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WO2005058333A1 - Methode zur gewinnung eines biologisch aktiven mit elektroschock behandelten blutserums und seine verwendung - Google Patents

Methode zur gewinnung eines biologisch aktiven mit elektroschock behandelten blutserums und seine verwendung Download PDF

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Publication number
WO2005058333A1
WO2005058333A1 PCT/EP2003/014578 EP0314578W WO2005058333A1 WO 2005058333 A1 WO2005058333 A1 WO 2005058333A1 EP 0314578 W EP0314578 W EP 0314578W WO 2005058333 A1 WO2005058333 A1 WO 2005058333A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
line
blood
blood serum
serum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2003/014578
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Vitali Alexandrovich Shestakov
Christoph Hanz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Owen Holding Ltd
Original Assignee
Owen Holding Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Owen Holding Ltd filed Critical Owen Holding Ltd
Priority to AU2003298215A priority Critical patent/AU2003298215A1/en
Priority to PCT/EP2003/014578 priority patent/WO2005058333A1/de
Priority to PCT/EP2004/014510 priority patent/WO2005058889A2/en
Priority to EP04804108A priority patent/EP1699470A2/de
Priority to RU2006121488/15A priority patent/RU2364404C2/ru
Priority to AU2004299279A priority patent/AU2004299279B2/en
Priority to CN2004800376828A priority patent/CN1893961B/zh
Priority to CA002546979A priority patent/CA2546979A1/en
Priority to BRPI0417797-5A priority patent/BRPI0417797A/pt
Priority to JP2006544384A priority patent/JP2007514706A/ja
Publication of WO2005058333A1 publication Critical patent/WO2005058333A1/de
Priority to IL176343A priority patent/IL176343A0/en
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Ceased legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention belongs to medicine and is used to obtain a biologically active and electroshocked blood serum which is useful in some diseases and disorders of the human and animal organism (energy change and cyclic adenosine monophosphoric acid content in brain tissue, long-term memory, epilepsy, etc.) )
  • a biologically active and electroshocked blood serum which is useful in some diseases and disorders of the human and animal organism (energy change and cyclic adenosine monophosphoric acid content in brain tissue, long-term memory, epilepsy, etc.)
  • the use of the blood serum according to the invention for regulating the proliferation of different human tumor cells is also treated.
  • a method for obtaining an active substance from blood serum is known, which is based on the extraction of blood from humans and animals, the incubation and the secretion of the active substance with subsequent preservation.
  • This method involves obtaining a blood serum that increases the body's resistance to exogenous and endogenous factors such as air pressure, air temperature, gravity, light etc. as well as hunger, thirst, sleep and sexual needs etc. (see JP 2123287, EP 0 542 303; RU 2096041, RU 2120301).
  • the blood serum is taken from a donor who has previously been put into a certain functional state. Depending on the degree of exposure, blood serum with different biological activity is obtained, namely with miogenic, somnogenic, ophthalmogenic, audioactive, thermoactive, dietary, sexually active, anti-hypoxic, anti-alcohol and anti-nicotine activity.
  • the present invention represents a further development of these methods and deals with the different uses of the blood serum obtained.
  • such peptides such as the parathyroid peptide, gastrin, bombezin promote the development of tumor cells and the development of breast, bone and colon cancer [sh. Kitazawa S., Maeda S., Development of skeletal metastases // Clin. Orthop, 1995, v. 312, p. 45-50; Kaji et al. Carbokyl - termmal peptices from parathyroid hormone-related protein stimulate osteoclast - like cell formation // Endocrinology, 1995, V. 136, P. 842-847].
  • the aim of the present invention is to provide a new method for obtaining a biologically active blood serum from chicken blood.
  • Another aspect of the present invention is the development of a drug form for a new, biologically active blood serum.
  • the invention is based on various pharmaceutical forms: inter alia peroral, parenteral, nasal and buccal administration and in the form of suppositories and similar types.
  • the invention provides for the use of suitable and physiologically acceptable media (such as distilled water) and fillers (e.g. cocoa butter).
  • suitable and physiologically acceptable media such as distilled water
  • fillers e.g. cocoa butter
  • the biologically active blood serum treated with electroshock can be used both independently and in conjunction with other biologically active agents.
  • An additional object of the invention is a pharmaceutical composition in which the active substance according to the present invention acts as an agent.
  • the pharmaceutical composition must have an active ingredient in an amount sufficient to have a beneficial effect on the patient's organism, i.e. an effective amount.
  • Another object of the invention is to determine the effective dose of the active substance according to the present invention. This dose is presumably in the range from 95 to 105 mg / kg of body weight of the patient. The treating doctor should therefore determine the specific dose based on the patient's condition, age, weight and type of treatment.
  • Another object of the invention is the use of the blood serum according to the invention for regulating the proliferation of different human tumor cells.
  • the following cells were used: cells from the Jurkat line of human T cell lymphoma, cells from the Raj line of human B cell lymphoma, cells from the Bro line of human melanoma cells, cells from the HeLa line of cervical cancer, cells from the adenocarcinoma of the mammary gland MCF-7 line, cells of the Mg63 line and fibrosarcoma of the HT1080 line, cells of the IMR-32 neuroblastoma and hepatocarcinoma of the HepG2 line.
  • lymphoid cells Jurkat and Raj
  • epitheloid cells HeLa and MCF-7
  • cells of neuronal origin IMR-32
  • cells of the connective tissue Mg63 and HT1080
  • mesenchymal cells HepG2
  • the electro shock Il.bis III. Degree-treated chicken blood (electrical current 80-120 volts, frequency 50 Hertz, current 0.05 amps, exposure time: 3-4 seconds in the head area).
  • the blood was taken from the carotid artery and subsequently incubated at 4-8 ° C for 18-24 hours in polyethylene jars. After complete blood clot retraction, the vials were held at 3000 rpm for 20-30 minutes. centrifuged, the serum was separated from blood clots and lyophilized under normal conditions.
  • the vials with the lyophilized serum were irradiated on RZ-100 M systems at 20 to 30 kGy, preferably at about 25 kGy, using Co.
  • the serum obtained in this way was stored at a temperature of 4-8 ° C.
  • the experiments were carried out on rats of the Wistar line, namely males with a body mass of 280-300 g.
  • the animals were divided into 4 groups of 10 rats each.
  • the rats were given 1.0 ml of the physiological solution.
  • the rats of the second group were administered serum in a dose of 100 +/- 5.0 mg / kg of body weight (1.0 ml in volume).
  • the rats were decapitated 30 minutes after the injection.
  • the rats of the third group were given 1.0 ml of the physiological solution and the rats of the fourth group were given serum (100 +/- 5.0 mg / kg body weight) in a volume of 1.0 ml. 30 minutes after the injection, the Animals with a weight attached to the tail (10% of the body weight of the rat) are placed in a container with water (25 ° C). After the first signs of agony, the animals were removed from the water and decapitated.
  • the brain, heart, liver (as organs with an intense energetic overload in processes of extreme adaptation) and the skeletal muscles (as the main carrier organ) were used as patterns.
  • the tissue patterns of each rat were weighed, cooled with an isotonic NaCl solution and quickly frozen with liquid nitrogen. The total time of "loading" until the end of sampling was max. 5-6 minutes.
  • Adenosine triphosphoric acid, adenosine desophosphoric acid and adenosine monophosphoric acid were determined in the skeletal muscles of the rats. Nucleotides were separated on columns using ion exchange chromatography using Dowex 1 anionite. The quantitative determination of the adenosine triphosphoric acid, adenosine desophosphoric acid and adenosine monophosphoric acid content was carried out spectrophotometrically (spectrophotometer Hitachi-557) within a range of 256 Nm.
  • the energy potential was calculated using the following formula:
  • the amount of cyclic adenosine monophosphoric acid in the brain, heart and liver was determined by radioimmunological analysis using a special device from Amersham (Great Britain).
  • the marked adenosine monophosphoric acid was determined using the scintillator computer GS-8.
  • adenosine triphosphoric acid adenosine desophosphoric acid and adenosine monophosphoric acid and the increase in the energy potential are both when comparing the third group with the control group and the second group (p ⁇ 0.05) as well as the fourth group with the control group and the second group (p ⁇ 0.05) as well as when comparing the third and fourth groups with each other (p ⁇ 0.05 Table 1).
  • Table 1 Content of adenosine triphosphoric acid, adenosine desophosphoric acid and adenosine monophosphoric acid and the energy potential in the tissue of the skeletal muscles after electroshock-treated serum
  • adenyl system values when awake and 30 minutes after slight stress due to the injection confirm that under the influence of serum the mixing of the levels of adenosine triphosphoric and adenosine desophosphoric acid in the muscle tissue takes place to the upper standard values, while the adenosine monophosphoric acid content is directed downwards.
