WO2005110476A1

WO2005110476A1 - テロメレース活性阻害方法および阻害剤

Info

Publication number: WO2005110476A1
Application number: PCT/JP2005/008239
Authority: WO
Inventors: Naoya Wada; Takashi Okamoto; Keiji Tanigaki; Hirofumi Doi; Yasuhiro Kikuchi; Kensaku Imai
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-05-13
Filing date: 2005-04-28
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2006-11-13
Also published as: EP1745801A1; US20070105796A1; JPWO2005110476A1

Abstract

　テロメレースの触媒サブユニットであるＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３の結合を阻害することまたは活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化阻害することを特徴とする、テロメレース活性化阻害方法およびテロメレース活性化阻害剤、テロメレース活性阻害方法およびテロメレース活性阻害剤、癌疾患の防止方法および／または治療方法、癌疾患の防止剤および／または治療剤、ＴＥＲＴとＭＡＰＫＡＰＫ３の結合を阻害する化合物または活性化型ＭＡＰＫＡＰＫ３によるＴＥＲＴのリン酸化を阻害する化合物の同定方法、並びに試薬キットを提供した。

Description

テロメレース活性阻害方法および阻害剤

技術分野

[0001] 本発明は、 MAPKAPK3 (mitogen— activated protein kinase -activated protein kinase— 3)とァロメレ ~~ス "酵素 (telomerase reverse transcn ptase、 TERT)の結合を阻害すること、または活性化型 MAPKAPK3による TERT のリン酸ィ匕を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害方法、テロメレース活性阻害方法、テロメレース活性ィ匕阻害剤およびテロメレース活性阻害剤に関する。また、 MAPKAPK3不活性ィ匕型変異体によるテロメレース活性阻害方法および該変異体を含んでなるテロメレース活性阻害剤に関する。

さらに、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物または活性化型 MAPKA PK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法に関する。

また、前記テロメレース活性化阻害方法および Zまたは前記テロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

さらに、前記テロメレース活性ィ匕阻害方法を用いるテロメレース活性ィ匕阻害、および Zまたは前記テロメレース活性阻害方法を用いるテロメレース活性阻害を特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。また、 MAPKAPK3、 MAPKAPK3をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか 1つと、 TERT, TERTをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれ力 1つとを含んでなる試薬キットに関する。

背景技術

[0002] テロメレースは、真核細胞の染色体末端のテロメァ配列の伸張反応を触媒する酵素であり、铸型となる RNA分子であるテロメレース RNA(TR)と触媒サブユニットである TERTからなるリボ核蛋白質である（非特許文献 1)。 [0003] テロメレースは、テロメァ長を維持することにより、細胞に不死化能 (無限寿命）を与える。テロメァは真核細胞の染色体 DNAの末端部分に存在する単純な繰り返し配列であり、染色体の安定性維持に寄与している。細胞分裂において DNAの複製を司る通常の DNAポリメラーゼでは DNAの最末端まで完全に複製が行われないため、細胞分裂に伴いテロメァは短縮される。正常な体細胞では一定回数分裂後に増殖が停止し、細胞の老化あるいは細胞死が生じる。

[0004] テロメレース活性は生殖細胞、各種幹細胞および末梢血リンパ球を除く正常細胞では検出されない。したがって、大多数の正常細胞は分裂毎にテロメァ長が短縮するためテロメァ長を維持することができず、その寿命は有限である。

[0005] 一方、癌細胞等不死化した細胞の大多数にお!、ては、テロメレース活性が検出される。すなわち、細胞分裂に伴い短縮されたテロメァがテロメレースにより伸張され、その結果、テロメァ長が維持されることが、癌細胞の無限増殖性獲得機序の 1つであると考えられて、る。テロメレースによるテロメァ長の維持が癌細胞の不死化に寄与することは、アンチセンス RNAを用いて癌細胞のテロメレース活性を消失させると、 1 0数回の細胞分裂の後に細胞増殖が停止し、細胞死が誘導されるという報告により明らかである。また、癌細胞内でドミナントネガティブ型テロメレースを発現させることにより、テロメレース活性の消失と細胞分裂に伴ったテロメァ長の短小化、染色体末端融合の出現および細胞死が誘導されることが報告されて!、る。

[0006] テロメレースの活性ィ匕に関しては、 TERT遺伝子の発現活性ィ匕による活性ィ匕ゃ TE RTのリン酸ィ匕を介した活性ィ匕等が報告されている。前者については、多くの正常細胞において TR遺伝子の発現は検出されるものの TERT遺伝子の発現は検出されないのに対し、多くの癌細胞では TRおよび TERT両遺伝子の発現が認められることから、癌細胞等テロメレース活性が検出される細胞では何らかの機構により TERT遺伝子の発現が活性ィ匕されていると考えられている。後者については、癌細胞の核抽出液を脱リン酸ィ匕処理すると抽出液中のテロメレース活性が低減することが報告されており、テロメレースの活性化にリン酸ィ匕が関与している可能性が示唆されている（非特許文献 2)。また、癌細胞由来の核抽出液を Aktやプロテインキナーゼ C (PKC)と反応させることにより抽出液中のテロメレース活性が上昇することが報告されており、これらキナーゼがテロメレース活性ィ匕に関与する可能性があると考えられて、る（非特許文献 3および 4)。さらに、ヒト臍帯静脈内皮細胞に活性型 Aktを過剰に発現させると該細胞内テロメレース活性が上昇することが報告されて、る（非特許文献 5および 6 )。また、ヒト臍帯静脈内皮細胞にドミナントネガティブ型 Aktを過剰に発現させると該細胞内テロメラーゼ活性が低減することが報告されている（非特許文献 5および 6)。さらに、 PI3—キナーゼ阻害剤によるヒト臍帯静脈内皮細胞内テロメラーゼ活性の低減も報告されている（非特許文献 5および 6)。しかし、 Aktについては、乳癌組織における Akt活性とその正常組織における Akt活性とに差が見られないことが報告されている（非特許文献 7)。また、 PKCについては、癌細胞内において PKCがテロメレース活性を上昇させるか否かは不明である。なお、 PKCのァイソザィムの 1つである PKCalphaおよび Aktと MAPKAPK3とは一次構造上の相同性が低ぐそれぞれおよそ 14. 89%、 23. 76%の相同性を示す。 PKCの他のアイソザィムと MAPKAP K3との一次構造上の相同性も同様に低、。

[0007] MAPKAPK3はセリン Zスレオ-ンキナーゼの一つであり、 MAPキナーゼファミリ一 (ERK、 p38および JNK等）によりリン酸ィ匕されて活性ィ匕することが報告されている。 MAPKAPK3の機能については黄体成熟機構への関与が報告されているのみである。また、基質として HSP27 (small heat shock protein 27)、転写因子 CR EB (cAMP regulatory element binding protein)および転写因子 E47をリン酸化することが報告されている。しかし、これら基質とテロメレースとの関連についての報告はない。

[0008] 以下に本明細書において引用した文献を列記する。

特許文献 1：国際公開第 WO01Z67299号パンフレット。

非特許文献 1 :ケラー（Kelleher C. )ら、「トレンズインバイオケミカルサイェンシズ（TRENDS in Biochemical Sciences)」、 2002年、第 27卷、 p. 572— 57 9₀

非特許文献 2：「ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（Journal of Biolog ical Chemistry)」、 1997年、第 272卷、 p. 16729— 16732。

非特許文献 3：「ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（Journal of Biolog ical Chemistry)」、 1999年、第 274卷、 p. 13085— 13090。

非特許文献 4:「ジャーナルォブバイオロジカルケミストリー（Journal of Biolog ical Chemistry)」、 1998年、第 273卷、 p. 33436— 33442。

非特許文献 5 :「フエブスレターズ (FEBS Letters)」、 2001年、第 493卷、 p. 21 25。

非特許文献 6 :「フエブスレターズ (FEBS Letters)」、 2003年、第 536卷、 p. 18 0—186。

非特許文献 7 :「インターナショナルジャーナルォブキャンサー（International Journal of Cancer)」、 2002年、第 98卷、 p. 148— 154。

非特許文献 8 :「アメリカンジャーナルォブレスピレイトリーセルアンドモレキュフ' ~~ ノィォロン¹ ~~ American Journal of Respiratory Cell and Moiecu lar Biology)」、 2002年、第 26卷、 p. 558— 564。

非特許文献 9 :「キャンサーレターズ（Cancer Letters)」、 2003年、第 191卷、 p. 229— 237。

非特許文献 10 :「ジャーナルォブタリ-カルインべスティゲーシヨン (Journal of Clinical Investigation)」、 1997年、第 99卷、 p. 1478— 1483。

非特許文献 11 :「キャンサーリサーチ（Cancer Research)」、 1995年、第 55卷、 p . 4182—4187。

非特許文献 12 :「ジャーナルォブタリ-カルインべスティゲーシヨン (Journal of

Clinical Investigation)」、 1997年、第 99卷、 p. 1463— 1464。

非特許文献 13 :「ブラッド（Blood)」、 1999年、第 93卷、 p. 3893— 3899。

非特許文献 14:「アメリカンジャーナルォブパソロジー（American Journal of

Pathology)」、 1998年、第 153卷、 p. 1411— 1423。

非特許文献 15 :「ジャーナルォブステロイドバイオケミストリーアンドモレキユラ ~~ノヽィォロン ~~ (Journal of steroid Biocnemistry and Molecular Biolog y)」、 2002年、第 80卷、 p. 239— 256。

非特許文献 16 :「パソロジー、リサーチアンドプラクティス（Pathology, Research and Practice)」、 2000年、第 196卷、 p. 817— 826。非特許文献 17 :「パソロジー、オンコロジ一リサーチ（Pathology Oncology Res earch)」、 2001年、第 7卷、 p. 171— 177。

非特許文献 18 :「キャンサーリサーチ（Cancer Research)」、 1999年、第 59卷、 p . 279— 284。

非特許文献 19 :「アンチキャンサーリサーチ（Anticancer Research)」、 2001年、第 21卷、 p. 2733 - 2738₀

非特許文献 20 :「キャンサーリサーチ（Cancer Research)」、 2001年、第 61卷、 p . 6500— 6510。

非特許文献 21 :「へノ讣ロジ一（Hepatology)」、 1998年、第 27卷、 p. 951— 958。非特許文献 22：「ジャーナルォブゥロロジー（Journal of Urology)」、 1999、第 162卷、 p. 1537—1542。

非特許文献 23 :ウルマー（K. M. Ulmer)、「サイエンス（Science)」、 1983年、第 2 19卷、 p. 666— 671。

非特許文献 24:「ペプチド合成」、丸善株式会社、 1975年。

非特許文献 25：「ペプチドシンテシス (Peptide Synthesis)」、インターサイエンス (Interscience)、ニューヨーク (New York) ^ 1996年。

非特許文献 26 :「モレキュラーアンドセルラーバイオロジー（Molecular and C ellular Biology)」、 1996年、第 16卷、 p. 6687— 6697。

非特許文献 27 :キム（Kim N. W. )ら、「サイエンス（Science)」、 1994年、第 266 卷、第 5193号、 p. 2011— 2015。

非特許文献 28 :ゥェン（Wenz C. )ら、「ザェンボジャーナル（The EMBO Jou rnal)」、 2001年、第 20卷、第 13号、 p. 3526— 3534。

非特許文献 29 :タテマツ（Tatematsu K. )ら、「オンコジーン（Oncogene)」、 1996 年、第 13卷、第 10号、 p. 2265— 2274。

非特許文献 30 :ナカムラ（Nakamura Y. )ら、「タリ-カルケミストリー（Clinical C hemistry)」、 1999年、第 45卷、第 10号、 p. 1718— 1724。

非特許文献 31 :マエサヮ（Maesawa C. )ら、「ヌクレイックァシッズリサーチ（Nuc leic Acids Research) , 2003年、第 31卷、第 2号、 p. E4— 4。非特許文献 32 :「バイオテクニクス（Biotechniques)」、 2002年、第 32卷、第 5号、 p . 1154—1156、 1158、 1160。

非特許文献 33 :パディソン（Paddison P. J. )ら、「ジーンズアンドディべ口プメント（Genes and Development)」、 2002年、第 16卷、 p. 948— 958。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明の課題は、テロメレースの活性ィ匕に関与する蛋白質を見出して提供することである。また、本発明の課題には、テロメレースの活性ィ匕を阻害する手段およびテロメレースの活性を阻害する手段を提供することが含まれる。さらに、本発明の課題には、テロメレース活性の亢進に起因する疾患、例えば癌疾患の防止および Zまたは治療に有用な手段を提供することが含まれる。

