Möglichkeiten, eine submerse Kultur zu erreichen. Zum einen kann die schwimmfähige Matrix mit einem Gewicht, vorzugsweise an mehreren Stellen am Rand der Matrix, beschwert werden, so dass die Matrix nicht zur Oberfläche des Kulturmediums aufsteigen kann. Zum anderen kann - sofern die Matrix dadurch schwimmfähig ist, dass sie mit mindestens einem schwimmfähigen Körper verbunden oder auf ihm aufgelagert ist - diese Verbindung oder Auflagerung erst nach der submersen Kultur hergestellt werden.
Die Höhe des Kulturmediums in dem Kulturgefäß kann bei einem diskontinuierlichen Medienwechsel nach visueller Kontrolle eingestellt werden. Vorteilhaft ist jedoch ein Verfahren, bei dem man für die Liquid-Air-Kultur eine Apparatur zur automatischen Regelung der Höhe des Kulturmediums in dem Kulturgefäß verwendet, die so ausgebildet ist, dass die Höhe des Kulturmediums auf die Höhe der Matrix eingestellt wird. Die Verwendung einer solchen Apparatur erlaubt einen kontinuierlichen Austausch von Medium und damit eine optimale Versorgung mit Nährstoffen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Epithel respiratorisches Epithel, Haut oder Cornea. Es ist besonders bevorzugt, respiratorisches Epithel zu kultivieren, beispielsweise Epithel aus der Nasenschleimhaut, Septum, Larynx, Gingiva, Bronchien, oder Trachea.
Vorzugsweise wird das Verfahren zur Liquid-Air-Kultur von Epithel so lange durchgeführt, bis das Epithel sich differenziert, so dass funktionelles Epithel vorliegt, das für eine Transplantation geeignet ist. Bei respiratorischem Epithel ist das beispielsweise dann der Fall, wenn sich mindestens auf 75% der Flache eine Schicht rundlicher, Pflasterstein-artiger epithelialer Zellen gebildet hat, die zu großem Teil Microvilli demonstrieren, bevorzugt aber bewegte Zilien erkennen lassen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit, das die beschriebene Vorrichtung, Instruktionen zur Liquid-Air-Kultur von Epithel und eine geeignete Menge von Kulturmedium enthält, optional zusätzlich zur Wiederverwendung der Halterung mehrere Ersatzmatrizes .
Grundsätzlich sind alle im Labor üblichen Kulturmedien, z.B. RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) auch zur Verwendung bei der Liquid-Air-Kultur geeignet, DMEM ist jedoch bevorzugt. Es kann serumfreies Medium oder mit Serum versetztes Medium (z.B. mit 10% Fötalem Kälberserum (FKS)) verwendet werden. Die Verwendung von Serum kann jedoch zu unerwünschter Proliferation von Fibroblasten führen, so dass serumfreies Medium bevorzugt ist. Das Medium kann, z.B. durch die vorherige Kultur von Fibroblasten, konditioniert sein oder auch definierte Wachstumsfaktoren enthalten, z.B. EGF oder Insulin. Die Verwendung von Antibiotika-haltigem Medium (z.B. mit Penicillin/Streptomycin oder Gentamycin) ist bevorzugt. Vor allem zur Generierung von differenziertem respiratorischen Epithel ist die Kombination DMEM/HamsF12 (ca. 3/1), mit verschiedenen Zusätzen (EGF, Choleratoxin, Insulin, Hydrocortison, Transferrin, Selen, Bovine Pituary Extract, Antibiotika (z.B. Penicillin / Streptomycin) , bevorzugt (Usui S et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 2000, 109, 271-277) .
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung funktioneilen autologen artifiziellen Epithels, bei dem man
a) einem Patienten entnommenes Epithel auf der Matrix einer beschriebenen Vorrichtung ansiedelt,
b) während einer Proliferationsphase eine submerse Kultur des Epithels durchführt,
c) während einer Differenzierungsphase eine Liquid-Air-Kultur mit der beschriebenen Vorrichtung durchführt.
Der Patient kann dabei sowohl ein menschlicher Patient als auch ein Tier sein.
Die Apparatur, die im Rahmen dieser Erfindung zur automatischen Regelung der Höhe des Kulturmediums in dem Kulturgefäß verwendet werden kann, kann eine elektronische Regelung des Füllstands mit Medium umfassen (vgl. z.B. DE 198 01 763). Vorteilhaft ist jedoch der Einsatz einer Apparatur zur Regelung der Höhe der Oberfläche von Medium in einem Kulturgefäß, bei der durch mindestens einen Zufluß Medium in ein Kulturgefäß zugeführt wird und durch mindestens einen Abfluß, dessen Öffnung sich auf der gewünschten Höhe der Oberfläche des Mediums befindet, Medium abgeführt wird (vgl. US 5,565,353) .
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Apparatur jedoch so ausgebildet, dass die gewünschte Höhe des Mediums in dem Kulturgefäß einstellbar ist, da so besondere Vorteile, besonders hinsichtlich der gewünschten Abfolge von submerser und Liquid-Air-Kultur von Epithelzellen erreicht werden können.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit, das die Vorrichtung zur Liquid-Air-Kultur von Epithelzellen umfaßt, wobei die Vorrichtung eine Apparatur zur automatischen Regelung der Höhe der Oberfläche des Mediums umfasst, und zusätzlich Instruktionen zur Durchführung der Liquid-Air-Kultur und, optional, mehrere Ersatzmatrizes umfaßt.
Gegenüber dem Stand der Technik weist die vorliegende Erfindung vielfältige Vorteile auf. Die beschriebenen Vorrichtungen, die die Matrix in die Grenzschicht zwischen Medium und Luft einbringen und damit eine Liquid-Air-Kultur erlauben, machen es möglich, bisher bestehende Beschränkungen hinsichtlich der Größe und Beschaffenheit der Matrix zu überwinden. Damit kann nun Epithel in vi tro kultiviert werden, das besonders für die Transplantation geeignet ist. Die reversible Verbindung der Matrix mit dem Rest der Vorrichtung erlaubt es, die bewachsene Matrix direkt für eine Transplantation zu verwenden. Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass es zur Durchführung der Liquid-Air-Kultur besonders vorteilhaft ist, wenn man den Füllstand des Mediums im Kulturgefäß regelt.
Die Erfindung betrifft daher ferner eine Vorrichtung zur Regelung des Füllstandes des Mediums in einem Kulturgefäß (Regelungsapparatur) , bei der der gewünschte Füllstandes des Mediums einstellbar ist, sowie die Verwendung dieser Vorrichtung zur Zeil- oder Gewebekultur. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur unter Verwendung einer erfindungsgemäßen, nachfolgend eingehender beschriebenen Vorrichtung.
