[go: up one dir, main page]

WO2005005665A1 - Lceによる肥満治療に有効な化合物の評価方法 - Google Patents

Lceによる肥満治療に有効な化合物の評価方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005005665A1
WO2005005665A1 PCT/JP2004/009834 JP2004009834W WO2005005665A1 WO 2005005665 A1 WO2005005665 A1 WO 2005005665A1 JP 2004009834 W JP2004009834 W JP 2004009834W WO 2005005665 A1 WO2005005665 A1 WO 2005005665A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lce
seq
sirna
nos
obesity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/009834
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hidehito Kotani
Hiraku Itadani
Hiromitsu Araki
Kazuhiko Takahashi
Hiroaki Suwa
Nao Odagiri
Tsutomu Kobayashi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MSD KK
Original Assignee
Banyu Phamaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Banyu Phamaceutical Co Ltd filed Critical Banyu Phamaceutical Co Ltd
Priority to CA002532150A priority Critical patent/CA2532150A1/en
Priority to JP2005511544A priority patent/JPWO2005005665A1/ja
Priority to US10/564,311 priority patent/US7491381B2/en
Priority to EP04747302A priority patent/EP1657311A4/en
Publication of WO2005005665A1 publication Critical patent/WO2005005665A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91045—Acyltransferases (2.3)
    • G01N2333/91051—Acyltransferases other than aminoacyltransferases (general) (2.3.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating a compound effective for treating or preventing fertility using an LCE Oong chain fatty acyl elongase) gene or protein.
  • the present invention also relates to a method for detecting obesity using the gene or protein.
  • Obesity is a risk factor for various adult diseases represented by hypertension, diabetes, hyperlipidemia, ischemic heart disease and the like. In addition, many of these are chronic diseases, which are thought to cause medical expenses to rise in the future, and have become a major social problem.
  • Anti-obesity drugs are being developed to prevent such obesity, and at present, appetite suppressants and lipid absorption inhibitors are clinically used.
  • leptin, PPARy, neuropeptide Y, etc. are known as target molecules for antiobesity drug research.Because the causes of force obesity are extremely diverse, the mechanism of action as a drug discovery target is Different target molecules are needed.
  • fatty acid biosynthesis is performed by acetyl-CoA carboxylase and fatty acid synthase.
  • LCE Accession No. NM_024090 (human: SEQ ID NO: 1); NM_130450 (mouse: SEQ ID NO: 2)
  • Acid myristic acid It is known that it is responsible for elongation of the carbon chain of fatty acids mainly containing 12 or more carbon atoms, such as palmitic acid, normitic acid stearic acid, palmitoleic acid to vaccenic acid (J. Biol. Chem., 276 (48), 45358-45366 (2001);
  • WO02 / 44320 Patent Document 1 describes that ELG5 (LCE) has activity as elongase using polyunsaturated fatty acid (PUFA) as a substrate.
  • PUFA polyunsaturated fatty acid
  • Non-Patent Document 2 mentions that Longonges is involved in diseases such as diabetes.
  • Patent document l WO02 / 44320
  • Non-Patent Document 1 J. Biol. Chem., 276 (48), 45358-45366, (2001)
  • Non-Patent Document 2 Suneja et al., Biochem. Biophys. Acta, 1042: 81-85 (1990)
  • Non-Patent Document 3 Matsuzaka T. et al "J. Lipid Res., 43 (6): 911-20 (2002)
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the related art, and has a direct relation between LCE and obesity, whereby a method for obesity or leanness test which can be determined at a molecular level and
  • An object of the present invention is to provide a test agent for obesity and leanness using the molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating a compound, such as screening for a therapeutic or diagnostic agent for obesity or leanness.
  • Another object of the present invention is to provide a method for suppressing fat synthesis and obesity.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, the weight change and LCE The present inventors have found that there is a certain correlation with the expression level, and completed the present invention.
  • the present invention provides the following methods (1)-(4) for evaluating compounds effective for treating or preventing obesity.
  • a method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity comprising:
  • a method for evaluating a compound effective for treating or preventing fertility comprising:
  • obesity characterized by comprising a step of bringing a test compound into contact with an LCE protein, and a step of confirming whether or not the test compound affects the activity of the protein.
  • a method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity comprising:
  • a therapeutic or prophylactic agent for obesity containing as an active ingredient a compound obtained by the above-described method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity of the present invention is also included in the present invention. .
  • the present invention also provides a method for suppressing fat synthesis, which comprises suppressing the fatty acid synthesis activity of LCE.
  • means for suppressing the fatty acid synthesis activity of LCE is not particularly limited, but RNAi (RNA
  • RNAi is a nucleic acid consisting of the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 13 or 14, or an siRNA consisting of the nucleic acid represented by SEQ ID NO: 15 or 16.
  • siRNA small interfering RNA
  • an siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOs: 17 and 18, an siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOs: 19 and 20, and a nucleic acid of SEQ ID NOs: 21 and 22 Consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOS: 23 and 24, the siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOS: 25 and 26, the siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOs: 27 and 28,
  • the present invention also provides a method for treating or preventing obesity, which comprises suppressing the fatty acid synthesis activity of LCE by RNAi.
  • means for suppressing the fatty acid synthesis activity of LCE is not particularly limited, but suppression by RNAi is preferred.
  • RNAi is achieved by using the above-mentioned siRNA, but it is particularly preferable to use siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOS: 23 and 24.
  • the present invention also provides the following obesity test methods (1)-(4).
  • a method for examining obesity comprising measuring the expression level of LCE gene or a change in the expression level in a test tissue or test cell.
  • a method for examining obesity which comprises measuring the expression level or a change in the expression level of LCE protein in a test tissue or test cell.
  • An obesity test method characterized by detecting a polymorphism present in the LCE gene in a test tissue or test cell.
  • a method for examining obesity which comprises detecting the expression level or activity of a protein that affects the expression level of the LCE gene by interacting with the LCE protein.
  • the present invention further provides an siRNA characterized by comprising the nucleic acid set forth in SEQ ID NOS: 23 and 24, and comprises an LCE expression inhibitor, a fat synthesis inhibitor, and obesity characterized by including the siRNA. And a therapeutic or prophylactic agent.
  • FIG. 1 is a graph showing (a) LCE mRNA expression level and (b) LCE activity in cells in which LCE was forcibly expressed.
  • HEK293 indicates untreated cells
  • A5 indicates cells in which LCE is moderately expressed
  • D8 indicates cells in which LCE is highly expressed.
  • FIG. 2 is a graph showing fatty acid composition in cells in which LCE was forcibly expressed.
  • the black portion represents fatty acids having 18 or more carbon atoms in the carbon chain
  • the white portion represents fatty acids having 16 or less carbon atoms in the carbon chain.
  • (A)-(c) shows the composition of the fatty acids that make up the triglyceride
  • (d) one shows the composition of the fatty acids that make up the cholesterol ester
  • (g)-(i) the composition of the phospholipids Represents the composition of fatty acids.
  • wt represents untreated HEK293 cells.
  • FIG. 3 shows the detailed fatty acid composition in cells in which LCE was forcibly expressed.
  • A represents the composition of the fatty acid constituting the triglyceride
  • (b) represents the composition of the fatty acid constituting the cholesterol
  • (c) represents the composition of the fatty acid constituting the phospholipid.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of suppression of LCE expression by RNAi.
  • A shows the corresponding portion of each siRNA in the LCE gene, and
  • b shows the amount of LCE mRNA expression when each siRNA is introduced.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of suppression of LCE activity by RNAi.
  • A shows the expression level of LCE mRNA
  • (b) shows the elongation activity of Fatty Acyl CoA.
  • LCERNAi indicates that LCE RNAi was performed using hLCE-siRNA_6 (the same applies hereinafter unless otherwise specified).
  • FIG. 6 is a graph showing the expression level of LCE mRNA in H-marked G2 cells into which siRNA has been introduced. (A): After 24 hours, (b): After 48 hours.
  • FIG. 7 is a graph showing the expression levels of (a) LCE, (b) FAS, and (c) SCD mRNA in H-marked G2 cells into which siRNA has been introduced.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of suppression of mouse LCE expression by RNAi.
  • A is a mouse
  • B shows the expression level of mouse LCE mRNA when each siRNA was introduced
  • c shows the expression level of mouse FAS mRNA when each siRNA was introduced. ing.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of RNAi-induced suppression of (a) LCE and (b) FAS expression and (c) suppression of fatty acid synthesis.
  • FIG. 10 shows the results of (a) suppression of LCE expression and (b) suppression of apolipoprotein B secretion by RNAi.
  • FIG. 11 is a graph showing changes in (a) body weight, (b) blood glucose level, and (c) plasma insulin by siRNA administration.
  • the scramble RNAi indicates a control in which RNAi was performed using a scramble siRNA that is not effective in mammals.
  • FIG. 12 is a graph showing the expression levels of SREBP-1 and SREBP-2 mRNA in H-marked G2 cells into which siRNA has been introduced.
  • FIG. 13 is a view showing (a) a fatty acid synthesizing ability and (b) a neutral fat synthesizing ability in H-marked G2 cells into which siRNA has been introduced.
  • FIG. 14 is a graph showing the amount of neutral fat in the H-mark G2 cells into which siRNA has been introduced.
  • FIG. 15 is a graph showing (a) the amount of CO production, (b) the amount of ketone bodies produced, and (c) the amount of palmitic acid incorporated into triglyceride in siRNA-introduced G2 cells. is there.
  • FIG. 16 is a graph showing the expression level of CPT-1 mRNA in H-marked G2 cells into which siRNA has been introduced.
  • FIG. 17 is a graph showing (a) body weight, (b) epididymal fat weight, and (c) LCE mRNA expression level in liver in mice loaded with a high sucrose diet.
  • CA-1 represents mice fed a normal diet
  • HSD (3 days) and HSD (10 days) represent mice fed a high sucrose diet for 3 and 10 days, respectively.
  • FIG. 18 is a graph showing (a) body fat mass, (b) fat weight / Z body weight ratio, and (c) plasma leptin concentration of mice administered with siRNA.
  • HSD SCR-RNAi indicates that mice challenged with a high sucrose diet were administered scramblesiRNA, which is ineffective in mammals.
  • HSD LCE-RNAi indicates that mice loaded with a high sucrose diet were administered hLCE-siRNA_6.
  • FIG. 19 is a graph showing (a) LCE mRNA expression level, (b) FAS mRNA expression level, and (c) triglyceride content in liver of mice administered with siRNA.
  • FIG. 20 is a graph showing changes in LCE protein levels in the liver of mice to which siRNA was administered.
  • Figure 21 shows (a) ACC, FAS, SCD1,
  • FIG. 22 is a graph showing LCE activity of an LCE mutant.
  • A shows the LCE activity of the mutant in which cysteine is substituted with alanine
  • (b) shows the LCE activity of the mutant in which histidine is substituted with alanine.
  • the "expression level” in the present invention refers to an absolute amount or a relative amount of a transcript of the LCE gene.
  • the gene includes either DNA or mRNA.
  • the “expression level” refers to the absolute or relative amount of the translation product of the LCE gene.
  • test animal in the present invention is not particularly limited as long as it is an animal that can be used for evaluating a compound, but specifically, for example, a mouse, a rat, a guinea pig, and the like. , Egrets, dogs and monkeys.
  • test tissue in the present invention is not particularly limited as long as it is a tissue that can be extracted from a living body when a test for obesity or leanness is performed. From the viewpoint of being easily reflected, for example, a liver tissue, an adipose tissue, a muscle tissue, and a blood tissue are preferable. Further, from the viewpoint that the tissue can be easily isolated, a blood tissue is preferable among the tissues.
  • a liver tissue an adipose tissue, a muscle tissue, and a blood tissue
  • a blood tissue is preferable among the tissues.
  • the animal species from which these tissues are derived there is no particular limitation on the animal species from which these tissues are derived, but humans are preferred because the main use of the present invention is clinical use in humans.
  • the type of the "test cell” in the present invention is not particularly limited as long as it is a cell that can be extracted for vitality when obesity or leanness is examined, but the effect of obesity or leanness is reflected.
  • hepatocytes adipocytes (white adipocytes) , Brown fat cells, etc.), muscle cells (myoblasts, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, etc.), knee cells (knee islet cells, etc.), and blood cells.
  • the animal species from which such a tissue is derived is not particularly limited, but it is preferable that the main use of the present invention is clinical use in humans, and that humans be used.
  • “obesity” in the present invention is defined as a state in which adipose tissue is excessively accumulated, in addition to general obesity, which is accompanied by complications such as diabetes and hypertension or visceral fat. Also includes “obesity”. Further, “obesity” in the present invention also means a state in which the body weight has increased relatively as compared to the original body weight when the body weight was controlled by drug administration or the like.
  • test in the present invention includes not only the determination of obesity or leanness but also the case of "predicting” future obesity or leanness.
  • longage activity in the present invention means an activity of elongating a carbon chain of a fatty acid or a fatty acid CoA.
  • the method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity according to the present invention will be described.
  • the test compound is administered to the test animal and test cells, and the expression level of the LCE gene, which fluctuates when the test compound is contacted, is measured.
  • the effect of the test compound on the LCE protein by contacting it with the test compound is examined. This makes it possible to evaluate the test compound.
  • test compound Whether the test compound is administered or brought into contact with a test animal or test cell, and whether the test compound regulates the expression level of the LCE gene or a gene functionally equivalent to the gene in the test animal or test cell. Is effective in treating or preventing obesity Compound can be evaluated.
  • test compound is evaluated in the following procedure.
  • a test compound is administered or brought into contact with a test animal or a test cell.
  • the test compound is not limited, as long as it is a candidate compound for a therapeutic or prophylactic agent for obesity, regardless of its structure or properties.
  • the method of administering the test compound to the test animal is not particularly limited. Specific methods include, for example, oral administration, parenteral administration (for example, transdermal administration, intramuscular injection, intravenous injection, and subcutaneous injection).
  • the method of bringing the test compound into contact with the test cells is not particularly limited.Specifically, for example, they are mixed in a solution such as a culture solution or a buffer solution (phosphate buffer solution or the like) and brought into contact with each other. Method.
  • test compound regulates the expression level of the LCE gene or a gene functionally equivalent to the gene in the test animal or test cell.
  • a change before the administration or contact as described above which is not particularly limited, is used as a control.
  • the detection can be performed by an amplification method, a method using a DNA microarray, a Northern hybridization method, or the like.
  • an animal or cell into which a fusion gene of the gene expression regulatory region and a reporter gene has been artificially introduced may be used.
  • specific examples of the reporter gene include a galactosidase gene, a luciferase gene and a green fluorescens protein gene.
  • the term "gene functionally equivalent to the LCE gene” refers to a gene having a base sequence different from that of the LCE gene but showing relatively high homology and having the same or similar activity as LCE gene.
  • the homology is not particularly limited as long as the functions of the genes are equivalent, but the homology of the base sequence is preferably 70-100%, more preferably 80 100%. Even more preferred is 90 100%. Especially preferred is 95 100%.
  • the homology is lower than the lower limit, there is a tendency that the possibility of not exhibiting the same or similar function as LCE is high.
  • the homology of the nucleotide sequences is less than the lower limit, if the homology between the domain having a function specific to LCE and the nucleotide sequence corresponding to the domain is high, it is the same as the LCE gene. Or it may have a similar function. This Such a gene can be suitably used even if the homology of the nucleotide sequence is out of the above range.
  • the gene having relatively high homology may be a gene in which one or more bases in the LCE gene are naturally or artificially substituted, deleted, disabled and / or inserted.
  • the expression level of the LCE gene or a gene functionally equivalent to the LCE gene when the test compound is administered or contacted is 20% or more, preferably 50% or less, compared to the case where the test compound is not administered or contacted. When it decreases by at least%, the test compound can be evaluated as a compound effective for treating or preventing obesity.
  • test compound By bringing a test compound into contact with the LCE protein and confirming whether or not the test compound affects the activity of the protein, it is possible to evaluate a compound that is effective for treating or preventing obesity.
  • test compound is evaluated according to the following procedure.
  • a test compound is brought into contact with the LCE protein.
  • the method of bringing the protein into contact with the test compound is not particularly limited, and specifically includes, for example, a method of mixing and contacting in a solution such as a buffer solution (such as a phosphate buffer solution).
  • the conditions for measuring the activity of the protein may be appropriately set depending on the properties of the protein used. Specific examples of such conditions include, for example, in the case of LCE protein, the elongase activity can be used as an index.
  • the microsome fraction extracted from cells is used for NADPH, After mixing and incubating in a solution containing palmitoyl-CoA, 14C- labeled malonyl-CoA, and the like, and extracting the fatty acid, the elongase activity can be measured by measuring the radioactive specific activity contained in the fatty acid. Also, J.
  • the test compound When the activity of the LCE protein is decreased by 20% or more, preferably 50% or more when the test compound is administered or brought into contact with the test compound, the test compound is It can be evaluated as a compound that is effective for treating or preventing obesity.
  • the method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity as described above, This enables screening of therapeutic and diagnostic agents for obesity, evaluation of the efficacy or safety of these agents, and selection of appropriate agents in bespoke treatment.
  • the test compound is brought into contact with a plurality of types of elongase proteins containing LCE, the activities of the plurality of types of elongase proteins are measured, and then a test compound that inhibits the activity of LCE is selected.
  • a test compound that inhibits the activity of LCE is selected.
  • the evaluation is performed in the following procedure.
  • a test compound is brought into contact with each of a plurality of types of elongase proteins including LCE.