課題を解決するための手段

[0010] 上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、テロメレースの触媒サブユニットである TERT ) MAPKAPK3、mitogen— activated protein kinase— activat ed protein kinase— 3)と相互作用することをインシリコ（in silico)で予測した。そして、 MAPKAPK3がテロメレースの活性ィ匕に関与することを実証した。具体的には、 MAPKAPK3が TERTと結合すること、およびテロメレース活性が活性化型 MA PKAPK3の用量依存的に上昇することを実証した。これらから、 TERTと MAPKA PK3が結合した後、該 MAPKAPK3が ERK、 JNKおよび Zまたは p38等によりリン酸化されることにより活性化型 MAPKAPK3が生成され、該活性化型 MAPKAPK 3により該 TERTがリン酸ィ匕され、その結果、テロメレース活性が上昇すると考える。

[0011] 本発明においてはまた、 TERTと結合する不活性ィ匕型 MAPKAPK3によりテロメレース活性を阻害できることを見出した。具体的には、 TERTと不活性ィ匕型 MAPKA PK3が結合すること、および TERTと結合する不活性ィ匕型 MAPKAPK3によりテロメレース活性が低減し、その結果、ゲノム DNAのテロメァ長が短縮されることを実証した。これらから、 TERTと結合する不活性化型 MAPKAPK3は、テロメレースの活性ィ匕および Zまたはテロメレースを阻害することにより、テロメレースの活性を阻害すると考える。 TERTと結合する不活性化型 MAPKAPK3のキナーゼ活性は、 MAP KAPK3および活性化型 MAPKAPK3と比較し、低減または消失している。しかし、 TERTと結合する不活性化型 MAPKAPK3は、 MAPKAPK3の基質である TERT への結合能を有する。したがって、 TERTと結合する不活性ィ匕型 MAPKAPK3は、 MAPKAPK3への TERTの結合を拮抗的に阻害することによりテロメレースの活性化を阻害し、その結果、テロメレース活性を阻害すると考える。このように、 TERTと結合する不活性ィ匕型 MAPKAPK3によりテロメレース活性を阻害できる。

[0012] 上述のように、 TERTと MAPKAPK3との結合を阻害すること、または活性化型 M APKAPK3によるテロメレースのリン酸化を阻害することにより、テロメレースの活性化を阻害することができ、その結果、テロメレースの活性を阻害できる。

[0013] また、不活性ィ匕型 MAPKAPK3を用いてテロメレース活性を低減させることができ、その結果、テロメァ長の短縮を引き起こすことができた。したがって、 TERTと MAP KAPK3との結合を阻害すること、または活性化型 MAPKAPK3によるテロメレースのリン酸ィ匕を阻害することにより、テロメレース活性を低減させることができ、テロメァ長の短縮を引き起こして、癌細胞の有限寿命化と染色体の不安定ィ匕による細胞死を誘導できる。その結果、癌疾患、例えば乳癌等を防止および Zまたは治療することができる。

[0014] 本発明は、これら知見により完成した。

[0015] すなわち本発明は、以下の群より選ばれるテロメレース活性ィ匕阻害方法に関する：

(i) MAPKAPK3と TERTの結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害方法、および

(ii)活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害方法。

[0016] 本発明はまた、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害方法に関する。

[0017] 本発明はさらに、前記いずれかのテロメレース活性ィ匕阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性阻害方法に関する。

[0018] 本発明はさらにまた、 MAPKAPK3の不活性ィ匕型変異体によるテロメレース活性阻害方法であって、該変異体が TERTと結合する変異体である、テロメレース活性阻害方法に関する。

[0019] 本発明はまた、 MAPKAPK3の不活性化型変異体が配列表の配列番号 6のァミノ酸配列で表される蛋白質である、前記テロメレース活性阻害方法に関する。

[0020] 本発明はさらに、前記いずれかのテロメレース活性ィ匕阻害方法、および Zまたは前記!、ずれかのテロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0021] 本発明はさらにまた、テロメレース活性の亢進に起因する疾患が癌疾患である前記テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0022] 本発明はまた、癌疾患が、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌および非小細胞肺癌のいずれカゝである前記テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0023] 本発明はさらに、癌疾患が乳癌疾患である前記テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

[0024] 本発明はさらにまた、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と MAPKAPK3および Zまたは TERTとの相互作用を可能にする条件下、該化合物と MAPKAPK3および Zまたは TERTとを接触させ、次いで、 MAPKAPK3と TERTの結合により生じるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が MAPKAPK3と TERTの結合を阻害するか否かを決定する方法に関する。

[0025] 本発明はまた、活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と活性化型 MAPKAPK3および Zまたは TERTとの相互作用を可能にする条件下、該化合物と活性ィ匕型 MAPKAPK3および Zまたは TERTとを接触させ、次いで、活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化により生じるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化を阻害するか否かを決定する方法に関する。

[0026] 本発明はさらに、以下の群より選ばれるテロメレース活性ィ匕阻害剤に関する：

(i) MAPKAPK3と TERTの結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害剤、および

(ii)活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害剤。

[0027] 本発明はさらにまた、以下の群より選ばれるテロメレース活性ィ匕阻害剤に関する：

(i) MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物を少なくとも 1つ含んでなるテロメレース活性ィ匕阻害剤、および

(ii)活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物を少なくとも 1 つ含んでなるテロメレース活性ィ匕阻害剤。

[0028] 本発明はまた、以下の群より選ばれるテロメレース活性阻害剤に関する：

(i) MAPKAPK3と TERTの結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性阻害剤、および

(ii)活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害することを特徴とするテロメレース活性阻害剤。

[0029] 本発明はさらに、以下の群より選ばれるテロメレース活性阻害剤に関する：

(i) MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物を少なくとも 1つ含んでなるテロメレース活性阻害剤、および

(ii)活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物を少なくとも 1 つ含んでなるテロメレース活性阻害剤。

[0030] 本発明はさらにまた、 MAPKAPK3の不活性ィ匕型変異体を含んでなるテロメレース活性阻害剤であって、該変異体が TERTと結合する変異体である、テロメレース活性阻害剤に関する。

[0031] 本発明はまた、 MAPKAPK3の不活性ィ匕型変異体が配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である、前記テロメレース活性阻害剤に関する。

[0032] 本発明はさらに、前記いずれかのテロメレース活性ィ匕阻害方法を用いるテロメレース活性ィ匕阻害、および Zまたは前記、ずれかのテロメレース活性阻害方法を用いるテロメレース活性阻害を特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0033] 本発明はさらにまた、前記テロメレース活性化阻害剤並びに前記テロメレース活性阻害剤のうち少なくともいずれか 1つを含んでなるテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0034] 本発明はまた、テロメレース活性の亢進に起因する疾患力癌疾患である前記いずれかのテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0035] 本発明はさらに、癌疾患が、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌および非小細胞肺癌のいずれかである前記テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0036] 本発明はさらにまた、癌疾患が乳癌疾患である前記テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。

[0037] 本発明はまた、 MAPKAPK3、 MAPKAPK3をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれ力 1つと、 TERT、 TERTをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくとも V、ずれか 1つとを含んでなる試薬キットに関する。

発明の効果

[0038] 本発明により、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害すること、または活性化型 MA PKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害方法、テロメレース活性阻害方法、テロメレース活性ィ匕阻害剤およびテロメレース活性阻害剤を提供できる。また、 MAPKAPK3不活性ィ匕型変異体によるテロメレース活性阻害方法および該変異体を含んでなるテロメレース活性阻害剤を提供できる。さらに、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物または活性化型 MAPKA PK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定方法を提供できる。また、前記テロメレース活性化阻害方法および Zまたは前記テロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法を提供できる。さらに、前記テロメレース活性ィ匕阻害方法を用いるテロメレース活性ィ匕阻害、および Zまたは前記テロメレース活性阻害方法を用いるテロメレース活性阻害を特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤を提供できる。また、 MAPKAPK3、 MAPKAPK3をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか 1つと、 TERT、 TERTをコードするポリヌクレォチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれ力 1つとを含んでなる試薬キットを提供できる。

[0039] 本発明により、テロメレースの活性ィ匕およびテロメレース活性を阻害することができる。そのため本発明により、テロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止および Z または治療が可能になる。テロメレースは、細胞に不死化能 (無限寿命）を与える機能を有し、癌細胞等不死化細胞においてその活性が検出されている。本発明によるテロメレース活性ィ匕阻害およびテロメレース活性阻害により、癌細胞の有限寿命化と染色体の不安定ィ匕による細胞死が誘導できる。したがって本発明により、例えば、乳癌等の癌疾患の防止および Zまたは治療が可能になる。

図面の簡単な説明

[0040] [図 1]テロメレースの触媒サブユニットである TERTと MAPKAPK3の相互作用をィンシリコで予測した結果を示す図である。 TERTと MAPKAPK3の間でローカルァラィメントを行い、高いスコア（score)を示した領域を図示した。アミノ酸配列は 1文字表記した。図中の数字は、 TERTまたは MAPKAPK3の各アミノ酸配列における、図示した各領域の N末端アミノ酸の位置を意味する。（実施例 1)

[図 2]MAPKAPK3または活性化型 MAPKAPK3と³⁵ S—メチォニン標識蛋白質として合成した TERTとが結合することを、ダルタチオンセファロースを用いたプルダウン法により検出した結果を示す図である。また、不活性ィ匕型 MAPKAPK3も、 MAP KAPK3または活性化型 MAPKAPK3と比較して弱!、結合である力 TERTと結合した。 GSTは TERTと結合しなカゝつた。矢頭は、 TERTの位置を示す。（実施例 2) [図 3]TERTと HA— MAPKAPK3を共発現させた細胞の細胞溶解液（レーン 2)にっ、て、抗 HA抗体で免疫沈降 (IP)後に抗 TERT抗体を用いたウェスタンブロッティング (WB)で蛋白質の検出を行なったところ、 HA— MAPKAPK3の共沈降が認められた（最下段のパネル）ことを示す図である。レーン 1は、 HA—MAPKAPK3をコードするポリヌクレオチドを含むベクターの代わりに空ベクターをトランスフエクシヨンした細胞の細胞溶解液にっ、ての結果を示す。（実施例 3)

[図 4]活性ィ匕型 MAPKAPK3を一過性発現させた細胞では、細胞内テロメレース活性が上昇したことを示す図である。一方、不活性化型 MAPKAPK3を一過性発現させた細胞では、細胞内テロメレース活性は低減した。用いた細胞は、テロメレース活性を有する細胞である。図中、「* *」はスチューデント t—テストで有意差 (pく 0. 0 1)が認められたことを示す。（実施例 4)

圆 5]脱リン酸ィ匕処理により、脱リン酸ィ匕酵素の用量依存的にテロメレース活性が低減したことを示す図である。（実施例 5)

[図 6]脱リン酸ィ匕処理によりテロメレース活性が低減した核抽出液に活性ィ匕型 MAPK APK3を添カ卩してリン酸ィ匕反応を行なったところ、活性化型 MAPKAPK3用量依存的にテロメレース活性が上昇したことを示す図である。 GSTを添加して同様にリン酸化反応を行なったときは、テロメレース活性の上昇は認められな力つた。図中、「CIP 」とは、脱リン酸ィ匕酵素を意味する。（実施例 5)

[図 7]脱リン酸ィ匕処理によりテロメレース活性が低減した核抽出液に活性ィ匕型 MAPK APK3を添加してリン酸ィ匕反応を行なったところテロメレース活性が上昇した力 MA PKAPK3または不活性化型 MAPKAPK3によってはテロメレース活性の上昇が認められな力つたことを示す図である。（実施例 5)

[図 8- A]不活性化型 MAPKAPK3発現レトロウイルス感染細胞（inactive 3pK、図中では黒カラムで示す）において、親株 (parent,図中では白カラムで示す)または空ウィルス感染細胞（empty、図中では斜線カラムで示す）と比較して、テロメレース活性が顕著に低減したことを示す図である。（実施例 6)

[図 8-B]不活性化型 MAPKAPK3発現レトロウイルスを癌細胞株（PC— 3および U -87MG)に感染させたときに、感染細胞（inactive 3pK)において不活性化型 Μ APKAPK3が過剰発現されたことを示す図である。コントロールである j8—チューブリンの発現量は、感染細胞 (inactive 3pK)、親株 (parent)および空ウィルス感染