Diese Vorrichtung ist besonders zur Perfusionskultur (kontinuierlicher Zufluß und Abfluß von Medium) geeignet und wurde auf der Grundlage gebräuchlicher Zellkulturgefäße entwickelt. Ein automatischer, kontinuierlicher Austausch von Medium hat gegenüber einem diskontinuierlichen Mediumwechsel bei visueller Kontrolle bei der Zellkultur mehrere Vorteile, die sich ins¬ besondere bei längeren Kulturzeiten mit öfterem Medienwechsel bemerkbar machen. Einen Vorteil stellt die optimale, konstante Versorgung mit Nährstoffen und der konstante Abtransport von toxischen StoffWechselprodukten dar. Ein kontinuierlicher Me- diumaustausch erlaubt eine besonders dichte Kultur von Zellen. Ein diskontinuierlicher Mediumwechsel beeinflußt viele vor allem empfindliche Zellen negativ, da Schwankungen in Nährstoffkonzentration, pH-Wert, Temperatur und weiteren Faktoren auftreten können. Die Zellen werden bei kontinuierlichem Aus- tausch von Medium eher unter Bedingungen kultiviert, die physiologischen Bedingungen ähneln. Ein weiterer Vorteil insbesondere bei länger andauernden Kultivierungen einer kontinuierlichen Kultur mit definierter Medienhohe besteht darin, dass durch Wegfall des häufigen Öffnens des Kulturgefäßes zum diskontinuierlichen Medien- Wechsel die Gefahr der Kontamination sinkt.
Ein dritter Vorteil der kontinuierlichen Kultur im Gegensatz zur diskontinuierlichen Variante bei längeren Kulturzeiten besteht darin, daß der Arbeitsaufwand reduziert ist.
Ein besonderer Vorteil ergibt sich bei der Zellkultur, wenn beim Austausch von Medium die Höhe der Oberfläche des Mediums konstant gehalten werden kann. Dies ist bei diskontinuierlichem Mediumwechsel z.B. wegen möglicher Verdunstung nicht immer gewährleistet. Prinzipiell ist eine konstante Höhe der Oberflache des Mediums für jede Zellkultur wichtig, um ein op- timales Verhältnis von Mediumvolumen zu dem Gasraum über dem Medium und damit einen optimalen Gasaustausch zu erlauben. Für einige spezielle Anwendungen, wie z.B. die Liquid-Air-Kultur, ist eine genaue Regulation der Höhe jedoch besonders wichtig.
Eine Apparatur zur automatischen Regelung des Füllstandes des Kulturmediums in dem Kulturgefäß kann eine elektronische Regelung des Füllstands mit Medium umfassen (vgl. z.B. DE 198 01 763). Einfacher ist jedoch der Einsatz einer Apparatur zur Regelung der Höhe der Oberfläche von Medium in einem Kulturgefäß, bei der durch mindestens einen Zufluß Medium in ein Kulturgefäß zugeführt wird und durch mindestens einen Abfluß, dessen Öffnung sich auf der gewünschten Höhe der Oberfläche des Mediums befindet, Medium abgeführt wird (vgl. US 5,565,353) .
Probleme ergeben sich jedoch bei der Verwendung einer solchen Apparatur dann, wenn die gewünschte Höhe der Oberfläche des
Mediums variabel sein soll, z.B. um verschiedene Kultur- bedingungen bei einer submersen und einer nachfolgenden Liquid-Air-Kultur von Epithelzellen, bei der die Zellen an der Grenzfläche zwischen Medium und Luft kultiviert werden sollen, zu erreichen.
Mit der im Rahmen der vorliegenden Erfindung bereitgestellten und verwendet Vorrichtung, bei der der gewünschte Füllstands des Mediums in dem Kulturgefäß einstellbar ist, kann in vorteilhafter Weise die erfindungsgemäße Liquid-Air-Kultur durchgeführt werden.
Um die gewünschte Höhe des Füllstands eines Kulturgefäßes mit Kulturmedium einzustellen, wird eine Vorrichtung bereitgestellt, die ein Kulturgefäß zur Zeil- und Gewebekultur umfaßt, das mindestens einen Zufluß und mindestens einen Abfluß für Medium umfaßt, wobei die Höhe der Abflußöffnung (en) inner- halb des Kulturgefäßes verstellbar ist.
Unter .„Kulturgefäß zur Zeil- und Gewebekultur" wird im Rahmen dieser Anmeldung jedes Gefäß verstanden, dass zur Kultur von Zellen oder Gewebe, bevorzugt eukaryontischen Zellen bzw. Geweben, geeignet ist. Das Kulturgefäß besteht bevorzugt aus ei- ne Material, das für die Kultur von Zellen geeignet ist, insbesondere aus einem zur Zellkultur beschichteten Kunststoff oder Glas. Bevorzugt hat das Kulturgefäß die Grundform einer Petrischale, aber auch andere Formen, z.B. ein rechteckiger Grundriß oder die Form von Zellkulturflaschen ist möglich. Das Kulturgefäß sollte so ausgeführt sein, dass eine sterile Kultur der Zellen möglich ist. Dafür sollte es steril verschließbar sein. Bevorzugt ist die visuelle und mikroskopische Kon¬ trolle der Zellkultur in dem geschlossenen Kulturgefäß möglich. Dazu muß das Kulturgefäß zumindest teilweise aus einem transparenten Material, etwa Glas oder Kunststoff, bestehen. In das Kulturgefäß wird, wie beschrieben, die Matrix für die Liquid-Air-Kultur eingebracht. Bevorzugt umfaßt das Kulturgefaß einen Zufluß und einen Abfluß mit einer Abflußöffnung. Sind z.B. mehrere Abflüsse enthalten, so muss für eine Regelung des Füllstandes mindestens die Höhe der untersten Abflußöffnung verstellt werden. Die Höhe mehre- rer Abflüsse kann selbstverständlich auch gemeinsam verstellt werden.
Unter „Medium" wird im Rahmen dieser Anmeldung jede Flüssigkeit verstanden, die in dem Gefäß zur Kultur von Zellen enthalten ist, und deren Füllhöhe eingestellt werden soll. Dabei wird es sich bevorzugt um ein klassisches Zellkulturmedium, wie z.B. DMEM, RPMI-Medium, Iscove's Medium, etc. handeln, gegebenenfalls mit Zusätzen wie z.B. Fetalem Kälberserum, Wachstumsfaktoren oder Antibiotika. Unter Medium wird jedoch auch eine andere, im Allgemeinen für die Zellkultur verträgliche Flüssigkeit wie z.B. PBS (Phosphate buffered saline) verstanden. Auch Lösungen etwa zum Ablösen von Zellen, wie z.B. Tryp- sin/EDTA werden im Rahmen dieser Erfindung als Medium bezeichnet, da die Regelungsapparatur auch besonders zum Wech¬ seln von Flüssigkeiten in dem Kulturgefäß geeignet ist. Auch ein gradueller Austausch von verschiedenen Kulturmedien kann damit vorgenommen werden.
