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WO2005023234A1 - Utilisation de l’acide nor-dihydroguaiaretique en tant qu’inhibiteur de la formation adipocytaire humaine - Google Patents

Utilisation de l’acide nor-dihydroguaiaretique en tant qu’inhibiteur de la formation adipocytaire humaine Download PDF

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WO2005023234A1
WO2005023234A1 PCT/FR2004/002203 FR2004002203W WO2005023234A1 WO 2005023234 A1 WO2005023234 A1 WO 2005023234A1 FR 2004002203 W FR2004002203 W FR 2004002203W WO 2005023234 A1 WO2005023234 A1 WO 2005023234A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
use according
cosmetic
dermo
composition
active
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2004/002203
Other languages
English (en)
Inventor
Anne-Marie Rodriguez
Christian Dani
Gérard Ailhaud
Joëlle Guesnet
Anne Guezennec
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Yves Saint Laurent Parfums SA
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Yves Saint Laurent Parfums SA
Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Yves Saint Laurent Parfums SA, Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO2005023234A1 publication Critical patent/WO2005023234A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the use of nor-dihydroguaiaretic acid (“NDGA”) or a derivative thereof, as an anti-adipogenic agent in cosmetic, dermo-pharmaceutical, pharmaceutical and food preparations, in particular for human use.
  • NDGA nor-dihydroguaiaretic acid
  • the invention also relates to cosmetic, dermo-pharmaceutical, pharmaceutical and food compositions containing NDGA in an amount sufficient to inhibit the formation of human adipocytes.
  • the invention also encompasses methods for the prevention or treatment of overweight or any other condition involving aberrant or undesirable adipocyte differentiation, in humans, using compositions based on
  • the adipocyte is the main cell of adipose tissue, and not only contains the equipment necessary for regulating the energy balance (under hormonal control), but also plays a complex and dynamic role interfering with immunological responses, vascular diseases and appetite regulation, thanks to its endocrine, autocrine and paracrine cell capacities.
  • Adipocytes highly specialized cells, store energy in the form of triglycerides and release it in the form of fatty acids.
  • the weight development of adipose tissue is a direct reflection of the state of lipid energy reserves.
  • the adipocyte precursor cells (the preadipocytes), can differentiate into adipocytes throughout life. This differentiation is stimulated by hormones or by nutrients such as fatty acids.
  • adipose tissue leading to obesity involves on the one hand, adipocyte enlargement (increase in cell size) and on the other hand, cellular hyperplasia, ie an increase in the number of adipose cells .
  • the mature adipocyte which is a differentiated cell, has lost all capacity for division. Consequently, the increase in the number of adipocytes, observed during the development of adipose tissue, results in fact from the overproliferation and the differentiation of cellular precursors into adipocytes, the precursors being present in the vascular fraction of the stroma of this tissue.
  • NDGA nordihydroguaiaretic acid
  • NDGA has already been used in cosmetic and therapeutic preparations, in particular for its anti-hair regrowth effects (WO 00/28959), its anti-acne effects (FR 2830195), its antioxidant effects (Ref. 12), its anti-inflammatory effects (US 4,530,844 and US 4,568,696), and its anti-tumor effects (EP 297733).
  • this compound has not been used to date as an adipocyte differentiation inhibitor.
  • the present invention therefore relates to the use of nor-dihydroguaiaretic acid (C ⁇ 8 H 22 ⁇ ), or of its derivatives, as active ingredient in a cosmetic, dermopharmaceutical, pharmaceutical or food composition, as an inhibitor of the formation of human adipocytes.
  • the present invention relates to the use of nor-dihydroguaiaretic acid (C 18 H 22 ⁇ 4 ), or a derivative thereof, as active ingredient in a cosmetic composition, as an inhibitor of formation of human adipocytes or as active principle in a dermo-pharmaceutical composition for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of pathologies involving a dysfunction of adipocyte differentiation in humans.
  • nor-dihydroguaiaretic acid C 18 H 22 ⁇ 4
  • a derivative thereof as active ingredient in a cosmetic composition, as an inhibitor of formation of human adipocytes or as active principle in a dermo-pharmaceutical composition for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of pathologies involving a dysfunction of adipocyte differentiation in humans.
  • Nor-dihydroguaiaretic acid (C 18 H 22 ⁇ 4 ) has the following chemical formula
  • NDGA is also known under the names of: ⁇ ' ⁇ -dimethyl- ⁇ - ⁇ -bis (3,4-dihydroxyphenyl) butane 1, 2-benzenediol, 4,4 '- (2,3-dimethyl-1, 4 -butane) 1,4-Bis (3,4-dihydroxyphenyl) -2,3-dimethylbutane 4.4 '- (2,3-dimethyI-1,4-butanediyl) bis (pyrocatechol) Butane, 1,4-bis (3,4-dihydroxyphenyl) -2,3-dimethyI- Masoprocol Dihydronorguaiaretic acid
  • NDGA can be a natural molecule, obtained by plant extraction, for example from the plant Larrea divaricata or Larrea tridentata.
  • NDGA can be purified from the plant extract, or the raw extract can be used.
  • NDGA can also be produced by chemical synthesis.
  • an NDGA derivative means any molecule being structurally related to NDGA, and having an anti-adipogenic activity as defined below.
  • the derivatives have the formula I:
  • R, 1, R are, independently of one another, either (-H) or a methyl radical
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 10 , R 11 , R 12 and R 13 are independently of each other (-H), or a methyl radical (-CH 3 ) or an ethyl radical (-C 2 H 5 ),
  • R 7 , R 8 and R 9 are independently of each other either (-H), or (-OH), or a methyl radical (-CH 3 ) or an ethyl radical (-C 2 H 5 ), or a radical methoxy (-COCH 3 ) or ethoxy (-
  • R 1 and R 2 represent (-H)
  • R 7 and R 8 represent (-OH)
  • R 3 to R 6 and R 10 to R 13 represent independently (-H), or a methyl radical
  • NDGA and its derivatives exert an inhibitory effect on the formation of human adipocytes.
  • This effect also designated as an “anti-adipogenic effect”, signifies an inhibition of the differentiation of human stem cells or of human preadipocyte precursor cells, into adipocytes.
  • Adipocyte differentiation is mainly characterized by a morphological modification of the precursor cells (passage from the fibroblastic form to a round form with accumulation of triglyceride droplets), a phenotypic change, and the appearance of specific markers of the adipocyte, for example the hPPAR ⁇ 2 (human ⁇ 2 receptor activated by proliferators of peroxisome or "human peroxisome proliferator activated receptor ⁇ "), and haP2 (human fatty acid binding protein or "human adipocyte fatty acid binding protein”).
  • GPDH glycerophosphate dehydrogenase
  • the inhibition by NDGA of the formation of adipocytes takes place at an early stage of differentiation, in particular before the appearance of specific markers of adipocytes, such as hPPAR ⁇ 2 or haP2, before the expression of specific enzymatic activity, such as GPDH activity, and before the formation of adipocytes loaded with triglycerides.
  • the anti-adipogenic effect of NDGA and its derivatives can be demonstrated in vitro by measuring either the level of expression of adipocyte markers, or the level of specific enzymatic activity, presented by multipotent human cells in the presence of NDGA or its derivatives, after several days of culture in an adipocyte differentiation medium. These levels are compared with those presented by the same cells in the absence of NDGA or its derivatives.
  • the cells having been exposed to the medium containing NDGA exhibit a level of expression of the adipocyte markers, or a level of enzymatic activity, much lower than the levels observed in the absence of NDGA or its derivatives.
  • hPPAR ⁇ 2 or haP2 are suitable as specific adipocyte markers. Their expression levels can be determined by assaying mRNA or proteins. To measure the levels of enzyme activity, GPDH activity can be used.
  • the anti-adipogenic effect of NDGA and its derivatives is demonstrated by measuring the glycerophosphate dehydrogenase (GPDH) activity, for example by implementing the tests described in the experimental protocols below.
  • GPDH glycerophosphate dehydrogenase
  • a significant inhibition of adipocyte differentiation means a statistically significant decrease in the specific activity of GPDH, compared to cells, differentiated into adipocytes in the absence of treatment.
  • This significant inhibition results, for example, in a reduction of at least 10%, or at least 15% or 30% of the specific activity of GPDH, compared with cells differentiated into adipocytes in the absence of treatment, preferably at least 50%, more particularly at least 60%, and preferably at least 80% of the specific activity of GPDH, relative to the control.
  • the process for demonstrating the anti-adipogenic effect preferably comprises the following steps (see Figure 1):
  • Initiation of differentiation (Day 0) by culturing the cells in an adipocyte differentiation medium, in the absence of fetal calf serum, and in the presence of NDGA or one of its derivatives, at the desired concentration, for 12 days ;
  • GPDH activity Maintaining the presence of NDGA or its derivatives until the determination of GPDH activity, this determination step being able to take place at any time between Day 0 and Day 12.
  • a significant reduction in the specific activity of GPDH compared to the level of activity in the absence of treatment can be noted from Day 1, and generally reaches a reduction of at least 50% from Day 3.
