WO2004005511A1

WO2004005511A1 - 腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウイルス

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Publication number: WO2004005511A1
Application number: PCT/JP2003/008573
Authority: WO
Inventors: Toshiyoshi Fujiwara; Yoshiko Shirakiya; Takeshi Kawashima; Noriaki Tanaka; Satoru Kyo
Original assignee: Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
Current assignee: Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
Priority date: 2002-07-08
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2004-01-15
Anticipated expiration: 2005-01-08
Also published as: AU2003281310B2; KR100947194B1; JP3867968B2; CA2491907A1; NZ537631A; KR20050075867A; ES2455127T3; PL374644A1; JP2004033186A; US20060239967A1; CA2491907C; EP1553178A4; AU2003281310A1; DK1553178T3; KR20090043589A; EP1553178B1; PT1553178E; CN1665927A; CN100430476C; ZA200500047B

Abstract

テロメラーゼのプロモーターと、E1遺伝子、好ましくはE1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子を含む配列とを含む遺伝子配列を有するウイルス及び該ウイルスを用いた抗癌剤を用いることによって、前記ウイルスが腫瘍細胞において増殖することにより、効率の良い抗癌作用を示す。

Description

腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウィルス技術分野

本発明は、腫瘍細胞において増殖することにより抗腫瘍作用を示すウィルス、該ウィルスに含まれるポリヌクレオチド、該ウィルスを含む抗癌剤及び該ウイルスを用いた癌の治療方法に関する。

明田

背景技術

現在、癌の治療方法の 1つとして、遺伝子治療が行われている。しかし、遺伝子治療では、非増殖性ウィルスベクターを用いて患部組織等に遺伝子が導入されるため、人体の安全を考慮して標的細胞の周囲にしか適用できない。また、現在の遺伝子治療では、遺伝子の導入効率が低いために満足のいく治療効果が得られない。

癌ィ匕した細胞又は不死ィ匕した細胞株では、テロメラ一ゼの活性が増大していることが多く、一方、生殖系の細胞、血球系細胞、上皮系幹細胞等以外の正常な体細胞では、テロメラーゼの活性はほとんど検出されないことが知られている。そこで、本発明の主な目的は、腫瘍細胞において活性ィ匕しているテロメラーゼを利用することにより腫瘍細胞においてウィルスを増殖させ、腫瘍細胞を効率良く死滅させることである。図面の簡単な説明

図 1は、腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウィルスの構造の模式図を示す。非増殖性ウィルスベクターでは欠失している E1遺伝子領域に、 hTERT プロモーター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子からなる増殖カセットが揷入されている。

図 2は、ヒト癌細胞および正常細胞におけるテロメラーゼ活性の比較を示す。図 3は、ヒト癌細胞および正常細胞における TRAD感染後の E1A及び E1Bの mRNA及び夕ンパク質の発現を示す。

図 4は、ヒト癌細胞及び正常細胞における TRAD感染後の細胞内における増殖を示す。

図 5は、ヒト癌細胞及び正常細胞における TRAD による細胞障害活性を Coomassie brilliant blue染色によって示した写真である。

図 6は、ヒト癌細胞及び正常細胞における TRADによる細胞障害活性を顕微鏡写真で示したものである。

図 7は、ヒト癌細胞及び正常細胞における TRADによる細胞障害活性を XTT アツセィにより示したグラフである。

図 8は、ヌードマウスとヒト肺癌細胞 H358を用いた非増殖性 p53遺伝子発現アデノウイルスベクターの腫瘍内局所投与の抗腫瘍効果を示したグラフである。図 9は、ヌ一ドマウス及びヒト大腸癌細胞 SW620を用いた TRADの腫瘍内局所投与の抗腫瘍効果を示したグラフである。発明の開示

本発明者は、テロメラ一ゼのプロモーターと増殖能とを有するウィルスを癌細胞に感染させることにより、癌細胞でウィルスが増殖し、癌細胞を死滅させることができることを初めて見出し、本発明を完成するに至つた。