  • the method of bringing the test compound into contact with the protein is not particularly limited, and specifically includes, for example, a method of mixing and contacting in a solution such as a buffer solution (phosphate buffer solution or the like).
  • a buffer solution phosphate buffer solution or the like.
  • the plural types of elongases are not particularly limited as long as they have elongase activity, but specific examples include FAS (Fatty Acid Synthase) and ELO-1.
  • test compound affects the activity of each protein.
  • Conditions for measuring the activity of a protein may be appropriately set depending on the properties of the protein to be used. As such conditions, for example, in the case of LCE protein, the elongase activity can be used as an index. Specifically, J. Biol. Chem., 276 (48),
  • the activity may be measured according to a known method using elongase activity as an index, as in LCE.
  • a therapeutic or diagnostic agent for obesity is screened, and the efficacy or safety of these agents is evaluated.
  • LCE is a fatty acid synthase that is a component of fat
  • its enzymatic activity By inhibiting the synthesis of fatty acids, it becomes possible to inhibit the synthesis of fatty acids and, consequently, the synthesis of fats.
  • fat synthesis is suppressed in the following procedure.
  • a substance that inhibits the activity of LCE is selected.
  • Such substances include, for example, compounds that function as LCE inhibitors, LCE antibodies, antisense nucleotides, and siRNA (small
  • interfering RNA double-stranded RNA of sense RNA; antisense RNA.
  • the above substance is introduced into an individual, tissue, or cell in which LCE exists.
  • the method of introduction is not particularly limited.
  • the compound may be administered intranasally, transbronchially, or muscle.
  • Target or oral introduction method If the target is a tissue, there is no particular limitation on the method of introduction, and examples include a method of injecting into a tissue and introducing by mixing in a buffer solution. Further, if the target is a cell, the method of introduction is not particularly limited, but examples thereof include mixing in a buffer solution, electo-portation, and the like.
  • siRNA can be introduced into cells by adding siRNA encapsulated in ribosomes to a cell culture solution and contacting the cells, and RNAi can be caused.
  • siRNA can be used for RNAi of LCE.
  • hLCE-siRNA-1 (SEQ ID NOs: 13 and 14), hLCE-siRNA-2 (SEQ ID NOs: 15 and 16), hLCE-siRNA-3 (SEQ ID NOs: 17 and 18), hLCE-siRNA-4 (SEQ ID NO: 19) And 20), hLCE-siRNA-5 (SEQ ID NOS: 21 and 22), hLCE-siRNA-6 (SEQ ID NOs: 23 and 24), LCE-siRNA-2 (SEQ ID NOs: 25 and 26), hLCE-siRNA-7 (SEQ ID NO: 25) SEQ ID NOS: 27 and 28), hLCE-siRNA_8 (SEQ ID NOs: 29 and 30), hLCE-siRNA-9 (SEQ ID NOs: 31 and 32), hLCE-siRNA_10 (SEQ ID NOs: 33 and 34), hLCE-siRNA-l l ( SEQ ID NOS: 35 and 36), hLCE
  • RNAi may be generated by using a combination of a plurality of these siRNAs.
  • hLCE-siRNA-6 SEQ ID NOS: 23 and 24
  • LCE RNAi because it has a particularly strong LCE expression inhibitory effect.
  • the method of suppressing fat synthesis can be applied to the treatment or prevention of obesity.
  • inhibiting the activity of LCE in vivo suppresses the synthesis of fatty acids, and consequently suppressing the synthesis of lipids makes it possible to treat or prevent obesity.
  • obesity is treated or prevented according to the following procedure.
  • a substance that inhibits the activity of LCE is selected.
  • Such substances include, for example, compounds that function as LCE inhibitors, LCE antibodies, antisense nucleotides, and siRNAs used for RNAi.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include intranasal, transbronchial, muscular, and oral administration methods in addition to intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection.
  • the specific method using RNAi is as described in the method for suppressing fat synthesis.
  • (A) Method for Testing Obesity or Leanness by Measuring LCE Gene Expression Level By measuring changes in the LCE gene expression level in a test tissue or test cell, or measuring the expression level By doing so, it is possible to examine and diagnose whether or not the living body (for example, human) from which the test tissue or test cell has been extracted is obese. In addition, it is possible not only to detect the obesity state at the time of the test, but also to predict whether obesity or leanness may occur in the future.
  • a test tissue or a test cell is extracted from a living body to be tested.
  • the extraction method is not particularly limited, and can be extracted by a known method.
  • LCE RNA total RNA or mRNA
  • Preparation of such RNA can be performed by known methods, for example, Molecular
  • the expression level is measured, for example, by a gene amplification method such as RT-PCR, a method using a DNA microarray (for example, a DNA chip manufactured by Affymetrix), or a Northern hybridization method. can do.
  • a gene amplification method such as RT-PCR
  • a method using a DNA microarray for example, a DNA chip manufactured by Affymetrix
  • a Northern hybridization method can do.
  • in situ hybridization using test tissues or test cells in situ hybridization using test tissues or test cells (in
  • the expression level can also be measured by situ hybridization or the like.
  • the above-mentioned measurement of the expression level is performed before and after a period in which the expression level is predicted to change (for example, before and after administration of a therapeutic agent for obesity). Then, the difference in the expression level may be measured. Specifically, in the test tissue or test cells, body weight increased when the expression level of the LCE gene significantly increased around the period in which the expression level of the LCE gene was predicted to change as described above. Or, it can be diagnosed that it may increase in the future.
  • (B) Method for Examining Obesity or Leanness by Measuring LCE Protein Expression Level By measuring a change in LCE protein expression level in a test tissue or test cell, or measuring the expression level By doing so, it is possible to examine and diagnose whether or not the living body (for example, human) from which the test tissue or test cell has been extracted is obese. In addition, it is possible not only to examine the obesity state at the time of the examination but also to predict the power that may become obese or lean in the future.
  • Methods for measuring the expression level of a protein include a method for quantifying a protein isolated from a living body and a method for measuring a blood concentration of the protein, and specific methods are not particularly limited.
  • Specific examples of a method for quantifying a protein isolated from a living body are as follows. First, an LCE protein is prepared from a test tissue or a test cell. Preparation of such a protein can be performed by a known method. Prepared in this way For example, the expression level of the isolated protein can be measured by a method using a protein chip (for example, a protein chip system manufactured by CIPHERGEN) or an immunological method (for example, ELISA, EIA, Western blotting). it can.
  • a protein chip for example, a protein chip system manufactured by CIPHERGEN
  • an immunological method for example, ELISA, EIA, Western blotting
  • the expression level can also be measured by immunostaining using a test tissue or test cell.
  • a specific example of a method for measuring the blood protein concentration includes a method for quantifying LCE protein by the above immunological method or the like using blood collected from a living body.
  • obesity of a subject can be detected by measuring the expression level of the LCE gene or protein and analyzing the result. That is, according to the present invention, it has been clarified that the expression level of LCE protein and body weight have a certain correlation, and therefore, the above test results are compared with the expression level of LCE protein in a control group (healthy person etc.). This makes it possible to determine the degree of obesity. Further, according to the detection method of the present invention, it is possible to not only detect the state of obesity at the time of the test, but also to predict the possibility of obesity or leanness in the future.
  • the above-mentioned measurement of the expression level is performed before and after a period in which the expression level is predicted to change (for example, before and after administration of a therapeutic agent for obesity). Then, the difference in the expression level may be measured. Specifically, in a test tissue or test cell, if the expression level of the LCE protein significantly increases before or after the above-mentioned period in which the expression level of the LCE protein is predicted to change, the body weight has increased or It can be diagnosed that it may increase in the future.
  • the expression level of the LCE gene or protein may change, or an abnormality in the activity of the protein may occur, depending on the presence or absence and type of the polymorphism. Therefore, by detecting such a genetic polymorphism, it is possible to obtain knowledge on the expression and activity of LCE, and to further conduct a test for obesity in the test tissue or the test subject from which the test cells were derived. it can.
  • Specific examples of such genetic polymorphisms include, for example, mini-satellite, micro-satellite, SNP (single
  • nucleotide polymoi-phism —salt polymorphism
  • Polymorphism in the LCE gene can be detected as follows. That is, Based on the LCE gene, a base sequence is determined for an obese subject to be tested for a region whose expression level is controlled, and a polymorphic site is detected. The allele frequency of the detected polymorphic site is calculated and polymorphisms that correlate with obesity are identified by finding alleles that are significantly increased or decreased in the subject population. Genetic polymorphisms detected in this way can be analyzed, for example, by analyzing the base sequence of the polymorphic site in genomic DNA derived from the subject, It can be detected clinically by methods that utilize differences in chemical properties and restriction enzyme sites, methods that use appropriate detection probes for the detection of the polymorphic site, and methods that use mass spectrometry. is there.
  • LCE protein has a certain correlation with the expression level and the activity of the LCE protein, which interacts with the LCE protein to affect the LCE gene expression level, and it is necessary to detect either behavior Thus, the other behavior can be estimated.
  • interaction means that the LCE protein and another protein act directly or indirectly.
  • the LCE protein physically contacts another protein, And the effect of interacting via the third protein to indirectly affect the expression of LCE protein.
  • proteins include, for example, proteins that exert physiological functions upstream or downstream of the LCE protein in signal transduction via the LCE protein.
  • the method for detecting the expression level or activity of such a protein is not particularly limited as long as a suitable means is appropriately selected depending on the type of the target protein.
  • the obesity detection method of the present invention as described in the above (A) and (D) not only makes it possible to diagnose obesity at the molecular level, but also about the possibility of becoming obese in the future. Also predict This makes it possible to perform more accurate diagnosis as compared with the conventional diagnosis method.
  • the LCE gene shows a correlation between its expression level and body weight. Therefore, a compound that regulates the expression level of the gene to a normal level is not only useful for treating or preventing obesity, but also for example, for leanness, diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and ischemic heart disease. Is also applicable. Examples of such a compound include compounds selected by the above-described method for evaluating a compound of the present invention. In order to use these compounds as medicaments, in addition to administering the compounds directly to patients, they can also be administered as pharmaceutical compositions formulated by known pharmaceutical methods.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, binder, Lubricants, sweeteners, flavors or colorings are mentioned.
  • Methods for administering such a pharmaceutical composition to a patient include, for example, intranasal, transbronchial, muscular, or oral administration in addition to intraarterial, intravenous, and subcutaneous injection.
  • Can be The dose of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's body weight, age, administration method, and the like, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the expression level of LCE protein correlates with obesity-based weight change. Therefore, obesity can be easily tested by detecting and measuring the amount of protein in the test cells and the test tissue using an antibody against the protein.
  • the “antibody” refers to an entire antibody molecule or a fragment thereof that can bind to an LCE gene product as an antigen.
  • Such an antibody can be produced by a known method, and may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • a known method may be used, and specific examples thereof include a fluorescent antibody method and an enzyme antibody method.
  • the kit may include, in addition to the antibody, for example, a secondary antibody labeled with a fluorescent label or a radioisotope to detect the antibody, or a buffer used when performing an antigen-antibody reaction.
  • a liquid may be provided.
  • hLCE-siRNA-6 siRNA consisting of nucleic acids of SEQ ID NOS: 23 and 24
  • LCE expression inhibitor lipogenesis inhibitor
  • therapeutic or preventive agent for obesity containing the same
  • the siRNA is composed of the nucleic acids of SEQ ID NOS: 23 and 24.
  • hLCE-siRNA-6 strongly suppresses LCE expression. Therefore, hLCE-siRNA-6 can be used as an LCE expression inhibitor, can be used as a fat synthesis inhibitor, and can also be used as a therapeutic or preventive agent for obesity.
  • a model mouse showing obesity by administering the NPY Y5 agonist was prepared in the following manner. 9-12-week-old male mice (C57BL / 6J: Claire) were incubated at room temperature 23 ⁇ 2. One animal was bred in one plastic gauge under the conditions of C and a humidity of 55 ⁇ 15%. The light cycle at the time of rearing was 12 hours, and was turned on at 7:00 am and turned off at 7:00 pm. In addition, the mice were allowed to freely take feed (CE-2 (protein: 25.4% by weight, carbohydrate: 50.3% by weight, lipid: 4.4% by weight): Claire) and water.
  • CE-2 protein: 25.4% by weight, carbohydrate: 50.3% by weight, lipid: 4.4% by weight
  • mice are anesthetized with 80 mg / kg sodium pentobarbital (manufactured by Dynabot), and a sterilized 28-gauge brain injection neuron (manufactured by Alzet) is stereotactically implanted into the right cerebral cortex. did. The force neuron was fixed at 0.4 mm posterior to Bredama, 0.8 mm laterally, and 2 mm deep with dental cement perpendicular to the skull. Osmotic pump filled with 10 mM phosphate buffer containing 0.05% ⁇ ⁇ ⁇ serum albumin (BSA)
  • BSA serum albumin
  • mice were divided into three groups (vehicle group injected with solvent only) and group injected with D-Try 34 NPY (NPY Y5 agonist) (ad lib fed group) with the same average body weight. ), And D-Try 34 NPY was injected into a pair-fed group.
  • D-Try 34 NPY NPY Y5 agonist
  • a model mouse showing obesity by administering MCH (melanin-concentrating hormone) was prepared as follows.
  • mice A 13-week-old male mouse (C57BL / 6J: Claire) was used at room temperature of 23 ⁇ 2. One animal was raised per plastic gauge under the conditions of C and humidity of 55 ⁇ 15%. The light cycle during rearing was 12 hours, with the lights on at 7 am and off at 7 pm. In addition, mice were allowed to freely ingest food (CE-2 (protein: 25.4% by weight, carbohydrate: 50.3% by weight, lipid: 4.4% by weight): Claire) and water. When the mice were adapted to the environment, they were fed with MHF (protein: 15.0% by weight, carbohydrate: 52.4% by weight, lipid: 32.6% by weight, manufactured by Oriental Bio Services) as a feed.
  • CE-2 protein: 25.4% by weight, carbohydrate: 50.3% by weight, lipid: 4.4% by weight
  • MHF protein: 15.0% by weight, carbohydrate: 52.4% by weight, lipid: 32.6% by weight, manufactured by Oriental Bio Services
  • a mouse is anesthetized with 80 mg / kg sodium pentobarbital (manufactured by Dynabot), and a sterilized 28-gauge brain injection neuron (manufactured by Alzet) is stereotactically implanted into the right cerebral cortex. did.
  • the force neuron was fixed 0.4 mm posterior to Bredama, 0.8 mm laterally, and 2 mm deep with dental cement perpendicular to the skull.
  • the force neuron was connected to an osmotic pump filled with 30% propylene glycol (Model No. 2002: manufactured by Alze) via a polybutyl chloride tube.
  • a pump was implanted subcutaneously on the back of the mice and antibiotics were injected subcutaneously.
  • mice were divided into three groups (vehicle group injected with solvent only), group injected with MCH (ad lib fed group), Group (pair-fed
  • MFDJ refers to mice fed with MHF until they no longer gain weight.
  • mice were fed HFD (protein: 20.8% by weight, carbohydrate: 38.59% by weight, lipid: 32.88% by weight), which is a high-calorie diet containing a higher fat than MHF.
  • HFD protein: 20.8% by weight, carbohydrate: 38.59% by weight, lipid: 32.88% by weight
  • DIO mice were also prepared.
  • mice C57BL / 6N, 17 weeks old were individually raised in one cage.
  • the food was given a normal diet (CA_1, CLEA).
  • Food restriction was performed according to the following schedule. In other words, food (CA-1) was given only for 3 hours a day (10: 00-13: 00), and water was freely available. The weight of the food was measured before and after the feeding time, and the difference was defined as the amount of food. During the period during which food intake was restricted, observation of body weight, appearance, and the like were monitored. Mice that seemed to have failed in conditioning (mice that showed extreme weight loss (eg, a decrease of about 20%) in a short period of time) were not used in the experiment. After the mice were bred under vigorous conditions for 7 days, white adipocytes were excised.
  • Example 11-5 and Comparative Example 1 Expression of LCE in White Adipocytes
  • the expression level of the LCE gene in the liver and white adipocytes was measured.
  • the expression level was measured by treating the RNA extracted from the white adipocytes of each model mouse with a mouse U74A chip (Aifymetrix).
  • DIO mouse DIO
  • D_Trv 34 NPY-administered mouse NPY (FF)
  • D-Try 34 NPY when the expression level of LCE in untreated C57BL / 6N liver or WAT was 1.00, respectively pair feeding administration group mice (NPY (PF)), MCH administration mice (MCH (FF)), MCH pair feeding administration mice (MCH (PF)), restricted diet mice (Fasting) and NPY
  • Table 1 shows the expression level of the LCE gene in the Y5 antagonist-administered mouse (Y5ant).
  • Mouse LCE cDNA was amplified by RT-PCR using RNA extracted from mouse liver. After subcloning the obtained PCR product into the expression vector pCDNA3.1, the nucleotide sequence was confirmed. Next, the expression vector in which mouse LCE was subcloned was linearized with the restriction enzyme Seal, and introduced into HEK293 cells. Lmg / ml
  • mLCE-exF 5- GCC ACC ATG GGC AAC ATG TCA GTG TTG ACT TTA C _3 '(SEQ ID NO: 3)
  • mLCE_exR 5' _
  • RNA was purified from HEK293 cells, and cDNA was obtained by reverse transcription reaction.
  • mouse LCE mRNA and human LCE mRNA were measured using the TaqMan PCR method with the Detector System.
  • a standard curve of mouse LCE was prepared by expression analysis using a DNA obtained by subcloning the above-described mouse LCE into a linearized DNA with the restriction enzyme Seal.
  • a standard curve of human LCE was prepared by expression analysis using a DNA fragment prepared by subcloning a cDNA fragment of human LCE prepared by PCR into pcDNA3.1 and linearizing with Seal. Next, the expression level of mouse LCE was divided by the expression level of human LCE, and the ratio of the expression level of the introduced mouse LCE gene to that of the endogenous human LCE gene was determined.
  • microsomal fraction was prepared by ultracentrifugation. Using the obtained microsomal fraction, LCE activity was measured by the following method. The microsomal fraction was added to a phosphate buffer containing NADPH, palmitoyl-CoA, and 14C- labeled malonyl-CoA required for the reaction, and incubated at 37 ° C for 5 minutes. Next, a 15% potassium hydroxide-methanol solution was added, and the mixture was heated at 75 ° C. for 45 minutes to perform a saponification treatment. After adding 5N hydrochloric acid to this, fatty acids were extracted with hexane. The specific activity of radioactivity contained in the obtained fatty acids was measured, and the amount of malonyl-CoA incorporated into the fatty acids by the fatty acid stretching reaction was determined.