  • the determination of the GPDH activity is therefore performed between Day 3 and Day 12; The culture medium is changed every two days until Day 12.
  • the term “stem cell” designates a multipotent cell having a high capacity for self-renewal, significant telomerase activity, and an ability to enter into quiescence. These multipotent cells are capable of differentiating into at least two cell types, and preferably into at least three or four different cell types.
  • preadipocyte designates any precursor cell of the adipocyte already engaged in an adipocyte differentiation pathway. The preadipocytes are also called “adipocyte precursor cells”.
  • CNCM Culture of Microorganisms
  • SGBS Adipocytes (Ref. 11).
  • the anti-adipogenic effects of NDGA and its derivatives are particularly evident in adult stem cells derived from human adipose tissue.
  • HLA class I negative HLA class II negative
  • CD3 negative HLA class II negative
  • telomeres are associated with a normal karyotype, and with significant telomerase activity.
  • the cells are also LIF-R negative.
  • This phenotype is conserved in vitro in a stable manner, that is to say in the absence or in the presence of FGF-2, and at concentrations of fetal calf serum which can exceed 10%.
  • the phenotype is also preserved at high seeding densities, and beyond
  • multipotent human stem cells can be obtained by implementing a process comprising the following steps: a) enzymatic digestion of a sample of adipose tissue originating from a child aged less than ten years, for example aged less than five years ; b) recovery of a cell fraction devoid of adipocytes, containing all the cell types present in the preparation obtained according to (a), with the exception of adipocytes, c) in vitro culture for at least 12 hours, of the cell fraction obtained according to step (b), d) selection of two cellular subpopulations, called “CA” population and “CS” population, the CA population having an adhesion speed of less than 12 hours, and the “CS” population having an adhesion speed greater than 12 hours, e) enrichment of the “CA” population until a population of cells capable of entering a state of quiescence is obtained, f) possibly, induction of proliferation increased stem cells from the “CA” population, for example by adding a growth factor.
  • NDGA significantly inhibits the differentiation of multipotent stem cells into adipocytes, and this at an early stage of differentiation, that is to say before the appearance of cellular or enzymatic markers, specific for adipocytes.
  • NDGA or a derivative thereof, is suitable for use as an active ingredient in a cosmetic, pharmaceutical or food composition, as an inhibitor of the formation of human adipocytes.
  • compositions of the invention are intended for the prevention or treatment of non-pathological overweight, the prevention or treatment of cellulite, the prevention or treatment of dimpling, or skin tightening.
  • compositions based on NDGA, or on its derivatives can also be used in dermo-pharmaceutical applications, in which case, they are intended for the prevention or treatment of pathological overweight implicating a dysfunction of adipocyte differentiation in humans. , such as overweight and obesity.
  • concentrations of NDGA or of its derivatives used in the cosmetic or dermo-pharmaceutical compositions of the invention are of the order of 0.0001% to 10% by weight, relative to the total weight of the composition, for example at a concentration included between 0.001% and 5% by weight, preferably between 0.001% and 1% by weight.
  • compositions of the invention are generally formulated for administration by the cutaneous, percutaneous or transcutaneous route.
  • Administration by the cutaneous route consists of administration to the skin, without breaking the skin, with a view to local action (topical effect) or not (systemic effect).
  • compositions of the invention are intended for pharmaceutical use other than dermo-pharmaceutical, they are formulated for administration by the intradermal, subcutaneous or oral route.
  • the composition based on NDGA, or its derivatives is applied directly to the skin of the parts of the body to be treated, for example on the hips, thighs, lower legs. belly, belly, arms, chest.
  • the cosmetic or dermo-pharmaceutical composition can be incorporated or adsorbed in textiles capable of being placed directly in contact with the skin in order to allow continuous topical delivery.
  • compositions of the invention are presented in the form of an emulsion, milk, lotion, gel, ointment, body oil, soap, spray, stick, capsules, tablets, patch, syrup, solutes, or solutions.
  • the active principle (s) is (or are) incorporated (s) as is (s) in the composition in the form of liposomes, macro-, micro-, nanoparticles, or are absorbed (s) on an organic or inorganic support .
  • compositions of the invention generally contain other ingredients, for example an excipient which is acceptable from the cosmetic or physiological point of view.
  • compositions of the invention may contain any ingredient usually used in cosmetics, such as gelling polymers, surfactants, emulsifying agents, plant extracts, marine extracts, water or liposoluble active principles, biotechnological extracts, sun filters , and essential oils.
  • cosmetics such as gelling polymers, surfactants, emulsifying agents, plant extracts, marine extracts, water or liposoluble active principles, biotechnological extracts, sun filters , and essential oils.
  • the cosmetic and dermo-pharmaceutical compositions of the invention may contain a second active principle.
  • the second active principle can be any active agent commonly used in cosmetics. It is preferably chosen from the following active principles: a slimming active, a draining active, an activator of the microcirculation, a protector of the blood capillaries, or else a mixture of at least two of these active principles.
  • compositions based on NDGA, or its derivatives contain, as an additional active principle, a slimming active, the latter is preferably an activator of lipolysis, such as caffeine, or a derivative of the latter such as siloxanetriol. caffeine alginate, or xanthic base promoting lipolysis.
  • the slimming active can also be an inhibitor of lipoprotein lipase.
  • extracts of plant origin for example containing flavonoids, ruscogenins and derivatives, and aescin contained in the extracts of Ruscus aculeatus.
  • nor-dihydroguaiaretic acid is used as active ingredient in a slimming food composition, for use human.
  • the composition based on NDGA, or its derivatives is formulated for oral ingestion, for example in the form of tablets, granules, rusks, capsules, drinks, cakes, etc.
  • the content of NDGA, or its derivatives is preferably of the order of 0.0001% to 10% by weight, relative to the total weight of the composition, for example at a concentration of between 0.001% and 5% by weight, of preferably between 0.001% and 1% by weight.
  • the term “food composition” includes food supplements for nutritional or physiological use.
  • a composition is said to be slimming when it allows, in the more or less long term, to make or make an individual appear thinner.
  • Such an effect is for example obtained by reducing the volume or density of adipose tissue, or by modifying its appearance. It is for example measured by reducing the diameter of the thighs, belly, hips, arms, etc.
  • FIG. 2 schematic representation of the enzymatic reaction used in the GPDH activity tests.
  • DHAP dihydroxyacetone phosphate.
  • Figure 3 Standard curve: NDGA and Morine.
  • Figure 5 GPDH specific activity in nmoles / min / mg of protein in the presence of 2.5 ⁇ M NDGA and 10 ⁇ M NDGA.
  • Figure 7 GPDH specific activity in nmoles / min / mg of protein in the presence of 2.5 ⁇ M Quercetin and 10 ⁇ M Quercetin
  • Figure 8 NDGA dose-response curve, illustrating the specific GPDH activity in nmoles / min / mg of protein in the presence of different concentrations of NDGA (0 to 10 ⁇ M NDGA). The inhibition of GPDH activity by NDGA is concentration-dependent.
  • Multipotent stem cells are obtained from human adipose tissue, by implementing the method described in international patent application PCT / FR 03/02439. More particularly, the stem cells are obtained by the following process: a) enzymatic digestion of a sample of adipose tissue coming from a healthy child, aged less than ten years, for example from a newborn or a child aged 2 or 3 months to 8 years. They may be male or female children; b) recovery of a cell fraction devoid of adipocytes, containing all the cell types present in the preparation obtained according to (a), (for example preadipocytes, stem cells, endothelial cells, pericytes, mast cells ...) with the exception adipocytes.
  • adipocytes for example preadipocytes, stem cells, endothelial cells, pericytes, mast cells
  • Fat cells can be removed, for example, by centrifugation; c) in vitro culture for at least 12 hours, of the cell fraction obtained according to step (b), and preferably for 12 to 80 hours, for example 12 to 72 hours.
  • the seeding of the cells is preferably carried out at a density of between
  • the culture medium used for this stage of the process is normally a DMEM type culture medium, supplemented with fetal serum without addition of other growth factors.
  • a particularly suitable medium is the following: DMEM + 10% of decomplemented fetal calf serum + antibiotics (100 U / ml of penicillin, 100 ⁇ g / ml of streptomycin) .; d) selection of two cellular subpopulations, called “CA” population and “CS” population, the CA population having an adhesion speed less than 12 hours, and the “CS” population having an adhesion speed greater than 12 hours (for example from 48 to 72 hours).
  • the CS population is found after 12 hours of culture, in suspension in the culture medium, while the CA population adheres to the dishes.
  • Stem cells are found only in the CA subpopulation; e) enrichment of the “CA” population until a population of cells capable of entering a state of quiescence is obtained.
  • This enrichment is obtained by culturing the “CA” population, in a medium without added growth factors, for example the DMEM culture medium + 10% of decomplemented fetal calf serum + antibiotics (100 U / ml of penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin).