Insbesondere wird eine Vorrichtung verwendet, bei der die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens ist. Die Abflußöffnung ist die Öffnung des Abflußstutzens, die sich im Inneren des Kulturgefäßes befindet. Der Abflußstutzen ist zum Durchleiten von Flüssigkeiten geeignet. Im Allgemeinen ist der Abflußstutzen ein Rohr oder Schlauch. Bevorzugt hat der Abflußstutzen einen runden Innenquerschnitt. Die Abflußöffnung befindet sich bevorzugt an einem Ende des Abflußstutzens, sie kann je- doch, bei einem verschlossenen Ende, auch seitlich angebracht sein. Dies kann sinnvoll sein, wenn erwünscht ist, dass der Füllstand des Mediums nicht beliebig einstellbar ist, sondern z.B. immer ein gewisser Mindest-Füllstand vorliegen soll. In diesem Fall kann ein Teil des Abflußstutzens als Abstandshalter dienen.
Der Abflußstutzen ist bevorzugt durch eine Dichtung in einer Wand des Kulturgefäßes geführt. Als Wand des Kulturgefäßes wird die gesamte Hülle des Kulturgefäßes bezeichnet, also die Seitenwand oder Seitenwände sowie Oberseite und Unterseite des Kulturgefäßes, d.h. auch Deckel (soweit z.B. die Oberseite als abnehmbarer Deckel ausgebildet ist) und Boden.
Eine Dichtung liegt an dem Abflußstutzen an und sorgt für ei- nen Abschluß gegenüber der Wand des Kulturgefäßes. Eine Dichtung sorgt daher, soweit sie sich bei Gebrauch der Vorrichtung zur Zellkultur in dem Bereich befindet, der nicht mit Medium gefüllt ist, für einen sterilen Abschluß gegenüber der Außenseite des Kulturgefäßes, die nicht steril sein muß. Befindet sich die Dichtung in dem Bereich, der mit Medium gefüllt ist, muss die Dichtung weiterhin ein Auslaufen des Mediums verhindern, also einen gegenüber dem Medium dichten Abschluß bilden. Bevorzugt ist die verwendete Dichtung für beide Zwecke geeignet .
Eine einfache Form einer solchen Dichtung ist elastisch und liegt daher sowohl an dem Abflußstutzen als auch dem Kulturgefäß an. Dichtungen aus Gummi oder Silikon sind dem Fachmann gut bekannt. Auch ein möglicherweise gefetteter Glasschliff o.a. kann jedoch geeignet sein, soweit ein gegenüber Medium dichter Abschluß nicht erforderlich ist. Die Dichtung hat eine geeigneter Größe, so dass der Abflußstutzen in ihr beweglich ist .
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Abflußstutzen in vertikaler Richtung beweglich durch die Unter- oder Oberseite des Kulturgefäßes geführt. Bevorzugt ist der Abflußstutzen durch eine Dichtung an der Oberseite des Kulturgefäßes ge- führt. Die Oberseite des Kulturgefäßes kann, beispielsweise bei einer Petrischale, ein Deckel sein.
Bevorzugt ragt der Abflußstutzen aus dem Kulturgefäß und über die Dichtung heraus. Dann kann der Abflußstutzen und mit ihm die Höhe der Abflußöffnung besonders leicht verschoben werden, ohne dass dafür ein Öffnen des Gefäßes notwendig wäre, das stets mit der Gefahr von Kontamination verbunden ist. Die Län¬ ge, um die der Abflußstutzen herausragt, ist bei einer vertikalen Beweglichkeit des Abflußstutzens davon abhängig, wie die Höhe der Abflußöffnung eingestellt ist. Die Länge, um die der Abflußstutzen maximal oder minimal aus dem Kulturgefäß herausragen kann, beeinflußt, wie weit die Höhe des Füllstandes des Mediums in dem Kulturgefäß verstellt werden können soll. Bevorzugt ist diese Höhe beliebig einstellbar. Der Ablaufstutzen sollte also so lang sein, dass er bei jeder Einstellung aus dem Kulturgefäß und über die Dichtung herausragt.
Es kann sinnvoll sein, den Abflußstutzen, beispielsweise mit einem Anschlag unterhalb und/oder oberhalb der Gefäßwand bzw. der Dichtung so auszugestalten, dass ein versehentliches 'zu starkes Hineinschieben und/oder völliges Herausziehen des Abflußstutzens verhindert wird.
In einer Ausführungsform ist die Dichtung ein elastisches Schlauchstück, das mit seinem unteren Ende mit einer an der Oberseite des Kulturgefäßes angebrachten Halterung verbunden ist. Diese Halterung kann unterschiedlich ausgebildet sein, möglich ist z.B. ein nach oben gerichteter Rand um eine Öffnung herum, auf die das Schlauchstück aufgeschoben werden kann. Die Halterung kann aus dem gleichen Material wie das Kulturgefäß oder auch aus einem anderen geeigneten Material bestehen. Die Halterung kann homogen aus dem Material der Oberseite des Kulturgefäßes gezogen sein (z.B. aus Glas) oder aus dem gleichen oder einem anderen geeigneten Material zweck- entsprechend geformt und über ein Loch in der Oberseite luftdicht aufgeklebt sein (z.B. mit Silikonkleber, Epoxidharzkleber) . An dem oberen Ende des Schlauchstückes liegt dieses an dem Teil des Abflußstutzens, der aus dem Kulturgefäß heraus- ragt, an.
Eine Vorrichtung, die ein derartiges Kulturgefäß umfaßt, ist schematisch in Figur 4 abgebildet.
Nach dem gleichen Prinzip, allerdings mit einer schrägen Halterung und Führung des Abflußstutzens, ist es auch möglich, den Abflußstutzen durch eine Seitenwand des Kulturgefäßes zu führen, und zwar bevorzugt so, dass der Abflußstutzen von schräg oben in das Kulturgefaß hineinragt.
Alternativ ist die Vorrichtung so ausgebildet, daß die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens ist, der einen fest mit dem Kulturgefaß verbundenen, nicht beweglichen Teil umfaßt, der in das Innere des Kulturgefäßes hineinragt, sowie ein Schlauchstück, das als beweglicher Teil des Abflußstutzens auf den nicht beweglichen Teil aufgesteckt ist und die Abflußöffnung umfaßt. In dieser Ausführungsform der Apparatur, wie auch in anderen denkbaren Ausführungsformen, muss die Dichtung nicht separat ausgebildet sein, da ihre Funktion von dem Abflußstutzen selbst wahrgenommen wird. Die Höhe der Abflußöffnung ist verstellbar, indem der bewegliche Teil mehr oder weniger weit auf den unbeweglichen Teil aufgesteckt wird. Die Höhe ist bei dieser Ausführungsform nicht von außen, sondern von innerhalb des Kulturgefaßes verstellbar. Dazu kann bespielsweise eine sterile Pinzette verwendet werden, um die Sterilität der Innenseite des Gefäßes zu gewährleisten. Sofern das Gefäß einen abnehmbaren Deckel hat, kann dieser für das Einstellen ab- genommen werden, aber auch z.B. durch die Öffnung einer Zellkulturflasche ist ein solches Einstellen möglich. Allgemein ist ein Einstecken in ein verbundenes Teil einem Aufstek- ken auf ein verbundenes Teil äquivalent, wobei ein Durchfluß des Mediums gewährleistet sein muß.