即ち、本発明は以下の項 1〜： L0に関する。

1 . ヒトテロメラ一ゼのプロモーター及び少なくとも 1種の E1遺伝子を含むポリヌクレオチド。

2 . E1遺伝子がアデノウィルス由来の E1遺伝子である前記項 1に記載のポリヌクレオチド。

3 . ヒトテロメラーゼのプロモーターが hTERTである前記項 1又は 2に記載のポリヌクレオチド。

4. E1遺伝子が、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む前記項 1〜3のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

5 . 前記項 1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むウィルス。

6 . ウィルスがアデノウィルスである前記項 5に記載のウィルス。 7 . 前記項 5又は 6に記載のウィルスを有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗癌剤。

8 . 前記項 5又は 6に記載のウィルス又は請求項 7に記載の抗癌剤を用いた癌の治療方法。

9 . 癌が、胃、大腸、肺、肝、前立腺、勝、食道、膀胱、胆嚢 '胆管、乳房、子宮、甲状腺及び卵巣からなる群から選ばれる少なくとも 1種の癌である前記項 8 に記載の治療方法。

1 0 . 癌が、骨肉腫及び脳腫瘍からなる群から選ばれる少なくとも 1種である前記項 9に記載の治療方法。発明の詳細な記述

本発明は、多くの種類の癌細胞がテロメラ一ゼ活性を有するという知見に基いて、テロメラーゼのプロモー夕一及び増殖能を有するウィルスを癌細胞に感染させ、癌細胞において当該ウィルスを増殖させることにより、癌細胞を死滅させることを特徴とする。

本発明において用いられるウィルスは特に限定されないが、安全性等の点からアデノウイルスが好ましい。また、アデノウイルスの中でも、使用の簡便さ等の点からタイプ 5のアデノウィルスが特に好ましい。

ウィルスのポリヌクレオチドに含まれる E1遺伝子とは、ウィルスの有する DNA複製に関する初期遺伝子（early : E) と後期遺伝子 (late： L) のうちの初期遺伝子の一つをいい、 E1遺伝子はウィルス ·ゲノムの転写の制御に係わる夕ンパク質をコードする。

本発明において用いる E1遺伝子は、どのウイルス由来のものも使用できるが、アデノウイルス由来のものが好ましい。

また、 E1遺伝子は、 E1A、 E1B等から構成されることが知られている。 E1A 遺伝子によりコードされる E1Aタンパク質は、感染可能なウィルス産生に必要な遺伝子群（E1B、 E2、 E4等）の転写を活性化する。

E1B遺伝子によりコードされる E1Bタンパク質は、後期遺伝子（L遺伝子）の niRNAが感染した宿主細胞の細胞質へ蓄積するのを助け、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、ウィルスの複製を促進する。アデノウイルスの E1A 遺伝子及び E1B遺伝子の配列は、それぞれ以下の配列 1及び 2に示す。

本発明において、 E1遺伝子は公知のものをそのまま用いることもできるが、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に有するもの、即ち、 IRES配列を E1A遺伝子と E1B遺伝子との間に挿入したものを使用することが好ましい。ウィルスが宿主細胞に感染した際に、増殖能が高くなるからである。

本発明の効果を達成し得るのであれば、 IRES配列と E1A遺伝子との間、 IRES 配列と E1B遺伝子との間、 E1A遺伝子の上流及び E1B遺伝子の下流からなる群から選ばれる少なくとも 1ケ所に、少なくとも 1個のヌクレオチドが挿入されていてもよい。また、本発明の効果を達成し得るのであれば、 E1A遺伝子、 IRES 配列、 E1B遺伝子又は E1遺伝子において、少なくとも 1個、好ましくは複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。