  • Cell transfer is performed when the cells reach 80% confluence and the seeding is carried out at high density, that is to say at a density between
  • the cells 1000 to 5000 cells / cm 2 , preferably between 2000 and 2500 cells / cm 2 .
  • the cells are diluted by 2 or 3 at most, for approximately
  • the CA population can be considered to have reached quiescence when there is spontaneous arrest of proliferation at approximately 70% confluence; f) induction of an increased proliferation of stem cells from the “CA” population, for example by addition of a growth factor, such as human FGF-2. After reaching quiescence, the proliferation of cells of the CA population is induced by trypsinization and dilution of the cells in new dishes.
  • the multipotent cells (“stem”) are always maintained at 37 ° C in an incubator ensuring a humid atmosphere (95% air; 5% C0 2 ).
  • Multipotent cells are cultured in DMEM medium enriched with 10% fetal calf serum (FCS) decomplemented (heating 20 minutes at 56 ° C), supplemented with antibiotics (62 ⁇ g / ml of penicillin and 50 ⁇ g / ml of streptomycin) and in human FGF-2 at a final concentration between 2.5 ng / ml and 10ng / ml (Sigma F0291).
  • FCS fetal calf serum
  • the maintenance cultures are sown in boxes 100 mm in diameter at the rate of 2.5 ⁇ 10 5 cells per box.
  • the environment is changed every two days.
  • the cells are trypsinized (Gibco Trypsin-EDTA 1X Invitrogen Corporation) when they reach approximately 70% confluence. They thus retain their cellular plasticity.
  • Adipocyte differentiation protocol :
  • the cells When the cells reach confluence, they are maintained for an additional 24 to 48 hours in the culture medium in the absence of FGF-2. At this stage, adipocyte differentiation can then be induced.
  • the culture medium is changed and the cells are now cultured in DMEM / F12 medium (1: 1), in the absence of fetal calf serum (FCS) but then supplemented with antibiotics (62 ⁇ g / ml of penicillin and 50 ⁇ g / ml of streptomycin) and in various products detailed in the following table: th -
  • the medium is then changed every two days until day 12.
  • the preadipocyte cells (called “Primo 2CA” stem cells) are seeded in 96-well plates at the rate of 5.10 3 cells per well in the proliferation medium (DMEM + 10% FCS) in the absence of human FGF-2. 24 hours later, the differentiation is induced according to the differentiation protocol described above by adding or not adding the products to be tested in the culture medium.
  • MTT ((3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) makes it possible to eliminate all the products which prove to be toxic for the cells.
  • MTT is a soluble yellow dye which is said to be supravital with a metabolization step, i.e. it is absorbed by the cells alive then metabolized by mitochondrial enzymes (succinate dehydrogenase) into a dark blue compound: formazan, which is in the form of purple crystals insoluble in aqueous medium. The formation of formazan depends directly on the activity of succinate dehydrogenase and therefore on the number of viable cells.
  • the medium is devoid of product but contains DMSO.
  • the wells located around the 96-well plate are not sown. Otherwise, they could generate errors when reading with a spectrophotometer.
  • the wells representing the blank remain empty. They measure the background noise.
  • the wells representing the positive controls do not receive any product.
  • the wells receiving the products to be tested (1/1000 of the mother solutions prepared) are seeded at 5.10 3 cells per well.
  • the differentiation medium with or without the drugs to be tested is changed every other day until day 12.
  • ROCHE Cell Proliferation kit I MTT On D12, add 10 ⁇ l of MTT per well (ROCHE Cell Proliferation kit I MTT). The plates are placed in an incubator ensuring a humid atmosphere (95% air; 5% C0 2 ) for 4 hours. Then add 100 ⁇ l per well of the solubilization solution (ROCHE Cell Proliferation kit I MTT). They are then placed in the incubator overnight.
  • the reading is made the next morning with a spectrophotometer at 550 nm.
  • the ODs are then compared with the OD of the control taken as 0% mortality.
  • % mortality [(D.O (0% mortality)) - (D.O (product)) * 100] / (D.O (0% mortality)
  • the plates are put on ice.
  • the culture medium is aspirated.
  • the wells are gently rinsed with PBS (Gibco BRL, Life Technologies) so as not to peel off the cell mat.
  • 200 ⁇ l of cold homogenization buffer (Tris 242g (20 mM); EDTA 37.2 mg (1mM); ⁇ -mercaptoethanol 7 ⁇ l (1mM); H 2 0 100 ml qs; adjust to pH 7.3) are added per well.
  • the cells are then recovered with a policeman or a pipette tip and then placed in 1.5 ml tubes.
  • the homogenate obtained is subjected to a sonic treatment between 20 and 30 Hz for 10 to 15 seconds while keeping the tubes in ice.
  • the initial rate of disappearance of NADH at 340 nm is determined, which makes it possible to calculate the amount of substrate consumed per well, then the specific enzymatic activity after assaying the proteins (see FIG. 2).
  • the dosage is :
  • the cells are seeded in a 24-well plate at the rate of 10 5 cells per well in “conventional” culture medium used for maintenance but without human FGF-2. 24 hours later, the cells are placed in differentiation medium containing or not containing the retained product (NDGA) at increasing concentrations ranging from 2 to 10 ⁇ M.
  • “conventional” culture medium used for maintenance but without human FGF-2 24 hours later, the cells are placed in differentiation medium containing or not containing the retained product (NDGA) at increasing concentrations ranging from 2 to 10 ⁇ M.
  • NDGA retained product
  • the differentiation medium whether or not containing NDGA, is changed every two days.
  • the ddiifffféérreenncciiaattiioonn eesstt aarrrrêêttééee tthhee 1I2 th day and activity assays dehydrogenase glycerophosphatase are made.
  • the selected compounds are tested in triplicate at two different concentrations
  • NDGA appears to be non-cytotoxic and anti-adipogenic (Table 4) at the concentrations tested.
  • the dose-response curve provides information on the specific activity (in nmoles / min / mg of protein) as a function of the different concentrations of NDGA (0; 2; 4; 6; 8 and 10 ⁇ M). The results are reported in Table 4 and Figure 8. The IC50 (concentration required for 50% inhibition) is 4.5 ⁇ M.
  • nor-dihydroguaiaretic acid appears to be non-toxic and has an anti-adipogenic effect on human cells during their differentiation into adipocytes. It is therefore suitable for use in therapy and in cosmetics, in pharmaceuticals (or in therapy) and in food.
  • NDGA-based compositions can be included in cosmetic formulations of the following types: SLIMMING CREAM
  • STEARIC ACID (STEARIC ACID) 2.40
  • OLEIC ACID OLEIC ACID 0.50

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou d'un dérivé de celui-ci, comme principe actif dans une composition cosmétique ou alimentaire, en tant qu'inhibiteur de la formation d'adipocytes humains ou comme principe actif dans une composition dermo-pharmaceutique ou pharmaceutique pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention de pathologies impliquant un dysfonctionnement de la différenciation adipocytaire chez l'homme.

Description

UTILISATION DE L ' ACIDE NOR-DIHYDROGUAIARETIQUE EN TANT QU' INHIBITEUR DE LA FORMATION ADIPOCYTAIRE HUMAINE
La présente invention concerne l'utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique (le « NDGA ») ou d'un dérivé de celui-ci, comme agent anti-adipogénique dans des préparations cosmétiques, dermo-pharmaceutiques, pharmaceutiques et alimentaires, notamment à usage humain.
L'invention concerne également des compositions cosmétiques, dermo-pharmaceutiques, pharmaceutiques et alimentaires contenant le NDGA en quantité suffisante pour inhiber la formation d'adipocytes humains. L'invention englobe aussi des méthodes pour la prévention ou le traitement de surcharges pondérales ou de tout autre condition impliquant une différenciation adipocytaire aberrante ou indésirable, chez l'homme, en utilisant des compositions à base de
NDGA ou de ses dérivés.
L'adipocyte est la principale cellule du tissu adipeux, et comporte non seulement l'équipement nécessaire à la régulation de la balance énergétique (sous contrôle hormonal), mais joue également un rôle complexe et dynamique interférant sur les réponses immunologiques, les maladies vasculaires et la régulation de l'appétit, grâce à ses capacités de cellule endocrine, autocrine et paracrine. Les adipocytes, cellules hautement spécialisées, stockent l'énergie sous forme de triglycérides et la libèrent sous forme d'acides gras. Le développement pondéral du tissu adipeux est le reflet direct de l'état des réserves d'énergie lipidique. Les cellules précurseurs des adipocytes (les préadipocytes), peuvent se différencier en adipocyte tout au long de la vie. Cette différenciation est stimulée par des hormones ou par des nutriments comme les acides gras. Le développement excessif du tissu adipeux conduisant à l'obésité fait intervenir d'une part, une hypertrophie adipocytaire (augmentation de la taille cellulaire) et d'autre part, une hyperplasie cellulaire, c'est à dire une augmentation du nombre des cellules adipeuses.