Bevorzugt ragt der Abflußstutzen von oben oder von unten in das Innere des Kulturgefäßes hinein. In diesem Fall sollten beweglicher und unbeweglicher Teil des AblaufStutzens eine gerade Grundform haben. Alternativ kann der unbewegliche Teil des AblaufStutzens von einer Seitenwand aus in das Innere des Kulturgefäßes hineinragen und gewinkelt oder gebogen sein, wobei der bewegliche Teil eine gerade Form hat. Eine Vor- richtung, die ein derartiges Kulturgefäß umfaßt, ist schematisch in Figur 5 abgebildet.
In einer alternativen Ausführungsform ist die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens, der gewinkelt oder gebogen ist und durch eine Seitenwand des Kulturgefäßes geführt ist, wobei die Höhe der Abflußöffnung durch eine Drehung des Abflußstutzens einstellbar ist. Bevorzugt ist ein Winkel von ca. 90°. Wenn der Abflußstutzen durch eine Dichtung geführt ist und über die Wand des Kulturgefäßes und die Dichtung hinausragt, kann die Höhe der Abflußöffnung von außen eingestellt werden.
Alternativ kann die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens sein, der einen geraden, fest mit dem Kulturgefäß verbundenen, nicht beweglichen Teil umfaßt, der in das Innere des Kulturgefäßes hineinragt, sowie ein gewinkeltes oder gebogenes Schlauchstück, das als beweglicher Teil des Abflußstutzens auf den nicht beweglichen Teil aufgesteckt ist und die Abflußöffnung umfaßt. Dann ist die Höhe der Abflußöffnung, wie oben beschrieben, z.B. mit einer Pinzette, durch Drehung des beweglichen Teils einstellbar.
Will man vermeiden, dass bei Verwendung der Regelungsapparatur das zugeführte Medium die Oberfläche des Mediums stört, was z.B. für eine Liquid-Air-Kultur nachteilig sein kann, oder dass Medium bei der Zufuhr an Seitenwände oder Oberseite des Kulturgefäßes spritzt, so sollte das Kulturgefäß so ausgebildet sein, dass der Zufluß bzw. die Zuflußöffnung unterhalb der Öffnung des Abflusses liegt, die den Füllstand des Kultur- gefaßes mit Medium bestimmt. Die Zuflußöffnung kann direkt ei- ne Öffnung in der Wand des Kulturgefäßes sein, gegebenenfalls mit einer Halterung für einen zu befestigenden Schlauch oder eine Rohrverbindung. Die Zuflußöffnung kann jedoch auch Teil eines Zuflußstutzens sein, der durch eine Wand des Kulturgefäßes geführt ist, gegebenenfalls durch eine Dichtung oder damit fest verbunden. Bevorzugt ist ein Zuflußstutzen nahe dem Boden des Gefäßes durch eine Dichtung in einer Seitenwand geführt. Ein Zuflußstutzen kann, wenn z.B. eine Petrischale oder ein anderes genormtes Kulturgefäß verwendet wird, auch durch den Deckel geführt werden. Wenn auch der Abflußstutzen durch den Deckel geführt wird, kann ein solcher Deckel, der den für die Erfindung wesentlichen Abfluß und Zufluß umfaßt, in Kombination mit jedem passenden Petrischalen-Unterteil oder dazu passenden genormten Unterteil verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung, die ferner ein Vorratsgefäß mit frischem Medium umfaßt, das mit dem Zufluß verbunden ist, und die ferner ein Gefäß zum Sammeln alten Mediums umfaßt, das mit dem Abfluß verbunden ist. Bei Verwendung der Vorrichtung stehen diese Gefäße bevorzugt gekühlt. Alternativ kann das Vorratsgefäß mit frischem Medium aber auch z.B. bei der gewünschten Temperatur der Zellkultur aufbewahrt werden, falls die Zellen empfindlich gegenüber Temperaturänderungen sind. Ein Sammelgefäß ist nicht unbedingt notwendig, da das alte Medium, das in Kontakt mit den Zellen war, auch so¬ fort verworfen werden kann.
Die jeweilige Verbindung zwischen Zufluß und Abfluß und Vor¬ rats- bzw. Sammelgefäß kann z.B. eine Rohrverbindung sein, be¬ vorzugt sind wegen ihrer Flexibilität jedoch Schläuche. Die Vorrichtung umfaßt also bevorzugt ferner mindestens einen Schlauch, der mit einem Zufluß verbunden ist, und mindestens einen Schlauch, der mit einem Abfluß verbunden ist. Insbesondere ist mindestens ein an der Vorrichtung verwendeter Schlauch aus Silikon, bevorzugt alle verwendeten Schläuche. Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung, die ferner mindestens eine Pumpe umfaßt. Ein Pumpe kann den Zufluß des Mediums steuern, und eine zweite Pumpe, oder dieselbe Pumpe, den Abfluß des Mediums. Alternativ können Zufluß und Abfluß des Mediums auch z.B. durch Schwerkraft getrieben werden, in- dem das Vorratsgefäß mit neuem Medium über dem Kulturgefäß und das Sammelgefäß unter dem Kulturgefäß angeordnet wird.
Damit bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung der Füllstand des Mediums in dem Kulturgefäß der Höhe der Abflußöffnung entspricht, darf - nach dem Füllen des Gefäßes zur ge- wünschten Höhe - die Menge zugeführten Mediums die Menge abgeführten Mediums nicht übersteigen, da sonst der Füllstand nicht konstant bleibt, sondern ansteigt. Daher muß die Menge zufließendes und abfließendes Mediums aufeinander abgestimmt werden. Nach dem ersten Füllen des Kulturgefäßes entspricht dann die Menge des abgeführten Mediums automatisch der Menge des zugeführten Mediums, da wegen des Konstruktionsprinzips der Vorrichtung nicht mehr Medium abgeführt als zugeführt werden kann. Der Fachmann wird unschwer, z.B. über die Leistung der Pumpen und/oder den Innendurchmesser der Schläuche, Zu- flußöffnung (en) , Abflußöffnung (en) , Abflußstutzen etc., die Menge des zugeführten oder abgeführten Mediums so einstellen können, dass nicht zuviel Medium zugeführt wird.
Bevorzugt sind die Zuflußöffnung (en) und die Abflußöffnung (en), der/die Abflußstutzen, Schläuche und Pumpenleis- tung(en) der Vorrichtung so ausgestaltet und aufeinander abge¬ stimmt, dass die Menge des abführbaren Mediums mindestens so groß wie oder größer ist als die Menge des zuführbaren Medi- ums. Bevorzugt ist die Kapazität aller Abflüsse größer als die Kapazität aller Zuflüsse.
Bevorzugt sind Zufluß und Abfluß von Medium über dieselbe Schlauchpumpe gekoppelt. Das Funktionsprinzip der Schlauch- pumpe beruht auf dem Abdrücken oder Abquetschen eines flexiblen Pumpenschlauches an einer oder mehreren Stellen und durch Bewegung der abgedrückten Stelle in gewünschter Förderrichtung der Flüssigkeit. Die Bewegung der abgedrückten Stelle wird mit Hilfe eines Pumpenrotors realisiert, an dessen Umfang sich walzenförmige Rotorrollen befinden. Die Rotordrehzahl (Bewegungsgeschwindigkeit der abgedrückten Stelle) und der Innendurchmesser des Schlauches bestimmen die Förderleistung. Bei einem gleichen Innendurchmesser von Schläuchen, die auf die- selbe Schlauchpumpe aufgespannt sind, ist die Förderleistung also gleich.