  • the electroshock-treated serum increases the energy potential in the skeletal muscle tissue of the rat, promotes the increase in the content of cyclic adenosine monophosphoric acid in the brain tissue both at rest and under extreme conditions physical exertion and, after physical stress in the rats, favors the increase in cyclic adenosine monophosphoric acids in the heart and liver tissue.
  • rats were placed in a cylinder which was located in a thermostatic vessel filled with water.
  • the cylinder set up on three supports, allowed the animals to dive under its lower edge and reach the platform outside the cylinder.
  • the electroshock-treated serum was injected into the abdominal cavity at a dose of 100 mg / kg body weight 30 minutes before the start of the experiment.
  • the control animals were given 1 ml of the physiological solution. The next day the reflex behavior was tested, after which there was a 42-day break.
  • 30 animals that had been taught how to dive under a "bell" for five days were divided into three groups.
  • the animals of the first group (10 rats) were injected with cytisine (H-cholinoceptive-B looseness of the brain) in the form of a physiological solution at a dose of 1 mg / kg body weight 30 minutes before the test.
  • the third group of animals (control - 10 rats) was injected with a physiological solution in a dose of 1 ml.
  • the complex behavior of the animals was tested 48 hours after the injection of the substances mentioned using the above method.
  • the bioassay showed 48 hours after the effects of cytisine were noticeable, a marked slowdown in the "escape response" from a closed room, that is three times as compared to the control animals.
  • Preliminary administration of the serum until the cytisine injection not only abolished the action of this blocker, but also caused a 20% increase in "escape” response compared to the control group, and the overall efficacy of the substance exceeded that of the blocker 5 times (Table 5).
  • the blood serum treated with electroshock therefore promotes the formation of long-term memory, especially in animals with a slow "escape reaction” from a closed room and from water. It also plays an important role in maintaining long-term memory via the H-cholinoceptive brain mechanisms.
  • camphor in toxic doses causes hyperactivation of the moving areas of the central nervous system, which in turn is reflected in the development of tonic cramps. For this reason, camphor is used in addition to Korazol for the generation of cramps. Depending on the dose of the preparation administered, camphor is used to produce all the typical components of a small and large epileptic seizure.
  • the blood serum according to the invention is a lyophilized, with electroshock II. - III. Grade treated chicken blood serum [Beresnjewa W.I., "Electrical trauma, electrical combustion and treatment", M., 1964, p. 87]. Two types of these were used in the tests: the first - dissolved in water at a concentration of 100 mg / ml (test fraction 1), the second - after centrifuging the suspension at 10,000 x g for three minutes (three minutes) (test fraction 2).
  • the cells of the Jurkat and Raji lines and lymphocytes of the human peripheral blood were placed in plastic plates (Nunc or Falcon) in 1640 RPMI medium (Sigma) by adding the 10% bovine fetal serum (Gibco), 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin at a room temperature of 37 ° C in a CO incubator with 5% CO 2 content and cultured at 95% humidity.
  • Bro, HeLa, MCF-7, Mg63, HT1080, IMR-32 and HepG2 lines were also cultured, but in DMEM medium (Sigma).
  • a 15 ml Phykoll-Pak solution is poured into two 50 ml conical test tubes (Falcon), after which 25 ml of blood diluted twice in a phosphate salt buffer (PSP) are applied.
  • the test glasses are then spun in a baket rotor at 400 x g and 20 ° C for 30 minutes.
  • the upper phase, which contains plasma, is not used.
  • the evaluation of the biosynthetic intensity DNA was carried out after the addition of 3 H-thymidine to the acid-insoluble cell fraction.
  • lymphocytes were cultivated in 96-well plates in 200 ul medium with 200-800 thousand medium in each well in the full medium with different concentrations of the test substance.
  • 3 H-thymidine (1 ⁇ Ki / well, 40 mKi / mmol) was added 2 hours before the end of the incubation.
  • the cells were collected on filters using an automatic device for cell collection, the acid-soluble products were washed with 5% TH-acetic acid (H 2 O) and their radioactivity was measured with a scintillometer.
  • the biosynthesis intensity DNA is in imp./min. measured.
  • the cells were collected in a logarithmic growth phase (adhesive cells if they fill approximately half an area of the nutrient plate), placed in the nutrient medium, in the Gorjaew chamber) and then counted in a nutrient medium with a concentration of 50-100,000 dissolved in 1 million.
  • the cell solution was added to the 96-well plates after adding different concentrations of the test substances, each 100 .mu.l.
  • 50 ⁇ l of MTT solution in the nutrient medium (3-4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2.5 diphenyl tetrazolium bromide were added to all waves after the incubation in various 96-wave columns in all waves.
  • MTT solution 1 ml of MTT starting solution is mixed with 4 ml of nutrient medium.
  • the MTT final solution is prepared by dissolving this substance in a phosphate salt solution (PSL, 0.01 M sodium phosphate buffer pH 7.4, with a 0.15 M NaCl content) with a concentration of 5 mg MTT / ml PSL and further filtering a filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m (storage takes place at a temperature of + 4 ° C for up to one month).
  • PSL phosphate salt solution
  • a filter 0.45 ⁇ m
  • the nutrient medium is removed by suction with the pump, 150 ⁇ l of dimethyl sulfoxide (DMSO) are added to each well to dissolve the blue formazan crystals formed, and the optical density of the solution in each well on a multi-channel spectrophotomer for microplates at a wavelength of 540 nm measured (lab system).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the results of the viability of the cells depending on the concentration of the substance are shown in percent of the survival of the control cells.
  • the data were processed with the "Origin" computer program. Results and discussion The results are shown in Figures 1 - 8. This results in the following: the highly concentrated substance S1 (2.5-20 mg / ml) has an inhibitory effect on all cells, but the reaction of cells of different tissue types to this substance is different.
  • the IC50 dose (concentration of the substance that leads to 50% inhibition of the cells) varies for different cell lines from 2.2 (Jurkat) to> 20 mg / ml (Mg63) for the starting substance (Index 1) from 3.6 ( Peripheral blood lymphocytes) up to> 20 mg / ml (Mg 63 and HeLa) for the soluble fraction of the substance (index 2).
  • the toxicity of the starting substance was higher than that of the soluble substance.
  • the toxicity of these forms was almost the same (Mg63, Raji, lymphocytes of peripheral blood), and for others (Jurkat, MCG-7, LMR-32) there were 2-3 according to IC50 - major differences.
  • Table 7 Sensitivity of the tested cell lines to the preparation "Doxorubizin"
  • test substance has mitogenic activity, ie an ability to stimulate lymphocyte proliferation (in this case its increase in volume, which is usually due to the enhancement of the biosynthesis of DNA lymphocytes, which is assessed for the presence of 3 H-thymidine) is detected).
  • test substance has a toxic effect on lymphocytes (is mostly assessed after the inhibition of lymphocyte proliferation, which was previously stimulated by mitogens with 3 H-thymidine content or with the help of vital MTT-type dyes).
  • non-activated lymphocytes do not proliferate in the culture and that their number increases under the influence of mitogens as the mitogen concentration increases. This is expressed in the increase in the marked DNA.
  • Section (1) reflects the range of the mitogen concentration in which the increasing effect (the biosynthetic intensity DNA) is in relation to the mitogen concentration.
  • the second section of the curve (2) shows the flat section again and contains the range of the mitogen concentration, namely when the highest effect has already been achieved, the increase in the mitogen concentration is not characterized by a change in the proliferation level reached and no cytotoxic effect is observed.
  • Section (3) shows the range of the mitogen concentration in which it already has a toxic effect.
  • the subject of the investigation was the effect of the substance on the non-activated lymphocytes of the human peripheral blood.
  • the dependence of the proliferative activity (effectiveness) on the dose of the substance was tested.
  • the subject of the tests carried out was the effect of the substance on the biosynthetic intensity DNA of the lymphocytes (FHA 20 ⁇ g / ml) activated by phytohemaglytinyl in the second phase.
  • the number of peripheral blood lymphocytes has not changed significantly.
  • the effectiveness of the substance was examined for the lymphocytes activated with Mitogen FHA 20 ⁇ kg / ml, the inhibition of the activated lymphocytes was found.
  • the cytotoxic activity of the substance was also examined by adding to the cells the carcinoma of the mammary gland of the MCF-7 line, which is in the state of a monomolecular layer. No proliferation was found due to contact braking of the cells. With such a model one can determine the toxic effect of the substance, i.e. separate them from the cytostatic activity. When using this model, it has been found that the substance has its own cytotoxic effect at a concentration above 2.5 mg / ml, regardless of whether the insoluble fraction has been removed or not. However, the dependence on the dose is very weak.