  • FIG. 1 shows (a) expression level of LCE mRNA in cells in which LCE was forcibly expressed
  • FIG. 1 A graph showing LCE activity. As shown in FIG. 1, it was confirmed that cell lines with enhanced LCE expression could be obtained, and that LCE activity was also enhanced in these cell lines.
  • Example 7 Measurement of fatty acid composition contained in HEK293 cells
  • HEK293 cells were sonicated in a phosphate buffer, and C17: 0 triglycerides, cholesteryl oleestenole (cholesteryl) were used as internal standard substances.
  • Fig. 2 shows the results of comparison between fatty acids having a carbon chain length of 18 or more and fatty acids having a carbon chain length of 16 or less.
  • the cell line with increased LCE expression tends to increase the proportion of fatty acids C18 and higher, and the carbon chain elongation reaction progresses in proportion to the enhancement of LCE activity. Power S could be confirmed.
  • most of the fatty acids exist as esters such as triglycerides, cholesteryl esters, and phospholipids.
  • the increase in the expression of LCE tends to increase the composition ratio of fatty acids C18 and higher.
  • the change in LCE activity is thought to change the fatty acid composition ratio of the whole cell. We believe that it is a key factor in determining the fatty acid composition of cells.
  • FIG. 3 shows the result of comparing the composition of each fatty acid. As is evident from FIG. 3, it was confirmed that the cell line in which the expression of LCE was enhanced tended to increase the composition ratio of C18 or higher fatty acids.
  • Example 8 Suppression of human LCE expression by RNAi
  • siRNA small interfering RNA
  • RNA was prepared.
  • cDNA is prepared by the reverse transcription reaction, and the faqMan using the ABI PRISM 7700 Sequence Detector System.
  • FIG. 4 (a) shows the corresponding part of each siRNA in the LCE gene.
  • Figure 4 (b) shows LCE when each siRNA was introduced.
  • Figure 5 (a) shows the expression level of LCE mRNA.
  • FIG. 5 (b) is a graph showing elongation activity. As shown in FIGS. 5 (a) and (b), it was confirmed that the expression of LCE was specifically suppressed and the activity of LCE was suppressed.
  • siRNA_6 which has a strong expression suppression effect
  • LCE-siRNA_2 having a moderate expression suppression effect
  • RNA was prepared, gene expression analysis was performed using a DNA chip (manufactured by Affymetrix), and genes whose expression was reduced by introducing siRNA were selected.
  • Figure 6 shows LCE after siRNA introduction.
  • the expression of human FAS mRNA and human SCD mRNA was measured by TaqMan PCR using Sequence Detector System.
  • the standard curve is human FAS prepared by PCR.
  • FIG. 7 is a graph showing the expression levels of (a) LCE, (b) FAS and (c) SCD mRNA in H-marked G2 cells into which siRNA has been introduced. As shown in FIG. 7, the expression of LCE was remarkably reduced by the introduction of siRNA, while the expression of FAS and SCD was not as low as LCE, but was 40-60. It was confirmed that the expression decreased by about / o.
  • Example 8 The same experiment as in Example 8 was performed for mouse LCE. Based on the nucleotide sequence information of mouse LCE cDNA, an siRNA having the following sequence was synthesized. Each synthesized siRNA Transfected into 3T3-L1 cells and 24 hours later total
  • RNA was prepared. Next, cDNA was prepared by the reverse transcription reaction, and ABI PRISM 7700
  • mouse LCE mRNA The expression level of mouse LCE mRNA was measured by PCR.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of suppression of mouse LCE expression by RNAi.
  • A shows the corresponding part of each siRNA in the mouse LCE gene, and
  • b shows the mouse LCE when each siRNA was introduced.
  • (c) is a graph showing the expression level of mouse FAS mRNA when each siRNA was introduced. As shown in FIG. 8, it was confirmed that the expression of LCE and FAS was suppressed by each siRNA.
  • hLCE-siRNA-6 (identical to hLCE-siRNA-6, which is siRNA for human LCE described above) (6 siRNA in FIG. 8)
  • mLCE-siRNA-7 (m7 siRNA in Fig. 8)
  • Example 10 Effect of LCE RNAi on FAS mRNA expression in 3T3_L1 cells siRNA (hLCE_siRNA_6) was introduced into 3T3-L1 cells differentiated into adipocytes, and 24 hours later, total RNA was purified from the cells. Total obtained
  • CDNA is prepared from RNA by reverse transcription reaction, and mouse FAS is prepared by TaqMan PCR using ABI PRISM 7700 Sequence Detector System.
  • the expression level of mRNA was measured. A standard curve was created using a mouse FAS cDNA fragment prepared by PCR. The expression level of FAS was normalized by the expression level of ⁇ -actin. [0106] The primers and probes used for the measurement are as follows.
  • siRNA hLCE-siRNA-6
  • 3T3-L1 cells differentiated into adipocytes 14C- labeled sodium acetate was added to the medium.
  • 14C- labeled sodium acetate was added to the medium.
  • the cells were lysed with 0.1% SDS, and a 15% potassium hydroxide in methanol solution was added, followed by saponification by heating at 75 ° C for 45 minutes.
  • lipid components were extracted with black form methanol (2: 1). Extract the extracted lipid component with silica
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of (a) suppression of LCE and (b) FAS expression and (c) suppression of fatty acid synthesis by RNAi. As shown in FIG. 9, it was confirmed that suppressing the expression of LCE suppressed the synthesis of fatty acids.
  • Example 11 H mark LCE RNAi exerts on apolipoprotein B secretion in G2 cells
  • the siRNA (hLCE_siRNA_6) was introduced into HepG2 cells, and the medium was replaced 48 hours later. After the medium was replaced, the culture was incubated for 48 hours, the culture supernatant was collected, and the amount of apolipoprotein B secreted into the medium was quantified.
  • microplate EIA method Example 11
  • APO B TEST A standard curve was prepared using an apolipoprotein B standard solution, and the concentration of apolipoprotein B in the culture supernatant was determined. Controls have no homology to the mammalian gene, siRNA of sequence
  • Fig. 10 is a diagram showing the results of (a) suppression of LCE expression and (b) suppression of apolipoprotein B secretion by RNAi. As shown in FIG. 10, it was confirmed that suppressing the expression of LCE suppressed the secretion of apolipoprotein B.
  • Example 12 Effect of LCE RN on DIO mice
  • mice Seven-week-old mice (ICR, females) were bred for 23 weeks on a high calorie diet, MHFdiet, to form obesity. First, the mice were weighed before starting administration of siRNA.
  • mice (hLCE-siRNA 6) were administered from the tail vein of mice using HVJ-ribosome as a carrier (40 ⁇ g / mouse / injection). The administration was performed 5 times every other day, and the weight of the mice was measured 2 days after the final administration, and the change in body weight before and after administration of the siRNA was determined. Blood was collected from the orbital venous plexus and blood glucose levels were measured. Blood was collected from the abdominal vena cava and the plasma insulin concentration was measured. Controls show no effect in mammalian cells, scramble
  • mice to which the siRNA was administered were used.
  • FIG. 11 is a diagram showing changes in (a) body weight, (b) blood glucose level, and (c) plasma insulin level by siRNA administration. As shown in FIG. 11, the administration of siRNA against LCE to mice reduced body weight. In addition, it was also confirmed at the individual level that both the blood glucose level and the plasma insulin level were reduced, and that siRNA activity against LCE suppressed the activity of SLCE and exhibited an obesity ameliorating effect.
  • the expression level of receptor substrate (IRS) -2 mRNA was measured.
  • the standard curve was prepared using cDNA fragments of each gene prepared by PCR.
  • the expression level of each gene was normalized by the expression level of ⁇ -actin.
  • FIG. 21 is a graph showing the mRNA expression levels of (a) ACC, FAS, SCD1, SREBP-lc, IRS-2 and (b) LCE in the liver of a mouse administered with siRNA.
  • LCE By suppressing the expression of LCE, the expression of ACC, FAS, and SCD1, which are enzymes involved in fatty acid synthesis, is reduced, and the expression level of SREBP-lc, a transcription factor that regulates fatty acid synthesis, is also reduced.
  • SREBP-lc a transcription factor that regulates fatty acid synthesis
  • IRS-2 insulin receptor substrate-2
  • Example 13 Effect of LCE RNAi on fatty acid composition of cells in HepG2 cells
  • SiRNA (hLCE_siRNA_6) was introduced into HepG2 cells, and the cells were collected 72 hours later.
  • the cells were sonicated in a phosphate buffer, and C17: 0 neutral fat, cholesteryl ester, and phospholipid were added as an internal standard, and the lipid component was extracted by the Bligh-Dyer method. After the obtained lipid was dried under a nitrogen stream, silica
  • Table 2 shows the analysis results of the fatty acid composition. As can be seen from the results shown in Table 2, it was confirmed that when the expression of LCE was suppressed by RNAi, the constituent ratio of C18 or higher fatty acids was reduced in any of triglycerides, cholesteryl esters and phospholipids.
  • SREBP-1 sterol regulatory element binding protein-1 involved in lunar fatty acid synthesis
  • SREBP-2 sterol regulated in cholesterol synthesis
  • the cDNA fragment and the human SREBP-2 cDNA fragment were used for the preparation.
  • the expression level of each gene was normalized by the expression level of ⁇ -actin.
  • FIG. 12 is a graph showing the expression levels of SREBP-1 and SREBP-2 mRNA in siRNA-introduced G-marked G2 cells. As shown in FIG. 12, it was confirmed that the introduction of siRNA significantly reduced the expression of SREBP-1 but did not change the expression of SREBP-2.
  • SiRNA (hLCE-siRNA-6) was introduced into HepG2 cells, and after 72 hours, the medium was supplemented with 14 C-labeled sodium acetate. 0.1% cells 4 hours after addition
  • Saponification treatment was performed by heating at 75 ° C for 45 minutes. After adding 5N hydrochloric acid, lipid components were extracted with chloroform-form methanol (2: 1). Extract the extracted lipid component with silica
  • lipid component was directly extracted from a part of the above cell lysate with form-mouth methanol (2: 1).
  • the obtained lipid component was fractionated by thin-layer chromatography, and the neutral fat synthesizing ability was measured by measuring 14 C acetic acid incorporated in the neutral fat fraction.
  • the obtained values of fatty acid synthesis ability and neutral fat synthesis ability are specified by the amount of protein in the cell lysate. It has become.
  • Control siRNA with no homology to mammalian gene
  • HepG2 cells transfected with (scramble siRNA Duplex: Dharmacon, Inc) were used.
  • FIG. 13 is a diagram showing (a) a fatty acid synthesizing ability and (b) a neutral fat synthesizing ability in H-marked G2 cells into which siRNA has been introduced. As shown in FIG. 13, it was confirmed that the introduction of siRNA and the suppression of LCE expression reduced the ability to synthesize fatty acids and neutral fat.
  • Example 16 Effect of LCE RNAi on triglyceride content of HepG2 cells
  • siRNA H mark siRNA (hLCE_siRNA_6) was introduced into G2 cells, and the cells were collected 72 hours later. The cells were sonicated in a phosphate buffer and lipid components were extracted from a part of the cells by the Bligh-Dyer method. The resulting lipid was dried under a nitrogen stream, dissolved in 2-propanol, and the amount of neutral fat was measured by an enzymatic method. The obtained value of the amount of neutral fat was normalized by the amount of protein in the ultrasonic lysate of the cells. As controls, siRNAs with sequences that are not homologous to mammalian genes
  • HepG2 cells transfected with (scramble siRNA Duplex: Dharmacon, Inc) were used.
  • FIG. 14 is a graph showing the amount of neutral fat in the H-marked G2 cells into which the siRNA has been introduced. As shown in FIG. 14, it was confirmed that the introduction of siRNA to suppress the expression of LCE reduced the triglyceride content in the cells.
  • Example 17 Effect of LCE RNAi on fatty acid oxidation of cells in HepG2 cells
  • SiRNA (hLCE-siRNA-6) was introduced into HepG2 cells, and after 72 hours, 14 C palmitic acid was added to the medium. After incubating for 30 minutes, the medium was transferred to another tube, and 10% trichloroacetic acid was removed. The CO released from the medium is trapped with 10% aqueous sodium hydroxide solution.
  • the amount of CO produced by oxidation was determined. After the CO is released, the medium is centrifuged and
  • the lipid component was extracted from a part of the cell lysate with black form-methanol (2: 1) and fractionated by thin-layer chromatography. The specific activity of the neutral fat fraction was measured, and the amount of palmitic acid added to the medium was incorporated into the neutral fat in the cells. . The obtained values of the amount of CO, the amount of ketone bodies, and the amount of uptake into neutral fat were normalized by the mass of protein in the cell lysate. As controls, siRNA (scramble
  • FIG. 15 is a graph showing (a) the amount of CO production, (b) the amount of ketone bodies produced, and (c) the amount of palmitic acid incorporated into triglyceride in siRNA-introduced G2 cells.
  • siRNA was introduced to suppress the expression of LCE, the production of CO and ketone bodies increased, and the incorporation of noremitic acid into triglycerides decreased.
  • This result suggests that suppressing the expression of LCE promotes the burning of fatty acids, because CO and ketone bodies are produced with the burning of fatty acids.
  • Example 18 Effect of LCE RNAi on CPT-1 expression in cells in HepG2 cells [0131] Inhibition of LCE expression on CPT-1 (carnitine palmitoyl transferase-1), a transporter that imports fatty acids into mitochondria The effect of the test was investigated. H mark siRNA on G2 cells
  • ABI PRISM ABI PRISM
  • HepG2 cells transfected with (scramble siRNA Duplex: Dharmacon, Inc) were used.
  • the standard curve is human CPT-1 prepared by PCR.
  • FIG. 16 is a graph showing the expression level of CPT-1 mRNA in siRNA-introduced G-marked G2 cells. As shown in FIG. 16, it was confirmed that when the expression of LCE was suppressed by introducing siRNA, the expression level of CPT-1 was increased.
  • mice 8-week-old mice (ICR, male) were bred on a high sucrose diet (67% sucrose) for 3 days, and 7-week-old mice (ICR, male) were reared on a high sucrose diet for 10 days. After weighing, the mice were euthanized, and epididymal fat was excised and weighed. Uotal RNA was isolated from the liver of the mouse and purified, and the expression level of LCE mRNA in the liver was measured using TaqMan PCR.
  • LCE mRNA The expression level of LCE mRNA was normalized by the expression level of actin. Mice bred on a normal diet (CA_1) were used as controls.
  • FIG. 17 is a graph showing (a) body weight, (b) epididymal fat weight, and (c) LCE mRNA expression level in liver in mice loaded with a high sucrose diet. As shown in Fig. 17, high sucrose loading increased the body weight and fat weight of mice, and increased LCE in the liver.
  • Example 20 Effect of LCE RNAi administration on mice loaded with high sucrose diet
  • siRNA hLCE-siRNAi_6
  • mice 7 weeks old, ICR, male
  • tail vein 40 ⁇ g / mouse / injection
  • mice were bred on a high sucrose diet.
  • a mouse to which scramble siRNA having no effect on mammalian cells was administered was used.
  • the administration of siRNA was performed 5 times every other day. (Minispec; mq7.5) to determine the fat weight / body weight ratio. Blood was collected from the abdominal vena cava and plasma lebutin concentration was measured.
  • FIG. 18 is a graph showing (a) body fat mass, (b) fat weight / body weight ratio, and (c) plasma leptin concentration of mice administered with siRNA. Suppression of LCE expression by administration of LCE RNAi suppressed an increase in body fat mass due to high sucrose loading. Similarly, the increase in the fat weight / body weight ratio was suppressed. This indicates that suppression of LCE expression inhibits obesity formation due to high sucrose consumption (anti-obesity effect). Lebutin also secretes adipose tissue power, so that as fat weight increases, the concentration of secreted lebutin increases.
  • an increase in lebutin due to a high sucrose diet load means an increase in fat mass
  • a decrease in leptin concentration in the LCE RNAi-treated group was due to a decrease in leptin concentration after LCE RNAi administration. It means that the increase in weight was suppressed.
  • the liver was excised, the total RNA was purified from a part thereof, and the expression levels of LCE mRNA and FAS mRNA in the liver were measured using TaqMan PCR.
  • the expression level of mRNA was normalized by the expression level of j3-actin.
  • a part of the liver was homogenized in a phosphate buffer, and lipid components were extracted by the Bligh-Dyer method.
  • the obtained lipid was dried under a nitrogen stream, dissolved in 2-propanol, and the amount of neutral fat was measured by an enzymatic method.
  • the obtained value of the amount of neutral fat was normalized by the amount of protein contained in the liver homogenized solution.
  • a microsomal fraction was prepared from liver tissue, and the change in the amount of LCE protein was measured by Western blotting.
  • FIG. 19 is a graph showing (a) the expression level of LCE mRNA, (b) the expression level of FAS mRNA, and (c) the content of neutral fat in the liver of a mouse administered with siRNA. From FIG. 19 (a), it was confirmed that LCE expression in the liver was enhanced by a high sucrose diet load, that is, LCE expression in the liver was enhanced during the process of obesity formation. Also, LCE
  • FIG. 20 is a graph showing changes in the amount of LCE protein in the liver of mice to which siRNA was administered. The relationship between fatty acid synthesis and LCE expression level shown in FIG. 19 could also be confirmed at the LCE protein level.
  • Example 21 Amino acid substitution of human LCE and change in LCE activity by the substitution
  • Human LCE cDNA was prepared by adding a forward primer (hLCE_5BamHI) with a BamHI site and a reverse primer with an Xhol site.
  • CTCGAGCTATTCAGCTTTCGTTGTT (SEQ ID NO: 94)
  • cDNA encoding the mutated LCE was prepared by introducing point mutations using the PCR method. The method for introducing a point mutation is described below. First, hL is used as the forward primer and E— is used as the reverse primer. Mutagenic primer for each mutant is used. LCE introduced by PCR
  • LCE was determined by PCR using hLCE_510S as the forward primer and T7 as the reverse primer.
  • the 3 'portion of the cDNA was made.
  • the resulting mixture of the mutagenized LCE cDNA 5 'fragment and the LCE cDNA 3' fragment was
  • the prepared mutagenesis LCE is as follows. Mutations introduced into human LCE were those in which cysteine 99 was replaced with alanine (C99A), those in which cysteine 225 was replaced with alanine (C225A), and that of histidine 141 was alanine (H141A) The histidine at the 144th was converted to alanine (H144A), the histidine at the 145th was converted to alanine (H145A), and the histidine at the 174th was converted to alanine (H147A).
  • sequences of the primers used for the mutagenesis are as follows.
  • mutant LCE cDNA fragment was subcloned into plasmid pCMV_Tag2B using the restriction enzymes EcoRI and Xhol to prepare a mutant LCE expression construct. These constructs were converted to Lipofectamine2000
  • FIG. 22 is a graph showing the LCE activity of the LCE mutant.
  • A shows the LCE activity of the mutant in which cysteine was replaced with alanine
  • (b) shows the LCE activity of the mutant in which histidine was replaced with alanine. All mutants have less than half the LCE activity compared to the wild type.
  • metabolic diseases and circulatory diseases using substances having an activity of suppressing long-chain fatty chain elongase activity for example, sieves, low molecular weight compounds, proteins, antibodies, etc.
  • substances having an activity of suppressing long-chain fatty chain elongase activity for example, sieves, low molecular weight compounds, proteins, antibodies, etc.
  • metabolic diseases include obesity, diabetes, hormonal abnormalities, hyperlipidemia, gout, and fatty liver.
  • circulatory diseases include angina pectoris, acute / congestive heart failure, myocardial infarction, coronary arteriosclerosis, hypertension, kidney disease, electrolyte abnormalities, and the like.
  • Central nervous system diseases include bulimia.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　肥満又は痩せの検査において、LCE遺伝子又はタンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルや、当該遺伝子における多型等に基づいた検査をする。また、肥満又は痩せの治療薬のスクリーニング等をはじめとする化合物の評価において、LCE遺伝子又はタンパク質の性質を利用して当該評価をする。