、ても同程度であった。不活性化型 MAPKAPK3 (N 末端 HA— tag付加）の検出は抗 HA抗体、 β—チューブリンの検出は抗 j8—チューブリン抗体を用いたウェスタンプロット (WB)により実施した。（実施例 6)

[図 9]不活性化型 MAPKAPK3発現レトロウイルスを癌細胞株 U— 87MGに感染させたときに、感染細胞 (inactive 3pK)におヽて経時的なテロメァ長の短縮が認められたことを示す図である。一方、親株 (parent)および空ウィルス感染細胞 (empty )においてはテロメァ長の変化は認められな力つた。（実施例 6)

発明を実施するための最良の形態

[0041] 以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。

本明細書にぉヽては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」 t 、う用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している 2個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、 1文字または 3文字にて表記することがある。

[0042] 本発明においては、テロメレースの触媒サブユニットである TERTが MAPKAPK3 と相互作用することを、特許文献 1に記載の方法に従ってインシリコで予測した。そして、 TERTが MAPKAPK3と結合することを実証した。さら〖こ、テロメレース活性が活性ィ匕型 MAPKAPK3の用量依存的に上昇することを明らかにした。また、 TERTと不活性ィ匕型 MAPKAPK3が結合すること、および TERTと結合する不活性ィ匕型 M APKAPK3によりテロメレース活性が低減し、その結果、ゲノム DNAのテロメァ長が短縮されることを実証した。

[0043] MAPKAPK3はセリン Zスレオ-ンキナーゼの一つであり、 MAPキナーゼファミリ一 (ERK、 p38および JNK等）によりリン酸ィ匕されて活性ィ匕することが報告されている。 MAPKAPK3の機能については黄体成熟機構への関与が報告されているのみである。また、基質として HSP27、転写因子 CREBおよび転写因子 E47をリン酸ィ匕することが報告されている。しかし、これら基質とテロメレースとの関連についての報告はない。

[0044] MAPKAPK3を活性化することが知られて!/、る p38は乳癌組織および非小細胞肺癌組織において活性ィ匕しているという報告がある（非特許文献 7— 9)。また、 MAPK APK3を活性ィ匕することが知られている ERKは、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、ダリァ性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌等の癌組織において活性ィ匕しているという報告がある（非特許文献 10— 22)。したがって、これらの癌組織において MAPKAPK3の活性化によりテロメレースが活性化するといぅシグナルが存在して、る可能性があると考える。

[0045] 本発明にお!/、て、 MAPKAPK3が TERTと結合すること、および活性化型 MAPK APK3によりテロメレース活性が上昇することを明らかにした。これらから、 TERTと M APKAPK3が結合した後、該 MAPKAPK3が p38等によりリン酸化されることにより活性化型 MAPKAPK3が生成され、該活性化型 MAPKAPK3により該 TERTがリン酸化され、その結果、テロメレース活性が上昇すると考える。

[0046] したがって、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害すること、または活性化型 MAP KAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害することにより、テロメレースの活性ィ匕を阻害でき、その結果、テロメレース活性を阻害できると考える。

[0047] さらに本発明にお、て、 TERTと不活性化型 MAPKAPK3が結合すること、および TERTと結合する不活性ィ匕型 MAPKAPK3によりテロメレース活性が低減し、その結果、テロメァ長が短縮されることを明らかにした。 TERTと結合する不活性ィ匕型 MAPKAPK3は、テロメレースの活性化および Zまたはテロメレースを阻害することにより、テロメレースの活性を阻害すると考える。 TERTと結合する不活性化型 MAP KAPK3のキナーゼ活性は、 MAPKAPK3および活性化型 MAPKAPK3と比較し、低減または消失している。しかし、 TERTと結合する不活性ィ匕型 MAPKAPK3は、 MAPKAPK3の基質である TERTへの結合能を有する。したがって、 TERTと結合する不活性化型 MAPKAPK3は、 MAPKAPK3への TERTの結合を拮抗的に阻害することによりテロメレースの活性ィ匕を阻害し、その結果、テロメレース活性を阻害する可能性が高い。 TERTと結合する不活性ィ匕型 MAPKAPK3によりテロメレース活性を阻害できる。

[0048] テロメァは真核細胞の染色体 DNAの末端部分に存在する単純な繰り返し配列であり、染色体の安定性維持に寄与している。したがって、テロメァ長が短縮されることにより、癌細胞の有限寿命化と染色体の不安定化による細胞死が誘導される。

[0049] TERTと結合する不活性ィ匕型 MAPKAPK3を発現させた癌細胞にぉヽて実際に、テロメレース活性が低減し、テロメァ長の短縮が引き起こされたことから、 TERTと結合する不活性ィ匕型 MAPKAPK3によりテロメレース活性を低減させることによって細胞死を誘導できると考える。

[0050] テロメレースが癌の種類を問わずほとんどの癌細胞で発現していることから、 TERT と結合する不活性化型 MAPKAPK3を用いること、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害すること、または活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害することにより、テロメレース活性を阻害し、それにより癌細胞の細胞死を誘導して、癌疾患等、例えば乳癌疾患等を防止および Zまたは治療できる。

[0051] 本発明の一態様は、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害すること、または活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害方法および該テロメレース活性ィ匕阻害方法を用いるテロメレース活性阻害方法に関する。さらに、本発明の一態様は、 MAPKAPK3の不活性ィ匕型変異体によるテロメレース活性阻害方法であって、該変異体が TERTと結合する変異体である、テロメレース活性阻害方法に関する。好ましくは、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌並びに非小細胞肺癌等のヒト癌組織におけるテロメレース活性ィ匕阻害方法およびテロメレース活性阻害方法、さらに好ましくは、ヒト乳癌組織におけるテロメレース活性ィ匕阻害方法およびテロメレース活性阻害方法に関する。

[0052] 「活性化型 MAPKAPK3Jとは、キナーゼ活性を示すように活性化された MAPKA PK3を意味する。活性化型 MAPKAPK3は、 MAPKAPK3が MAPキナーゼフアミリー（ERK、 p38および JNK等）等によりリン酸化されて活性化した MAPKAPK3であることができる。好ましくは、 MAPキナーゼファミリ一等により、 MAPKAPK3のアミノ酸配列第 201番目と第 313番目のスレオニンカ^ン酸化された結果、リン酸化を受ける前の MAPKAPK3と比較し、高、キナーゼ活性を示すように活性ィ匕された MA PKAPK3であることができる。また、 MAPKAPK3にキナーゼ活性を示すような変異が天然にお、てあるいは遺伝子工学的手法を用いて導入された MAPKAPK3変異体であってもよい。力かる MAPKAPK3変異体として、 MAPKAPK3のアミノ酸配列第 201番目と第 313番目のスレオニンをグルタミン酸に置換した変異体 (配列番号 8)が例示できる。

[0053] 「MAPKAPK3」とは、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列（配列番号 2)からなる蛋白質であり、リン酸化等により活性ィ匕されておらず、キナーゼ活性を示さな、ある、はキナーゼ活性が低、ものを意味する。

[0054] TERT遺伝子および該遺伝子がコードする蛋白質は、それぞれ配列表の配列番号 3および配列番号 4に記載の各配列で表される遺伝子および蛋白質である。

[0055] 「MAPKAPK3と TERTの結合」とは、 MAPKAPK3と TERTが複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により、 MAP KAPK3と TERTが相互作用することを意味する。ここでの結合とは、 MAPKAPK3 と TERTがそれら分子の一部分において結合すれば足りる。例えば、 MAPKAPK3 または TERTを構成するアミノ酸の中に、 MAPKAPK3と TERTの結合に関与しな V、アミノ酸が含まれて、てもよ、。

[0056] MAPKAPK3と TERTの結合は、免疫沈降法による共沈物の確認、ツーハイブリッド法、ウェスタンプロット法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法またはこれらの方法を組合わせることにより検出され得る。

[0057] 例えば、まず、 N末端にダルタチオン S トランスフェラーゼ (GST)を融合させた M APKAPK3 (GST-MAPKAPK3)と³⁵ S—メチォニン標識蛋白質として合成した T ERTとを反応させる。次いで、グルタチオンセファロースにより GST—MAPKAPK3 を回収し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE)により展開する。オートラジオグラフィ一で TERTを検出することにより、 MAPKAPK3 と TERTの結合を検出できる（実施例 2を参照)。

[0058] また、 N末端に HA—tagが付カ卩された MAPKAPK3と TERTとを反応させた後に、抗 HA抗体を用いて該 MAPKAPK3を免疫沈降する。次いで、共沈物を抗 TERT 抗体を用いてウェスタンブロッテイングすることにより、 MAPKAPK3と TERTの結合を検出できる（実施例 3を参照)。

[0059] 「テロメレースの活性ィ匕」とは、テロメレースを構成する TERTが活性化型 MAPKA PK3によりリン酸ィ匕を受けた結果、リン酸ィ匕を受ける前と比較しテロメレース活性が上昇することを意味する。

[0060] MAPKAPK3, TERTおよびこれらの遺伝子は上記各配列で表されるものに限らず、一般に知られて、る MAPKAPK3および TERTの機能を有する限りにお!/、て、上記各配列において 1乃至数個の変異を有する蛋白質およびポリヌクレオチドであることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために、上記各配列に 1乃至数個の変異を導入した変異体を用いることもできる。

[0061] MAPKAPK3遺伝子および TERT遺伝子は、例えば、それぞれの遺伝子の発現が認められる適当な起源 (例えば、ヒト乳癌由来の細胞)から、自体公知のクローニング方法等を用いて容易に取得され得る。活性ィ匕型 MAPKAPK3遺伝子は、例えば、 MAPKAPK3遺伝子の変異体として、 MAPKAPK3遺伝子に部位特異的突然変異法等自体公知の変異導入手段を用いて変異を導入することにより取得され得る。これら遺伝子がコードする蛋白質は、例えば、それぞれの遺伝子を用いた自体公知の遺伝子工学的手法により取得され得る。

[0062] MAPKAPK3と TERTの結合阻害は、例えば、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物を用いることにより実施できる。ここでは、このような阻害効果を有する化合物 (後述する例として競合阻害効果を有するポリペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる）を阻害剤と称する。

[0063] MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物として、好ましくは当該結合を特異的に阻害する化合物、より好ましくは当該結合を特異的に阻害する低分子量ィ匕合物が挙げられる。 MAPKAPK3と TERTの結合を特異的に阻害するとは、当該結合を強く阻害するが、他の蛋白質間結合は阻害しないか、弱く阻害することを意味する

[0064] MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物としてその他に、 MAPKAPK3と TERTが結合する部位のアミノ酸配列力もなるポリペプチドが例示できる。かかるポリペプチドは、蛋白質間の結合を競合的に阻害し得る。かかるポリペプチドは、 MAP KAPK3または TERTのアミノ酸配列力設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害するものを選択することにより取得できる。このように特定されたポリペプチドに、 1乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよぐまた変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術 (非特許文献 23)を利用できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質 (物性、機能または免疫学的活性等)を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸 (極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著、変更を伴わな、程度に改変できる。

[0065] 上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。

具体的には、成書 (非特許文献 24および 25)に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えば Fmoc法等が挙げられる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造できる。あるいは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換え発現ベクターを作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフエクシヨンして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造できる。

[0066] MAPKAPK3と TERTの結合の阻害は、 MAPKAPK3または TERTを認識する抗体であって、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する抗体を用いることによつても実施できる。かかる抗体は、 MAPKAPK3または TERT自体、またはこれら蛋白質の断片、好ましくは MAPKAPK3と TERTが結合する部位のアミノ酸配列カゝらなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。

[0067] 「活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化」とは、活性化型 MAPKAPK3 により、 TERTを構成するアミノ酸のうちセリン、スレオニン残基のヒドロキシル基にァデノシン三リン酸 (ATP)の γ リン酸基が転移されることを意味する。一般的に酵素活性を有する蛋白質は、リン酸ィ匕によりその酵素活性が調節されることが多い。したがって、リン酸ィ匕により TERTの逆転写酵素活性が促進され、その結果テロメレース活性が上昇すると考える。

[0068] 活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化、およびリン酸化された TERTの検出は、自体公知の方法により実施できる。生体内においては、 TERTと MAPKAP K3が結合した後に、該 MAPKAPK3が ERK、 JNKおよび p38等の MAPキナーゼファミリ一等により活性ィ匕されると考える。しかし、実施例に示したように、変異体である活性化型 MAPKAPK3は TERTと結合し、かつ活性化型 MAPKAPK3の用量依存的にテロメレース活性を上昇させる。したがって、活性ィ匕型 MAPKAPK3と TE RTとを共存させることにより、活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を実施できる。活性化型 MAPKAPK3として、 MAPKAPK3のアミノ酸配列第 201番目と第 313番目のスレオニンをグルタミン酸に置換した MAPKAPK3変異体が好ましく例示できる。