  • the toxic effect is significantly weaker, which may be related to the fact that an effect was registered within 24 hours and not after 72 hours, as is the case with the proliferated cells (A prolonged cell incubation in the state of a monomolecular layer can lead to the death of the control cells).
  • test substance not only has a cytostatic effect, but also its own cytotoxic activity.
  • cytotoxic activity was significantly lower than the total cytotoxic and cytostatic activity, although these were observed at the same concentration.
  • Grade S1 obtained in the dosage 0.1-1.1 mg / ml causes 10-40% higher proliferation of the human cells of the Jurkat, Raji, Bro, Mg63, HT1068 and HegL2 lines than those of the control group.
  • the substance used in higher doses (2.5 - 20 mg / ml) have a noticeable inhibition of the proliferation of all of the human cancer cells that we examined.
  • the sensitivity of the cells to the substance S1 is significantly higher than to the known anti-tumor preparation doxorubizine.
  • the substance has both a cytostatic and a cytotoxic effect.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung gehört zur Medizin und wird zur Gewinnung eines biologisch aktiven und mit Elektroschock behandelten Blutserums verwendet, welches sich bei einigen Erkrankungen und Störungen des menschlichen und tierischen Organismus als nützlich erweist (Energiewechsel und Gehalt an zyklischer Adenosinmonophosphorsäure im Hirngewebe, Langzeitgedächnis, Epilepsie usw.) Weiters wird die Verwendung des erfindungsgemässen Blutserums zur Regulierung der Proliferation unterschiedlicher menschlicher Tumorzellen behandelt.

Description

Methode zur Gewinnung eines biologisch aktiven mit Elektroschock behandelten Blutserums und seine Verwendung
Die vorliegende Erfindung gehört zur Medizin und wird zur Gewinnung eines biologisch aktiven und mit Elektroschock behandelten Blutserums verwendet, welches sich bei einigen Erkrankungen und Störungen des menschlichen und tierischen Organismus als nützlich erweist (Energiewechsel und Gehalt an zyklischer Adenosinmonophosphorsaure im Hirngewebe, Langzeitgedächnis, Epilepsie usw.) Weiters wird die Verwendung des erfindungsgemäßen Blutserums zur Regulierung der Proliferation unterschiedlicher menschlicher Tumorzellen behandelt.
Stand der Technik
Bekannt ist ein Verfahren zur Gewinnung einer aktiven Substanz aus Blutserum, dem die Entnahme des Bluts von Menschen und Tieren, die Inkubation sowie die Absonderung der aktiven Substanz mit anschließender Konservierung zugrunde liegt. Diese Methode betrifft die Gewinnung eines Blutserums, das die Widerstandsfähigkeit des Körpers in bezug auf exogene und endogene Faktoren wie Luftdruck, Lufttemperatur, Schwerkraft, Licht etc. sowie Hunger, Durst, Schlaf- und sexuelle Bedürfnisse usw. erhöht (sh. JP 2123287, EP 0 542 303; RU 2096041, RU 2120301).
Das Blutserum wird hierbei von einem Spender entnommen, der zuvor in einen bestimmten funktionellen Zustand versetzt wird. Dabei wird je nach Einwirkungsgrad Blutserum mit unterschiedlicher biologischer Aktivität gewonnen, und zwar mit miogener, somnogener, oph- talmogener, audioaktiver, thermoaktiver, diätaktiver, sexaktiver, antihypoxischer, Antialko- hol- und Antinikotinaktivität.
Ein anderes Verfahren, veröffentlicht in der EP 1 283 047, beschreibt die Behandlung von tierischem Blutserum , welches einer Gamma-Bestrahlung ausgesetzt wird mit dem Ziel, die biologische Aktivität zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Weiterentwicklung dieser Methoden dar und behandelt die unterschiedlichen Verwendungen des gewonnenen Blutserums.
Gegenwärtig wird nach peptidartigen Substanzen gesucht, welche die Zeilproliferation unterschiedlicher menschlicher Gewebearten regulieren. Sowohl Stimulatoren als auch Inhibitoren der Zellteilung der normalen und pathologisch somatischen Zellen sowie Nervenzellen werden vielseitig erforscht [sh. Aschmarin I.P., "Neurochemie", Moskau, Verlag des Biomed. Chem. Instituts an der Russischen Akademie der Wissenschaften, 1996]. Es wurde festgestellt, dass neben den allgemeinen Aktivierungsfunktionen der peptiden Wachstumsfaktoren - Mitosestimulation, Zelldifferenzierung und Zellwachstum unterschiedlicher Arten des Normalgewebes, schneller Wundheilung - Wachstumspeptide zur Tumorbildung führen können [sh. Bouneres P. // Growth hormone effects on carbohydrate and Lipid metabolism. Horm. Res., 1993, Vol 40, P. 31; Robinson C. // Growth factors: therapeutic advances in wound healing. Ann. Med., 1993, Vol 25, P. 535; Diegnez C, Casanueva F. // Influence of metabolic Substrates and ibesity on growth hormone secretion. Trends Endocrin. Metab., 1995, Vol.6, P.55; Menster D., Herrmann J., Nicolson J// The role of tropic factors and autocrine/paracrine growth factors in brain meta.].
Unter anderem fördern derartige Peptide wie das parathyroide Peptid, Gastrin, Bombezin die Entwicklung von Tumorzellen sowie die Entstehung von Brust-, Knochen- und Darmkrebs [sh. Kitazawa S., Maeda S., Development of skeletal metastases // Clin. Orthop, 1995, V. 312, P. 45-50; Kaji et al,. Carbokyl - termmal peptices from parathyroid hormone-related protein stimulate osteoclast - like cell formation //Endocrinology, 1995, V. 136, P. 842-847].
Obwohl gewisse Peptide die normale Zellteilung begünstigen und Verhaltensstimulatoren für Mensch und Tier sind, besteht bei ihrer Verwendung die Gefahr der Bildung von Tumorzellen und der Entwicklung von Krebskrankheiten.
Frühere Untersuchungen haben ergeben, dass die Elektroschockstimulation von Tieren zur Erhöhung des Betaendorphin-Spiegels im Blut führt [sh. Litvinova S.V., et al. Action of beta- endorfm antiserum of defferent antibody tits on thermal or tail-shock pain in rats// Biomed Scie-1990. V. 1/5 - P.471-474.]. In seinem Übersichtswerk liefert W.I. Udowitschenko zahlreiche Daten darüber, dass der Schock beliebiger Ätiologie wie z.B. der Elektroschock sowohl bei Menschen als auch bei Tieren die Konzentration an Betaendorphinen-, Meta- und Leuenkephalinen im Blut deutlich erhöht [sh. Udowitschenko W.I. "Das endogene opioide System beim Schock" Pathologische Physiologie und experimentelle Therapie, 1989, Nr. 6, S. 72-77].
Aus unseren Untersuchungen geht hervor, dass das nach Elektroschock entnommene tierische Serum (Substanz Sl) mit endogenen Peptiden einer Molekularmasse von bis zu 10-14 kDa (sh. EP 1 283 047) angereichert ist und das Hörvermögen bei gehörlosen Tieren stimuliert [sh. "Einfluss der Substanz Sl auf Ratten mit gesenktem Hörvermögen"// Exper. Biol. Und Medizin, 2002, Nr. 1, S. 42-43].
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung einer neuen Methode zur Gewinnung eines biologisch aktiven Blutserums aus Hühnerblut.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in der Entwicklung einer Arzneimittelform für ein neues, biologisch aktives Blutserum. Die Erfindung geht von diversen Arzneimittelformen aus: unter anderem der peroralen, pa- renteralen, nasalen und buccalen Verabreichung sowie in Form von Suppositorien und ähnlichen Arten.
In der Erfindung ist die Verwendung von geeigneten und physiologisch vertretbaren Medien (wie z.B. destilliertem Wasser) und Füllmitteln (z.B. Kakaobutter) vorgesehen.
Das mit Elektroschock behandelte biologisch aktive Blutserum kann sowohl selbständig als auch in Verbindung mit anderen biologisch aktiven Mitteln verwendet werden.