L'adipocyte mature, qui est une cellule différenciée, a perdu toute capacité de division. Par conséquent, l'augmentation du nombre des adipocytes, observée au cours du développement du tissu adipeux, résulte en fait de la sur-prolifération et de la différenciation de précurseurs cellulaires en adipocytes, les précurseurs étant présents dans la fraction vasculaire du stroma de ce tissu.
Dans la mesure où le développement du tissu adipeux résulte en partie de la différenciation de précurseurs cellulaires, il est intéressant, dans la recherche de molécules susceptibles d'être efficaces dans la lutte contre la surcharge pondérale, d'identifier des composés capables d'inhiber la différenciation adipocytaire. A ce jour, un certain nombre d'inhibiteurs de différenciation adipocytaire sur cellules 3T3-L1 notamment ou d'autres lignées cellulaires ont été publiés, par exemple, la [1 ,25]-dihydroxy- vitamine D3 (Kelly, K.A. et al., Réf. 1) ou I 'acide rétinoïque à forte concentration (Hilda et al., Réf. 2) alors que ce dernier est décrit comme activateur de la différenciation adipocytaire à faible concentration (Safanova et al., Réf. 3 et 4), l'octoanoate (Han et al., Réf. 5) et la vitamine
K2 (Palacios et al., Réf. 6). Ceci étant, ces molécules sont peu ou pas adaptées, voire interdites, pour une utilisation en cosmétique, pharmaceutique ou alimentaire.
Il existe donc aujourd'hui un besoin d'identifier des molécules ayant un effet inhibiteur sur la formation d'adipocytes humains, et qui soient adaptées à une utilisation cosmétique, thérapeutique ou alimentaire.
Les présents inventeurs ont criblé un nombre important de molécules à la recherche d'agents anti-adipogéniques. Ils ont découvert, de manière surprenante, que l'acide nor- dihydroguaiarétique (le « NDGA ») est capable d'inhiber de façon significative, la différenciation adipocytaire humaine, et ce à un stade très précoce du processus de différenciation.
L'activité anti-adipogénique du NDGA sur des cellules humaines est inattendue pour plusieurs raisons. Bien que Thuillier P et al., (Référence 7) aient récemment montré que certains inhibiteurs de lipoxygénase (LOX), dont le NDGA, la quercétine et la morine, inhibent la différenciation de kératinocytes murins, probablement via une action inhibitrice sur les récepteurs PPA α et PPARγ (« Peroxisome Proliferator-Activated Receptors α et γ" »), les présents inventeurs ont constaté que ces résultats ne pouvaient être extrapolés à la différenciation adipocytaire humaine. En effet des essais menés par les inventeurs dans le cadre de la présente invention démontrent que la quercétine et la morine n'ont aucun effet anti- adipogénique sur des cellules humaines.
En outre, des travaux effectués par Ye et Serrero (Référence 8), sur une lignée cellulaire adipogénique murine (lignée 1246) ont montré que le NDGA n'a aucun effet sur l'expression de l'ADRP (« adipose differentiation related protein ») qui est un marqueur précoce de la différenciation adipocytaire (Jang & Serrero, Référence 9).
Il ressort de ces différents travaux que les effets du NDGA sur la différenciation adipocytaire humaine ne pouvaient être prévus sur la base de ses effets sur des cellules de rongeurs.
Le NDGA a déjà été utilisé dans des préparations cosmétiques et thérapeutiques, notamment pour ses effets anti-repousse poil (WO 00/28959), ses effets anti-acnéiques (FR 2830195), ses effets anti-oxydants (Réf. 12), ses effets anti-inflammatoires (US 4,530,844 et US 4,568,696), et ses effets anti-tumoraux (EP 297733). Ceci étant, ce composé n'a pas à ce jour été utilisé en tant qu'inhibiteur de différenciation adipocytaire.
La présente invention concerne donc l'utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique (Cι8H22θ ), ou de ses dérivés, comme principe actif dans une composition cosmétique, dermo- pharmaceutique, pharmaceutique ou alimentaire, en tant qu'inhibiteur de la formation d'adipocytes humains.
Notamment, la présente invention concerne l'utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22θ4), ou d'un dérivé de celui-ci, comme principe actif dans une composition cosmétique, en tant qu'inhibiteur de la formation d'adipocytes humains ou comme principe actif dans une composition dermo-pharmaceutique pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention de pathologies impliquant un dysfonctionnement de la différenciation adipocytaire chez l'homme.
L'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22θ4) présente la formule chimique suivante
Figure imgf000004_0001
Le NDGA est également connu sous les noms de : β'γ-diméthyl-α-δ-bis (3,4-dihydroxyphenyl) butane 1 ,2-benzenediol,4,4'-(2,3-diméthyl-1 ,4-butane) 1 ,4-Bis(3,4-dihydroxyphenyl)-2,3-dimethylbutane 4,4'-(2,3-dimethyI-1 ,4-butanediyl)bis(pyrocatechol) Butane,1 ,4-bis(3,4-dihydroxyphenyl)-2,3-dimethyI- Masoprocol Dihydronorguaiaretic acid
Dans le contexte de l'invention le NDGA peut être une molécule naturelle, obtenue par extraction végétale, par exemple de la plante Larrea divaricata ou Larrea tridentata. Le NDGA peut être purifié à partir de l'extrait végétal, ou l'extrait brut peut être utilisé. Le NDGA peut également être produit par synthèse chimique.
Dans le contexte de l'invention, un dérivé du NDGA signifie toute molécule étant structurellement apparentée au NDGA, et ayant une activité anti-adipogénique telle que définie ci-dessous. De préférence les dérivés ont la formule I :
Figure imgf000005_0001
R20
FORMULE I
dans laquelle R ,1 , R sont, indépendamment l'un de l'autre, soit (-H), soit un radical méthyl
(-CH3) soit un radical éthyl (-C2H5), soit un radical méthoxy (-COCH3) ou éthoxy (-
COC2H5),
R3 , R4 , R5 , R6 , R10 , R11 , R12 et R13 sont indépendamment les uns des autres (-H), ou un radical méthyl (-CH3) ou un radical éthyl (-C2H5),
R7, R8 et R9 sont indépendamment les uns des autres soit (-H), soit (-OH), soit un radical méthyl (-CH3) soit un radical éthyl (-C2H5), soit un radical méthoxy (-COCH3) ou éthoxy (-
COC2H5).
De préférence, dans la formule I, R1 et R2 représentent (-H), R7 et R8 représentent (-OH), R9 rreepprréésseente (H), et R3 à R6 et R10 à R13 représentent indépendamment (-H), ou un radical méthyl
(-CH3).
Selon l'invention, le NDGA et ses dérivés exercent un effet inhibiteur sur la formation d'adipocytes humains. Cet effet, également désigné comme un « effet anti-adipogénique », signifie une inhibition de la différenciation de cellules souches humaines ou de cellules précurseurs préadipocytaires humaines, en adipocytes. La différenciation adipocytaire se caractérise principalement par une modification morphologique des cellules précurseurs (passage de la forme fibroblastique à une forme ronde avec accumulation de gouttelettes de triglycérides), un changement phénotypique, et l'apparition des marqueurs spécifiques de l'adipocyte, par exemple le hPPARγ2 (récepteur γ2 humain activé par les proliférateurs de péroxisome ou "human peroxisome proliferator activated receptor γ"), et la haP2 (protéine humaine de liaison des acides gras ou "human adipocyte fatty acid binding protein"). Une induction de l'expression de certaines enzymes, par exemple la glycérophosphate déshydrogénase (GPDH), est également constatée au cours de la différenciation adipocytaire.
Selon l'invention, l'inhibition par le NDGA de la formation d'adipocytes a lieu à un stade précoce de la différenciation, notamment avant l'apparition de marqueurs spécifiques d'adipocytes, tels que le hPPARγ2 ou la haP2, avant l'expression d'activité enzymatique spécifique, telle que l'activité GPDH, et avant la formation d'adipocytes chargés de triglycérides.
L'effet anti-adipogénique du NDGA et de ses dérivés peut être mis en évidence in vitro en mesurant soit le niveau d'expression de marqueurs adipocytaires, soit le niveau d'activité enzymatique spécifique, présentés par des cellules humaines multipotentes en présence du NDGA ou de ses dérivés, après plusieurs jours de culture dans un milieu de différenciation adipocytaire. Ces niveaux sont comparés avec ceux présentés par les mêmes cellules en l'absence du NDGA ou de ses dérivés. Les cellules ayant été exposées au milieu contenant du NDGA présentent un niveau d'expression des marqueurs adipocytaires, ou un niveau d'activité enzymatique, largement inférieur aux niveaux constatés en l'absence du NDGA ou de ses dérivés. Pour effectuer les mesures de niveau d'expression, le hPPARγ2 ou la haP2 conviennent comme marqueurs spécifiques adipocytaires. Leurs niveaux d'expression peuvent être déterminés par dosage d'ARNm ou de protéines. Pour effectuer les mesures de niveaux d'activité enzymatique, l'activité GPDH peut être utilisée.