IRES配列とは、ピコルナウィルス科のウィルスに特異的なタンパク質合成開始シグナルであり、 18Sリボソーム RNAの 3'末端と相補的な配列があるためリポソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。ピコルナウィルス科のウィルス由来の mRNAはこの配列を介して翻訳されることが知られている。

IRES配列からの翻訳効率は高く、 mRNAの途中からでもキヤップ構造非依存的にタンパク質合成が行われる。従って、本ウィルスでは、ヒトテロメラーゼのプロモーターにより E1A遺伝子と IRES配列の下流にある E1B遺伝子の両方が独立に翻訳される。 IRES配列を以下の配列 3に示す。

また、本発明において、 E1遺伝子は、その上流にヒトテロメラーゼのプロモ一夕一を有することが好ましい。テロメラーゼ活性を有する癌細胞内で、本発明のウィルスの増殖を促進させることができるからである。ヒトテロメラ一ゼのプ口モータ—は、ヒト由来のプロモーターであれば種類などは限定されないが、その中で hTERTが好ましい。

hTERTはヒトテロメラーゼ逆転写酵素をコ一ドする遺伝子であり、その 5'末端の上流 1.4kbpの領域には多くの転写因子結合配列が確認されている。その領域が hTERTプロモーターであると考えられるが、中でも翻訳開始部位の上流 181 bpの配列が下流の遺伝子発現に重要なコア領域である。本発明において、ヒトテロメラ一ゼのプロモータ一としては、このコア領域を含むものであれば限定されずに使用することができるが、このコア領域を完全に含む上流 378 bp程度の配列を hTERTプロモ一ターとして使用するのが好ましい。この 378 bp程度の配列は、その遺伝子発現効率が 181 bpのコァ領域単独の場合と同等であることが確認されている。 hTERTの配列を以下の配列 4示す。

本発明のテロメラーゼのプロモーター及び E1遺伝子（E1A遺伝子、 IRES遺伝子及び E1B遺伝子を含む遺伝子）を有する遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。

E1遺伝子としては、それを有する公知のウィルスのものが使用できるが、好ましくはアデノウィルスの E1遺伝子が好ましい。

また、例えば、 E1遺伝子を発現している細胞、好ましくは E1遺伝子を発現させた 293細胞等から E1A-S、 E1A-AS、 E1B_S、 E1B-AS等のプライマーを用いて、 R PCR及び,又は DNA-PCRを行うことにより E1A遺伝子及び E1B遺伝子を増幅することができる。必要に応じて TAクローニングのような公知の方法を用いて配列を確認した後、 EcoRIのような公知の制限酵素で E1A及び E1Bの DNA断片を切り出すことができる。

pIRESのような公知のベクタ一に、通常の遺伝子工学的手法により E1A及び E1Bを挿入し、該ベクター中に E1A-IRES-E1B配列を作成することができる。次いで、 Mlul、 Bglll等の制限酵素で切り出した hTERTプロモーター配列を、 E1A の上流にある Xhol等の部位に挿入することができる。

必要に応じて、 pShuttle等の公知のベクターに含まれるサイトメガロウィルス (CMV) プロモ一夕一を Mfel、 Nhel等の制限酵素により取り除き、その部位に phTERT-ElA-IRES-ElBより制限酵素 Nhelおよび Notlで切り出した配列を揷入することができる（得られらたものを「pSlrhAIB」という。）。

pSh-hAIBから I-Ceul、 Pl-Scel等の制限酵素により必要な部分の（hTERTプロモ—ター、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子を含む）配列を切り出し、 Adeno-X Expression System ( CLONTECH) 等の市販のキットを用いて Adeno-X Viral DNA等のウィルスの DNAに揷入することができる（得られたものを「AdenoX-hAIB」という。）。上記の hTERTプロモータ一、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子を含む配列は、本発明の効果を達成し得るのであればウィルスの遺伝子のどの部分に揷入してもよいが、例えば、遺伝子治療用のアデノウイルスにおいては、 E1遺伝子を欠損させているので、その欠損させた部分に揷入するのが好ましい。