Ein zusätzliches Ziel der Erfindung ist eine pharmazeutische Komposition, bei der die aktive Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung als Agens auftritt. Dabei muss die pharmazeutische Komposition einen aktiven Bestandteil in einer Menge aufweisen, die ausreicht, um eine günstige Wirkung auf den Organismus des Patienten auszuüben, d.h. eine effektive Menge.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Ermittlung der effektiven Dosis der aktiven Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung. Vermutlich liegt diese Dosis im Bereich 95 bis 105 mg/kg Körpergewicht des Patienten. Die konkrete Dosis soll daher vom behandelnden Arzt ausgehend vom Zustand des Patienten, seinem Alter, seinem Gewicht und der Behandlungsart festgelegt werden.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Blutserums zur Regulierung der Proliferation unterschiedlicher menschlicher Tumorzellen. Folgende Zellen wurden verwendet: Zellen des humanen T-Zell-Lymphoms der Linie Jurkat, Zellen des humanen B-Zell-Lymphoms der Linie Raj, Zellen der humanen Melanomzellen der Linie Bro, Zellen des Gebärmutterhalskarzinoms der Linie HeLa, Zellen des Adenokarzinoms der Milchdrüse der Linie MCF-7, Zellen des Osteosarkoms der Linie Mg63 und des Fibrosar- koms der Linie HT1080, Zellen des Neuroblastoms IMR-32 und des Hepatokarzinoms der Linie HepG2. Es wurde somit die Wirkung der Substanz auf die Lymphoidzellen (Jurkat und Raj), Epitheloidzellen (HeLa und MCF-7), Zellen der neuronalen Herkunft (IMR-32), Zellen des Bindegewebes (Mg63 und HT1080) sowie Mesenchymzellen (HepG2) erforscht. Als Normalzellen wurden die in vitro stimulierten Lymphozyten des peripheren menschlichen Bluts verwendet.
Kurzbeschreibung des Inhalts der Erfindung
Die Behandlung von Hühnern mit Elektroschock und die Bearbeitung des Blutserums mit Gamma-Strahlen führen zu einer bedeutenden Erhöhung der biologischen Aktivität, die viele Körperfunktionen des Patienten positiv beeinflusst.
Gleichzeitig ist jedoch bekannt, dass Elektroschocks große Störungen sämtlicher lebenswichtiger Funktionssysteme des Organismus, vor allem des zentralen Nerven-, des Herz- Kreislauf-, des Atmungssystems und des Blutkreislaufes hervorrufen, [sh. Orlow A.N., Sarkowow M.A., Butenko M.W. - Elektrotrauma, M., Medizin, 1977]. Ebenfalls wurde festgestellt, dass Blut und aus Blut hergestellte Präparate bestrahlungsempfindlich und nicht beständig sind sowie unter Einfluss der ionisierten Strahlung deaktiviert werden, [sh. // Radiomedizin - M., Atomisdat - 1972. S.123-125; Gergely J., et. AI. Studies of gamma- ray -irradiated human immunoglobulin G.// Radiosterilization of Medical Products, - 1967. Vienna. - P. 115-124].
Alle diese Studien gemeinsam haben nicht die Ergebnisse gebracht, die von den Autoren der vorliegenden Erfindung erzielt wurden.
Es stellte sich heraus, dass wenn man venöses oder arterielles mit Elektroschock II.-III. Grades behandeltes Hühnerblut 24 Stunden lang bei niedrigen Temperaturen (circa 4-8°C) inkubiert und im Anschluss daran nach der Blutgerinnselretraktion und seiner Separation ein Serum gewinnt, lyophilisiert und mit ca. 20-30 (25+5) kGy bestrahlt, so erhält man ein aktives Blutserum (darauf wird in späterer Folge eingegangen).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Nachfolgend wird die Erfindung in den bevorzugten Varianten der konkreten Ausführung eingehend geschildert. Dabei sollen die angeführten Beispiele der aktiven Substanzen und Gewinnungsverfahren, der pharmazeutischen Kompositionen und Arzneimittelformen keinen Grund zur Einschränkung der Ansprüche darstellen, sondern sie sind lediglich dazu gedacht, die Machbarkeit der Erfindung sowie die Umsetzung der genannten Zweckbestimmung(en) vorzuführen. Jeder Fachmann auf diesem Gebiet wird sich sicherlich davon überzeugen, dass für die hier angeführten Optionen der Erfindungsführung zahlreiche Modifikationen vorgeschlagen werden können, die allesamt unter die Ansprüche fallen, welche weiter unten angeführt werden.
1. Methode zur Gewinnung vom mit Elektroschock behandeltem Hühnerblut
Zur Serumgewinnung verwendet man das mit dem Elektroschock Il.bis III. Grades behandelte Hühnerblut (elektrischer Strom 80-120 Volt, Frequenz 50 Hertz, Stromstärke 0,05 Ampere, Einwirkdauer: 3-4 Sek. lang im Kopfbereich). Das Blut wurde aus der arteria carotis entnommen und in weiterer Folge bei 4-8°C 18-24 Stunden in Polyäthylengläschen inkubiert. Nach der vollständigen Blutgerinnselretraktion wurden die Fläschchen 20-30 Minuten lang bei 3000 U/Min. zentrifugiert, das Serum wurde von Blutgerinnseln getrennt und unter gewöhnlichen Verhältnissen lyophilisiert. Die Fläschchen mit dem lyophilisierten Serum wurden auf RZ- 100 M- Anlagen bei 20 bis 30 kGy, bevorzugt bei etwa 25 kGy unter Verwendung von Co bestrahlt. Das auf diese Weise gewonnene Serum wurde bei einer Temperatur von 4- 8°C gelagert.
2.1. Beweise für die stimulierende Wirkung des mit Elektroschock behandelten Hühnerblutserums
Die Versuche wurden an Ratten der Linie Wistar, und zwar Männchen mit Körpermasse 280- 300 g durchgeführt. Die Tiere wurden in 4 Gruppen zu je 10 Ratten eingeteilt. In der ersten Gruppe wurde den Ratten 1,0 ml der physiologischen Lösung verabreicht. Den Ratten der zweiten Gruppe wurde Serum in einer Dosierung von 100+/-5,0 mg/kg des Körpergewichts (Umfang 1,0 ml) verabreicht. 30 Minuten nach der Injektion wurden die Ratten dekapitiert.
Den Ratten der dritten Gruppe wurde 1,0 ml der physiologischen Lösung verabreicht und den Ratten der vierten Gruppe Serum (100 +/-5,0 mg/kg Körpergewicht) in einem Umfang von 1,0 ml. 30 Minuten nach der Injektion wurden die Tiere mit einem am Schwanz befestigten Gewicht (10% des Körpergewichts der Ratte) in ein Gefäß mit Wasser (25°C) gesetzt. Nach ersten Anzeichen der Agonie wurden die Tiere aus dem Wasser herausgenommen und dekapitiert.
Als Muster wurden Hirn, Herz, Leber (als Organe mit einer intensiven energetischen Überlastung in Prozessen der extremen Adaptierung) sowie die Skelettmuskulatur (als Hauptträgerorgan) verwendet. Die Gewebsmuster jeder Ratte wurden abgewogen, mit einer isotonischen NaCl-Lösung abgekühlt und mit Flüssigstickstoff schnell eingefroren. Die Gesamtzeit der "Belastung" bis zum Ende der Probenentnahme betrug max. 5-6 Minuten.
In den Skelettmuskeln der Ratten wurden Adenosintriphosphorsäure, Adenosindesophosphor- säure und Adenosinmonophosphorsaure bestimmt. Nukleotide wurden mittels Ionenwech- selchromatographieverfahren auf Säulen unter Anwendung von Anionit Dowex 1 getrennt. Die Mengenbestimmung des Adenosintriphosphorsäure-, Adenosindesophosphorsäure- und Adenosinmonophosphorsäuregehalts wurde spektrophotometrisch (Spektrophotometer Hita- chi-557) in einer 256 Nm Reichweite durchgeführt.
Das Energiepotenzial wurde nach folgender Formel berechnet:
(ATP+0,5ADF)/(ATP+ADP+AMP).
Die Mengenbestimmung des Gehalts an zyklischer Adenosinmonophosphorsaure in Hirn, Herz und in Leber wurde mittels radioimmunologischer Analyse mit einem speziellen Gerät der Firma Amersham (Großbritannien) durchgeführt.
Die Bestimmung der markierten Adenosinmonophosphorsaure erfolgte unter Verwendung des Szintillator-Rechners GS-8.