Bevorzugt ist daher der Innendurchmesser des mit dem Abfluß verbundenen Schlauches mindestens so groß ist wie der Innendurchmesser des mit dem Zufluß verbundenen Schlauches. Besonders bevorzugt ist der Innendurchmesser des mit dem Abfluß verbundenen Schlauches größer als der Innendurchmesser des mit dem Zufluß verbundenen Schlauches, da ein als gleich angegebener Innendurchmesser praktisch oft zu Problemen führt, da die Durchmesser der Schläuche, die im allgemeinen als Zu- oder Abflüsse verwendet werden, oft nicht exakt gleich sind.
Wenn die Regelung des Zu- bzw. Abflusses über eine Schlauchpumpe (oder mehrere Schlauchpumpen mit der gleichen Pumpleistung) erfolgt, so ist hierbei der Durchmesser der Pumpschlauche in der Schlauchpumpe entscheidend, so dass hier der „abpumpende" Schlauch einen etwas größeren Durchmesser als der „zupumpende" Schlauch haben sollte. Die sonstigen Schläuche (z.B. von Vorratsgefäßen zur Pumpe, von der Pumpe zum Kultur- gefäß) sollten möglichst einen etwas größeren Durchmesser als die Pumpschläuche haben.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist dazu geeignet, zur Zell- und Gewebekultur verwendet zu werden. Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung der Vorrichtung zur Zeil- und Gewebekultur, sowie ein Verfahren zur Zeil- oder Gewebekultur, bei dem man die Kultur in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführt. Zur Kultur der Zellen wird das Kulturgefäß bevorzugt in einen geeigneten Inkubator eingebracht, dessen Tempe- ratur und C02-Gehalt für die kultivierten Zellen optimal eingestellt werden kann. Die Zeil- und Gewebekultur umfaßt dabei bevorzugt eine Liquid-Air-Kultur , besonders die Liquid- Air-Kultur von Epithelzellen. Bei der Liquid-Air-Kultur, z.B. der Liquid-Air-Kultur von Epithel, sind die Zellen an eine Ma- trix angeheftet, die in die Grenzschicht zwischen Medium und Luft eingebracht werden kann. Die an eine Matrix gebundenen oder adhärierten Zelle können auch, entweder auf dem Boden des Kulturgefäßes liegend oder durch eine Vorrichtung über dem Boden des Kulturgefäßes gehalten, submers kultiviert werden.
Für die optimale Kultur von Gewebe, z.B. zur Transplantation, ist die Versorgung mit Nährstoffen besonders wichtig, so dass die erfindungsgemäße Vorrichtung hierfür besonders geeignet ist. Verschiedene Gewebestücke können in einem Kulturgefäß, z.B. in einer Petrischale, kultiviert werden, die in verschie- dene Kompartimente aufgeteilt ist. Diese verhindern nicht den Austausch von Medium, ermöglichen jedoch die gleichzeitige Kultivierung verschiedener definierter Gewebestücke ohne deren Vermischung. Kompartimentiert bedeutet, dass der Boden des Ge¬ fäßes durch Stege o.a. so aufgeteilt ist, dass verschiedene Proben in die entstehenden Kompartimente („Tröge") platziert werden können und sich nicht bei Transport/Bewegung des Kulturgefäßes vermischen. Die Höhe der Stege ist so gehalten, dass sie deutlich unter der Höhe des Mediums liegt. Die Stege können verschiebbar angebracht sein. Die Kompartimentierung erlaubt die vergleichende Kultivierung z.B. von Zellen, die auf Matrizes aus verschiedenen Materialien adhärieren oder von verschiedener Gewebeproben unter ansonsten identischen Bedingungen und erlaubt die sichere Zuordnung der Proben. Verschiedene Proben können auch mit Hilfe von mehreren Vorrichtungen zum Einbringen von Matrizes für die Liquid-Air-Kultur in einem Kulturgefäß kultiviert werden, dessen Füllhöhe mit Medium über die beschriebene Regelungsapparatur gesteuert wird.
Die in den Abbildungen dargestellten Vorrichtungen illustrieren mögliche Ausführungsformen, die erfindungsgemäßen Vorrichtungen sind jedoch nicht auf diese besonderen Ausführungsformen beschränkt. Weitere im Rahmen der Beschreibung offen- barte Ausfuhrungsformen sind dem Fachmann leicht ersichtlich.
Liste der Abbildungen:
Fig. 1: Schema einer Vorrichtung zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur von Epithel mit einem oben offenen Basisgefäß
Fig. 2 A: Vorrichtung zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur von Epithel mit einem oben offenen Basisgefäß
Die Abbildung zeigt Komponenten der Vorrichtung von Fig. 1 in einer besonderen Ausführungsform. Links ist das Basisgefäß zu sehen, rechts davon der auf die Matrix aufzulegende Rand und vorne die Klammern. Hinten ist die Vorrichtung in zusammenge¬ setzter Form mit eingespannter Matrix abgebildet. Die Matrix wurde auf das Basisgefäß aufgelegt und der Rand darauf mit Hilfe der Klammern sicher befestigt. In dieser Form kann die Vorrichtung in das Kulturgefäß mit Medium eingebracht werden.
Fig. 2 B: Vorrichtung zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur von Epithel mit Kulturgefäß, bei der die Halterung auf dem Boden des Kulturgefäßes steht
Die Abbildung zeigt ein geöffnetes Kulturgefäß, hier eine Petrischale, in die eine Vorrichtung zur Aufnahme bzw. Ablage von Matrixmaterialien mit Zellen eingebracht werden kann. Die oben im Bild abgebildete Vorrichtung besteht aus einem Siebge- webe aus nichtrostendem Stahl, welches auf Metallfüßen steht.
Fig. 3 A: Proliferierende Fibroblasten auf einer kollagenisier- ten Matrix (Material: Polyamid, Maschenöffnung: 150 μm)
Fig. 3 B: Proliferierende respiratorisehe Epithelzellen auf einer kollagenisierten Matrix der erfindungsgemäßen Vorrich- tung (Material: Polyamid, Maschenöffnung: 150 μm)
Im Rahmen der folgenden Abbildungen, die die Vorrichtung zur Regelung des Füllstandes des Mediums in einem Kulturgefäß zeigen, haben die verwendeten Bezugszahlen folgende Bedeutung:
11: Kulturgefäß, 12: Zufluß, 13: Abflußöffnung, 14: bewegli- eher Teil eines Abflußstutzens, 15: nicht beweglicher Teil ei¬ nes Abflußstutzens, 16: Füllstand des Mediums in dem Kulturgefäß, 17: Vorratsgefäß mit frischem Medium, 18: Sammelgefäß für altes Medium, 19: Deckel des Kulturgefäßes, 20: elastischer Schlauch, 21: Halterung, 22/22 λ: Abflußstutzen, 23: Schlauchpumpe
Fig. 4: Vorrichtung zur automatischen Regelung des Füllstands des Mediums in einem Kulturgefäß, bei der der Abflußstutzen durch eine Dichtung an der Oberseite des Kulturgef ßes geführt ist .