De préférence, l'effet anti-adipogénique du NDGA et de ses dérivés est mis en évidence en mesurant l'activité glycérophosphate déshydrogénase (GPDH), par exemple en mettant en oeuvre les essais décrits dans les protocoles expérimentaux ci-dessous.
Le principe du dosage GPDH est résumé sur ce schéma: GPDH
Dihydroxyacétone phosphate + NADH - Glycérophosphate + NAD
La vitesse initiale de disparition du NADH est déterminée à 340nm (en présence de NADH, DHAP et du lysat cellulaire), permettant ainsi de calculer la quantité de substrat dégradé, et par conséquent, l'activité enzymatique spécifique (après dosage des protéines). Dans le contexte de l'invention, une inhibition significative de la différenciation adipocytaire signifie une diminution significative du point de vue statistique de l'activité spécifique de la GPDH, par rapport aux cellules, différenciées en adipocytes en l'absence de traitement. Cette inhibition significative se traduit par exemple par une diminution d'au moins 10%, ou d'au moins 15% ou 30 % de l'activité spécifique de la GPDH, par rapport aux cellules différenciées en adipocytes en l'absence de traitement, de préférence d'au moins 50 %, plus particulièrement d'au moins 60 %, et préférentiellement d'au moins 80% de l'activité spécifique de la GPDH, par rapport au contrôle.
Le procédé de mise en évidence de l'effet anti-adipogénique comporte de préférence les étapes suivantes (voir Figure 1) :
Multiplication des cellules souches ou précurseurs jusqu'à confluence ;
Initiation de la différenciation (Jour 0) par mise en culture des cellules dans un milieu de différenciation adipocytaire, en absence de sérum de veau foetal, et en présence du NDGA ou de l'un de ses dérivés, à la concentration désirée, pendant 12 jours ;
Maintien de la présence du NDGA ou de ses dérivés jusqu'à la détermination de l'activité GPDH, cette étape de détermination pouvant intervenir à tout moment entre le Jour 0 et le Jour 12. Une réduction significative de l'activité spécifique de la GPDH par rapport au niveau d'activité en l'absence de traitement peut être constatée à partir de Jour 1 , et atteint généralement une réduction d'au moins 50% à partir de Jour 3. De préférence la détermination de l'activité GPDH est donc effectuée entre le Jour 3 et le Jour 12; Le milieu de culture est changé tous les deux jours jusqu'au Jour 12.
Les effets anti-adipogéniques du NDGA, et de ses dérivés, se manifestent sur des cellules souches adultes humaines, ainsi que sur des préadipocytes humains. Dans le contexte de l'invention, le terme « cellule souche » désigne une cellule multipotente ayant une capacité d'autorenouvellement élevée, une activité télomérase significative, et une capacité à rentrer en quiescence. Ces cellules multipotentes sont capables de se différencier en au moins deux types cellulaires, et de préférence en au moins trois ou quatre types cellulaires différents. Le terme « préadipocyte » désigne toute cellule précurseur de l'adipocyte déjà engagée dans une voie de différenciation adipocytaire. Les préadipocytes sont également désignés « cellules précurseurs des adipocytes ». Comme exemple de préadipocytes humains susceptibles d'être utilisés pour la mise en évidence in vitro de l'effet antiadipogénique du NDGA ou de ses dérivés, l'on peut citer la lignée cellulaire de préadipocytes bruns humains PAZ-6 (Réf. 10, et demande de brevet internationale WO 9634100). Cette lignée a été déposée auprès de la Collection Nationale de
Culture de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur, sous le numéro 1-1531. L'on peut également citer les cellules dénommées « SGBS Adipocytes » (Réf. 11). Les effets anti-adipogéniques du NDGA et ses dérivés se manifestent de façon particulièrement évidente sur des cellules souches adultes dérivées du tissu adipeux humain. Comme exemple de ces cellules souches préférées, l'on peut citer des cellules multipotentes décrites dans la demande de brevet internationale n° PCT/FR 03/02439. Plus précisément, ces cellules multipotentes, après avoir atteint la quiescence, présentent de façon stable le phénotype suivant in vitro :
HLA classe I négative, HLA classe II négative, CD3 négative,
CD13 positive, Oct-4 positive, Rex-1 positive, ABCG2 positive.
Ces caractéristiques phénotypiques s'associent à un caryotype normal, et à une activité télomérase significative. De préférence les cellules sont également LIF-R négatives. Ce phénotype est conservé in vitro de façon stable, c'est-à-dire en l'absence ou en présence de FGF-2, et à des concentrations de sérum de veau foetal qui peuvent dépasser 10%. Le phénotype est également conservé à des densités d'ensemencement élevées, et au-delà de
140 doublements de populations.
Ces cellules souches humaines multipotentes peuvent être obtenues en mettant en œuvre un procédé comprenant les étapes suivantes : a) digestion enzymatique d'un prélèvement de tissu adipeux provenant d'un enfant âgé de moins de dix ans, par exemple âgé de moins de cinq ans ; b) récupération d'une fraction cellulaire dépourvue d'adipocytes, contenant tous les types cellulaires présents dans la préparation obtenue selon (a), à l'exception des adipocytes, c) culture in vitro pendant au moins 12 heures, de la fraction cellulaire obtenue selon l'étape (b), d) sélection de deux sous-populations cellulaires, dites population « CA » et population « CS », la population CA présentant une vitesse d'adhésion inférieure à 12 heures, et la population « CS » présentant une vitesse d'adhésion supérieure à 12 heures, e) enrichissement de la population « CA » jusqu'à l'obtention d'une population de cellules capables de rentrer dans un état de quiescence, f) éventuellement, induction d'une prolifération accrue des cellules souches de la population « CA », par exemple par addition d'un facteur de croissance. Dans le cadre de la présente invention, il a été démontré que le NDGA inhibe, de façon importante, la différenciation de cellules souches multipotentes en adipocytes, et cela à un stade précoce de la différenciation, c'est-à-dire avant l'apparition des marqueurs cellulaires ou enzymatiques, spécifiques des adipocytes. De ce fait, le NDGA, ou un dérivé de celui-ci, se prête à une utilisation comme principe actif dans une composition cosmétique, pharmaceutique ou alimentaire, en tant qu'inhibiteur de la formation d'adipocytes humains.
Lorsque les compositions anti-adipogéniques de l'invention sont utilisées dans un contexte cosmétique, elles sont destinées à la prévention ou au traitement des surcharges pondérales non-pathologiques, à la prévention ou au traitement de la cellulite, à la prévention ou au traitement de capitons, ou au raffermissement cutané.
Les compositions à base de NDGA, ou de ses dérivés, peuvent également être utilisées dans des applications dermo-pharmaceutiques, auquel cas, elles sont destinées à la prévention ou au traitement des surcharges pondérales pathologiques impliquant un dysfonctionnement de la différenciation adipocytaire chez l'homme, tels que le surpoids et l'obésité.
Les concentrations de NDGA ou de ses dérivés utilisées dans les compositions cosmétiques ou dermo-pharmaceutiques de l'invention sont de l'ordre de 0.0001 % à 10% en poids, par rapport au poids total de la composition, par exemple à une concentration comprise entre 0.001 % et 5% en poids, de préférence entre 0.001 % et 1 % en poids.
Les compositions anti-adipogéniques cosmétiques et dermo-pharmaceutiques de l'invention sont généralement formulées pour une administration par voie cutanée, percutanée ou transcutanée. L'administration par voie cutanée consiste en une administration sur la peau, sans effraction de la peau, en vue d'une action locale (effet topique) ou non (effet systémique).
L'administration par voie percutanée, ou transcutanée conduit à une diffusion à travers les structures cutanées et sous-cutanées, et éventuellement à un effet systémique, après résorption sanguine. Lorsque les compositions anti-adipogéniques de l'invention sont destinées à une utilisation pharmaceutique autre que dermo-pharmaceutique, elles sont formulées pour une administration par voie intradermique, sous-cutanée ou orale.
Selon les aspects cosmétique et dermo-pharmaceutique de l'invention, la composition à base du NDGA, ou de ses dérivés, est appliquée directement sur la peau des parties du corps à traiter, par exemple sur les hanches, les cuisses, le bas-ventre, le ventre, les bras, la poitrine.
Alternativement, la composition cosmétique ou dermo-pharmaceutique peut être incorporée ou adsorbée dans des textiles susceptibles d'être mis directement au contact de la peau afin de permettre une délivrance topique continue.
Les compositions de l'invention sont présentées sous forme d'émulsion, de lait, de lotion, de gel, de pommade, d'huile corporelle, de savon, de spray, de stick, de gélules, de comprimés, de patch, de sirop, de solutés, ou de solutions. Le ou les principes actifs est (ou sont) incorporé(s) tel(s) quel(s) dans la composition sous forme de liposomes, macro-, micro-, nanoparticules, ou sont absorbé(s) sur un support organique ou minéral.
Hormis le NDGA, ou ses dérivés, les compositions de l'invention contiennent généralement d'autres ingrédients, par exemple un excipient acceptable du point de vue cosmétique ou physiologique.