AdenoX-hAIBを Pad等の公知の制限酵素により線状化した後、 293細胞等の培養細胞にトランスフエクシヨンし、感染性のある組換えアデノウィルスを作製することができる（得られたウィルスを、「本発明のウィルス」又は「TRADJ ということがある。）。トランスフエクシヨンする方法も限定されず、効率の点からリン酸カルシウム法、エレクトロポレーシヨン等を用いることが好ましい。

上記のようにして得られた本発明のウィルスは、通常ウィルスを増殖させる方法、例えば 293細胞等の宿主細胞に感染させるなどして増殖させることができる。本発明のウィルスは、抗癌剤として使用することができる。例えば、癌の治療だけでなく、手術後の再発予防、転移の防止及び Z又は予防等にも使用できる。本発明の抗癌剤を適用する癌の種類としては、限定されるものではなく、あらゆる種類の癌に用いることができる。例えば、胃、大腸、肺、肝、前立腺、塍、食道、 fl旁胱、胆嚢 ·胆管、乳房、子宮、甲状腺、卵巣等における癌や、脳腫瘍、骨肉腫等に有効であり、その中でも固形癌により有効である。

本発明の抗癌剤は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下といった注射、鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、坐剤、外用剤等によりヒト（対象となる細胞や臓器）に導入することもできる。

また、本発明のウィルスは、例えば凍結乾燥などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。）などと混合して医薬組成物として調製することができる。

本発明の抗癌剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、筋肉、腹腔等への局部注射、静脈への注射等が例示される。

投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、一日投与量として、通常有効成分である本発明ウィルスの量を 10⁶〜： !OUPFU程度、好ましくは 10⁹〜1( PFU程度とするのがよく、 1日 1回投与することもでき、数回に分けて投与することもでぎる。

また、本発明のウィルスを使用する際には、公知の免疫抑制剤等を用いることにより、生体の免疫を抑制し、該ウィルスが感染し易くすることもできる。更に、本発明のウィルスは、従来の遺伝子治療で用いられている例えば p53遺伝子を含むような非増殖性ウィルス、公知の抗癌剤及び放射線からなる群から選ばれる少なくとも 1種の抗癌剤を併用することもできる。

生体（癌細胞や癌組織）に感染した本発明のウィルスは、該細胞内で増殖し、該細胞を死滅させることができる。このように癌細胞を死滅させることにより、癌を治療したり、癌細胞の増殖を抑制したり、転移を防いだりすることができる。本発明の抗癌剤は、以下の理由で副作用が生じる可能性は極めて低いと考えられ、非常に安全な製剤であるということができる。

(1) 正常の体細胞ではテロメラーゼ活性がほとんどなく、また、アデノウィルス自体が造血細胞等の浮遊細胞には感染しにくいため、本発明でいおいてアデノウィルスを使用した場合には、腫瘍の種類に対してより選択性が高くなる。 (2) 本発明のウィルスは増殖能を有するので、通常の遺伝子治療で用いられている非増殖性ウィルスよりも低い濃度で使用することができる。

(3) 本発明のウィルスが過剰に投与された場合であっても、生体内の通常の免疫作用によつて抗ウイルス作用が働く。実施例

以下、本発明を更に詳しく説明するために実施例を挙げるが、いうまでもなく本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 1

ぐ TRADの作製 > 293細胞から抽出した RNAから特異的プライマー（E1A-S：配列 5、 E1A-AS：配列 6) を用いて T-PCRを行い、 899 bpの E1A遺伝子を増幅した。 293細胞から抽出した DNAよりプライマ一（E1B-S : 配列 7、 E1B-AS：配列 8) を用いて DNA-PCRを行い、 1823 bpの E1B遺伝子を増幅した。