Fig. 5: Vorrichtung zur automatischen Regelung der Höhe der Oberfläche des Mediums, bei der der Abflußstutzen durch eine 5 Dichtung an der Seitenwand des Kulturgefäßes geführt ist, wobei ein bewegliches Schlauchstück auf ein nicht bewegliches, gewinkeltes Teil des Abflußstutzens aufgeschoben ist.
Fig. 6: Vorrichtung zur Regelung der Höhe der Oberfläche von Medium in einem Kulturgefäß
'TO A: Gezeigt sind die Hauptkomponenten einer Ausführungsform des Systems, Schlauchpumpe, Vorrats- und Ablaufgefäß (üblicherweise im Kühlschrank) sowie das Kulturgefäß mit Absaugung des Mediums von oben.
B: Die Abbildung zeigt im Detail ein geöffnetes Kulturgefäß 15 (Petrischale) mit Absaugung von oben. In dem Gefäß können entweder direkt oder nach Einbringung einer geeigneten Vorrich¬ tung z.B. indirekt auf einer Matrix Zellen kultiviert werden. Die gezeigten Kammern in der Petrischale verhindern nicht den Austausch von Medium, erlauben jedoch eine Kultur definierter 20 Zellen oder Gewebe in den verschiedenen Kammern.
C: Gezeigt ist ein geöffnetes Kulturgefäß (Petrischale) mit Absaugung von unten, in die z.B. eine Vorrichtung zur Aufnahme bzw. Ablage von Matrixmaterialien mit Zellen eingebracht werden kann. Die oben im Bild abgebildete Vorrichtung besteht aus 25 einem Siebgewebe aus nichtrostendem Stahl, welches auf Metall¬ füßen steht.
Fig. 7: Kultur von Fibroblasten unter diskontinuierlichem (A) oder kontinuierlichem (B) Medienwechsel Beispiele
1. Beschichtung einer Matrix mit Kollagen
Um die Beschichtung der Matrix vorzubereiten, wurde eine Unterlage, z.B. eine Petrischale, mit einem dünnen Film aus Paraffin (Schmelzpunkt 50-70°C) beschichtet. Es wurde für jeden Versuch eine neue Petrischale (Durchmesser 80-100 mm) dünn mit erhitztem Paraffin ausgegossen, welches unter der Laminarbox erstarrt.
Ein sterilisiertes Netzwerk aus einem geeigneten Polymer, z.B. aus Polyamid (Reichelt Chemietechnik oder Institut für Polyme'rforschung Dresden) wurde auf die beschichtete Petrischale gelegt und eine Lösung von Kollagen G (2 mg/ml in PBS (Phosphate buffered saline) , Biochrom) darauf gegeben. Die Matrix wurde mindestens 15 Minuten bei 37°C inkubiert, dann die Kollagenlösung abgesaugt und das Kollagen ange¬ trocknet. Als nächster Schritt wurde die angetrocknete Schicht mit sterilem 0,25% Glutaraldehyd in PBS bedeckt, sofort wieder abgesaugt und erneut angetrocknet. Schließlich erfolgte ein Absättigen der noch reaktiven Aldehydgruppen durch Bedecken der Kollagenschicht mit einer Aminosäurelösung (ca. 0,1 M, z.B. MEM-NEAS, Gibco/Invitrogen lOOx, 1:100 in PBS), die anschließend sofort wieder abgesaugt wurde. Vor Gebrauch wurde die so kollagenisierte Matrix mindestens dreimal mit sterilem destillierten Wasser gespült. Ergebnis :
Die Matrix wurde ohne Beschädigung von der hydrophoben Unterlage abgelöst und für die Kultur von Epithelzellen verwendet .
2. Überziehen eines Netzes mit einer hydrophoben Schicht
Für die Herstellung einer schwimmfähigen Unterlage, auf die eine Matrix zur Liquid-Air-Kultur von Epithelzellen aufgelegt werden kann, wurde ein Netz aus Polyamid in eine Lösung von Paraffin in Hexan getaucht, wobei verschiedene Konzentrationen getestet wurden. Vor der Verwendung wurde das Verdunsten des Losungsmittels (mindestens ca. 30 Minuten bei RT) abgewartet.
Ergebnis :
Die Unterlage war bei allen getesteten Konzentrationen in der Lage, auf Kulturmedium zu schwimmen. Bei Konzentrationen von 0,2-20% Wachs in Lösungsmittel waren die Fäden des Netzwerks von Wachs umschlossen, die Zwischenräume jedoch frei. Eine auf dem Netz gelagerte Matrix hatte Kontakt zu Medium und Luft, und kultivierte respiratorisehe Epithelzellen proliferierten.
3. Gewinnung von Epithelzellen
Humane Nasenschleimhautexplantate aus Septumkorrekturen bzw. aus Nasenpolypen wurden unmittelbar nach der Operation für mindestens 30 Minuten in Gentamycinlösung (100 μg/ml in PBS, Gibco) bei 4°C gelagert. Das Gewebe wurde in Stücke von 3 mm x 3 mm geteilt. Anschließend wurden primäre Epithelzellen durch enzymatische Dissoziation aus dem Gewebe oder durch Fixierung auf der Matrix und anschließendes „Auswachsen" der Zellen gewonnen. Die Zellen wurden zunächst submers, also bedeckt mit Kulturmedium (SFM oder DMEM 10% FKS) , kultiviert (37°C, 5% C02) .
3.1 Dissoziation des Zellmaterials mit Protease XIV (Pronase®) oder Protease XIV (Pronase®) und Dispase Die Gewebestücke wurden in Pronase® (0,1% in PBS, Sigma) oder in Pronase® und Dispase (je 0,1% in PBS) ca. 16 Stunden bei ca. 5°C und anschließend noch ca. 90 Minuten bei 37 °C geschüttelt. Der epitheliale Teil der Gewebestücke wurde weiterhin mit einem Skalpell bearbeitet, um gelockerte Epithelzellen aus dem Zellverband zu lösen. Anschließend wurde die Zellsuspension zweimal mit PBS gewaschen und auf die zu bewachsende Matrix aufgebracht.
3.2 Sequentielle Dissoziation des Zellmaterials mit Trypsin / EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid) Die Gewebestücke wurden insgesamt viermal in einer Lösung von Trypsin (0,5 μg/ml, Gibco) und EDTA (0,2 μg/ml) in PBS ohne Calcium- und Magnesiumionen (Gibco) bei 37 °C 45 Minuten geschüttelt. Der Überstand mit den gelösten Zellen wurde jeweils zentrifugiert und in DMEM (Gibco) mit 10% FKS (Gibco) aufgenommen. Die verwertbaren Fraktionen wurden gesammelt, gewaschen und auf die zu bewachsende Matrix aufgebracht.