Forschungsergebnisse
Die unterschiedlichen Gehalte an Adenosintriphosphorsäure, Adenosindesophosphorsäure und Adenosinmonophosphorsaure und die Erhöhung des Enegriepotentials sind sowohl beim Vergleich der dritten Gruppe mit der Kontrollgruppe und der 2. Gruppe (p<0,05) als auch der vierten Gruppe mit der Kontrollgruppe und der zweiten Gruppe (p<0,05) sowie beim Vergleich der dritten und vierten Gruppe untereinander (p<0,05 Tabelle 1) offensichtlich. Tabelle 1: Gehalt an Adenosintriphosphorsäure, Adenosindesophosphorsäure und Adenosinmonophosphorsaure und das Energiepotential im Gewebe der Skelettmuskulatur nach Elektroschock behandelten Serums
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Die Adenylsystemwerte im Wachzustand und 30 Minuten nach leichtem Stress aufgrund der durchgeführten Injektion (Kontrollgruppe) bestätigen, dass unter dem Serumeinfluss die Vermischung des Gehalts an Adenosintriphosphor- und Adenosindesophosphorsäure im Muskelgewebe zu den oberen Normwerten stattfindet, während sich der Adenosinmo- nophosphorsäuregehalt nach unten richtet.
Diese Ergebnisse könnten bedeuten, dass das Serum die Wachstumsprozesse der energetischen Reserve im Muskelgewebe vorantreibt. Die Berechnung des Energiepotentials bestätigt diese Tendenz.
Unter dem Einfluss einer extremen Schwimmbelastung in der dritten Gruppe (physiologische Lösung + Schwimmen) wurde eine Abnahme an Adenosintriphosphorsäure und eine Erhöhung des Gehalts an Adenosindesophosphor- und Adenosinmonophosphorsaure in Bezug auf die Kontrollgruppe festgestellt.
Bei der extremen Belastung der Ratten aus der vierten Gruppe (Serum + Schwimmen) blieben die grundsätzlichen Tendenzen in Zusammenhang mit der Werteveränderung der dritten Gruppe gleich, der Anteil an Adenosintriphosphorsäure blieb jedoch deutlich höher, und bei der Berechnung des Energiepotenzials wurde eine Erhöhung der Werte in Bezug auf die Werte der dritten Gruppe um 43% (p<0,05) festgestellt. Die Vergleichsanalyse der zyklischen Adenosintriphosphorsäure im Herz- und im Lebergewebe sowie in der Hirnsubstanz bei Ratten der ersten und zweiten Gruppe zeigte, dass unter Serumeinfluss eine Erhöhung des Gehalts der zyklischen Adenosinmonophosphorsaure in der Hirnsubstanz festzustellen ist (p<0,01), während im Herz- und Lebergewebe keine bedeutenden Unterschiede zu den entsprechenden Daten der Kontrollgruppe (Tabelle 2) herausgefunden werden konnten.
Tabelle 2: Gehalt an zyklischer Adenosinmonophosphorsaure im Hirngewebe, des Herzens und der Leber nach der Beigabe des mit Elektroschock behandelten Serums
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Unter dem Einfluss extremer Belastung wurde eine nachweisliche Senkung (<0,05) des Gehalts an zyklischer Adenosinmonophosphorsaure bei allen Gewebsarten der Ratten der dritten Gruppe (physiologische Lösung + Schwimmen) sowie bei Ratten der vierten Gruppe (Serum + Schwimmen) festgestellt, was jedoch unter Serumeinfluss in einem geringeren Ausmaß der Fall war. Der Anteil an Adenosinmonophosphorsaure war daher in der Hirnsubstanz um 92% höher als der entsprechende Wert der dritten Gruppe (p<0,05), im Herzgewebe um 69% und im Lebergewebe um 25,7%.
Somit ruft das mit Elektroschock behandelte Serum die Erhöhung des Energiepotenzials im Skelettmuskelgewebe der Ratte hervor, fördert die Erhöhung des Gehalts an zyklischer Adenosinmonophosphorsaure im Hirngewebe sowohl im Ruhezustand als auch unter extremer physischer Belastung und begünstigt nach physischem Stress der Ratten den Anstieg an zyklischen Adenosinmonophosphorsäuren im Herz- und Lebergewebe.
2.2 Langzeitgedächtnis
Methode
Beim Versuch wurden 150 männliche Ratten der Linie Wistar eingesetzt. Alle Ratten wurden vorher im Rahmen des klassischen Tests "offenes Feld" geprüft, und je nach gezeigter Aktivität wurden sie in drei Gruppen - aktive, mittlere und passive - aufgeteilt.
Zur Bildung des Situationsreflexes wurden Ratten in einem Zylinder untergebracht, der sich in einem thermostatischen, mit Wasser befüllten Gefäß befand. Der auf drei Stützen aufgestellte Zylinder erlaubte es somit den Tieren, unter dessen unterer Kante durchzutauchen und die außerhalb des Zylinders liegende Plattform zu erreichen.
Feststellbar war eine Latenzzeit des ersten Versuchs und eine Latenzzeit der endgültigen Bewältigung der Aufgabe der "Befreiung" aus einem geschlossenen Raum und aus dem Wasser.
Beim Bilden des Situationsreflexes wurden die Ratten in drei Gruppen aufgeteilt: "schnelle Taucher": jene, die bereits in der ersten Minute den Ausgang finden konnten; "langsame Taucher": jene, die erst nach 2-3 Minuten begannen, den Ausgang zu suchen; Ratten, die die Aufgabe nicht innerhalb von 10 Minuten lösen wollten.
Die Injektion des mit Elektroschock behandelten Serums erfolgte in einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht 30 Minuten vor Beginn des Versuchs in die Bauchhöhle. Den Kontrolltieren wurde 1 ml der physiologischen Lösung verabreicht. Am nächsten Tag wurde das Reflexverhalten getestet, wonach es eine 42-tägige Pause gab.
Nach dieser Methode wurden 120 Ratten - 60 Kontroll- und 60 Versuchsratten - "ausgebildet", welche vorher in drei Gruppen - aktive, mittlere und passive- aufgeteilt wurden (zu je 20 Tieren in jeder Gruppe); ferner wurden diese für die Analyse in "schnelle und langsame Taucher" unterteilt.
Forschungsergebnisse
Bei manchen Ratten fehlte der "Untertauchreflex" zur Gänze (Tabelle 3). In der Kontrollgruppe waren es sechs der aktiven und mittleren Ratten, unter den passiven waren es 12 Tiere. Am zweiten Tag blieb diese Zahl bei den aktiven und mittleren Ratten gleich, bei den passiven fiel diese auf sieben Tiere, nach 42 Tagen wollten die gleichen 11 Ratten jedoch keineswegs erneut unter der Zylinderkante durchtauchen (eine Ratte starb während des Versuchs).
Bei den aktiven Ratten der Versuchsgruppe gab es gar keine Ratten, die am zweiten Tag darauf "verzichteten", die Aufgabe zu lösen. Bei den mittleren Ratten der Versuchsgruppe waren es am ersten Tag drei, am zweiten Tag lösten sie dennoch die Aufgabe und behielten diese Fähigkeit auch noch nach 42 Tagen. Unter den passiven Ratten der Versuchsgruppe wollten vier Ratten die Aufgabe nicht lösen, am zweiten Tag reduzierte sich diese Zahl jedoch auf zwei und blieb auch nach 42 Tagen des Versuchs gleich.
Tabelle 3: Anzahl der Ratten, bei denen sich kein sog. "Untertauchreflex" gebildet hat
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Bei den "schnellen Tauchern" führte die einmalige Seruminjektion innerhalb von 42 Versuchstagen zu keinen nachweislichen Veränderungen beim Aufrechterhalten des Situationsreflexes.
Bei den "langsamen Tauchern" war eine statistisch nachweisliche Aufrechterhaltung der erlernten Fähigkeiten, schnell den Ausweg aus einer Extremsituation zu finden, feststellbar (Tabelle 4). Dabei verkürzte sich die Zeit am zweiten Tag der Reflexbildung im Vergleich zum ersten Tag sowohl in den Kontroll- als auch in den Versuchsgruppen. In der Kontrollgruppe war dieser Reflex 42 Tage nach der Pause zur Gänze verschwunden, während er bei den Tieren, denen eine Injektion verabreicht worden war, vollständig vorhanden war; der Unterschied lag auch in der Zeit, die bei den Kontrollratten um das 2-3-fache (p<0,001) ausgeprägter war.
Tabelle 4: Einfluss des Blutserums auf die Bildung und Aufrechterhaltung situationsbedingter Reflexe bei «langsamen Tauchern» (Sek.)