それぞれの PCR産物の TA Cloning (TA Cloning Kit Dual Promoter; Invitrogen) を行い、シークェンスを確認した後、制限酵素 EcoRIにより、各々 899 bp (E1A) , 1823 bp (E1B) の DNA断片を切り出した。

pIRESベクタ一（CLONTECH)の Mlul切断部位に E1Aを、 Sail部位に E1B をそれぞれ順方向に挿入した（E1A-IRES-E1B)。

制限酵素 Mlulおよび Bglllで切り出した 455 bpの hTERTプロモータ一配列を、 E1A-IRES-E1B の E1A 上流にある Xhol 部位に順方向に揷入した (phTERTElA-IRES-ElB)„ .

pShuttleベクタ一に含まれるサイトメガロウィルス (CMV) プロモーターを制限酵素 Mfel および Nhel 処理により取り除き、その部位に phTERT-ElA-IRES-ElBより制限酵素 Nhelおよび Notlで切り出した 3828 bp の配列を揷入した（pSh-hAIB)。

pSh-hAIBより制限酵素 I-Ceulおよび Pl'Scelにより 4381 bpの配列を切り出し、 Adeno-X Expression System (CLONTECH)の Adeno-X Viral DNAに揷入した（AdenoX-hAIB)。 AdenoX-hAIBを制限酵素 Pad処理で線状化した後、. 293 細胞にリン酸カルシウム法を用いてトランスフエクシヨンし、感染性のある組換えアデノウイルスを作製した（TRAD)。 TRADの模式図を図 1に示す。

実施例 2

くヒト癌細胞及び正常細胞におけるテ口メラ一ゼ活性の比較 >

ヒト肺癌細胞（A549、 H226Br、 H1299)、ヒト大腸癌細胞（SW620、 DLD'1、 LoVo)、ヒト胎児腎臓細胞 293、 SV40遺伝子導入で不死化したヒト血管内皮細胞 HUVEC, ヒト正常線維芽細胞（WI38、 NHLF) の 10種類の細胞から RNAzol (Cinna/Biotecx) を用いて RNAを抽出し、 LightCyclerおよび LightCycler DNA TeloTAGGG Kit (Roche Molecular Biochemicals) を用いてリアルタイム定量的 reverse transcription (RT) — PCR を行い、それぞれの細胞における hTERT遺伝子発現レベルを比較した。結果を図 2に示す。

最も発現レベルの高かった A549細胞を 1.0として比較すると、 A549、H226Br、 H1299、 SW620、 DLD'1、 LoVoなどの癌細胞及び 293細胞では 0.18〜： 1.00の hTERT遺伝子発現が確認されたが、不死化した HuVEC細胞や WI38, NHLF などの正常細胞ではその発現は検出されなかった。

実施例 3

くヒト癌細胞及び正常細胞における、 TRAD感染後の E1A及び E1Bの mRNA 及び夕ンパク質の発現 >

ヒト大腸癌細胞 SW620及びヒト正常線維芽細胞 WI38を in vitroで培養し、 0.1及び 1 MOI (multiplicity of infection) の濃度で TRADを感染させ、 36時間後に RNAを回収した。陽性コントロ一ルとして 293細胞を用いた。

GeneAmp RNA PCR Core Kitを用いて RTを行い、 E1A及び E1B遺伝子に対するプライマ一を用いて GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (PE Applied Biosystems) により 30サイクルの増幅を行った。 PCR産物を 1.2%ァガロースゲル上で泳動し、ェチジゥムブ口マイドで染色して可視化した（図 3A に上 2つ）。バンドの強度をイメージアナライザ一にて測定し、 GAPDHを内部コントロールとして定量化してグラフ化した（図 3Aの下)。