3.3 „Auswachsen" der Zellen
Gewebestücke wurden auf die zu bewachsende Matrix aufgebracht. Sie wurden dort durch Auflegen von sterilen Deckgläschen oder durch Aufkleben des Gewebes mit Fibrinkleber (TissueColl® DuoS, Immuno, 1:10 in PBS) fixiert . Ergebnis :
Die Dissoziation mit Pronase® oder Pronase® und Dispase erbrachte im Vergleich zu der sequentiellen Trypsinierung eine geringere Menge an nichthämatogenen Zellen. Allerdings bestanden von den mittels Pronase® oder Pronase® und Dispase gewonnenen Zellen jeweils ca. 10% der Zellen aus respiratorischen Epithelzellen mit schlagenden Zilien, so dass die Dissoziation diesen Enzymen in der Folge bevorzugt verwendet wurde. Da die Ausbeute an Zellen mit schlagenden Zilien bei der Dissoziation mit diesen Enzymen annähernd gleich ist, Dispase jedoch durch Fetales Kälberserum nicht inaktiviert wird, wurde die Behandlung nur mit Pronase ® bevorzugt. Von den ausgesäten Zellen wuchsen etwa 15-25% an.
Für die anschließende Liquid-Air-Kultur ist eine möglichst hohe Dichte, mindestens jedoch von 100 000 dissoziierten Zellen / cm2 Matrix zu empfehlen. Sollte diese Zellzahl ausgehend von begrenztem Probenmaterial nicht erreicht werden, ist eine Zwischenkultivierung in Kollagen-beschichteten Zellkulturgefäßen (z.B. BD-Biocoat) durchzuführen. Die dann abschließende Mobilisierung der Zellen sollte nicht mit Trypsin/EDTA, sondern mit schonenderen Verfahren (z.B. mit Accutase, PAA Laboratories) durchgeführt werden.
Auch das „Auswachsen" der Zellen aus nicht-dissoziierten Gewebestücken, z.B. mit Auflegen von Deckgläschen auf das Gewebe, ist möglich.
Um eine ausreichende Dichte von Zellen für die anschließende Liquid-Air-Kultur zu erreichen, ist eine Verteilung von Gewebestucken im Abstand von jeweils ca. 20 mm zu empfehlen. 4. Kultur von Epithel
4.1 Submerse Kultur von Epithel auf Folien
Da hier eine submerse Kultur untersucht werden sollte, wurden Folien aus PLLA (Poly-L-Laktid) oder PHB (Poly- hydroxybuttersäure) mit oder ohne vorherige Aminofunktio- nalisierung der Folien oder Kollagenisierung mit respiratorischen Epithelzellen, die nach den unter 3. beschriebenen Methoden gewonnen wurden, besiedelt. Die Kultur fand unter Standard-Zellkulturbedingungen (37 °C, 5% C02) mit SFM oder DMEM 10% FKS statt. Das Medium wurde diskontinuierlich nach visueller Kontrolle gewechselt.
Ergebnis :
Ohne Aminofunktionalisierung war vor allem bei PHB nur eine schlechte Anheftung von Zellen zu beobachten. Nach ca. 3 Wochen wuchsen - bei Ansiedlung suboptimaler Menge an Gewebe bzw. Zellsuspension - Kulturen von 2-3 cm Durchmesser auf der Matrix. Bei mehrwöchiger Kultur entwickelten sich komplexe dreidimensionale Strukturen mit Fibroblasten und Epithelzellen auf der Matrix. Bis zu ca. 20 Tage nach Versuchsbeginn, danach jedoch nicht mehr, waren in der submersen Kultur lose und feste Zellen mit aktiver Zilienbewegung lichtmikroskopisch zu erkennen. Es wird daher vermutet, das diese Zellen aus dem Gewebe stammende Zilien-tragende Zellen sind, die also unter Kulturbedingungen nicht proliferiert oder differenziert sind .
Die Zellen begannen, bei Gewinnung aus dissoziiertem Gewebe, nach 15-30 Tagen, bei Gewinnung durch „Auswachsen" nach 20-70 Tagen, sich zum Teil von der Matrix abzulösen und als Suspensionszellen weiter zu wachsen. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Kultur beendet.
4.2 Submerse und Liquid-Air-Kultur von Epithel auf Netzwerken
Kollagenisierte Matrizes aus Netzwerken biokompatibler Polymere, z.B. aus Polyamid wurden mit respiratorischen Epithelzellen, die nach den unter 3. beschriebenen Methoden gewonnen wurden, besiedelt. Die kollagenisierten Matrizes waren teilweise vorher mit Fibroblasten besiedelt worden. Die Kultur fand unter Standard-Zellkulturbedingungen (37°C, 5% C02) mit SFM oder DMEM 10% FKS statt. Das Medium wurde diskontinuierlich nach visueller Kontrolle gewechselt. Zunächst wurde für ca.14-21 Tage eine submerse Kultur durchgeführt. Dann wurde die Matrix zwischen dem Basisgefäß 1 und dem Rahmen 5 einer bereits beschriebenen Vorrichtung eingespannt und die Höhe des Mediums so eingestellt, dass die Oberfläche der Matrix nur minimal mit Medium bedeckt war .
Ergebnis :
Nach weiteren 14-21 Tagen der Liquid-Air-Kultur war die Matrix dicht mit Epithelzellen bewachsen, die auch Microvilli demonstrierten. Kulturen auf der Basis von vorher mit Fibroblasten besiedelten Matrizes zeigten bessere Ergebnisse. Der wesentliche Unterschied zwischen der submersen Kultur und der Liquid-Air-Kultur auf Matrizes aus Netzwerken lag in dem höheren Differenzierungszustand der Epithelzellen. Die Liquid-Air-Kulturen waren jedoch auch wesentlich dichter. 5. Transplantation von in vitro generiertem Epithel
Aus dem Nasenseptum von Kaninchen können unter Narkose Gewebestücke entnommen werden. Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren werden sowohl Fibroblasten als auch Epithelzellen daraus gewonnen und nacheinander auf einer netzförmigen Kollagen-beschichteten Polyamid-Matrix angesiedelt. Für 14 Tage wird eine submerse und anschließend für weiter drei Wochen eine Liquid-Air-Kultur durchgeführt, bei der die Matrix zwischen dem Basisgefäß 1 und dem Rahmen 5 einer bereits beschriebenen Vorrichtung eingespannt und die Höhe des Mediums so eingestellt wird, dass die Oberfläche der Matrix nur minimal mit Medium bedeckt ist, bis sich bei den Epithelzellen Microvilli und bewegliche Zilien zeigen. Dieses autologe Transplantat kann leicht aus der Vorrichtung zur Liquid-Air-Kultur gelöst und verwendet werden, um einen wiederum unter Narkose gesetzten Defekt im Nasenseptum des Kaninchens zu decken. Das Transplantat kann durch Fibrinkleber und /oder Naht fixiert werden.