Description

明 細 書
LCEによる肥満治療に有効な化合物の評価方法
技術分野
[0001] 本発明は、 LCE Oong chain fatty acyl elongase)遺伝子又はタンパク質を用いた肥 満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法に関する。また、本発明は、前記遺 伝子又はタンパク質を用いた肥満の検查方法に関する。
^景技術
[0002] 肥満は、高血圧症、糖尿病、高脂血症、虚血性心疾患等に代表される種々の成人 病の危険因子である。また、これらの多くは慢性疾患であることから、将来的には医 療費の高騰の原因になると考えられ、社会的にも大きな問題となっている。
[0003] このような肥満を防止するために抗肥満薬の開発が進められており、現在では、食 欲抑制剤や脂質吸収阻害剤が臨床的に利用されている。ここで、抗肥満薬研究の 標的分子としては、これまでにレプチン、 PPAR y、ニューロペプチド Y等が知られて いる力 肥満の原因は非常に多様であるため、創薬標的として作用機序の異なった 標的分子が待望されている。
[0004] また、このような肥満状態あるいはその原因を適切に診断することは、その後の適 切な治療にとって不可欠であるため、簡便で精度の高い肥満マーカーの出現が望ま れている。また、近年、投与した薬剤の効果が被投与者の遺伝子多型等の遺伝子型 に影響を受ける現象が見出されており、薬剤の開発段階における臨床試験やいわゆ るオーダーメイド医療において、分子レベルでの検查ゃ診断のマーカーが待望され ている。
[0005] 一方、脂肪酸の生合成はァセチル CoAカルボキシラーゼと脂肪酸合成酵素によつ て行われる。 LCE (Accession No.NM_024090 (ヒト：配列番号 1)； NM_130450 (マウス: 配列番号 2) )は、脂肪酸合成酵素の一種であり、ァセチル CoAを基質として合成が 始まる脂肪酸合成経路において、ラウリン酸からミリスチン酸、ミリスチン酸力 パルミ チン酸、ノルミチン酸カ ステアリン酸、パルミトレイン酸からワクセン酸等、主に炭素 数が 12以上の脂肪酸の炭素鎖の伸長を司ることが知られている (J. Biol. Chem. , 276(48), 45358-45366 (2001) ;非特許文献 1)。
[0006] 例えば、 WO02/44320号公報（特許文献 1)には、 ELG5(LCE)が多不飽和脂肪酸（ PUFA)を基質としてェロンゲース (elongase)としての活性を有することが記載されてレヽ る。また、糖尿病モデルラットである STZ
induced diabetic ratの肝臓においてェロンゲースの活性が亢進する旨の報告（ Suneja et al., 1990, Biochem. Biophys.
Acta, 1042: 81-85 ;非特許文献 2)を引用して、ェロンゲースが糖尿病等の疾患に関 与するとの記載がある。
[0007] また、摂餌によりマウス FACE(LCE)の発現量が変化する旨の報告もある（
Matsuzaka T. et al., J. Lipid Res., 43(り
911-20 (2002) ;非特許文献 3)。
[0008] 特許文献 l : WO02/44320号
非特許文献 1 : J. Biol. Chem., 276(48), 45358-45366, (2001)
非特許文献 2： Suneja et al., Biochem. Biophys. Acta, 1042: 81-85 (1990)
非特許文献 3 : Matsuzaka T. et al" J. Lipid Res., 43(6): 911-20 (2002)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] し力 ながら、前記文献には、 LCEと肥満とについて直接的に示したデータは開示 されておらず、また、その際、 LCEの飽和脂肪酸に対するェロンゲース活性が重要な 役割を果たすことについては何ら示されていなかった。
[0010] 本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、 LCEと肥満と の直接的な関係を示すことにより、分子レベルで判断可能な肥満又は痩せの検査方 法及び当該分子を用いた肥満及び痩せの検査薬等を提供することを目的とする。ま た、肥満又は痩せの治療薬や診断薬をスクリーニングする等、化合物の評価方法を 提供することを目的とする。さらに、脂肪合成の抑制や肥満の抑制をする方法を提供 することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、体重変化と LCEの 発現量との間に一定の相関関係があることを見出し、本発明を完成した。
[0012] すなわち、本発明は、以下の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法（1 )一 (4)を提供する。
(1)被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、該被検 化合物が、該被検動物又は該被検細胞中で LCE遺伝子あるいは該遺伝子と機能的 に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程と、を含むことを特 徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
(2)被験化合物を、 LCE遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子 を有する被検動物又は被検細胞に接触させる工程と、該レポーター遺伝子の被検 動物又は被検細胞中での発現レベルを測定する工程と、を含むことを特徴とする肥 満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
(3)被検化合物を、 LCEタンパク質に接触させる工程と、該被検化合物が、該タンパ ク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする肥満の 治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
(4)被検化合物を、 LCEを含む複数種のェロンゲ一スタンパク質に接触させる工程と 、該複数種のェロンゲ一スタンパク質の活性を測定する工程と、該複数種のエロンゲ 一スタンパク質において LCEの活性を阻害する被検化合物を選択する工程と、を含 むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[0013] ここで、前述した本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法によつ て得られた化合物を有効成分として含有する肥満の治療又は予防剤も本発明に含 まれる。
[0014] 本発明は、また、 LCEの脂肪酸合成活性を抑制することを特徴とする脂肪合成抑 制方法を提供する。ここで、 LCEの脂肪酸合成活性を抑制する手段は特に制限され ないが、 RNAi(RNA
interference)により抑制することが好ましレ、。 RNAiは、配列番号 13及び 14に記載の 核酸力、らなる siRNA、配列番号 15及び 16に記載の核酸からなる siRNA
(small interfering RNA)、配列番号 17及び 18に記載の核酸からなる siRNA、配列番 号 19及び 20に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 21及び 22に記載の核酸から なる siRNA、配列番号 23及び 24に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 25及び 26 に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 27及び 28に記載の核酸からなる siRNA、酉己 列番号 29及び 30に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 31及び 32に記載の核酸 力 なる siRNA、配列番号 33及び 34に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 35及び 36に記載の核酸力、らなる siRNA、配列番号 37及び 38に記載の核酸からなる siRNA、 配列番号 49及び 50に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 51及び 51に記載の核 酸からなる siRNA及び配列番号 53及び 54に記載の核酸からなる siRNAからなる群か ら選択される一以上の siRNAを使用することにより達成されるが、特に、配列番号 23 及び 24に記載の核酸からなる siRNAを使用することが好ましい。
[0015] 本発明は、また、 LCEの脂肪酸合成活性を RNAiにより抑制することを特徴とする肥 満の治療又は予防方法を提供する。ここで、 LCEの脂肪酸合成活性を抑制する手段 は特に制限されないが、 RNAiにより抑制することが好ましレ、。 RNAiは、上述の siRNA を使用することにより達成されるが、特に配列番号 23及び 24に記載の核酸からなる siRNAを使用することが好ましい。
[0016] 本発明は、また、以下の肥満の検査方法（1)一（4)を提供する。
(1)被検組織又は被検細胞における LCE遺伝子の発現レベル又は発現レベルの変 化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
(2)被検組織又は被検細胞における LCEタンパク質の発現レベル又は発現レベル の変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
(3)被検組織又は被検細胞における LCE遺伝子に存在する多型を検出することを特 徴とする肥満の検査方法。
(4) LCEタンパク質と相互作用することにより LCE遺伝子の発現量に影響を及ぼすタ ンパク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
[0017] 本発明は、さらに、配列番号 23及び 24に記載の核酸からなることを特徴とする siRNAを提供し、当該 siRNAを含むことを特徴とする LCE発現抑制剤、脂肪合成抑制 剤及び肥満の治療又は予防剤を提供する。
発明の効果
[0018] 本発明の化合物の評価方法等によれば、 LCEと肥満との直接的な関係が明らかと なり、分子レベルで判断可能な肥満又は痩せの検査方法及び当該分子を用いた肥 満及び痩せの検査薬等を提供することが可能となる。また、肥満又は痩せの治療薬 や診断薬のスクリーニング等、化合物の評価方法を提供することが可能となる。さら に、脂肪合成の抑制や肥満の抑制をする方法を提供することが可能となる。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、 LCEを強制発現させた細胞における、 (a)LCE mRNAの発現量、及び (b)LCE活性を表すグラフである。 HEK293は非処理の細胞を、 A5は LCEが中程度発 現している細胞を、 D8は LCEが高発現している細胞を、それぞれ表す。
[図 2]図 2は、 LCEを強制発現させた細胞における脂肪酸組成を表すグラフである。 黒色部分は炭素鎖の炭素数が 18以上の脂肪酸を、白色部分は炭素鎖の炭素数が 16以下の脂肪酸を表す。（a)— (c)はトリグリセリドを構成する脂肪酸の組成を表し、 (d) 一 (f)はコレステロールエステルを構成する脂肪酸の組成を表し、（g)— (i)はリン脂質を 構成する脂肪酸の組成を表す。 wtは非処理の HEK293細胞を表す。
[図 3]図 3は、 LCEを強制発現させた細胞における詳細な脂肪酸組成を表- ある。（a)はトリグリセリドを構成する脂肪酸の組成を表し、（b)はコレステロ一 ルを構成する脂肪酸の組成を表し、（c)はリン脂質を構成する脂肪酸の組成を表す。
[図 4]図 4は、 RNAiによる LCEの発現抑制の結果を表す図である。（a)は LCE遺伝子に おける各 siRNAの対応部分を表し、（b)は各 siRNAを導入した場合の LCEmRNAの発 現量を表している。
[図 5]図 5は、 RNAiによる LCEの活性抑制の結果を表すグラフである。（a)は LCE mRNAの発現量を表し、（b)は Fatty Acyl CoAの伸長活性を表している。 LCERNAiは 、 hLCE-siRNA_6を用いて LCEの RNAiを行ったことを表す（以下、特に断らない限り 同様である）。
[図 6]図 6は、 siRNAを導入した H印 G2細胞における LCE mRNAの発現量を表すグラ フである。（a) : 24時間後、（b) : 48時間後。
[図 7]図 7は、 siRNAを導入した H印 G2細胞における（a) LCE、（b) FAS及び（c) SCDの mRNAの発現量を表すグラフである。
[図 8]図 8は、 RNAiによるマウス LCEの発現抑制の結果を表す図である。（a)はマウス LCE遺伝子における各 siRNAの対応部分を表し、（b)は各 siRNAを導入した場合のマ ウス LCEmRNAの発現量を表し、（c)は各 siRNAを導入した場合のマウス FAS mRNAの 発現量を表している。
[図 9]図 9は、 RNAiによる (a)LCE及び (b)FASの発現抑制並びに (c)脂肪酸合成抑制の 結果を表す図である。
[図 10]図 10は、 RNAiによる (a)LCEの発現抑制及び (b)アポリポタンパク質 Bの分泌抑 制の結果を表す図である。
[図 11]図 11は、 siRNA投与による (a)体重、（b)血糖値及び (c)血漿インスリンの変化を 表す図である。 scramble RNAiは、哺乳類では効果を示さない scramblesiRNAを用レヽ て RNAiを行つたコント口ールを表す。
[図 12]siRNAを導入した H印 G2細胞における SREBP-1及び SREBP-2の mRNAの発現 量を表すグラフである。
[図 13]図 13は、 siRNAを導入した H印 G2細胞における (a)脂肪酸合成能及び (b)中性 脂肪合成能を表す図である。
[図 14]図 14は、 siRNAを導入した H印 G2細胞中の中性脂肪量を表すグラフである。
[図 15]図 15は、 siRNAを導入した H印 G2細胞における (a)CO産生量、（b)ケトン体産 生量及び (c)パルミチン酸の中性脂肪への取り込み量を表すグラフである。
[図 16]図 16は、 siRNAを導入した H印 G2細胞における CPT-1 mRNAの発現量を表す グラフである。
[図 17]図 17は、高スクロース食を負荷したマウスにおける (a)体重、（b)精巣上体の脂 肪重量及び (c)肝臓における LCE mRNAの発現量を表すグラフである。 CA-1は通常 食を与えたマウスを表し、 HSD(3days)及び HSD (lOdays)は、それぞれ、高スクロース 食を 3日間及び 10日間与えたマウスを表す。
[図 18]図 18は、 siRNAを投与したマウスの (a)体脂肪量、（b)脂肪重量 Z体重比及び (c)血漿レプチン濃度を表すグラフである。 HSD SCR-RNAiは、高スクロース食を負荷 したマウスに哺乳類では効果を示さなレ、 scramblesiRNAを投与したことを表す。 HSD LCE-RNAiは高スクロース食を負荷したマウスに hLCE-siRNA_6を投与したことを表 す。 [図 19]図 19は、 siRNAを投与したマウスの (a)LCE mRNAの発現量、（b)FAS mRNAの 発現量及び (c)肝臓における中性脂肪含量を表すグラフである。
[図 20]図 20は、 siRNAを投与したマウスの肝臓における LCEタンパク質量の変化を表 す図である。
[図 21]図 21は、 siRNAを投与したマウスの肝臓における (a)ACC、 FAS、 SCD1、
SREBP-lc、 IRS-2及び (b)LCEの mRNAの発現量を表すグラフである。
[図 22]図 22は、 LCE変異体の LCE活性を表すグラフである。（a)はシスティンをァラニ ンに置換した変異体の LCE活性を表し、（b)はヒスチジンをァラニンに置換した変異体 の LCE活性を表している。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
[0021] 本発明における「発現レベル」とは LCE遺伝子の転写産物の絶対量又は相対量を いう。この場合、当該遺伝子は、 DNA又は mRNAのいずれをも含む。また、発現の検 出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、 LCE遺伝子の翻訳産物の絶対 量又は相対量をいう。
[0022] また、本発明における「被検動物」とは、化合物の評価に使用できる動物であれば、 その種は特に限定されなレ、が、具体的には、例えば、マウス、ラット、モルモット、ゥサ ギ、ィヌ、サルが挙げられる。
[0023] また、本発明における「被検組織」とは、肥満又は痩せの検查を行う際に生体から 抽出可能な組織であれば、その種類は特に限定されないが、肥満又は痩せの影響 が反映されやすいとの観点から、例えば、肝臓組織、脂肪組織、筋肉組織、血液組 織であることが好ましい。また、組織の単離が容易であるとの観点から、前記組織の 中でも血液組織であることが好ましい。ここで、これらの組織の由来となる動物種につ レ、ては特に制限されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから 、ヒトであることが好ましい。
[0024] また、本発明における「被検細胞」についても、肥満又は痩せの検査を行う際に生 体力 抽出可能な細胞であれば、その種類は特に限定されないが、肥満又は痩せ の影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞 、褐色脂肪細胞等）、筋肉細胞（筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等）、膝細胞（ 膝島細胞等）、血球細胞であることが好ましい。ここで、かかる組織の由来となる動物 種については特に限定されなレ、が、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用である こと力 、ヒトであることが好ましい。
[0025] さらに、本発明における「肥満」とは、脂肪組織が過剰に蓄積した状態と定義される 一般的な肥満に加え、これに糖尿病や高血圧等の合併症又は内臓脂肪が伴う、い わゆる「肥満症」も含む。また、本発明における「肥満」は、薬物投与等による体重の コントロールを受けた場合に、もとの体重と比較して相対的に体重が増加した状態を も意味する。
[0026] また、本発明における「検査」とは、肥満又は痩せであることを単に判断するのみな らず、将来的な肥満又は痩せを「予測」する場合をも含む。
[0027] また、本発明における「ェロンゲース活性」とは、脂肪酸又は Fatty acy卜 CoAの炭素 鎖を伸長させる活性を意味する。
[0028] (1)肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法
本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法について説明する。被 検化合物を被検動物ゃ被検細胞に投与、接触させることにより変動する LCE遺伝子 の発現量を測定したり、被検化合物を LCEタンパク質に接触させて当該タンパク質の 活性に及ぼす影響を検討したりすることにより、当該被検化合物の評価を行うことが 可能となる。
[0029] すなわち、このような被検化合物の中には、細胞や組織に作用することにより、 LCE 遺伝子の発現レベルや LCEタンパク質の活性を正常化あるいはコントロールし、脂肪 の蓄積や食欲のコントロール等、肥満の原因となるメカニズムの正常化を図ることが できるものがあると考えられる。従って、以下に説明するような評価方法により、肥満 の治療薬又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
[0030] (A) LCE遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方法
被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、当該被検化合物が被 検動物又は被検細胞中で LCE遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子 の発現レベルを調節するか否かを確認することにより、肥満の治療又は予防に有効 な化合物を評価することが可能となる。
[0031] 具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。
先ず、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる。ここで、被検 化合物としては、肥満の治療又は予防薬の候補化合物であれば、その構造や性質 は問わず、化合物種も限定されない。被検化合物を被検動物に投与する方法として は特に制限はなぐ具体的には、例えば、経口投与、非経口投与 (例えば、経皮投 与、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射）力 S挙げられる。また、被検化合物を被検細 胞に接触させる方法としても特に制限はなぐ具体的には、例えば、培養液や緩衝液 (リン酸緩衝液等)等の溶液中で混合し両者を接触させる方法が挙げられる。
[0032] 次に、被検化合物が被検動物又は被検細胞中で LCE遺伝子あるいは当該遺伝子 と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する。
[0033] 前記遺伝子の発現レベルの調節の有無の確認法としては、特に制限はなぐ前述 の投与又は接触の前を対照とし、当該遺伝子の発現量の変化を RT-PCRのような遺 伝子増幅法、 DNAマイクロアレイを用いる方法又はノーザンハイブリダィゼーシヨン法 等によって検出することにより実施することができる。また、前記遺伝子の発現調節領 域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細胞を用いても よい。この場合、レポーター遺伝子としては、具体的には、例えば、 —ガラクトシダ ーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルォレツセンスプロテイン遺伝子 が挙げられる。
[0034] ここで、「LCE遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、 LCE遺伝子と塩基配列は異 なるものの、比較的高い相同性を示し、 LCEと同じ又は類似の活性を有する遺伝子 を示す。ここで、前記相同性は、遺伝子の機能が等価であれば特に制限はないが、 塩基配列の相同性が 70— 100%であることが好ましぐ 80 100%であることがより 好ましぐ 90 100%であることがさらに好ましぐ 95 100%であることが特に好ま しい。相同性が前記下限より低い場合には、 LCEと同じ又は類似の機能を示さない 可能性が高い傾向にある。し力、しながら、塩基配列の相同性が前記下限未満であつ ても、 LCEに特有の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相 同性が高い場合には LCE遺伝子と同様又は類似の機能を有する場合がある。このよ うな遺伝子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。 また、比較的相同性の高い遺伝子としては、 LCE遺伝子における 1又は 2以上の塩 基が自然若しくは人工的に置換、欠失、不可及び/又は挿入したものであってもよ レ、。
[0035] 被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触 させた場合の LCE遺伝子又は LCE遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルが 20%以上、好ましくは 50%以上低下した場合、当該被検化合物は肥満の治療又は 予防に有効な化合物と評価できる。
[0036] (B) LCEタンパク質の活性を指標とする評価方法
被検化合物を LCEタンパク質に接触させ、被検化合物が当該タンパク質の活性に 影響を与えるか否力 ^確認することにより、肥満の治療又は予防に有効な化合物を 評価することが可能となる。
[0037] 具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。
先ず、被検化合物を LCEタンパク質に接触させる。このようなタンパク質と被検化合 物を接触させる方法としては、特に制限はなぐ具体的には、例えば、緩衝液（リン酸 緩衝液等）等の溶液中で混合し接触させる方法が挙げられる。
[0038] 次に、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する。タン パク質の活性測定における条件は、使用するタンパク質の性質により適宜設定すれ ばよレ、。このような条件としては、具体的には、例えば、 LCEタンパク質の場合には、 ェロンゲース活性を指標とすることができ、具体的には、例えば、細胞から抽出したミ クロソーム画分を、 NADPH、パルミトイル CoA、 14C標識マロニル CoA等を含む溶液中 で混合してインキュベートし、脂肪酸を抽出した後、脂肪酸に含まれる放射性比活性 を測定することによりェロンゲース活性を測定することができる。また、 J.