Pour une utilisation cosmétique, les compositions de l'invention peuvent contenir tout ingrédient habituellement utilisé en cosmétique, tels que polymères gélifiants, agents tensioactifs, agents émulsifiants, extraits de plantes, extraits marins, principes actifs hydro- ou liposolubles, extraits biotechnologiques, filtres solaires, et huiles essentielles.
En outre, les compositions cosmétiques et dermo-pharmaceutiques de l'invention peuvent contenir un deuxième principe actif. Dans le cas d'une composition cosmétique, le deuxième principe actif peut être tout agent actif utilisé de façon courante en cosmétique. Il est de préférence choisi parmi les principes actifs suivants : un actif amincissant, un actif drainant, un activateur de la microcirculation, un protecteur des capillaires sanguins, ou encore un mélange d'au moins deux de ces principes actifs.
Lorsque les compositions à base de NDGA, ou de ses dérivés, contiennent, comme principe actif additionnel, un actif amincissant, celui-ci est de préférence un activateur de lipolyse, tel que la caféine, ou un dérivé de celle-ci comme le siloxanetriol alginate de caféine, ou une base xanthique favorisant la lipolyse. L'actif amincissant peut également être un inhibiteur de la lipoprotéine lipase.
Comme exemple de deuxième principe actif stimulant la microcirculation cutanée, l'on peut citer des extraits d'origine végétale, contenant par exemple des flavonoïdes, des ruscogénines et dérivés, et de l'aescine contenus dans les extraits de Ruscus aculeatus.
Selon une autre variante de l'invention, l'acide nor-dihydroguaiarétique, ou un dérivé de celui-ci, est utilisé comme principe actif dans une composition alimentaire amincissante, à usage humain. Selon cet aspect de l'invention, la composition à base de NDGA, ou de ses dérivés, est formulée pour une ingestion orale, par exemple sous forme de comprimés, granules, biscottes, capsules, boissons, gâteaux etc. La teneur en NDGA, ou ses dérivés, est de préférence de l'ordre de 0.0001 % à 10% en poids, par rapport au poids total de la composition, par exemple à une concentration comprise entre 0.001% et 5% en poids, de préférence entre 0.001 % et 1 % en poids. Dans le contexte de l'invention, le terme « composition alimentaire » inclut les compléments alimentaires à usage nutritionnel ou physiologique.
Selon la présente invention, une composition est dite amincissante lorsqu'elle permet, à plus ou moins long terme, de rendre ou de faire paraître un individu plus mince. Un tel effet est par exemple obtenu par réduction du volume ou de la densité des tissus adipeux, ou par modification de son aspect. Il est par exemple mesuré par la réduction du diamètre des cuisses, du ventre, des hanches, des bras, etc....
Différents aspects de l'invention sont illustrés dans les figures :
Figure 1 : représentation schématique de l'essais d'activité GPDH à 340 nm (mesure du NAD consommé en présence de dihydroxyacétone phosphate). Abbréviations : J = jour; GPDH = Glycérophosphate déshydrogénase.
Figure 2 : représentation schématique de la réaction enzymatique utilisée dans les essais d'activité GPDH. Abbréviations : DHAP = dihydroxyacétone phosphate.
Figure 3 : Courbe étalon : NDGA et Morine.
Figure 4 : Courbe étalon : Quercétine.
Figure 5 : Activité spécifique GPDH en nmoles/min/mg de protéine en présence de 2.5 μM NDGA et lO μM NDGA.
Figure 6 : Activité spécifique GPDH en nmoles/min/mg de protéine en présence de 2.5 μM
Morine et 10 μM Morine.
Figure 7 : Activité spécifique GPDH en nmoles/min/mg de protéine en présence de 2.5 μM Quercétine et 10 μM Quercétine
Figure 8 : Courbe dose-réponse NDGA, illustrant l'activité spécifique GPDH en nmoles/min/mg de protéine en présence de différentes concentrations de NDGA (0 à 10 μM NDGA). L'inhibition de l'activité GPDH par le NDGA est concentration-dépendent. EXEMPLES
MATERIEL ET METHODES
A.1 CULTURE DE CELLULES MULTIPOTENTES HUMAINES :
Des cellules souches multipotentes (appelées « cellules Primo 2CA »), sont obtenues à partir de tissu adipeux humain, par la mise en oeuvre du procédé décrit dans la demande de brevet internationale PCT/FR 03/02439. Plus particulièrement, les cellules souches sont obtenues par le procédé suivant : a) digestion enzymatique d'un prélèvement de tissu adipeux provenant d'un enfant sain, âgé de moins de dix ans, par exemple d'un nouveau-né ou d'un enfant âgé de 2 ou 3 mois à 8 ans. Il peut s'agir d'enfants de sexe masculin ou féminin ; b) récupération d'une fraction cellulaire dépourvue d'adipocytes, contenant tous les types cellulaires présents dans la préparation obtenue selon (a), (par exemple préadipocytes, cellules souches, cellules endothéliales, péricytes, mastocytes...) à l'exception des adipocytes. Les adipocytes peuvent être éliminés, par exemple, par centrifugation ; c) culture in vitro pendant au moins 12 heures, de la fraction cellulaire obtenue selon l'étape (b), et de préférence pendant 12 à 80 heures, par exemple 12 à 72 heures. L'ensemencement des cellules est de préférence effectué à une densité comprise entre
1000 et 5000 cellules /cm2, par exemple 1000 à 3500 cellules /cm2 . Le milieu de culture utilisé pour cette étape du procédé est normalement un milieu de culture type DMEM, additionné de sérum foetal sans ajout d'autres facteurs de croissance. Par exemple, un milieu particulièrement approprié est le suivant : DMEM+ 10 % de sérum de veau fœtal décomplémenté + antibiotiques (100 U/ml de pénicilline, 100 μg / ml de streptomycine).; d) sélection de deux sous-populations cellulaires, dites population « CA » et population « CS », la population CA présentant une vitesse d'adhésion inférieure à 12 heures, et la population « CS » présentant une vitesse d'adhésion supérieure à 12 heures (par exemple de 48 à 72h). La population CS se trouve après 12 heures de culture, en suspension dans le milieu de culture, alors que la population CA adhère aux boîtes. Les cellules souches se retrouvent uniquement dans la sous-population CA ; e) enrichissement de la population « CA » jusqu'à l'obtention d'une population de cellules capables de rentrer dans un état de quiescence. Cette enrichissement est obtenue par mise en culture de la population « CA », dans un milieu sans facteurs de croissance rajouté, par exemple le milieu de culture DMEM+ 10% de sérum de veau fœtal décomplémenté + antibiotiques (100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine). Un transfert cellulaire est effectué lorsque les cellules arrivent à 80% de confluence et l'ensemencement est effectué à haute densité, c'est-à-dire à une densité comprise entre
1000 à 5000 cellules / cm2, de préférence entre 2000 et 2500 cellules / cm2. A chaque transfert cellulaire, les cellules sont diluées par 2 ou par 3 au maximum, pendant environ
50-80 doublements de population (stade auquel la population CA est fortement enrichie en cellules souches.) La population CA peut être considérée comme ayant atteint la quiescence lorsqu'il y a arrêt spontané de la prolifération à 70% de confluence environ ; f) induction d'une prolifération accrue des cellules souches de la population « CA », par exemple par addition d'un facteur de croissance, tel que le FGF-2 humain. Après avoir atteint la quiescence, la prolifération des cellules de la population CA est induite par trypsinisation et dilution des cellules dans de nouvelles boîtes.
Les cellules multipotentes (« souches ») sont toujours maintenues à 37°C dans un incubateur assurant une atmosphère humide (95% air ; 5% C02).
Milieu de culture pour les cellules souches en prolifération:
Les cellules multipotentes sont cultivées en milieu DMEM enrichi par 10% de sérum de veau fœtal (FCS) décomplémenté (chauffage 20 minutes à 56°C), supplémenté en antibiotiques (62 μg/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine) et en FGF-2 humain à une concentration finale entre 2,5 ng/ml et 10ng/ml (Sigma F0291).
Entretien:
Les cultures d'entretien sont ensemencées dans des boîtes de 100 mm de diamètre à raison de 2,5.105 cellules par boîte. Le milieu est changé tous les deux jours. Les cellules sont trypsinées (Gibco Trypsine-EDTA 1X Invitrogen Corporation) lorsqu'elles arrivent environ à 70% de confluence. Elles conservent ainsi leur plasticité cellulaire.
Protocole de différenciation adipocytaire:
Lorsque les cellules atteignent la confluence, celles-ci sont maintenues 24h à 48h supplémentaires dans le milieu de culture en l'absence de FGF-2. A ce stade, la différenciation adipocytaire peut alors être induite.
A J0 (début de la différenciation), le milieu de culture est changé et les cellules sont désormais cultivées en milieu DMEM/F12 (1 : 1), en absence de sérum de veau fœtal (FCS) mais alors supplémenté en antibiotiques (62 μg/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine) et en différents produits détaillés dans le tableau suivant :
Figure imgf000014_0001
ème -
Le milieu est ensuite changé tous les deux jours jusqu'au 12 jour.