[0069] 活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化、およびリン酸化された TERTを検出する方法として、具体的には、次の方法が例示できる。

[0070] 放射性同位体で標識された ATP (例えば [ γ ³² P] ATP)を含むキナーゼバッファ一中で活性化型 MAPKAPK3と TERTとを接触させ、反応後〖こ SDS— PAGEで反応産物を展開し、オートラジオグラフィ一により放射活性を測定することにより、活性化型 MAPKAPK3によりリン酸化された TERTを検出できる。

[0071] また、 TERT自体を自体公知の方法によりマイクロタイタープレートのゥエル上に固定した後、該ゥエル内に ATPおよび活性ィ匕型 MAPKAPK3を添カ卩し、 TERTと活性ィ匕型 MAPKAPK3を接触させ、反応後に、予めユーロピウム (Eu)標識されかつリン酸ィ匕された TERTを認識する抗体を用いて、リン酸ィ匕された TERTと該抗体との抗原抗体反応を行い、時間分解蛍光を検出することにより、活性化型 MAPKAPK3〖こよりリン酸ィ匕された TERTを検出できる。

[0072] TERTを結合させたドナービーズと活性ィ匕型 MAPKAPK3とを接触させ、反応後に抗リン酸化 TERT抗体を結合させたァクセプタービーズを反応溶液に添加し、両ビーズが近接したときのみ発生するシグナル (例えば、ドナービーズをレーザ照射した際に発生する一重項状態の酸素が、ァクセプタービーズに含まれる蛍光物質を活性化させた結果、発生する一定波長の光）を検出することにより、活性化型 MAPKAP K3によりリン酸ィ匕された TERTを検出できる。

[0073] また、自体公知のシンチレーシヨンプロキシミティアツセィ法（Scintillation proxi mity assay, SPA)を用いて、活性化型 MAPKAPK3によりリン酸化された TERT を検出できる。

[0074] 上記例示した方法は、 TERTの代わりに、活性ィ匕型 MAPKAPK3によりリン酸ィ匕を受ける TERTの部分ポリペプチドを基質として用いて実施することもできる。 MAPK APK3の基質である HSP27および eEF2キナーゼが MAPKAPK3によりリン酸化を受ける部位についての報告から、活性ィ匕型 MAPKAPK3によりリン酸ィ匕を受ける TE RTの部位は RXXSの 4つのアミノ酸（ここで、 Xは、ずれのアミノ酸でもあり得る）からなる部分ポリペプチドに相当する部位と予測される。力かる部位を含む TERTの部分ポリペプチドのうち、活性ィ匕型 MAPKAPK3によるリン酸ィ匕を受けることが実証された TERTの部分ポリペプチドを TERTの代わりに基質として用いることができる。 TE RTの部分ポリペプチドは自体公知の方法により合成できる。

[0075] 活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化の阻害は、活性化型 MAPKAPK 3による TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物を用いることにより実施できる。活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物として、例えば、活性化型 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物が挙げられる。活性化型 MAPKA PK3と TERTの結合を阻害する化合物は、活性化型 MAPKAPK3と TERTの相互作用を阻害できるため、活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化を阻害すると考える。また、 TERTが MAPKAPK3と結合し、その後、該 MAPKAPK3が ERK 、JNKおよび/または p38等によりリン酸ィ匕されることにより活性ィ匕型 MAPKAPK3 が生成され、該活性ィ匕型 MAPKAPK3により該 TERTカ^ン酸ィ匕されると考えられること力ゝら、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物は、 MAPKAPK3と TER Tの相互作用を阻害し、その結果、活性ィ匕型 MAPKAPK3の生成とそれに引き続いて起きる活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害すると考える。したがつて、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物力活性化型 MAPKAPK3 による TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物として好ましく例示できる。その他、活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化を阻害する化合物として、活性化型 MAP KAPK3のキナーゼ活性を阻害する化合物が挙げられる。

[0076] あるいは、細胞内、例えば癌細胞内の MAPKAPK3の発現を RNA干渉の手法により低減させること〖こより、活性ィ匕型 MAPKAPK3の生成を低減させ、活性化型 MA PKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害できる。その結果、テロメレース活性を低減または消失させることができる。したがって、カゝかる RNA干渉の手法によりテロメレース活性を低減または消失させる siRNA (small interfering RNA)もテロメレース活性を阻害する化合物として例示できる。癌細胞に siRNAを導入することにより、該細胞内の該細胞内のテロメレース活性は低減し、それにより細胞分裂に伴う染色体末端のテロメァ長の短縮ィ匕が起こり、細胞死を誘導することができる。

[0077] 「MAPKAPK3の不活性化型変異体」とは、 MAPKAPK3に、アミノ酸の欠失、置換、付カ卩または挿入等の変異を導入した MAPKAPK3であって、 MAPKAPK3および活性ィ匕型 MAPKAPK3と比較しキナーゼ活性が減弱し、または消失した MAP KAPK3を意味する。 MAPKAPK3の不活性ィ匕型変異体は、天然に存在するものであることができ、人工的に変異を導入したものであることもできる。力かる変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術 (非特許文献 23)を利用して実施できる。好ましくは、例えば、 MAPKAPK3の、 ERK、 JNKおよび Zまたは p38 等の MAPKAPK3をリン酸ィ匕および活性ィ匕するキナーゼによりリン酸ィ匕される部位、 MAPKAPK3の TERTとの結合部位および MAPKAPK3の ATPとの結合部位のうち少なくともいずれ力 1つの部位に変異を導入した MAPKAPK3であることができる。 MAPKAPK3をリン酸ィ匕および活性ィ匕するキナーゼによりリン酸ィ匕される MAP KAPK3の部位として、 MAPKAPK3のアミノ酸配列第 201番目および第 313番目、 MAPKAPK3と ATPとの結合部位として該アミノ酸配列第 73番目が報告されている（非特許文献 26)。したがって、 MAPKAPK3の不活性ィ匕型変異体として、 MAP KAPK3のアミノ酸配列の第 73番目、第 201番目および第 313番目のうちの少なくともいずれか 1つの部位のアミノ酸に変異を導入した MAPKAPK3の不活性ィ匕型変異体が挙げられる。

[0078] より好ましくは、 MAPKAPK3の不活性化型変異体であって、かつ TERTと結合する不活性ィ匕型変異体が適当である。力かる変異体として、配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。該変異体は、 MAPKAPK3のアミノ酸配列第 201番目および第 313番目のスレオニンがァラニンに置換された MAPK APK3の不活性ィ匕型変異体である。該変異体は、 TERTと結合し (実施例 2および図 2を参照）、またテロメレース活性を有する細胞で発現させたときに、細胞内テロメレース活性を低減させた (実施例 4および図 4を参照)。また、該変異体は、癌細胞で発現させたときに、細胞内テロメレース活性を低減させ、その結果、テロメァ長の短縮を引き起こした (実施例 6、図 8— A、図 8— Bおよび図 9を参照)。これらから、細胞内において、該変異体は、テロメレースの活性ィ匕および Zまたはテロメレースを阻害することにより、テロメレースの活性を阻害すると考える。

[0079] さらに好ましくは、 TERTと結合する MAPKAPK3の不活性化型変異体であって、 MAPKAPK3と TERTの結合を拮抗的に阻害する MAPKAPK3の不活性化型変異体が適当である。カゝかる不活性ィ匕型変異体は、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害することによりテロメレースの活性ィ匕を阻害し、結果としてテロメレース活性を阻害できる。配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質は、 TERTと結合し、テロメレース活性を有する細胞や癌細胞で発現させたときに、細胞内テロメレース活性を低減させた。すなわち、該蛋白質は、 MAPKAPK3に対してドミナントネガティブ効果を有すると考える。したがって、該蛋白質は、 MAPKAPK3と TERT の結合を拮抗的に阻害する MAPKAPK3の不活性ィ匕型変異体であると発明者らは考えている。

[0080] MAPKAPK3の不活性化型変異体と TERTの結合は、前記 MAPKAPK3と TE RTの結合の検出方法と同様の方法により検出され得る。 [0081] 本発明の別の一態様は、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物の同定方法に関する。本化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。例えば、上述のような MAPKAPK3と TERTの結合を検出する方法を用いて実施できる。

[0082] MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物の同定方法は、具体的には、調ベようとする化合物（被検化合物）と MAPKAPK3および Zまたは TERTとの相互作用を可能にする条件を選択し、当該条件下で、被検化合物と MAPKAPK3および /または TERTとを接触させ、 MAPKAPK3と TERTの結合を検出し得るシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより実施できる。例えば MA PKAPK3と TERTの結合により生じるシグナルまたは該結合のマーカー力被検化合物を MAPKAPK3または TERTと接触させたときに消失あるいは低減する等の変化を示した場合、当該被検化合物は MAPKAPK3と TERTの結合を阻害すると判定できる。力かる同定方法において、被検化合物を MAPKAPK3および Zまたは T ERTと予め接触させ、その後に MAPKAPK3と TERTの結合反応を行なうことができ、または被検化合物をこれらの結合反応に共存させることもできる。被検化合物と MAPKAPK3および Zまたは TERTとの相互作用を可能にする条件は、インビトロのものであってよぐインビボのものであってもよい。例えば、 MAPKAPK3と TERT とを共発現させた細胞を用いることができる。かかる細胞は、 MAPKAPK3をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターと TERTをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的方法でこれらを細胞にトランスフエクシヨンすることにより取得できる。あるいは力かる細胞は、テロメレース活性が認められた細胞に MAPKAPK3をコードするポリヌクレオチドをトランスフエクシヨンすることによっても取得できる。さら〖こ、実施例 2に示したように、活性ィ匕型 MAPKAPK3が T ERTと結合したことから、 MAPKAPK3の代わりに、活性化型 MAPKAPK3を用いて同様の同定方法を構築することができる。この場合、 ERK、JNKおよび/または p 38をコードするポリヌクレオチドを共発現させて、細胞内で MAPKAPK3をリン酸ィ匕して活性ィ匕させることもできる。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとして、ルシフェラーゼ、および放射性同位体等、マーカーとして、レポーター遺伝子、例えばクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子等、または検出用のェピトープタグ、例えば 6 X His— tag等、公知のものが利用できる。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知である。 MAPKAPK3と TERTの結合は、簡便には、これら蛋白質の結合の存在若しくは不存在の検出および Zまたはその量の変化の測定により判定できる。これら蛋白質の結合の検出は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッテイング法等を用いて実施できる

[0083] MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物の同定方法は、具体的には例えば、 MAPKAPK3または TERTの一方を固相化し、他方をシグナルで標識ィ匕して用 V、て結合反応を行、、標識シグナルを定量的に測定すると!、つた当業者に知られた一般的なインビトロ (in vitro)における結合試験系を用いて実施できる。このような試験系に被検化合物を共存させたときの標識シグナルが、被検化合物の非共存下における標識シグナルと比較して低減するまたは消失する場合、該被検化合物は M APKAPK3と TERTの結合を阻害すると判定できる。

[0084] MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物の同定方法はまた、 GST融合 M APKAPK3または GST融合活性化型 MAPKAPK3と TERTとをインビトロで反応させて、 GSTを用いたプルダウン法により両蛋白質の結合を検出する試験系（実施例 2を参照）を用いて実施できる。このような試験系における MAPKAPK3と TERT との結合の検出は、 TERTを予め標識物質で標識しておき、その標識物質を検出することにより実施できる。標識物質は、一般に蛋白質の検出に使用されている標識物質であればいずれも使用できる。具体的には、 ³⁵s等の放射性同位体等が好ましく例示できる。このような試験系に被検化合物を共存させたときに検出される標識物質の量が、被検化合物の非共存下において検出される標識物質の量と比較して低減するまたは消失する場合、該被検化合物は MAPKAPK3と TERTの結合を阻害すると判定できる。 [0085] あるいは、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物の同定方法は、動物細胞に TERTをコードするポリヌクレオチドおよび MAPKAPK3をコードするポリヌクレォチドをトランスフエクシヨンして得られた細胞を用いて細胞内における結合反応を検出する試験系（実施例 3を参照）を用いて実施できる。このような試験系における MA PKAPK3と TERTとの結合の検出は、免疫沈降法やウェスタンブロッテイング等の公知方法で実施できる。このような試験系に被検化合物を共存させたとき、被検化合物の非共存下における結果と比較して、結合する蛋白質量が減少するあるいは結合が検出されなくなる場合、該被検化合物は MAPKAPK3と TERTの結合を阻害すると判定できる。