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Bei der Bildung und beim langfristigen Behalten von Informationen kommt den H-cholino- zeptiven Mechanismen eine bedeutende Rolle zu. 30 Tiere, denen fünf Tage lang beigebracht worden war, wie man unter einer "Glocke" durchtaucht, wurden in drei Gruppen unterteilt. Den Tieren der ersten Gruppe (10 Ratten) wurde 30 Minuten vor dem Test Zytisin (H-choli- nozeptive-B locker des Hirns) in Form einer physiologischen Lösung in einer Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht in die Bauchhöhle injiziert. Den Tieren der zweiten Gruppe (10 Ratten) wurde ein mit Elektroschock behandeltes Serum in einer Dosis von 100 mg/kg und 30 Minuten später eine Zytisin-Lösung in einer Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Der dritten Tiergruppe (Kontrolle - 10 Ratten) wurde eine physiologische Lösung in einer Dosis von 1 ml injiziert. Das komplexe Verhalten der Tiere wurde nach der oben angeführten Methode 48 Stunden nach der Injektion der erwähnten Substanzen getestet. Die Biotestierung zeigte 48 Stunden, nachdem die Wirkung von Zytisin bemerkbar war, eine deutliche Verlangsamung der "Fluchtreaktion" aus einem geschlossenen Raum, und zwar um das Dreifache im Vergleich zu den Kontrolltieren. Die vorläufige Verabreichung des Serums bis zur Zytisin-Injektion hob nicht nur die Wirkung dieses Blockers auf, sondern rief auch einen Reaktionsanstieg beim "Flüchten" um 20% im Vergleich zur Kontrollgruppe hervor, und die allgemeine Wirksamkeit der Substanz übertraf die Wirkung des Blockers um das 5-fache (Tabelle 5).
Tabelle 5: Latenzzeit der situationsbedingten Reaktion bei Ratten in Zusammenhang mit von Zytisin und mit Elektroschock behandeltem Serum (Sek)
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Auf Grund der erzielten Ergebnisse wurde festgestellt, dass die H- Hirncholinorezeptoren bei der Wiederherstellung der "Fluchtreaktion" im Zusammenhang mit dem Modellieren eines komplexen Verhaltens der Tiere eine Rolle spielen und dass das mit Elektroschock behandelte Serum der Entwicklung einer gebremsten "Lernwirkung" vorbeugt.
Das mit Elektroschock behandelte Blutserum fördert daher die Bildung des Langzeitgedächtnisses, und zwar vor allem bei Tieren mit einer verlangsamten "Fluchtreaktion" aus einem geschlossenen Raum und aus Wasser. Ferner spielt es beim Aufrechterhalten des Langzeitgedächtnisses über die H-cholinozeptiven Hirnmechanismen eine große Rolle.
2.3. Epilepsie
Methode
Nach heutigem Stand bewirkt Kampfer in toxischen Dosierungen die Hyperaktivierung der beweglichen Bereiche des Zentralnervensystems, was sich wiederum in der Entwicklung tonischer Krämpfe wiederspiegelt. Aus diesem Grund wird Kampfer neben Korazol zur Generation von Krämpfen verwendet. Abhängig von der Dosis des verabreichten Präparates werden mit Hilfe von Kampfer sämtliche typische Komponente eines kleinen und großen epileptischen Anfalls hervorgerufen.
Bei unserem Versuch wurde der Einfluss eines mit Elektroschock behandelten Serums auf die epileptische Aktivität untersucht, welche durch Injizieren von Kampfer in die Bauchhölle von Ratten hervorgerufen wird.
Beim Versuch wurden 40 männliche Ratten der Linie Wistar mit einem Gewicht von 190-210 g verwendet. Die Kampferöllösung (20%) wurde in die Bachhölle in einer Dosis von 0,25; 0,5 Erscheinungsformen der Krampfaktivität: die Latenzzeit der Krampfaktivität wird erhöht, die klonischen Krämpfe verlaufen schwächer und ohne Verlust der gewöhnlichen Bewegungsfähigkeit. Außerdem bewahrt das mit Elektroschock behandelte Serum die Tieren beim Modellieren von schweren Epilepsieformen vor dem Tod (alle Tiere bleiben nach Verabreichung von 0,5 ml der 20%-Kampferlösung am Leben).
2.4. Die Wirkung des erfindungsgemäßen Blutserums auf die Zeilproliferation des Menschen
Das erfindungsgemäße Blutserum stellt ein lyophilisiertes, mit Elektroschock II. - III. Grades behandeltes Hühnerblutserum dar [Beresnjewa W.I., "Elektrotrauma, Elektroverbrennung und die Behandlung", M., 1964, S. 87]. Zwei Arten davon wurden bei den Tests verwendet: die erste - aufgelöst in Wasser in einer Konzentration von 100 mg/ml (Versuchsfraktion 1), die zweite - nach dreiminütigem Zentrifugieren der Suspension bei 10000 x g (drei Minuten lang) (Versuchsfraktion 2).
Zellgewinnung
Die Zellen der Jurkat- und Raji-Linie sowie Lymphozyten des menschlichen peripheren Bluts wurden in Kunststoffplatten (Nunc oder Falcon) im 1640-RPMI-Medium (Sigma) durch Zugabe des 10%-Rinderfetalserums (Gibco), 100 Einheiten/ml Penizillin und 100 μg/ml Strep- tomyzin bei' einer Raumtemperatur von 37°C in einem CO -Inkubator mit 5% CO2-Gehalt und bei 95% Feuchtigkeit kultiviert. Zellen der Linien Bro, HeLa, MCF-7, Mg63, HT1080, IMR-32 sowie HepG2 wurden ebenfalls kultiviert, jedoch im DMEM-Medium (Sigma).
Isolierung der mononuklearen Leukozyten (ML) nach der Boyum-Methode
[Boym A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.// Scand J.Lab. Clin. Invest. - 1968. - 21 - Suppl. 97. -P.9-18]
In je zwei konische 50 ml Probiergläser (Falcon) wird eine 15 ml Phykoll-Pak-Lösung eingefüllt, worauf anschließend je 25 ml in einem Phosphatsalzpuffer (PSP) zweifach verdünntes Blut aufgetragen wird. Daraufhin werden die Probiergläser in einem Baket-Rotor bei 400 x g und 20°C 30 Minuten geschleudert. Die obere Phase, die Plasma enthält, kommt nicht zur Anwendung.
Die monoklearen Leukozyten (ML), die sich an der Trennlinie zwischen Plasma und Trennmedium ringförmig konzentrieren, werden im Zentrifugenreagenzglas gesammelt, vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt, in der Folge zweifach mit PSP gewaschen, wobei die Lösung bei 250 x g 10 Minuten geschleudert und im Kulturmedium aufgelöst wird. Diese Fraktion enthält 10-30%) Monozyten und 80-90% Lymphozyten, die im Folgenden als Lymphozyten bezeichnet werden. Ein Teil der Lymphozyten wurde für die Erforschung der mitogenen Aktivität des Testpräparats verwendet und ein anderer zur Proliferation stimuliert, indem der Zelllösung Phytohemaglutinin in Konzentration 20 mkg/ml hinzugefügt wurde. Evaluierung der Biosyntheseintensität Desoxyribonucleinsäure (DNS) in Zellen
Die Evaluierung der Biosyntheseintensität DNS wurde durchgeführt, nachdem der säureunlöslichen Zellfraktion 3H-Thymidin hinzugefügt worden war. Zu diesem Zweck wurden Lymphozyten in 96-Well-Platten in 200 μl Medium zu je 200-800tausend Medium in jedem Well im Vollmedium mit unterschiedlicher Konzentration der Testsubstanz kultiviert. 3H-Thymidin (lμKi/Well, 40 mKi/mMol) wurde 2 Stunden vor Inkubationsschluss zugegeben. Für die Radiometrie wurden die Zellen mit Hilfe einer automatischen Vorrichtung für die Zellsammlung auf Filter gesammelt, die säurelöslichen Produkte mit 5% TH-Essigsäure (H20) gewaschen und ihre Radioaktivität mit Szintillometer gemessen. Die Biosyntheseintensität DNS wird in Imp./Min. gemessen.