A.2 Screening des produits - test de cvtotoxicite au MTT
Préparation des solutions mères des produits testés :
Figure imgf000014_0002
Les cellules préadipocytaires (appelées cellules souches « Primo 2CA ») sont ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 5.103 cellules par puits dans le milieu de prolifération (DMEM +10% FCS) en l'absence de FGF-2 humain. 24 heures après, la différenciation est induite selon le protocole de différenciation décrit plus haut en ajoutant ou pas les produits à tester dans le milieu de culture.
Le test au MTT ((3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) permet d'éliminer tous les produits qui s'avèrent toxiques pour les cellules. Le MTT est un colorant soluble jaune qui est dit supravital avec une étape de métabolisation, c'est à dire qu'il est absorbé par les cellules vivantes puis métabolisé par les enzymes mitochondriales (succinate déshydrogénase) en un composé bleu foncé : le formazan, qui se présente sous forme de cristaux violets insolubles en milieu aqueux. La formation de formazan dépend directement de l'activité de la succinate déshydrogénase et donc du nombre de cellules viables.
Afin d'obtenir des concentrations finales de l'ordre du μM, 1 μl des solutions mères préparées auparavant est pris dans 1 ml de milieu de différenciation adipocytaire. 100 μl de ces dilutions sont ensuite déposés par puits en duplicat.
Pour les contrôles positifs, le milieu est dépourvu de produit mais contient du DMSO.
Les puits situés au pourtour de la plaque de 96 puits ne sont pas ensemencés. Ils pourraient sinon générer des erreurs lors de la lecture au spectrophotomètre. Les puits représentant le blanc restent vides. Ils mesurent le bruit de fond. Les puits représentant les contrôles positifs (mortalité de base prise comme 0 % de mortalité), ne reçoivent aucun produit. Les puits recevant les produits à tester (1/1000 des solutions mères préparées) sont ensemencés à 5.103 cellules par puits.
Le milieu de différenciation avec ou sans les drogues à tester est changé tous les deux jours jusqu'au 12èmejour.
A J12, on ajoute 10 μl de MTT par puits (ROCHE Cell Prolifération kit I MTT). Les plaques sont mises dans un incubateur assurant une atmosphère humide (95% air ; 5% C02) pendant 4 heures. On y ajoute ensuite 100 μl par puits de la solution de solubilisation (ROCHE Cell Prolifération kit I MTT). Elles sont ensuite placées dans l'incubateur pendant la nuit.
La lecture est faite le lendemain matin au spectrophotomètre à 550 nm.
Les DO sont alors comparées à la DO du témoin prise comme 0% de mortalité.
% mortalité = [(D.O (0 % mortalité)) - (D.O (produit)) * 100] / (D.O (0 % mortalité)
A.3 CRIBLAGE PAR ESSAI DE L'ACTIVITE GLYCEROPHOSPHATE DESHYDROGENASE (GPDH)
Une fois le test de cytotoxicité au MTT terminé, certains produits ont été sélectionnés pour leur absence de cytotoxicité. Afin de suivre l'effet éventuel de ces produits sur la différenciation adipocytaire, ils sont alors criblés par des essais d'activité GPDH à 340 nm (mesure du NAD réduit consommé en présence de dihydroxyacétone phosphate). (Voir Figure 1) Principe et protocole de dosage de la Glycérophosphate déshydrogénase GPDH : Une différenciation adipocytaire est réalisée sur des plaques 24 puits. L'ensemencement de départ est de 105 cellules par puits, 24 heures avant le début de la différenciation.
A J12, les plaques sont mises sur de la glace. Le milieu de culture est aspiré. Les puits sont délicatement rincés avec du PBS (Gibco BRL, Life Technologies) afin de ne pas décoller le tapis cellulaire. 200 μl de tampon d'homogénéisation froid (Tris 242g (20 mM) ; EDTA 37,2 mg (1mM) ; β-mercaptoéthanol 7 μl (1mM) ; H20 100 ml qsp ; ajuster à un pH de 7,3) sont ajoutés par puits. Les cellules sont ensuite récupérées avec un Policeman ou une pointe de pipette puis déposées dans des tubes de 1 ,5 ml. L'homogénat obtenu est soumis à un traitement sonique entre 20 et 30 Hz pendant 10 à 15 secondes tout en gardant les tubes dans la glace. On détermine la vitesse initiale de disparition du NADH à 340 nm ce qui permet de calculer la quantité de substrat consommé par puits, puis l'activité enzymatique spécifique après dosage des protéines (Voir Figure 2).
Le dosage :
Dans une cuve de spectrophotomètre sont ajoutés : 830 μl d'eau, 100 μl de tampon de dosage (Triéthanolamine 14,9g (1 M) ; β-mercaptoéthanol 7 μl (1 mM) ; EDTA 930 mg (25mM) ; H20 100 ml qsp ; ajuster le pH à 7,7) à température ambiante, 10 μl de NADH à 12,5 mM en concentration initiale (Roche).
On vérifie que la D.O de base se trouve autour de 0,6 à 0,8. Puis on ajoute 50 μl d'homogénat et 10 μl de DHAP à 20 mM initial (Roche).
On lit ensuite la variation de D.O à 340 nm.
Les calculs :
Le coefficient d'extinction du NADH à 340 nm est de 6220 (la D.O à 340 nm d'une solution de NADH 1 M = 6220). D'où pour une solution à 1 nmole/ml → 0,00622
D.O /mn (vitesse d'oxydation du NADH) * Volume du tampon d'homogénéisation (200 μl)
0,00622 * Volume d'homogénat dosé (en général 50 μl)
exprimé en nmole/min/puits Exemple de calcul :
Activité = 12 nmoles/min pour 50 μl d'homogénat Au total pour 200 μl d'homogénat : (12 * 200) 150 = 48 nmoles/min/puits
Dosage des protéines : pour 5 μl d'homogénat on obtient une D.O = 0.1 Donc pour 200 μl d'homogénat (1 puits) = (200 * 0.1) / 5 = 4 Courbe étalon BSA : 1 μg de protéine = 0,05 D.O
Donc pour 1 puits : (4 * 1) / 0.05 = 80 μg de protéines
AS = (48 * 1000) / 80 = 600 nmoles/min/mg de protéines
A.5 COURBE DOSE-REPONSE
Les cellules sont ensemencées dans une plaque 24 puits à raison de 105 cellules par puits dans du milieu de culture « classique » utilisé pour l'entretien mais sans FGF-2 humain. 24 heures après, les cellules sont mises dans du milieu de différenciation contenant ou pas, le produit retenu (NDGA) à des concentrations croissantes allant de 2 à 10 μM.
Le milieu de différenciation, contenant ou pas le NDGA, est changé tous les deux jours. La ddiifffféérreenncciiaattiioonn eesstt aarrrrêêttééee aauu 1I2ème jour et des dosages d'activité de la glycérophosphatase déshydrogénase sont effectués.
B. RESULTATS
B.1 TEST DE CYTOTOXICITE AU MTT
Tous les composés sont testés en duplicat à différentes concentrations finales (10 ; 5 ; 1 ; 0,5 ; 0,1 μM).
Les résultats obtenus au test de cytotoxicité au MTT sont rapportés dans le tableau 1.
On constate que les trois composés testés (la quercétine, l'acide nor-dihydroguaiarétique, la morine), ne présentent aucune toxicité pour les cellules.
Tous les composés sont donc testés en fin de différenciation adipocytaire pour leur effet anti- adipogénique par essais d'activité GPDH B.2 CRIBLAGE PAR DES ESSAIS D'ACTIVITE DE LA GLYCEROPHOSPHATE DESHYDROGENASE (GPDH)
Les composés sélectionnés sont testés en triple à deux concentrations différentes
Figure imgf000018_0001
Les résultats obtenus sont rapportés dans les tableaux 2 et 3 et dans les figures 3 et 4. Les figures 5, 6 et 7 présentent les histogrammes révélant l'activité spécifique en nmoles/min/mg de protéines de tous les composés non cytotoxiques testés.
Le NDGA se révèle être non cytotoxique et anti-adipogénique (tableau 4) aux concentrations testées.
B.4 COURBE DOSE-REPONSE
La courbe dose-réponse nous renseigne sur l'activité spécifique (en nmoles/min/mg de protéine) en fonction des différentes concentrations de NDGA (0 ; 2 ; 4 ; 6 ; 8 et 10 μM). Les résultats sont rapportés dans le tableau 4 et la Figure 8. L'IC50 (concentration requise pour une inhibition de 50 %) est à 4,5 μM.
En conclusion, l'acide nor-dihydroguaiarétique se révèle être non toxique et possède un effet anti-adipogénique sur les cellules humaines au cours de leur différenciation en adipocytes. Il est donc adapté à une utilisation en thérapie et en cosmétique, en pharmaceutique (ou en thérapeutique) et en alimentaire.