[0086] また、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物の同定方法の実施に、公知のツーハイブリッド（two—hybrid)法を利用することもできる。例えば、 MAPKAPK 3と DNA結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、 TERTと転写活性ィ匕蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続した lacZ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母、真核細胞等に導入し、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量を被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより達成できる。被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して減少した場合、該被検化合物は MAPKAPK3と TERT との結合を阻害する作用を有すると判定できる。

[0087] ビアコアシステム（BIACORE system)等の表面プラズモン共鳴センサー、 SPA 法、めレヽ【ま光共エネノレ³ r一移 (Fluorescence resonance energy tran sfer、 FRET)を応用した方法を用いて、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物の同定方法を実施することもできる。

[0088] 本発明の別の一態様は、活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化を阻害する化合物の同定方法に関する。本化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリ一-ングシステムを利用して実施できる。例えば、上述のような活性ィ匕型 MAPKAP K3による TERTのリン酸ィ匕を検出する方法を用いて実施できる。

[0089] 活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化を阻害する化合物の同定方法は、具体的には、被検化合物と活性ィ匕型 MAPKAPK3および Zまたは TERTとの相互作用を可能にする条件を選択し、当該条件下で、被検化合物と活性化型 MAPKA PK3および Zまたは TERTとを接触させ、活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を検出し得るシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより実施できる。例えば活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕により生じるシグナルまたは該結合のマーカー力被検化合物を活性ィ匕型 MAPKAPK3および Zまたは TERTと接触させたときに消失あるいは低減する等の変化を示した場合、当該被検化合物は活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害すると判定できる。被検化合物と活性ィ匕型 MAPKAPK3および Zまたは TERTとの相互作用を可能にする条件は、インビトロのものであってよぐインビボのものであってもよい。例えば、活性ィ匕型 MAPKAPK3と TERTとを共発現させた細胞を用いることができる。

[0090] 活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化を阻害する化合物の同定方法は、具体的には例えば、テロメレース活性が確認されて、る細胞力調製した核抽出液を用い、脱リン酸ィ匕処理を行なった後、活性ィ匕型 MAPKAPK3を添加してテロメレース活性の上昇を測定する試験系（実施例 5を参照)を用いて実施できる。かかる試験系に被検化合物を共存させたときにテロメレース活性の上昇が阻害された場合、該被検化合物は TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物であると判定できる。または、か力る試験系において、テロメレース活性の上昇を測定する代わりに、 TERTのリン酸化を検出することにより、 TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物の同定を実施できる。

[0091] 活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化を阻害する化合物の同定方法はまた、上述した活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化、およびリン酸化された TERTの検出を実施する方法を用いた試験系を用いて実施できる。かかる試験系に被検化合物を共存させ、該被検化合物による TERTのリン酸ィ匕が被検化合物の非共存下におけるリン酸化と比較して低減されるまたは消失する場合に、該被検化合物は活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化を阻害すると判定できる。

[0092] MAPKAPK3、活性化型 MAPKAPK3、不活性化型 MAPKAPK3および TER T等の蛋白質はいずれも、遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であることができ、あるいはさらに精製されたものであることができる。これらはまた、それぞれの蛋白質をコードする遺伝子のうち少なくとも 1を含む細胞において発現しているものであることができる。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフエクシヨンして得られた形質転換体であることができる。これらはまた、 MAPKAPK3と TERTの結合、および活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕等の機能に影響がなければ、 N末端側や C末端側に別の蛋白質やポリペプチド、例えば GST、 β ガラクトシダーゼ、 IgG等の免疫グロブリン Fc断片、 His -tag, Myc— tag、 HA— tag、 FLA G— tag、または Xpress— tag等の tagペプチド類を、直接的にまたはリンカーぺプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加したものであることができる。

[0093] 被検化合物は、例えばィ匕学ライブラリーや天然物由来の化合物、または活性ィ匕型 MAPKAPK3または TERTの一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。あるいは、 MAPKAPK3と TERTの結合部位のァミノ酸配列力なるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。

[0094] 本発明の別の一態様は、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害剤およびテロメレース活性阻害剤に関する。本テロメレース活性ィ匕阻害剤およびテロメレース活性阻害剤として、好ましくは、 MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する化合物、例えば上記化合物を少なくとも 1つ含んでなるテロメレース活性ィ匕阻害剤およびテロメレース活性阻害剤が挙げられる。

[0095] 本発明の別の一態様は、活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害剤およびテロメレース活性阻害剤に関する。本テロメレース活性ィ匕阻害剤およびテロメレース活性阻害剤として、好ましくは、活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害する化合物、例えば上記化合物を少なくとも 1つ含んでなるテロメレース活性ィ匕阻害剤およびテロメレース活性阻害剤が挙げられる。より好ましくは、上記 MAPKAPK3の不活性ィ匕型変異体を含んでなるテロメレース活性阻害剤、または該不活性ィ匕型変異体を含んでなるテロメレース活性ィ匕阻害剤が挙げられる。

[0096] テロメレース活性ィ匕阻害作用およびテロメレース活性阻害作用の確認は、例えばトラップ法 (TRAP法：非特許文献 27)、ダイレクトテロメレースアツセィ（Direct telom erase assay:非特許文献 28)、ストレッチ PCRアツセィ（Stretch PCR assay:非特許文献 29)、ハイブリダィゼーシヨンプロテクションアツセィ（Hybridization prot ection assay：非特許文献 30)、 TREアツセィ（非特許文献 31)、ラビッドダイレクトテロメレースアツセィ（rapid direct telomerase assay:非特許文献 32)等の方法により実施できる。あるいは、これらの確認をパディソンらの方法 (非特許文献 33)や本明細書の実施例に具体的に記載した方法等に従って実施できる。

[0097] 本発明の別の一態様は、上記化合物および上記阻害剤を含む医薬組成物に関する。上記化合物および上記阻害剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製できる。医薬組成物の調製において、これら化合物や阻害剤は、単独で使用することができ、また、複数を組み合わせて使用することができる。本発明に係る医薬組成物は、テロメレースの作用やその活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤、並びに当該疾患の防止方法および Zまたは治療方法に利用できる。テロメレース活性の亢進に起因する疾患として、例えば癌疾患が挙げられる。

[0098] テロメレースは腫瘍の種類に関わらず大多数の腫瘍にぉ、てその活性が確認されていることから、本発明に係る医薬組成物は多様な癌細胞の増殖阻害に有効であると考える。したがって、本医薬組成物を癌疾患に使用する場合、対象となる腫瘍の種類は特に限定されず、固形腫瘍または非固形腫瘍のいずれにも適用できる。固形腫瘍または非固形腫瘍の種類も特に限定されず、テロメレース活性を有するあらゆる種類の腫瘍において適用できる。癌疾患として、胃癌、食道癌、大腸癌、小腸癌、十二指腸癌、肺癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、腎臓癌、膀胱癌、口腔癌、骨癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、脳腫瘍、神経芽腫等の固形腫瘍、あるいは白血病や悪性リンパ腫等の非固形腫瘍等を例示できるが、本医薬組成物の適用対象はこれら疾患に限定されない。より好ましくは、さらに MAPKAPK3の活性ィ匕やその遺伝子発現の亢進が認められる癌疾患、あるいは MAPKAPK3の活性ィ匕に関与する蛋白質の活性ィ匕が認められる癌疾患に適用できる。 MAPKAPK3を活性ィ匕することが知られて V、る p38が乳癌組織および非小細胞肺癌組織にぉ、て活性化されて!/、ることが報告されている。さらに、 MAPKAPK3を活性化することが知られている ERK力乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌等の癌組織において活性化されていることが報告されている。したがつて、好ましくは、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌および非小細胞肺癌への適用が望ましぐさらに好ましくは乳癌への適用が望ま、。

[0099] 本発明に係る疾患の防止剤および Zまたは治療剤は、上記化合物および上記阻害剤のうち少なくともいずれか 1つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、 1種または 2種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。

[0100] 本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常約 0. 00001〜70重量％、好ましくは 0. 0001〜5重量％程度の範囲とするのが適当である。

[0101] 医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。

[0102] 例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビュルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、力ゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヮセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マン-トール、ソルビトール、ラタトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜 1種類または 2種類以上を組合せて使用される。

[0103] 所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、 pH調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製することちでさる。 [0104] 安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常の L アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記 L— アミノ酸は、特に限定はなぐ例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなぐ例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マン-トール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなぐメチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシェチルセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、力ルポキシメチルセルロースナトリウム等の、ずれでもよ、。界面活性剤も特に限定はなぐイオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノァシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。

[0105] 緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クェン酸、 ε アミノカプロン酸、グルタミン酸および Ζまたはそれらに対応する塩 (例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)等を例示できる。

[0106] 等張化剤は、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。

[0107] キレート剤は、例えばェデト酸ナトリウム、クェン酸等を例示できる。

[0108] 本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる。その他、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。

[0109] 医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質 (体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重 lkgあたり約 0. 01 μ g乃至 lOOmg程度、好ましくは約 0. l ^ g 〜lmg程度の範囲であることが好ましい。し力しながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量を変更できる。上記投与量は 1日 1〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよい。

[0110] 本発明の医薬組成物を投与するときは、該医薬組成物を単独で使用してもよぐあるいは目的の疾患の防止および zまたは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、他のテロメレース阻害剤または抗腫瘍用医薬の有効成分等を配合してもよい。

[0111] 投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に直接投与することが好ましい。

[0112] 投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的な例として、錠剤

、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リボソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさら〖こ投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。

[0113] 本発明の一態様は、 MAPKAPK3、 MAPKAPK3をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか 1つと、 TERT、 TERTをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、および該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれ力 1つとを含んでなるキットに関する。当該キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。好ましくは、 MAPKAPK3として活性化型 MAPKAPK3 を使用できる。

[0114] ポリヌクレオチドは、例えばヒト cDNAライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製できる。ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体は、当該ポリヌクレオチドを適当な発現ベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより、また得られたベクターを周知の方法で適当な細胞にトランスフエクシヨンすることにより取得できる。

[0115] 上記キットは、 MAPKAPK3または活性化型 MAPKAPK3と TERTとの結合、または活性化型 MAPKAPK3による TERTのリン酸化を検出するためのシグナルおよび Zまたはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および Zまたは防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたつては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。

[0116] 以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。

実施例 1

[0117] (TERTと相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）

テロメレースの触媒サブユニットである TERTと相互作用する機能を有する蛋白質の予測を、特許文献 1に記載のインシリコでの予測方法に従って次のように予測した： i) TERTのアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、 ii)各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、 iii)得られた蛋白質と TERTとの間でローカルァライメントを行、、 iv)ローカルァライメントのスコアの高、ものを TERTと相互作用すると予測する

[0118] 解析の結果 (図 1)、 TERTと相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、 MAPKAPK3を見出した。

実施例 2

[0119] (TERTと MAPKAPK3のインビトロにおける結合解析）

TERTと MAPKAPK3が結合するか否かを、 GST— pull down法によるインビト口結合試験により検討した。 MAPKAPK3として、 MAPKAPK3、活性化型 MAPK APK3および不活性ィ匕型 MAPKAPK3をそれぞれ使用した。

[0120] <材料およびその調製 > TERT発現プラスミドの構築

ヒト TERT cDNAはヒト胸腺 cDNA(Clontech社製）から PCRにより獲得した。ヒト TERT cDNAを動物細胞用発現ベクター pCIneo (Promega社製）へ糸且込むことにより、動物細胞用 TERT発現プラスミドを構築した。

[0121] MAPKAPK3発現プラスミドの構築

ヒト MAPKAPK3 cDNAはヒト骨格筋 cDNA(Clontech社製）力ら PCRにより獲得した。ヒト MAPKAPK3 cDNAを、大腸菌での GST融合蛋白質発現用ベクターである pGEX— 4T(Amersham Bioscience社製）へ組込むことにより、大腸菌用 N末端 GST融合 MAPKAPK3発現プラスミドを構築した。