Biol. Chem. , 276(48)，45358_45366, (2001)を参照して行うこともできる。
[0039] 被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触 させた場合の LCEタンパク質の活性が 20%以上、好ましくは 50%以上低下した場合 、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
[0040] 以上説明したような本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法に より、肥満の治療薬や診断薬のスクリーニングや、これらの薬剤の有効性又は安全性 の評価、さらには、オーダーメイド治療における適切な薬剤の選択が可能となる。
[0041] (C) LCEタンパク質を阻害する化合物の評価方法
被検化合物を、 LCEを含む複数種のェロンゲ一スタンパク質に接触させ、当該複数 種のェロンゲ一スタンパク質の活性を測定した後、 LCEの活性を阻害する被検化合 物を選択することにより、ェロンゲースの中でも LCEのェロンゲース活性を阻害する化 合物を評価 ·選択することが可能となる。
[0042] 具体的には、以下の手順で評価を行う。
先ず、被検化合物を、 LCEを含む複数種のェロンゲ一スタンパク質にそれぞれ接 触させる。このようなタンパク質と被検化合物を接触させる方法としては、特に制限は なぐ具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触させ る方法が挙げられる。ここで、複数種のェロンゲースとは、ェロンゲース活性を有する ものであればその種類は特に制限されなレ、が、具体的には、例えば、 FAS (Fatty Acid Synthase) , ELO-1が挙げられる。
[0043] 次に、被検化合物がそれぞれのタンパク質の活性に影響を与えるか否力を確認す る。タンパク質の活性測定における条件は、使用するタンパク質の性質により適宜設 定すればよい。このような条件としては、例えば、 LCEタンパク質の場合には、ェロン ゲース活性を指標とすることができ、具体的には、 J. Biol. Chem. , 276(48),
45358-45366, (2001)を参照して行うことができる。また、他のェロンゲースにおいて は、 LCEと同様にェロンゲース活性を指標にすればよぐ公知の方法に従って活性 測定を行えばよいが、例えば、前記の』.
Biol. Chem. , 276(48), 45358-45366, (2001)を参照して実施することができる。
[0044] 以上説明したような本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法に より、肥満の治療薬又は診断薬のスクリーニングや、これらの薬剤の有効性又は安全 性の評価、さらには、オーダーメイド治療における適切な薬剤の選択が可能となる。
[0045] (2)脂肪合成抑制方法及び肥満の治療又は予防方法
次に、本発明の脂肪合成抑制方法及び肥満の治療又は予防方法について説明す る。 LCEは脂肪の構成成分である脂肪酸の合成酵素であることから、かかる酵素活性 を阻害することにより脂肪酸の合成を阻害することが可能となり、ひいては、脂肪の合 成を阻害することが可能となる。
[0046] 具体的には、以下の手順で脂肪合成抑制を行う。
先ず、 LCEの活性を阻害する物質を選択する。かかる物質としては、例えば、 LCE 阻害剤として機能する化合物、 LCEの抗体、アンチセンスヌクレオチド及び RNAiに使 用する siRNA (small
interfering RNA;センス RNA.アンチセンス RNAの二本鎖 RNA)が挙げられる。
[0047] 次に、 LCEが存在する個体、組織、細胞に対して前記の物質を導入する。具体的 には、対象が個体であれば、導入方法としては特に制限はないが、前記化合物等を 、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は 経口的に導入する方法が挙げられる。また、対象が組織であれば、導入方法として は特に制限はないが、組織中への注入、緩衝液中での混合により導入する方法が 挙げられる。さらに、対象が細胞であれば、導入方法としては特に制限はなレ、が、緩 衝液中での混合、エレクト口ポレーシヨン等が挙げられる。
[0048] より具体的には、 RNAiの場合、例えば、リボソームに封入した siRNAを細胞培養液 に添カ卩し細胞に接触させることで細胞内に siRNAを導入でき、 RNAiを起こすことがで きる（Nature,
411, 494-498,(2001)、 J. Cell ScL, 114(Pt 24), 4557-4565, (2001)、 Biochem. Biophys. Res. Commun., 301(3)， 804-809, 2003)。 LCEの RNAiには、以下の siRNAを 用いることができる。 hLCE-siRNA-l (配列番号 13及び 14)、 hLCE-siRNA-2 (配列番 号 15及び 16)、 hLCE-siRNA-3 (配列番号 17及び 18)、 hLCE-siRNA-4 (配列番号 1 9及び 20)、 hLCE-siRNA-5 (配列番号 21及び 22)、 hLCE-siRNA-6 (配列番号 23及 び 24)、 LCE-siRNA-2 (配列番号 25及び 26)、 hLCE-siRNA-7 (配列番号 27及び 2 8)、 hLCE-siRNA_8 (配列番号 29及び 30)、 hLCE-siRNA-9 (配列番号 31及び 32) 、 hLCE-siRNA_10 (配列番号 33及び 34)、 hLCE-siRNA-l l (配列番号 35及び 36)、 hLCE-siRNA- 12 (配列番号 37及び 38)、 hLCE-siRNA-6 (配列番号 49及び 50)、 mLCE-siRNA_7 (配列番号 51及び 52)及び mLCE_siRNA-l l (配列番号 53及び 54) 。これらの siRNAを複数組み合わせて使用することにより RNAiを生じさせてもよレ、。こ れらの中でも、 hLCE-siRNA-6 (配列番号 23及び 24)は LCEの発現抑制作用が特に 強いため、 LCEの RNAiに適してレヽる。
[0049] このように LCEの活性を阻害することにより、脂肪酸の炭素鎖の伸張反応が抑制さ れ、脂肪酸の生合成が抑制される。
[0050] また、力、かる脂肪合成抑制方法を肥満の治療又は予防に応用することができる。す なわち、生体内で LCEの活性を阻害することにより脂肪酸の合成を抑制し、結果的に 脂質の合成を抑制することにより肥満の治療又は予防が可能となる。
[0051] 具体的には、以下の手順で肥満の治療又は予防を行う。
先ず、 LCEの活性を阻害する物質を選択する。かかる物質としては、例えば、 LCE 阻害剤として機能する化合物、 LCEの抗体、アンチセンスヌクレオチド及び RNAiに使 用する siRNAが挙げられる。
[0052] 次に、このような物質を生体内に投与する。投与方法としては、特に制限はないが、 例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉 的又は経口的な投与方法が挙げられる。 RNAiを用いた具体的な方法については、 脂肪合成抑制方法で説明した通りである。
[0053] (3)肥満又は痩せの検査方法
次に、本発明の肥満又は痩せの検査方法について説明する。
[0054] (A) LCE遺伝子の発現レベルを測定することによる肥満または痩せの検査方法 被検組織又は被検細胞における LCE遺伝子の発現レベルの変化を検出することに より、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽出し た生体 (例えばヒト）が肥満であるか否かを検査 ·診断することが可能である。また、単 に検查時の肥満の状態を検查するのみならず、将来的に肥満又は痩せになりうるか を予測することも可能である。
[0055] 以下に、このような検査の具体的な方法について説明する。
先ず、検査対象となる生体より被検組織又は被検細胞を抽出する。このような抽出 の方法としては特に制限はなぐ公知の方法により抽出することができる。
[0056] 次に、抽出された被検組織又は被検細胞から発現レベルの測定の対象となる遺伝 子を調製する。 LCE遺伝子の発現レベルを測定するには、先ず、被検組織又は被検 細胞力ら LCEの RNA (total RNA又は mRNA)を調製する必要がある。このような RNA の調製は、公知の方法によって行うことができる力 例えば、 Molecular
cloning A LABORATORY MANUAL 2nd EDITION (1989)(T. Maniatis著： Cold Spring Harbor
Laboratory Press) 7.3-7.36を参照して行うことができる。こうして調製した RNAを用レヽ て、例えば、 RT- PCRのような遺伝子増幅法、 DNAマイクロアレイ（例えば、 Affymetrix 社製 DNAチップ）を用いる方法、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法により、その発現 量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いたイン サイチュ ノヽ イブリダィゼーシヨン（in
situ hybridization)等により、その発現量を測定することもできる。
[0057] また、 LCE遺伝子の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定を当 該発現量が変化すると予測される期間の前後 (例えば、肥満治療薬の投与の前後） について行い、発現量の差を測定すればよい。具体的には、被検組織又は被検細 胞において、前述した LCE遺伝子の発現量が変化すると予測される期間の前後で、 その発現レベルが有意に上昇した場合に、体重の増加があった又は将来的に増加 する可能性があると診断できる。
[0058] (B) LCEタンパク質の発現レベルを測定することによる肥満又は痩せの検査方法 被検組織又は被検細胞における LCEタンパク質の発現レベルの変化を検出するこ とにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を抽 出した生体 (例えばヒト）が肥満であるか否かを検査 ·診断することが可能である。また 、単に検査時の肥満状態を検査するのみならず、将来的に肥満又は痩せになりうる 力、を予測することも可能である。
[0059] 以下、このような検査の具体的な方法について説明する。
タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、生体から単離したタンパク質を 定量する方法やタンパク質の血中濃度を測定する方法があり、具体的な方法として は特に限定されなレ、。生体から単離したタンパク質を定量する方法の具体例としては 、以下のとおりである。先ず、被検組織又は被検細胞から LCEタンパク質を調製する 。このようなタンパク質の調製は、公知の方法によって行うことができる。こうして調製 したタンパク質から、例えば、プロテインチップ（例えば、 CIPHERGEN社製プロテイン チップシステム）を用いる方法、免疫学的方法（例えば、 ELISA、 EIA法、ウェスタンブ ロッテイング法）により、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検 細胞を用いた免疫染色等によって、その発現量を測定することもできる。一方、タン パク質の血中濃度を測定する方法の具体例としては、生体から採取した血液を用い て、上記免疫学的方法等により、 LCEタンパク質を定量する方法が挙げられる。
[0060] 以上のようにして、 LCEの遺伝子又はタンパク質の発現レベルを測定した後、その 結果を解析することにより、被検体の肥満を検查できる。すなわち、本発明より、 LCE タンパク質の発現レベルと体重は一定の相関関係を有することが明らかになつたた め、上記検査結果と対照群 (健常人等）における LCEタンパク質の発現量とを比較す ることにより、肥満の程度を判断することが可能となる。また、本発明の検查方法によ れば、単に検查時の肥満の状態を検查するのみならず、将来的な肥満又は痩せの 可能性の予測も可能となる。
[0061] また、 LCEタンパク質の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測定 を当該発現量が変化すると予測される期間の前後 (例えば、肥満治療薬の投与の前 後）について行い、発現量の差を測定すればよい。具体的には、被検組織又は被検 細胞において、前述した LCEタンパク質の発現量が変化すると予測される期間の前 後でその発現レベルが有意に上昇した場合に、体重の増加があった又は将来的に 増加する可能性があると診断できる。
[0062] (C) LCE遺伝子の遺伝的多型を検出する肥満又は痩せの検査方法
LCE遺伝子に遺伝的多型が存在する場合、その多型の有無や種類により LCE遺 伝子又はタンパク質の発現レベルが変化したり、当該タンパク質の活性に異常が生 じたりする場合がある。従って、このような遺伝的多型を検出することにより LCEの発 現や活性に関する知見を得、さらに、被検組織ゃ被検細胞の由来となった被検体の 肥満の検查を行うことができる。このような遺伝的多型としては、具体的には、例えば 、ミニサテライト、マイクロサテライト、 SNP(single
nucleotide polymoi-phism :—塩 多型)が挙げられる。
[0063] LCE遺伝子における多型の検出は以下のようにして行うことができる。すなわち、 LCE遺伝子にぉレ、て、その発現量を制御する領域を検査対象となる肥満の被検体を 対象として塩基配列を決定し、多型部位を検出する。検出された多型部位の対立遺 伝子頻度を算出し、被検体集団において有意に増加又は減少している対立遺伝子 を見出すことにより肥満と相関する多型を同定する。このようにして検出された遺伝的 多型は、例えば、被検体由来のゲノム DNAについて、多型部位の塩基配列の解析、 多型部位に存在する塩基の種類に依存して変化する DNAの物理化学的性質の差 や制限酵素部位の相違を利用する方法、当該多型部位の検出に適当な検出用プロ ーブを利用する方法及び質量分析法を利用した方法等によって臨床的に検出可能 である。
[0064] (D) LCEタンパク質と相互作用することにより LCE遺伝子の発現量に影響を及ぼす タンパク質の発現量又は活性を検出することによる肥満の検查方法
生体内において、多くのタンパク質は他のタンパク質と相互作用することにより、所 定の生理機能を発揮する。 LCEについても同様に、例えば、その発現を制御する転 写因子等の作用を受けることにより発現量が制御され、所定の機能を発揮している。 LCEタンパク質と、当該 LCEタンパク質と相互作用することにより LCE遺伝子の発現 量に影響を及ぼすタンパク質の発現量やその活性とは、一定の相関関係を有し、い ずれか一方の挙動を検出することにより、他方の挙動を推測できる関係にある。
[0065] ここで、「相互作用」とは、 LCEタンパク質と別のタンパク質が直接的又は間接的に 作用することをいい、例えば、 LCEタンパク質が別のタンパク質と物理的に接触するこ とによりアミノ酸の修飾等を生じるような作用や、第 3のタンパク質を介して相互作用し 、間接的に LCEタンパク質の発現に影響を及ぼすような作用が挙げられる。このよう なタンパク質としては、例えば、 LCEタンパク質を介するシグナル伝達において、 LCE タンパク質の上流又は下流で生理的機能を発揮するタンパク質が挙げられる。このよ うなタンパク質の発現量又は活性を検出する方法としては、対象となるタンパク質の 種類に応じて好適な手段を適宜選択すればよぐ具体的な手段としては特に限定さ れない。
[0066] 以上の (A) (D)で説明したような本発明の肥満の検查方法によって、分子レべ ルで肥満の診断が可能となるばかりか、将来的に肥満になる可能性についても予測 できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。
[0067] (4)肥満の治療、予防剤
LCE遺伝子は、その発現量と体重とが相関関係を示す。従って、当該遺伝子の発 現レベルを正常レベルへと調節する化合物は肥満の治療又は予防に有用であるの みならず、例えば、痩せ、糖尿病、高血圧症、高脂血症、虚血性心疾患にも応用可 能である。このような化合物としては、上述したような本発明の化合物の評価方法によ つて選択された化合物が挙げられる。これらの化合物を薬剤として使用するには、当 該化合物を直接患者へ投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医 薬組成物として投与することもできる。製剤化するに際し、薬理学上許容される担体 若しくは媒体としては、具体的には、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤 、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香料又は着色剤が挙 げられる。また、このような医薬組成物を患者に投与する方法としては、例えば、動脈 内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的又は経口 的な投与が挙げられる。医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢又は投与方法 等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能であ る。
[0068] (5)肥満の検査薬、検査キット
LCEタンパク質の発現量は、肥満に基づく体重変化と相関関係を有する。従って、 当該タンパク質に対する抗体を使用して被検細胞ゃ被検組織中のタンパク質量を検 出、測定することにより、肥満の検査を簡便に行うことができる。ここで、「抗体」とは、 抗原である LCE遺伝子産物に結合しうる抗体分子全体又はその断片をいう。このよう な抗体は、公知の方法によって製造することができ、モノクローナル抗体又はポリクロ ーナル抗体のいずれであってもよい。また、当該抗体を用いた免疫学的測定法とし ては、公知の方法を使用すればよぐ具体的には、例えば、蛍光抗体法、酵素抗体 法が挙げられる。
[0069] また、このような抗体を含んだキットを製造し、本発明を実施することも可能である。
キットの構成としては、当該抗体に加え、例えば、抗体を検出するために蛍光標識や ラジオアイソトープで標識された 2次抗体や抗原抗体反応を行う際に使用する緩衝 液を備えていてもよい。
[0070] このような肥満の検査薬を使用することにより、分子レベルで肥満の診断が可能と なるばかりか、将来的に肥満になる可能性についても予測できることとなり、従来の診 断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。また、本発明の肥満の検查キットを 使用することにより、前述したような的確な診断を非常に簡便に実施することが可能と なる。
[0071] (6) hLCE-siRNA-6 (配列番号 23及び 24の核酸からなる siRNA)及びそれを含む LCE発現抑制剤、脂肪合成抑制剤、肥満の治療又は予防剤
既に述べたように、配列番号 23及び 24の核酸からなる siRNAである
hLCE-siRNA-6は、 LCEの発現を強く抑制する。したがって、 hLCE-siRNA-6は LCE 発現抑制剤として用いることができ、また、脂肪合成抑制剤として用いることもでき、さ らに、肥満の治療又は予防剤として用いることも可能である。
実施例
[0072] (肥満モデル動物の作製）
製造例 1 :ニューロペプチド Y (Neuropeptide Y: NPY) Y5ァゴニスト脳質内（i.c.v.)投 与マウス）
[0073] NPY Y5ァゴニストを投与することにより肥満を呈するモデルマウスを以下の要領で 作製した。 9一 12週齢の雄マウス（C57BL/6J :クレア社製）を、室温 23 ± 2。C、湿度 5 5 ± 15%の条件下、 1プラスチックゲージに 1匹ずつ飼育した。また、飼育時の明喑 のサイクルは 12時間とし、午前 7時に点灯し、午後 7時に消灯した。また、マウスには 、飼料（CE-2 (タンパク質： 25. 4重量％、炭水化物： 50. 3重量％、脂質: 4. 4重量 %)：クレア社製）と水を自由に摂取させた。
[0074] マウスを 80mg/kgペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔し、滅菌さ れた 28ゲージの脳注入力ニューレ（アルゼ (Alzet)社製）を右側脳質へ定位的に移 植した。力ニューレを、ブレダマより後方へ 0.4mm、側方へ 0.8mm、深さ 2mmの位置に 、頭蓋骨に対し垂直に歯科用セメントで固定した。力ニューレを、 0.05%ゥシ血清アル ブミン（BSA)を含む 10mMのリン酸緩衝液で満たした浸透圧ポンプ
2002 :アルゼ社製）にポリビエルクロライドチューブで接続した。 10mM PBS(0.05% BSA含む)に D-TryMNPY(5マイクログラム/日になるように調製)を溶解した 溶液をポンプに満たした後、マウスの背中の皮下に坦め込み、抗生物質（50mg/kgの セファメジン（Cefamedine)：藤沢薬品製）を皮下注射した。
[0075] これらのマウスを、平均体重を一致させた 3つのグループ（溶媒のみを注入したダル ープ（vehicle group)、 D- Try34NPY(NPY Y5ァゴニスト)を注入したグループ（ad lib fed group)、 D_Try34NPYを注入しペアフィードとしたグループ（pair-fed group) )に分 けた。
[0076] 製造例 2 : MCH投与マウス
MCH(melanin-concentrating hormone)を投与することにより肥満を呈するモデルマ ウスを以下の要領で作製した。
[0077] 13週齢の雄マウス（C57BL/6J :クレア社製）を、室温 23 ± 2。C、湿度 55 ± 15%の 条件下、 1プラスチックゲージに 1匹ずつ飼育した。また、飼育時の明暗のサイクルは 12時間とし、午前 7時に点灯し、午後 7時に消灯した。また、マウスには、飼料 (CE-2 (タンパク質： 25. 4重量％、炭水化物： 50. 3重量％、脂質: 4. 4重量％)：クレア社 製）と水は自由に摂取させた。マウスが環境に適応した頃、飼料として MHF (タンパク 質：15. 0重量％、炭水化物： 52. 4重量％、脂質： 32. 6重量％、オリエンタルバイオ サービス社製)を与えた。
[0078] マウスを 80mg/kgペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔し、滅菌さ れた 28ゲージの脳注入力ニューレ（アルゼ (Alzet)社製）を右側脳質へ定位的に移 植した。力ニューレはブレダマより後方へ 0.4mm、側方へ 0.8mm、深さ 2mmの位置に、 頭蓋骨に対し垂直に歯科用セメントで固定した。力ニューレを、 30%プロピレングリコ ールで満たした浸透圧ポンプ（モデルナンバー 2002：アルゼ社製）にポリビュルクロラ イドチューブで接続した。ポンプをマウスの背中の皮下に埋め込み、抗生物質を皮下 注射した。
[0079] これらのマウスを、平均体重を一致させた 3つのグループ（溶媒のみを注入したダル ープ（vehicle group)、 MCHを注入したグループ（ad lib fed group)、 MCHを注入しぺ ァフィードとしたグループ（pair-fed
group) )に分けた。続いて、エーテル麻酔下で、ポンプを MCH(3マイクログラム/日）又 は溶媒（30%プロピレングリコール）に置き換えた。
[0080] 製造例 3： DIO(Diet induced obesity)マウス
18週齢のマウス（C57BL/6J :クレア社製）を、室温 23 ± 2°C、湿度 55 ± 15%の条 件下、 1プラスチックゲージに 1匹ずつ飼育した。このマウスに高カロリー食である MHF (タンパク質： 18. 2重量％、炭水化物： 55. 6重量％、脂質： 15. 5重量％)を 6 ヶ月間に渡って与え、肥満を呈するモデルマウス（DIOマウス）を作製した。なお、実 施例中、「 established
MFDJは、これ以上体重が増えないようになるまで MHFを与えて飼育したマウスを指 す。
[0081] また、前記のマウスに MHFよりさらに高い脂肪を含有する高カロリー食である HFD ( タンパク質： 20. 8重量％、炭水化物： 38. 59重量％、脂質： 32. 88重量％)を与え た DIOマウス（HFD)も作製した。
[0082] 製造例 4 :食事制限をしたマウス
マウス（C57BL/6N、 17週齢）を 1ケージに 1匹ずつ個別に飼育した。また、エサは 普通食 (CA_1、 CLEA)を与えた。摂食制限は、以下のようなスケジュールで行った。 すなわち、エサ (CA-1)を 1日にっき 3時間 (10 : 00— 13： 00)だけ与え、水は自由に 摂取できるようにした。摂食時間の前後で餌の重量を測定し、その差を摂食量とした 。また、摂食制限をしている期間は、体重、外見の観察等をモニターした。なお、条 件付けに失敗したと思われるマウス (短期間に極度な体重減少（例えば 20%程度の 減少）が見られるマウス）は実験には使用しなかった。力かる条件下でマウスを 7日間 飼育した後、白色脂肪細胞を摘出した。