Die Bestimmung der Zelllebensfähigkeit nach Inkubation mit unterschiedlichen Präparaten mittels MTT-Test
[Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellur growth and survaval: application to proliferation and cytotoxicity assays.// J. Immunol. Meth., 1983, 65, 55-63]
Zur Durchführung des Tests wurden die Zellen in einer logarithmischen Wachstumsphase gesammelt (Haftzellen, wenn sie etwa eine halbe Fläche der Nährplatte ausfüllen), in das Nährmedium gesetzt, in der Gorjaew-Kammer) gezählt und anschließend in einem Nährmedium mit einer Konzentration von 50-100tausend in 1 Mio. aufgelöst. Die Zelllösung wurde nach Zugabe von verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanzen zu je 100 μl in die 96- Wellplatten eingefügt. Für die Zählung der vitalen Zellen wurden nach Beendigung der Inkubation in diverse 96-Wellenpaltten in sämtliche Wellen je 50 μl MTT-Lösung im Nährmedium (3-4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 Diphenyl Tetrazolium Bromid) zugefügt. Für die Herstellung einer MTT-Lösung wird 1 ml MTT-Ausgangslösung mit 4 ml Nährmedium vermischt. Die Zubereitung der MTT-Endlösung erfolgt durch die Auflösung dieser Substanz in einer Phosphatsalzlösung (PSL, 0,01 M Natriumphosphatpuffer pH 7.4, mit einem 0,15 M NaCl-Gehalt) mit einer Konzentration von 5 mg MTT/ml PSL und weitere Filtrierung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von 0,45 μm (die Lagerung erfolgt bei einer Temperatur von +4°C bis zu einem Monat). Nach dem Zufügen der MTT-Lösung werden die Platten unter den gleichen Bedingungen für weitere 4 Stunden in den Inkubator gestellt. Weiters wird durch das Absaugen mit der Pumpe das Nährmedium entfernt, in jedes Well werden je 150 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) zur Auflösung von gebildeten blauen Formazankristallen zugegeben und die optische Dichte der Lösung in jedem Well auf einem Mehrkanalspektro- fotomer für Mikroplatten bei einer Wellenlänge von 540 nm gemessen (Labsystem). Die Ergebnisse der Lebensfähigkeit der Zellen je nach Konzentration der Substanz werden in Prozenten des Überlebens der Kontrollzellen dargestellt. Die Daten wurden mit dem Computerprogramm "Origin" verarbeitet. Ergebnisse und Diskussion Die Ergebnisse sind auf den Abbildungen 1 - 8 dargestellt. Daraus ergibt sich Folgendes: die hochkonzentrierte Substanz Sl (2,5 - 20 mg/ml) hat auf alle Zellen eine hemmende Wirkung, die Reaktion der Zellen verschiedener Gewebearten auf diese Substanz ist jedoch unterschiedlich. Die IC50 - Dosis (Konzentration der Substanz, die zur 50% Hemmung der Zellen führt) variiert bei unterschiedlichen Zelllinien von 2,2 (Jurkat) bis >20 mg/ml (Mg63) für die Ausgangssubstanz (Index 1) von 3,6 (Lymphozyten des peripheren Bluts) bis > 20 mg/ml (Mg 63 und HeLa) für die lösliche Fraktion der Substanz (Index 2). Bei sämtlichen Zelllinien lag die Toxizität der Ausgangssubstanz über jener der löslichen Substanz. Hier wäre jedoch zu erwähnen, dass für einzelne Linien die Toxizität dieser Formen fast gleich war (Mg63, Raji, Lymphozyten des peripheren Bluts), und für andere (Jurkat, MCG-7, LMR-32) wiederum gab es nach IC50 2-3-fach große Unterschiede. Die Gegenüberstellung der Empfindlichkeit der Zellen der Testsubstanz im Vergleich zum herkömmlichen Krebspräparat "Doxo- rubizin" finden Sie in der Tabelle 7. Tabelle 7: Empfindlichkeit der getesteten Zelllinien auf das Präparat "Doxorubizin"
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Anmerkung: *- hM = 0,58 hg/ml ** - die Empfindlichkeit auf das Präparat "Doxorubizyn" wurde nicht getestet. Ferner wurde beobachtet, dass in einem bestimmten Konzentrationsbereich (von 0,3 bis 3 mg/ml) je nach Zelllinie und Substanzform das Mittel auf bestimmte Zellen stimulierend wirkt. Eine stimulierende Wirkung wurde auch in Bezug auf die Jerkat-, Raji-, Bro-, Mg63-, HT1068- und HepG2-Zellen festgestellt. Die stimulierende Wirkung war unerheblich (10-20- 40%>), jedoch bei beiden Substanzformen vorhanden. Bei den Zellen der Linie HeLa, MCF-7, JMR-32 und Lymphozyten des peripheren Bluts war keine stimulierende Wirkung nachzuweisen. Die stimulierende Wirkung der Ausgangssubstanz in einer Lösungsform war in einer viel niedrigeren Konzentration als in seiner löslichen Fraktion. Möglicherweise liegt der Grund für die zu beobachtende Stimulation nicht im eigentlichen Stimulieren der Proliferation, sondern in der verstärkten Atmung der Zellen, was ebenfalls bei der Methode zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen festzustellen ist. Die letzte Frage bedarf einer genaueren Untersuchung.
Bei der Untersuchung der Wechselwirkungen verschiedener Substanzen mit den immunkompetenten Zellen werden in der Regel zwei Fragen erörtert:
1. Ob die Testsubstanz über eine mitogene Aktivität verfügt, d.h. über eine Fähigkeit, die Lymphozytenproliferation zu stimulieren (in diesem Fall ihre Mengenerhöhung, was üblicherweise nach der Verstärkung der Biosynthese der DNS-Lymphozyten, die nach dem Bestand von 3H-Thymidin beurteilt, festgestellt wird).
2. Ob die Testsubstanz auf Lymphozyten eine toxische Wirkung ausübt (wird meistens beurteilt nach der Hemmung der Lymphozytenproliferation, die durch Mitogene mit 3H- Thymidin-Gehalt oder mit Hilfe vitaler Farbstoffe des Typs MTT vorher stimuliert wurden).
Ferner ist zu erwähnen, dass die nicht aktivierten Lymphozyten in der Kultur nicht proliferie- ren und dass deren Zahl unter Einwirkung von Mitogenen bei ansteigender Mitogenkonzentration steigt. Dies drückt sich im Anstieg der markierten DNS aus.
Der Wirkungsgrad der Mitogene auf Lymphozyten wird je nach Dosis in einer s.g. "glockenförmigen" Kurve dargestellt (Abb. 9). Abschnitt (1) spiegelt jene Reichweite der Mitogenkonzentration wieder, bei der die ansteigende Wirkung (die Biosyntheseintensität DNS) im Verhältnis zur Mitogenkonzentration steht. Der zweite Kurvenabschnitt (2) zeigt den flach verlaufenden Abschnitt wieder und beinhaltet die Reichweite der Mitogenkonzentration, nämlich wann die höchste Wirkung bereits erreicht wurde, das Ansteigen der Mitogenkonzentration nicht durch Veränderung des erreichten Proliferationsniveau gekennzeichnet und keine zytotoxische Wirkung zu beobachten ist. Abschnitt (3) zeigt jenen Bereich der Mitogenkonzentration, in dem dieser bereits eine toxische Wirkung hat.
Die Beurteilung der mitogenen Aktivität der Substanz wurde in zwei Versuchen durchgeführt:
1. Gegenstand der Untersuchung war die Wirkung der Substanz auf die nicht aktivierten Lymphozyten des menschlichen peripheren Bluts. Dabei wurde die Abhängigkeit der proliferativen Aktivität (der Wirksamkeit) von der Dosis der Substanz getestet.
2. Gegenstand der durchgeführten Tests war die Wirkung der Substanz auf die Biosyntheseintensität DNS der mittels Phytohämaglytinyl aktivierten Lymphozyten (FHA 20 μg/ml) in der zweiten Phase.
Beim Untersuchen der Substanz wurde keine mitogene Aktivität festgestellt, d.h., dass im getesteten Bereich der Substanzkonzentration (0.1 - 100.0 mg/ml) keine Stimulation der Bio- Syntheseintensität Desoxyribonucleinsäure der Lymphozyten des peripheren Bluts erkennbar war (Abbildung 10).
Unabhängig von der Substanzdosis hat sich die Anzahl der Lymphozyten des peripheren Bluts nicht wesentlich verändert. Beim Untersuchen der Wirksamkeit der Substanz auf die mit Mitogen FHA 20 μkg/ml aktivierten Lymphozyten wurde die Hemmung der aktivierten Lymphozyten festgestellt.
In Rahmen der durchgeführten Tests wurde somit festgestellt, dass in einer Konzentration von über 0,3 mg/ml die Substanz die Biosyntheseintensität Desoxyribonucleinsäure der stimulierten Lymphozyten inhibieren kann (Abb. 11), obwohl die Frage über den Realisierungsmechanismus dieser Wirkung noch offen bleibt. Die Untersuchung der zytostatischen und der eigenen zytotoxischen Wirkung ist daher von Bedeutung.