C FORMULATIONS COSMETIQUES
Les compositions à base de NDGA peuvent être incluses dans des formulations cosmétiques des types suivants : CREME AMINCISSANTE
Nom INCI Quantité
EAU (WATER) QSP 100
GLYCERINE 5.00
CARBOPOL 0.20
SEL SODIQUE DE L'ACIDE ETHYLENE DIAMINE TETRACETIQUE 0.10
HUILE DE FEUILLE (LEAF OIL) de CAMELLIA SINENSIS 2.00
POLYISOBUTENE HYDROGENE 8.00
STEARATE DE GLYCERYLE SE 2.00
DIMETHICONE 1.00
STEARATE DE GLYCERYLE ET PEG-100 STEARATE 1.50
TRIETHYLHEXANOINE 5.00
ACIDE STEARIQUE 2.00
ALCOOL CETYLIQUE 1.00
SILICE 1.00
MALEATE DE DICAPRYLE 6.00
STEARATE DE GLYCERYLE 1.00
DIMETHICONE 3.50
EAU (WATER) 2.30
TRIETHANOLAMINE 0.50
PHENOXYETHANOL, p-HYDROXYBENZOATE DE METHYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE PROPYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE BUTYLE, 0.70 p-HYDROXYBENZOATE D'ETHYLE
FRAGRANCE 0.30
ACETATE DE TOCOPHEROL 0.50
CAFEINE 2.00
HYALURONATE DE SODIUM 0.04
EXTRAIT DE CENTELLA ASIATICA 1.00
EXTRAIT DE RUSCUS ACULEATUS 1.00
NDGA ou dérivés 0.001 à 10 GEL AMINCISSANT
Nom INCI Quantité
EAU (WATER) QSP 100
SEL SODIQUE DE L'ACIDE ETHYLENE DIAMINE TETRACETIQUE 0.20
CARBOPOL 0.50
GLYCERINE 3.00
POLYGLYCERYLMETHACRYLATE ET PROPYLENEGLYCOL 5.00
DIPROPYLENEGLYCOL 3.00
BUTYLENEGLYCOL 5.00
PHENOXYETHANOL, p-HYDROXYBENZOATE DE METHYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE PROPYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE BUTYLE, 0.65 p-HYDROXYBENZOATE D'ETHYLE
TRIETHANOLAMINE 0.50
CAFEINE 2.00
EXTRAIT DE RUSCUS ACULEATUS 1.00
NDGA ou dérivés 0.001 à 10
SERUM AMINCISSANT
Nom INCI Quantité
EAU (WATER) QSP 100
SEL TRISODIQUE DE L'ACIDE ETHYLENE DIAMINE TETRACETIQUE 0.10
HYDROXYETHYLCELLULOSE 0.10
GOMME DE XANTHANE 0.30
PHENOXYETHANOL, p-HYDROXYBENZOATE DE METHYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE PROPYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE BUTYLE, 0.65 p-HYDROXYBENZOATE D'ETHYLE
BUTYLENEGLYCOL 5.00
MONOSTEARATE POLYOXYETHYLENIQUE (20) DE SORBITANNE 1.00
FRAGRANCE 0.05
ACETATE DE TOCOPHEROL 0.10
CITRATE DE SODIUM 0.65
CAFEINE 2.00
NDGA ou dérivés 0.001 à 10 CREME TEINTEE AMINCISSANTE
Nom INCI Quantité
EAU (WATER) QSP 100
SILICATE DOUBLE D'ALUMINIUM ET DE MAGNESIUM 0.50
GOMME DE CELLULOSE 0.35
GLYCERINE 3.00
POLYVINYLPYRROLIDONE (PVP) 5.00
DIPROPYLENEGLYCOL 0.05
PROPYLENEGLYCOL 2.00
PHENOXYETHANOL, p-HYDROXYBENZOATE DE METHYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE PROPYLE, p-HYDROXYBENZOATE DE BUTYLE, 1.00 p-HYDROXYBENZOATE D'ETHYLE
GOMME DE XANTHANE (XANTHAN GUM) 0.20
TRIETHANOLAMINE 0.70
PALMITATE D'ISOPROPYLE 4.00
HUILE MINERALE (MINERAL OIL) 2.00
HEXYLDECANOL 3.00
STEARATE DE GLYCERYLE 2.00
ACIDE STEARIQUE (STEARIC ACID) 2.40
ACIDE OLEIQUE (OLEIC ACID) 0.50
MONOSTEARATE POLYOXYETHYLENIQUE (60) DE SORBITANNE 0.70
TOCOPHEROL 0.50
DIOXYDE DE TITANE (TITANIUM DIOXIDE) 7.00
OXYDE DE FER (IRON OXIDE) 4.00
NYLON-2 6.00
HYALURONATE DE SODIUM 0.01
FRAGRANCE 0.50
PROPYLENEGLYCOL DICAPRYLATE / DICAPRATE 7.20
NDGA ou dérivés 0.001 à 10
Tableau 1
r
Figure imgf000022_0001
Tableau 2
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
Tableau 4
Figure imgf000025_0001
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou d'un dérivé de celui-ci, à titre de principe actif en tant qu'inhibiteur de la formation d'adipocytes humains, dans une composition cosmétique, ou dans une composition dermo-pharmaceutique pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention de pathologies impliquant un dysfonctionnement de la différenciation adipocytaire chez l'homme.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le principe actif est une molécule naturelle, obtenue par extraction végétale.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le principe actif est contenu dans un extrait végétal.
4. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le principe actif est une molécule de synthèse.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la composition cosmétique est destinée à la prévention ou au traitement des surcharges pondérales non-pathologiques, à la prévention ou au traitement de la cellulite, à la prévention ou au traitement de capitons, ou au raffermissement cutané.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la composition dermo-pharmaceutique est destinée à la prévention ou au traitement des surcharges pondérales pathologiques, tels que le surpoids et l'obésité.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la composition cosmétique, ou dermo-pharmaceutique contient l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou le dérivé de celui-ci, à une concentration comprise entre 0.0001 % et 10% en poids, de préférence entre 0.001 % et 5% en poids, et plus préférentiellement entre 0.001 % et 1.0% en poids, par rapport au poids total de la composition
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la composition cosmétique ou dermo-pharmaceutique est appliquée par voie cutanée, percutanée ou transcutanée.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la composition cosmétique ou dermo-pharmaceutique se présente sous forme d'émulsion, de lait, de lotion, de gel, de pommade, de huile corporelle, de savon, de spray, de stick, de gélules, de comprimés, de patch, de sirop, de solutés, de solutions.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le ou les principes actifs sont incorporé(s) dans la composition sous forme de liposomes, macro-, micro-, nanoparticules, ou sont absorbé(s) sur un support organique ou minéral.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la composition cosmétique contient en outre un excipient cosmétiquement acceptable, et éventuellement tout autre ingrédient habituellement utilisé en cosmétique, tels que polymères gélifiants, agents tensioactifs, agents émulsifiants, extraits de plantes, extraits marins, principes actifs hydro- ou liposolubles, extraits biotechnologiques, filtres solaires, huiles essentielles.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisée en ce que la composition dermo-pharmaceutique contient en outre un excipient acceptable du point de vue physiologique.
13. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la composition cosmétique ou dermo-pharmaceutique contient un deuxième principe actif.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que le deuxième principe actif est choisi parmi les principes actifs suivants : un actif amincissant, un actif drainant, un activateur de la microcirculation, un protecteur des capillaires sanguins.
15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'actif amincissant est un activateur de lipolyse, tel que la caféine, ou un inhibiteur de la Lipoprotéine Lipase.
16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que la composition cosmétique ou dermo-pharmaceutique est incorporée ou liée ou adsorbée dans les textiles susceptibles d'être mis directement au contact de la peau afin de permettre une délivrance topique continue.
17. Composition cosmétique amincissante comprenant de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou un dérivé de celui-ci , en association avec un agent lipolytique tel que la caféine ou un dérivé de celle-ci comme le siloxanetriol alginate de caféine, ou une base xanthique favorisant la lipolyse.
18. Composition cosmétique amincissante comprenant de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22θ4), ou un dérivé de celui-ci, en association avec un inhibiteur de Lipoprotéine Lipase.
19. Composition cosmétique amincissante comprenant de l'acide nor-dihydroguaiarétique (C18H22O4), ou un dérivé de celui-ci, en association avec un extrait végétal stimulant la microcirculation cutanée comme les flavonoïdes, les ruscogénines et dérivés, l'aescine contenus dans les extraits de Ruscus aculeatus.
20. Utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique, ou d'un dérivé de celui-ci, comme principe actif dans une composition alimentaire amincissante à usage humain.
21. Utilisation de l'acide nor-dihydroguaiarétique, ou d'un dérivé de celui-ci, comme principe actif dans une composition pharmaceutique pour la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention de pathologies impliquant un dysfonctionnement de la différenciation adipocytaire chez l'homme, ledit médicament étant formulé pour administration par voie intradermique, sous-cutanée ou orale.
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