[0083] 実施例 1一 5及び比較例 1：白色脂肪細胞における LCEの発現
製造例 1一 4におレ、て製造したモデルマウスを用いて、肝臓及び白色脂肪細胞（ WAT)における LCE遺伝子の発現量を測定した。発現量の測定は、各モデルマウス の白色脂肪細胞力 抽出した RNAを、 mouse U74Aチップ (Aifymetrix社製）を用いて 処理することにより行った。
[0084] 非処理の C57BL/6Nの肝臓又は WATそれぞれにおける LCEの発現量を 1.00とした 場合の、 DIOマウス (DIO)、 D_Trv34NPY投与マウス (NPY(FF))、 D-Try34NPY pair feeding投与群マウス (NPY(PF))、 MCH投与マウス (MCH(FF))、 MCH pair feeding 投与群マウス (MCH(PF))、食事制限をしたマウス (Fasting)及び NPY
Y5 antagonist投与マウス (Y5ant)における LCE遺伝子の発現量を表 1に示す。
[0085] 表 1より明らかなように、肥満モデルマウスでは LCE遺伝子の発現量が増加する傾 向にあり、食事制限をしたマウスではその発現量が低下していた。したがって、 LCE の発現量と体重とが相関関係を有していることが明らかとなった。
[0086] [表 1]
Figure imgf000022_0001
[0087] 実施例 6 : HEK293細胞におけるマウス LCE mRNAの発現量測定
1. LCE発現亢進細胞の作製
マウス肝臓より抽出した RNAを用いて、 RT- PCR法によりマウス LCEの cDNAを増幅 した。得られた PCR産物を発現ベクター pCDNA3.1にサブクローユングした後、その 塩基配列を確認した。次に、マウス LCEがサブクローニングされた発現ベクターを制 限酵素 Sealで直線化し、 HEK293細胞に導入した。この細胞を lmg/ml
G418を含む選択培地で培養することにより、マウス LCE遺伝子の安定高発現細胞株 を得た。
[0088] 以下に、 RT-PCRに用いたプライマーの塩基配列を示す。
mLCE-exF:5 - GCC ACC ATG GGC AAC ATG TCA GTG TTG ACT TTA C _3' (配列番号 3) mLCE_exR:5' _
CTA CTC AGC CTT CGT GGC TTT CTT _3' (酉己歹 lj番号 4)
[0089] 2. HEK293細胞におけるマウス LCE mRNAの発現量測定
HEK293細胞から total RNAを精製し、逆転写反応により cDNAを得た。 ABI PRISM 7700 sequence
Detector Systemによる TaqMan PCR法を用いてマウス LCE mRNA及びヒト LCE mRNAの発現量を測定した。マウス LCEの標準曲線は、前記のマウス LCEがサブクロ 一ユングされた発現ベクターを制限酵素 Sealにより直鎖化した DNAを用いた発現解 析により作成した。また、ヒト LCEの標準曲線は、 PCRにより調製したヒト LCEの cDNA 断片を pcDNA3.1にサブクローユングし、 Sealにより直鎖化した DNA断片を用いた発 現解析により作成した。次に、マウス LCEの発現量をヒト LCEの発現量にて除し、導入 されたマウス LCE遺伝子の発現量と内在性ヒト LCE遺伝子の発現量の比を求めた。
[0090] 以下に使用したプライマー及びプローブの塩基配列を記す。
マウス LCE用 TaqMan probe
mLCE-P:5' -
CTT TCC TGT TTT CTG CGC TGT ACG CTG _3' (配列番号 5)
マウス LCE用 TaqMan primer
mLCE-F:5' -
GGA TGC AGG AAA ACT GGA AGA A _3' (配列番号 6)
mLCE-R:5' -
TGC CGA CCA CCA AAG ATA AAG -3' (配列番号 7)
ヒ卜 LCE用 TaqMan probe
hLCE-P2:5' -
ATC ACT GTG CTC CTG TAC T -3' (酉己歹 lj番号 8)
ヒト LCE用 TaqMan primer
hLCE-F2:5' -
AGC TGA TCT TCC TGC ACT GGT AT _3' (配列番号 9) hLCE-R2:5' -
GGC AAC CAT GTC TTT GTA GGA GTA _3' (配列番号 10)
ヒト LCE用 PCR primer
mLCE-exF:5' -
GCC ACC ATG GGC AAC ATG TCA GTG TTG ACT TTA C -3' (配列番号 11) hLCE-exR:5' -
CTA TTC AGC TTT CGT TGT TTT CCT C _3' (配列番号 12)。
[0091] 3. HEK293細胞における LCE活性の測定
HEK293細胞を超音波破砕した後に、超遠心操作によりミクロソーム画分を調製し た。得られたミクロソーム画分を用いて以下の方法により LCE活性を測定した。反応 に必要とされる NADPH、パルミトイル CoA、 14C標識マロニル CoAを含むリン酸緩衝液 中にミクロソーム画分を加えて、 37°Cで 5分間インキュベートした。次に、 15%水酸化 カリウム-メタノール溶液を加え、 75°Cで 45分間加熱してけん化処理を行なった。これ に 5N塩酸を加えた後、へキサンを用いて脂肪酸を抽出した。得られた脂肪酸に含ま れる放射性比活性を測定し、脂肪酸延伸反応により脂肪酸に取り込まれたマロニル CoAの量を求めた。
[0092] 図 1は、 LCEを強制発現させた細胞における、 (a)LCE mRNAの発現量、及び
(b)LCE活性を表すグラフである。図 1に示すように、 LCEの発現が亢進した細胞株を 取得できたことが確認されるとともに、これらの細胞株では LCEの活性も亢進している ことが確認できた。
[0093] 実施例 7 : HEK293細胞中に含まれる脂肪酸組成の測定
HEK293細胞をリン酸緩衝液中にて超音波破砕し、内部標準物質として C17:0の中 十生脂肪 (triglycerides)、 コレステリノレエステノレ (cholesteryl
esters)及びリン脂質 (phospholipids)を加えた後に、クロ口ホルム—メタノール (2 : 1)によ り脂質成分を抽出した。得られた脂質を窒素気流下にて乾固した後、 silica gel Gを用いた薄層クロマトグラフによる分画 (へキサン：ジェチルエーテル：酢酸 =80 : 20 : 1)を行い、中性脂肪、コレステリルエステル及びリン脂質を分離した。これら 3画 分それぞれを 5%塩酸一メタノールにより脂肪酸残基をメチルイ匕し、ガスクロマトグラフ (GC-FID)を用いて脂肪酸組成の分析を行なった。
[0094] 炭素鎖長 18以上の脂肪酸と 16以下の脂肪酸を比較した結果を図 2に示す。図 2か ら明らかなように、 LCEの発現が亢進した細胞株では C18以上の脂肪酸の構成比率 が増加する傾向にあり、炭素鎖の伸長反応は LCEの活性の増強に比例して進行す ること力 S確認できた。また、細胞内では、脂肪酸のほとんどがトリグリセリド、コレステリ ルエステル、リン脂質といったエステル体として存在する。これら全てのエステル体に おいて LCEの発現亢進により C18以上の脂肪酸の構成比率が増加する傾向が認め られること力 、 LCEの活性変化は細胞全体の脂肪酸構成比率を変更すると考えら れ、 LCEは細胞の脂肪酸組成を決定する重要因子であると、本発明者らは考えてい る。
[0095] また、各脂肪酸の組成を比較した結果を図 3に示す。図 3から明らかなように、 LCE の発現が亢進した細胞株では C18以上の脂肪酸の構成比率が増加する傾向にある ことが確認できた。
[0096] 実施例 8： RNAiによるヒト LCEの発現抑制
1.発現抑制実験に使用する siRNAの検討
ヒト LCE cDNAの塩基配列情報に基づいて、下記配列からなる siRNA (small interfering RNA)を合成した。合成した siRNAそれぞれを HepG2細胞に導入し、 24時 間後に細胞から total
RNAを調製した。次に、逆転写反応により cDNAを作製し、 ABI PRISM 7700 Sequence Detector Systemによる faqMan
PCR法によりヒト LCE mRNAの発現量を測定した。図 4(a)に、 LCE遺伝子における各 siRNAの対応部分を示した。図 4(b)は、各 siRNAを導入した場合の LCE
mRNAの発現量を表すグラフである。図 4(b)に示すように、 siRNA(hLCE_siRNA_6)を 用いた場合に LCEの発現抑制の効果が高いことが確認できた。
[0097] 使用した siRNAの配列を以下に示す。
hLCE-siRNA-1
(図 4における 1の siRNA)
5， -GACCGCAAGGCAUUCAUUUUU-3 ' (配列番号 13) 3， -UUCUGGCGUUCCGUAAGUAAA-5， (配列番号 14) hLCE-siRNA-2
(図 4における 2の siRNA)
5， -CACUCGAAAUCAAGCGCUUUU-3 ' (配列番号 15)
3， -UUGUGAGCUUUAGUUCGCGAA-5， (配列番号 16) hLCE-siRNA-3
(図 4における 3の siRNA)
5， -CACGUAGCGACUCCGAAGAUU-3 ' (配列番号 17)
3， -UUGUGCAUCGCUGAGGCUUCU-5 ' (配列番号 18) hLCE-siRNA-4
(図 4における 4の siRNA)
5， -UGAAGCCAUCCAAUGGAUGUU-3 ' (配列番号 19)
3， -UUACUUCGGUAGGUUACCUAC-5， (配列番号 20) hLCE-siRNA-5
(図 4における 5の siRNA)
5 ' -GCCAUUAGUGCUCUGGUCUUU-3 ' (配列番号 21)
3， -UUCGGUAAUCACGAGACCAGA-5 ' (配列番号 22) hLCE-siRNA-6
(図 4における 6の siRNA)
5， -AGGCCUGAAGCAGUCAGUUUU-3， (酉己歹 IJ番号 23)
3， -UUUCCGGACUUCGUCAGUCAA-5， (酉己歹 IJ番号 24)
LCE-siRNA-2
(図 4における 7の siRNA)
5， -UGGACCUGUCAGCAAAUUCUU-3 ' (配列番号 25)
3， -UUACCUGGACAGUCGUUUAAG-5， (配列番号 26) hLCE-siRNA-7
(図 4における 8の siRNA)
5， -AGCACCCGAACUAGGAGAUUU-3 ' (配列番号 27) 3， -UUUCGUGGGCUUGAUCCUCUA-5 ' (配列番号 28)
hLCE-siRNA-8
(図 4における 9の siRNA)
5， -CAUCUUCUGGUCCUCACUCUU-3， (配列番号 29)
3， -UUGUAGAAGACCAGGAGUGAG-5 ' (配列番号 30)
hLCE-siRNA-9
(図 4における 10の siRNA)
5， -UCACACGUGGUGCAGCUAAUU-3 ' (配歹' J番号 31 )
3， -UUAGUGUGCACCACGUCGAUU-5 ' (配列番号 32)
hLCE-siRNA-10
(図 4における 11の siRNA)
5， -GCACUGCUGCUGGAAGACCUU-3， (酉己歹 IJ番号 33)
3， -UUCGUGACGACGACCUUCUGG-5 ' (配歹幡号 34)
hLCE-siRNA-11
(図 4における 12の siRNA)
5， -ACUGUGCGAGCACAACACAUU-3， (配列番号 35)
3， -UUUGACACGCUCGUGUUGUGU-5， (配列番号 36)
hLCE-siRNA-12
(図 4における 13の siRNA)
5， -AGGGGGUGAAUACUUCCCCUU-3 ' (配列番号 37)
3， -UUUCCCCCACUUAUGAAGGGG-5， (配列番号 38)。
2. HepG2細胞における siRNAの LCE活性低下作用
siRNA (hLCE-siRNA-6)を導入した H印 G2細胞を超音波破砕した後に、超遠心操 作によりミクロソーム画分を調製した。次に、得られたミクロソーム画分の LCE活性（ Fatty
Acyl CoAの伸長活性）を測定した。対照には哺乳類遺伝子に相同性を持たない配 列である siRNA (scramble siRNA Duplex:
Dharmacon, In ）を導入した H印 G2細胞を用いた。図 5(a)は、 LCE mRNAの発現量 を表すグラフであり、図 5(b)は、伸長活性を表すグラフである。図 5(a), (b)に示すように 、 LCEの発現が特異的に抑制されるとともに、 LCEの活性が抑制されることが確認で きた。
[0099] また、 H印 G2細胞に 2種類の siRNA (発現抑制効果が強レ、もの： hLCE_siRNA_6、発 現抑制効果が中程度のもの： LCE-siRNA_2)をそれぞれ導入した。 siRNAの導入後 24時間及び 48時間の時点で、細胞から total
RNAを調製し、 DNAチップ (Affymetrix社製）を用いて遺伝子発現解析を行なレ、、 siRNAの導入により発現が低下している遺伝子を選択した。図 6は、 siRNA導入後の LCE
mRNAの発現量を表すグラフである（(a) : 24時間後、（b) : 48時間後）。 siRNAの導入 により LCEの発現が抑制されていることが確認された。
[0100] siRNAの導入により発現が低下した遺伝子は、 24時間で 5遺伝子、 48時間で 64遺伝 子であった。発現が低下した遺伝子の中で、 LCEと同じ脂肪酸合成に関与する FAS ( Fatty
Acid Synthase)及び SCD (stearoyl CoA desaturase)に注目し、その発現量を検討し た。具体的には、 siRNA
(hLCE-siRNA-6)を導入した HepG2細胞から total RNAを精製し、逆転写反応により cDNAを得た。次に、 ABI PRISM 7700
Sequence Detector Systemを用いた TaqMan PCR法により、ヒト FAS mRNA及びヒト SCD mRNAの発現を測定した。標準曲線は、 PCRにより調製したヒト FAS
cDNA断片及びヒト SCD cDNA断片をそれぞれ用いて作成した。 FAS及び SCDの発現 量は j3—ァクチンの発現量で規格化した。図 7は、 siRNAを導入した H印 G2細胞にお ける（a) LCE、 （b) FAS及び（c) SCDの mRNAの発現量を表すグラフである。図 7に示 すとおり、 siRNAの導入により、 LCEの発現は顕著に低下する一方、 FAS及び SCDは LCEほどの発現の低下は見られないものの、 40— 60。/o程度の発現低下が見られる ことが確認された。
[0101] 以下に、測定に用いたプライマー及びプローブの塩基配列を示す。
ヒ卜 FAS用 l aqMan probe hFAS- P:5，-
ACC CGC TCG GCA TGG CTA TCT T _3' (配列番号 39)
ヒ卜 FAS用 TaqMan primer
hFAS-F:5'-
GCA AAT TCG ACC TTT CTC AGA AC -3' (配列番号 40)
hFAS-R:5'-
GGA CCC CGT GGA ATG TCA _3' (配列番号 41)
ヒト FAS cDNA作成用 PCR primer
hFAS-4823S:5'-
TAC GCC TCC CTC AAC TTC CG -3' (配列番号 42)
hFAS-5604A:5'-
CAC TTG AGG GGC CGT ACC AC _3' (配歹' J番号 43)
ヒト SCD用 TaqMan probe
hSCD- P:5，-
CAC ATG CTG ATC CTC ATA ATT CCC GAC G _3' (配列番号 44) ヒ卜 SCD用 TaqMan primer
hSCD- F:5，_
GCC CAC CAC AAG TTT TCA GAA _3' (配列番号 45)
hSCD- R:5，_
CCA CGT GAG AGA AGA AAA AGC C _3' (配列番号 46)
ヒト SCD cDNA作成用 PCR primer
hSCD- 600S:5'_
TGT GGA GCC ACC GCT CTT AC -3' (配列番号 47)
hSCD- 931A:5，-
AAG CGT GGG CAG GAT GAA GC -3' (配列番号 48)。
実施例 9： RNAiによるマウス LCEの発現抑制
実施例 8と同様の実験をマウス LCEについても行った。マウス LCE cDNAの塩基配 列情報に基づいて、下記配列からなる siRNAを合成した。合成した siRNAそれぞれを 3T3-L1細胞に導入し、 24時間後に細胞から total
RNAを調製した。次に、逆転写反応により cDNAを作製し、 ABI PRISM 7700
Sequence Detector Systemによる faqMan
PCR法によりマウス LCE mRNAの発現量を測定した。
[0103] 図 8は、 RNAiによるマウス LCEの発現抑制の結果を表す図である。（a)はマウス LCE 遺伝子における各 siRNAの対応部分を示す図であり、（b)は各 siRNAを導入した場合 のマウス LCE
mRNAの発現量を表すグラフであり、（c)は各 siRNAを導入した場合のマウス FAS mRNAの発現量を表すグラフである。図 8に示すように、各 siRNAにより LCE及び FAS の発現が抑制されることが確認された。
[0104] 実験に用いた siRNAを以下に示す。
hLCE-siRNA-6(先述したヒト LCEに対する siRNAである hLCE-siRNA-6と同一） (図 8における 6の siRNA)
5， -AGGCCUGAAGCAGUCAGUUUU-3， (酉己歹 IJ番号 49)
3， -UUUCCGGACUUCGUCAGUCAA-5， (酉己歹 IJ番号 50)
mLCE-siRNA-7 (図 8における m7の siRNA)
5， -UCCCAUAUGGUGCAGCUAAUU-3 ' (配列番号 51 )
3， -UUAGGGUAUACCACGUCGAUU-5， (配列番号 52)
mLCE-siRNA-ll (図 8における mi lの siRNA)
5'- GCAUCCGUUGUUCAGUUGCUU- 3' (配列番号 53)
3'- UUCGUAGGCAACAAGUCAACG-5' (配列番号 54)。
[0105] 実施例 10 : 3T3_L1細胞において LCE RNAiが FAS mRNAの発現に与える影響 脂肪細胞に分化した 3T3-L1細胞に siRNA (hLCE_siRNA_6)を導入し、 24時間後に 細胞から total RNAを精製した。得られた total
RNAより逆転写反応により cDNAを調製し、 ABI PRISM 7700 Sequence Detector Systemを用いた TaqMan PCR法によりマウス FAS
mRNAの発現量を測定した。標準曲線は、 PCRにより調製したマウス FAS cDNA断片 を用いて作成した。 FASの発現量は β—ァクチンの発現量で規格化した。 [0106] 測定に用いたプライマーおよびプローブは下記の通りである。
マウス FAS用 TaqMan probe
mFAS-P2 : 5' -
ATG CTG GCC AAA CTA ACT ACG GCT TCG -3' (酉己歹 lj番号 55)
マウス FAS用 TaqMan primer
mFAS-F2 : 5' -
TGG CCT TCT CCT CTG TAA GCT G 一 3' (酉己歹 lj番号 56)
mFAS-R2 : 5' -
CTG TTC ACA TAT ACG CTC CAT GG -3' (配列番号 57)
マウス FAS cDNA作成用 PCR primer
mFAS-5541S : 5' -
TTC CGC TAC ATG GCT CAG GG _3' (酉己歹 lj番号 58)
mFAS-7551A: 5' -
CCC GTA CAC TCA CTC GTG GC _3' (配列番号 59)
[0107] また、脂肪細胞に分化した 3T3-L1細胞に、 siRNA (hLCE-siRNA-6)を導入し、 24時 間後に培地に14 C標識酢酸ナトリウムを添加した。添加してから 4時間後に細胞を 0.1 %SDSにて溶解し、 15%水酸化カリウム メタノール溶液を加え 75°C45分間加熱によ るけん化処理を行った。これに 5N塩酸をカ卩えた後、クロ口ホルム メタノール (2 : 1)にて 脂質成分を抽出した。抽出した脂質成分を silica
gel Gを用いた薄層クロマトグラフにより分画 (へキサン：ジェチルエーテル：酢酸 =80： 20 : 1)し、脂肪酸画分に取り込まれた14 C酢酸を測定することで脂肪酸合成能を測定 した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列の siRNA
(scramble siRNA Duplex: Dharmacon, Inc.)を導入した 3T3-L1細胞を用いた。
[0108] 図 9は、 RNAiによる (a)LCE及び (b)FASの発現抑制並びに (c)脂肪酸合成抑制の結 果を表す図である。図 9に示すように、 LCEの発現を抑制することにより、脂肪酸の合 成が抑制されることが確認できた。
[0109] 実施例 11 : H印 G2細胞において LCE RNAiがアポリポタンパク質 Bの分泌に与える HepG2細胞に siRNA (hLCE_siRNA_6)を導入し 48時間後に培地を交換した。培地 交換後 48時間インキュベートし、培養上清を回収し、培地中に分泌されたアポリポタ ンパク質 Bを定量した。アポリポタンパク質 Bの定量には、マイクロプレートの EIA法 (Exocell,
Inc社製： APO B TEST)を用いた。アポリポタンパク質 B標準液を用いて標準曲線を 作成し、培養上清中のアポリポタンパク質 Bの濃度を求めた。対照には哺乳類遺伝 子に相同性がなレ、配列の siRNA
(scramble siRNA Duplex: Dharmacon, Inc.社製）を導入した H印 G2細胞を用いた。
[0110] 図 10は、 RNAiによる (a)LCEの発現抑制及び (b)アポリポタンパク質 Bの分泌抑制の 結果を表す図である。図 10に示すように、 LCEの発現を抑制することによりアポリポタ ンパク質 Bの分泌が抑制されることが確認できた。
[0111] 以上より、 LCEの活性を抑制することにより、抗肥満効果を示すことが示唆された。
[0112] 実施例 12 : DIOマウスにおける LCE RN が与える影響
7週齢のマウス (ICR、雌)を高カロリー食である MHFdietにて 23週間飼育し、肥満を 形成させた。先ず、 siRNAの投与開始前にマウスの体重を測定した。 siRNA
(hLCE-siRNAト 6)を、 HVJ-リボソームをキャリアとして用いマウスの尾静脈から投与し た (40 μ g/mouse/injection)。投与は 1日おきに 5回行レヽ、最終投与 2日後にマウスの 体重を測定し、 siRNA投与の前後での体重変化を求めた。眼窩静脈叢より採血し血 糖値を測定した。腹部大静脈より採血し血漿インスリン濃度を測定した。対照には、 哺乳類細胞では効果を示さなレ、scramble
siRNAを投与したマウスを用レヽた。
[0113] 図 11は、 siRNA投与による (a)体重、（b)血糖値及び (c)血漿インシュリンレベルの変 化を表す図である。図 11に示すように、 LCEに対する siRNAをマウスに投与すること により体重が減少した。また、血糖値および血漿インシュリンレベルのいずれもが減 少し、 LCEに対する siRNA力 SLCEの活性を抑制し、肥満改善効果を示すことが個体レ ベルでも確認できた。
[0114] また、これらマウスの肝臓から total RNAを精製し、逆転写反応により cDNAを得た。
ABI PRISM 7700 Sequence Detector Systemによる TaqMan PCR法を用いてマウス LCE mRNA、マウス acety卜 CoA carboxylase (ACC) mRNA、マウス FAS mRNA、マウス SCD-1 mRNA、マウス SREBP-lc mRNA、マウス insulin
receptor substrate (IRS)-2 mRNAの発現量を測定した。標準曲線は PCRにより調製 した各遺伝子の cDNA断片をそれぞれ用いて作製した。各遺伝子の発現量は β—ァ クチンの発現量で規格化した。
測定に用いたプライマーおよびプローブの塩基配列を示す。
マウス ACC1用 TaqMan probe
5' -
AGCTGCAAGCCTGTCATCCTCAATATCG -3' (配歹' J番号 73)
マウス ACC 1 TaqMan PCR primer
forward:
5 ' - TTCTGAATGTGGCTATCAAGACTGA _3 ' (配列番号 74)
reverse:
5' - TGCTGGGTGAACTCTCTGAACA _3' (配列番号 75)
マウス ACC1用 cDNA作製用 primer
forward:
5' - TAGTGTCAGCGATGTTCTGT _3' (酉己歹 lj番号 76)
reverse:
5' - AAATCTCTGATCCACCTCAC _3' (酉己歹 lj番号 77)
マウス SCD-1用 TaqMan probe
ACTCGCCTACACCAACGGGCTCC (配列番号 78)
マウス SCD-1用 TaqMan primer
forward:
5' - TTTCCAAGCGCAGTTCCG _3' (配列番号 79)
reverse:
5' - ATCGAGCGTGGACTTCGGT _3' (配歹' J番号 80)
マウス SCD-1 cDNA作製用 PCR primer forward:
5，- CACCCATCCCGAGAGTCAGG -3， （配列番号 81) reverse:
5' - GTGGGCCGGCATGATGATAG _3' (配列番号 82) マウス SREBP- lc用 TaqMan probe
5' -
CTTCAAATGTGCAATCCATGGCTCCGT _3' (配歹' J番号 83) マウス SREBP- lc用 TaqMan primer
forward:
5' - GTAGCGTCTGCACGCCCTA -3' (酉己歹 lj番号 84) reverse:
5' - CTTGGTTGTTGATGAGCTGGAG _3' (配列番号 85) マウス SREBP_lc cDNA作製用 PCR primer
forward:
5' - AAGCTGTCGGGGTAGCGTCT _3' (配列番号 86) reverse:
5' - AGGCTCGAGTAACCCAGCAC _3' (配列番号 87) マウス IRS-2用 TaqMan probe
5，-
ACTTAGCCGCTTCAAGCCCGATGTG _3' (配歹幡号 88) マウス IRS-2 TaqMan PCR用 primer
forward:
5' - AGAAGGTGCCCGAGTGGC _3' (配列番号 89) reverse:
5' - CCCCAGATACCTGATCCATGA - 3' (配列番号 90) マウス IRS-2 cDNA作製用 primer
forward:
5' - CAGTAGGCTCCATGGATGGC _3' (配列番号 91) reverse:
5' - ATGACCTTAGCACCCCGGTG _3' (配歹幡号 92)
[0116] 図 21は、 siRNAを投与したマウスの肝臓における (a)ACC、 FAS、 SCD1、 SREBP-lc 、 IRS-2及び (b)LCEの mRNAの発現量を表すグラフである。 LCEの発現を抑制するこ とにより、脂肪酸合成に関わる酵素である ACC、 FAS、 SCD1の発現が低下しており、 また脂肪酸合成を調節する転写因子である SREBP-lcの発現量も低下していることが 確認された。すなわち、 DIOマウスの肝臓における LCEの発現抑制により、肝臓での 脂肪合成が抑制されることが示唆された。
[0117] また、 IRS- 2 (insulin receptor substrate-2)の発現が LCE RNAi投与マウスの肝臓で 亢進しているのは、肝臓の LCEの発現抑制が肝臓のインスリン感受性を亢進させるこ とを示唆する。これは、実施例 12で示した LCEの発現抑制による血糖値及び血漿ィ ンスリン濃度の低下を引き起こす原因になっていると発明者らは考えている。
[0118] 実施例 13 : HepG2細胞において LCE RNAiが細胞の脂肪酸組成に与える影響
HepG2細胞に siRNA (hLCE_siRNA_6)を導入し 72時間後に細胞を回収した。その 細胞をリン酸緩衝液中にて超音波破砕し、内部標準として C17:0の中性脂肪、コレス テリルエステル、リン脂質を加えた後に Bligh-Dyer法により脂質成分を抽出した。得ら れた脂質を窒素気流下にて乾固した後、 silica
gel Gを用いた薄層クロマトグラフによる分画（へキサン：ジェチルエーテル：酢酸 =80 : 20 : 1)を行い、中性脂肪、コレステリルエステル、リン脂質を分離した。これら 3画分 それぞれを 5%塩酸一メタノールにより脂肪酸残基をメチル化し、ガスクロマトグラフ (GC-FID)を用いて脂肪酸組成の分析を行った。対照には哺乳類遺伝子に相同性が なレ、配列の siRNA(scramble
siRNA Duplex: Dharmacon, Inc)を導入した H印 G2細胞を用いた。
[0119] 脂肪酸組成の分析結果を表 2に示す。表 2に示した結果から分かるように、 RNAiに より LCEの発現を抑制すると、トリグリセリド、コレステリルエステル及びリン脂質のいず れにおいても C18以上の脂肪酸の構成比率が減少することが確認できた。
[0120] [表 2] C16:0 016：1 C 18:0 C18:l C16/C18 ト リ グ リ セ リ ド コ ン ト 口 一ノレ 34.3 16.3 8.7 29.0 1.34 hLCE-siRNA-6 37.3 16.1 7.7 26.1 1.58 コ レ ス テ リ ゾレエ ス テノレ コ ン ト ロ ーノレ 23.6 7.0 18.6 36.1 0.56 hLCE-siRNA-6 26.5 7.7 18.8 37.7 0.61 リ ン脂質 コ ン ト 口 一ノレ 29.1 20.4 9.1 25.3 1.44 hLCE-siRNA-6 30.4 23.2 8.1 21.5 1.81
[0121] 実施例 14:HepG2細胞において LCE RNAiが他遺伝子の発現に与える影響
月旨肪酸合成に関与する SREBP— 1 (sterol regulatory element binding protein— 1)及 びコレステロール合成に関与する SREBP- 2(sterol
regulatory element binding protein- 2)に対して、 LCE発現抑制が与える影響にっレヽ て調べた。 siRNA
(hLCE-siRNA_6)を導入した H印 G2細胞から total RNAを精製し、逆転写反応により cDNAを得た。 ABI PRISM 7700
Sequence Detector Systemを用いた TaqMan PCR法によりヒト SREBP— 1 mRNA、ヒト SREBP-2 mRNAの発現を測定した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列の siRNA
(scramble siRNA Duplex: Dharmacon, Inc)を導入した HepG2細胞を用いた。標準曲 f泉 ίま PCR【こより調製したヒ卜 SREBP—1
cDNA断片、ヒト SREBP-2 cDNA断片をそれぞれ用いて作製した。各遺伝子の発現量 は βーァクチンの発現量で規格化した。
[0122] 測定に用いたプライマーの塩基配列を示す。
ヒト SREBP—1用 TaqMan primer
forward:
5，- CAACACAGCAACCAGAAACTCAAG _3， （配列番号 60)
reverse:
5'- TTGCTTTTGTGGACAGCAGTG -3' (配列番号 61)
ヒト SREBP-1 cDNA作製用 PCR primer forward: 5，- CGGAGAAGCTGCCTATCAAC -3， （配列番号 62)
reverse: 5，- GGTCAGTGTGTCCTCCACCT -3， （配列番号 63)
ヒト SREBP-2用 TaqMan primer
forward:
5 ' - GATATCGCTCCTCCATCAATGAC -3 ' (酉己歹 lj番号 64)
reverse:
5，- ACTTGTGCATCTTGGCGTCTG -3 ' (配列番号 65)
ヒト SREBP- 2 cDNA作製用 PCR primer
forward:
5 ' - CATTCTGACCACAATGCCTG _3 ' (酉己歹 lj番号 66)
reverse:
5 ' - AGTAGGGAGAGAAGCCAGCC -3 ' (配列番号 67)
[0123] 図 12は、 siRNAを導入した H印 G2細胞における SREBP-1及び SREBP-2の mRNAの 発現量を表すグラフである。図 12に示すとおり、 siRNAの導入により、 SREBP-1の発 現は顕著に低下する一方、 SREBP-2の発現は変化しなレ、ことが確認された。
[0124] 実施例 15 : HepG2細胞において LCE RNAiが細胞の脂質合成に与える影響
HepG2細胞に siRNA (hLCE-siRNA-6)を導入し、 72時間後に培地に14 C標識酢酸ナ トリウムを添カ卩した。添加 4時間後に細胞を 0.1%
SDSにて溶解した。細胞溶解液の一部に 15%水酸化カリウム メタノール溶液をカロえ
75°C45分間加熱によるけん化処理行った。 5N塩酸を加えた後に、クロ口ホルム メタ ノール (2： 1)にて脂質成分を抽出した。抽出した脂質成分を silica
gel Gを用いた薄層クロマトグラフにより分画 (へキサン：ジェチルエーテル：酢酸 =80：
20 : 1)し、脂肪酸画分に取り込まれた14 C酢酸を測定することで脂肪酸合成能を測定 した。
[0125] また、上記細胞溶解液の一部から直接、クロ口ホルム一メタノール (2: 1)にて脂質成 分を抽出した。得られた脂質成分を薄層クロマトグラフにより分画し、中性脂肪画分 に取り込まれた14 C酢酸を測定することで中性脂肪合成能を測定した。得られた脂肪 酸合成能および中性脂肪合成能の値は、細胞溶解液中のタンパク質量により規格 化した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がない配列の siRNA
(scramble siRNA Duplex: Dharmacon, Inc)を導入した HepG2細胞を用いた。
[0126] 図 13は、 siRNAを導入した H印 G2細胞における (a)脂肪酸合成能及び (b)中性脂肪 合成能を表す図である。図 13に示したように、 siRNAを導入して LCEの発現を抑制す ることで、脂肪酸合成能及び中性脂肪合成能が低下することが確認された。
[0127] 実施例 16 : HepG2細胞において LCE RNAiが細胞の中性脂肪含量に与える影響
H印 G2細胞に siRNA (hLCE_siRNA_6)を導入し 72時間後に細胞を回収した。その 細胞をリン酸緩衝液中にて超音波破砕し、その一部から Bligh-Dyer法により脂質成 分を抽出した。得られた脂質を窒素気流下にて乾固した後、 2-プロパノールに溶解 し、酵素法により中性脂肪量を測定した。得られた中性脂肪量の値は、細胞の超音 波破砕液中のタンパク質量にて規格化した。対照には哺乳類遺伝子に相同性がな い配列の siRNA
(scramble siRNA Duplex: Dharmacon, Inc)を導入した HepG2細胞を用いた。
[0128] 図 14は、 siRNAを導入した H印 G2細胞中の中性脂肪量を表すグラフである。図 14 に示したように、 siRNAを導入して LCEの発現を抑制することで、細胞内の中性脂肪 含量が低下することが確認された。
[0129] 実施例 17 : HepG2細胞において LCE RNAiが細胞の脂肪酸酸化に与える影響
HepG2細胞に siRNA (hLCE-siRNA-6)を導入し、 72時間後に培地に14 Cパルミチン 酸を添加した。 30分間インキュベーションした後に、培地を別チューブに移し 10%トリ クロ口酢酸をカ卩えた。培地から遊離した COを 10%水酸化ナトリウム水溶液によりトラッ
2
プした。トラップされた COの放射比活性を測定し、培地にカ卩えたパルミチン酸から β
2
酸化により作られた CO量を求めた。また COを遊離させた後の培地を遠心して、そ
2 2
の上清中の酸可溶性画分の放射比活性を測定し、培地に加えたパルミチン酸から β酸化により作られたケトン体量を求めた。インキュベーション後の Η印 G2細胞は培 地を取り除いた後に 0.1%
SDSにて溶解した。細胞溶解液の一部からクロ口ホルム一メタノール (2:1)にて脂質成 分を抽出し、薄層クロマトグラフにより分画した。そして中性脂肪画分の放射比活性を 測定し、培地に加えたパルミチン酸が細胞中の中性脂肪に取り込まれた量を求めた 。得られた CO量、ケトン体量、中性脂肪への取り込み量の値は、細胞溶解液中のタ ンパク質量にて規格化した。対照には、哺乳類遺伝子に相同性がない配列の siRNA(scramble
siRNA Duplex: Dharmacon, Inc)を導入した H印 G2細胞を用いた。
[0130] 図 15は、 siRNAを導入した H印 G2細胞における (a)CO産生量、（b)ケトン体産生量 及び (c)パルミチン酸の中性脂肪への取り込み量を表すグラフである。図 15に示した ように、 siRNAを導入して LCEの発現を抑制すると、 CO産生量及びケトン体産生量 が増加し、ノ^レミチン酸の中性脂肪への取り込みが低下することが確認された。脂肪 酸の燃焼にともなって CO及びケトン体が産生するため、この結果は、 LCEの発現抑 制は、脂肪酸の燃焼を促進することを示唆している。
[0131] 実施例 18 : HepG2細胞において LCE RNAiが細胞の CPT-1の発現に与える影響 脂肪酸をミトコンドリアに取り込むトランスポーターである CPT-1 (carnitine palmitoyl transferase- 1)に対して、 LCE発現抑制が与える影響について調べた。 H印 G2細胞 に siRNA
(hLCE-siRNA-6)を導入し 72時間後に細胞を回収した。この細胞から total RNAを精 製し、逆転写反応により cDNAを得た。 ABI PRISM
7700 Sequence Detector Systemを用いた TaqMan PCR法によりヒト CPT-l mRNAの 発現を測定した。対照には、哺乳類遺伝子に相同性がない配列の siRNA
(scramble siRNA Duplex: Dharmacon, Inc)を導入した HepG2細胞を用いた。標準曲 線は PCRにより調製したヒト CPT-1
cDNA断片を用いて作製した。得られた値は β -ァクチンの発現量で規格化した。
[0132] 測定に用いたプライマーおよびプローブの塩基配列を示す。
ヒ卜 CPT-1 TaqMan probe
5' -
CCGGGAGGAAATCAAACCAATTCGTC -3' (配列番号 68)
ヒ卜 CPT-l用 TaqMan primer
forward:
5，_ TGCTTTACAGGCGCAAACTG—3' (酉己歹 lj番^ ~69) reverse:
5，- TGGAATCGTGGATCCCAAA -3， （配列番号 70)
ヒト CPT-1 cDNA作製用 PCR primer
forward:
5， - ATTTGAAGTTAAAATCCTGGTGGGC -3， （配列番号 71 )
reverse:
5，_ TTCCCACGTCCAAAATAGGC _3' (酉己歹 lj番号 72)
[0133] 図 16は、 siRNAを導入した H印 G2細胞における CPT-1 mRNAの発現量を表すグラ フである。図 16に示したように、 siRNAを導入して LCEの発現を抑制すると、 CPT-1の 発現量が増加することが確認された。
[0134] 実施例 19 :高スクロース食負荷マウスにおける肝臓での LCE発現の変化
8週齢のマウス (ICR、雄)を高スクロース食 (67%スクロース)にて 3日間、および 7週齢 のマウス (ICR、雄)を高スクロース食にて 10日間飼育した。体重測定後にマウスを安楽 死させ、精巣上体脂肪を摘出し重量を測定した。また、マウスから肝臓を摘出 Uotal RNAを精製し、 TaqMan PCR法を用いて肝臓での LCE mRNAの発現量を測定した。
LCE mRNAの発現量は ーァクチンの発現量で規格化した。対照には通常食（CA_1 )で飼育したマウスを用いた。
[0135] 図 17は、高スクロース食を負荷したマウスにおける (a)体重、（b)精巣上体の脂肪重 量及び (c)肝臓における LCE mRNAの発現量を表すグラフである。図 17に示したよう に、高スクロース負荷することにより、マウスの体重及び脂肪重量は増加し、肝臓にお ける LCE
mRNAの発現量が増加することが確認された。
[0136] 実施例 20：高スクロース食負荷マウスにおける LCE RNAi投与の作用
HVJ -リボソームをキャリアとして用レ、、 siRNA (hLCE-siRNAi_6)を、マウス（7週齢、 ICR,雄）に尾静脈から投与した (40 μ g/mouse/injection)。投与開始直後から、マウス を高スクロース食にて飼育した。対照には、哺乳類細胞では効果を示さない scramble siRNAを投与したマウスを用いた。 siRNAの投与は 1日おきに 5回行レ、、最終投与の翌 日にマウスの体重を測定し、体脂肪量を NMR analyzer (Minispec; mq7.5)にて測定し、脂肪重量/体重比を求めた。腹部大静脈より採血し、 血漿レブチン濃度を測定した。
[0137] 図 18は、 siRNAを投与したマウスの (a)体脂肪量、（b)脂肪重量/体重比及び (c)血 漿レプチン濃度を表すグラフである。 LCE RNAiの投与による LCE発現抑制は、高ス クロース負荷による体脂肪量の増加を抑制した。同様に脂肪重量/体重比の増加を 抑制した。これは LCEの発現抑制が、高スクロース摂食による肥満形成を阻害するこ と (抗肥満効果）を示す。また、レブチンは脂肪組織力も分泌されるので、脂肪重量が 増加すると分泌されるレブチン濃度が増加する。この実験において、高スクロース食 負荷によりレブチンが増加しているのは、脂肪量が増加したことを意味し、 LCE RNAiの投与群でレプチン濃度上昇が抑えられているのは、 LCE RNAi投与で脂肪重 量の増加が抑制されたことを意味する。
[0138] また、マウスを安楽死させた後に肝臓を摘出し、その一部から total RNAを精製し、 TaqMan PCR法を用いて肝臓での LCE mRNA、 FAS mRNAの発現量を測定した。
LCE mRNA, FAS
mRNAの発現量は j3 -ァクチンの発現量で規格化した。また、肝臓の一部をリン酸緩 衝液中においてホモジナイズし、 Bligh-Dyer法により脂質成分を抽出した。得られた 脂質を窒素気流下にて乾固し、 2-プロパノールに溶解し、酵素法により中性脂肪量 を測定した。得られた中性脂肪量の値は肝臓ホモジナイズ液中に含まれるタンパク 質量で規格化した。さらに、肝臓組織からミクロソーム画分を調製し、ウェスタンブロッ ティング法により LCEのタンパク質量の変化を測定した。ウェスタンブロッテイングには 、マウス LCEタンパク質の一次構造に含まれるアミノ酸配列" FEAYIGKVKKATKAE" に基づいて合成した合成ペプチド" CFEAYIGKVKKATKAE"をゥサギ (SPF，
Japanese White Rabbit)に免疫して得た抗 LCEポリクローナル抗体を用いた。
[0139] 図 19は、 siRNAを投与したマウスの (a)LCE mRNAの発現量、（b)FAS mRNAの発現 量及び (c)肝臓における中性脂肪含量を表すグラフである。図 19(a)より、高スクロース 食負荷により肝臓の LCEの発現が亢進すること、すなわち肥満形成の過程で肝臓の LCE発現が亢進していることが確認された。また、 LCE
RNAiの投与がマウスの肝臓での LCEの発現亢進を抑制していることが確認された。 [0140] 図 19(b)より、高スクロース食負荷により肝臓の FASの発現が亢進すること、すなわち 肝臓での脂肪酸合成が亢進していることが示唆された。また、 LCE
RNAi投与による LCE発現抑制により FASの発現亢進が抑制され、脂肪酸合成亢進 が抑制されることが示唆された。
[0141] 図 19 ( c)より、高スクロース食負荷により肝臓への脂肪の蓄積が亢進していることが 確認された。また、 LCE RNAi投与による LCE発現抑制が肥満形成の過程での肝臓 での脂肪蓄積を抑制することが確認された。
[0142] 以上より、高スクロース食負荷により肝臓での脂肪合成が亢進すること（肥満形成の 促進過程）と、 LCEの発現抑制がこの脂肪合成亢進を阻害 (肥満形成過程を抑制） することが確認された。
[0143] 図 20は、 siRNAを投与したマウスの肝臓における LCEタンパク質量の変化を表す図 である。図 19に示した脂肪酸合成と LCEの発現量との関係を LCEタンパク質レベル でも確認することができた。
[0144] 実施例 21：ヒト LCEのアミノ酸置換及びそれによる LCE活性の変化
ヒト LCE cDNAを、 BamHIサイトを付加した forward primer(hLCE_5BamHI)および Xholサイトを付加した reverse
primer (hLCE_3XhoI)を用いた PCRにより作製した。得られた cDNA断片を、付加した BamHIサイトと Xholサイトを用いて、プラスミド pCMV_Tag2B(Stratagene)にサブクロー ユングした (wild-type
LCE construct)。
[0145] 用いたプライマーの配列は以下の通りである。
hLCE-5BBamHI:
GGATCCAACATGTCAGTGTTGACTT (配列番号 93)
hLCE-3XhoI:
CTCGAGCTATTCAGCTTTCGTTGTT (配列番号 94)
[0146] このプラスミドを铸型として、 PCR法を用いた点突然変異導入により変異 LCEをコー ドする cDNAを作成した。点突然変異の導入方法を以下に記す。最初に Forward primerとして hLし E— を、 reverse primerとし飞各変異 人用の mutagenic primerを用 いた PCRにより変異導入 LCE
cDNAの 5'側部分を作製した。また Forward primerとして hLCE_510Sを、 reverse primerとして T7を用いた PCRにより LCE
cDNAの 3'側部分を作製した。得られた各変異導入 LCE cDNA 5'側断片と LCE cDNA 3'側断片を混合したものを铸型として、 forward
primerに hLCE-F4を、 reverse primerに T7を用いた PCRにより、変異を導入した LCE のコーディング領域全長を含む cDNA断片を得た。
[0147] 用いたプライマーの配列は以下の通りである。
hLCE-F4:
AACATGTCAGTGTTGACTTTAC (酉己歹 IJ番号 95)
hLCE-510S:
GTGCTCTTCGAACTGGTGCT (酉己歹 lj番号 96)
T7:
TAATACGACTCACTATAGGG (配列番号 97)
[0148] 作製した突然変異導入 LCEは下記の通りである。ヒト LCEに導入した突然変異は、 99番目のシスティンをァラニンに置換したもの (C99A)、 225番目のシスティンをァラニ ンに置換したもの (C225A)、 141番目のヒスチジンをァラニンにしたもの (H141A)、 144 番目のヒスチジンをァラニンにしたもの (H144A)、 145番目のヒスチジンをァラニンにし たもの (H145A)、及び 174番目のヒスチジンをァラニンにしたもの (H147A)である。
[0149] これら変異導入に使用したプライマーの配列は以下の通りである。
C99A:
CCCTGGTCGGCAACTGACTGCTTC (配歹' J番号 98)
C225A:
GTGAGAGTGGGCCTGGTCATGCTG (配歹' J番号 99)
H141A:
GTGATACCAGGCCAGGAAGATC (配列番号 100)
H144A:
GTGATGTGGGCATACCAGTGC (配列番号 101 ) H145A:
CACAGTGATGGCGTGATACCAG (配歹幡号 102)
H174A:
CATCACGGCGGCCACGCCATAG (配列番号 103)
[0150] 得られた変異 LCE cDNA断片は、制限酵素 EcoRI及び Xholを利用してプラスミド pCMV_Tag2Bにサブクローユングし、変異 LCE発現コンストラクトを作製した。これら のコンストラクトを Lipofectamine2000
(Invitrogen)を用いて HEK293細胞にトランスフエタトし、変異 LCEを発現させた。トラン スフエタトから 2日後に細胞を回収し、ミクロソーム画分を調製し、ミクロソーム中の LCE 活性を測定した。なお、 LCEの活性測定は、実施例 6に記載の方法と同様の方法に より行った。
[0151] 図 22は、 LCE変異体の LCE活性を表すグラフである。（a)はシスティンをァラニンに 置換した変異体の LCE活性を表し、（b)はヒスチジンをァラニンに置換した変異体の LCE活性を表している。いずれの変異体も野生型と比較して半分以下に LCE活性が 低下している。
産業上の利用可能性
[0152] 本発明によれば、長鎖脂肪鎖伸長酵素活性を抑制する活性を有する物質 (例えば 、 si匪、低分子化合物、タンパク質、抗体など)を用いた代謝系疾患、循環器系疾 患、中枢神経系疾患などの治療 ·予防方法を提供することが可能となり、また、かかる 物質を含有する治療 ·予防剤を提供することが可能となる。代謝系疾患としては、例 えば、肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、高脂血症、通風、脂肪肝などが挙げら れる。循環器疾患としては、例えば、狭心症、急性 ·うつ血性心不全、心筋梗塞、冠 状動脈硬化症、高血圧、腎臓病、電解質異常などが挙げられる。中枢神経系疾患と しては、過食症などが挙げられる。