[0122] 活性ィ匕型および不活性ィ匕型 MAPKAPK3発現プラスミドの構築

N末端に GSTを融合させた活性ィ匕型 MAPKAPK3発現プラスミドを構築するために、上記 MAPKAPK3 cDNAに、 MAPKAPK3のアミノ酸配列第 201番目と第 3 13番目のスレオニンが共にグルタミン酸に置換されるように変異を導入した。変異が導入された MAPKAPK3 cDN Aを大腸菌での GST融合蛋白質発現用ベクターである pGEX— 4Tへ組込むことにより、 N末端に GSTを融合させた活性化型 MAPKA PK3発現プラスミドを構築した。また、 N末端に GSTを融合させた不活性ィ匕型 MAP KAPK3発現プラスミドを構築するために、上記 MAPKAPK3 cDNAに、 MAPK APK3のアミノ酸配列第 201番目と第 313番目のスレオニンが共にァラニンに置換されるように変異を導入した。変異が導入された MAPKAPK3 cDNAを大腸菌での GST融合蛋白質発現用ベクターである pGEX—4Tへ組込むことにより、 N末端に G STを融合させた不活性ィ匕型 MAPKAPK3発現プラスミドを構築した。

[0123] 各プラスミドを用いた蛋白質の調製

TERTは、 TNT quick coupled transcription/ translation systems (Pro mega社製)を使用してインビト口にて³⁵ S—メチォニン標識した蛋白質として合成した

GST融合 MAPKAPK3 (GST— MAPKAPK3)、 GST融合活性化型 MAPKA PK3 (活性化型 GST— MAPKAPK3)および GST融合不活性化型 MAPKAPK3 (不活性ィ匕型 GST—MAPKAPK3)は、上記構築した各プラスミドを用いて大腸菌にトランスフエクシヨンして発現誘導後、ダルタチオンセファロースで精製して使用した

[0124] 各 GST— MAPKAPK3の活性確認

それぞれ 5 μ gの GST—MAPKAPK3、活性化型 GST—MAPKAPK3、不活性化型 GST— MAPKAPK3または GSTと、基質として 2 μ gの HSP27 (Upstate社製 )とを 5 μ Ciの [ γ— ³²P] ATP (3, OOOCi/mmol, PerkinElmer社製）を含む 20 μ 1のリン酸化バッファー（25mM Tris -HCU pH7. 5/5mM j8—グリセ口ホスフエート（j8— glycerophosphate) Z2mM ジチオスレィトール（DTT) ZO. ImM N a VO ZlOmM MgCl /ΙΟ μ Μ ATP)中にて、 30°Cで 15分間インキュベーシ

3 4 2

ヨンすることによりリン酸ィ匕反応を行った。反応後、 20 μ 1の 2 X SDS サンプルバッファー（4% SDS/125mM Tris HC1, pH6. 8/20% グリセロール Ζθ. 01 % ΒΡΒ/10% β—メルカプトエタノール）を反応液にカ卩え、 100°Cで 5分間処理した。次ヽで、 5— 20⁰/₀ SDS— PAGE【こより蛋白質を分離し、 BAS2000 (Fuji film 社製)を用いたオートラジオグラフィ一によりリン酸化された HSP27を検出した。

[0125] <方法 >

GST-pull down法による結合試験

TERT合成反応液の 20 μ 1と GST—MAPKAPK3、活性化型 GST—MAPKAP K3または不活性化型 GST— MAPKAPK3の 5 μ gとを、 500 μ 1のバインディングバッファー（20mM Tris -HCl, pH8. 0/140mM NaCl/1 mM エチレングリコーノレビス四酢酸（EGTA) ZlmM DTT/1 % TritonX- 100/10% グリセロール）中にて、氷上、 1時間静置した。その後、 20 1のダルタチオンセファロース

4B (Glutathione sepharose 4B)を添カ卩し、 4°Cにてー晚、転倒混和した後、遠心処理によりセファロースビーズを回収した。セファロースビーズを 500 μ 1のバインデイングバッファーで 4回洗浄した後、 20 μ 1の 2 X SDS サンプルバッファー（125mM

Tris -HCl, pH6. 8/4% SDS/20% グリセロール Ζθ. 01 % ブロモフエノールブルー（BPB) )をカ卩え、 3分間煮沸後、上清を 5— 20% SDS— PAGEにより分離した。その後、 FLA3000 (Fuji film社製）により TERTを検出した。陰性コントロールとして、各 MAPKAPK3の代わりに GSTを用い、上記同様の処理を行なった。また、 SDS— PAGEによる TERT検出のコントロールとして、 ³⁵S—メチォニン標識した TERTを用いた。

[0126] <結果>

GST—MAPKAPK3、活性化型 GST—MAPKAPK3および不活性化型 GST — MAPKAPK3はいずれも、インビトロで TERTと結合した（図 2)。一方、 GSTと TE RTとの結合は認められなかった。この結果から、各 GST—MAPKAPK3と TERTとの結合は特異的であると言える（図 2)。

[0127] GST— MAPKAPK3、活性化型 GST— MAPKAPK3および不活性化型 GST

MAPKAPK3は!、ずれも、 TERTと直接結合することが明らかになつた。実施例 3

[0128] (TERTと MAPKAPK3の細胞内における結合解析）

TERTと MAPKAPK3が細胞内において結合するか否かを、細胞内共発現 Z免疫共沈降法による結合試験により検討した。

[0129] <材料 >

MAPKAPK3発現プラスミドの構築

ヒト MAPKAPK3 cDNAは RT— PCRにより獲得し、動物細胞用発現ベクター pc DNA3. 1 (+ ) (Invitrogen社製）へ組込んだ。その際、 5 則に HA— tagコード配列を挿入し、動物細胞用 N末端 HA— tag付加型 MAPKAPK3発現プラスミドを構築した。

[0130] TERT発現プラスミドは、実施例 2で作製したプラスミドを用いた。

[0131] <方法 >

トランスフエクシヨンおよび免疫共沈降法による結合試験

細胞数 4 X 10⁵の HEK293T細胞を 5%CO存在下にて 37°Cでー晚培養した後（

2

直径 60mmシャーレ）、 2 μ gの HA— tag付カ卩型 ΜΑΡΚΑΡΚ3発現プラスミドまたは陰性コントロールとして pcDNA3. 1 (+ )を 2 gの TERT発現プラスミドと共に、 Fu GENE6 Transfection Reagent (Roche社製）を用いてトランスフエクシヨンした。 2日間培養後、細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS (—））で洗浄して回収後、 500 1の細胞溶解バッファー（20mM Tris-HCl, pH7. 4/150mM NaC 1/lmM エチレンジァミン四酢酸（EDTA) ZlmM EGTA/1% Triton X—l 00/2. 5mM ピロホスフェートナトリウム（sodium pyrophosphate) /ImM β ーグリセ口ホスフェート/ ImM Na VO /プロテアーゼ阻害剤カクテル（protease

3 4

inhibitor cocktail) )に懸濁し、氷上で 10分間放置した。その後、 4°C、 14, 000 rpmで 10分間の遠心処理により上清を回収し、細胞溶解液として用いた。次に、 50 0 μ 1の細胞溶解液に 10 μ 1のァガロース結合正常ゥサギ IgG (Agarose -conjugat ed normal rabbit IgG、 Sigma社製）をカ卩え、 4°Cにて 30分間転倒混和した後、遠心処理により上清を回収した。回収した上清に 10 1のァガロース結合抗 HA抗体 (Y— 11、 SantaCruz社製)をカ卩え、 4°Cにて一晩転倒混和した後、遠心処理によりァガロースビーズを回収した。ァガロースビーズを 500 μ 1の細胞溶解バッファーで 4 回洗浄した後、 25 μ 1の 2 X SDS サンプルバッファーをカ卩え、 5分間加熱後、上清を 5- 20% SDS— PAGEにより分離した。その後、抗 TERT抗体（L— 20、 SantaCr uz社製)を用いたウェスタンブロッテイングにより結合蛋白質を検出した。なお、検出 ίま ECL western clotting detection t、Amersham biosciences干土製)を使用して行なった。

[0132] <結果>

TERTと HA— tag付カ卩型 MAPKAPK3 (HA— MAPKAPK3)を共発現させた細胞の細胞溶解液にっ、て、抗 HA抗体で免疫沈降した後に抗 TERT抗体でウェスタンブロッテイングを行なった結果、バンドが検出された（図 3におけるレーン 2の下段パネル)。一方、 TERTのみを発現させた細胞の細胞溶解液について、同様に免疫沈降およびウェスタンブロッテイングを行った結果、バンドは検出されなかった（図 3 におけるレーン 1の下段パネル）。細胞における HA— MAPKAPK3および TERT の発現は、それぞれ抗 HA抗体および抗 TERT抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより確認した（図 3におけるレーン 1および 2の上段パネルおよび中段パネル)。

[0133] この結果から、 TERTが HA— MAPKAPK3と共沈降することが明らかになった。

すなわち、 TERTと MAPKAPK3が細胞内で結合することが明らかになった。

実施例 4

[0134] (MAPKAPK3—過性発現による細胞内テロメレース活性の上昇）テロメレース陽性細胞である HEK293T細胞への MAPKAPK3の一過性発現により細胞内テロメレース活性が変動する力否かについて検討した。

[0135] <材料 >

MAPKAPK3発現プラスミドは、実施例 3で構築した動物細胞用 N末端 HA— tag 付カ卩型 MAPKAPK3発現プラスミドを用いた。この HA— tag付カ卩型 MAPKAPK3 発現プラスミドを基に、 MAPKAPK3のアミノ酸配列第 201番目と第 313番目のスレォニンが共にグルタミン酸に置換されるように変異を導入することにより、 N末端に H A— tagが付加された活性ィ匕型 MAPKAPK3発現プラスミドを構築した。また、 N末端に HA— tagが付加された不活性ィ匕型 MAPKAPK3発現プラスミドを、上記 HA— tag付加型 MAPKAPK3発現プラスミドを基に、 MAPKAPK3のアミノ酸配列第 20 1番目と第 313番目のスレオニンが共にァラニンに置換されるように変異を導入することにより構築した。また、陰性コントロールとして _PcDNA3. 1 (+ )を使用した。

[0136] <方法 >

トランスフエクシヨンおよび TRAP法による細胞内テロメレース活性の測定

細胞数 2 X 10⁴の HEK293T細胞を 5%CO存在下にて 37°Cでー晚培養した後（

2

24wellプレート）、各 0. 2 μ gの発現プラスミドをそれぞれ FuGENE6 Transfectio n Reagent (Roche社製）を用いてトランスフエクシヨンした。 48時間培養後、細胞を回収し、 TRAPEZE XL Kit (Intergen社製）を用いた TRAP法により細胞内テロメレース活性を測定した。

[0137] 具体的には、細胞を 100 1の I X CHAPS 細胞溶解バッファー（10mM Tris — HCl、pH7. 5/lmM MgCl /ImM EGTA/0. ImM ベンズアミジン（Be

2

nzamidine) /5mM j8—メルカプトエタノール Z〇. 5% CHAPS/10% グリセロール）に懸濁し、 30分間氷上で静置した後、遠心処理して上清を回収し、細胞溶解液として用いた。細胞溶解液中の蛋白質濃度を Coomassie Plus— 200 Protei n Assay Reagent (Pierce社製）で測定後、蛋白質量 5ngの細胞溶解液を用いて TRAP反応を行った。

[0138] TRAP反応は、まず 30°Cで 30分間のテロメレース反応を行った後、生成したテロメァリピート配列の増幅を PCR反応により行った。 PCR反応は、 94°Cで 30秒間、 59°C で 30秒間、 72°Cで 1分間を 36サイクル行なった後、 55°Cで 25分間反応させることにより実施した。その後、 PCR反応液の蛍光強度を測定することによりテロメレース活性の強度を測定した。蛍光強度の測定は、 PCRに用いたプライマーに標識されたフルォレセイン (テロメレース反応産物の指標）およびスルホローダミン（内部標準の指標）の各蛍光強度を、蛍光分光光度計 F— 2000 (Hitachi)を使用し、測定波長（ λ Ex Ζ λ Em) 485nmZ535nmおよび 585nmZ620nmで計測することにより行なった。その際、反応液 23 μ 1を 600 1の測定用希釈液（10mM Tris— HC1、 pH7. 4/ 0. 15M NaCl/2mM MgCl )で希釈して測定した。テロメレース活性は、内部標