ヒト大腸癌細胞 SW620及びヒト正常線維芽細胞 WI38を in vitroで培養し、 0.1及び 1 MOIの濃度で TRADを感染させ 48時間後に付着細胞を回収、溶解液中で 30分反応させた後に遠沈し、上清のタンパク質濃度を測定した。 12%ポリアクリルアミドゲル上で泳動し、膜にトランスファ一した後、抗アデノウイルス 5型 E1A抗体（PharMingen International) を用いてウェスタンブロット解析を行った。結果を図 3Bに示す。

癌細胞である SW620においては、 TRADの感染により明らかに強い E1A遺伝子（502 bp)、 E1B遺伝子 (543 bp) の発現がみられたが、正常細胞である WI38 では、それらは弱い発現がみられたのみであった（図 3A)。陽性コントロールの 293細胞では、それらは中等度の発現が認められた。

ウエスタンブロット解析では、 SW620において 0.1 MOI、 1 MOIと TRADの濃度に従つて E1A夕ンパク質の発現が増強した（図 3B)。一方、 WI38では 1 MOI の TRADを使用しても、 E1Aタンパク質の発現はとんど検出さなかった。

実施例 4

<ヒト癌細胞及び正常細胞における TRAD感染後の細胞内増殖の検討 >

ヒト癌細胞（SW620及び H1299) 及びヒト正常細胞（WI38及び NHLF) に TRADを 1 MOIで 2時間 37°Cで感染させ、 TRADを含む培養液を捨て、新しい培養液で 1回洗浄、さらに新しい培養液を加えた。その直後に Day 0としてスクレーパーで細胞を回収、凍結融解を繰り返した後に 1 _mlの培養液に浮遊させた。更に、同様の方法で Day 1、 2、 3、 5、 7にウィルスを回収し、力価測定を行った。結果を図 4に示す。

正常細胞である WI38や NHLFでは、 10² PFUの TRADが 3日目には 10⁵ PFU 程度と 100〜1000倍の増殖がみられたが、癌細胞である SW620や H1299では 10⁷〜10⁸ PFUと 10⁵〜10⁶倍の増殖が認められ、癌細胞特異的なウィルス増殖が確認された。

実施例 5

<ヒト癌細胞および正常細胞における TRADの細胞障害活性 >

24ゥェルプレートに、 5種類のヒト癌細胞（SW620、 H1299、 A549、 DLD-1、 H226Br)を 6〜8 X 10個ウエル、及び 2種類のヒト正常細胞（WI38、 NHLF) を 2〜4X 10⁴個 Zゥエルでそれぞれ蒔き、 24時間後に TRADを 0.01、 0.1、 1、 2、 5 MOIで感染させた。感染から 96時間後に、顕微鏡下に SW620、 DLD_1、 NHLF 細胞の形態学的変化を観察した。更に、すべての細胞において、培養液を捨て、生細胞を Coomassie brilliant blueで染色し、スキャナ一にてマクロ画像を取り込んだ。

96ゥエルプレートに SW620、 H1299を 10個/ゥエル、 NHLFを 5X 103個 Zゥヱルで蒔き、 TRADを 0 (非感染細胞）、 0.01、 0.1、 1 MOIで感染させ、 XTT ァッセィにて Day 1、 2、 3、 5、 7に生細胞数を計測した。 4ゥェルずつで測定し、非感染細胞を 1.0として平均値 +/· SDにてダラフ化した。それぞれの結果を図 5、 6及び Ίに示す。

SW620, H1299, A549、 DLD-1、 H226Brなどの癌細胞では、 TRADの濃度依存性に細胞数が減り、青く染まる領域が減少しているのがわかる。一方、 WI38 NHLFなどの正常細胞では、青く染色される生細胞数の顕著な減少は認められなかった。（図 5)。

顕微鏡所見では、 SW620、 DLD-1細胞はプレートの底面から剥がれて円形化し、細胞密度も減少していたが、 NHLFではほとんど形態学的変化はみられず、細胞数の減少も認められなかった（図 6)。