Claims

請求の範囲
[1] 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
該被検化合物が、該被検動物又は該被検細胞中で LCE遺伝子あるいは該遺伝子 と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程と、 を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[2] 被験化合物を、 LCE遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を 有する被検動物又は被検細胞に接触させる工程と、
該レポーター遺伝子の被検動物又は被検細胞中での発現レベルを測定する工程 と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[3] 被検化合物を、 LCEタンパク質に接触させる工程と、
該被検化合物が、該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、 を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[4] 被検化合物を、 LCEを含む複数種のェロンゲ一スタンパク質に接触させる工程と、 該複数種のェロンゲ一スタンパク質の活性を測定する工程と、
該複数種のェロンゲ一スタンパク質において LCEの活性を阻害する被検化合物を 選択する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[5] 請求項 1一 4のいずれか一項に記載の評価方法によって得られた化合物を有効成 分として含有する肥満の治療又は予防剤。
[6] LCEの脂肪酸合成活性を抑制することを特徴とする脂肪合成抑制方法。
[7] LCEの脂肪酸合成活性を RNAiにより抑制することを特徴とする脂肪合成抑制方法
[8] 前記 RNAiが、配列番号 13及び 14に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 15及び
16に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 17及び 18に記載の核酸からなる siRNA、 配列番号 19及び 20に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 21及び 22に記載の核 酸からなる siRNA、配列番号 23及び 24に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 25及 び 26に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 27及び 28に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 29及び 30に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 31及び 32に記 載の核酸からなる siRNA、配列番号 33及び 34に記載の核酸からなる siRNA、配列番 号 35及び 36に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 37及び 38に記載の核酸から なる siRNA、配列番号 49及び 50に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 51及び 51 に記載の核酸からなる siRNA及び配列番号 53及び 54に記載の核酸からなる siRNA 力 なる群から選択される一以上の siRNAを使用したものであることを特徴とする請求 項 7に記載の脂肪合成抑制方法。
[9] 前記 RNAiが、配列番号 23及び 24に記載の核酸からなる siRNAを使用したものであ ることを特徴とする請求項 7に記載の脂肪合成抑制方法。
[10] LCEの脂肪酸合成活性を抑制する工程を含むことを特徴とする肥満の治療又は予 防方法。
[11] LCEの脂肪酸合成活性を RNAiにより抑制することを特徴とする肥満の治療又は予 防方法。
[12] 前記 RN が、配列番号 13及び 14に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 15及び
16に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 17及び 18に記載の核酸からなる siRNA、 配列番号 19及び 20に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 21及び 22に記載の核 酸からなる siRNA、配列番号 23及び 24に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 25及 び 26に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 27及び 28に記載の核酸からなる siRNA,配列番号 29及び 30に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 31及び 32に記 載の核酸からなる siRNA、配列番号 33及び 34に記載の核酸からなる siRNA、配列番 号 35及び 36に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 37及び 38に記載の核酸から なる siRNA、配列番号 49及び 50に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 51及び 51 に記載の核酸からなる siRNA及び配列番号 53及び 54に記載の核酸からなる siRNA 力 なる群から選択される一以上の siRNAを使用したものであることを特徴とする請求 項 11に記載の肥満の治療又は予防方法。
[13] 前記 RNAiが、配列番号 23及び 24に記載の核酸からなる siRNAを使用したものであ ることを特徴とする請求項 11に記載の肥満の治療又は予防方法。
[14] 被検組織又は被検細胞における LCE遺伝子の発現レベル又は発現レベルの変化 を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
[15] 被検組織又は被検細胞における LCEタンパク質の発現レベル又は発現レベルの 変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
[16] 被検組織又は被検細胞における LCE遺伝子に存在する多型を検出することを特徴 とする肥満の検査方法。
[17] LCEタンパク質と相互作用することにより LCE遺伝子の発現量に影響を及ぼすタン パク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする肥満の検査方法。
[18] 配列番号 23及び 24に記載の核酸からなることを特徴とする siRNA。
[19] 請求項 18に記載の siRNAを含むことを特徴とする LCE発現抑制剤。
[20] 請求項 18に記載の siRNAを含むことを特徴とする脂肪合成抑制剤。
[21] 請求項 18に記載の siRNAを含むことを特徴とする肥満の治療又は予防剤。
PCT/JP2004/009834 2003-07-11 2004-07-09 Lceによる肥満治療に有効な化合物の評価方法 Ceased WO2005005665A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002532150A CA2532150A1 (en) 2003-07-11 2004-07-09 Method of evaluating compound efficacious in treating obesity
JP2005511544A JPWO2005005665A1 (ja) 2003-07-11 2004-07-09 Ｌｃｅによる肥満治療に有効な化合物の評価方法
US10/564,311 US7491381B2 (en) 2003-07-11 2004-07-09 Method of evaluating compound efficacious in treating obesity
EP04747302A EP1657311A4 (en) 2003-07-11 2004-07-09 METHOD FOR EVALUATING AN OBJECT RELATING TO THE TREATMENT OF OBESITY

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003196154 2003-07-11
JP2003-196154 2003-07-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005005665A1 true WO2005005665A1 (ja) 2005-01-20

Family

ID=34055772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/009834 Ceased WO2005005665A1 (ja) 2003-07-11 2004-07-09 Lceによる肥満治療に有効な化合物の評価方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US7491381B2 (ja)
EP (1) EP1657311A4 (ja)
JP (1) JPWO2005005665A1 (ja)
CA (1) CA2532150A1 (ja)
WO (1) WO2005005665A1 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008178363A (ja) * 2007-01-25 2008-08-07 Tohoku Univ レプチンシグナル伝達障害モデル動物
WO2008120653A1 (ja) 2007-04-02 2008-10-09 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. インドールジオン誘導体
WO2009038021A1 (ja) 2007-09-21 2009-03-26 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. ４－スルホニルピペリジン誘導体
WO2009081789A1 (ja) 2007-12-26 2009-07-02 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. スルホニル置換六員環誘導体
WO2009099086A1 (ja) 2008-02-06 2009-08-13 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. ３位置換スルホニルピペリジン誘導体
WO2009131065A1 (ja) 2008-04-24 2009-10-29 萬有製薬株式会社 アリールスルホニル誘導体を有効成分とする長鎖脂肪酸伸長酵素阻害剤
JP2013059332A (ja) * 2012-10-26 2013-04-04 Tohoku Univ マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法
CN117363741A (zh) * 2023-10-13 2024-01-09 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 猪gpx3基因5’utr内与猪胴体和肉质性状相关的分子标记及其应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8227184B2 (en) * 2008-01-14 2012-07-24 President And Fellows Of Harvard College Methods for modulating de novo hepatic lipogenesis by modulating XBP-1 activity
WO2011140190A1 (en) 2010-05-05 2011-11-10 Infinity Pharmaceuticals Tetrazolones as inhibitors of fatty acid synthase
US8450350B2 (en) 2010-05-05 2013-05-28 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Triazoles as inhibitors of fatty acid synthase
US9956236B2 (en) 2011-02-07 2018-05-01 Cornell University Methods for increasing immune responses using agents that directly bind to and activate IRE-1
WO2013017656A1 (en) * 2011-08-02 2013-02-07 Medizinische Universität Wien Antagonists of ribonucleases for treating obesity
WO2013134774A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Cornell University Modulation of breast cancer growth by modulation of xbp1 activity
EP3521431A1 (en) 2013-09-25 2019-08-07 Cornell University Compounds for inducing anti-tumor immunity and methods thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004013347A2 (en) * 2002-08-06 2004-02-12 Curagen Corporation Methods of identifying compounds that modulate protein activity
JP2004121218A (ja) * 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004513662A (ja) 2000-11-29 2004-05-13 キセノン　ジェネティックス　インコーポレイテッド ヒトエロンガーゼ遺伝子、その使用およびそれを調節する化合物
JP2004532638A (ja) 2001-06-05 2004-10-28 エクセリクシス・インコーポレイテッド ｐ５３経路のモディファイヤーとしてのＭＡＰ３Ｋｓおよび使用方法
WO2005030985A2 (en) 2003-09-25 2005-04-07 Devgen N.V. Use of amino acid sequences involved in the elongation of fatty acids in identifying and/or developing compounds for preventing and/or treating metabolic diseases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004013347A2 (en) * 2002-08-06 2004-02-12 Curagen Corporation Methods of identifying compounds that modulate protein activity
JP2004121218A (ja) * 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATSUZAKA T. ET AL: "Cloning and characterization of a mammalian fatty acyl-CoA elongase as a lipogenic enzyme regulated by SREBPs", JOURNAL OF LIPID RESEARCH, vol. 43, 2002, pages 911 - 920, XP002903505 *
SANOJ K. ET AL: "Enzyme site-specific changes in hepatic microsomal fatty acid chain elongation in streptozotocin-induced diabetic rats", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1042, 1990, pages 81 - 85, XP002903504 *
See also references of EP1657311A4 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008178363A (ja) * 2007-01-25 2008-08-07 Tohoku Univ レプチンシグナル伝達障害モデル動物
WO2008120653A1 (ja) 2007-04-02 2008-10-09 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. インドールジオン誘導体
JP5319518B2 (ja) * 2007-04-02 2013-10-16 Ｍｓｄ株式会社 インドールジオン誘導体
WO2009038021A1 (ja) 2007-09-21 2009-03-26 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. ４－スルホニルピペリジン誘導体
JP5319536B2 (ja) * 2007-09-21 2013-10-16 Ｍｓｄ株式会社 ４−スルホニルピペリジン誘導体
WO2009081789A1 (ja) 2007-12-26 2009-07-02 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. スルホニル置換六員環誘導体
WO2009099086A1 (ja) 2008-02-06 2009-08-13 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. ３位置換スルホニルピペリジン誘導体
WO2009131065A1 (ja) 2008-04-24 2009-10-29 萬有製薬株式会社 アリールスルホニル誘導体を有効成分とする長鎖脂肪酸伸長酵素阻害剤
JP2013059332A (ja) * 2012-10-26 2013-04-04 Tohoku Univ マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法
CN117363741A (zh) * 2023-10-13 2024-01-09 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 猪gpx3基因5’utr内与猪胴体和肉质性状相关的分子标记及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US7491381B2 (en) 2009-02-17
US20060148739A1 (en) 2006-07-06
EP1657311A4 (en) 2006-10-11
CA2532150A1 (en) 2005-01-20
JPWO2005005665A1 (ja) 2006-11-09
EP1657311A1 (en) 2006-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Abdul-Ghani et al. Mitochondrial dysfunction, insulin resistance, and type 2 diabetes mellitus
Heikkinen et al. The Pro12Ala PPARγ2 variant determines metabolism at the gene-environment interface
Kim et al. Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle
Tyynismaa et al. Mitochondrial myopathy induces a starvation-like response
Spruiell et al. Role of pregnane X receptor in obesity and glucose homeostasis in male mice
Maher et al. Men supplemented with 17β-estradiol have increased β-oxidation capacity in skeletal muscle
Scanu et al. Lipoprotein (a). Heterogeneity and biological relevance.
Kang et al. Thioesterase superfamily member 2/acyl-CoA thioesterase 13 (Them2/Acot13) regulates hepatic lipid and glucose metabolism
WO2005005665A1 (ja) Lceによる肥満治療に有効な化合物の評価方法
Di Nottia et al. A homozygous MRPL24 mutation causes a complex movement disorder and affects the mitoribosome assembly
US20120164154A1 (en) Method for increasing insulin sensitivity and for treating and preventing type 2 diabetes
Powell et al. Fatty acid desaturase 1 knockout mice are lean with improved glycemic control and decreased development of atheromatous plaque
Izumi et al. CRISPR/Cas9-mediated Angptl8 knockout suppresses plasma triglyceride concentrations and adiposity in rats
Shindo et al. Involvement of microsomal triglyceride transfer protein in nonalcoholic steatohepatitis in novel spontaneous mouse model
Griess et al. Sphingolipid subtypes differentially control proinsulin processing and systemic glucose homeostasis
Olsson et al. Bovine growth hormone-transgenic mice have major alterations in hepatic expression of metabolic genes
Chiefari et al. The cAMP-HMGA1-RBP4 system: a novel biochemical pathway for modulating glucose homeostasis
Pan et al. Metabolic consequences of ENPP1 overexpression in adipose tissue
Tomašić et al. Fasting reveals largely intact systemic lipid mobilization mechanisms in respiratory chain complex III deficient mice
Hemmeryckx et al. Effect of premature aging on murine adipose tissue
Jelinek et al. The C57BL/6J Niemann–Pick C1 mouse model with decreased gene dosage has impaired glucose tolerance independent of body weight
Schlaepfer et al. Increased expression of the SNARE accessory protein Munc18c in lipid-mediated insulin resistance
Kelder et al. CIDE-A gene expression is decreased in white adipose tissue of growth hormone receptor/binding protein gene disrupted mice and with high-fat feeding of normal mice
Gamal et al. In vivo and in silico insights into the antidiabetic efficacy of EVOO and hydroxytyrosol in a rat model
Fukuyama et al. Association of the− 112A> C polymorphism of the uncoupling protein 1 gene with insulin resistance in Japanese individuals with type 2 diabetes

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005511544

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2532150

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006148739

Country of ref document: US

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10564311

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004747302

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004747302

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10564311

Country of ref document: US