Um festzustellen, wie die erhaltenen Daten beim Menschen zu werten sind, sollte man wissen, wie die Substanzkonzentration in den einzelnen Organen oder im Gewebe nach der Durchführung bestimmter Tierversuche aussieht. In diesem Zusammenhang ist es daher wichtig zu untersuchen, in welcher unterschiedlicher Konzentration die Substanz die Biosyntheseintensität DNS in Organen beeinflusst, die die Lymphopoese bestimmen, und zwar im Knochenmark, in der Milz und im Thymus der Maus.
Abgesehen von Lymphozyten wurde ebenfalls die zytotoxische Aktivität der Substanz untersucht, indem den Zellen das Karzmom der Milchdrüse der Linie MCF-7, die sich im Zustand einer monomolekularen Schicht befinden, hinzugefügt wurde. Auf Grund einer Kontaktbremsung der Zellen wurde keine Proliferation festgestellt. Bei einem' solchen Modell kann man die toxische Wirkung der Substanz feststellen, d.h. diese von der zytostatischen Wirksamkeit trennen. Bei der Verwendung dieses Modells hat man festgestellt, dass die Substanz über eine eigene zytotoxische Wirkung bei einer Konzentration von über 2,5 mg/ml verfügt, unabhängig davon, ob die nichtlösliche Fraktion entfernt wurde oder nicht. Die Abhängigkeit von der Dosis ist jedoch sehr schwach ersichtlich. Zu erwähnen ist, dass bei der Inkubation mit den proliferierten Zellen die toxische Wirkung bedeutend schwächer ist, was möglicherweise damit in Zusammenhang steht, dass eine Wirkung innerhalb von 24 Stunden registriert wurde und nicht nach 72 Stunden, wie dies bei den proliferierten Zellen der Fall ist (eine längere Zellinkubation im Zustand einer monomolekularen Schicht kann zum Tod der Kontrollzellen führen).
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Testsubstanz nicht nur über eine zytostatische Wirkung, sondern auch über eigene zytotoxische Akitivität verfügt. Die zytotoxische Aktivität war jedoch wesentlich geringer als die gesamte zytotoxische und zytostatische Aktivität, obwohl diese bei gleicher Konzentration beobachtet wurden.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die aus tierischem Blut mit Elektroschock II.-III. Grades gewonnene Substanz Sl in der Dosierung 0,1 - 1,1 mg/ml eine um 10-40% höhere Proliferation der menschlichen Zellen der Linien Jurkat, Raji, Bro, Mg63, HT1068 und HegL2 hervorruft als jene der Kontrollgruppe. In Bezug auf die Zellen der Linien Heia, MCF-7, JMR-32 und Lymphozyten des peripheren Bluts bewirkt die in höherer Dosierung verwendete Substanz (2,5 - 20 mg/ml) eine feststellbare Hemmung der Proliferation sämtlicher von uns untersuchten Krebszellen des Menschen. Die Sensibilität der Zellen gegenüber der Substanz Sl liegt deutlich höher als gegenüber dem bekannten tumorbekämpfenden Präparat Doxorubizin. Bezugnehmend auf den Einschluss von 3H-Thymidin in die Biosynthese DNS hat die Substanz sowohl eine zytostatische als auch zytotoxische Wirkung.

Claims

P A T E NTA N S P R Ü C HE
1. Verfahren zur Gewinnung eines biologisch aktiven Serums aus Spenderblut, welche die Elektrostimulation des Kopfes, Blutentnahme, Inkubation, Serumisolierung, Lyophili- sierung des Serums und die darauffolgende Gammastrahlenbehandlung beinhaltet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Spenderblut das Blut von Geflügel, insbesondere von Hühnern eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach einer 3 bis 4 Sekunden dauernden Elektrostimulation des Hühnerkopfes im Bereich von 80 bis 120 Volt, bevorzugt im Bereich von 110 bis 120 Volt das Blut entnommen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass Co60 für die Bestrahlung im 25+5,0 kGy - Bereich verwendet wird.
5. Blutserum, das aus Arterien- und Venenblut gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 gewonnen wird, insbesondere aus dem Arterien- und Venenblut von Geflügel.
6. Blutserum nach Anspruch 5, mit einer biologischen Aktivität in einer Konzentration von 95 mg/kg bis 105 mg/kg des Körpergewichts des Spendertieres.
7. Blutserum nach Anspruch 5 oder 6, das den Energiewechsel und den Gehalt an zyklischer Adenosinmonophosphorsaure im Hirngewebe erhöht, den Lern- und Bildungspro- zess des Langzeitgedächtnisses fördert, die Krampfaktivität senkt und bei schweren Epilepsieformen vor dem Tod schützt .
8. Blutserum nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sowohl eine zytostatische, als auch eine zytotoxische Aktivität besitzt.
9. Blutserum nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensibilität der Zellen des humanen T-Zell-Lymphoms der Linie Jurkat, Zellen des humanen B-Zell-Lymphoms der Linie Raj, Zellen der humanen Melanomzellen der Linie Bro, Zellen des Gebärmutterhalskarzinoms der Linie HeLa, Zellen des Adenokarzinoms der Milchdrüse der Linie MCF-7, Zellen des Osteosarkoms der Linie Mg63 und des Fibrosarkoms der Linie HT1080, Zellen des Neuroblastoms IMR-32 und des Hepato- karzinoms der Linie HepG2 gegenüber der Substanz S 1 höher liegen als im Vergleichsfall mit Doxorubizin.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine effektive Menge an Blutserum gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9 enthält und gemäß einer der in den Ansprüchen 1 bis 4 dargelegten Methode hergestellt wird, und bei Bedarf zusätzlich auch ein pharmazeutisch vertretbares Medium, Füllungs- bzw. Lösungsmittel enthält.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, die den Energiewechsel und den Gehalt an zyklischer Adenosinmonophosphorsaure im Hirngewebe erhöht , den Lern- und Bildungsprozess des Langzeitgedächtnisses fördert, die Krampfaktivität senkt und bei schweren Epilepsieformen vor dem Tod schützt .
12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, die in Lösungs-, Tabletten-, Zäpfchen-, Pulver- oder Kapselform hergestellt ist.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 bis 12 unter Verwendung von destilliertem Wasser als Lösungsmittel.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 bis 12 unter Verwendung von Kakaobutter, Vitebsol als Trägersubstanz.
15. Verfahren zur Erhöhung des Energiewechsels und des Gehaltes an zyklischer Adenosinmonophosphorsaure im Hirngewebe durch Zuführung eines Blutserums gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei der die Effektivdosis von 95 bis 105 mg/kg Körpergewicht des Patienten beträgt.
17. Verfahren zur Förderung des Lern- und Bildungsprozess des Langzeitgedächtnisses durch Zuführung eines Blutserums gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14.
18. Verfahren nach Anspruch 17, bei der die Effektivdosis von 95 bis 105 mg/kg Körpergewicht des Patienten beträgt.
19. Verfahren zur Senkung der Krampfaktivität und zum Schutz vor dem Tod bei schwerem Epilepsiegrad, gekennzeichnet durch die Zuführung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei der die Effektivdosis von 95 bis 105 mg/kg Körpergewicht des Patienten beträgt.
21. Verwendung eines Blutserums nach einem der Ansprüche 5 bis 9 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14, zur Regulierung der Proliferation unterschiedlicher menschlicher Tumorzellen, vergleichbar den Zellen des humanen T-Zell-Lymphoms der Linie Jurkat, Zellen des humanen B-Zell- Lymphoms der Linie Raj, Zellen der humanen Melanomzellen der Linie Bro, Zellen des Gebärmutterhalskarzinoms der Linie HeLa, Zellen des Adenokarzinoms der Milchdrüse der Linie MCF-7, Zellen des Osteosarkoms der Linie Mg63 und des Fibrosarkoms der Linie HT1080, Zellen des Neuroblastoms IMR-32 und des Hepatokarzinoms der Linie HepG2.
22. Verwendung eines Blutserums nach einem der Ansprüche 5 bis 9 zur Regulierung der Proliferation unterschiedlicher menschlicher Tumorzellen nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass zur Stimulierung der Zellproliferation eine Dosierung von 0,1 - 1,1 mg/ml Flüssigkeitsmenge und zur Hemmung eine Dosis von 2,5 - 20 mg/ml Flüssigkeitsmenge eingesetzt wird.
23. Verwendung eines Blutserums nach einem der Ansprüche 5 bis 9 zur Regulierung der Proliferation unterschiedlicher menschlicher Tumorzellen vergleichbar den Zellen der Linie Heia, MCF-7, JMR-32 und Lymphozyten des peripheren Bluts nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer Dosierung von über 2,5 mg/ml Flüssigkeitsmenge eingesetzt wird.
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