SW620および H1299では、 1 MOIの TRADの感染により 3日目までのほぼ 100%の細胞死が観察され、 0.1 MOIでも 80%以上の細胞数減少が認められた。これに対し、 NHLFでは 3日目でもほとんど細胞数の減少はみられず、 7日目には 1 MOIの TRADで 60%程度の細胞数の低下が観察されたが、 0.01 MOIでは全くウィルスの影響はなかった（図 7)。

実施例 6

<動物モデルを用いた TRADの抗腫瘍活性の検討〉

5— 6週齢ヌードマウスの背部皮下にヒト肺癌細胞 H358を 5 X 10⁶個移植し、直径が約 5— 6 mmとなった時点で、 p53遺伝子を発現する非増殖性アデノウィルスベクター（Ad-p53) を 1 X 108 PFU、 3 X 1〇8 PFU、 I X 10⁹ PFUを連日 2日間腫瘍内局所注入した。その後、直交する腫瘍径を定期的に測定し、推定腫瘍重量を（長径） X (短径） ²Z2で算出した。コントロールとして挿入遺伝子をもたない非増殖性アデノウイルスベクタ一 (U312を用いた。

5 - 6週齢ヌ一ドマウスの背部皮下にヒト大腸癌細胞 SW620を 5 X 10⁶個移植し、直径が約 5 - 6 mmとなつた時点で、 2 X 10⁷ PFUの dl312及び 4X 10³ PFUの TRADを連日 3日間腫瘍内局所注入した。同様に腫瘍径を測定し、推定腫瘍重量を算出した。結果を図 8及び 9に示す。（図中、 Mockとはコントロールを示し、 PBS (リン酸緩衝液）を投与した。）

3 X 108 PFU, 1 X 109 PFUの Ad-p53投与により H358腫瘍の増殖は有意に（p < 0.05)抑制された。しかし、 I X 108 PFUの Ad-p53投与では有意な増殖抑制は認められなかった（図 8)。また、コントロールの dl312の投与では腫瘍増殖は全く影響されなかった。

抗腫瘍効果がみられた Ad-p53 よりも極めて低濃度である 4 X 103 PFU の TRADの腫瘍内投与により、有意差をもって（pO.05) SW620腫瘍の増殖が抑制された。コントロールの (Π312の投与では腫瘍増殖は全く影響されなかった。以上より、本発明のウィルスは効率良く癌細胞において増殖し、癌細胞を死滅させることがわかる。また、本発明のウィルスは増殖能を有しているので、低濃度でも大きな抗癌作用を発揮し、投与するウィルスを低濃度にすることにより副作用を抑制することもできる。

Claims

請求の範囲

1 . ヒトテロメラ一ゼのプロモータ一及び少なくとも 1種の E1遺伝子を含むポリヌクレオチド。

2 . E1遺伝子がアデノウィルス由来の E1遺伝子である請求項 1に記載のポリヌクレオチド。

3 . ヒトテロメラーゼのプロモーターが hTERTである請求項 1又は 2に記載のポリヌクレオチド。

4. E1遺伝子が、 E1A遺伝子、 IRES配列及び E1B遺伝子をこの順に含む請求項 1〜3のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

5 . 請求項 1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むウィルス。

6 . ウィルスがアデノウイルスである請求項 5に記載のウィルス。

7 . 請求項 5又は 6に記載のウィルスを有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗癌剤。

8 . 請求項 5又は 6に記載のウィルス又は請求項 7に記載の抗癌剤を用いた癌の治療方法。

9 . 癌が、胃、大腸、肺、肝、前立腺、勝、食道、膀胱、胆嚢 *胆管、乳房、子宮、甲状腺及び卵巣からなる群から選ばれる少なくとも 1種の癌である請求項 8に記載の治療方法。

1 0 . 癌が、骨肉腫及び脳腫瘍からなる群から選ばれる少なくとも 1種である請求項 9に記載の治療方法。