2

準との比（ Δ FL/ A RL)により表した。

免疫複合体キナーゼ試験による MAPKAPK3活性の確認

細胞数 2 X 10⁵の HEK293T細胞を 5%CO存在下にて 37°Cでー晚培養した後（

2

6cmシャーレ）、各 2 μ gの発現プラスミドをそれぞれ FuGENE6 Transfection R eagent (Roche社製）を用いてトランスフエクシヨンした。 48時間培養後、細胞を回収し、 500 μ 1の細胞溶解バッファー（実施例 3で用いた細胞溶解バッファーと同組成）に懸濁し、氷上で 20分間放置した。その後、 4°Cで、 14, 000rpm、 10分間の遠心処理により上清を回収し、細胞溶解液として用いた。次に、 500 1の細胞溶解液に 1 0 μ 1のァガロース結合正常マウス IgG (Sigma社製）を加え、 4°Cにて 30分間転倒混和した後、遠心処理により上清を回収した。回収した上清に 10 1の Anti-HA Af finity Matrix (Roche社製）をカ卩え、 4°Cにて 2時間転倒混和した後、遠心処理によりァガロースビーズを回収し、さらにァガロースビーズを 500 μ 1の細胞溶解バッファ一で 2回、 500 1のキナーゼバッファー（25mM Tris— HC1、 pH7. 5/5mM β —グリセ口ホスフェート /2mM DTT/0. ImM Na VO /10mM MgCl )で 2

3 4 2 回洗浄した。次に、ビーズに 2 μ gの HSP27 (Upstate社製）と 10 M ATPおよび 5 μ の [ γ— ³²P] ATP (3, OOOCi/mmol, PerkinElmer社製）を含む 20 μ 1のキナーゼバッファーを加え、 30°Cにて 30分間リン酸ィ匕反応を行った。反応後、 20 1の 2 X SDS サンプルバッファーをカ卩え、 5分間煮沸後、上清を SDS— PAGEにより分離し、 FLA3000 (Fuji film社製)を用いたオートラジオグラフィ一によりリン酸ィ匕された HSP27を検出した。 [0140] <結果>

テロメレース活性を有する HEK293T細胞に活性化型 MAPKAPK3を一過性発現させたときに、陰性コントロールであるベクターをトランスフエクシヨンしたときと比較して、細胞内テロメレース活性の上昇が認められた (約 1. 4倍、図 4)。活性化型 ΜΑ ΡΚΑΡΚ3の一過性発現によるテロメレース活性の上昇は、スチューデント t—テストで有意差（ρ< 0. 01)が認められた。それに対し、 HEK293T細胞に MAPKAPK3 を一過性発現させたときには細胞内テロメレース活性の変化は殆ど認められなかつた。

[0141] 一方、 HEK293T細胞に不活性化型 MAPKAPK3を一過性発現させたときは、細胞内テロメレース活性の低減が認められた (約 0. 7倍)。

[0142] 一過性発現させた各 MAPKAPK3のキナーゼ活性を HSP27を基質として用いたリン酸ィ匕試験で測定した結果、活性ィ匕型 MAPKAPK3におヽてのみキナーゼ活性が認められた。

[0143] 上記結果から、 HEK293T細胞のテロメレース活性が活性化型 MAPKAPK3の一過性発現により促進されること、および MAPKAPK3によるテロメレース活性の促進効果は MAPKAPK3のキナーゼ活性に依存することが明らかになった。

[0144] また、 HEK293T細胞のテロメレース活性が不活性化型 MAPKAPK3の一過性発現により低減されることが明らかになった。不活性ィ匕型 MAPKAPK3は TERTと結合する（実施例 2を参照）が、そのキナーゼ活性は低減または消失している。このこと力ゝら、不活性化型 MAPKAPK3は、内因性の MAPKAPK3の TERTへの結合を拮抗的に阻害することによりテロメレースの活性ィ匕を阻害し、その結果、テロメレース活性を低減させたと考える。

実施例 5

[0145] (MAPKAPK3によるテロメレース活性の上昇 ZHEK293細胞核抽出液を用いたィンビトロ系での検討）

細胞抽出液を脱リン酸化処理することにより抽出液中のテロメレース活性が低減することが報告されている。このことから、テロメレースの活性ィ匕におけるリン酸ィ匕の必要性が示唆されている。そこで、 HEK293細胞核抽出液を用いて核抽出液中のテロメレース活性に対する脱リン酸ィ匕処理の影響について検討した。さらに、 HEK293細胞核抽出液中のテロメレース活性力精製した MAPKAPK3との反応により変化する力否かについて検討した。

[0146] く材料 >

MAPKAPK3の調製と活性確認

GST—MAPKAPK3、活性化型 GST—MAPKAPK3および不活性化型 GST MAPKAPK3は、実施例 2に記載の方法と同様の方法で調製した。また、各 MA PKAPK3の活性は、実施例 2に記載の方法で確認した。

[0147] HEK293細胞核抽出液の調製

HEK293細胞を 400 /z Lのバッファー A (10mM Hepes— KOHゝ pH8. O/lO mM KCl/O. ImM EDTA/O. ImM EGTA/lmM DTTZプロテアーゼ阻害剤カクテル）に懸濁し、氷上で 15分間放置後、 25 /z Lの 10% ノニデット P— 4 0をカ卩えてさらに氷上で 10分間放置した。その後、 4°Cで 14, OOOrpm, 5分間の遠心処理により沈降した核を回収した。沈殿した核に 100 /z Lのバッファー C (20mM Hepes -KOH, pH8. 0/400mM NaCl/lmM EDTA/ ImM EGTA/l mM DTTZプロテアーゼ阻害剤カクテル)をカ卩えてよく攪拌し、氷上で 15分放置後、 4°Cで 14, OOOrpm, 5分間の遠心処理により上清を回収し、核抽出液として用いた。その後、回収した核抽出液にバッファー D (20mM Hepes -KOH, pH8. 0 /0. 2mM EDTA)をカ卩え、核抽出液中の NaClの最終濃度を 150mMにした。核抽出液は使用時まで 80°Cで保存した。

[0148] <方法 >

HEK293細胞核抽出液の脱リン酸ィ匕処理および核抽出液内テロメレース活性の測定

蛋白質量 2000ngの HEK293細胞核抽出液に 500、 100、 20、 4、 0. 8、 0、 muni tのホスファターゼ、アルカリ一ァガロース（CIP— Agarose、 Sigma社製）をカ卩え、 20 1の反応バッファー（50mM Tris-HCl, pH8. 0/lmM MgCl )中で 30°Cで

2

30分間脱リン酸化反応を行った。その後、遠心処理上清 1 μ 1を上記反応バッファーで 20 1〖こ希釈し、そのうち 1 1を用いて TRAP反応を行い、テロメレース活性を測定した。

[0149] HEK293細胞核抽出液中のテロメレース活性に対する MAPKAPK3の影響についての検討

上記と同様の方法で HEK293細胞核抽出液を脱リン酸化処理後、遠心処理上清 1 /z lに 100、 50、 25、 12. 5、 6. 25pmolの活' 14ィ匕型 GST— MAPKAPK3または GSTをカ卩え、 20 1の反応系（25mM Tris— HC1、 pH7. 5/5mM β—グリセ口ホスフェート Z2mM DTT/O. ImM Na VO /10mM MgCl /0. ImM A

3 4 2

TP)にて 30°Cで 30分間リン酸ィ匕反応を行った。その後、反応液 1 μ 1を用いて TRA P反応を行い、テロメレース活性を測定した。活性ィ匕型 GST— MAPKAPK3の代わりに MAPKAPK3または不活性化型 GST— MAPKAPK3をリン酸化反応に用いるときは、それぞれ lOOpmolを使用した。

[0150] <結果>

脱リン酸化処理により、脱リン酸ィ匕酵素であるホスファターゼ、アルカリーァガロースの用量依存的に、テロメレース活性の低減が認められた（図 5)。この結果から、 HEK 293細胞核抽出液中のテロメレースカ^ン酸ィ匕依存的に活性ィ匕されていることが判明した。

[0151] 脱リン酸ィ匕処理によりテロメレース活性が低減した核抽出液に活性ィ匕型 MAPKAP K3を添加してリン酸ィ匕反応を行なった。その結果、活性ィ匕型 MAPKAPK3用量依存的にテロメレース活性が上昇した (最大約 1. 5倍、図 6)。それに対し、 GSTを添カロして同様にリン酸ィ匕反応を行なったときは、テロメレース活性の上昇は認められなかつた。また、 MAPKAPK3または不活性化型 MAPKAPK3を添カ卩して同様にリン酸化反応を行なったときには、テロメレース活性の変化は認められな力つた（図 7)。

[0152] 精製した各 MAPKAPK3のキナーゼ活性を HSP27を基質として用いたリン酸ィ匕試験で測定した結果、活性ィ匕型 MAPKAPK3におヽてのみキナーゼ活性が認められた。

[0153] これら結果から、インビト口においても MAPKAPK3がそのキナーゼ活性依存的にテロメレース活性を上昇させることが明らかになった。

実施例 6 [0154] (不活性ィ匕型 MAPKAPK3過剰発現によるテロメレース活性の阻害およびテロメァ長短縮の検討）

癌細胞株において不活性ィ匕型 MAPKAPK3過剰発現によりテロメレース活性が阻害されるカゝ否かおよびテロメァ長が短出されるカゝ否かを検討した。

[0155] 不活性化型 MAPKAPK3は、ドミナントネガティブ効果を有し、内因性の MAPKA PK3の作用を阻害すると考える。実際、不活性ィ匕型 MAPKAPK3は、 TERTと結合し (実施例 2および図 2を参照）、 HEK293T細胞に一過性発現させたときに細胞内テロメレース活性を低減させた (実施例 4および図 4を参照)。

[0156] 不活性化型 MAPKAPK3は、組換えレトロウイルスを利用し、癌細胞株にお！、て安定的に過剰発現させた。

[0157] テロメレース活性の測定は TRAP法により実施した。また、テロメレース活性の阻害はテロメァ長の短縮を誘導すると考えられることから、不活性ィ匕型 MAPKAPK3を安定に過剰発現させた癌細胞株のテロメァ長の測定を行った。

[0158] <材料と方法 >

不活性化型 MAPKAPK3発現用組換えレトロウイルスベクターの構築

p38によるリン酸化部位である 201番目と 313番目のスレオニンのコドンをそれぞれァラニンのコドンに置換した MAPKAPK3 cDNA (5 則に HA— tagコード配列を挿入）をレトロウイルスベクターである pQCXIP (Clontech社製）に組込むことにより、不活性ィ匕型 MAPKAPK3発現用組換えレトロウイルスベクターを構築した。本べクタ一により発現される MAPKAPK3は、 p38によるリン酸ィ匕を受けないために活性ィ匕されず、そのためキナーゼ活性を示さない。また、本ベクターにより発現される MAPK APK3は、その N末端に HA— tagが付カ卩されている。

[0159] 組換えレトロウイルスの作製

細胞数 2 X 10⁶の HEK293T細胞を 5%CO存在下にて 37°Cでー晚培養した後（

2

60mm シャーレ）、 2 μ gの不活性化型 ΜΑΡΚΑΡΚ3発現用組換えレトロウイルスベクターを各 2 μ gの pVPack— GPおよび pVPack— VSV— G (共に Stratagene社製）と共に、 FuGENE6 Transfection Reagent (Roche社製）を用いてトランスフェクシヨンした。 2日間培養後、培養上清を回収し、 0. 45 μ mフィルターでろ過した後、ウィルス液として用いた。陰性コントロールとして不活性化型 MAPKAPK3 cD NAを組込んで!/、な!/、pQCXIPを用い、同様に処理してウィルス液（以下空ウィルスと称する)を得た。

[0160] 培養細胞への組換えレトロウイルスの感染

癌細胞株として、ヒト前立腺癌由来細胞株 PC - 3およびヒト神経膠芽腫由来細胞株 U— 87MGを用、た。 PC— 3および U— 87MGをそれぞれ 12ゥエルプレートにてー晚培養した後（約 10% コンフリュエンシー（confluency) )、培地を 8 μ g/mlのポリプレン（Sigma社製）を含むウィルス液（350 μ 1/well)に置換した。 24〜36時間培養後、 2. 5 gZmlのピューロマイシンを含む培地に交換し、ウィルス感染細胞の選択培養を開始した。一週間以上選択培養後、ウェスタンブロッテイングによる発現蛋白質の検出および TRAP法によるテロメレース活性の測定を実施した。なお、ゥィルス感染細胞は、その後も選択培地にて継代維持した。