6. Durchführung der Kultur unter Verwendung der Vorrichtung zur Füllstandsregelung:
In Versuchsreihen wurde festgestellt, dass bei der diskontinuierlichen submersen Kultivierung von Fibroblasten auf kollagenisiertem Siebgewebe bei einer Medienhöhe von ca. 10 mm wesentliche Parameter des Mediums (DMEM, 10% fetales Kälberserum) bereits nach 24 Stunden komplett verändert wa¬ ren. So hat sich nach dieser Zeit der Gehalt an Glukose als Hauptenergielieferant von ca. 5 mM auf ca. 0,2 mM reduziert, wahrend der Gehalt an Laktat von ca. 1,5 mM (aus dem fetalen Kälberserum) auf ca. 9 mM erhöht war. Üblicherweise wird das Medium bei derartigen Kultivierungen erst nach ca. 3 Tagen gewechselt. Bei Kultur der Fibroblasten mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung unter kontinuierlichem Medienwechsel blieben Laktat- und Glukosewerte jedoch im wesentlichen stabil.
In Figur 7A und B sind nach gleicher Kulturzeit Fibroblasten gezeigt, die auf kollagenisiertem Netzwerk (Maschenweite 150 μm) kultiviert wurden. Es ist zu erkennen, dass die Zellen aus der Kultur mit kontinuierlichem Austausch des Mediums (Fig. 7B) dichter sind - also stärker proliferiert haben als bei diskontinuierlichem Mediumwechsel (Fig. 7A) .

Claims

Patentansprüche :
1. Vorrichtung zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur von Epithel, die ein Kulturgefäß und eine mit Kollagen beschichtete, für Kulturmedium permeable biokompatible Matrix 10 umfaßt, wobei die Vorrichtung so ausgebildet ist, dass die Matrix 10 horizontal ausgerichtet ist und nicht auf dem Boden des Kulturgefäßes aufliegt und die Oberfläche der Matrix 10 sich unter der Oberkante des Kulturgefäßes befindet, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix 10 entweder a) auf einer für Medium permeablen Halterung aufliegt und mit dieser nicht fest verbunden ist oder b) schwimmfähig ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung auf dem Boden des Kulturgefäßes steht oder auf dessen Boden angebracht ist.
3. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung ein nach oben offenes Basisgefäß 1 mit einem ebenen Rand ist, auf dessen gesamten Rand die Matrix 10 aufliegt.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass über dem gesamten Rand des Basisgefäßes 1 ein Rahmen 5 auf der Matrix 10 aufliegt.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix 10 straff zwischen Basisgefäß 1 und Rahmen 5 liegt .
6. Vorrichtung nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass mindestens eine Klammer 4 den Rahmen 5 und das Basisgefäß 1 auf ihrer Außenseite verbindet.
7. Vorrichtung nach den Ansprüchen 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Wand des Basisgefäßes 1 mindestens eine Öffnung 3 aufweist.
8. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung eine Auflagefläche für die Matrix 10 umfaßt, die ein Netz ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass über dem Rand der Matrix 10 ein Rahmen aufliegt.
10. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix 10 schwimmfähig ist, wobei die Matrix 10 teilweise mit einer hydrophoben Schicht überzogen ist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix 10 schwimmfähig ist, wobei die Matrix 10 mit mindestens einem schwimmfähigen Körper verbunden ist oder auf einem schwimmfähigen, für Medium permeablen Körper aufliegt, wobei die Matrix 10 mit dem mindestens einen schwimmfähigen Körper so verbunden oder so auf ihn aufgelagert ist, dass die Oberfläche der Matrix 10 bei Schwimmen in Kulturmedium in der Grenzfläche zwischen Luft und Kulturmedium ausgerichtet ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der schwimmfähige Körper, auf dem die Matrix 10 aufliegt, ein Netz ist, das mit einer hydrophoben Schicht überzogen ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophoben Schicht ein Wachs oder Fett ist.
14. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix 10 aus biodegradierbarem oder nicht biodegradierbarem Material oder einem Gemisch derselben besteht.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das biodegradierbare Material Poly-L-Laktid (PLLA) , Poly- hydroxybuttersäure (PHB), Polyglycolsäure, Hyaluronsäure, Goretex oder ein Gemisch derselben und das nicht biodegradierbare Material Polyethylen, Polyamid, Polyester, Polyurethan, Polypropylen oder ein Gemisch derselben ist.
16. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix 10 ein Netz ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Maschenweite des Netzes etwa 50-500 μm beträgt.
18. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Fläche der Matrix 10 größer als etwa 100 mm2, bevorzugt größer als etwa 500 mm2, insbesondere größer als etwa 710 mm2 ist.
19. Verfahren zur Herstellung einer mit Kollagen beschichteten Matrix 10 zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur von Epithel, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die Matrix 10 mit einer Kollagenlösung in Kontakt bringt, b) die Kollagenlösung antrocknen läßt, c) das Kollagen vernetzt, d) eine Behandlung mit einer Aminosäure- oder Proteinlosung durchführt und e) man die Matrix 10 mit destilliertem Wasser wäscht.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Vernetzung in Schritt c eine chemische Vernetzung ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vernetzung mit Glutaraldehyd durchführt.
22. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass man die Beschichtung der Matrix 10 mit Kollagen auf einer hydrophoben Unterlage durchführt.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass man die hydrophobe Unterlage dadurch erhält, dass man auf eine Unterlage einen Film von Wachs, Öl oder Paraffin aufträgt .
24. Verwendung der Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 18 zur Liquid-Air-Kultur von Epithel.
25. Verfahren zur Liquid-Air-Kultur von Epithelzellen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Matrix 10 einer Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 18 mit Epithelzellen besiedelt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass man die Matrix 10 vor der Besiedlung mit Epithelzellen mit autologen Fibroblasten besiedelt.
27. Verfahren nach den Ansprüchen 25 und 26, dadurch gekennzeichnet, dass man nach der Besiedlung der Matrix 10 zunächst eine submerse Kultur und dann eine Liquid-Air- Kultur durchführt .
28. Verfahren nach den Ansprüchen 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Liquid-Air-Kultur eine Appara¬ tur zur automatischen Regelung der Höhe des Kulturmediums in dem Kulturgefäß verwendet, die so ausgebildet ist, dass die Höhe des Kulturmediums der Höhe der Matrix 10 ent¬ spricht .
29. Verfahren nach den Ansprüchen 25 bis 28, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass das Epithel respiratorisches Epithel, Haut oder Cornea ist.
30. Verfahren nach den Ansprüchen 25 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultur durchführt, bis das Epithel sich differenziert.
31. Kit, dadurch gekennzeichnet, dass es die Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 18 und eine geeignete Menge von Kulturmedium sowie Instruktionen zur Durchführung einer Liquid-Air-Kultur von Epithel enthält.
32. Verfahren zur Herstellung funktioneilen autologen artifi- ziellen Epithels, dadurch gekennzeichnet, dass man a) einem Patienten entnommenes Epithel auf der Matrix 10 einer Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 1 bis 18 ansiedelt, b) wahrend einer Proliferationsphase eine submerse Kultur des Epithels durchführt, c) während einer Differenzierungsphase eine Liquid-Air- Kultur mit einer Vorrichtung gemäß den Ansprüchen 1 bis 18 durchführt.
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