[0161] ウェスタンブロッテイング

細胞を SDSサンプルバッファー（125mM Tris -HCl, pH6. 8/4% SDS/2 0% グリセロール Ζθ. 01 % ΒΡΒ)に懸濁し、超音波処理後、 5分間煮沸したものを細胞抽出液として用いた。細胞抽出液を 5— 20% SDS— PAGEにより分離した後、抗 HAポリクローナル抗体 (Y— 1 1、 Santa Cruz社製）を用いたウェスタンブロッティングにより、不活性ィ匕型 MAPKAPK3の検出を行った。また、コントロールとして、抗 J3 チューブリンポリクローナル抗体（SantaCruze社製）を用いて j8—tubuli nの検出を行った。

[0162] TRAP法によるテロメレース活性の定量

細胞内テロメレース活性は、 TRAPEZE XL Kit (Intergen社製）を用い、実施例 4に記載した方法と同様の方法 (TRAP法)で測定した。ただし、細胞溶解バッファ一は、次に示す組成のものを用いた： 10mM Tris -HCl, pH 7. 5/lmM Mg CI /ImM EGTA/0. ImM Benzamidine/5mM β—メルカプトエタノール

2

/0. 5% CHAPS/10% グリセロール Z5mM ピロリン酸ナトリウム ZlmM β —グリセ口ホスフェート ZlmM Na VO /ImM NaF。また、蛋白質量 40ngの細

3 4

胞溶解液を用いて TRAP反応を行った。 [0163] 培養細胞からのゲノム DNAの抽出

ヒト神経膠芽腫由来細胞株 U— 87MG力もゲノム DNAを抽出し、テロメァ長の測定に用いた。ゲノム DNAの抽出は、 Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (Q iagen社製)を用い、添付の説明書に従!、実施した。

[0164] テロメァ長の測定

テロメァ長の測定は、 Terminal restriction fragments (TRF)解析法により実施した。具体的には、テロメァ長の測定は、 TeloTAGGG Telomere Length A ssay Kit (Roche社製)を用い、添付の説明書に従い実施した。即ち、 Hinflおよび Rsalで消化した 2 /z gのゲノム DNAを 0. 8%ァガロースゲル電気泳動により分離後、ナイロンメンブレン（positively— charged、 Roche社製）に 20 X SSC存在下にてキャピラリートランスファーした。トランスファー後のメンブレンを 120°Cで 30分間べイクし、 DNAを固定した。次に、メンブレンをキットに付属の DIG Easy Hyb液中にてプレハイブリダィゼーシヨンした後、ジゴキシゲニン (DIG)標識されたテロメァプローブ（キットに付属）をカ卩え、 42°Cにて 3時間以上ハイブリダィゼーシヨンを行った。メンブレンを洗浄後、アルカリホスファターゼ標識抗 DIG抗体および CDP— Star (共にキットに付属）を用いた化学発光法により TRFのシグナルを検出した。

[0165] <結果 >

不活性化型 MAPKAPK3発現レトロウイルス感染細胞（inactive 3pK)にお!/、て、親株 (parent)または空ウィルス感染細胞 (empty)と比較して、テロメレース活性が顕著に低減した（図 8— A)。不活性ィ匕型 MAPKAPK3発現レトロウイルス感染細胞 (inactive 3pK)にお!/、て不活性化型 ΜΑΡΚΑΡΚ3が過剰発現されて!、ることはウェスタンブロットにより確認された。（図 8— Β)。すなわち、不活性化型 ΜΑΡΚΑΡΚ 3発現レトロウイルス感染細胞は、不活性ィ匕型 ΜΑΡΚΑΡΚ3を安定的に過剰発現している。

[0166] 不活性化型 ΜΑΡΚΑΡΚ3発現レトロウイルス感染細胞にお!、て経時的なテロメァ長の短縮が認められた（図 9)。特に、感染 38日後では、親株 (parent)および空ウイルス感染細胞 (empty)と比較して明らかなテロメァ長短縮が認められた（図 9)。一方、親株 (parent)および空ウィルス感染細胞（empty)においてはテロメァ長の変化は認められなかった（図 9)。

[0167] これら結果から、不活性ィ匕型 MAPKAPK3過剰発現によりテロメレース活性が阻害され、それによりテロメァ長の短縮が引き起こされることが明らかになった。

[0168] 不活性ィ匕型 MAPKAPK3は TERTと結合する（実施例 2を参照）力そのキナーゼ活性は低減または消失している。このことから、不活性ィ匕型 MAPKAPK3は、内因性の MAPKAPK3の TERTへの結合を拮抗的に阻害することによりテロメレースの活性ィ匕を阻害し、それによりテロメレース活性の低減とテロメァ長の短縮を引き起こしたと考える。

産業上の利用可能性

[0169] 本発明によれば、テロメレースの活性ィ匕またはテロメレースの活性を阻害する化合物の同定方法を提供できる。また、本発明によれば、テロメレースの活性ィ匕またはテロメレースの活性を阻害できる。さらに、テロメレースの作用やその活性の亢進に起因する疾患の防止および Zまたは治療を期待できる。テロメレースが癌の種類を問わずほとんどの癌細胞で発現しており、生殖細胞以外の正常体細胞ではほとんど発現していないことから、本発明は例えば、多様な癌疾患の防止および Zまたは治療に有効であると考える。

[0170] このように本発明は、テロメレースが関与する細胞増殖や細胞老化のメカニズムおよびテロメレースの作用やその活性の亢進に起因する疾患等に関する基礎的研究等に有用である。さらにテロメレースの作用やその活性の亢進に起因する疾患、例えば癌疾患の防止および Zまたは治療に非常に有用である。

配列表フリーテキスト

[0171] 配列番号 1： MAPKAPK3 (配列番号 2)をコードするポリヌクレオチド。

配列番号 3 :TERT (配列番号 4)をコードするポリヌクレオチド。

配列番号 5： MAPKAPK3 (配列番号 2)の第 201番目および第 313番目のアミノ酸残基が共にスレオニン力ァラニンに置換した不活性ィ匕型変異体をコードするポリヌクレオチド。

配列番号 6： MAPKAPK3 (配列番号 2)の第 201番目および第 313番目のアミノ酸残基が共にスレオニン力ァラニンに置換した不活性ィ匕型変異体。配列番号 7 : MAPKAPK3 (配列番号 2)の第 201番目および第 313番目のアミノ酸残基が共にスレオニン力グルタミン酸に置換した活性ィ匕型変異体をコードするポリヌクレオチド。

配列番号 8： MAPKAPK3 (配列番号 2)の第 201番目および第 313番目のアミノ酸残基が共にスレオニン力グルタミン酸に置換した活性ィ匕型変異体。

配列番号 9： MAPKAPK3 (配列番号 2)の部分配列と高!、相同性を有する、 TERT (配列番号 4)の部分配列。

配列番号 10： TERT (配列番号 4)の部分配列と高!ヽ相同性を有する、 MAPKAPK 3 (配列番号 2)の部分配列。

配列番号 11： MAPKAPK3 (配列番号 2)の部分配列と高!、相同性を有する、 TER T (配列番号 4)の部分配列。

配列番号 12： TERT (配列番号 4)の部分配列と高!ヽ相同性を有する、 MAPKAPK 3 (配列番号 2)の部分配列。

配列番号 13： TERT (配列番号 4)および MAPKAPK3 (配列番号 2)の配列にお!/、て、同一の部分配列。

Claims

請求の範囲

[1] 以下の群より選ばれるテロメレース活性ィ匕阻害方法：

u) MAPKAPK3 (mitogen— activated protein kinase― activated protein kinase― 3)と TERT (telomerase reverse transcriptase)の結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害方法

および

[2] MAPKAPKd mitogen— activated protein Kinase― activated protein ki nase― 3)と TERT (telomerase reverse transcriptase)の結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害方法。

[3] 請求項 1または 2に記載のテロメレース活性ィ匕阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性阻害方法。

[4] MAPKAPKd mitogen— activated protein Kinase― activated protein ki nase- 3)の不活性ィ匕型変異体によるテロメレース活性阻害方法であって、該変異体が TERT(telomelase reverse transcriptase)と結合する変異体である、テロメレース活性阻害方法。

[5] MAPKAPKd mitogen— activated protein Kinase― activated protein ki nase- 3)の不活性化型変異体が配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である、請求項 4に記載のテロメレース活性阻害方法。

[6] 請求項 1若しくは 2に記載のテロメレース活性ィ匕阻害方法、および Zまたは請求項 3 力 5のいずれか 1項に記載のテロメレース活性阻害方法を用いることを特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法。

[7] テロメレース活性の亢進に起因する疾患力癌疾患である請求項 6に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法。

[8] 癌疾患が、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌および非小細胞肺癌のいずれかである請求項 7 に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法。

[9] 癌疾患が乳癌疾患である請求項 7に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法。

[10] MAPKAPK3 (mitogen— activated protein Kinase― activated protein ki nase― 3)と TERT (telomerase reverse transcriptase)の結合を阻害するィ匕合物の同定方法であって、ある化合物と MAPKAPK3および Zまたは TERTとの相互作用を可能にする条件下、該化合物と MAPKAPK3および Zまたは TERTとを接触させ、次いで、 MAPKAPK3と TERTの結合により生じるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が MAPKAPK3と TERTの結合を阻害する力否かを決定する方法。

[11] 活'性ィ匕型 MAPKAPK3 (mitogen— activated protein kinase -activated pr otein kinase— 3)によ o rERT (telomerase reverse transcriptase)のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と活性ィ匕型 MAPKAPK3および Zまたは TERTとの相互作用を可能にする条件下、該化合物と活性ィ匕型 MAP KAPK3および Zまたは TERTとを接触させ、次いで、活性化型 MAPKAPK3よる TERTのリン酸ィ匕により生じるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、該化合物が活性ィ匕型 MAPKAPK3による TERTのリン酸ィ匕を阻害するか否かを決定する方法。

[12] 以下の群より選ばれるテロメレース活性ィ匕阻害剤：

u) MAPKAPK3 (mitogen— activated protein kinase― activated protein kinase― 3)と TERT (telomerase reverse transcriptase)の結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性ィ匕阻害剤

および

[13] 以下の群より選ばれるテロメレース活性ィ匕阻害剤： (i) MAPKAPK3 (mitogen— activated protein kinase― activated protein kinase― 3)と TERT (telomerase reverse transcriptase)の結合を阻害する化合物を少なくとも 1つ含んでなるテロメレース活性ィ匕阻害剤

および

[14] 以下の群より選ばれるテロメレース活性阻害剤：

u) MAPKAPK3 (mitogen— activated protein kinase― activated protein kinase― 3)と TERT (telomerase reverse transcriptase)の結合を阻害することを特徴とするテロメレース活性阻害剤

および

[15] 以下の群より選ばれるテロメレース活性阻害剤：

u) MAPKAPK3 (mitogen— activated protein kinase― activated protein kinase― 3)と TERT (telomerase reverse transcriptase)の結合を阻害する化合物を少なくとも 1つ含んでなるテロメレース活性阻害剤

および

[16] MAPKAPKd mitogen— activated protein Kinase― activated protein ki nase- 3)の不活性ィ匕型変異体を含んでなるテロメレース活性阻害剤であって、該変異体が TERT (telomelase reverse transcriptase)と結合する変異体である、テロメレース活性阻害剤。

[17] MAPKAPKd mitogen— activated protein Kinase― activated protein ki nase- 3)の不活性化型変異体が配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である、請求項 16に記載のテロメレース活性阻害剤。

[18] 請求項 1若しくは 2に記載のテロメレース活性ィ匕阻害方法を用いるテロメレース活性化阻害、および Zまたは請求項 3から 5の、ずれか 1項に記載のテロメレース活性阻害方法を用いるテロメレース活性阻害を特徴とするテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

[19] 請求項 12および 13に記載のテロメレース活性ィ匕阻害剤並びに請求項 14から 17に記載のテロメレース活性阻害剤のうち少なくともいずれか 1つを含んでなるテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

[20] テロメレース活性の亢進に起因する疾患力癌疾患である請求項 18または 19に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

[21] 癌疾患が、乳癌、腎細胞癌、急性白血病、グリア性腫瘍、前立腺癌、神経上皮腫、扁平上皮癌、肝細胞癌、前立腺癌および非小細胞肺癌のいずれかである請求項 20 に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

[22] 癌疾患が乳癌疾患である請求項 20に記載のテロメレース活性の亢進に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

[23] MAPKAPKd mitogen— activated protein Kinase― activated protein ki nase— 3)、 MAPKAPK3をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれか 1つと、 TERT (telomerase reverse transcriptase 、 TERTをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび該ベクターを含有する形質転換体のうちの少なくともいずれ力 1つとを含んでなる試薬キット。